ES2303496B1 - Metodo analitico perfeccionado para la deteccion de hepatitis c oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnostico. - Google Patents

Metodo analitico perfeccionado para la deteccion de hepatitis c oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnostico. Download PDF

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Abstract

Método analítico perfeccionado para la detección de hepatitis C oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnóstico. Dicho método analítico está basado en la técnica del inmunoensayo y se han determinado las condiciones operativas más idóneas para permitir la detección de la hepatitis C oculta. El kit de diagnóstico es el complemento de dicho método.
La presente invención tiene aplicación en medicina, investigación biomédica y el campo de las técnicas analíticas.

Description

Método analítico perfeccionado para la detección de hepatitis C oculta, aplicaciones del mismo y su correspondiente kit de diagnóstico.
Campo técnico de la invención
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la identificación y detección del virus C de la hepatitis (VHC).
Más específicamente, la presente invención proporciona un método analítico perfeccionado y su correspondiente kit de diagnóstico para la detección de dicho virus C con especial utilidad en la identificación y detección de las llamadas "infecciones ocultas por VHC", que no pueden ser detectadas en muestras de suero o plasma por los métodos analíticos convencionales, empleados en la actualidad.
Estado de la técnica
El VHC pertenece a la familia de virus animales denominada Flaviviridae, género Hepacivirus. El genoma del VHC (VHC-ARN a partir de aquí) consiste en una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de alrededor de 9,4 kilobases (kb) de longitud. Se asume que la replicación del VHC ocurre mediante la síntesis de una cadena de ARN de polaridad negativa, es decir, complementaria a la molécula de ARN genómico del virus que, a su vez, sirve como molde para la síntesis de nuevas moléculas del ARN genómico. Aunque el hígado es el principal órgano diana para la infección por VHC, este virus puede, potencialmente, infectar cualquier tipo de célula, tejido u órgano dentro del cuerpo humano.
Actualmente existen técnicas que permiten diagnosticar sin dificultad la infección por VHC en un paciente mediante la detección en muestras de su suero o plasma de anticuerpos frente a antígenos del VHC (anti-VHC a partir de aquí) o del VHC-ARN.
Sin embargo, existe una forma de infección por VHC descrita muy recientemente, que se caracteriza por ser "serológicamente silenciosa", en la que los pacientes infectados no presentan frente a los kits de detección comerciales ni anti-VHC ni VHC-ARN en su suero ni en su plasma ("infección oculta" a partir de aquí).
El perfil general de este tipo de pacientes es el de personas con análisis de la función hepática anómalos desde períodos de tiempo prolongados, esto es, niveles sanguíneos anormalmente altos de las enzimas hepáticas. En estos pacientes se han evaluado todas o una gran parte de las causas conocidas de enfermedades hepáticas, en los que se han tenido que descartar sustancialmente todas ellas ya sea con base a datos analíticos, clínicos o epidemiológicos, por ejemplo: infección por el virus B de la hepatitis (los pacientes eran antígeno de superficie de la hepatitis B y VHB-ADN en suero negativos), VHC (los pacientes eran anti-VHC y VHC-ARN en suero negativos), hepatitis autoinmune crónica, hepatitis alcohólica, síndrome de Gilbert, cirrosis biliar, así como trastornos autoinmunes, metabólicos y genéticos, junto con factores de riesgo de daño hepático como ingesta de alcohol, drogas, fármacos, transfusiones, tatuajes, piercings, comportamiento sexual descuidado, etc.
Por lo tanto, estamos ante un sector de la población, con una función hepática alterada que los métodos analíticos actuales no son capaces de justificar, y que cuya causa puede ser una infección oculta por una forma de virus C de la hepatitis. La imposibilidad de diagnosticar de una forma rápida, eficaz y segura con los medios actuales este tipo de infección tiene una doble repercusión de gran importancia:
-
En primer lugar desde el punto de vista del propio paciente, el cual se encuentra en una situación de total desventaja frente a los pacientes cuya enfermedad es detectable en suero o plasma por los métodos analíticos actuales, en cuyo caso el médico especialista puede ocuparse de su dolencia particular y proporcionarle la terapia más adecuada para su situación concreta.
-
En segundo lugar desde el punto de vista epidemiológico y de propagación de la enfermedad derivada del des-conocimiento de la misma tanto por parte del portador como de los especialistas. Así, los pacientes infectados con la forma oculta del virus C de la hepatitis portan VHC-ARN en las células mononucleares de su sangre periférica pero no en su suero, lo que debe ser tenido muy en cuenta en el caso de donaciones de sangre, órganos, hemodiálisis, etc. los cuales pueden estar infectados sin que, en principio, hubiera sospecha de ello. Por otra parte, el conocimiento de la enfermedad, permitirá al especialista aconsejar al paciente las medidas elementales de seguridad para evitar contagios indeseables en su círculo habitual.
Dentro del campo técnico en que nos encontramos, los investigadores emplean el inmunoensayo como una técnica analítica habitual, por la fiabilidad de sus resultados. En particular el enzimoinmunoensayo (EIA) es una técnica analítica habitual, por su carácter de metodología sencilla, reproducible, de interpretación objetiva que permite procesar una gran cantidad de muestras de fluidos corporales en poco tiempo, lo que facilita su implementación en laboratorios de menor complejidad.
Actualmente existen inmunoensayos comerciales para determinar en sangre anti-VHC. En estos EIA se detectan anticuerpos frente a las proteínas estructurales (core y envuelta) y no estructurales (NS) del VHC. Por otra parte, la sensibilidad de los EIA comerciales para determinar anti-VHC en sangre difiere según qué antígenos del VHC se utilicen para recubrir la fase sólida, ya sean proteínas individuales ó fusionadas ó fragmentos peptídicos.
El EIA comercial para la detección de anti-VHC en suero ó plasma humano comprende los siguientes componentes activos:
-
una fase sólida (por ejemplo, los pocillos de una microplaca) revestida de una mezcla de antígenos del VHC: core y/o E2/NS1 y/o NS3 y/o NS4 y/o NS5. La mayoría de los EIA comercializados incluyen al menos los antígenos core, NS3 y NS4.
-
control negativo y control positivo de la reacción,
-
diluyente de muestra,
-
solución de lavado,
-
diluyente de conjugado,
-
conjugado,
-
tampón de substrato y/o solución de substrato,
-
solución de parada.
El campo técnico de acción del método EIA comercial para detectar anti-VHC es la infección clásica por VHC.
Estos EIA, llamados de cribaje (screening) que sirven para cribar una muestra de una población de individuos que han podido estar en contacto con el VHC, presentan una eficacia reconocida igual o superior al 99% en términos de especificidad y una sensibilidad analítica cercana al 100% en pacientes con infección clásica por VHC.
La especificidad del método EIA comercial disminuye en poblaciones de sujetos inmunocompetentes, como donantes voluntarios de sangre, personal sanitario, trabajadores de instituciones penitenciarias o personal militar. Así mismo, la sensibilidad es menor en individuos inmunodeprimidos [datos del centro para el control de las enfermedades de Atlanta, EE.UU., según la publicación: Morbidity and Mortality Weekly Report 2003;52(No.RR-3):
1-13].
Si bien la técnica del inmunoensayo tiene ya un protocolo de trabajo sobradamente establecido no se escapa a ningún especialista en el campo, que la determinación específica de cada antígeno o anticuerpo concreto requerirá de un esfuerzo investigador para encontrar las condiciones operativas y los reactivos adecuados a cada caso concre-
to.
Como referencia de lo anterior se aporta una relación de publicaciones que utilizan el método EIA para determinar anti-VHC.
(1) Kuo G, et al. Science 1989;244:362-364.
(2) Alter HJ, et al. Lancet 1989;2:1006-1008.
(3) Van der Poel CL, et al. Vox Sang 1992;62:208-212.
(4) Kleinman S, et al. Transfusion 1992;32:805-813.
(5) Okamoto H, et al. Hepatology 1992;15:180-186.
(6) Sällberg M, et al. J Clin Microbiol 1992;30:1989-1994.
(7) Sällberg M, et al. Immunol Lett 1992;33:27-33.
(8) Bresters D, et al. J Med Virol 1992;37:187-191.
(9) Sato A, et al. J Med Virol 1994;44:88-91.
(10) Sällberg M, et al. J Med Virol 1994;43:62-68.
(11) Mondelli MU, et al. J Clin Microbiol 1994;32:2523-2527.
(12) Chen M, et al. Gastroenterology 1999;116:135-143.
(13) Toyoda H, et al. Am J Gastroenterol 1999;94:2230-2236.
(14) Laperche S, et al. J Clin Microbiol 2005;43:3877-383.
(15) Netski DM, et al. Clin Infect Dis 2005;41:667-675.
(16) Muerhoff AS, et al. J Med Virol 2008;80:411-418.
En particular, las publicaciones (5), (6), (7), (8), (9), (10) y (16) del listado anterior hacen referencia al uso del antígeno core en la determinación de anti-VHC en distintas situaciones clínicas de la infección clásica por VHC. Como se puede comprobar en las citadas publicaciones, se ha empleado proteína core o péptidos de diferentes tamaños para detectar anticuerpos anti-core del VHC.
A modo de ejemplo, en la referencia (5) se describe el uso de un péptido sintético core 5-23, que permite detectar anti-VHC por EIA.
En las publicaciones (6) y (7) y otras relacionadas se lleva a cabo un análisis de las regiones antigénicas de la proteína core del VHC (que comprende los aminoácidos 1 a 190) para identificar las regiones inmunodominantes mediante el uso de péptidos sintéticos que permitan caracterizar la respuesta inmune en la infección "clásica" por VHC. En concreto: 1) se identifica un péptido que comprende los aminoácidos 1-17 del extremo amino de la proteína core; 2) se localiza la región antigénica principal en la secuencia de aminoácidos 9-16; 3) mediante EIA usando un péptido core se detectan anticuerpos anti-VHC de tipo IgG en el 83% de los sueros de pacientes con anti-VHC detectable por EIA comercial.
Por otra parte, en la referencia (17) y otras relacionadas se describe tanto el uso de péptidos sintéticos de la proteína core de genotipo la como antígenos de VHC para detectar anti-VHC. El empleo de péptidos de core de VHC con secuencias de aminoácidos 1-18, 10-24, 11-28 1-30, 10-43 y otros, produjo diferentes porcentajes de detección de anti-VHC mediante EIA. A modo de ejemplo, el porcentaje de detección de anti-VHC en sueros de pacientes con infección clásica por VHC genotipo 1 (con resultado anti-VHC positivo por EIA comercial) usando cada péptido fue: 78% con core 1-18; 89% con core 10-24; 85% con core 11-28; 93% con core 1-30; 100% con core 10-43. En esta publicación no se refieren datos de determinación de anticuerpos anti-core en sujetos anti-VHC negativo por EIA comercial.
El equipo investigador que ha desarrollado la presente invención viene utilizando el inmunoensayo durante los últimos años para sus determinaciones de VHC tanto en sangre (suero ó plasma) como en sobrenadantes de cultivos de células humanas. Ha utilizado el inmunoensayo para las determinaciones analíticas de VHC en muestras de suero o plasma y en muestras de sobrenadantes de cultivos celulares, con resultados expuestos en las referencias siguien-
tes:
(1) Quiroga JA, et al. Hepatology 1991;14:38-43.
(2) Quiroga JA, et al. Clin Diag Lab Immunol 1994;1:545-551.
(3) Quiroga JA, et al. J Infect Dis 1996;173:300-305.
(4) Martín J, et al. Cytokine 1998;10:635-644.
(5) Quiroga JA, et al. J Clin Microbiol 2006;44:4559-4560.
Si bien los EIA comerciales detectan anti-VHC en la infección "clásica" por VHC, no funcionan (es decir, se obtiene un resultado negativo) con la variedad "oculta" de la enfermedad. Posiblemente, los EIA comerciales no son suficientemente sensibles para detectar cantidades traza de anti-VHC. La razón por la que pueden no funcionar correctamente es que la mezcla de antígenos que recubren la fase sólida puede interferir e impedir la detección de cantidades traza de anti-VHC.
Para solventar estos problemas se han intentado algunas modificaciones o aplicaciones alternativas.
Así, se determinó la presencia de anti-VHC mediante la prueba MONOLIS® HCV Ag-Ab ULTRA (Bio-Rad Laboratories, Marnes-la-Coquette, Francia) en muestras de suero de pacientes diagnosticados de infección oculta por VHC (resultado anti-VHC negativo con los EIA comerciales: Ortho HCV 3.0 ELISA, Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ, EE.UU.; e INNOTEST HCV Ab IV, Innogenetics, Gante, Bélgica). La prueba MONOLIS® HCV Ag-Ab ULTRA sólo fue capaz de detectar la presencia de anti-VHC en el suero de 1 paciente con infección oculta por VHC [Quiroga JA, et al. J Clin Microbiol 2006;44:4559-4560].
De estos datos se deduce que las alternativas para detectar anti-VHC no han funcionado.
De lo anteriormente expuesto se deduce que es evidente la necesidad de disponer de un método rápido, seguro y eficaz para la determinación de la existencia de infección oculta por VHC en un sujeto que se sospeche pueda estar infectado. El método "gold standard" para identificar una infección oculta por VHC es la detección de VHC-ARN en tejido hepático obtenido mediante una biopsia de hígado.
En este sentido, la Patente Española Nº. 200303050 describe un método analítico basado en la técnica de la hibridación in situ que permite la detección en tejido hepático del VHC-ARN y por tanto, la identificación de la infección oculta por VHC que no puede detectarse en muestras de suero o plasma por los métodos analíticos convencionales.
No obstante, la biopsia es un procedimiento invasivo que no siempre se realiza pues entraña riesgos para el enfermo. Por tanto, se necesita disponer de un método sencillo y sensible que permita realizar el diagnóstico en sangre de la infección "oculta" por VHC.
Los investigadores han profundizado en la búsqueda de los parámetros determinantes del protocolo de inmunoensayo (por ejemplo, método de preparación de la matriz de reacción, pretratamiento de las muestras anterior a la reacción inmunoquímica, tipo y concentración del antisuero conjugado, tiempo necesario para que se produzca la reacción inmunoquímica, etc.) para el diagnóstico de una potencial infección oculta por virus C.
Descripción de la invención
La presente invención, tal y como se describe en su enunciado, se refiere a un método analítico perfeccionado para detección de hepatitis C oculta, a las aplicaciones del mismo y a su correspondiente kit de diagnóstico.
En concreto, refiere a un inmunoensayo de cribaje. Una realización preferente de lo anterior es un inmunoensayo seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo fluorescente, quimioluminiscente o bioluminiscente.
Dicho inmunoensayo de cribaje para la detección de hepatitis C oculta utiliza muestras de suero o plasma derivado de sangre periférica o proveniente de órganos, fluidos producidos o secretados por células aisladas, o secreciones de tejidos o de órganos.
Una realización preferente de la invención está constituida por un inmuonensayo de cribaje para la detección de la hepatitis C oculta que utiliza como antígeno un péptido de la proteína Core del VHC, y una realización más preferente aún utiliza como antígeno el péptido representado por la secuencia SEQ.ID.NO: 1.
La realización más preferente de la invención es un ELISA que utiliza como antígeno el péptido representado por la secuencia SEQ.ID.NO: 1.
Esta realización más preferente detecta mediante EIA anti-core de VHC de tipo IgG en el suero del 98% de pacientes con infección clásica por VHC genotipo 1 (con resultado anti-VHC positivo por EIA comercial). La aplicación novedosa es que también detecta anti-core de VHC de tipo IgG en el suero del 40% de pacientes con infección oculta por VHC (es decir, con resultado anti-VHC negativo por EIA comercial), por lo que puede afirmarse que el método analítico objeto de esta invención aumenta la sensibilidad de los EIA descritos, mejora el diagnóstico serológico y puede ser útil para la trazabilidad de la infección oculta por VHC.
Otra realización de la invención es un inmuoensayo de cribaje que utiliza como antígeno un péptido que contiene el representado por la secuencia SEQ.ID.NO: 1.
Por otra parte, en otros experimentos efectuados por los investigadores se observó que péptidos de menor longitud, con secuencias de entre 6 y 10 aminoácidos a partir del extremo amino de la proteína core, presentaban funcionalidad como antígeno. Sin embargo, la sensibilidad de la detección de anti-VHC era menor que usando el péptido de 15 aminoácidos de la realización más preferente de la invención.
De modo que otra realización de la invención utiliza como antígeno del inmunoensayo de cribaje un péptido con al menos 6 aminoácidos correlativos a partir del extremo NH-terminal del péptido representado por SEQ.ID.NO: 1.
De acuerdo con las opciones que ofrece el estado de la técnica, dicho inmunoensayo puede utilizar un antisuero marcado con un marcador isotópico o no isotópico. Entre estos últimos, una realización preferente de la invención comprende utilizar un fluoróforo, un cromóforo, una enzima o cualquier otra molécula que produzca un conjugado apto para el inmunoensayo. Una realización más preferente aún utiliza un antisuero anti-IgG humana conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (anti-IgG-HRP).
Otra realización preferente de la invención está constituida por un kit de diagnóstico para la puesta en práctica de dicho método analítico para la detección de la hepatitis C oculta. En concreto, dicho kit comprende como elementos fundamentales del inmunoensayo de cribaje a realizar una Matriz de reacción, Reactivo VHC, Agente bloqueante, Diluyente de muestra, Solución de lavado, Solución de conjugado y Reactivos para el revelado de la reacción inmunoquímica.
En concreto, el inmunoensayo de cribaje que se puede efectuar con este kit está seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo fluorescente, quimioluminiscente o bioluminiscente.
Dicho inmunoensayo de cribaje contenido en el kit para la detección de hepatitis C oculta utiliza muestras de suero o plasma derivado de sangre periférica o proveniente de órganos, fluidos producidos o secretados por células aisladas, o secreciones de tejidos o de órganos.
Una realización preferente de este kit de diagnóstico utiliza el péptido representado por la SEP.ID.NO.1 o un péptido mayor que lo contenga.
Otra realización de este kit utiliza un péptido de al menos 6 aminoácidos correlativos a partir del extremo NH-terminal del representado por la SEQ.ID.NO: 1.
El método analítico de la presente invención basado en la técnica del inmunoensayo puede resumirse esquemáticamente como sigue:
1
Dado que el método analítico de la presente invención está destinado especialmente a la detección de anti-VHC en la infección oculta, es preciso poner a punto las diferentes etapas de la técnica general a este caso concreto, para poder conseguir el método analítico perfeccionado objeto de la presente invención.
La reacción inmunoquímica en la que se basa la técnica del inmunoensayo en fase sólida se lleva a cabo en un soporte o matriz de reacción que puede ser del tipo microplaca dividida en celdillas o pocillos para muestras individuales, tubos, esferas, tiras o combinaciones de los mismos, de un material orgánico del tipo poliestireno, polietileno, polivinilo, policarbonato, celulosa, etc.
Las moléculas diana del método son anticuerpos anti-VHC específicos de la proteína estructural core del virus C de la hepatitis. Las muestras que contienen estas moléculas diana pueden ser de suero o plasma. Estas muestras provendrán de pacientes en los que no se detecten en su suero o plasma los anticuerpos anti-VHC ni el VHC-ARN por los métodos comerciales disponibles, pero posean valores anómalos sostenidos de las enzimas hepáticas en sangre. Las muestras se obtienen normalmente a partir de una extracción de sangre de los pacientes.
Los siguientes ejemplos ilustran el método de la invención sin ser en modo alguno limitantes de ésta.
Ejemplos
Ejemplo 1
Obtención de las muestras
Para obtener la muestra de suero o plasma, se realiza la extracción de 10 ml de sangre venosa mediante un dispositivo apropiado y se dispone la sangre en un tubo de cristal tipo Vacutainer® (Beckton-Dikinson, Plymouth, RU) con gel en la parte inferior, diseñado para la obtención de suero, o que contenga anticoagulante (170 unidades internacionales de heparina de litio) para la obtención de plasma. La sangre se centrifuga 20 minutos a 1.200 x g a temperatura ambiente (entre 20 y 25ºC) en una centrífuga Heraeus Megafuge 1.0R (Heraeus, Osterode, Alemania). Se separa la capa superior que contiene el suero o plasma y se dispone aproximadamente 1 ml en un tubo de poliestireno con tapón, apto para almacenar el suero o plasma a -20ºC hasta su empleo.
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Ejemplo 2
Obtención del reactivo VHC
El reactivo VHC utilizado en el método objeto de la invención es un pentadecapéptido sintético con secuencia representada por SEQ.ID.NO: 1, que comprende los aminoácidos del 5 al 19 del extremo N-terminal de la proteína core del VHC (en adelante, péptido core 5-19). El péptido core 5-19 fue sintetizado por la compañía GeneScript Corporation (Scotch Plains, NJ, EE.UU.) El péptido core 5-19 liofilizado contiene 7 mg de proteína con una pureza del 93,8% según análisis realizado por cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas. El péptido core 5-19 liofilizado se disuelve en H_{2}O ultrapura (Milli-Q; Millipore, Molsheim, Francia) para obtener una concentración de 1 mg/ml; se reparte en partes alícuotas de 220 \mul en tubos estériles de polipropileno de 1 ml con tapón y se almacena a una temperatura de -20ºC hasta su empleo.
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Ejemplo 3
Preparación de la matriz de reacción (fase sólida)
La fase sólida consiste en una placa de poliestireno microtiter EIA de 96 pocillos de fondo plano, sin tapa, estéril (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). Para preparar la matriz de reacción, se descongela hasta 4ºC una alícuota de péptido core 5-19 de las descritas en el ejemplo 2. Se prepara una solución de reactivo de 10 \mug/ml de concentración para lo que se mezclan 110 \mul de péptido core 5-19 reconstituido y 10,89 ml de solución tamponada de carbonato sódico 0,1 M pH 9,6 pre-enfriada a 4ºC. En cada pocillo de la placa se disponen 100 \mul de solución de péptido core 5-19 de 10 \mug/ml y se incuba durante 18 horas a una temperatura de 4ºC sin agitación en una cámara frigorífica modelo S-1000-2 (Azkoyen, Madrid, España). Al finalizar la incubación cada pocillo de la placa se lava 2 veces con un volumen de 200 \mul de solución de lavado formada por tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,4 al que se añade 0,05% de polioxietilen-(20)-sorbitan monolaureato (Tween-20®; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Al acabar el último lavado se retira el exceso de solución de lavado por inversión de la placa sobre una toalla de papel. A continuación se añaden 150 \mul del agente bloqueante compuesto por solución tamponada de fosfato sódico y potásico 0,1 M pH 7,4 suplementada con 10% de suero fetal bovino inactivado por calentamiento a 56ºC durante 30 minutos (Sera Laboratories International Ltd., West Sussex, RU) a la que se añade 0,05% de Tween-20® y se incuba 60 minutos a 37ºC en una estufa Heraeus modelo I-42. Al final de la incubación se retira el exceso de agente bloqueante por inversión de la placa. Cada pocillo se lava 2 veces con un volumen de 200 \mul de solución de lavado. Al acabar el último lavado se retira el exceso de solución de lavado por inversión de la placa sobre una toalla de papel. Al finalizar esta etapa la matriz de reacción está lista para proceder a incubar con las muestras.
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Ejemplo 4
Pretratamiento de la muestra
Se descongela la muestra de suero o plasma desde -20ºC hasta temperatura ambiente (entre 20 y 25ºC), volteando el tubo para homogeneizar su contenido antes del pretratamiento. Este pretratamiento es una etapa crucial en el método objeto de invención, paso no especificado en los protocolos de la mayoría de los EIA comerciales. Consiste en una incubación cuya finalidad es adsorber los componentes de la muestra para eliminar las uniones antígeno-anticuerpo no específicas que puedan enmascarar las cantidades traza de anti-VHC. Se disponen 50 \mul de muestra de suero o plasma en un microtubo de polipropileno de 1,5 ml de capacidad (Sarsted, Nümbrecht, Alemania) y se añaden 450 \mul de solución tamponada de fosfato sódico y potásico 0,1 M pH 7,4 suplementada con 10% de suero fetal bovino (Sera Laboratories International Ltd.) a la que se añade 0,05% de Tween-20® (Sigma). La mezcla se incuba 1 h a 37ºC en un incubador Thermomixer modelo 5436 (Eppendorf, Hamburgo, Alemania).
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Ejemplo 5
Reacción inmunoquímica antígeno-anticuerpo
Unas muestras pretratadas según el ejemplo anterior (100 \mul) se añaden a los pocillos de la matriz de reacción; la placa se cubre con una lámina transparente ("Plate Sealer", Perkin Elmer - Wallac, Turku, Finlandia) y se incuba 1 h a 37ºC en una estufa Heraeus modelo I-42. Al finalizar la incubación se retira la lámina transparente y cada pocillo se lava 5 veces con un volumen de 200 \mul de solución de lavado. Al acabar el último lavado se retira el exceso de solución de lavado por inversión de la placa sobre una toalla de papel.
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Ejemplo 6
Preparación del antisuero conjugado
El antisuero conjugado usado en el método objeto de invención es un antisuero policlonal anti-inmunoglobulina de tipo G (IgG) humana obtenido en conejo mediante inmunización con IgG aislada de sueros humanos normales y conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (anti-IgG-HRP; DakoCytomation A/S, Glostrup, Dinamarca). El antisuero conjugado se suministra en forma líquida en solución tamponada de Tris-HC1 0,05 mol/l, NaN_{3} 15 mmol/1, pH 7,2 con una concentración de 1 mg/ml. Se mantiene a 4ºC hasta su uso. Para preparar la solución de antisuero conjugado se mezclan 11 \mul de anti-IgG-HRP y 11 ml de solución de agente bloqueante (descrito en el ejemplo 3) por lo que se obtiene una dilución 1:1000, óptima para este tipo de EIA [Harlow D & Lane D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York; 1988: pp592]. Se añaden 100 \mul de la solución de antisuero conjugado a cada pocillo de la reacción para detectar la reacción inmunoquímica antígeno-anticuerpo; la placa se cubre con una lámina transparente ("Plate Sealer", Perkin Elmer - Wallac) y se incuba 1 h a 37ºC en una estufa Heraeus modelo I-42. Al finalizar la incubación se retira la lámina transparente y cada pocillo se lava 5 veces con un volumen de 200 \mul de solución de lavado. Al acabar el último lavado se retira el exceso de solución de lavado por inversión de la placa sobre una toalla de papel.
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Ejemplo 7
Revelador para detectar la reacción
En el método objeto de invención se emplea como solución de revelado la sal diamónica de 2,2'-azinobis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico] (ABTS; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). ABTS es un substrato cromogénico de la peroxidasa de rábano que da lugar a la formación de un producto de color verde cuando se oxida. ABTS se suministra como solución líquida lista para su uso (no requiere preparación ulterior) y se almacena a 4ºC hasta su empleo. Antes de usar la solución de ABTS se atempera a temperatura ambiente (entre 20 y 25ºC). El substrato ABTS (100 \mul/pocillo) se añade a los pocillos de la microplaca y se incuba durante 30 minutos en oscuridad (para lo cuál se tapa completamente la placa, por ejemplo con una capa de papel de aluminio) con agitación suave en un agitador Atom modelo 85 (Atom, Barcelona, España). Opcionalmente, como solución de parada de la reacción se emplea n-Dodecilsulfato sódico (Calbiochem - Biosciences Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) al 1A (100 \mul/pocillo). La reacción se mide en un lector de placas Whittaker modelo 2001 (Anthos Labtec Instruments, Salzburgo, Austria) a una longitud de onda de 405 nm con longitud de onda de referencia a 620 nm. La intensidad del color verde dependerá de la cantidad de anti-VHC presente en la muestra analizada.
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Ejemplos de ensayos en pacientes tipificados
Ejemplo 8
Pacientes con infección oculta por VHC Establecimiento del valor "cut-off":
Se obtienen las muestras de pacientes diagnosticados de infección oculta por VHC según el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se procede a analizar la muestra para detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA con el método objeto de la invención. Para ello, se prepara la matriz de reacción conforme a la descripción del ejemplo 3 usando el reactivo del ejemplo 2. Se realiza el pretratamiento de la muestra (en este caso, suero) según el ejemplo 4 y la reacción inmunoquimica conforme al ejemplo 5 y se procede a detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA siguiendo los procedimientos descritos anteriormente en los ejemplos 6 y 7. La determinación se lleva a cabo por duplicado empleando como controles las muestras de 3 personas sanas (controles negativos) y 1 paciente anti-VHC positivo por ELISA comercial (control positivo) obtenidas y procesadas según lo descrito en los ejemplos 1, 4 y 5. Al medir la reacción se obtienen los siguientes resultados:
- Los controles negativos dan valores promedio de 0,047, 0,055 y 0,050 unidades de absorbancia a 405/620 nm; el valor promedio de los 3 controles negativos es 0,051 unidades de absorbancia a 405/620 nm y la desviación estándar calculada es 0,004.
- El valor promedio del control positivo es 0,789 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
- Se establece el valor de corte entre resultado NEGATIVO y POSITIVO (valor "cut-off" del ensayo) como la suma del valor promedio de los 3 controles negativos más cinco veces la desviación estándar del valor promedio.
- El valor "cut-off" del ensayo resulta ser de 0,071 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
Paciente Nº 1:
Paciente (mujer) que acude a consulta por presentar valores anómalos de las enzimas hepáticas. Se descartan las causas conocidas de enfermedad hepática, incluyendo la infección "clásica" por VHC (anti-VHC y VHC-ARN no detectables en suero por los métodos comerciales). Se detecta en biopsia hepática la presencia de VHC-ARN genotipo 1 por lo que se diagnostica infección oculta por VHC y se demuestra lesión del hígado (cirrosis hepática con actividad inflamatoria).
- El suero del paciente Nº. 1 da valores de absorbancia a 405/620 nm de 0,166 y 0,172 unidades; el valor promedio del suero del paciente Nº. 1 es de 0,169 unidades de absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off" del ensayo, el valor promedio del suero del paciente Nº. 1 resulta ser mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el suero analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
Paciente Nº 2:
Paciente (hombre) que acude a consulta por presentar valores anómalos de las enzimas hepáticas. Se descartan las causas conocidas de enfermedad hepática, incluyendo la infección "clásica" por VHC (anti-VHC y VHC-ARN no detectables en suero por los métodos comerciales). Se detecta en biopsia hepática la presencia de VHC-ARN genotipo 1b por lo que se diagnostica infección oculta por VHC y se demuestra lesión del hígado (hepatitis crónica periportal con fibrosis en estadio 2).
- El suero del paciente Nº.2 da valores de absorbancia a 405/620 nm de 0,102 y 0,107 unidades; el valor promedio del suero del paciente nº. 1 es de 0,105 unidades de absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off" del ensayo, el valor promedio del suero del paciente Nº. 2 resulta ser mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el suero analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
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Ejemplo 9
Pacientes en hemodiálisis con riesgo potencial de infección oculta por VHC Establecimiento del valor "cut-off":
Se obtienen las muestras de pacientes en hemodiálisis con sospecha de infección oculta por VHC según el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se procede a analizar la muestra para detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA con el método objeto de la invención. Para ello, se prepara la matriz de reacción conforme a la descripción del ejemplo 3 usando el reactivo del ejemplo 2. Se realiza el pretratamiento de la muestra (en este caso, plasma) según el ejemplo 4 y la reacción inmunoquímica conforme al ejemplo 5 y se procede a detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA siguiendo los ejemplos 6 y 7 de la técnica descritos anteriormente. La determinación se lleva a cabo por duplicado empleando como controles las muestras de 3 personas sanas (controles negativos) y 1 paciente anti-VHC positivo por ELISA comercial (control positivo) obtenidas y procesadas según lo descrito en los ejemplos 1, 4 y 5. Al medir la reacción se obtienen los siguientes resultados:
- Los controles negativos dan valores promedio de 0,057, 0,063 y 0,068 unidades de absorbancia a 405/620 nm; el valor promedio de los 3 controles negativos es 0,062 unidades de absorbancia a 405/620 nm y la desviación estándar calculada es 0,0057.
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- El valor promedio del control positivo es 0,715 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
- Se establece el valor de corte entre resultado NEGATIVO y POSITIVO (valor "cut-off" del ensayo) como la suma del valor promedio de los 3 controles negativos más cinco veces la desviación estándar del valor promedio.
El valor "cut-off" del ensayo resulta ser de 0,091 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
Paciente Nº 3:
Paciente (hombre) que debido a su enfermedad renal crónica lleva sometiéndose desde hace más de 12 meses a hemodiálisis. Periódicamente se realiza controles analíticos y presenta valores anómalos de enzimas hepáticas.
- El plasma del paciente Nº.3 da valores de absorbancia a 405/620 nm de 0,163 y 0,143 unidades; el valor promedio de la muestra del paciente Nº.3 es de 0,153 unidades de absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off" del ensayo, el valor promedio de la muestra del paciente Nº.3 resulta ser mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el plasma analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
Paciente Nº 4:
Paciente (hombre) que debido a su enfermedad renal crónica (ERC) lleva sometiéndose desde hace más de 12 meses a hemodiálisis. Recibe transfusiones de sangre debido a la anemia asociada a ERC. En un control analítico presenta valores anómalos de enzimas hepáticas.
- El plasma del paciente Nº.4 da valores de absorbancia a 405/620 nm de 0,092 y 0,094 unidades; el valor promedio de la muestra del paciente Nº.4 es de 0,093 unidades de absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off" del ensayo, el valor promedio de la muestra del paciente Nº.4 resulta ser mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el plasma analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
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Ejemplo 10
Otras poblaciones con riesgo potencial de infección oculta por VHC Establecimiento del valor "cut-off":
Se obtienen las muestras de personas con riesgo potencial de infección oculta por VHC (por ejemplo, familiares de pacientes con infección oculta por VHC) según el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se procede a analizar la muestra para detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA con el método objeto de la invención. Para ello, se prepara la matriz de reacción conforme a la descripción del ejemplo 3 usando el reactivo del ejemplo 2. Se realiza el pretratamiento de la muestra (en este caso, suero) según el ejemplo 4 y la reacción inmunoquímica conforme al ejemplo 5 y se procede a detectar la presencia de anti-VHC mediante ELISA siguiendo los ejemplos 6 y 7 de la técnica descritos anteriormente. La determinación se lleva a cabo por duplicado empleando como controles las muestras de 3 personas sanas (controles negativos) y 1 paciente anti-VHC positivo por ELISA comercial (control positivo) obtenidas y procesadas según lo descrito en los ejemplos 1, 4 y 5. Al medir la reacción se obtienen los siguientes resultados:
- Los controles negativos dan valores promedio de 0,046, 0,050 y 0,047 unidades de absorbancia a 405/620 nm; el valor promedio de los 3 controles negativos es 0,048 unidades de absorbancia a 405/620 nm y la desviación estándar calculada es 0,0025.
- El valor promedio del control positivo es 1,466 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
- Se establece el valor de corte entre resultado NEGATIVO y POSITIVO (valor "cut-off" del ensayo) como la suma del valor promedio de los 3 controles negativos más cinco veces la desviación estándar del valor promedio.
- El valor "cut-off" del ensayo resulta ser de 0,060 unidades de absorbancia a 405/620 nm.
Paciente Nº 5:
Familiar (hermana) de paciente (hombre) diagnosticado de infección oculta por VHC genotipo 1b y hepatitis crónica lobulillar leve, que acude a consulta para revisión médica y control analítico.
- La muestra de suero Nº.5 da valores de absorbancia a 405/620 nm de 0,169 y 0,173 unidades; el valor promedio de la muestra Nº.5 es de 0,171 unidades de absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off" del ensayo, el valor promedio de la muestra Nº.5 resulta ser mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el suero analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
Paciente Nº 6:
Familiar (cónyuge) de paciente (hombre) diagnosticado de infección oculta por VHC genotipo 1, que acude a consulta para revisión médica y control analítico.
- La muestra de suero Nº. 6 da valores de absorbancia a 405/620 nm de 0,111 y 0,112 unidades; el valor promedio de la muestra Nº. 6 es de 0,112 unidades de absorbancia a 405/620 nm. Comparado con el valor "cut-off" del ensayo, el valor promedio de la muestra Nº. 6 resulta ser mayor, por lo que se le asigna un resultado POSITIVO: el suero analizado contiene anticuerpos anti-VHC.
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<110> FUNDACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LAS HEPATITIS VIRALES
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<120> MÉTODO ANALÍTICO PERFECCIONADO PARA LA DETECCIÓN DE HEPATITIS C OCULTA, APLICACIONES DEL MISMO Y SU CORRESPONDIENTE KIT DE DIAGNÓSTICO
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<130> FUNDACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LAS HEPATITIS VIRALES
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<160> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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<210> SEQ ID NO:l
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<211> 15
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<212> Péptido
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<213> Péptido sintético de la proteína Core del Virus de la Hepatitis C
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<220> Domain: 5-19
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<400> 1
2

Claims (13)

1. Un método para la detección de hepatitis C oculta, caracterizado porque comprende la realización de un inmunoensayo de cribaje sobre una muestra en el que se utiliza como antígeno un péptido de la proteína Core del VHC representado por la secuencia SEQ.ID.NO:l, y en el que dicha muestra está seleccionada entre:
- muestras de suero o plasma,
- muestras de fluidos producidos o secretados por células aisladas del paciente
- muestras de secreciones de tejidos o de órganos.
2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje está seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo fluorescente, uno quimioluminiscente o uno bioluminiscente.
3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque dichas muestras son de suero o plasma derivado de sangre periférica o proveniente de órganos del paciente.
4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un ELISA.
5. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje utiliza un antisuero marcado con un marcador isotópico.
6. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje utiliza un antisuero anti-IgG humana conjugado con un marcador no isotópico.
7. Un método según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho marcador no isotópico está seleccionado entre un fluoróforo, un cromóforo, una enzima o cualquier otra molécula que produzca un conjugado apto para el inmunoensayo.
8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho marcador no isotópico es la enzima peroxidasa de rábano, anti-IgG-HRP.
9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es un ELISA y porque utiliza un antisuero anti-IgG humana conjugado con la enzima peroxidasa de rábano, anti-IgG-HRP.
10. Un kit para la detección de la infección oculta de hepatitis C que comprende los componentes necesarios para realizar un inmunoensayo de cribaje, caracterizado porque utiliza muestras de suero o plasma de pacientes y porque el antígeno que utiliza dicho inmunoensayo de cribaje es un péptido representado por la SEQ.ID.NO:1.
11. Un kit según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje está seleccionado entre un ELISA, un radioinmunoensayo, un inmunoensayo fluorescente, uno quimioluminiscente o uno bioluminiscente.
12. Un kit según las reivindicaciones 10 ú 11, caracterizado porque dicho inmunoensayo de cribaje es un ELISA.
13. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque dicho inmunoensayo es un ELISA que utiliza un antisuero anti-IgG humana conjugado con la enzima peroxidasa de rábano, anti-IgG-HRP.
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