KR101561893B1 - 잠재 헤파타이티스 ｃ의 검출을 위한 개선된 분석 방법, 그 사용 및 대응하는 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잠재 헤파타이티스 C의 검출을 위한 개선된 분석 방법, 그 사용 및 대응하는 진단 키트에 관한 것이다. 분석 방법은 면역분석 기법에 기초하며, 잠재 헤파타이티스 C 검출을 위한 가장 적합한 수행조건이 밝혀졌다. 또한 본 발명은 상기 방법과 상호 보완적인 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명은 의약, 생체의학 연구 및 분석 기술 분야에서의 사용에 적합하다.
Description
본 발명은 헤파타이티스 C 바이러스(HCV)의 동정 및 검출의 기술분야에 해당한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기 바이러스 C의 검출을 위한 개선된 분석 방법 및 그 대응하는 진단 키트를 제공하며, 이는 특히, 현재의 표준 분석 방법을 이용한 혈청 또는 혈장 샘플에서는 검출될 수 없는, 소위 "잠재 HCV 감염"의 동정 및 검출에 있어서 유용하다.
HCV는 동물 바이러스의 플라비비리대(Flaviviridae ) 과 내의 헤파시바이러스(Hepacivirus ) 지너스의 멤버이다. HCV 게놈(이하 HCV-RNA)은 대략 9.4 킬로베이스(kb) 길이인 양극성의 단일쇄 RNA 분자로 구성된다. HCV 복제는 마이너스 쇄 RNA 체인의 합성을 통해서 발생하는 것으로 가정되고, 즉 바이러스의 게노믹 RNA의 분자에 보완적인 체인은, 차례대로, 게노믹 RNA의 신규 분자의 합성에 대해 몰드로서 작용한다. 간은 주요 HCV 감염에 대한 메인 표적 기관이지만, 이 바이러스는 잠재적으로 인간의 세포, 조직 또는 기관의 어떠한 형태로 감염될 수 있다.
현재, 혈청 또는 플라즈마 샘플에서 HCV 항원(이하, 안티-HCV) 또는 HCV-RNA에 대한 항체를 감지함으로써 환자에게서 HCV 감염을 진단하는 어려움을 없게 하는 기술이 있다.
그러나, "세로로지컬리 사일런트(serologically silent)" 특성이 있는, 최근에 기재된 HCV 감염의 형태에 있어서, 감염된 환자는 혈청 또는 플라즈마(이하 잠재성 감염)에서 상용 검출 키트의 결과 안티-HCV 또는 HCV-RNA에서 양성 결과를 일으키지 않는다.
환자의 이런 형태에 대한 일반적인 프로필은 간장 효소의 이상적으로 고레벨을 의미하는 연장된 시간에 대해 간장 기능 시험에서 이상 결과의 사람이다. 간질환의 알려진 원인의 모두 또는 대부분은 이러한 환자에서 평가되고, 임상의 또는 역학의 데이터 어느쪽의 분석에 의거하며, 예를 들면: 간염 B 바이러스에 의한 간염(환자는 혈청 간염 B 표면 항원 및 HBV-DNA에 음성이었음), HCV(환자는 혈청 안티-HCV 및 HCV-RNA에 음성이었음), 만성 자기 간염, 알코올 간염, 길버트 신드롬, 단즙성간경변뿐만 아니라 자기 면역, 대사 및 알코올 소비, 약품, 의약품, 이식, 문신, 바디 피어싱, 부주의한 성적인 행동 등의 간장 장애의 위험 요소와 함께의 유전성 진환.
따라서, 우리는 현재 분석적인 방법이 설명할 수 없는 변경된 간장 기능의 개체를 처리하고, 원인은 간염 C 바이러스의 특정 형태에 의해 잠재성 감염일 수 있다. 이 감염은 현재의 방법에 의해 신속하고, 효과적이고, 안전하게 진단하는 것이 불가능하기 때문에, 감염의 이런 형태는 매우 중요한 결과를 갖는다:
- 무엇보다도, 환자의 관점으로부터 이러한 환자는 현재 분석적인 방법을 사용하는 혈청 또는 플라즈마에서 검출될 수 있는 질병을 가진 환자와 비교하여 완전히 불리하고, 전문 의사가 그들의 특정한 조건을 연구하고, 그들에게 가장 적절한 치료를 제공할 수 있다.
- 두 번째로, 보균자와 전문가의 양쪽의 그러한 질병에 지식의 부족으로부터의 결과인 질병의 역학 및 유포의 관점으로부터이다. 그러므로, 간염 C 바이러스의 잠재성 형태로 감염된 환자는 혈청이 아닌 그들의 말초혈의 단핵 세포에서 HCV-RNA를 운반하고, 혈액과 기관 기증, 혈액 투석, 등에 대해 고려될 수 있기 때문에 의심되는 것 없이 감염될 수 있다. 반면에, 질병의 지식은 전문가가 기본 안전 방법으로 환자에게 충고하게 하여 통상의 범위에서 바람직하지 않은 감염을 방지할 수 있다.
이 기술 분야에서, 연구자들은 그 결과의 신뢰도 때문에 통상의 임상 검사로서 면역 생물학을 이용한다. 특히, 효소 면역 측정법(EIA)은 짧은 시간에 체액 샘플의 큰 양을 처리하게 하여 간단하며 재생산할 수 있고, 객관적인 방법 때문에 공통으로 이용되는 시험이다.
혈액에서 안티-HCV를 결정하기 위해 현재 존재하는 상업적인 면역 생물학이 있다. 이들 EIA는 HCV의 구조상(코어 및 외피) 및 비-구조상의(NS) 단백질에 대해서 항체를 검출한다. 반면에, 혈액에서 안티-HCV를 결정하기 위한 상업적인 EIA의 감도는 HCV 항원이 고체 상태로 코팅함에 따라 다르고, 이것은 개개의 또는 융합 단백질, 또는 펩티드 파편이다.
인간 혈청 또는 플라즈마에서 안티-HCV의 검출을 위해 상업적인 EIA는 다음 활동 성분을 포함한다:
- 고체 상태(예를 들면, 마이크로플레이트 웰)는 HCV 항원의 혼합물과 코팅된다: 코어 및/또는 E2/NS1 및/또는 NS3 및/또는 NS4 및/또는 NS5. 시장에서 대부분의 EIA는 적어도 NS3 및 NS4 코어 항원을 포함한다.
- 반응을 위한 음극 및 양극 컨트롤
- 샘플 희석제,
- 세척 용액,
- 활용 희석제,
- 활용,
- 기질 완충 및/또는 기질 용액,
- 스토퍼 용액.
안티-HCV를 검출하기 위한 상업적인 EIA 방법의 행동의 기술 분야는 HCV에 의한 "통상적인" 감염이다. 이들 EIA는 EIA 스크리닝(screening)으로 불리고, HCV와 접촉할 수 있는 개개의 샘플의 개체 샘플을 스크린하기 위해 이용되고, 통상적인 HCV 감염으로 환자에게 100%에 가까운 특이성과 분석적인 감도에 관하여 증명된 효과나 99% 또는 이상을 나타낸다.
상업적인 EIA 방법의 특이성은 자발적인 혈액 기증자, 건강 전문가, 교도소 노동자 또는 군대 직원 등의 주제의 면역응답성 그룹에서 감소한다. 유사하게, 그들의 감도는 면역응답성 개인[information from the Centre for Disease Control and Prevention of Atlanta, USA, according to its publication: Morbidity and Mortality Weekly Report 2003;52(No.RR-3):1-13]에서 내려간다.
이미 면역 측정 기술이 매우 잘 확립된 프로토콜이지만, 그 분야에서 어떤 전문가도 각 특정한 항원 또는 항체의 특정한 결정이 각 경우에 대해서 적절한 작업 조건과 약품제를 찾기 위해 특정한 조사 노력을 요구한다는 것을 안다. 이전을 참조함으로써 우리는 안티-HCV를 결정하기 위해 EIA 방법을 사용하는 출판물 리스트를 제공한다.
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구체적으로, 리스트로부터 출판물 (5), (6), (7), (8), (9), (10) 및 (16)은 통상적인 HCV 감염의 다른 임상의 환경에서 안티-HCV 결정에서 코어 항원의 이용을 참조한다. 이러한 출판물에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 다른 크기의 코어 단백질 또는 펩티드는 안티-코어 HCV 항체를 검출하기 위해 이용된다.
실시예와 같이, 참조 문헌 (5)는 EIA를 이용하는 안티-HCV를 검출하게 하는 종합적인 코어 펩티드(5-23)의 이용을 기재한다.
출판물 (6)과 (7) 및 다른 관련된 출판물은 HCV 코어 단백질(아미노 산 1 ~ 190을 포함함)의 항원 영역의 분석을 실행하여 HCV에 의해 "통상적인" 감염에서 면역성 응답에 특징을 이루는 종합적인 펩티드를 이용하는 면역우성 영역을 확인한다. 구체적으로: 1) 펩티드는 코어 단백질의 아미노 터미널(amino terminal)의 아미노 산(1-17)을 포함하는 것이 확인된다; 2) 아미노 산(9-16)의 연속으로 메인 항원 영역이 위치된다; 3) 안티-HCV IgG 항체는 상업적인 EIA 키트로 검출가능한 안티-HCV와 함께 환자로부터 세라(sera)의 83%에서 코어 펩티드를 사용하는 EIA에 의해 검출된다.
반면에, 참조 문헌 (16)과 다른 관련된 출판물은 유전자형(1a)을 갖는 종합적인 코어 단백질 펩티드와 안티-HCV를 검출하기 위해 HCV 항원의 것의 이용의 양쪽을 기재한다. 아미노 산(1-18, 10-24, 11-28 1-30, 10-43)과 다른 것의 연속과 함께 HCV 코어 펩티드의 이용은 EIA에 의해 안티-HCV의 검출의 다른 퍼센티지로 생산된다. 실시예와 같이, 각 펩티드를 사용하는 HCV 유전자형 1(상업적인 EIA에 의해 결과로 양성 안티와 함께)에 의해 통상적인 감염과 함께 환자의 세라에서 안티-HCV의 검출의 퍼센티지는 다음과 같았다: 코어(1-18)를 갖는 78%; 코어(10-24)를 갖는 89%; 코어(11-28)를 갖는 85%; 코어(1-30)를 갖는 93%; 코어(10-43)를 갖는 100%. 이 출판물은 상업적인 EIA를 이용하는 안티-HCV에 음성의 주제로 안티-코어 항체의 결정에 데이터를 제공하지 않는다.
본 발명을 개발한 연구팀은 혈액(혈청 또는 플라즈마)과 인간 세포 배양의 초자연 양쪽의 HCV의 그들의 결정에 대해 근년의 면역 측정을 사용하였다. 혈청 또는 플라즈마 샘플에서 그리고 다음 참조 문헌에서 기재된 결과로서 세포 배양의 상청액의 샘플에서 HCV의 분석적인 결정을 위해 면역 측정이 이용했다.
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(5) Quiroga JA, et al. J Clin Microbiol 2006;44:4559-4560.
상업적인 EIA는 by HCV에 의해 "통상적인" 감염에서 안티-HCV를 검출할 수 있지만, 그들은 질병의 "잠재성" 다양함으로 연구(즉, 그들은 음성 결과를 생산함)하지 않았다. 상업적인 EIA는 안티-HCV의 트레이스(trace) 양을 검출하기에 충분히 민감하지 않을 것이다. 그들이 정확하게 연구하지 않았을 이유는 안티-HCV의 트레이스 양의 검출을 간섭하고 방해하였을 것이다.
이러한 문제를 풀기 위해 우리는 일부의 개량과 변경 적용을 했다.
따라서, 우리는 HCV(상업적인 EIA의 결과인 음성 안티-HCV: Ortho HCV 3.0 ELISA, Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ, USA; 및 INNOTEST HCV Ab IV, Innogenetics, Gante, Belgium)에 의해 잠재성 감염이 진단된 환자들로부터 혈청 샘플에 MONOLISAR HCV Ag-Ab ULTRA assay(Bio-Rad Laboratories, Marnes-la-Coquette, France)을 사용하는 안티-HCV의 존재를 결정했다. MONOLISAR HCV Ag-Ab ULTRA assay는 HCV[Quiroga JA, et al. J Clin Microbiol 2006;44:4559-4560]에 의해 잠재성 감염을 갖는 1 환자의 혈청에서 안티-VHC의 존재를 검출할 수만 있었다.
이 데이터는 안티-HCV 검출에 대해 대안이 연구되지 않은 것을 나타낸다.
상기로부터 감염이 의심되는 환자로부터 잠재성 HCV 감염의 존재를 결정하기 위해 빠르고, 안전하고, 및 효과적인 방법이 필요한 것이 추론될 수 있다. 잠재성 HCV 감염을 확인하기 위한 골드 스탠다드(gold standard) 방법은 간 조직의 생검법으로부터 HCV-RNA 검출이다.
이와 관련해서, 스페인 특허 제 200303050 호에 간 조직에서 HCV-RNA를 검출하는 시투 하이브리디세이션(situ hybridisation)에 의거한 분석적인 방법이 기재되어 있고, 그러므로 혈청 또는 플라즈마 샘플에 검출될 수 없는 표준 분석적인 방법을 사용하는 잠재성 HCV 감염을 확인한다.
그럼에도 불구하고, 생검법은 항상 실행될 수 없는 침입성 방법이므로 환자에 대해 위험과 관련있다. 그러므로, 간단하고 민감한 방법은 혈액 샘플로부터 잠재성 HCV 감염을 진단하는 것이 요구된다.
연구자들은 잠재성 HCV 감염을 진단하기 위해 면역 측정 프로토콜[예를 들면, 면역화학 반응, 형태 및 공역(conjugate) 항혈청, 반응하기 위해 면역 화학 반응에 대한 시간 필요, 등에 앞서 반응 메트릭스의 준비 방법, 샘플의 전처리]의 강도의 파라미터를 결정하기 위한 연구를 증강한다.
본 발명의 분석방법은 기존의 EIA 시험법의 감도를 증가시키고, 혈청학적 진단을 향상시키며, 잠재 HCV 감염을 밝혀내는데 유용하다.
도 1은 HCV 코어 아미노산 서열 1 내지 120 위치의 정렬을 나타낸다. 6 메인 서열 사이의 공통 서열은 공통 라인(Consensus line)으로 표시된다; SEQ.ID.NO:1에 해당하는 영역은 음영처리되는 반면, 서열 SEQ.ID.NO:2 및 SEQ.ID.NO:3에 해당하는 영역은 밑줄처리된다. 나타낸 서열의 GenBank 등록번호(accession number)는: AF009606, subtype 1a; AF165064, subtype 1b; AB047639, subtype 2a; AY232749, subtype 2b; D17763, subtype 3a; Y11604, subtype 4a; Y13184, subtype 5a; Y12083, subtype 6a.
본 발명은, 그 명칭에서 기재된 바와 같이, 잠재 헤파타이티스 C의 검출을 위한 개선된 분석 방법, 그 분석 방법의 적용 및 그 대응하는 진단 키트에 관한 것이다.
구체적으로, 이는 스크리팅 면역분석법에 관한 것이다. 이것의 바람직한 실시예는 ELISA, 방사면역분석(radioimmunoassay), 또는 형광(fluorescent), 화학발광(chemiluminescent) 혹은 생물발광(bioluminescent) 면역분석 중에서 선택되는 면역분석이다.
잠재 헤파타이티스 C의 검출을 위한 상기 스크리닝 면역분석은 말초혈 혹은 기관, 단리된 세포에 의해 생성 또는 분비된 액(fluids), 혹은 조직 또는 기관의 분비물(secretions), 혹은 기관의 혈액 또는 액(fluids) 유래의 혈청 또는 혈장 샘플을 사용한다.
본 발명의 바람직한 실시예는 SEQ.ID.NO:1의 서열에 해당하는 HCV 코어 단백질의 펩티드를 사용하는 잠재 헤파타이티스 C 검출용 스크리닝 면역분석으로 이루어진다.
특히 실시예는 SEQ.ID.NO.1 뿐만 아니라 SEQ.ID.NO.2에 해당하는 추가적 서열을 사용한다.
특히 실시예는 SEQ.ID.NO.1 뿐만 아니라 SEQ.ID.NO.3에 해당하는 추가적 서열을 사용한다.
특히 실시예는 SEQ.ID.NO.1 뿐만 아니라 SEQ.ID.NO.2 및 SEQ.ID.No.3의 두개의 추가적 서열을 사용한다.
본 발명의 바람직한 면역분석은 SEQ.ID.NO.1, 두 서열 SEQ.ID.NO.1 및 SEQ.ID.NO.2의 조합, 두 서열 SEQ.ID.NO.1 및 SEQ.ID.NO.3의 조합, 그리고 세 서열 SEQ.ID.NO.1, SEQ.ID.NO.2 및 SEQ.ID.NO.3의 조합으로 표시되는 펩티드를 항원으로 사용하는 ELISA 이다.
한편, 연구자들에 의해 수행된 다른 분석에 있어서, SEQ.ID.NO.1로 표시되는 것 이외에 20개 아미노산의 서열을 갖는 코어 단백질의 다른 펩티드도 항원 기능성을 나타내는 것이 관찰되었다. 그러나, 항-HCV 검출 감도가 본 발명의 바람직한 실시예인 15개 아미노산 펩티드를 사용한 것보다 낮았다.
서열 태그 SEQ.ID.NO.2를 갖는 펩티드를 항원으로서 사용하는 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 유전자형 1, 3 및 4의 전형적 HCV 감염 환자(상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 양성 결과인) 100%의 혈청에서 항-HCV IgG 코어가 EIA에 의해 검출된다. 신규한 적용은 잠재 HCV 감염 환자 15%의 혈청에서 또한 항-HCV IgG 코어를 검출한다.
서열 태그 SEQ.ID.NO.3을 갖는 펩티드를 항원으로서 사용하는 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 유전자형 1, 3 및 4의 전형적 HCV 감염 환자(상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 양성 결과인) 75%의 혈청에서 항-HCV IgG 코어가 EIA에 의해 검출된다. 신규한 적용은 잠재 HCV 감염 환자 25%의 혈청에서 또한 항-HCV IgG 코어를 검출한다는 것이다.
서열 태그 SEQ.ID.NO.1, SEQ.ID.NO.2 및 SEQ.ID.NO.3을 갖는 펩티드를 사용하는 본 발명의 실시예는, 유전자형 1, 3 및 4의 전형적 HCV 감염 환자(상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 양성 결과인) 100%의 혈청에서 항-HCV IgG 코어를 EIA에 의해 검출한다. 신규한 적용은 유전자형 1을 갖는 잠재 HCV 감염 환자(즉, 상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 음성 결과인) 25%의 혈청에서도 항-HCV IgG 코어를 검출한다는 것이다. 따라서 본 발명의 분석방법 주체는 기존의 EIA 시험법의 감도를 증가시키고, 혈청학적 진단을 향상시키며, 잠재 HCV 감염을 밝혀내는데 유용하다고 할 수 있다.
그러한 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 스크리닝 면역분석을 위한 항원으로서 서열 태그 SEQ.ID.NO.1를 갖는 펩티드, 그리고 적어도 SEQ.ID.NO.2 및/또는 SEQ.ID.NO.3의 서열을 갖는 다른 펩티드를 사용한다.
이 서열 태그 SEQ.ID.NO.1를 갖는 서열의 보다 바람직한 실시예는 유전자형 1의 전형적 HCV 감염 환자(상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 양성 결과인) 98%의 혈청에서 항-HCV IgG 코어를 EIA에 의해 검출한다. 신규한 적용은, 이는 잠재 HCV 감염 환자(즉, 상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 음성 결과인) 40%의 혈청에서 또한 항-HCV IgG 코어를 검출한다는 것이다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 분석방법 주체는 기존의 EIA 시험법의 감도를 증가시키고 혈청학적 진단을 향상시키고 잠재 HCV 감염을 밝혀내는데 유용하다고 말할 수 있다.
따라서, 잠재 HCV 감염의 잠재적 위험이 있는 다른 인구들에 있어서, 상용 EIA 시험법을 사용하여 항-HCV 음성결과를 나타냈던 잠재 HCV 감염 환자의 친척들 27% 그리고 전형적 HCV 감염 환자의 친척들 35%의 혈청에서 항-HCV IgG 코어가 검출된다. 즉, 상용 항-HCV 스크리닝법에 비해, 항-HCV IgG 코어 측정은 HCV에 대한 노출여부, HCV 감염된 환자의 친척들 간의 전염여부를 결정할 수 있게 한다.
한편, 유전자형 1b 외에는 잠재 HCV 감염으로 기재된 바 없지만, 본 발명의 방법 주체는 유전자형 1 외의 유전자형을 갖는 케이스뿐만 아니라 유전자형 1(1b 또는 1a)의 전형적 HCV 감염 환자의 혈청 또는 혈장 내 항-HCV IgG 코어 항체를 검출할 수 있다. 서열 태그 SEQ.ID.NO:1를 갖는 서열은 다른 더 긴 서열에 대해 몇가지 장점이 있다: 펩티드의 아미노산 서열의 4 및 20 위치를 생략할때, 유전자형 2b, 3, 4 및 6(도 1 참조)에 존재하는, 바로 앞 및 뒤에 몇몇 가변 위치 또한 제외되고, 따라서 SEQ.ID.NO:1은 서로다른 HCV 유전자형 1 내지 6 중에서 보존된다(도 1의 공통 라인 참조). HCV 시약으로서 SEQ.ID.NO:1을 사용할 때 항-HCV IgG 코어 검출의 유전자형 의존성은 제거된다(실시예 2에 서술),(참조문헌 No.16의 저자에 의해 인지된 바와 같이, 특히 위치 4에 기인함).
한편, 본 발명자들의 다른 실험에서, 코어 단백질의 아민 말단 유래의 6 내지 10 아미노산의 서열을 갖는 더 짧은 펩티드가 항원 기능성을 나타내는 것을 발견했다. 그러나 항-HCV 검출 감도가 본 발명의 바람직한 실시예인 15 아미노산 펩티드를 사용한 것보다 낮았다.
본 발명의 또 다른 실시예는 서열 태그 SEQ.ID.NO:1을 갖는 펩티드의 NH-말단 유래의 적어도 6개의 상관(correlative) 아미노산을 갖는 펩티드를 스크리닝 면역분석의 항원으로서 사용한다.
본 기술분야에서 발견된 선택에 따르면, 본 면역분석은 동위원소(isotopic) 또는 비-동위원소 트레이서(non-isotopic tracer)로 표지된 항혈청을 사용할 수 있다. 후자 중에서, 본 발명의 바람직한 실시예는 형광단, 발색단, 면역분석 시험에 적합한 복합체를 생성하는 효소 또는 기타 분자의 사용을 포함한다. 더욱 바람직한 실시예는 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase enzyme)와 접합하는 항-인간 IgG 항체를 사용한다(항-IgG-HRP).
본 발명은 또한 잠재 헤파타이티스 C의 검출을 위한 상기 분석 방법의 실행을 위한 진단 키트를 대상으로 한다. 구체적으로, 상기 키트는, 반응 매트릭스, 시약, HCV, 중지제(Stopping agent), 샘플 희석제(Sample diluent), 세정 용액(Washout solution), 컨쥬게이트 용액(Conjugate solution) 및 면역화학 반응 전개를 위한 시약 등 실시되는 스크리닝 면역분석의 필수 성분을 포함한다.
구체적으로, 이 키트로 수행되는 스크리닝 면역분석은 ELISA, 방사면역분석, 형광, 화학발광 혹은 생물발광 면역분석 중에서 선택된다.
잠재 헤파타이티스 C 검출을 위한 상기 키트에 포함되는 상기 스크리닝 면역분석은 말초혈 또는 기관 유래의 혈청 또는 혈장 샘플, 혹은 단리된 세포에 의해 생성 또는 분비된 유체(fluids), 혹은 조직 또는 기관 유래 분비물(secretions), 혹은 기관 유래 혈액 또는 유체를 사용한다.
본 진단 키트의 바람직한 실시예는 SEQ.ID.NO:1에 해당하는 서열을 갖는 펩티드를 사용한다.
추가적인 특정 실시예는 SEQ.ID.NO.1 뿐만 아니라 SEQ.ID.NO.2에 해당하는 추가적 서열을 사용한다.
이 진단 키트의 추가적인 특정 실시예는 SEQ.ID.NO.1 뿐만 아니라 SEQ.ID.NO.3에 해당하는 추가적 서열을 사용한다.
이 진단 키트의 추가적인 특정 실시예는 SEQ.ID.NO.1 뿐만 아니라 SEQ.ID.NO.2 및 SEQ.ID.No.3에 해당하는 두개의 추가적 서열을 사용한다.
면역분석에 기초한 본 발명의 분석 방법은 하기 도표로 요약될 수 있다:
본 방법의 도표
시약 및 반응 매트릭스의 준비
↓
샘플의 전처리
↓
항원-항체 면역화학 반응
↓
세척
↓
반응검출
↓
세척
↓
반응 전개
↓
반응 측정
본 발명의 분석 방법은 특히 잠재 감염에서 항-HCV의 검출을 위한 것이므로, 본 발명의 목적인 개선된 분석 방법을 달성하기 위해서는, 이러한 특정 케이스를 위해 일반적인 방법의 서로 다른 단계를 최적화할 필요가 있다.
고체상 면역분석이 기초하는 면역화학 반응은 개별 샘플을 위한 작은 셀(cells) 또는 웰(wells), 튜브(tubes), 스피어(spheres), 스트립(strips) 또는 그 조합으로 구획되는 마이크로플레이트(microplate)가 될 수 있는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐, 폴리카보네이트, 셀룰로오스 등의 유기 재료의 반응 매트릭스(reaction matrix) 또는 지지체(support)에서 이루어진다.
본 방법의 타겟 분자는 헤파타이티스 C 바이러스 구조 코어 단백질의 특정 항-HCV 항체이다. 이러한 타겟 분자를 포함하는 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플일 수 있다. 이러한 샘플은 시중의 상용 방법을 사용시 항-HCV 또는 HCV-RNA 항체가 혈청 또는 혈장에서 검출되지 않으나 혈액 중 간 효소 수치가 비정상적으로 지속되는 환자로부터 채취할 것이다.
상기 샘플은 통상적으로 환자로부터 추출된 혈액으로부터 얻어진다.
하기 실시예는 본 발명의 방법에 대해 설명하나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1. 샘플의 획득
혈청 또는 혈장 샘플은 혈장을 획득하기 위해 또는 혈청을 획득하도록 설계되거나 항응혈성[리튬 헤파린(lithium heparin) 170 IU]을 포함하도록 저부에 겔과 함께 적절한 장치를 사용함으로써 정맥 혈액의 10 ml를 추출하고 Vacutainer® 형태(Beckton-Dikinson, Plymouth, UK)의 유리관에서 혈액를 추출함으로써 획득된다.
이어서, 혈액은 1.0R Heraeus Megafuge centrifuge(Heraeus, Osterode, Germany)에서 주위 온도(20℃과 25℃ 사이)로 1,200 x g로 20분간 원심분리된다. 혈청 또는 혈장을 포함하는 상층이 분리되고, 이것의 약 1㎖는 사용시까지 -20℃에서 혈청 또는 혈장을 저장하기에 적합한 캡이 있는 폴리스티렌 튜브에 배치된다.
실시예2
.
HCV
시약 취득
본 발명의 방법 오브젝트에 사용된 시약 HCV는 HCV 코어 단백질의 N-말단(terminal end)의 아미노산 5 내지 19를 포함하는 SEQ.ID.NO:1의 서열을 가진 합성 펜타데카펩티드(synthetic pentadecapeptide)(이하, 코어 펩티드 5-19)이다. 코어 펩티드 5-19는 GeneScript Corporation(Scotch Plains, NJ, USA)에 의해 합성된다. 동결 건조된 코어 펩티드 5-19는 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법에 의해 수행되는 분석에 따르면 순도 93.8%의 단백질 7㎎을 포함한다. 동결 건조된 코어 펩티드 5-19는 1㎎/㎖의 농도를 얻기 위해 초고순도의 H2O(Milli-Q; Millipore, Molsheim, France)에 용해되고; 이것은 캡(cap)을 갖는 살균된 1㎖ 캡폴리프로필렌 튜브에 220㎕의 분취량(aliquots)으로 분할되고, 사용시까지 -20℃의 온도로 저장된다.
실시예3
. 반응 매트릭스의 준비(고체상)
고체상은 캡이 없는 플랫 보톰(flat bottom), 살균, 96-웰 EIA 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(96-well EIA polystyrene microtitre plate)(Costar, Cambridge, MA, USA)로 구성된다. 반응 매트릭스를 준비하기 위해 실시예2에 기재된 코어 펩티드 5-19의 분취량을 4℃까지 녹인다. 4℃까지 미리 냉각되고, pH 9.6에서 0.1M 버퍼링된 탄산 나트륨 용액 10.89㎖와 함께 재구성된 코어 펩티드 5-19의 110㎕를 혼합함으로써 10㎍/㎖의 농도를 가진 시약 용액을 준비한다. 10㎍/㎖ 코어 펩티드 5-19 용액의 100㎕를 각 웰에 배치하고, 교반하지 않고 S-1000-2 냉장고(Azkoyen, Madrid, Spain)에서 4℃의 온도에서 18시간 동안 인큐베이팅한다. 인큐베이션 기간의 마지막에 0.05%의 폴리옥시에틸렌-(20)-소르비탄 모노라우레이트(Tween-20®/Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)가 첨가된 pH7.4에서 0.1M의 인산 나트륨 버퍼로 이루어진 200㎕의 세척 용액으로 각 웰을 두번 세척한다. 마지막 세척이 완료되면 흡착지상으로 플레이트를 거꾸로 돌림으로써 남은 세척 용액을 제거한다. 이어서, pH7.4로 버퍼링된 인산 나트륨 및 인산 칼륨 0.1M으로 이루어지고, 10%의 우태아 혈청(foetal bovine serum)(Sera Laboratories Internation Ltd., West Sussex, UK)이 첨가되고, 30분간 56℃로 가열하고, 이어서 0.05%의 Tween-20®이 첨가되고, Heraeus I-42 인큐베이터에서 60분간 37℃에서 전체를 인큐베이팅함으로써 비활성화된 150㎕의 차단제를 첨가한다. 플레이트를 거꾸로 돌림으로써 인큐베이션 기간의 마지막에 남은 차단제를 제거한다. 200㎕의 세척 용액으로 각 웰을 두번 세척한다. 마지막 세척이 종료되면 흡착지상으로 플레이트를 거꾸로 돌림으로써 남은 세척 용액을 제거한다. 이번 스테이지의 마지막에 반응 매트릭스가 샘플과의 인큐베이션을 위해 준비된다.
실시예3의 변형예1
제 1 옵션은 반응 매트릭스를 준비하기 위해 각각 SEQ.ID.NO:1, SEQ.ID.NO:2, 및 SEQ.ID.NO:3을 사용하여 동시 판정을 수행하는데 있다(본 출원의 실시예3). "100㎕의 10㎍/㎖ 코어 펩티드 5-19 용액이 각 웰이 배치되고, 4℃의 온도에서 18시간 동안 인큐베이팅되는 것"; 또는 "100㎕의 10㎍/㎖ 코어 펩티드 21-40 용액이 각 웰이 배치되고, 4℃의 온도에서 18시간 동안 인큐베이팅되는 것"; 또는 "100㎕의 10㎍/㎖ 코어 펩티드 101-120 용액이 각 웰이 배치되고, 4℃의 온도에서 18시간 동안 인큐베이팅되는 것"이다. 플레이트 웰(plate wells)은 펩티드 중 하나에 의해 코팅되거나, 또는 두개의 펩티드를 사용하여 각 펩티드로 플레이트 웰을 반씩 코팅하거나, 또는 세개의 펩티드를 사용하여 각 펩티드로 플레이트 웰의 1/3씩 코팅함으로써 코팅될 수 있다. 상기 방법의 나머지는 동일하다.
실시예3의 변형예2
제 2 옵션은 반응 매트릭스를 준비하기 위해 서열 태그 SEQ.ID.NO:1, SEQ.ID.NO:2, 및 SEQ.ID.NO:3를 갖는 펩티드를 결합함으로써 본 발명을 수행하는데 있다(본 출원의 실시예3). SEQ.ID.NO:1과 SEQ.ID.NO:2에 대응하는 서열을 갖는 두개의 펩티드의 혼합 용액, SEQ.ID.NO:1과 SEQ.ID.NO:3의 혼합 용액, 또는 SEQ.ID.NO:1, SEQ.ID.NO:2, 및 SEQ.ID.NO:3의 혼합 용액의 100㎕를 플레이트 웰에 배치, 즉 예컨대, "10㎍/㎖ 코어 펩티드 5-19와 10㎍/㎖ 코어 펩티드 101-120의 혼합 용액의 100㎕가 각 웰에 배치되고, 4℃의 온도에서 18시간 동안 인큐베이팅되는 것" 등이다. 상기 방법의 나머지는 동일하다.
실시예4
. 샘플의 예비-처리
혈청 또는 혈장 샘플은 예비처리전에 그 콘텐츠를 호모제나이징(homogenising)하기 위해 튜브를 반복적으로 회전시켜서 -20℃로부터 주위 온도(20℃과 25℃ 사이)까지 녹인다. 이 예비처리는 가장 상용의 EIA 시험법의 프로토콜에서는 특정되지 않은 스텝이며 본 발명의 방법 오브젝트에 있어서의 중요한 스테이지이다. 이것은 항-HCV의 미량을 감출 수 있는 비특정 항원-항체 결합을 제거하기 위해 샘플 성분을 흡수하는 것이 목적인 인큐베이션에 특징이 있다. 50㎕의 혈청 또는 혈장 샘플은 1.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로튜브(Sarsted, Numbrecht, Germany)에 배치되고, 10%의 우태아 혈청(Sera Laboratories International Ltd.)과 0.05%의 Tween-20®(Sigma)가 보충된 pH 7.4의 0.1M 버퍼링된 인산 나트륨 및 인산 칼륨 용액 450㎕가 첨가된다. 혼합물은 Thermomixer 5436 인큐베이터(Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅된다.
실시예4bis
. 차단용 샘플의 예비-처리
혈청 또는 혈장 샘플은 예비처리전에 그 콘텐츠를 호모제나이징하기 위해 튜브를 반복적으로 회전시켜서 -20℃로부터 주위 온도(20℃과 25℃ 사이)까지 녹인다. 이 샘플 예비처리 변형예는 본 발명의 방법 오브젝트에 따른 항-HCV에 대한 디검출 특이성(detection specificity)을 입증한다. 이것은 샘플내의 특정 항-HCV 항체를 마스킹(masking)하여 실시예5에 기재된 면역화학 반응에 의해 HCV 시약에 결합하는 것을 차단하기 위해 비특이 항체-항원 펩티드 결합을 사용하여 샘플의 특정 항-HCV 항체를 마스킹하는 것이 목적인 인큐베이션에 특징이 있다. 50㎕의 혈청 또는 혈장 샘플은 1.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로튜브(Sarsted, Numbrecht, Germany)에 배치되고, 실시예2에 기재된 HCV 시약(SEQ.ID.NO:1의 서열을 갖는 합성 펜타데카펩티드)의 충분한 양(10㎍/㎖과 1000㎍/㎖ 사이)을 포함하지 않거나("비차단") 포함하고("차단"), 0.05%의 Tween-20®(Sigma)이 첨가되고 10%의 우태아 혈청(Sera Laboratories International Ltd.)이 보충된 pH 7.4의 0.1M 버퍼링된 인산 나트륨 및 인산 칼륨 용액 450㎕가 첨가된다. SEQ.ID.NO:1에 기재된 서열에 무관한 HCV 코어 단백질(도 1에 도시된 서열을 갖는 아미노산 21-40)의 다른 펩티드 시약은 대조군으로서 동일 조건하에서 사용된다. 혼합물은 Thermomixer 5436 인큐베이터(Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅된다.
실시예5
. 면역화학에서의 항원-항체 반응
상기 실시예에 따라 예비처리된 샘플(100㎕)은 반응 매트릭스의 웰에 첨가되고, 플레이트는 투명 시트("Plate Sealer", Perkin Elmer - Wallac, Turku, Finland)에 의해 커버링되고, Heraeus I-42 인튜베이터에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅된다. 인큐베이션이 종료되면 투명 시트를 제거하고, 200㎕의 세척 용액에 의해 각 웰을 5회 세척한다. 마지막 세척이 종료되면 흡수지상으로 플레이트를 거꾸로 회전함으로써 남은 세척 용액을 제거한다.
실시예6
.
결합된
항혈청의 준비
본 발명의 방법 오브젝트에 사용된 결합된 항혈청은 정상인 혈청으로부터 단리된 IgG와의 면역화에 의해 토끼로부터 취득되고 겨자무과산화효소(항-IgG-HRP: DakoCytomation A/S, Clostrup, Denmark)와 결합된 다클론성 항인간 면역글로블린 G(IgG) 항혈청이다. 결합된 항혈청은 1mg/mL의 농도와 pH7.2에서 0.05mmol/l Tris-HCl, 15mmol/l NaN3의 버퍼링된 용액내의 유체로서 공급된다. 이것은 사용시까지 4℃로 유지된다. 결합된 항혈청 용액을 준비하기 위해 11㎕의 항-IgG-HRP와 11㎖의 차단제 용액(실시예3에 기재됨)이 혼합되고, 이러한 타입의 EIA를 위해 최적인 1:1000 희석을 얻는다(Harlow D & Lane D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York; 1988: pp592). 항원-항체 면역화학 반응을 검출하기 위해 100㎕의 결합된 항혈청 용액이 반응의 각 웰에 첨가되고; 플레이트는 투명 시트("Plate Sealer", Perkin Elmer - Wallac)에 의해 커버링되고, Heraeus I-42 인큐베이터에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅된다. 인큐베이션이 종료되면 투명 시트가 제거되고, 200㎕의 세척 용액에 의해 각 웰이 5회 세척된다. 마지막 세척이 종료되면 흡수지상으로 플레이트를 거꾸로 회전함으로써 남은 세척 용액을 제거한다.
실시예7
. 반응 검출을 위한
디벨로퍼
본 발명의 방법 오브젝트는 전개 용액으로서 2.2'-아지노비스(aninobis)-(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄염(ABTS: Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용한다. ABTS는 산화시에 녹색으로 착색물을 생성하는 겨자무과산화효소의 발색 기질(chromogenic substrate)이다. ABTS는 레디-투-유즈 액체 용액(후속 준비가 불필요한)으로서 공급되고 사용시까지 4℃로 저장된다. ABTS 용액은 사용전에 실온(20℃와 25℃ 사이)으로 되어야 한다. ABTS 서브스트레이트(100㎕/웰)는 마이크로플레이트 웰에 첨가되고, Atom 85 교반기(Atom, Barcelona, Spain)에서 부드러운 교반에 의해 어둠(예컨대 알루미늄 호일 시트에 의해 전체 플레이트가 커버링)속에서 30분간 인큐베이팅된다. 선택적으로, 1% n-소듐 도데실 술페이트(1% n-sodium dodecyl sulphate)는 반응 중지 용액(Calbiochem-Biosciences Inc., La Jolla, CA, USA)(100㎕/웰)으로서 사용될 수 있다. 반응은 Whittaker Microplate Reader 2001(Anthos Labtec Instruments, Salzburg, Austria)에서 620㎚의 기준 파장에 의해 405㎚의 파장에서 측정된다. 녹색의 강도는 분석된 샘플에 존재하는 항-HCV의 양에 의존한다.
표준화된 환자에 있어서의
시험예
실시예8. 잠재 HCV 감염 환자
컷-오프값의 판정:
샘플은 실시예1에 기재된 방법에 따라 HCV 감염으로 진단된 환자로부터 취득된다. 이어서, 샘플은 본 발명의 방법 오브젝트에 의한 ELISA를 사용하여 항-HCV의 존재를 검출하기 위해 분석된다. 이것을 위해 반응 매트릭스는 실시예2의 시약을 사용하여 실시예3의 기재를 따라 준비된다. 샘플(이 경우에는 혈청)은 실시예4에 기재된 바와 같이 예비-처리되고, 면역화학 반응은 실시예5와 같이 수행되고, 항-HCV의 존재는 실시예6 및 실시예7에서 기재된 방법을 따라 ELISA를 사용하여 판정된다. 상기 판정은, 실시예1, 실시예4, 및 실시예5에 기재된 바와 같이 취득되고 처리되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 양성 결과를 나타내는 1명의 환자[양성 대조군(positive control)]와 3명의 건강한 사람[음성 대조군(negative controls)]의 샘플을 대조군으로서 사용하여 중복 수행된다. 이하의 결과는 반응 측정시에 취득된다:
- 음성 대조군은 405/620㎚에서 0.047, 0.055, 및 0.050 흡광도 단위(absorbance units)의 평균값을 제공하고; 상기 3개의 음성 대조군의 평균값은 405/620에서 0.051 흡광도 단위이고, 산출된 표준 편차는 0.004이다.
- 양성 대조군의 평균값은 405/620㎚에서 0.789 흡광도 단위이다.
- 음성 및 양성 결과간의 컷-오프값은 3개의 음성 대조군의 평균값과 평균값에 대한 표준 편차의 5배를 합산한 것으로서 판정(테스트 컷-오프값)된다.
- 테스트용 컷-오프값은 405/620㎚에서 0.071 흡광도 단위이다.
환자 No. 1
사무실에 있는 여성은 간 효소의 이상값으로 인한 환자이다. 전형적인 HCV 감염(항-HCV 및 HCV-RNA는 상용 방법에 의해 혈청에서 검출되지 않음)을 포함하는 간 질환의 공지된 원인은 배제된다. 간 검사(liver biopsy)는 유전자형 1 HCV-RNA의 존재를 입증하고, 이에 따라 잠재 HCV 감염이 진단되고, 간 병변이 검출된다(염증 활성을 갖는 간경변증).
- 환자 No. 1로부터의 혈청은 405/620㎚에서 0.166 및 0.172 단위의 흡광도값을 제공하고; 환자 No. 1로부터의 혈청에 대한 평균값은 405/620㎚에서 0.169 흡광도 단위이다. 환자 No. 1로부터의 혈청에 대한 평균값은 테스트용 컷-오프값보다 크고, 이에 따라 양성 결과가 부여된다: 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
환자 No. 2
사무실에 있는 남성은 간 효소의 이상값으로 인한 환자이다. 전형적인 HCV 감염(항-HCV 및 HCV-RNA는 상업적 방법에 의해 혈청에서 검출되지 않음)을 포함하는 간 질환의 공지된 원인은 배제된다. 간 검사(liver biopsy)는 유전자형 1b HCV-RNA의 존재를 입증하고, 이에 따라 잠재 HCV 감염이 진단되고, 간 병변이 검출된다[스테이지 2 섬유증(fibrosis)에 의한 문맥주위의 만성 간염].
- 환자 No. 2로부터의 혈청은 405/620㎚에서 0.102 및 0.107 단위의 흡광도값을 제공하고; 환자 No. 2로부터의 혈청에 대한 평균값은 405/620㎚에서 0.105 흡광도 단위이다. 환자 No. 2로부터의 샘플에 대한 평균값은 테스트용 컷-오프값보다 크고, 이에 따라 양성 결과가 부여된다: 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
실시예8bis. 잠재 HCV 감염 환자
- 환자 No. 2로부터의 혈청은 405/620㎚에서 0.102 및 0.107 단위의 흡광도값을 제공하고; 환자 No. 1로부터의 혈청에 대한 평균값은 405/620㎚에서 0.105 흡광도 단위이다. 환자 No. 2로부터의 샘플에 대한 평균값은 테스트용 컷-오프값보다 크고, 이에 따라 양성 결과가 부여된다: 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
실시예8bis. 잠재 HCV 감염의 의한 환자
항-HCV 검출의 특이성:
샘플은 실시예1에 기재된 방법에 따라 HCV 감염으로 진단된 환자로부터 취득된다. 이어서, 샘플은 본 발명의 방법 오브젝트에 의해 ELISA를 사용하여 항-HCV의 존재를 검출하기 위해 분석된다. 이것을 위해 반응 매트릭스는 실시예2의 시약을 사용하여 실시예3의 설명을 따라 준비된다. 샘플(이 경우에는 혈청)은 실시예4bis에 기재된 바와 같이 예비-처리되고, 면역화학 반응은 실시예5와 같이 수행되고, 항-HCV의 존재는 실시예6 및 실시예7에서 기재된 방법에 따라 ELISA를 사용하여 판정된다. 상기 판정은, 실시예1, 실시예4, 및 실시예5에 기재된 바와 같이 취득되고 처리되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 양성 결과를 나타내는 1명의 환자(양성 대조군)와 3명의 건강한 사람(음성 대조군)의 샘플을 대조군으로서 사용하여 중복 수행된다. 이하의 결과는 반응 측정시에 취득된다:
- 음성 대조군은 405/620㎚에서 0.054, 0.069, 및 0.063 흡광도 단위(absorbance units)의 평균값을 제공하고; 상기 3개의 음성 대조군에 대한 평균값은 405/620에서 0.061 흡광도 단위이고, 산출된 표준 편차는 0.006이다.
- 양성 대조군에 대한 평균값은 405/620㎚에서 1.391 흡광도 단위이다.
- 음성 및 양성 결과간의 컷-오프값은 3개의 음성 대조군의 평균값과 평균값에 대한 표준 편차의 5배를 합산한 것으로서 판정(테스트 컷-오프값)된다.
테스트용 컷-오프값은 405/620㎚에서 0.091 흡광도 단위이다.
항-HCV 검출이 차단되면 반응은 특이한 것으로 간주된다. 즉, SEQ.ID.NO:1에 대응하는 HCV 시약의 존재하에서 샘플 예비-처리에 의해 측정된 흡광도값은 HCV 시약없이 예비처리가 수행된 경우보다 적어도 50% 적다. 또한, 실시예4bis에 기재된 대조군 시약의 존재하에서 샘플을 예비-처리하는 경우에 항-HCV 검출이 차단되지 않아도 반응은 특이한 것으로 간주된다; 측정된 흡광도값은 HCV 시약 없이 예비처리시 측정된 평균값에 비해 10% 미만 감소한다. 항-HCV 검출 차단의 퍼센티지는 이하의 식에 따라 산출될 것이다:
% blocking = 100 - 100 x
(
HCV
시약으로 샘플의 흡광도) - (
HCV
시약으로 음성 대조군의 흡광도)
(HCV 시약 없이 샘플의 흡광도) - (HCV 시약 없이 음성 대조군의 흡광도)
환자 No. 3:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(여성). 전형적인 HCV 감염을 포함하여, 간질환의 원인으로 알려진 것은 제외하였다(상용 방법에 의해 혈청에서 항-HCV와 HCV RNA는 발견되지 않음). 간 생검은 유전자형 1 HCV-RNA의 존재를 증명하고, 그리하여 잠재 HCV 감염이 진단되고 간 병변이 감지된다(염증 활성이 있는 간 경변).
- HCV 시약 없이 샘플 전처리된 환자 No. 3로부터의 혈청은 405/620 nm에서 0.125 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 환자 No. 3로부터 샘플의 평균값은 테스트의 컷 오프 값보다 크고, 그리하여 양성결과로 분류된다: 상기 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
HCV 시약(코어 펩티드 5-19) 100㎍으로 샘플 전처리된 환자 No. 3로부터의 혈청은 405/620 nm에서 0.072 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 상기 기재된 식을 적용함으로써, 항-HCV 반응의 82% 블록킹을 얻고, 따라서 블록킹되지 않은 결과로 분류된다: 상기 항-HCV 반응은 특이적인 것으로 간주된다.
컨트롤 HCV 시약(코어 펩티드 21-40) 100㎍로 샘플 전처리된 환자 No. 3로부터의 혈청은 405/620 nm 에서 0.156 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 상기 기재된 식에 적용함으로써 항-HCV 반응의 0% 블록킹을 얻고, 따라서 블록되어지지 않은 결과로 분류되어진다: 상기 항-HCV 반응은 특이적인 것으로 간주된다.
환자 No. 4:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(남성). 전형적인 HCV 감염을 포함하여, 간질환의 원인으로 알려진 것은 제외하였다(상용 방법에 의해 혈청에서 항-HCV와 HCV RNA는 발견되지 않음). 간생검은 유전자형 1b HCV-RNA의 존재를 증명하고, 그리하여 잠재 HCV 감염이 진단되고 화학반응변화가 간에서 감지된다(미니멈 병변).
HCV 시약 없이 샘플 전처리된 환자 No. 4로부터의 혈청은 405/620 nm 에서 0.150 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 환자 No. 4로부터 샘플의 평균값은 테스트의 컷 오프 값보다 크고, 그리하여 양성결과로 분류된다: 상기 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
HCV 시약(코어 펩티드 5-19) 100㎍으로 샘플 전처리된 환자 No. 4로부터의 혈청은 405/620 nm 에서 0.060 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 상기 기재된 식을 적용함으로써 항-HCV 반응의 97% 블록킹을 얻고, 그것은 그리하여 블록킹되어지지 않은 결과로 분류되어진다: 상기 항-HCV 반응은 특이적인 것으로 간주된다.
컨트롤 HCV 시약(코어 펩티드 21-40) 100㎍으로 샘플 전처리된 환자 No. 4로부터의 혈청은 405/620 nm 에서 0.174 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 상기 기재된 식을 적용함으로써 항-HCV 반응의 0% 블록킹을 얻고, 그것은 그리하여 블록킹되어지지 않은 결과로 분류되어진다: 상기 항-HCV 반응은 특이적인 것으로 간주된다.
환자 No. 5:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(여성). 전형적인 HCV 감염이 진단된다(상용 방법이 사용된 혈청에서 감지된 항-HCV와 HCV-RNA). 간생검은 유전자형 1b HCV-RNA의 존재와 간 병변(스테이지 1의 간섬유증이 포함된 만성 활성 간염)을 증명한다.
HCV 시약 없이 샘플 전처리된 환자 No. 5로부터의 혈청은 405/620 nm 에서 1.391 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 환자 No. 5로부터 상기 샘플의 평균값은 테스트의 컷 오프 값보다 크고, 그리하여 양성결과로 분류된다: 상기 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
HCV 시약(코어 펩티드 5-19) 100㎍으로 샘플 전처리된 환자 No. 5로부터의 상기 혈청은 405/620 nm 에서 0.146 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 상기 기재된 식을 적용함으로써 항-HCV 반응의 93% 블록킹을 얻고, 그것은 그리하여 블록되어지지 않은 결과로 분류되어진다: 상기 항-HCV 반응은 특이적인 것으로 간주된다.
컨트롤 HCV 시약(코어 펩티드 21-40) 100㎍으로 샘플 전처리된 환자 No. 5로부터의 상기 혈청은 405/620 nm 에서 1.424 흡광도 단위의 평균값을 제공한다. 상기 기재된 식을 적용함으로써 항-HCV 반응의 0% 블록킹을 얻고, 그것은 그리하여 블록킹되어지지 않은 결과로 분류되어진다: 상기 항-HCV 반응은 특이적인 것으로 간주된다.
항-HCV의 적정:
이것은 분석된 샘플에 존재하는 항-HCV 항체의 양을 측정할 수 있게 한다. 이 측정은 임상학, 조직병리학, 바이러스학 또는 다른 특징들, 그리고 HCV 감염의 진행과 함께, 잠재하는 또는 전형적인 것, 그리고, 항바이러스 치료 다음의 후속 조치와 관계되어질 수 있다. 상기 샘플들은 실시예 1에 서술된 방법에 따라 HCV 감염으로 진단된 환자들로부터 획득되어진다. 상기 샘플은 그 후 본 발명의 방법으로 ELISA를 사용하여 항-HCV의 존재를 검출하기 위해 분석되어진다. 이를 위해, 반응 매트릭스는 실시예 2의 시약을 사용하여 실시예 3의 설명에 따라 준비되어진다. 상기 샘플은 실시예 4와 같이 전처리된다(이 경우 혈청). 1:10으로 희석된 상기 전처리된 샘플은, 2배로 연속하여, 즉, 1:20, 1:40, 1:80, 등으로 희석되어진다; 면역화학반응은 실시예 5에서처럼 수행되어지고 항-HCV의 존재는 실시예 6, 7에서 서술된 방법에 따라 ELISA에 의해 검출된다. 상기 측정은 3명의 건강한 사람(음성대조군)과 상기 실시예 1, 4 및 5에서 서술된 것에 따라 획득되고 진행되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 양성 결과를 보이는 1명의 환자(양성대조군)의 샘플을 대조군으로서 이용함으로써 중복하여 수행된다. 하기 결과들은 상기 반응을 측정할 때 획득된다.
환자 No.6:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(남성). 전형적인 HCV 감염을 포함하여, 간질환의 원인으로 알려진 것은 제외하였다(상용 방법에 의한 혈청에서 항-HCV와 HCV RNA는 발견되지 않음). 간생검은 유전자형 1b HCV-RNA의 존재를 증명하고, 그리하여 잠재하는 HCV 감염이 진단되고 지방증이 간에서 최소의 염증변화와 함께 관찰된다. 다음의 평균 결과들은 상기 반응을 측정할 때 405/620 nm 에서 흡광도 단위가 획득되어진다.
Dilution: 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120
negative c. 0.080 0.074 0.066 0.063 0.061 0.054 0.049 0.048 0.047 0.045
cut-off v 0.087 0.077 0.068 0.066 0.064 0.057 0.050 0.050 0.049 0.047
pat. No.6 0.396 0.263 0.151 0.086 0.069 0.056 0.046 0.040 0.035
Results: POS POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG
(POS: POSITIVE result; NEG: NEGATIVE result)
상기 분석된 혈청은 항-HCV 항체들이 농도 1:160에서 포함된다.
환자 No. 7:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(여성). 전형적인 HCV 감염이 진단된다(상용 방법이 사용시 혈청에서 검출가능한 항-HCV와 HCV-RNA). 간생검은 유전자형 1a HCV-RNA의 존재와 간 병변(격벽 섬유증과 함께 문맥주위의 간염)을 증명한다. 다음의 평균 결과들은 상기 반응을 측정할 때 405/620 nm단위에서 흡광도가 획득되어진다.
Dilution: 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120
negative c. 0.080 0.074 0.066 0.063 0.061 0.054 0.049 0.048 0.047 0.045
cut-off v 0.087 0.077 0.068 0.066 0.064 0.057 0.050 0.050 0.049 0.047
pat. No. 7 1.517 1.302 1.078 0.757 0.559 0.348 0.216 0.151 0.063
Results: POS POS POS POS POS POS POS POS POS NEG
(POS: POSITIVE result; NEG: NEGATIVE result)
상기 분석된 혈청은 항-HCV 항체들을 1:2560 농도에서 포함한다.
항-HCV 아이소타입(isotype):
이것은 분석된 샘플에 존재하는 항-HCV 항체(타입: IgA, IgG, IgM; IgG 아이소타입: IgG1, IgG2, 등)의 면역 글로블린(IG)의 타입과 아이소타입을 알 수 있게 한다. 이 측정은 임상학, 조직병리학, 바이러스학 또는 다른 특징들, 그리고 HCV 감염의 진행과 함께, 잠재하는 또는 전형적인 것, 그리고, 항바이러스 치료 다음의 후속 조치와 관계되어질 수 있다. 상기 샘플들은 실시예 1에서 서술된 방법에 따라 HCV 감염이 진단된 환자로부터 획득된다. 상기 샘플은 그 후 항-HCV의 존재를 검출하기 위해 본 발명의 방법으로 ELISA가 사용되어 분석되어진다. 이를 위해, 반응 매트릭스는 실시예 2의 시약을 사용하여 실시예 3의 서술에 따라 준비되어진다. 샘플(이 케이스에서 혈청)은 실시예 4에서 서술된 것처럼 전처리되고 면역화학반응은 실시예 5에서처럼 수행되고, 항-HCV의 존재는 앞서 언급된 실시예 6, 7의 방법에 따라 ELISA를 이용하여 검출된다. 상기 측정은 상기 3명의 건강한 사람(음성대조군)과 상기 실시예 1, 4 및 5에서 서술된 것에 따라 획득되고 진행되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 양성 결과들을 보이는 1명의 환자(양성대조군)의 샘플을 대조군으로서 이용함으로써 중복하여 수행된다. 실시예 6의 시약(항-IgG-HRP)은 검출되는 항체로서 동일 타입(예: 항-IgM-HRP) 또는 아이소타입(예:항-IgG1-HRP)의 특정 시약으로 교체된다. 다음의 결과들은 상기 반응이 측정될 때 획득된다.
환자 No. 8:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(남성). 전형적인 HCV 감염을 포함하여, 간질환의 원인으로 알려진 것은 제외하였다(상용 방법에 의한 혈청에서 항-HCV와 HCV RNA는 발견되지 않음). 간생검은 유전자형 1b HCV-RNA의 존재를 증명하고, 그리하여 잠재 HCV 감염이 진단되고 최소의 간 병변들이 관찰된다. 다음의 평균 결과들은 상기 반응을 측정할 때 405/620 nm에서 흡광도 단위로 획득된다.
Ig type/ isotype: IgG IgG1 IgG3
reagent: anti-IgG-HRP anti-IgG1-HRP anti-IgG3-HRP
dilution: 1:1000 1:1000 1:10000
negative c.: 0.065 0.034 0.030
cut-off value: 0.089 0.047 0.042
Pat. No.8: 0.325 0.069 0.029
Results: POS POS POS
(POS: POSITIVE result; NEG: NEGATIVE result)
분석된 혈청은 타입 IgG와 아이소타입 IgG1의 항-HCV 항체들을 포함한다.
환자 No. 9:
간효소의 비정상적인 값 때문에 오피스에 참석한 환자(여성). 전형적인 HCV 감염이 진단된다(상용 방법이 사용된 혈청에서 감지된 항-HCV와 HCV-RNA). 간 생체검사는 유전자형 1b HCV-RNA의 존재와 간 병변(스테이지 1의 간섬유증이 포함된 만성활성간염)을 증명한다. 다음의 평균 결과들은 상기 반응을 측정할 때 405/620 nm에서 흡광도 단위로 획득된다.
Ig type/ isotype: IgG IgG1 IgG3
reagent: anti-IgG-HRP anti-IgG1-HRP anti-IgG3-HRP
dilution: 1:1000 1:1000 1:10000
negative c.: 0.055 0.034 0.030
cut-off value: 0.089 0.047 0.042
Pat. No.9: 2.004 1.436 0.198
Results: POS POS POS
(POS: POSITIVE result; NEG: NEGATIVE result)
분석된 혈청은 타입 IgG와 아이소타입 IgG1 및 IgG3의 항-HCV 항체들을 포함한다.
실시예 9. 잠재 HCV 감염의 잠재적인 위험이 있는 투석을 받는 환자
컷 오프 값의 결정:
샘플들은 실시예 1에서 서술된 방법에 따라 잠재 HCV 감염을 갖는 투석을 받는 환자로부터 획득된다.
상기 샘플은 그 후 항-HCV의 존재를 감지하기 위해 본 발명의 방법으로 ELISA를 사용하여 분석된다.
이를 위해, 반응 매트릭스는 실시예 2의 시약을 사용하여 실시예 3의 서술에 따라 준비되어진다.
샘플(이 경우 혈장)은 실시예 4에서 서술된 것처럼 전처리되고 면역화학반응은 실시예 5에서처럼 수행되고, 항-HCV의 존재는 앞서 언급된 실시예 6, 7의 방법에 따라 ELISA를 이용하여 결정된다.
측정은 3명의 건강한 사람(음성대조군)과 상기 실시예 1, 4 및 5에서 서술된 것에 따라 획득되고 진행되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 양성 결과들을 보이는 1명의 환자(양성대조군)의 샘플을 대조군으로서 이용함으로써 중복하여 수행된다.
다음의 결과들은 상기 반응을 측정할 때 획득된다.
-상기 음성대조군은 405/620nm에서 0.057, 0.063과 0.068 흡광도 단위의 평균값을 제공한다; 상기 3개의 음성대조군 평균값은 405/620에서 0.062 흡광도 단위이고 상기 계산된 표준 편차는 0.0057이다.
-상기 양성대조군 평균값은 405/620 nm에서 0.715 흡광도 단위이다.
-상기 음성과 양성결과 사이의 컷 오프 값은 평균값의 표준 편차의 5배와 3개의 음성대조군 평균값의 합으로 결정된다(테스트 컷 오프 값).
상기 테스트용 컷 오프 값은 405/620 nm에서 0.091 흡광도 단위이다.
환자 No. 10(우선권 출원에서의 환자 No. 3)
만성적인 신장병 때문에 12달 이상 동안 투석을 받고 있는 환자(남자)이다. 그는 분석 컨트롤을 정기적으로 받고 간효소의 값이 비정상적으로 나타난다.
- 환자 3번으로부터의 혈장은 405/620nm에서 0.163 유닛 및 0.143 유닛의 흡광도 값을 제공하고, 환자 3번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 405/620nm에서 0.153 흡광도 유닛이다. 환자 3번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 테스트를 위한 컷-오프(cut-off)값보다 크며, 따라서 할당된 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈장은 항-HCV 항체를 포함한다.
환자 11번(우선권 출원에 있어서의 환자 4번)
만성 신질환(CKD)으로 인한 환자(남자)는 12개월 이상동안 haemodialysis 를 받아왔다. 그는 CKD 관련 빈혈로 인해 수혈을 받는다. 그는 임상시험에 있어서 간 효소에 대한 비정상 값을 나타낸다.
환자 4번으로부터의 혈장은 405/620nm에서 0.092 유닛 및 0.094 유닛의 흡광도 값을 제공하고, 환자 4번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 405/620nm에서 0.093 흡광도 유닛이다. 환자 4번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 임상시험에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈장은 항-HCV 항체를 포함한다.
실시예 10: HCV에 의한 잠재 감염의 잠재적 위험을 가진 타 개체군
컷-오프 값 결정:
실시예 1에서 설명된 방법을 따라 잠재 HCV 감염의 잠재적 위험을 가진 사람들(예컨대, 잠재 HCV 감염 환자의 친족)로부터 샘플이 얻어졌다. 이후, 본 발명의 방법 오프젝트로 ELISA를 사용하여 항-HCV의 존재를 검출하기 위해 상기 샘플은 분석된다. 이를 위해 실시예 2의 시약을 사용하여 실시예 3의 설명에 따라 반응 매트릭스가 준비된다. 상기 샘플(이 경우, 혈청)이 실시예 4에서 설명된 바와 같이 전처리되고, 면역 화학 반응이 실시예 5와 같이 수행되며, 항-HCV의 존재는 실시예 6 및 7에서 설명한 방법에 따라 ELISA를 사용하여 결정된다. 상기 결정은 3명의 건강한 사람(네가티브 컨트롤)과 실시예 1, 4 및 5에서 설명된 바와 같이 획득되고 처리되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 포지티브 결과를 나타내는 1명의 환자(포지티브 컨트롤)의 샘플을 컨트롤로서 사용하여 이중으로 수행된다. 다음의 결과가 상기 반응을 측정시에 얻어진다.
- 네가티브 컨트롤은 405/620nm에서 0.046, 0.050, 및 0.047 흡광도 유닛의 평균 값을 제공하며, 3 네가티브 컨트롤에 대한 평균 값은 405/620에서 0.048 흡광도 유닛이며, 산출된 표준 편차는 0.0025이다.
- 포지티브 컨트롤에 대한 평균 값은 405/620nm에서 1.466 흡광도 유닛이다.
- 네가티브 결과 값과 포지티브 결과 값 간의 컷-오프 값은 3 네가티브 컨트롤의 평균 값과 평균 값의 표준 편차×5의 합으로서 결정된다(테스트 컷-오프 값).
- 테스트 컷-오프 값은 405/620nm에서 0.060 흡광도 유닛이다.
환자 12번(우선권 출원에 있어서 환자 5번)
유전자형 1b 잠재 HCV 감염(genotype 1b occult HCV infection) 및 마일드 크로닉 로버럴 헤파티티스 마일드(mild chronic lobular hepatitis mild)로 진단된 환자(남성)의 친족(여동생)은 의학 실험 및 임상 시험을 위한 오피스에 존재한다.
- 환자 5로부터의 혈청 샘플은 405/620nm에서 0.169 유닛 및 0.173 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 샘플 5번에 대한 평균 값은 405/620nm에서 0.171 흡광도 유닛이다. 환자 5번으로부터의 샘플 평균 값은 시험을 위한 컷-오프 값보다 크고, 따라서 포지티브 결과로 분류된다: 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
환자 13번(우선권 출원에 있어서 환자 6번)
유전자형 1 잠재 HCV 감염으로 진단된 환자(남성)의 친족(배우자)는 의학 시험 및 임상 시험을 위한 오피스에 존재한다.
- 환자 6번으로부터의 혈청은 405/620nm에서 0.111 유닛 및 0.112 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 샘플 6번에 대한 평균 값은 405/620nm에서 0.112 흡광도 유닛이다. 환자 6번으로부터의 샘플 평균 값은 상기 시험을 위한 컷-오프 값보다 크며, 따라서 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
실시예 10bis: HCV에 의한 잠재 감염의 잠재적 위험을 가진 타 개체군
환자 14번:
전형적 HCV 감염(상용 방법을 사용한 혈청에서 검출된 항-HCV 및 HCV-RNA)으로 인한 간경변으로 진단된 환자(여성)의 친족(딸)은 의학 시험 및 분석 시험을 위한 오피스에 존재하며, 간 효소(liver enzyme)에 대해 정상 값을 가지며, 전형적 HCV 감염에 대한 비결정적인 결과 값(상용 방법을 사용하여 혈청에서 검출되지 않은 비결정된 항-HCV 및 HCV-RNA)을 제공한다. 상기 딸은 항-HCV 보인자로서 진단된다. 간생검(Liver biopsy)은 마일드 스테아토시스(mild steatosis) 및 유전자형 1 HCV-RNA의 존재를 나타내며, 따라서 상기 딸은 HCV 감염으로 진단된다.
- 환자 14-1로부터의 혈청 샘플은 405/620nm에서 0.117 유닛 및 0.117 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 샘플 14-1번에 대한 평균 값은 405/620 nm에서 0,117 흡광 유닛이다. 환자 14-1번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 상기 테스트에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서, 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다. 연이은 혈청 샘플에 대해서 항-HCV 결정이 반복되며, 상용 방법을 사용시 네가티브 값을 제공한다.
- 환자 14-2번으로부터의 혈청 샘플은 405/620nm에서 0.099 유닛 및 0.099 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 샘플 14-2에 대한 평균 값은 405/620 nm에서 0,099 흡광도 유닛이다. 환자 14-2번으로부터의 샘플 평균 값은 시험을 위한 컷-오프 값보다 크며, 따라서 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다. 상기 환자는 잠재 HCV 감염으로 진단된다.
실시예
11, 1 이외의 유전자형을 가진
HCV
감염 환자
컷-오프 값 결정:
실시예 1에서 설명된 방법에 따라 HCV 감염으로 진단된 환자로부터 샘플이 얻어졌다. 상기 샘플은 이후 분석되어 본 발명의 방법 오브젝트로 ELISA를 사용하여 항-HCV의 존재를 검출한다. 이를 위해 실시예 2의 시약을 사용하여 실시예 3의 설명에 따라 반응 매트릭스가 준비된다. 샘플(이경우, 혈청)은 실시예 4에 설명된 바와 같이 전처리되고, 면역 화학 반응이 실시예 5에서와 같이 수행되며, 항-HCV의 존재는 실시예 6, 7에서 설명된 방법에 따라 ELISA를 사용하여 결정된다. 상기 결정은 3명의 건강한 사람(네가티브 컨트롤)과 실시예 1, 4 및 5에서 설명된 바와 같이 획득되고 처리되며 커머셜 ELISA에 의해 항-HCV 포지티브 결과를 나타내는 1명의 환자(포지티브 컨트롤)의 샘플을 컨트롤로서 사용하여 이중으로 수행된다. 다음의 결과가 상기 반응을 측정시에 얻어진다.
- 네가티브 컨트롤은 405/620nm에서 0.070, 0.069 및 0.074 흡광도 유닛의 평균 값을 제공하며, 3명의 네가티브 컨트롤에 대한 평균 값은 405/620에서 0.071 흡광도 유닛이며, 산출된 표준 편차는 0.004이다.
- 포지티브 컨트롤에 대한 평균 값은 405/620nm에서 1.534 흡광도 유닛이다.
- 네가티브 결과 값과 포지티브 결과 값 간의 컷-오프 값은 3 네가티브 컨트롤의 평균 값과 평균 값의 표준 편차×5의 합으로서 결정된다(테스트 컷-오프 값).
- 테스트 컷-오프 값은 405/620nm에서 0.091 흡광도 유닛이다.
환자 15번:
간 효소의 비정상 값으로 인한 오피스에 존재하는 환자(여성). 전형적 HCV 감염(상용 방법을 사용한 혈청에서 검출가능한 항-HCV 및 HCV-RNA)이 진단된다. 간생검은 유전자형 3a HCV-RNA 및 간병변[리버 피브로시스(liver fibrosis) 없이 활성 만성 간염(active chronic hepatitis)]의 존재를 입증한다.
- 환자 15로부터의 혈청 샘플은 405/620nm에서 1.539 유닛 및 1.150 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 환자 15번으로부터의 혈청 평균 값은 405/620 nm에서 1.525 흡광 유닛이다. 환자 15번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 상기 테스트에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서, 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
환자 16번:
간 효소의 비정상 값으로 인한 오피스에 존재하는 환자(남성). 전형적 HCV 감염(상용 방법을 사용한 혈청에서 검출가능한 항-HCV 및 HCV-RNA)이 진단된다. 간생검은 유전자형 4 HCV-RNA 및 간병변(스테이지 1 리버 피브로시스를 가진 활성 크로닉 헤파타이티스)의 존재를 입증한다.
- 환자 16로부터의 혈청은 405/620nm에서 1.046 유닛 및 1.073 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 환자 16번으로부터의 혈청 평균 값은 405/620 nm에서 1.060 흡광 유닛이다. 환자 16번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 상기 테스트에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서, 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
실시예
12.
SEQ
.
ID
.
NO
.3에 대응하는 서열을 포함하는 펩티드를 항원으로서 사용하는 면역측정법
컷-오프 값 결정:
실시예 1에서 설명된 방법에 따라 HCV 감염으로 진단된 환자로부터 샘플이 얻어졌다. 상기 샘플은 이후 분석되어 본 발명의 방법 오브젝트로 ELISA를 사용하여 항-HCV의 존재를 검출한다. 이를 위해 SEQ.ID.NO.3에 대응하는 시약을 사용하여 실시예 3에서 설명한 바와 같은 반응 매트릭스를 준비한다. 샘플(이경우, 혈청)은 실시예 4에 설명된 바와 같이 전처리되고, 면역 화학 반응이 실시예 5에서와 같이 수행되며, 항-HCV의 존재는 실시예 6, 7에서 설명된 방법에 따라 ELISA를 사용하여 결정된다. 상기 결정은 3명의 건강한 사람(네가티브 컨트롤)과 실시예 1, 4 및 5에서 설명된 바와 같이 획득되고 처리되며 상용 ELISA에 의해 항-HCV 포지티브 결과를 나타내는 한 환자(포지티브 컨트롤)의 샘플을 컨트롤로서 사용하여 이중으로 수행된다. 다음의 결과가 상기 반응을 측정시에 얻어진다.
- 네가티브 컨트롤은 405/620nm에서 0.051, 0.059 및 0.058 흡광도 유닛의 평균 값을 제공하며, 3 네가티브 컨트롤에 대한 평균 값은 405/620에서 0.056 흡광도 유닛이며, 산출된 표준 편차는 0.004이다.
- 포지티브 컨트롤에 대한 평균 값은 405/620nm에서 0.813 흡광도 유닛이다.
- 네가티브 결과 값과 포지티브 결과 값 간의 컷-오프 값은 3 네가티브 컨트롤의 평균 값과 평균 값의 표준 편차×5의 합으로서 결정된다(테스트 컷-오프 값).
- 테스트 컷-오프 값은 405/620nm에서 0.076 흡광도 유닛이다.
환자 17번:
간 효소의 비정상 값으로 인한 오피스에 존재하는 환자(남성). 전형적 HCV 감염(상용 방법에 의해 혈청에서 검출되지 않는 항-HCV 및 HCV-RNA)을 포함하는 간장 질환의 알려진 원인은 제외되었다. 간생검은 유전자형 1b HCV-RNA의 존재를 입증하며, 따라서 잠재 HCV 감염이 진단되고, 활성 변화가 간에서 검출된다(최소 레젼). 환자 17번으로부터의 혈청은 항-코어 HCV IgG 항체의 결정이 실시예 2에서 설명된 시약을 사용하여 수행될 때 네가티브 결과 값을 제공한다.
- 환자 17번으로부터의 혈청은 405/620nm에서 0.084 유닛 및 0.092 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 환자 17번으로부터의 혈청 평균 값은 405/620nm에서 0.088 흡광도 유닛이다. 환자 17번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 상기 테스트에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
환자 18번:
간 효소의 비정상 값으로 인한 오피스에 존재하는 환자(남성). 전형적 HCV 감염(상용 방법에 의해 혈청에서 검출되지 않는 항-HCV 및 HCV-RNA)을 포함하는 간장 질환의 알려진 원인은 제외되었다. 간생검은 유전자형 1b HCV-RNA의 존재를 입증하며, 따라서 잠재 HCV 감염이 진단되고, 간 병변(스테이지 4 리버 피브로시스를 가진 활성 만성 간염)이 검출된다. 환자 18번으로부터의 혈청은 실시예 2에서 설명된 시약을 사용하여 항-코어 HCV IgG 항체의 결정이 수행될 때 포지티브 결과 값을 제공한다.
- 환자 18로부터의 혈청은 405/620nm에서 0.531 유닛 및 0.486 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 환자 18번으로부터의 혈청 평균 값은 405/620nm에서 0.509 흡광도 유닛이다. 환자 18번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 상기 테스트에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
환자 19번:
간 효소의 비정상 값으로 인한 오피스에 존재하는 환자(여성). 전형적 HCV 감염(상용 방법을 사용한 혈청에서 검출가능한 항-HCV 및 HCV-RNA)이 진단된다. 간생검은 유전자형 3a HCV-RNA 및 간 병변(스테이지 1 리버 피브로시스를 가진 활성 만성 간염)의 존재를 입증한다.
- 환자 19로부터의 혈청은 405/620nm에서 0.929 유닛 및 1.000 유닛의 흡광도 값을 제공하며, 환자 19번으로부터의 혈청 평균 값은 405/620 nm에서 0.965 흡광 유닛이다. 환자 19번으로부터의 샘플에 대한 평균 값은 상기 테스트에 있어서의 컷-오프 값보다 크며, 따라서, 포지티브 결과로 분류되며, 분석된 혈청은 항-HCV 항체를 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> FUNDACION PARA EL ESTUDIO DE LAS HEPATITIS VIRALES
<120> IMPROVED ANALYTICAL METHOD FOR THE DETECTION OF LATENT HEPATITIS C, USE THEREOF AND CORRESPONDING DIAGNOSIS KIT
<130> FUNDACION PARA EL ESTUDIO DE LAS HEPATITIS VIRALES
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> SEQ ID NO:1
<211> 15
<212> Peptide
<213> Synthetic peptide corresponding to the hepatitis C virus Core Protein
<220> Domain: 5-19
<400> 1
Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
1 5 10
Pro
15
<210> SEQ ID NO:2
<211> 20
<212> Peptide
<213> Synthetic peptide corresponding to the hepatitis C virus Core Protein
<220> Domain: 21-40
<400> 2
Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val
1 5 10
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg
15 20
<210> SEQ ID NO:3
<211> 20
<212> Peptide
<213> Synthetic peptide corresponding to the hepatitis C virus Core Protein
<220> Domain: 101-120
<400> 3
Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg
1 5 10
Arg Ser Arg Asn Leu Gly
15 20
Claims (18)
- SEQ.ID.NO:1로 표시되는 HCV 코어 단백질의 펩티드를 항원으로서 사용하여, 말초혈 유래, 기관 유래, 단리된 세포에 의해 생성 또는 분비된 액(fluids) 유래, 조직 또는 기관의 분비물(secretions) 유래, 혹은 기관의 혈액 또는 액(fluids) 유래의 혈청 및 혈장 샘플 중에서 선택되는 샘플에 대해 스크리닝 면역분석을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 잠재 헤파타이티스 C의 검출 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 펩티드를 사용하는 것에 더하여 서열 SEQ.ID.NO:2 및 SEQ.ID.NO:3로 표시되는 펩티드 중 하나 또는 둘을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 ELISA, 방사면역분석, 형광 면역분석, 화학발광 면역분석 및 생물발광 면역분석 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 삭제
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 ELISA인 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 펩티드는 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 펩티드를 항원으로서 사용하는 ELISA인 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 동위원소 트레이서(isotopic tracer)로 표지된 항혈청을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 비-동위원소 트레이서(non-isotopic tracer)와 결합된 인간 항-IgG 항혈청을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 비-동위원소 트레이서는 형광단, 발색단, 면역분석에 적합한 분자를 생성하는 효소 또는 기타 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 비-동위원소 트레이서는 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase enzyme)인 것을 특징으로 하는 검출 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 펩티드를 항원으로서 사용하는 ELISA이고, 겨자무과산화효소와 결합된 인간 항-IgG 항혈청(항-IgG-HRP)을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법. - SEQ.ID.NO:1로 표시되는 HCV 코어 단백질의 펩티드를 항원으로서 사용하여, 말초혈 유래, 기관 유래, 단리된 세포에 의해 생성 또는 분비된 액(fluids) 유래, 조직 또는 기관의 분비물(secretions) 유래, 혹은 기관의 혈액 또는 액(fluids) 유래의 혈청 및 혈장 샘플 중에서 선택되는 샘플에 대해 스크리닝 면역분석을 수행하는데 필요한 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 잠재 헤파타이티스 C 감염의 검출용 키트.
- 제 13 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 펩티드를 사용하는 것에 더하여 서열 SEQ.ID.NO:2 및 SEQ.ID.NO:3로 표시되는 펩티드 중 하나 또는 둘을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출용 키트. - 삭제
- 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 ELISA, 방사면역분석, 형광 면역분석, 화학발광 면역분석 및 생물발광 면역분석 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출용 키트. - 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 서열을 갖는 펩티드를 항원으로서 사용하는 ELISA인 것을 특징으로 하는 검출용 키트. - 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
상기 스크리닝 면역분석은 SEQ.ID.NO:1로 표시되는 펩티드를 항원으로서 사용하고, 겨자무과산화효소와 결합된 인간 항-IgG 항혈청(항-IgG-HRP)을 사용하는 ELISA인 것을 특징으로 하는 검출용 키트.
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