DE69433971T2

DE69433971T2 - Von menschlichen T-Zellen immunodominante Epitopen des Virus der C-Hepatitis

Info

Publication number: DE69433971T2
Application number: DE69433971T
Authority: DE
Inventors: Geert Leroux-Roels; Robert Deleys; Geert Maertens
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1993-11-04
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2014-10-29
Also published as: DK0992580T3; ATE236981T1; AU698878B2; CA2175692A1; EP0992580A2; EP0725824B1; DE69434295D1; EP0992581B1; ES2197170T3; WO1995012677A2; EP0992581A3; PT992580E; EP0992581A2; US6689368B1; DE69433971D1; EP0725824A1; JPH09504534A; WO1995012677A3; ES2239819T3; ATE274578T1

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt immundominante T-Zellepitope des Hepatitis-C-Virus, die für prophytaktische und therapeutische Hepatitis-C-Impfstoffe geeignet sind und sich von den HCV-Kern-, E1-, E2- und NS3-Proteinen herleiten.
Technisches Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion neuartiger synthetischer Immunogene, die mit den Kern-, E1-, E2- und NS3-Bereichen des Hepatitis-C-Virus in Verbindung stehen, sowie deren Verwendung bei der Produktion von Impfstoffen, therapeutischen Agenzien usw. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptidzusammensetzungen mit HVC-Kern-, E1-, E2- und NS3-T-Zelldeterminanten.
Hintergrund der Erfindung
In den wenigen Jahren seit seiner Entdeckung konnte gezeigt werden, daß das Hepatitis-C-Virus (HCV) eine Hauptursache für akute und chronische Erkrankungen der Leber darstellt. Beim HCV handelt es sich um ein Einzelstrang-RNA-Virus mit einem Genom von ungefähr 9400 Nukleotiden, das aus einem 5'-nicht transvertierten Bereich (5' untranslated region, 5'UR) von 341 Nukleotiden besteht, die einem einzigen großen offenen Leseraster, das für ein Vorläuferpolyprotein von etwa 3010 Aminosäuren codiert, vorgeschaltet sind (Kato et al., 1990). Die genetische Organisation des Virusgenoms ist mit der der Flavi- und Pestiviren verwandt, wobei die putativen Strukturproteine im N-terminalen Bereich sowie verschiedene Nichtstrukturproteine am C-terminalen Ende des Polyproteins lokalisiert sind. Bei den Strukturproteinen handelt es sich um das Kernprotein (C, Aminosäuren 1–191), gefolgt von den putativen Hüllproteinen E1 (Aminosäuren 192–383) sowie E2/NS1 (Aminosäuren 384–746). Die Ausdrücke E2 und NS1 werden häufig wechselseitig verwendet. Eine weitere Form von E2 setzt sich aus den Aminosäuren 384 bis 809 zusammen, und eine dritte Form ist mit NS2 verbunden. Die Nichtstrukturproteine sind NS2, NS3, NS4 und NS5, wobei gezeigt werden konnte, daß von diesen wenigstens NS4 und NS5 weiter zu NS4A, NS4B, NS5A und NS5B prozessiert werden.
Eine Strukturanalyse von HCV-Genomen zeigte die Existenz unterschiedlicher Genotypen, die in Typen und Subtypen eingeteilt wurden (Stuyver et al., 1993). Die Sequenzunterschiede verteilen sich über das gesamte Genom, einschließlich des 5'-nicht transvertierten Bereichs. Die höchste Sequenzvariabilität wurde dabei in den NS2- und 3'-nicht transvertierten Bereichen sowie in den die E1- und E2-Proteine codierenden putativen Hüllbereichen. Der Kern, NS3 sowie bestimmte Bereiche der NS4-Proteine zeigten eine deutlich geringere Verschiedenheit (Okamoto et al., 1992).
Humorale HCV-Antwort
Bald nach Entdeckung des HCV wurden Immunoessays zum Nachweis von zirkulierenden Antikörpern gegen HCV-Proteine allgemein verfügbar. Diese Werkzeuge führten zu einem explosionsartigen Anstieg des Wissens auf dem Gebiet der menschlichen humoralen Immunantwort gegen HCV unter unterschiedlichen Bedingungen. Sobald gezeigt worden war, daß HCV die Hauptursache der posttransfusionalen nicht-A-, nicht-B-Hepatitis darstellte, wurde die Suche nach Antikörpern gegen HCV der Sicherheitssceeningliste für Blutprodukte hinzugefügt. Dieses Verfahren erhöhte nicht nur die Sicherheit von Bluttransfusionen, sondern verbesserte ebenso das Wissen über die Epidemiologie des Virus. Die Tatsache, daß HCV für einen Großteil chronischer Leberinfektionen verantwortlich ist, wobei eine Bluttransfusion oder parenterale Inokulation ausgeschlossen sind, stellt weiterhin eine Hauptherausforderung für weitere epidemiologische Untersuchungen dar. Die weitverbreitete Verwendung der Essays zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV führte ebenso zur Erkennung der Bereiche mit humoraler Antigenität des Virus. Die Beziehung zwischen der Kinetik und der Größe der humoralen Immunantwort gegen die unterschiedlichen Proteine des HCV sowie dem Verlauf und Ausgang der Erkrankung bleibt noch zu ermitteln.
HCV-T-Zellepitope
Die Immunantwort gegen Virusantigene hängt fast ausschließlich von T-Zellen ab. T-Zellen werden sowohl für die Antikörperproduktion als auch für einige zytotoxische Reaktionen benötigt. HCV-codierte Proteine sind nicht nur auf der Ebene der B-Zellen, sondern auch auf der Ebene der T-Zellen immunogen.
Untersuchungen, die die zelluläre Immunantwort gegen HCV beschreiben, sind rar. Von Lin et al. (1993) werden Kandidaten-T-Zellepitope innerhalb von absolut konservierten Bereichen des HCV-Gens, die mittels einer Computerrecherche, bei der eine große Anzahl möglicher T-Zellepitope aufgezeigt wurde, erhalten wurden, beschrieben. Ebenso wurde berichtet, daß periphere Blutzellenmonozyten (PBMC) aus mit HCV infizierten Individuen sich als Reaktion auf rekombinante HCV-Proteine vermehren und daß periphere Reaktionen gegen das Kernprotein mit einem gutartigen Verlauf der Infektion korrelieren (Botarelli et al., 1993). In der Leber von Patienten mit chronischer HCV-Infektion wurden HCV-spezifische, HLA-Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) identifiziert und kloniert, die Epitope in E1- und NS2-Proteinen erkennen. Diese Untersuchungen konzentrierten sich hauptsächlich darauf, T-Zellklone aus individuellen Patienten zu gewinnen und auf die Lokalisierung der immunreaktiven Domäne für die einzelnen CTL-Klone.
Solche Untersuchungen führten zur Entdeckung des Epitops ASRCWVAM (AS 235–242) im aminoterminalen Teil des E1-Proteins sowie des Epitops LMALTLSPYYKRY (AS 826–838) aus dem NS2-Bereich (Koziel et al., 1992). In Patienten mit chronischer HCV-Hepatitis wurden intrahepatische CD4⁺-T-Zellen, die spezifisch das NS4-Protein von HCV erkennen, beobachtet. Der Klonotyp dieser T-Lymphozyten war in den PBMC aus diesen Personen nicht nachweisbar (Minutello et al., 1993). Diese Arbeiten zeigen, daß in Patienten mit HCV-Hepatitis HCV-spezifische T-Lymphozyten aus der infizierten Leber und dem peripheren Blut isoliert werden können. Ihre Rolle in der Patogenese der Leberschädigung bei der HCV-Hepatitis sowie ihre Relevanz hinsichtlich der Clearance oder Persistenz des Virus bleibt noch zu ermitteln. Obwohl die Neutralisierung bestimmter Virusinfektionen allein durch humorale Immunität möglich ist, können die meisten mikrobiologischen Agenzien nur mit Hilfe der zellulären Immunität aus dem Wirt eliminiert werden. Selbst wenn die neutralisierende Kapazität zirkulierender Antikörper bei gewissen Infektionen etabliert ist, so wird im allgemeinen eine T-Helferzellenaktivität benötigt, um den B-Zellen zu gestatten, die benötigten Niveaus an zirkulierenden Antikörpern zu produzieren, um eine Neutralisierung oder Clearance des infektiösen Agens zu erzielen. Bestimmte infektiöse Agenzien lassen sich jedoch nur mittels zellulärer Immunität neutralisieren.
Im Fall des Hepatitis-C-Virus darf man annehmen, daß für die Clearance des Virus T-Zellimmunität benötigt werden könnte, da die meisten Patienten einen chronischen Verlauf der Erkrankung durchlaufen und da die meisten mit HCV infizierten Patienten humorale Immunität gegenüber den meisten HCV-Antigenen, die sich zur Diagnose einer HCV-Infektion einsetzen lassen, entwickelt haben, wie in den Patentanmeldungen Nr. EP-A-0 318 216, EP-A-0 388 232, EP-A-0 442 394, EP-A-0 484 787, EP-A-0 489 968 beschrieben. Die meisten der antikörperpositiven Patienten waren jedoch nicht in der Lage, das Virus aus dem Kreislauf zu eliminieren, da sie HCV-PCR-positiv bleiben und infolge dessen die nachgewiesenen Antikörper weder genug Schutz boten noch ausreichend waren, um das Virus zu neutralisieren. Möglicherweise können Antikörper gegen andere Epitope, die zur Zeit nicht in den HCV-Diagnoseessays eingeschlossen sind, zur Neutralisierung einer HCV-Infektion fähig sein. Solche Epitope können auf den Virusmembranproteinen E1 und E2 lokalisiert sein, doch kann der Schutz gegen eine große Bandbreite unterschiedlicher HCV-Spezies durch die Hypervariabilität der HCV-Hüllbereiche beeinträchtigt werden.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, T-Zellen stimulierende Polypeptide und Peptide, die sich vom E2-Bereich des HCV herleiten, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, T-Zellen stimulierende Polypeptide und Peptide mit der oben angegebenen Bedeutung zur Verwendung bei der Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, T-Zellen stimulierende Peptide oder Polypeptide, die sich vom E2-Bereich des HCV herleiten, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, T-Zellen stimulierende Peptide oder Polypeptide aus HCV, wie oben angegeben, bereitzustellen, die entweder T-Helferzellen (CD4⁺)-Epitope und/oder CTL (CD8⁺)-Epitope enthalten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese enthaltende rekombinante Polypeptide bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese umfassende therapeutische ebenso wie prophytaktische Zusammensetzungen bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, auf diesen beruhende Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung einer HCV-Infektion bereitzustellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Insbesondere wird in der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid mit etwa 8 bis etwa 32 Aminosäuren beschrieben, das wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem E2-Bereich des HCV-Polyproteins ausgewählt sind, enthält oder daraus besteht, wobei die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten und unter der Voraussetzung, daß sich das Polypeptid von allen beschriebenen bekannten T-Zellepitope enthaltenden HCV-Peptiden oder Polypeptiden aus einem beliebigen der oben erwähnten Bereiche unterscheidet. Die letzteren bekannten HCV-Polypeptide und Peptide werden zum Screening auf B-Zellepitope beschrieben. Solche Polypeptide und Peptide werden beispielsweise in EP-A-0 318 261; EP-A-0 388 232, EP-A-0 442 394; EP-A-0 484 787; EP-A-0 489 968; WO 92/22571; Lesniewski et al., 1993; Weiner et al., 1993; usw. erwähnt.
Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden, wie sie oben beschrieben sind, zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.
Der Ausdruck „HCV-immunogene Zusammensetzung" bezieht sich auf die Vorbeugung oder Behandlung einer HCV-Infektion.
Vorzugsweise unterscheidet sich das Polypeptid von RALAHGVRVLEDG, RMAWDMM, PTDCFRKHP, YPYRLWH, GKSTKVP, PSVAAT, IGTVLDQAE, AVAYYR, ASRCWVAM und TGDFDSVID.
Der Begriff „HCV-Polyprotein" bezieht sich auf ein beliebiges im Stand der Technik offenbartes HCV-Polyprotein, das in einem Übersichtsartikel von Okamoto et al., 1992 beschrieben ist, wie z. B. das HCV-Polyprotein Typ 1a des HC-J1-Isolats, wie z. B. das HCV-Polyprotein des Typ-2a-HC-J6-Isolats (Okamoto et al., 1991), des Typ-2b-HC-J8-Isolats (Okamoto et al., 1992). Entsprechend dieser Definition, ist jede Variation, die bereits innerhalb eines der beschriebenen Bereiche des HCV beobachtet wurde, als Teil der Definition des HCV-Polyproteins zu betrachten. So sind beispielsweise zahlreiche Typen und Subtypen in Bukh et al., 1993, Bukh et al., 1994, Stuyver et al., 1993a, Stuyver et al., 1993b, Stuyver et al, 1994a, Stuyver et al., 1994c offenbart. Darüber hinaus können konservative Substitutionen erfindungsgemäß in diese HCV-Polyproteine eingeführt werden. Der Begriff „konservative Substitution", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, daß ein Aminosäurerest durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest ersetzt wurde. Zu den konservativen Substitutionen gehören beispielsweise die Substitution eines hydrophoben Rests, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen Rest, oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen Rest, wie z. B. zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und Asparaginsäure oder zwischen Glutamin und Asparagin, u. ä. Der Begriff „konservative Substitution" umfaßt ebenso die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht substituierten Ausgangsaminosäure, vorausgesetzt, daß Antikörper, die gegen ein solches Polypeptid erzeugt wurden, ebenso mit dem entsprechenden Polypeptid mit der nicht substituierten Aminosäure eine Immunreaktion eingehen.
Der Begriff „Antikörper" bezieht sich auf ein Molekül, bei dem es sich um ein Mitglied einer Familie glykolisierter Proteine mit der Bezeichnung Immunoglobuline handelt, die spezifisch mit einem Antigen kombinieren können.
Das Wort „Antigen" wurde historisch zur Bezeichnung einer Einheit, die von einem Antikörper gebunden wird, und ebenso zur Bezeichnung der Einheit, die die Produktion des Antikörpers induziert, verwendet. Eine neuere Verwendung beschränkt die Bedeutung von Antigen auf jene von einem Antikörper gebundene Einheit, während das Wort "Immunogen" für die Einheit verwendet wird, die die Antikörperproduktion induziert. Ist eine hier diskutierte Einheit sowohl immunogen als auch antigen, so wird ihre Bezeichnung als immunogen oder antigen typischerweise entsprechend ihrer beabsichtigten Nutzung erfolgen.
Der Begriff „entspricht" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, wie sie in Verbindung mit Peptidsequenzen verwendet werden, bedeutet das beschriebene Peptid plus oder minus bis zu drei Aminosäureresten an einem der oder an beiden Amino- und Carboxytermini, wobei das Peptid nur konservative Substitutionen, insbesondere Aminosäurereste entlang der Polypeptidsequenz, enthält.
„Epitop" bezieht sich auf denjenigen Teil eines Moleküls, der spezifisch von einem T-Zellantigenrezeptor oder einer Antikörperkombinationsstelle gebunden wird.
Der Begriff „eine Immunreaktion eingehen" in seinen verschiedenen Formen bedeutet die Bindung zwischen einem Antigen als Ligand und einem eine Antikörperkombinationsstelle enthaltenden Molekül, wie z. B. einem Fab-Anteil eines ganzen Antikörpers.
Der Ausdruck „T-Zellen stimulierendes Epitop" oder T-Zellepitop bezieht sich gemäß der vorliegenden Erfindung auf ein zur Stimulierung von T-Zellen fähiges Epitop. Ein T-Zellen stimulierendes Epitop kann erfindungsgemäß ausgewählt werden, indem man die lymphoproliferative Antwort (wie im Beispielteil ausführlich dargestellt) gegenüber Polypeptiden, die in ihrer Aminosäuresequenz wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem E2-Bereich eines beliebigen HCV-Polyproteins stammen, verfolgt. Diese lymphoproliferative Antwort kann mittels eines T-Helfer-Essays, bei dem eine in-vitro-Stimulation von PMBC aus Patienten mit Hepatitis-C-Infektion mit verschiedenen Konzentrationen von auf T-Zellen stimulierende Aktivität zu testenden Peptiden durchgeführt und die Menge an aufgenommenen radioaktiv markiertem Thymidin gezählt wird, gemessen werden. Die lymphoproliferative Antwort kann ebenso mittels eines CTL-Essays gemessen werden, bei dem man die lytische Aktivität zytotoxischer Zellen unter Verwendung der ⁵¹Cr-Freisetzung mißt. Dabei wird die Proliferation als positiv betrachtet, wenn der Stimulationsindex (mittlere cpm Antigen-stimulierender Kulturen/mittlere cpm der Kontrollkulturen) größer als 1, vorzugsweise größer als 2, am meisten bevorzugt größer als 3 ist. Um ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthaltendes Peptid auszuwählen, werden die Ergebnisse dieser lymphoproliferativen Essays verglichen und immundominante T-zellepitophaltige Polypeptide oder Peptide ausgewählt. Die Ergebnisse der lymphoproliferativen Essays gegen bestimmte Peptide können ebenso zwischen klinischen Patienten ohne Reaktion und klinischen Patienten mit Reaktion gegenüber einer Interferon-α-Behandlung verglichen werden. Die lymphoproliferative Antwort gegenüber einer Reihe synthetischer, überlappender Peptide, die die HCV-Kern-, E1- und E2/NS1-Sequenzen repräsentieren, sowie einem rekombinanten NS3-Protein wurde in 32 Patienten mit chronischer HCV-Hepatitis verfolgt, wie im Beispielteil der vorliegenden Erfindung offenbart ist.
Dementsprechend repräsentiert die vorliegende Erfindung eine Selektion immundominanter T-Zellepitope aus einer Reihe von Antigenen, die die Kern-, E1- E2 und NS3-Bereiche abdecken. Aus dem Beispielteil ist ersichtlich, daß nicht nur die Peptid-Pools 2 und 3 und die Peptide NS1–5* und NS1–7*, sondern auch die Pools 4, 5, 6 und 9 sowie NS3 häufig eine Reaktion bei Hepatitis-C-Patienten hervorriefen (Tabelle 4), während in den Normalkontrollen mit den gleichen Polypeptiden nur selten eine Reaktivität beobachtet werden konnte (Tabelle 5). Aus den in Tabelle 4 aufgeführten Daten läßt sich erkennen, daß große Bereiche des HCV-Strukturbereichs, wie z. B. Pool 1 (Aminosäuren 5–72) und Pools 7 und 8 (Aminosäuren 427–578) eine geringe Aktivität mit T-Zellen infizierter Patienten zeigen, selbst bei Patienten mit einer Reaktion auf die IFN-α-Behandlung. Am bemerkenswertesten war jedoch die Feststellung, daß, während die dominante B-Zellantwort auf Hepatitis C im allgemeinen auf den Kern-Aminoterminus lokalisiert wird (siehe auch Tabelle 3), sich die dominante T-Zellantwort gegen den carboxidterminalen Kernbereich (siehe Tabelle 4) richtet. In der Literatur lassen sich zahlreiche Hinweise darauf finden, daß die carboxidterminale Kernhälfte wenig oder keine B-Zellen-reaktive Epitope enthält. Auf Grundlage der vorliegenden Erfindung kann es wünschenswert sein, noch beispielsweise Teile des carboxidterminalen Kernbereichs (umfassend Aminosäuren 73–176) in prophylaktische oder therapeutische Impfstoffzusammensetzungen mit einzubeziehen.
Die Wörter „Polypeptid" und „Peptid" werden in der gesamten Beschreibung wechselseitig verwendet und bezeichnen eine lineare Abfolge von Aminosäuren, die miteinander über Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind. Polypeptide können verschieden lang sein, entweder in ihren natürlichen (ungeladenen) Formen oder in Formen, bei denen es sich um Salze handelt, und entweder frei von Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, Seitenkettenoxidation oder Phosphorilierung, vorliegen oder diese Modifikationen enthalten. Es ist im Fachgebiet allgemein bekannt, daß Aminosäuresequenzen saure und basische Gruppen enthalten und daß der von dem Peptid gezeigte bestimmte Ionisierungszustand vom pH-Wert des umgebenden Mediums, wenn sich das Protein in Lösung befindet, oder dem pH-Wert des Mediums, aus dem es gewonnen wurde, falls das Protein in fester Form vorliegt, abhängt. Die Definition umfaßt ebenso Proteine, die durch zusätzliche Substituenten, die an den Aminosäureseitenketten gebunden sind, wie z. B. Glykosyleinheiten, Lipide, oder anorganische Ione, wie z. B. Phosphate, ebenso wie Modifikationen, die in Verbindung mit chemischen Umwandlungen der Kette stehen wie z. B. Oxidation von Sulfidrylgruppen, modifiziert sind. Somit soll „Polypeptid" oder dessen äquivalente Begriffe die entsprechende angegebene Aminosäuresequenz umfassen, abhängig von denjenigen der vorstehenden Modifikationen, die seine Funktionalität nicht zerstören.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, und insbesondere die kürzeren Peptide darunter, lassen sich durch klassische chemische Synthese darstellen. Die Synthese kann in homogener Lösung oder in der Festphase durchgeführt werden.
So läßt sich beispielsweise als Synthesetechnik in homogener Lösung die von Houbenweyl in dem Buch mit dem Titel „Methode der organischen Chemie", herausgegeben von E. Wunsh, Bd. 15-I et II. THIEME, Stuttgart 1974, beschriebene Technik verwenden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich ebenso in fester Phase, gemäß den von Atherton und Shepard in ihrem Buch mit dem Titel „Solid phase peptide synthesis" [Festphasen-Peptidsynthese] (IRL Press, Oxford, 1989) darstellen.
Die Polypeptide lassen sich gemäß der vorliegenden Erfindung auch mittels rekombinanter DNA-Techniken, wie unten aufgeführt, darstellen.
Die Länge der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Peptide kann, wie oben angegeben, variieren. Die erfindungsgemäßen Peptide enthalten wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgende HCV-Aminosäuren. Die bevorzugte Länge der Peptide beträgt 8, 9, 10 oder mehr (z. B. 15, 20, 25, 30 usw.) Aminosäurereste.
Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, das wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem zwischen den Aminosäuren 397 und 428 des E2-Bereichs von HCV umfaßten Bereich ausgewählt sind, enthält oder daraus besteht, und wobei die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und vorausgesetzt, daß sich das Polypeptid von allen beschriebenen bekannten T-Zellepitope enthaltenden HCV-Peptiden oder Polypeptiden aus einem beliebigen der oben erwähnten Bereiche unterscheidet. Die letzteren bekannten HCV-Polypeptide und Peptide werden zum Screening auf B-Zellepitope beschrieben.
Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden, wie sie oben beschrieben sind, zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.
Der Ausdruck „zwischen Aminosäuren X bis Y umfaßt" schließt die Aminosäure X und die Aminosäure Y ein.
Die Bezifferung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten HCV-Polyproteins bezieht sich auf die Bezifferung, wie sie für das HCV-J-Isolat nach Kato et al., 1990 verwendet wird. Alle anderen im Fachgebiet bekannten HCV-Isolate können an dieser Sequenz ausgerichtet werden, um die angegebene HCV-Polyprotein-Bezifferung für jedes einzelne HCV-Isolat zu erhalten. So ist beispielsweise bekannt, daß Isolate vom Typ 2 vier zusätzliche Codons/Aminosäuren in ihrer E2-Sequenz enthalten können, während Typ-3-Sequenzen eine Insertion von 2 Aminosäuren im Vergleich mit Typ-1-Sequenzen aufweisen.
Im Beispielteil der vorliegenden Erfindung werden T-Zellepitope neben weiteren Bereichen des HCV-Strukturbereichs im: carboxiterminalen Bereich des Kernproteins (AS 73–176), in den Aminosäuren 192 bis 383 des E1-Bereichs, Aminosäuren 397 und 428 sowie Aminosäuren 571 bis 638 des E2-Bereichs, Aminosäuren 1188 bis 1463 des NS3-Bereichs, beschrieben. Gruppen von Peptiden, die Teile der Strukturproteine Core und E2 abdecken sowie das vollständige E1-Protein abdecken, wurden ebenso wie ein rekombinantes NS3-Protein untersucht. Peptide wurden als Gruppe 1 (AS 5–80), Gruppe 2 (AS 73–140), Gruppe 3 (AS 133–200), Gruppe 4 (AS 193–260), Gruppe 5 (AS 253–332), Gruppe 6 (325–392), Gruppe 7 (AS 427–494), Gruppe 8 (AS 487–578) und Gruppe 9 (AS 571–638), wie in Tabelle 1 gezeigt, getestet. Rekombinantes NS3 umfaßt die Aminosäuren 1188 bis 1463 des Isolats IG8309, das zur 1b-Subtypgruppe des HCV gehört.
Die T-Zellantwort auf die Gruppe-3-Peptide ebenso wie auf die individuellen Peptide NS1–7* und NS1–5* zeigt eine statistisch relevante Korrelation mit einer Abnahme der Niveaus an Alanin-Aminotransferase (ALT) und Virus-RNA, was nach allgemeiner Auffassung auf einen milderen Verlauf der Erkrankung hindeutet. Eine Korrelation zwischen der Antwort auf ein rekombinantes HCV-Kern-Protein und einem milderen Verlauf der Erkrankung wurde von Botarelli et al. 1993 beschrieben. Jedoch wurden weder Epitope kartiert, noch wurde die Sequenz und genaue Position des rekombinanten Kernproteins in Botarelli et al. 1993 beschrieben. In der vorliegenden Erfindung wurde eine ähnliche T-Zellantwort gegenüber den Gruppe-2-Peptiden (AS 73–140) sowohl in Patienten, die eine Reaktion auf IFN-α zeigen, als auch in Patienten, die keine Reaktion darauf zeigen, beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde eine T-Zellreaktivität gegenüber den Gruppe-3-Peptiden (AS 133–200) in Patienten mit Reaktion gegenüber Interferon-α beobachtet, die sich von der T-Zellreaktivität, die gegenüber diesem Bereich in Patienten ohne Reaktion gegenüber IFN-α-Behandlung beobachtet wurde, unterschied. Weiterhin konnte nach Untersuchung der Reaktivität individueller Peptide aus den Gruppen 2 und 3 diese mit einem milderen Verlauf der HCV-Infektion korrelierende spezifische Antwort weiterhin auf spezifische individuelle Peptide mit der Bezeichnung CORE 23, CORE 25 und CORE 27 kartiert werden. Das Peptid CORE 19, das zu den Gruppe-2-Peptiden gehört, wurde ebenso von einigen der Patienten mit Reaktion gegenüber IFN-α-Behandlung erkannt (siehe 1).
In der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, das wenigstens 8 bis etwa 32 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem Bereich zwischen Aminosäuren 397 bis 428 im E2-Bereich von HCV, gekennzeichnet durch die folgenden Sequenzen:
NH₂-X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅GX₄₆X₄₇QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TALN-COOH (SEQ ID NO 49, umspannt Positionen 397 bis 428, siehe 4)
ausgewählt sind, enthält oder daraus besteht, und wobei X₃₇ für S, A, Q, L, N, Y, R oder H, X₃₈ für G, S, T, A oder R, X₃₉ für F, I, L oder V, X₄₀ für V, A oder T, X₄₁ für S, D oder G, X₄₂ für L, I, W, F oder M, X₄₃ für L, I oder F, X₄₄ für A, T, D oder S, X₄₅ für P, Q, S, R, L, I oder T, X₄₆ für A, P oder S, X₄₇ für K, S, Q, A oder R, X₄₈ für N, K, D oder R, X₄₉ für V, I oder L, X₅₀ für Q, S oder Y, X₅₁ für I oder V, X₅₂ für L oder I, X₅₃ für S oder R und X₅₄ für T oder S steht,
und wobei die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und vorausgesetzt, daß sich das Polypeptid von allen beschriebenen bekannten T-Zellepitope enthaltenden HCV-Peptiden oder Polypeptiden aus einem beliebigen der oben erwähnten Bereiche unterscheidet. Die letzteren bekannten HCV-Polypeptide und Peptide werden zum Screening auf B-Zellepitope beschrieben.
Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden, wie sie oben beschrieben sind, zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.
In der vorliegenden Erfindung wird somit ebenfalls ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, das wenigstens 8 bis etwa 20 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem zwischen den Aminosäurepositionen 397 bis 416 des E2-Bereichs von HCV umfaßten Bereich:
NH₂-X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅GX₄₆X₄₇QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄-COOH (SEQ ID NO 55)
und insbesondere aus SGLVSLFTPGAKQNIQLINT (SEQ ID NO 46 oder Peptid NS1–7*) ausgewählt sind, umfaßt oder daraus besteht, und vorausgesetzt, daß sich das Polypeptid von allen beschriebenen bekannten T-Zellepitope enthaltenden HCV-Peptiden oder Polypeptiden aus einem beliebigen der oben erwähnten Bereiche unterscheidet. Die letzteren bekannten HCV-Polypeptide und Peptide werden zum Screening auf B-Zellepitope beschrieben.
Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden, wie sie oben beschrieben sind, zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.
In der vorliegenden Erfindung wird somit auch ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, das wenigstens 8 bis etwa 20 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem zwischen den Aminosäurepositionen 409 bis 428 des E2-Bereichs von HCV umfaßten Bereich:
NH₂-QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TRLN-COOH (SEQ ID NO 56)
und insbesondere aus QNIQLINTNGSWHINSTALN (SEQ ID NO 47 oder Peptid NS1–5*) ausgewählt sind, umfaßt oder daraus besteht,
und wobei die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und vorausgesetzt, daß sich das Polypeptid von allen beschriebenen bekannten T-Zellepitope enthaltenden HCV-Peptiden oder Polypeptiden aus einem beliebigen der oben erwähnten Bereiche unterscheidet. Die letzteren bekannten HCV-Polypeptide und Peptide werden zum Screening auf B-Zellepitope beschrieben.
Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden, wie sie oben beschrieben sind, zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eines der oben erwähnten Polypeptide, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein T-Zellen Helferepitop handelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eines der oben erwähnten Polypeptide, wobei es sich bei den T-Zellen stimulierenden Epitop um ein CTL-Epitop handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso den Einbau eines der oben erwähnten Polypeptide in eine prophylaktische Impfstoffzusammensetzung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung den Einbau eines der oben erwähnten Polypeptide in eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung.
Außerdem wird in der vorliegenden Erfindung auch ein Polypeptid betrachtet, das mehrere Wiederholungen eines der Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung, Kombinationen eines der Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung oder Mimotope der Peptide mit der oben angegebenen Bedeutung umfaßt oder daraus besteht.
Der Begriff „Mimotope" bezieht sich auf Peptide, die die Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung immunologisch imitieren. Da bei HCV eine Sequenzvariabilität beobachtet werden konnte, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um so die Epitope unterschiedlicher Stämme besser zu imitieren. Dabei versteht es sich, daß solche Mimotope nicht mit einer bestimmten HCV-Sequenz identisch sein müssen, solange die betreffenden Verbindungen dazu in der Lage sind, für eine immunologische Stimulierung zu sorgen, nach der die T-Zellen mit wenigstens einem HCV-Stamm reagieren. Die Polypeptide, wie sie oben beschrieben sind, können daher Insertionen, Deletionen und konservativen ebenso wie nicht konservativen Aminosäuresubstitutionen unterzogen werden, wo solche Veränderungen für bestimmte Vorteile bei ihrer Verwendung sorgen könnten. Die Peptide sind vorzugsweise so kurz wie möglich, während sie ihre gesamte Empfindlichkeit der größeren Sequenz behalten. In bestimmten Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehr Peptide zu einer einzigen Struktur zu vereinigen. An der Bildung einer solchen Verbundstruktur können kovalente oder nicht kovalente Verknüpfungen beteiligt sein.
In der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein rekombinantes Polypeptid handelt, das mittels eines Expressionsvektors, der eine ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung codierende Nukleinsäureinsertion umfaßt, exprimiert wird.
Zur Durchführung der Expression der T-Zellepitope enthaltenden Polypeptide der Erfindung in Bakterien wie z. B. E. coli, oder in eukaryontischen Zellen, wie z. B. in S. cervisiae, oder in kultivierten Vertebraten- oder Invertebraten-Wirten, wie z. B. Insektenzellen, Chinese Hamster Ovary (CHO)-, COS1-, BHK- und MDCK-Zellen, werden die folgenden Schritte ausgeführt:
Transformation eines geeigneten zellulären Wirts mit einem rekombinanten Vektor oder mittels Adenoviren, Influenzaviren, BCG oder einem beliebigen anderen lebenden Trägersystem, worin eine Nukleotidsequenz, die für eines der erfindungsgemäßen Polypeptide codiert, unter der Kontrolle der entsprechenden Regulationselemente, insbesondere eines Promotors, der von den Polymerasen des zellulären Wirts oder des lebenden Trägersystems erkannt wird, und im Fall eines prokaryontischen Wirts einer entsprechenden ribosomen Bindungsstelle (RBS) inseriert wurde, wodurch die Expression der Nukleotidsequenz in dem zellulären Wirt ermöglicht wird,
Kultur des transformierten zellulären Wirts unter Bedingungen, die die Expression der Insertion ermöglichen. Rekombinante Virus- oder Lebendträger-Vektoren können ebenso direkt als Lebendimpfstoffe im Menschen eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird in der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, das mit einem mit einem Krankheitserreger in Verbindung stehenden Immunogen, wie z. B. dem HCV-Kernprotein, den HCV-Hüllproteinen E1 und E2, oder den HCV-NS3-, NS4- oder NS5-Immunogenen oder einem HCV-Peptid mit einem B-Zellepitop operativ verknüpft ist.
Die Phrase „operativ verknüpft", wie sie hier verwendet wird, bedeutet, daß die Verknüpfung nicht die Fähigkeit jeder der verknüpften Gruppen, wie beschrieben zu funktionieren, z. B. als T- oder B-Zelldeterminante zu funktionieren, stört. Somit umfaßt operatives Verknüpfen nicht nur kovalente Verknüpfungen, sondern ebenso Verknüpfungen, die zur Induktion einer T-Zellfunktion fähig sind.
Die Phrase „mit einem Krankheitserreger in Verbindung stehend", wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet ein Polypeptid, das zur Induktion der T-Zellfunktion, die mit einem Krankheitserreger in nativer Form eine Immunreaktion eingeht, fähig ist.
Die definierten Polypeptide lassen sich als solche oder in Kombination mit HCV-B-Zellepitopen, HBsAg- oder HBcAg-Partikeln, HIV-Immunogenen, HTLV-Immunogenen, HCV-Peptiden, die bevorzugte B-Zellepitope enthalten, einsetzen, wie beispielsweise ausführlich in EP-A-0 489 968 und WO 93/18054 beschrieben.
Verfahren zum operativen Verknüpfen individueller Polypeptide über eine Aminosäurerestseitenkette unter Bildung eines immunogenen Konjugats, d. h. eines verzweigtkettigen Polypeptidpolymers, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu solchen Verfahren gehören das Verknüpfen über eine oder mehrere Arten von funktionellen Gruppen auf verschiedenen Seitenketten, wobei diese Verfahren dazu führen, daß die jeweiligen Polypeptidgrundgerüste kovalent verknüpft (gekoppelt) sind, dabei jedoch durch wenigstens eine Seitenkette voneinander getrennt sind.
Zu geeigneten funktionellen Gruppen der Seitenketten gehören epsilon-Aminogruppen, beta- oder gamma-Carboxylgruppen, Thiol(-SH)-Gruppen sowie aromatische Ringe (z. B. Tyrosin und Histidin). Verfahren zum Verknüpfen von Polypeptiden, bei denen jeweils die obigen funktionellen Gruppen verwendet werden, sind in Erlanger (1980), Aurameas et al. (1978) und US-Patent Nr. 4,493,795 Nestor et al. beschrieben. Darüber hinaus läßt sich eine stellengerichtete Kupplungsreaktion, wie in Rodwell et al. (1985) beschrieben, durchführen, so daß die biologische Aktivität der Polypeptide nicht wesentlich vermindert wird.
Weiterhin lassen sich, wie im Fachgebiet allgemein bekannt ist, das HBcAg-Protein- und Polypeptid-Immunogen in ihrer nativen Form einsetzen, oder ihr Gehalt an funktionellen Gruppen kann durch Succinylierung von Lysinresten oder Umsetzung mit Cystein-Thiolacton modifiziert werden. Ebenso kann eine Sulfodrylgruppe in jeweils eines der Polypeptide durch Umsetzung der Aminofunktionen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-(3-Dithiopyridyl)propionat eingebaut werden. Die Polypeptide lassen sich auch dahingehend modifizieren, daß Abstandshalter-Arme, wie z. B. Hexamethylendiamin oder andere bifunktionelle Moleküle ähnlicher Größe, eingebaut werden, um das Verknüpfen zu erleichtern.
Ein beliebiges Polypeptidimmunogen, gegen das eine Antikörperproduktion erwünscht ist, läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid-Protein unter Bildung eines erfindungsgemäßen immunogenen Konjugats verknüpfen. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Polypeptidimmunogen um ein mit einem Krankheitserreger verbundenes Immunogen, wobei das Konjugat die Fähigkeit besitzt, die Produktion von Antikörpern, die mit dem Krankheitserreger eine Immunreaktion eingehen, wenn sie in einer wirksamen Menge in ein Tier injiziert werden, zu induzieren. Beispielhafte Immunogene mit besonderer Bedeutung stammen aus Bakterien, wie z. B. B. pertussis, S. tysosa, S. Paratyphoid A und B, C. diptheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, B. anthracis, P. pestis, P. muttocida, V. cholerae, N. meningitides, N. gonorrhea, H. influenzae, T. palladium, u. ä.; aus Viren, wie z. B. Polio Virus, Adeno Virus, Parainfluenza Virus, Masern Virus, Mumps Virus, Respiratory-Syncytical-Virus, Influenza Virus, Equin-Encephalomyeitis-Virus, Schweinecholera Virus, Newcastle-Virus, Geflügel-Pocken-Virus, Tollwut Virus, Katzen- und Hunde-Staupe Viren, Maul-und-Klauenseuchenvirus, menschliche und Affen-Immunschwächeviren, u. ä.; Rickettsiae-Immunogen, wie z. B. epidemischem und endemischem Typhus, sowie den Fleckfiebergruppen, u. ä. Immunogene sind im Stand der Technik allgemein bekannt, und zwar in zahlreichen Literaturangaben, wie z. B. den US-Patenten Nr. 3,149,036, Nr. 3,983,228 und Nr. 4,069,313; in Essential Immunology, 3. Auflage, von Roit, veröffentlicht bei Blackwell Scientific Publications; in Fundamentals of Clinical Immunology, von Alexander and Good, veröffentlicht bei W. B. Saunders; und in Immunology, von Bellanti, veröffentlicht bei W. B. Saunders. Besonders bevorzugte mit Krankheitserregern in Verbindung stehende Immunogene sind die in den US-Patenten Nr. 4,625,015, Nr. 4,544,500, Nr. 4,545,931, Nr. 4,663,436, Nr. 4,631,191, Nr. 4,629,783 sowie in den internationalen PCT-Veröffentlichungen Nr. WO87/02775 und WO87/02892 beschriebenen Immunogene.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf eines der folgenden Peptide oder jedes Peptid, das in der Sequenz eines der folgenden Peptide enthalten ist, wobei die Peptide ein T-Zellepitop enthalten:
NH₂-X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅GX₄₆X₄₇QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄-COOH (SEQ ID NO 55)
SGLVSLFTPGAKQNIQLINT (SEQ ID NO 46)
NH₂-QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TALN-COOH (SEQ ID NO 56).
Außerdem wird in der vorliegenden Erfindung eine immunogene Zusammensetzung betrachtet, die wenigstens eines der Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung im Gemisch mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff umfaßt oder daraus besteht.
Vor Verabreichung an Patienten können Formulierungsstoffe zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden oder Peptiden hinzugegeben werden. Dabei ist eine flüssige Formulierung bevorzugt. Zu diesen Formulierungsstoffen können beispielsweise Öle, Polymere, Vitamine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Salze, Puffer, Albumin, Tenside oder Füllstoffe gehören. Zu den Kohlenhydraten gehören vorzugsweise Zucker oder Zuckeralkohole, wie z. B. mono-, di- oder Polysaccharide, oder wasserlösliche Glukane. Die Saccharide oder Glukane können Fruktose, Dextrose, Laktose, Glukose, Mannose, Sorbose, Xylose, Maltose, Saccharose, Dextran, Pultulan, Dextrin, alpha- und beta-Cyclodextrin, lösliche Stärke, Hydroxethylstärke und Carboxymethylzellulose, oder Gemische davon umfassen. Am meisten bevorzugt ist Saccharose. „Zuckeralkohol" ist definiert als ein C4- bis C8-Kohlenwasserstoff mit einer -OH-Gruppe und umfaßt Galaktitol, Inosit, Mannit, Xylit, Sorbit, Glyzerin und Arabitol. Am meisten bevorzugt ist Mannit. Diese oben erwähnten Zucker oder Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Dabei ist hinsichtlich der verwendeten Menge keine Grenze festgelegt, solange der Zucker oder Zuckeralkohol in der wäßrigen Präparation löslich ist. Vorzugsweise liegt die Zucker- oder Zuckeralkoholkonzentration zwischen 1,0% (w/v) und 7,0% (w/v), besonders bevorzugt zwischen 2,0 und 6,0% (w/v). Zu bevorzugten Aminosäuren gehören linksdrehende (L) Formen von Carnitin, Arginin und Betain; es können jedoch auch andere Aminosäuren zugegeben werden. Zu bevorzugten Polymeren gehören Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 2000 und 3000 oder Polyethylenglykol (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 3000 und 5000. Ebenso ist die Verwendung eines Puffers in der Zusammensetzung zur Minimierung von pH-Änderungen in der Lösung vor der Lyophilisierung oder nach der Rekonstituierung bevorzugt. Dabei können fast alle physiologischen Puffer verwendet werden, doch sind Zitrat-, Phosphat-, Succinat- und Glutamatpuffer oder Gemische davon bevorzugt. Am meisten bevorzugt ist ein Zitratpuffer. Die Konzentration liegt vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,3 Molar. Tenside, die zu der Formulierung gegeben werden können, sind in den EP-Patentanmeldungen Nr. EP 0 270 799 und EP 0 268 110 gezeigt.
Darüber hinaus lassen sich Polypeptide chemisch durch kovalente Konjugation an ein Polymer modifizieren, beispielsweise um ihre Zirkulationshalbwertzeit zu erhöhen. Bevorzugte Polymere sowie Verfahren zu deren Bindung an Peptide sind in den US-Patenten Nr. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 und 4,609,546 gezeigt. Bevorzugte Polymere sind polyoxyethylierte Polyole und Polyethylenglykol (PEG). PEG ist in Wasser bei Raumtemperatur löslich und besitzt die allgemeine Formel: R(O-CH₂-CH₂)_nO-R, wobei R für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe, wie z. B. eine Alkyl- oder Alkanolgruppe, stehen kann. Vorzugsweise weist die Schutzgruppe zwischen 1 und 8 Kohlenstoffatome auf, und ist besonders bevorzugt Methyl. Bei dem Symbol n handelt es sich um eine positive ganze Zahl, vorzugsweise zwischen 1 und 1000, besonders bevorzugt zwischen 2 und 500. Das PEG weist ein bevorzugtes durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 1000 und 40000, besonders bevorzugt zwischen 2000 und 20000, am meisten bevorzugt zwischen 3000 und 12000, auf. Vorzugsweise weist PEG wenigstens eine Hydroxygruppe auf und ist besonders bevorzugt eine terminale Hydroxygruppe. Dabei ist es diese Hydroxygruppe, die bevorzugt aktiviert wird. Es versteht sich jedoch, daß die Art und Menge der reaktiven Gruppen variieren kann, um ein kovalent konjugiertes PEG/Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu erzielen.
Wasserlösliche polyoxyethylierte Polyole sind ebenso bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Diese umfassen polyoxyethyliertes Sorbit, polyoxyethylierte Glukose, polyoxyethyliertes Glyzerin (POG), usw. POG ist bevorzugt. Ein Grund dafür liegt darin, daß das Glyzeringrundgerüst des polyoxyethylierten Glyzerins das gleiche Grundgerüst ist, das natürlicherweise beispielsweise in Tieren und Menschen in mono, di-, tri-Glyzeriden vorkommt. Daher würde diese Verzweigung nicht unbedingt als ein Fremdstoff im Körper angesehen. Das POG weist ein bevorzugtes Molekulargewicht im gleichen Bereich wie PEG auf. Die Struktur für POG ist in Knauf et al., 1988 gezeigt, und eine Diskussion der POG/IL-2-Konjugate findet sich im US-Patent Nr. 4,766,106.
Ein weiteres Wirkstoffzuführungssystem zur Erhöhung der Kreislaufhalbwertzeit ist das Liposom. Verfahren zur Herstellung von Liposomzuführungssystemen sind in Gabizon et al., 1982 und Szoka, 1980 erörtert. Weitere Wirkstoffzuführungssysteme sind im Fachgebiet bekannt und beispielsweise in Poznansky, 1984, beschrieben.
Nach der Zubereitung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung wird diese vorzugsweise lyophilisiert, um einen Abbau zu verhindern und Sterilität zu bewahren. Verfahren zur Lyophilisierung flüssiger Zusammensetzungen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Unmittelbar vor ihrer Verwendung kann die Zusammensetzung mit einem sterilen Verdünnungsmittel (z. B. Ringer-lösung, destilliertes Wasser, sterile Kochsalzlösung), die zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten kann, rekonstituiert werden. Nach der Rekonstituierung wird die Zusammensetzung vorzugsweise an Personen verabreicht, indem solche Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Wie oben angegeben werden die erfindungsgemäßen Polypeptide und Zusammensetzungen zur Behandlung menschlicher Patienten verwendet, um einem der oben erwähnten Krankheitszustände vorzubeugen oder diesen zu behandeln. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral. Bei der parenteralen Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer injizierbaren Einheitsdosisform, wie z. B. einer Lösung, Suspension oder Emulsion, zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen parenteralen Vehikel formuliert. Solche Vehikel sind von Natur aus nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele solcher Vehikel sind Kochsalzlösung, Ringer-lösung, Dextroselösung und Hanks-Lösung. Nichtwäßrige Vehikel, wie z. B. fette, Öle und Ethyloleat, können ebenso verwendet werden. Ein bevorzugtes Vehikel ist 5% Dextrose in Kochsalzlösung. Das Vehikel kann geringe Mengen an Additiven, wie z. B. Substanzen, die die Isotonität und chemische Stabilität erhöhen, einschließlich Puffern und Konservierungsstoffen, enthalten.
Die Dosierung und Art der Verabreichung hängt von dem Individuum ab.
Insbesondere wird in der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung zur Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung gegen HCV betrachtet, wobei man in dem Verfahren eine ausreichende Menge wenigstens eines der Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung, möglicherweise in Begleitung von pharmazeutisch unbedenklichen Adjuvanzien, verabreicht, um eine Immunantwort auszulösen.
Insbesondere handelt es sich bei der immunogenen Zusammensetzung um eine Impfstoffzusammensetzung. Ganz besonders handelt es sich bei der Impfstoffzusammensetzung um eine prophytaktische Impfstoffzusammensetzung. Als Alternative kann es sich bei der Impfstoffzusammensetzung auch um eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung handeln.
Die prophytaktische Impfstoffzusammensetzung bezieht sich auf eine Impfstoffzusammensetzung, die auf die Vorbeugung einer HCV-Infektion gerichtet ist und Normalpersonen, die noch nicht mit HCV infiziert sind, verabreicht wird.
Die therapeutische Impfstoffzusammensetzung bezieht sich auf eine Impfstoffzusammensetzung, die auf die Behandlung einer HCV-Infektion gerichtet ist und an Patienten, die mit HCV infiziert sind, verabreicht wird.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptide können mit Lipid (Lipopeptiden, z. B. PAM₃Cys) modifiziert und mit Alaun, Monophosphoryllipid A, Pluroniks, SAF1, Ribi, Trehalose-6,6-dimycolat oder anderen immunstimulierenden Verbindungen, die dem Fachmann bekannt sind, formuliert werden, um so ihre Immunogenität zu verbessern.
Ebenso wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, wobei die Zusammensetzung zusätzlich zu einem der T-Zellen stimulierenden Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung ein Peptid oder Polypeptid enthält, das wenigstens ein B-Zellepitop von HCV und/oder ein HCV- Strukturpolypeptid und/oder ein HCV-Nichtstrukturpolypeptid enthält.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird in der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung zur Verwendung in einem Verfahren zur HCV-Behandlung betrachtet, wobei man in dem Verfahren eine hinreichende Menge wenigstens eines der Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung, möglicherweise begleitet von pharmazeutisch unbedenklichen Adjuvanzien, verabreicht, um die Behandlung einer HCV-Infektion zu gestatten. In diesem Fall lassen sich die erfindungsgemäßen Polypeptide in Form eines therapeutischen Impfstoffs, der auf die Induktion eines ausreichenden Niveaus der T-Zellfunktion zur Clearance einer Hepatitis-C-Virusinfektion abzielt, einsetzen.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird in der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung mit der oben angegebenen Bedeutung betrachtet, wobei die Zusammensetzung zusätzlich zu einem der Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung ein Peptid oder Polypeptid enthält, das wenigstens ein B-Zellepitop von HCV, und/oder ein HCV-Strukturpolypeptid und/oder ein HCV-Nichtstrukturpolypeptid enthält.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform wird in der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung betrachtet, wobei die Polypeptide mit der oben angegebenen Bedeutung mit HBcAg- oder HBcAg-Partikeln, HBV-Immunogenen, HIV-Immunogenen und/oder HTLV-Immunogenen gemischt werden.
Erläuterungen zu den Figuren
1: Entwicklung der lymphoproliferativen Antworten und Transaminaseaktivitäten in HCV-Patient Nr. 632. AST bezeichnet Aspartat-Aminotransferase, ALT bezeichnet Alanin-Aminotransferase; SI: Simulationsindex; P1 bis P6 bezieht sich auf die Peptidgruppen 1 bis 6, wie sie in Tabelle 1 offenbart sind.
2: Häufigkeiten der Lymphoproliferationsantworten gegenüber Peptidpools 1–9, Einzelpeptiden NS1–7*, NS1–5* und rekombinantem NS3-Protein in gesunden Kontrollpersonen, Patienten mit Reaktion auf Interferon (IFN) und Patienten ohne Reaktion auf IFN.
3: stellt die Teilsequenz des Isolats IG8309, die getestet wurde, dar, wobei dieser Teil von Gly in Position 41 bis Ser in Position 318 reicht (SEQ ID NO 57).
4: zeigt eine Gegenüberstellung der HCV-Strukturbereiche.
5: Gegenüberstellung der die Aminosäurepositionen 571 bis 638 umfassenden E2-Bereiche.
6: Gegenüberstellung der die Aminosäurepositionen 1188 bis 1465 umfassenden NS3-Sequenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1. Untersuchte Patienten
Bei den untersuchten Patienten handelte es sich um 19 männliche und 13 weibliche Patienten im Alter zwischen 27 und 71 Jahren (Durchschnittsalter: 49,9 Jahre). Die Diagnose der chronischen HCV-Hepatitis beruhte auf a) einer dokumentierten Erhöhung der Alanin-Aminotransferase um das Zweifache über der normalen Obergrenze über einen Zeitraum von wenigstens sechs Monaten; b) der Anwesenheit HCV-spezifischer Serumantikörper, die mittels zweier Enzymimmunoassay-Tests der zweiten Generation (UB1-Test und Innotest HCV AbII, Innogenetics, Antwerpen, Belgien) und c) der Abwesenheit klinischer, histologischer oder serologischer Anzeichen einer anderen viralen, toxischen, metabolischen, ererbten oder Autoimmun-Hepatitis. Die Patienten wurden willkürlich ausgewählt, um entweder die Standardbehandlung, bestehend aus der dreimal wöchentlichen Gabe von 3 Millionen Einheiten Interferon α-2b (INTRON A) über 24 Wochen, oder eine experimentelle Behandlung, bestehend aus einer Induktionsphase mit dreimal wöchentlich 6 Millionen Einheiten Interferon α-2b über 8 Wochen, gefolgt von einer Aufrechterhaltungsphase mit dreimal wöchentlich titrierten Dosen von 6 bis 1 Million Einheiten Interferon, bis die biochemische und virologische Remission erreicht wurde (Alanin-Aminotransferaseaktivität normal, Hepatitis-C-Virus-RNA im Plasma nicht nachweisbar), zu erhalten. Als Patienten mit einer klinischen Reaktion werden jene betrachtet, bei denen eine Normalisierung der Alanin-Aminotransferaseaktivität bei wenigstens zwei aufeinanderfolgenden Kontrollbesuchen während der Behandlung in einem Abstand von wenigstens einem Monat beobachtet wurde.
Als Kontrollpersonen für die Spezifität der lymphoproliferativen Antworten wurden 18 gesunde Individuen im Alter von 25–58 Jahren (Durchschnitt 38,6 Jahre), von denen 10 männlich und 8 weiblich waren, ausgewählt. Diese Versuchspersonen waren negativ hinsichtlich HCV-Antikörpern und HCV-RNA. Eine Versuchsperson hatte eine Vorgeschichte einer vergangenen Hepatitis-B-Virusinfektion und 7 besaßen Antikörper gegen HBsAg als Ergebnis einer Impfung.
An allen Patienten wurde eine Leberbiopsie vor dem Start der Interferon-α-Therapie vorgenommen. Der histologische Status wurde gemäß der herkömmlichen histologischen Klassifizierung definiert (Knodell et al., 1981).
Auf Grundlage der oben gegebenen Definition von Patienten mit klinischer Reaktion konnten 18 Versuchspersonen als Patienten mit klinischer Reaktion auf Interferon-α betrachtet werden. Die dabei am meisten relevanten klinischen, pathologischen und virologischen Daten für beide Gruppen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Obwohl die Gruppe mit einer Reaktion mehr Frauen und die Gruppe ohne Reaktion mehr Männer, als theoretisch erwartet, umfaßte, waren die beobachteten Unregelmäßigkeiten nicht signifikant (X²-Test). Die Krankheitsdauer für jede Versuchsperson wurde auf Grundlage der Anamnesedaten (Operation mit mehreren Transfusionen, intravenöser Drogenmißbrauch, arbeitsbedingte Exposition durch Stechen mit einer Nadel, usw.) oder Patientenkarteidaten, die chronisch schwankende und erhöhte Transaminasespiegel zeigen, abgeschätzt. Die Krankheitsdauer variierte von einem Jahr bis 32 Jahre. Die durchschnittliche Krankheitsdauer betrug 9,2 ± 9,2 Jahre in Patienten mit Reaktion und 6,8 ± 5,4 Jahre in Patienten ohne Reaktion. Obwohl die Gruppe mit Reaktion mehr Versuchspersonen umfaßte, die nach der experimentellen Vorschrift behandelt worden waren, und die Gruppe ohne Reaktion mehr Versuchspersonen umfaßte, die nach der Standardvorschrift behandelt worden waren, war die Unregelmäßigkeit nicht signifikant (X²-Test). Sechsundzwanzig von 32 Patienten (81%) waren mit HCV-Genotyp 1b infiziert. Die Genotypen 3a, 4a und 5a wurden in 4, 1 bzw. 1 Versuchsperson(en) gefunden. Die Anamnesedaten gestatteten uns, Informationen über die Infektionsquelle zu sammeln. Bluttransfusionen sind die mögliche Quelle der HCV-Infektion in 14 Versuchspersonen, IV-Drogenmißbrauch in 3 Patienten und Unfälle durch Stechen mit einer Nadel in 3 weiteren Personen. In 12 Versuchspersonen konnte die Infektionsquelle nicht zurückverfolgt werden. Die meisten Patienten (20 von 32) zeigten pathologische Läsionen, die mit chronischer aktiver Hepatitis in milder, gemäßigter oder schwerer Form vereinbar waren. Sieben Patienten zeigten Anzeichen einer chronischen anhaltenden Hepatitis. In zwei Versuchspersonen zeigte die Biopsie nur aspezifische Läsionen, und in zwei weiteren Personen wurden Anzeichen von Leberzirrhose beobachtet.
Beispiel 2. Analyse der humoralen Immunantwort
Zum Nachweis von Antikörpern gegen Peptidepitope aus dem Kern-, NS4a + b- bzw. NS5a-Bereich wurde INNO-LIA HCV AbII (Innogenetics, Belgien) verwendet. Von jedem Patienten wurde eine vor dem Start der Interferontherapie gewonnene Serumprobe untersucht, wobei manchmal auch zusätzliche Folgeproben getestet wurden. Alle 32 untersuchten Patienten besaßen zirkulierende Antikörper gegen HCV, was mit zwei kommerziell erhältlichen Enzymimmunoassays demonstriert wurde. Mit einem Immunoblotassay auf Peptidbasis (INNO-LIA HCV AbII) war es möglich, die Spezifitäten dieser Antikörper teilweise zu definieren. Die Seren aus 31 Patienten wurden wenigstens einmal mit diesem Assay untersucht, und in 20 Versuchspersonen wurde der Assay auf zwei Seren, die im Abstand von 4 (Patient 635) bis 124 Wochen (Patient 606) entnommen wurden, angewandt. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse dieser Untersuchung gezeigt. Neben dem Reaktivitätsmuster mit den eingesetzten Antigenen (4 einzeln aufgetragene Kernpeptide, eine fünfte Reihe definierendes Gemisch aus NS4-Peptiden und eine eine sechste Reihe erzeugende Selektion aus NS5-Peptiden) ist in Tabelle 3 auch der HCV-Genotyp sowie der Zeitpunkt, zu dem das Serum bezüglich des Starts der Interferontherapie entnommen wurde, dargestellt. Die Daten weisen deutlich darauf hin, daß sich das Antikörpererkennungsmuster eines individuellen Patienten mit der Zeit kaum verändert. Die einzigen in den 20 Probenpaaren beobachteten Unterschiede bestanden in einstufigen Veränderungen der Reaktionsintensitäten. Sowohl in Patienten mit Reaktion als in Patienten ohne Reaktion auf Interferon wurde die gleiche Hierarchie in den serologischen Reaktionsmustern beobachtet. Unter Nichtberücksichtigung unbestimmter oder schwacher Reaktionen ergibt sich die folgende Hierarchie: Kern2 > NS4 > NS5 > Kern1 > Kern4 > Kern3.
Beispiel 3. Nachweis der HCV-RNA und HCV-Genotypisierung
Reverse Transkription und PCR wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Stuyver et al., 1993). Die PCR-Produkte wurden weiter zur Genotypisierung mittels des „Inno-LiPA Genotyping Assay" (Stuyver et al., 1993) aufgearbeitet. Die Ergebnisse der Genotypisierungsassays sind in Tabelle 3 enthalten.
Beispiel 4. Analyse der zellulären Immunantwort
4.1. Synthese von HCV-Antigenen
Neun Kern-, E1- und E2/NS1-Sequenzen entsprechende Peptidgruppen (Pools), zwei in diesen Pools nicht enthaltene E2/NS1 entsprechende Einzelpeptide sowie ein den zentralen Teil von NS3-HCV-Genotyp 1b darstellendes rekombinantes Protein wurden zur in-vitro-Stimulierung von PBMC verwendet. In jeder Gruppe waren 4–6 unterschiedliche 20-mer-Peptide, die sich um 8 Aminosäuren überlappten, gepoolt. Die Gruppen 1, 2 und 3 enthielten hauptsächlich Kernpeptide mit den Aminosäurepositionen 5–80, 73–140 bzw. 133–200 (Tabelle 1). Die Gruppen 4, 5 und 6 umfaßten vorwiegend E1-Peptide mit den Aminosäurepositionen 193–260, 253–332 bzw. 325–392. Die Gruppen 7, 8 und 9 umfaßten E2/NS1-Peptide mit den Aminosäurepositionen 427–494, 487–578 bzw. 571–638. Die beiden zusätzlichen Einzelpeptide (NS1–7* und NS1–5*) deckten die Aminosäuren von 397 bis 428 der E2-Sequenz ab (Tabelle 1). Ein Fusionsprotein mit der NS3-Sequenz wurde in E. coli exprimiert und deckte die HCV-Aminosäuren 1188 bis 1463 des belgischen Isolats IG8309 ab. Die Peptide wurden in den in Tabelle 1 gezeigten Puffern gelöst und zu den Kulturen mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml gegeben. Bei dieser Peptidkonzentration war die Konzentration der Lösungspuffer in den Zellkulturen nicht toxisch oder inhibierend. Um dies zu bestätigen, wurden Vorversuche ausgeführt. Das NS3-Protein wurde mit einer Endkonzentration von 1,5 μg/ml verwendet. Das als positives Kontrollantigen verwendete Tetanus-Toxoid (WHO, Kopenhagen, Dänemark) wurde dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben.
Alle Peptide wurden entweder auf dem mit dem säurelabilen Linker 4-(a-Fmoc-Amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäure funktionalisiertem PepSyn K-Harz (Millipore) oder auf dem mit demselben Linker funktionalisierten TentaGel S-RAM-Harz (Rapp Polymere) synthetisiert, wobei nach der Spaltung Peptidamide erhalten wurden. Es wurde ein Seitenkettenschutz auf t-Butyl-Basis sowie Fmoc-a-Amino-geschützte Aminosäurederivate verwendet. Die Guanidinogruppe des Arginin war mit 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl geschützt. Die Imidazolgruppe des Histidin wurde entweder mit t-Boc oder Trityl und die Sulfhydrylgruppe des Cystein mit einer Tritylgruppe geschützt. Die Kupplungen wurden unter Verwendung zuvor gebildeter O-Pentafluorphenylester durchgeführt, außer im Fall von Arginin, wo TBTU (O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N',-tetramethyluroniumtetrafluorborat; Novabiochem) als das Aktivierungsreagens in Gegenwart von 2 Äquivalenten der Base N-Methylmorpholin und 1 Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol verwendet wurde. Gelegentlich wurden auch Glutamin, Asparagin und Tryptophan über TBTU-Aktivierung gekuppelt. In diesen Fällen wurden die Trityl-geschützten Derivate von Glutamin und Asparagin (Millipore) und das t-Boc-geschützte Tryptophanderivat (Novabiochem) verwendet. Alle Synthesen wurden an einem Milligen 9050-PepSynthesizer (Millipore) im Continuous-Flow-Verfahren durchgeführt. Nach Abspaltung der Peptide mit Trifluoressigsäure in Gegenwart geeigneter Fängermoleküle und Präzipitation mit Diethylether wurden alle Peptide mittels C₁₈-Reverse-Phase-Chromatographie analysiert.
Die dem viralen Nukleocapsid-(Kern-)Protein und dem E1-Protein entsprechenden HCV-Aminosäuresequenzen wurden auf die von Okamoto et al. (1990) Japan J. Exp. Med. (1990) 60: 167–177) beschriebene HC-J1-Sequenz bezogen. Die am Aminosäurerest Gly₄₅₁ beginnenden HCV-Sequenzen wurden den von Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2451–2455 veröffentlichten Sequenzen entnommen. Die meisten Peptidsequenzen wurden so gewählt, daß die Peptide sich gegenseitig um 8 Aminosäurereste überlappten.
4.2. T-Zellen-Proliferationsassays
Das für alle Zellkulturen verwendete Medium bestand aus RPMI 1640, supplementiert mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (alle von Gibco Europe, Gent, Belgien), 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, Mo.) und 10% hitzeinaktiviertem gepooltem menschlichem AB-Serum. Dieses AB-Serum wurde aus gesunden Blutspendern mit der Blutgruppe AB⁺ gewonnen und wurde nur dann verwendet, wenn keine Antikörper gegen HCV und HCV-RNA vorhanden waren. Dieses „komplementierte" RPMI-1640-Medium wird im folgenden als „Komplettmedium" bezeichnet.
PBMC wurden aus heparinisiertem venösem Blut mittels isopyknischer Dichtezentrifugation auf Ficoll Hypaque (Lymphoprep, Nyegaard, Dänemark) isoliert und im Komplettmedium suspendiert. 4 × 10⁵ PBMC wurden jeweils in 200 μl Komplettmedium in 96-Well-Mikroplatten mit rundem Boden (Falcon Plastics) in Abwesenheit (nicht stimulierte Kontrollen) oder Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an Antigenen 5 Tage bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft kultiviert. Danach wurde 0,5 μCi (³H)-Thymidin in jedes Well gegeben, und 16 bis 20 h später wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern mit einem Multikanal-„Cell Harvester" (PHD, Cambridge, MA) zur Messung des Einbaus von (³H)-Thymidin mittels Flüssigszintillationszählung in einem LKB-Wallac 8100-Counter (LKB, Bromma, Schweden) geerntet. Die Ergebnisse sind in Form eines Stimulierungsindexes dargestellt (SI; mittlere cpm Antigen-stimulierte Kulturen/mittlere cpm Kontrollkulturen). Die Proliferation wurde als positiv angesehen, wenn der Stimulierungsindex > 3 betrug. In einigen Abbildungen sind die Ergebnisse als cpm (mittlere cpm Antigen-stimulierte Kulturen – mittlere cpm Kontrollkulturen) ausgedrückt. Die Standardabweichungen der cpm-Mittelwerte von Kulturen in Dreifachausfertigung lagen durchweg unter 10%.
Das Auftreten von in-vivo-sensibilisierten HCV-spezifischen Gedächtnis-T-Lymphozyten wurde unter Verwendung eines Lymphoproliferationsassays untersucht. PBMC aus 32 Patienten mit chronischem HCV wurden in vitro mit Pools von 4 bis 6 teilweise überlappenden synthetischen Peptiden, die die Kern-, E1- und E2/NS1-Bereiche von HCV-Typ 1a repräsentieren, mit 2 überlappenden Einzelpeptiden vom Aminoterminus des HCV-Typ 1a und mit einem rekombinanten, die NS3-Sequenz von HCV-Typ 1b enthaltenden Fusionsprotein stimuliert. Mit Ausnahme von 2 Patienten (#610 und #636) wurden an allen Patienten wenigstens 2 und bis zu 11 (#633) Assays durchgeführt. In Patient # 632 wurde beispielsweise die Lymphoproliferation zu 8 unterschiedlichen Zeitpunkten zwischen Woche 4 und 54 nach dem Start (Woche 0) der Interferontherapie untersucht. In 1 sind die Ergebnisse dieser Assays in Korrelation mit der biochemischen (ALT/AST)-Antwort auf die Therapie dargestellt. Vier Wochen nach dem Start mit Intron-A (Schering Plough) wurde eine Normalisierung der Transaminaseniveaus beobachtet. PBMCs aus den Patienten proliferierten durchweg und stark nach Stimulierung mit den Peptidpools 2 und 3. Die Antworten gegenüber den anderen Antigenpräparationen waren weniger stark und weniger reproduzierbar, was darauf hindeutet, daß die Anzahl der diese Epitope erkennenden Gedächtniszellen geringer ist. Antigene, mit denen zu keinem Zeitpunkt eine proliferative Antwort mit einem Stimulierungsindex (SI) von 3 induziert wurde, sind in dem Graphen nicht dargestellt.
Um die Ergebnisse der in den 32 HCV-Patienten durchgeführten 135 Assays zu analysieren und zusammenzufassen, wurde entschieden, die Reaktion eines individuellen Patienten auf eine bestimmte Antigenpräparation (Peptidpools 1 bis 9, NS1–5*-, NS1–7*- bzw. NS3-Protein) als signifikant anzusehen, wenn dadurch wenigstens in der Hälfte der durchgeführten Assays SIs von 3 induziert werden. Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse wurden mit diesem Auswertungsverfahren erhalten. Die Tabelle zeigt das Antigenerkennungsmuster chronischer HCV-Patienten gegenüber den standardmäßig verwendeten 12 Antigenpräparationen. Neben der individuellen Patientennummer und der Anzahl der mit den PBMCs aus jeder Versuchsperson durchgeführten Assays ist in Tabelle 4 ebenfalls der Zeitrahmen gezeigt, in dem diese Assays durchgeführt wurden. Der Start der Interferontherapie dient als Bezugspunkt, Woche 0. Keiner der Patienten zeigte eine Reaktion auf alle Antigene. PBMCs aus 13 von 18 (72%) Patienten mit klinischer Reaktion und aus 12 von 14 (85%) Patienten ohne Reaktion proliferierten als Reaktion auf wenigstens eine Antigenpräparation. Alle Antigenpräparationen außer einer, Peptidpool 8, induzierten eine proliferative Reaktion in wenigstens einer Versuchsperson. Die häufigsten Reaktionen wurden mit den Peptidpools 2 und 3 erhalten. Während sowohl Patienten mit Interferonreaktion als auch Patienten ohne Reaktion eine gleichermaßen gute Zellproliferation gegenüber Peptidpool 2 zeigten (56% bzw. 57%), zeigten Patienten ohne Reaktion eine geringere Reaktion gegenüber Peptidpool 3 (29% bzw. 4 von 14) als Patienten mit Reaktion (44% bzw. 8 von 18). Ähnliche Ungleichgewichte wurden bei den Reaktionen gegenüber Peptidpools 5 und 9 beobachtet, die häufiger von Patienten ohne Reaktion (43% bzw. 43%) als von Patienten mit Reaktion (17% bzw. 11%) erkannt wurden. Patienten ohne klinische Reaktion auf Interferontherapie reagierten auch häufiger (57% bzw. 8 von 14) auf eine Stimulierung mit dem NS3-Protein als Patienten mit Reaktion (24% bzw. 4 von 17). Jedoch erreichte keiner dieser Unterschiede in den proliferativen Reaktionsraten gegenüber Peptidpools 3, 5 und 9 bzw. gegenüber dem NS3-Protein statistische Signifikanz (p < 0,05 in ²-Test). Ein bemerkenswerter und signifikanter Unterschied (P = 0,01 in ²-Test) wurde bei der Reaktionsrate von Patienten mit Reaktion und Patienten ohne Reaktion gegenüber den Peptiden NS1–5* und NS1–7* beobachtet. So erkannten tatsächlich 8 von 17 Patienten mit Reaktion eines oder beide Peptide, während dies bei keinem der Patienten ohne Reaktion der Fall war. Die Ergebnisse aller dieser Proliferationsassays sind in 2 zusammengefaßt, mit den Reaktionsraten der HCV-Patienten ebenso wie von den 18 gesunden Kontrollpersonen gegenüber den 12 Antigenpräparationen. Um tatsächlich die Relevanz der in HCV-Patienten beobachteten proliferativen Reaktionen zu etablieren, wurden PBMCs aus 18 gesunden Kontrollpersonen mit den gleichen Antigenpräparationen stimuliert. Insgesamt wurden 27 Assays durchgeführt: ein einzelner Assay bei 10 Personen, zwei bei 7 Freiwilligen und 3 bei einem Individuum. Bei 12 Kontrollpersonen induzierte keines der Antigene eine proliferative Reaktion. In 6 Versuchspersonen wurde eine proliferative Reaktion mit einem SI von 3 in einem Einzelassay oder in wenigstens der Hälfte der durchgeführten Assays von einem oder mehreren Antigenen induziert. In Tabelle 5 sind die Antigene gezeigt, die die Proliferation in diesen Versuchspersonen induzierten. Obwohl 2 vermuten läßt, daß proliferative Reaktionen häufiger in HCV-Patienten als in gesunden Kontrollpersonen auftreten, erreichen diese Unterschiede nicht immer statistische Signifikanz (p < 0,05). Die Peptidpools 2 und 3 sowie das NS3-Protein induzieren deutlich (p < 0,05) häufigere proliferative Reaktionen in der gesamten Gruppe der HCV-Patienten als in den gesunden Kontrollpersonen. Die meisten dieser Unterschiede sind ebenfalls signifikant, wenn Patienten mit Interferonantwort und Patienten ohne Antwort jeweils mit der gesunden Kontrollgruppe verglichen werden. Nur für die proliferative Reaktion von Patienten mit Interferonreaktion gegenüber NS3 gilt dies nicht mehr. Obwohl die Häufigkeit der proliferativen Reaktion gegenüber Peptidpool 5 in gesunden Kontrollpersonen und in HCV-Patienten nicht signifikant unterschiedlich war, war dies der Fall (p < 0,03), wenn nur die Patienten ohne Reaktion mit den Kontrollversuchspersonen verglichen wurden. Alle anderen Unterschiede erreichten nicht das p < 0,05-Niveau.
Beispiel 5. Feinspezifität der Erkennung des HCV-Kernbereichs durch PBMC aus Patienten mit klinischer Reaktion: T-Zellen-Epitop-Lokalisierung im carboxyterminalen Kernbereich
Da die Peptidpools 2 und 3 proliferative Reaktionen in einem großen Teil der HCV-Patienten hervorriefen, wurde untersucht, welche Peptide aus diesen Pools diese Reaktionen induzierten. Die Stimulierungskapazität einzelner Peptide auf die PBMCs aus gesunden Kontrollversuchspersonen wurde ebenso getestet. Dreiundzwanzig Proliferationsassays wurden mit PBMCs aus 17 Kontrollversuchspersonen durchgeführt. Die Peptide Kern-C17, Kern-C21 und Kern-C31 wurden von 2, 1 bzw. 1 Versuchsperson(en) bzw. 12%, 6% bzw. 6% der Versuchspersonen erkannt. Die PBMCs wurden aus 11 HCV-Patienten präpariert, die auf die Interferontherapie ansprachen. Acht Versuchspersonen hatten eine proliferative Reaktion gegenüber einem oder beiden Peptidpools 2 und 3 gezeigt, während 3 Patienten keine Reaktion gezeigt hatten. Es wurden neunzehn Assays durchgeführt. Bei dem Auswertungssystem für positive Reaktionen handelte es sich um das wie in Beispiel 4 beschriebene System. In Tabelle 6 sind die Ergebnisse dieser 19 Assays zusammengefaßt, wobei die Übereinstimmung der Assayergebnisse demonstriert wird. So proliferierten in der Tat PBMCs aus den Patienten, die keine Reaktion gegenüber den Peptidpools gezeigt hatten, nicht nach Stimulierung mit einem beliebigen der einzelnen Peptide. Die PBMCs aus den Patienten, die zuvor eine proliferative Antwort gezeigt hatten, reagierten auch nach Stimulierung mit einem oder mehreren Peptiden aus diesen Pools. Wenigstens eines und bis zu 5 dieser Peptide wurden von diesen Patienten erkannt. Der am stärksten immunogene Bereich der HCV-Kernsequenz scheint zwischen den Aminosäuren 109 und 176 lokalisiert zu sein. Das von 6 der 8 Patienten mit proliferativer Reaktion erkannte Peptid C27 (AS 157–176) erwies sich als das am stärksten immunodominante, gefolgt von C25, das von 5 Patienten erkannt wird, und C23 und C19, die jeweils von 3 Versuchspersonen erkannt werden.
Beispiel 6
Die Feinspezifität der lymphoproliferativen Reaktionen wurde nochmals mit neuen Proben getestet, wobei die Mehrheit von diesen aus anderen Patienten als den in Beispiel 5 untersuchten gewonnen wurde. Fünf Patienten (zwei mit αIFN-Reaktion und drei ohne αIFN-Reaktion) und 16 normale Kontrollpersonen wurden untersucht. In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der in Patienten mit chronischer Hepatitis C durchgeführten Assays gezeigt. Die höchste in beiden getesteten Patienten mit αIFN-Reaktion beobachteten LPR lagen im Bereich der Aminosäurepositionen: 73–92 (C13); 109–128 (C19); 121–140 (C21); 145–164 (C25); 157–176 (C27). Nur die AS-Reste 121–140 (C21) und 133–152 (C23) riefen eine hohe PLR in zwei Patienten ohne αIFN-Antwort hervor. Daher ist möglicherweise die Verwendung der Peptide C13, C19, C25 und/oder C27 in prophylaktischen oder therapeutischen Impfstoffzusammensetzungen besonders vorteilhaft.
LITERATURHINWEISE

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TABELLE 1 Als Antigene in den lymphoproliferativen Assays verwendete synthetische Peptide.
Verwendete Lösungsmittel

Lösungsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure;
Lösungsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure, 25% Acetonitril; Lösungsmittel C: 0,1% Trifluoressigsäure, 30% Acetonitril;
Lösungsmittel D: 0,1% Trifluoressigsäure, 50% Acetonitril;
Lösungsmittel E: 0,005 Ammoniakpuffer,
Lösungsmittel O: 50% Dimethylsulfoxid;
Lösungsmittel H: 0,1% Trifluoressigsäure, 40% Acetonitril.

Claims

Verwendung eines Peptids mit 8 bis 32 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung zur Stimulierung von T-Zellen in einem mit einem HCV infizierten Patienten, wobei das Peptid wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem die Aminosäurepositionen 397 bis 428 des E2-Bereichs von HCV umfassenden Bereich: NH₂-X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅GX₄₆X₄₇QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TALN-COOH (SEQ ID NO 49) ausgewählt sind, enthält oder daraus besteht und die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und wobei X₃₇ für S, A, Q, L, N, Y, R oder H, X₃₈ für G, S, T, A oder R, X₃₉ für F, I, L oder V, X₄₀ für V, A oder T, X₄₁ für S, D oder G, X₄₂ für L, I, W, F oder M, X₄₃ für L, I oder F, X₄₄ für A, T, D oder S, X₄₅ für P, Q, S, R, L, I oder T, X₄₆ für A, P oder S, X₄₇ für K, S, Q, A oder R, X₄₈ für N, K, D oder R, X₄₉ für V, I oder L, X₅₀ für Q, S oder Y, X₅₁ für I oder V, X₅₂ für L oder I, X₅₃ für S oder R und X₅₄ für T oder S steht.
Verwendung eines Peptids mit 8 bis 32 Aminosäuren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung zur Stimulierung von T-Zellen, wobei das Peptid aus wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die aus dem die Aminosäurepositionen 397 bis 416 des E2-Bereichs von HCV umfassenden Bereich: NH₂-X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄X₄₅GX₄₆X₄₇QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄-COOH (SEQ ID NO 55) ausgewählt sind, besteht oder diese enthält und die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und wobei X₃₇ für S, A, Q, L, N, Y, R oder H, X₃₈ für G, S, T, A oder R, X₃₉ für F, I, L oder V, X₄₀ für V, A oder T, X₄₁ für S, D oder G, X₄₂ für L, I, W, F oder M, X₄₃ für L, I oder F, X₄₄ für A, T, D oder S, X₄₅ für P, Q, S, R, L, I oder T, X₄₆ für A, P oder S, X₄₇ für K, S, Q, A oder R, X₄₈ für N, K, D oder R, X₄₉ für V, I oder L, X₅₀ für Q, S oder Y, X₅₁ für I oder V und X₅₄ für T oder S steht.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid aus wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die aus dem Peptid SGLVSLFTPGAKQNIQLINT (SEQ ID NO 46 = Peptid NS1–7*) ausgewählt sind, besteht oder diese enthält.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Peptid um das Peptid SGLVSLFTPGAKQNIQLINT (SEQ ID NO 46 = Peptid NS1–7*) handelt.
Verwendung eines Peptids mit 8 bis 32 Aminosäuren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung zur Stimulierung von T-Zellen, wobei das Peptid aus wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die aus dem die Aminosäurepositionen 409 bis 428 des E2-Bereichs von HCV umfassenden Bereich: NH₂-QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TALN-COOH (SEQ ID NO 56) ausgewählt sind, besteht oder diese enthält und die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und wobei X₄₈ für N, K, D oder R, X₄₉ für V, I oder L, X₅₀ für Q, S oder Y, X₅₁ für I oder V, X₅₂ für L oder I, X₅₃ für S oder R und X₅₄ für T oder S steht.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 5, wobei das Peptid wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgende Aminosäuren, die aus dem Peptid QNIQLINTNGSWHINSTALN (SEQ ID NO 47 = Peptid NS1–5*) ausgewählt sind, enthält oder daraus besteht.
Verwendung eines Peptids mit 8 bis 20 Aminosäuren zur Herstellung einer HCV-immunogenen Zusammensetzung, wobei das Peptid aus wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die aus dem die Aminosäurepositionen 409 bis 428 des E2-Bereichs von HCV umfassenden Bereich: NH₂-QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TALN-COOH (SEQ ID NO 56) ausgewählt sind, besteht und die unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthalten, und wobei X₄₈ für N, K, D oder R, X₄₉ für V, I oder L, X₅₀ für Q, S oder Y, X₅₁ für I oder V, X₅₂ für L oder I, X₅₃ für S oder R und X₅₄ für T oder S steht.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 7, wobei das Peptid aus wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die aus dem Peptid QNIQLINTNGSWHINSTALN (SEQ ID NO 47 = Peptid NS1–5*) ausgewählt sind, besteht.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 7 und 8, wobei es sich bei dem Peptid um das folgende Peptid handelt: QNIQLINTNGSWHINSTALN (SEQ ID NO 47 = Peptid NS1–5*).
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein T-Zellen-Helferepitop handelt.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei dem T-Zellen stimulierenden Epitop um ein CTL-Epitop handelt.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Einbau in eine prophylaktische Impfstoffzusammensetzung.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Einbau in eine therapeutische Impfstoffzusammensetzung.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei dem Peptid um ein rekombinantes Peptid handelt, das mittels eines eine ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codierende Nukleinsäureinsertion umfassenden Expressionsvektors exprimiert wird.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Peptid mit einem mit dem Krankheitserreger in Zusammenhang stehenden Immunogen, wie z. B. den HCV-Hüllproteinen E1 und E2 oder den HCV-Immunogenen NS3, NS4 oder NS5, oder einem ein B-Zellen stimulierendes Epitop enthaltenden HCV-Peptid verknüpft ist.
Peptid mit 8 bis 20 Aminosäuren, das aus wenigstens 8 unmittelbar aufeinanderfolgenden Aminosäuren besteht, die aus den folgenden Peptiden ausgewählt sind: NH₂-QX₄₈X₄₉X₅₀LX₅₁NX₅₄NGSWHX₅₂NX₅₃TALN-COOH (SEQ ID NO 56) und QNIQLINTNGSWHINSTALN (SEQ ID NO 47 = Peptid NS1–5*), wobei das Peptid ein T-Zellen stimulierendes Epitop enthält und wobei X₃₇ für S, A, Q, L, N, Y, R oder H, X₃₈ für G, S, T, A oder R, X₃₉ für F, I, L oder V, X₄₀ für V, A oder T, X₄₁ für S, D oder G, X₄₂ für L, I, W, F oder M, X₄₃ für L, I oder F, X₄₄ für A, T, D oder S, X₄₅ für P, Q, S, R, L, I oder T, X₄₆ für A, P oder S, X₄₇ für K, S, Q, A oder R, X₄₈ für N, K, D oder R, X₄₉ für V, I oder L, X₅₀ für Q, S oder Y, X₅₁ für I oder V, X₅₂ für L oder I, X₅₃ für S oder R und X₅₄ für T oder S steht.
Immunogene Zusammensetzung, bestehend aus wenigstens einem oder enthaltend wenigstens eines der Peptide nach Anspruch 16 im Gemisch mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 17.
Prophylaktische Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 18.
Therapeutische Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 18.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, die zusätzlich zu einem der Peptide nach Anspruch 16 ein wenigstens ein B-Zellen stimulierendes HCV-Epitop enthaltendes Peptid oder Polypeptid und/oder ein HCV-Strukturpolypeptid und/oder ein HCV-Nichtstrukturpolypeptid umfaßt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das Peptid nach Anspruch 16 mit HBsAg- oder HBcAg-Partikeln, HBV-Immunogenen, HIV-Immunogenen und/oder HTLV-Immunogenen vermischt wird.