DE19908423A1

DE19908423A1 - An der Entwicklung des ZNS beteiligtes Protein (TP)

Info

Publication number: DE19908423A1
Application number: DE19908423A
Authority: DE
Inventors: Annemarie Poustka; Johannes Coy
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2000-08-31
Also published as: WO2000050451A3; AU3801800A; WO2000050451A2; EP1165607A2

Abstract

Beschrieben werden ein Protein (TP) und dazu verwandte Proteine, die an der Entwicklung des ZNS beteiligt sind und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert werden, sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Beschrieben werden ferner gegen diese Proteine gerichtete Antikörper oder Fragmente davon, sowie gegen die Expression dieser Proteine gerichtete Antisense-RNA bzw. Ribozyme. Schließlich werden Arzneimittel und Diagnoseverfahren beschrieben, bei denen die vorstehenden Verbindungen zur Anwendung kommen. Außerdem wird ein nicht-menschliches Säugetier beschrieben, dessen für TP codierendes Gen verändert ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein (TP) und dazu verwandte Proteine, die an der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS) beteiligt sind und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert werden, die nachstehend be schriebenen Varianten dieser Proteine sowie diese Proteine codierende DNA- Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gegen diese Proteine gerich tete Antikörper oder Fragmente davon, sowie gegen die Expression dieser Proteine gerichtete Antisense-RNAs bzw. Ribozyme. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und Diagnoseverfahren, bei denen die vor stehenden Verbindungen zur Anwendung kommen.

Mutationen in Genen, die eine Rolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung des Zentralen Nervensystems spielen, sind von größter wissen- und wirtschaftlicher Bedeutung, da Erkrankungen am ZNS sehr häufig vorkommen, oft durch einen schweren, zum Teil tödlichen Krankheitsverlauf gekennzeichnet sind und bisher nur sehr begrenzt therapierbar sind. Mit dem Anstieg der Lebenserwartung ist eine drastische Zunahme von neurologischen und psychischen Erkrankungen verbunden. Diese verursachen eine starke Einschränkung der Lebensqualität der betroffenen Personen sowie erhebliche Kosten sowohl für den Betroffenen als auch für die Gesellschaft.

Die Isolierung und Analyse ZNS-spezifischer Gene bietet eine gute Möglichkeit, Erkrankungen, wie z. B. Schizophrenie, Autismus, manische Depression und mentale Retardierungen untersuchen und schließlich auch behandeln zu können.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Mittel bereitzustellen, mit denen Störungen bei der Entwicklung des ZNS, insbesondere solche, die mit einer Tumorentwicklung in Zusammenhang stehen, diagnostiziert und gegebenenfalls therapiert werden können.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das an der Entwicklung des ZNS beteiligt ist und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert wird, wobei die DNA-Sequenz folgende DNA- Sequenzen umfaßt:

a) die DNA-Sequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7 oder Fig. 8;
b) die DNA-Sequenz von Fig. 9 oder Fig. 10;
c) die DNA-Sequenz von Fig. 11 oder Fig. 12;
d) die DNA-Sequenz von Fig. 13;
e) die DNA-Sequenz von Fig. 14 oder Fig. 15
f) eine mit (a), (b), (c), (d) oder (e) hybridisierende DNA-Sequenz;
g) Varianten oder Fragmente der DNA-Sequenz von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f); oder
h) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz von (a), (b), (c), (d), (e), (f) oder (g) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Isolierung einer humanen DNA-Sequenz (Gen "T" oder T-Gen genannt; siehe die Fig. 1-8, das das Protein TP codiert), wobei sich herausstellte, daß das von dieser DNA-Sequenz codierte Protein vor allem im sich entwickelnden Zentralnervensystem (ZNS) benötigt wird. Dabei ist die Expression des dieses Protein codierenden Gens zeitlich im wesentlichen auf die Embryonalentwicklung und räumlich im wesentlichen auf Gewebe des ZNS beschränkt. Die Sequenzanalyse ergab, daß es sich hierbei um ein neues Gen handelt. Darüber hinaus konnten weitere Gene isoliert werden, die Homologien zu diesem Gen aufweisen (murines Gen "T", Fig. 9 und 10; Gen "T2", Fig. 11 und 12; Gen "T3", Fig. 13). Somit kann davon ausgegangen werden, daß diese Gene Mitglieder einer neuen, bisher unbekannten Genfamilie sind. Defekte in diesen Genen führen zu Einschränkungen der Funktionen des ZNS. Desweiteren üben diese Gene eine wichtige Funktion bei der Kontrolle des Zellwachstums aus und Veränderungen in diesen Genen bzw. deren Expression führen zu Fehlern in der Kontrolle des Zellwachstums, beispielsweise auch zur Tumorbildung, insbesondere des Neuroblastoms. Von dieser Krebserkrankungen sind fast ausschließlich kleinere Kinder bis ca. 8 Jahre betroffen. In 25 bis 30 Prozent der Fälle treten die ersten Anzeichen bereits innerhalb der ersten 12 Lebensmonate auf. Beim Neuroblastom entarten sehr junge Zellen des autono men Nervensystems. Da diese Nerven an der Rückseite des Bauchraums und des Brustkorbes entlanglaufen, treten die meisten Neuroblastome im Bauch-, Becken- Brust- oder Halsbereich auf. Mehr als die Hälfte der Erkrankungen gehen vom Nebennierenmark aus, welches auch von Nervenzellen gebildet wird. Zeichen, die beim Kleinkind auf ein Neuroblastom hinweisen können, sind Knoten, Schwe llungen, Knochenschmerzen, Hinken, Müdigkeit, Fieber, Blässe, Schwitzen, hartnäckiger Husten, Blutergüsse ums Auge. Vom Arzt diagnostiziert werden kann ein Neuroblastom durch Blut-, Urin- und Ultraschalluntersuchungen sowie durch Entnahme von Biopsien aus dem Tumor und eine Knochenmarksunter suchung. ist der genaue Sitz der Geschwulst diagnostiziert, wird sie operativ entfernt. Problematisch ist die frühe Bildung von Metastasen. Durch die Isolation und Analyse des T-Gens ist es nun möglich, neuartige Diagnose- und Therapie maßnahmen für das Neuroblastom zu entwickeln. Hierdurch wird es dann möglich, eine frühzeitige Diagnose der Krebserkrankung durchzuführen und Therapieformen zu etablieren, die verbesserte Heilungschancen verheißen.

Desweiteren führen Mutationen in T-Gen zu Entwicklungs- und Differenzierungs störungen des ZNS, insbesondere des Gehirns. Dies führt in vielen Fällen zu geistigen Erkrankungen, z. B. mentalen Retardierungen. Das T-Gen übt auch eine wichtige Rolle bei der Verschaltung einzelner Gehirnareale, z. B. Vorder- und Mittelhirn, aus. Mutationen in diesem Gen führen in einigen Fällen zu schizophre nen Erkrankungen oder Autismussyndromen. Mit Hilfe des humanen und murinen T-Gens können wichtige, prinzipielle Rückschlüsse auf die Entstehung des ZNS und insbesondere des Gehirns gezogen werden. Hierbei bieten sich gute Ansatz punkte für die Erforschung krankhafter Veränderungen des ZNS und insbesonde re des Gehirns.

Mit Hilfe der genomischen Sequenzen können Patienten auf mögliche Mutatio nen hin einfacher untersucht werden. Die genomischen Sequenzen des T-Gens sind besonders dann von Vorteil, wenn wenig (Tumor)material für die Analyse zur Verfügung steht. Hierdurch ist es beispielsweise möglich, schon kleinste Tumoren auf Mutationen in diesem Gen zu untersuchen. Weiterhin eröffnet es die Möglichkeit, eine Therapie (insbesondere Bestrahlungs- und/oder Chemo therapie) auf ihren Erfolg hin zu überprüfen, da im Blut zirkulierende Tumorzellen mit genomischen Primern, die spezifisch für die genomische DNA sind, durch eine PCR-Reaktion detektiert werden können.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisieren" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridis ierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5×SSPE, 1% SDS, 1×Denhardts- Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2×SSC, 1% SDS und danach mit 0,2×SSC bei Temperaturen zwi schen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungs bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Varianten" oder "Frag ment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den Figuren ange gebenen Sequenzen durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen codierte Protein noch die vorstehend erwähnten Eigen schaften aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten und Spleißvarianten. Zwei ausgesuchte Beispiele von solchen Spleißvarianten sind in den Fig. 14 und 15 gezeigt. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nuclein säuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Moleku larbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäu resequenz codiertes Protein noch über die vorstehend erwähnten Eigenschaften verfügt.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 9, Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13, Fig. 14 oder Fig. 15 umfaßt, wobei das Protein die vorstehend definierte biologische Aktivität hat.

Durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der vorstehend beschrie benen DNA-Sequenzen, kann die Synthese der von diesen codierten Proteine, beispielsweise des Proteins TP verringert oder eliminiert werden, was beispiels weise bei bestimmten Krankheitszuständen wünschenswert ist. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Antisense- RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu den vorstehenden DNA-Se quenzen komplementär ist und die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten Proteins verringern oder hemmen kann und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet, daß es zu einem Teil der vorstehenden DNA-Sequenzen und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten Proteins verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense- RNAs und Ribozyme zu einer codierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen, geeignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehens weisen sind beispielsweise in EB-B1 0 223 399 oder EP-A1 0 458 beschrieben. Ribozyme sind RNA-Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang.

Diese können andere RNAs intermolekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Diese Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und, (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es inzwischen möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer be stimmten, vorgewählten Stelle schneiden (siehe beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. die die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme codierenden DNAs können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfin dung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvekto ren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z. B. pUC18, pBR322, pBlueScript), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phäno typische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatori schen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukary onten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40- Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDMB und pCEV4. Zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insekten zellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden, sodaß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispiels weise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG 13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9-Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und W138-Zellen. Verfahren zur Trans formation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner von den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen codierte Proteine sowie Verfahren zur Herstellung der von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten Proteine. Dem Fachmann sind Bedingungen bekannt, transformierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivie ren. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitäts chromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine oder ein Fragment davon. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammen hang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitop spezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt.

Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise als ersten Schritt die Herstel lung von polyclonalen Antikörpern unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon (beispielsweise synthetische Peptide) als Immu nogen zur Immunisierung geeigneter Tiere, beispielsweise Kaninchen oder Hühner, und die Gewinnung der polyclonalen Antikörper aus dem Serum bzw. Eigelb.

Dann werden beispielsweise Zell-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen hergestellt und cloniert. Anschließend wird ein Clon selektioniert, der einen Antikörper produziert, der für das verwendete Antigen spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymp hozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels dem Antigen nach dem Enzym-Antikörper-Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Clone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Clone werden beispiels weise BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoclonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie oder Affinitätschromato graphie) gereinigt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humani sierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimä re, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikör pern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Berei che, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halb wertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden mensch lichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine, zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken oder zu den nachstehend offenbarten Zwecken (Dia gnose/Therapie) verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Störungen der Entwicklung des ZNS auf genetischer Ebene zu untersuchen, beispielsweise Tumorerkrankungen. Diese Diagnose kann nicht nur postnatal sondern bereits pränatal erfolgen. Mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, festgestellt werden, ob sie ein Gen enthalten, das das erfindungsgemäße Protein codiert und/oder exprimiert bzw. ob dieses Gen zu einer mutierten Form des Proteins führt, die nicht länger biologisch aktiv ist. Dazu kann der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkription, PCR, LCR, Hybridisierung und Sequenzierung durchführen. Auch die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich für die Diagnostik, d. h. beispiels- weise zum Nachweis des Vorhandensein und/oder der Konzentration des erfin dungsgemäßen Proteins, einer verkürzten oder verlängerten Form des Proteins etc., in einer Probe. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunas says sind ELISA und RIA.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnoseverfahren zum Nach weis einer gestörten Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zum Nachweis einer veränderten Form dieses Proteins, bei dem man eine Probe mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder dem erfindungsgemäßen Antikör per oder Fragment davon in Berührung bringt und sodann beispielsweise direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration des Proteins und/oder seine Aminosäuresequenz im Vergleich zu einer aus einem gesunden Patienten gewon nenen Protein unterscheiden.

Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Durchführung therapeutischer Maß nahmen bei den vorstehend diskutierten Störungen des ZNS, d. h. die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Antisense-RNAs, Ribozyme und Antikörper können auch zur Herstellung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zum Aus tausch einer mutierten Form des Gens gegen eine funktionelle Form verwendet werden und somit auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder der Behandlung von Erkrankungen des ZNS, insbesondere Tumorerkrankungen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein in Säugern, insbesondere den Menschen, durch übliche Maßnahmen eingebracht werden. Hierzu kann es günstig sein, das Protein an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehe nes Protein, z. B. Transferrin oder Rinderserumalbumin (BSA) zu koppeln. Auch kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, Antisense-RNA oder Ribozym in Säuger, insbesondere den Menschen, eingebracht und exprimiert werden. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann die Expression des erfindungsgemä ßen Proteins (TP) bzw. der verwandten Proteine kontrolliert und reguliert wer den.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das die vorste hend beschriebenen DNA-Sequenzen, Antisense-RNA, das Ribozym, den Ex pressionsvektor, das erfindungsgemäße Protein oder den Antikörper bzw. das Fragment davon enthält. Dieses Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulie rung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsio nen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, in travenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosie rung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert und, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Vektors in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzug ten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren enthal tende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retro viren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durch führung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der eine erfindungs gemäße DNA-Sequenz oder den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper oder das Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagno stischen Kits können die DNA-Sequenz bzw. der Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.

Die Isolierung und Charakterisierung des menschlichen erfindungsgemäßen Gens und insbesondere der Maushomologe davon erlauben darüberhinaus die Etablie rung eines Tiermodells, was für das weitere Studium von Erkrankungen des ZNS auf molekularer Ebene sehr wertvoll ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ferner ein nicht-menschliches Säugetier, dessen T-Gen verändert ist, z. B. durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere einer Selektions markersequenz.

Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier, dessen T-Gen verändert sein kann. Beispiele solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.

Der Ausdruck "T-Gen, das verändert ist" bedeutet, daß in dem im nicht-mensch lichen Säugetier natürlich vorkommenden entsprechenden Gen durch Standard methoden eine Veränderung der Genstruktur oder der Gensequenz durchgeführt wird. Dies kann unter anderem durch die Einführung einer Deletion von ca. 1-2 kb, an dessen Stelle eine heterologe Sequenz, z. B. ein Konstrukt zur Vermittlung von. Antibiotika-Resistenz (z. B. eine "neo-Kassette"), eingeführt wird, erreicht werden. Desweiteren können heterologe Sequenzen in das T-Gen eingeführt werden, die es erlauben, in vivo Zeit- und gewebespezifische Deletionen durch zuführen. Weiterhin können heterologe Sequenzen in das T-Gen eingeführt werden, die es erlauben, die Expression des T-Gens in vivo zu verfolgen. Dies kann unter anderem durch die Insertion einer für das GFP (green fluorescent protein)-Protein codierenden Sequenz innerhalb eines Exons oder als eigen ständiges Exon durchgeführt werden. Diese Methoden sind allgemein in Schwar tzberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, S. 3210-3214, 1990 be schrieben, worauf hier Bezug genommen wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen können in jeglicher Form vorliegen, z. B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.

Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Ver fahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, enthaltend ein verändertes T-Gen, wobei das T-Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Markers, verändert worden ist;
b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-menschlichen Säuger (bevorzugt Maus);
c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA-Fragment von Schritt (a), wobei das T-Gen in den embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird,
d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhandensein der heterologen Sequenz, insbesondere des selektierbaren Markers,
f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastocysten (bevorzugt Maus- Blastozyten), Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibli che Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des T-Gens.

In Schritt (c) wird der Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R. M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) ausgenutzt, um embryonale Stammzellen zu trans fizieren. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA-Sequen zen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Methode können bei Verwen dung embryonaler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.

Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" betrifft jegliche embryonalen Stamm zellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung des T-Gens eignen. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, ins besondere die Zellen E14/1 oder 129/SV.

Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung des T-Gens ermög licht. Vorzugsweise weist der Vektor einen Marker auf, mit dem auf vorhandene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die gewünschte Rekombination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z. B. die IoxP/tkneo-Cassette, die mit Hilfe des Cre/loxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(f) durchzuführen.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitge stellt, dessen T-Gen verändert ist. Diese Veränderung kann ein Ausschalten der Genexpression-regulierenden Funktion sein. Mit einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die Genexpression-kontrollierende Funktion des TP- Proteins untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arznei mittel und Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die kontrollierde Funktion eingewirkt werden kann. Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Basis, um auf die verschiedensten Erkrankungen einzuwirken. Solche Erkrankun gen sind z. B. Einschränkungen der ZNS-Funktionen, die bis zu mentalen Retar dierungen reichen oder die Induktion von Krebs durch Fehler bei der Kontrolle der Zellproliferation.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:

Fig. 1 humane cDNA-Sequenz (Gen T) und abgeleitete Aminosäurese quenz,

Fig. 2 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 3 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 4 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 5 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 6 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 7 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 8 humane genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 9 partielle murine cDNA-Sequenz (Gen T) und abgeleitete Amino säuresequenz,

Fig. 10 partielle murine genomische DNA-Sequenz (Gen T),

Fig. 11 partielle humane cDNA-Sequenz (Gen T2) und abgeleitete Amino säuresequenz,

Fig. 12 partielle murine cDNA-Sequenz (Gen T2) und abgeleitete Amino säuresequenz,

Fig. 13 partielle murine cDNA-Sequenz (Gen T3) und abgeleitete Amino säuresequenz,

Fig. 14 Spleißvariante des humanen T-Gens mit abgeleiteter Aminosäurese quenz,

Fig. 15 Spleißvariante des humanen T-Gens mit abgeleiteter Aminosäurese quenz.

Folgende Clone wurden gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, am 18. August 1998 hinterlegt:

- Clon JFC277 (DSM 12371); humane cDNA; repräsentiert die humane cDNA-Sequenz von Bp 1218-3690
- Clon JFC405 (DSM12372); humane cDNA; repräsentiert die humane cDNA-Sequenz von Bp 1-1891
- Clon JFC601 (DSM 12373); murine cDNA; repräsentiert die murine cDNA-Sequenz von Bp 225-3026
- Clon JFC950 (DSM12374); humaner genomischer Clon; repräsentiert humane genomische Sequenz
- Clon JFC955 (DSM12375); humaner genomischer Clon; repräsentiert humane genomische Sequenz; beinhaltet Start der cDNA-Sequenz
- Clon JFC N21 12 (DSM12376); humaner genomischer Clon; wurde vollständig sequenziert. Die Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt und enthält die Sequenz von Bp 1756-4228 der humanen cDNA-Sequenz.

Am 2. Februar 1999 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

- Clon JFC-BN27 (DSM 12659); enthält die Sequenz von Bp 4370-8690 der humanen cDNA-Sequenz.

Am 19. Februar 1999 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

- Clon JFC-BN20 (DSM 12698); enthält die Sequenz von Bp 2025-6280 der humanen cDNA-Sequenz.

Die in den Fig. 2-8 gezeigten Sequenzen entstammen den Klonen JFC955 (DSM 12375) und JFC950 (DSM 12374). Die in Fig. 1 gezeigte Sequenz stammt aus den Clonen JFC277 (DSM 12371), JFC405 (DSM 12372) und JFC-BN27 (DSM 12659) und JFC-BN20 (DSM 12698). Die in Fig. 9 gezeigte Sequenz stammt aus dem Clon JFC610 (DSM12373).

Die Erfindung wird weiter anhand des nachfolgenden Ausführungsbeispiels beschrieben.

BEISPIEL

Hinsichtlich der verwendeten Methoden wird auch auf Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual; second edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1994-1998) hingewiesen, wobei die nachfolgend erwähnten Techniken, insbesondere Präparation von DNA bzw. RNA oder Northern-Blot dem Fachmann hinreichend bekannt sind und beherrscht werden.

Bevor die Durchführung der Experimente im einzelnen beschrieben wird, soll im nächsten Abschnitt erst einmal die Arbeitsstrategie erläutert werden.

Auf der Suche nach Genen, die im mutierten Zustand Erkrankungen des ZNS (z. B. neurodegenerative Erkrankungen, mentale Retardierungen, Tumorerkran kungen des ZNS) auslösen, wurden aus einer humanen fötalen Gehirn-cDNA- Bibliothek (Fa. Stratagene, Heidelberg) 23 cDNA-Klone isoliert. Eine humane fötale Gehirn-cDNA-Bibliothek wurde als Ausgangsmaterial verwendet, da davon ausgegangen wurde, daß in einer fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek Gene, die in der Entwicklung des ZNS und insbesondere des Gehirns eine Rolle spielen, vorhanden sind. Da aber auch sogenannte Haushaltsgene (Gene, die in den meisten Geweben exprimiert werden) im ZNS exprimiert werden, wurde nun getestet, ob die ausgewählten cDNA-Klone von Genen stammen, die eine ZNS spezifische Expression aufweisen. Hierzu wurden die in den einzelnen cDNA- Klonen enthaltenen cDNA-Stücke ("Inserts") isoliert und für die Hybridisierung mit Northernblots verwendet. Die verwendeten Northernblots beinhalteten polyA-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben (z. B. Gehirn, Skelett muskel, Leber und Niere) und verschiedenen Entwicklungsstadien (fötale und adulte Gewebe). Da, wie oben erwähnt, im fötalen Gehirn nicht nur gehirn spezifische Gene exprimiert werden, wurde die Hybrdisierung mit den Northern blots dazu verwendet, cDNA-Klone zu identifizieren, die vor allem im Gehirn exprimiert werden und weniger in anderen Geweben. Durch diese differentielle Analyse konnte ein cDNA-Klon identifiziert werden, der ein gehirnspezifisches Expressionsmuster aufweist. Unter Verwendung dieses cDNA-Klons konnte durch wiederholtes Hybridisieren der fötalen cDNA-Bibliothek die gesamte mRNA-Sequenz für das darin codierte neue Protein isoliert und entschlüsselt werden (Gen T mit darin codiertem Protein TP).

1. Titration der cDNA-Bibliotheken

Um eine effektive Infektion zu gewährleisten, war es zunächst notwendig, in einer Übernachtkultur phagenkompetente Bakterien herzustellen. Die in dem Medium enthaltenen Magnesium-Ionen induzieren den Maltose-Rezeptor der Bakterien, an dem der Phage bindet, um das Bakterium zu infizieren.

Durchführung

50 µl E. coli XL1-Blue in 50 ml LB-Medium ansetzen, wobei dem Medium MgSO₄ in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt wird. Bei 30°C und 220 rpm über Nacht inkubieren. Abzentrifugieren der Bakterien bei 4°C und 1000 xg für 10 min. In 25 ml 10 mM MgSO₄ resuspendieren. Die so erzeugten phagenkomp etenten Bakterien waren bei 4°C bis zu einer Woche lagerfähig.

2. Ausplattieren der cDNA-Bibliotheken

Zum Ausplattieren der Bibliothek mußten Baltimore Biological Lab. (BBL)-Agarpl atten, und BBL-Top-Agarose vorbereitet werden. Die Phagen (humane bzw. murine cDNA-Bibliothek, Fa. Stratagene) wurden, um nach dem Ausplattieren Einzelplaques zu erhalten, mit SM-Medium 1 : 10₃ und 1 : 10₄ verdünnt.

Durchführung

Für den BBL-Agar (pH 7,2) werden 10 g BBL-Trypticase, 5 g NaCl, und 10 g Select Agar eingewogen und auf 1 l mit H₂O aufgefüllt. Der Agar wird durch Autoklavieren gelöst. Nach Abkühlen auf ca. 60°C die Platten gießen. Die Platten werden vor Gebrauch auf 37°C vorgewärmt, um ein vorzeitiges Ersta rren der Top-Agarose zu vermeiden. Die BBL-Top-Agarose (pH 7,2) wurde mit 10 g BBL-Trypticase, 5 g NaCl, 6,5 g Agarose und 10 ml 1M MgSO₄ Lösung auf 1 l H₂O angesetzt. Durch Autoklavieren lösen und im Wasserbad auf 41°C bereitstellen. 15 µl wie vorstehend angeben verdünnte Phagenlösung und 250 µl der kompetenten XL-1 Bakterien in ein 15 ml Falcontube geben. 20 min. bei Raumtemperatur inkubieren. 10 ml BBL-Top Agarose zugeben, schwenken und auf die angewärmte Agarplatte geben. Nach ca. 20 min ist die Top-Agarose- Schicht fest, und die Platten können mit der Agarseite nach oben gestapelt werden. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 37°C. Die Platten sind nach abgelaufener Inkubationszeit bei 4°C lagerbar oder können direkt zum Transfer der Phagenplaques verwendet werden. Zur Lagerung die Platten diese zusam men mit einem chloroformgetränkten Tuch in Plastiksäcken gut verschließen. Das Chloroform verhindert das Wachstum von kälteliebenden Bakterien und Pilzen.

3. In vivo Excision

Die verwendeten cDNA-Banken (humane und murine fötale Gehirn-cDNA-Bibliot hek; Fa. Stratagene, Heidelberg) waren in dem Vektor λ-ZAPII kloniert. Hierdurch bestand die Möglichkeit, die Subklonierung des Phageninserts in einen Plasmid- Vektor zu umgehen. Dieses Protokoll erlaubt es auf einfache Weise, cDNA, die sich als Insert im λ-ZAPII-Vektor befindet, durch einen in vivo Ansatz in ein Insert zu überführen, das sich nun im Plasmid Blueskript SK(-) befindet. Das Prinzip dieses Ansatzes liegt darin, daß durch einen Helferphagen Informationen für Proteine eingebracht werden, die eine DNA-Amplifikation nur in dem Bereich des Phagengenoms erlauben, die die genetische Information für das Plasmid mit cDNA-Insert besitzen. Es wurde weitgehend nach dem Protokoll des Herstellers (Stratagene) verfahren.

Insbesondere wurde so ausplattiert, daß Einzel-Phagenplaques auf der Platte waren. Mit diesen Einzelplaques wurde dann das in-vivo Excisionsprotokoll durchgeführt. Aus den Bakterienklonen wurde die Plasmid-DNA und deren Plasmid-Inserts isoliert und anschließend mit Northern Blots hydridisiert. Die Auswahl der weiter zu untersuchenden Klone beruhte auf dem Expressions muster bei den Northern Blots.

Durchführung

100 µl eines Einzel-Phagen λ-ZAPII-Klones mit 200 µl XL1-Bakterien und 2 µl Helferphagen (im Stratagene-Kit enthalten) versetzen. 15 min. bei 37°C und 80 rpm schütteln, wobei die spezifische Anlagerung beider Phagentypen an das Wirtsbakterium stattfindet. 3 ml LB-Medium zugeben. 2 h bei 37°C und 200 rpm inkubieren. Während dieser Zeit findet die DNA-Replikation des im I-ZAPII- Vektors enthaltenen Plasmides, dessen Zirkularisierung, sowie die Verpackung in Hüllproteine und Ausschleusung aus dem Bakterium statt. Auf 70°C für 20 min. erhitzen. Im Anschluß 15 min. bei 4000 g zentrifugieren. Dies tötet die noch verbliebenen Bakterien ab und trennt deren Bruchstücke von den in der Phagen hülle vorhandenen Plasmiden ab, die sich im Überstand befinden. 1 µl davon zu 200 µl SOLR-Wirtszellen geben, 15 min. bei 37°C inkubieren. 100 µl auf LB/- Amp-Platten ausplattieren. Über Nacht bei 37°C lagern. Die nun gewachsenen Bakterienklone enthalten das Plasmid mit dem entsprechenden cDNA-Insert. Es wurde jeweils eine Mini-Prep-DNA-Präparation durchgeführt.

4. "random primed" DNA-Markierung

Die radioaktive Markierung der doppelsträngigen Insert-DNA des cDNA-Klons wurde für die weitere Isolation von überlappenden cDNA-Klonen wie folgt durchgeführt.

Durchführung

Für einen typischen Markierungsansatz 100 ng DNA in einem Volumen von 12 µl H₂O lösen. 10minütiges Erhitzen auf 95°C bewirkt die Denaturierung der DNA in Einzelstränge. Ansatz auf Eis lagern, um eine Reassoziation der beiden kom plementären DNA-Stränge zu verhindern. Den Reaktionsansatz durch 4 µl OLB (Oligo-labelling-buffer, 1 µl Klenow (1U) sowie 2,5 µl a-³²P- dCTP und 2,5 µl a- ³²P-dATP komplettieren. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Während dieser Zeit findet die Bildung des Komplementärstranges, ausgehend von den an einen Einzelstrang angelagerten Hexanucleotiden, durch das Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I statt. Die radioaktive Markierung der DNA erfolgt durch den Einbau des a-³²P-dCTP und des a-³²P-dATP.

5. Abtrennen von nichteingebauten radioaktiven Nucleotiden

Die Abtrennung der nichteingebauten Nucleotide erfolgte mit Hilfe einer selbst gefertigten Sephadex G-50 Säule. Das Auftrennungsprinzip der Säule beruht auf der Ausschlußchromatographie. Die kleineren nichteingebauten Nucleotide passen in kleine Poren des Säulenmaterials, während die DNA von diesen ausge schlossen bleibt. Das Volumen, in dem sich die Nucleotide bewegen können ist daher größer als das Volumen, das der DNA zur Verfügung steht. Trägt man nun ein Gemisch aus DNA und Nucleotiden auf die Säule, so läuft die DNA schneller als die Nucleotide durch die Säule. Dies erlaubt die Abtrennung der nichteinge bauten Nucleotide.

Durchführung

Eine Pasteurpipette wurde mit einem kleinen Glaskügelchen verschlossen.

Auffüllen der Pasteurpipette mit in Wasser gelöstem Sephadex G-50 ("Fine") bis sich das Füllmaterial 5 cm unter der Oberkante der Pasteurpipette befindet. 2× Spülen der Säule mit TE. Auftragen des obigen radioaktiven Markierungsan satzes. Zugabe von 320 µl TE. Die Lösung, die durch die Säule gelaufen ist, verwerfen. Eppendorf-Tube unter die Säule stellen. Zugabe von 350 µl TE. Auffangen der durch die Säule gelaufenen radioaktiven Lösung.

6. Plague-"blot"

Der Plaque-"Blot" wurde für die Analyse der cDNA-Bibliothek vorgenommen, um die in Phagenklonen befindliche cDNA der Hybridisierung zugänglich zu machen.

Durchführung

Eine beschriftete, markierte Hybond-N-Membran luftblasenfrei für 1 min auf die Platte mit den Phagenplaques legen. Das Markierungsmuster wurde übertragen. 10 min auf mit Denaturierungslösung (0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl) getränktes Whatmanpapier legen, die Plaque-Seite nach oben. 10 min. in 50 mM Phosph atpuffer neutralisieren. Mit einem Phosphatpuffer-getränkten Kleenex-Tuch werden die verbleibenden Reste des Bakterienrasens mit leichtem Druck abge wischt. Die Filter werden bei Raumtemperatur zum Trocknen ausgelegt. An schließend wurden die Filter 1 h bei 90°C gebacken.

7. Hybridisierung

Die Hybridisierung beruht auf der Bindung komplementärer, einzelsträngiger Nucleinsäuren. Dazu wurde die zu untersuchende DNA auf einer Membran immobilisiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert. Die komple mentäre Bindung bleibt auch nach dem Abwaschen der unspezifisch adhärenten Sonden erhalten und kann autoradiographisch sichtbar gemacht werden. Bei der Hybridsierung wurden einzelsträngige Moleküle unter Salz- und Temperaturbedin gungen inkubiert, die die Bildung von basengepaarten doppelsträngen begünstig en. Einen entscheidenden Faktor bei der Assoziations- und der Dissoziationski netik stellen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen-paaren G-C und A-T dar. Die Hybridisierungsreaktion wird durch Veränderungen der Temper atur und der Salz- und Probenkonzentration beeinflußt.

Durchführung

Zunächst die DNA-Filter in Hybridisierungslösung (0,5 M NaPi (pH 7,2); 7% SDS; 0,2% BSA; 0,2% PEG 6000; 0,05% Polyvinylpyrrolidon 360 000; 0,05% Ficoll 70 000; 0,5% Dextransulfat) mit 0,1 ml/cm² bei 65°C prähybridisieren. Dazu die Filter in einer Kunststoffbox in einem Schüttelwasserbad für die Dauer von mindestens 1 h bei 65°C inkubieren. Die Prähybridisierungslösung verwer fen. Die radioaktiv markierte Probe (s. oben 4. und 5.) mit 0,5 ml/cm² Hybridisi erungslösung (65°C) auf die Filter geben. Die Aktivität der Probe sollte 50 cpm, gemessen im Abstand von 40 cm, nicht unterschreiten. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 65°C (humane cDNA-Bibliothek) oder 55°C (Interspezies hybridisierungen Mensch-Maus und zur Isolation der homologen Gene). Die Filter zweimal 30 min mit etwa 500 ml Waschpuffer im Schüttelbad bei 65°C (55°C) waschen. Daran anschließend wurde eine Autoradiographie durchgeführt.

8. Autoradiographie

Die Filter wurden in Frischhaltefolie verpackt. Die Autoradiographie erfolgte bei -80°C in einer Röntgenkassette, die eine Verstärkerfolie aus Calciumwolframat enthielt. Die Exponierung dauerte je nach Stärke des Signals 30 min bis einige Tage.

Mit Hilfe der oben genannten Techniken konnte die komplette mRNA, die für das Protein des Gens T codiert, isoliert werden. Desweiteren konnte unter der Verwendung von cDNA-Klonen dieses neu isolierten Gens T zwei weitere Gene (T2 und T3) isoliert werden, die mit diesem Gen ausgeprägte Homologien aufweisen. Hierzu wurden wieder die oben erwähnten Techniken verwendet. Zur Isolation der verwandten Gene T2 und T3 wurde die Hybridisierungstemperatur auf 55°C erniedrigt.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das an der Entwicklung des ZNS beteiligt ist und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert wird, wobei die DNA-Sequenz folgende DNA-Sequenzen umfaßt:

a) die DNA-Sequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7 oder Fig. 8;
b) die DNA-Sequenz von Fig. 9 oder Fig. 10;
c) die DNA-Sequenz von Fig. 11 oder Fig. 12;
d) die DNA-Sequenz von Fig. 13;
e) die DNA-Sequenz von Fig. 14 oder Fig. 15;
f) eine mit (a), (b), (c), (d) oder (e) hybridisierende DNA-Se quenz;
g) Varianten oder Fragmente der DNA-Sequenz von (a), (b), (c), (d), (e) oder (f); oder
h) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz von (a), (b), (c), (d), (e), (f) oder (g) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die ein Protein codiert, das die Amino säuresequenz von Fig. 1, Fig. 9, Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13, Fig. 14 oder Fig. 15 umfaßt, wobei das Protein die in Anspruch 1 definierte bio logische Aktivität hat.

3. Antisense-RNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu der DNA-Sequenz von Anspruch 1 oder 2 komplementär ist und die Synthese des von dieser DNA-Sequenz codierten Proteins verringern oder hemmen kann.

4. Ribozym, dadurch gekennzeichnet, daß es zu der DNA-Sequenz von Anspruch 1 oder 2 komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von dieser DNA-Sequenz codierten Proteins verringert oder gehemmt wird.

5. Expressionsvektor, die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend oder die Antisense-RNA nach Anspruch 3 oder das Ribozym nach An spruch 4 codierend.

6. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.

7. Protein, das von der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird und das an der Entwicklung des ZNS beteiligt ist und gewebe- und ent wicklungsspezifisch exprimiert wird.

8. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 7, das die Züch tung der Wirtszelle nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedingungen und die Gewinnung des Proteins aus der Zelle oder dem Zuchtmedium umfaßt.

9. Antikörper, der gegen das Protein nach Anspruch 7 gerichtet ist, oder Fragment davon.

10. Verwendung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, der Antisense- RNA nach Anspruch 3, des Ribozyms nach Anspruch 4, des Expressions vektors nach Anspruch 5, des Proteins nach Anspruch 7 oder des Anti körpers oder des Fragments davon nach Anspruch 9 zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen des ZNS.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Erkrankung des ZNS eine Tu morerkrankung ist.

12. Diagnoseverfahren zum Nachweis einer gestörten Expression des Proteins nach Anspruch 7 oder zum Nachweis einer veränderten Form dieses Proteins, bei dem man eine Probe mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder dem Antikörper oder dem Fragment davon nach Anspruch 9 in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration des Proteins und/oder seine Aminosäuresequenz im Ver gleich zu einer aus einem gesunden Patienten gewonnenen Protein unter scheiden.

13. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 und/oder den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 9 enthält.

14. Nicht-menschliches Säugetier, dessen natürlich vorkommendes T-Gen eine Veränderung der Genstruktur oder der Gensequenz aufweist.

15. Nicht-menschliches Säugetier, wobei die Veränderung der Genstruktur durch die Einführung einer Deletion, an dessen Stelle eine heterologe Sequenz eingeführt wird, erreicht wird.

16. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 14 oder 15, wobei die heterologe Sequenz eine Selektionsmarkersequenz ist.

17. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 14, 15 oder 16, wobei die Selektionsmarkersequenz Resistenz gegen Neomycin vermittelt.

18. Verfahren zur Herstellung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 14-17 gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, ent haltend ein verändertes T-Gen, wobei das T-Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Mar kers, verändert worden ist;
b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-mensch lichen Säuger (bevorzugt Maus);
c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA-Fragment von Schritt (a), wobei das T-Gen in den em bryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird,
d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhanden sein der heterologen Sequenz, insbesondere des selektierbaren Markers,
f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastocysten (bevorzugt Maus-Blastozyten), Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Ana lyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des T- Gens.