DE19828624C1

DE19828624C1 - Modular aufgebaute RNA-Moleküle mit zwei Sequenzbereichstypen

Info

Publication number: DE19828624C1
Application number: DE19828624A
Authority: DE
Inventors: Annemarie Poustka; Johannes Coy
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-06-26
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2000-02-24
Anticipated expiration: 2018-06-27
Also published as: EP1090115A2; WO2000000603A3; WO2000000603A2; AU5407699A; CA2332175A1

Abstract

Beschrieben werden modular aufgebaute RNA-Moleküle, die an einen Liganden binden können und durch zwei Sequenzbereiche gekennzeichnet sind, einen ersten Sequenzbereich, der zur Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des RNA-Moleküls beiträgt, und einen zweiten Sequenzbereich, der für die spezifische Bindung des Liganden verantwortlich ist. Diese RNA-Moleküle, beispielsweise die NINTROX-RNA, können zur direkten Beeinflussung der Genexpression verwendet werden. Beschrieben werden ferner die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle enthaltende Vektoren sowie Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden RNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, ein diese RNA-Moleküle spezifisch erkennender Antikörper bzw. spezifisch an diese RNA-Moleküle bindende Antisense-RNA oder diese RNA-Moleküle spaltende Ribozyme. Außerdem betrifft die Erfindung nicht-menschliche Säuger, deren NINTROX-Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz verändert ist und daraus erhaltene Zellen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft RNA-Moleküle, die durch zwei Sequenzbereichs typen gekennzeichnet sind, einen ersten Sequenzbereichstyp, der zur Aufrech terhaltung der dreidimensionalen Struktur des RNA-Moleküls beiträgt, und einen zweiten Sequenzbereichstyp, der für die spezifische Bindung eines Liganden verantwortlich ist. Vorzugsweise sind diese RNA-Moleküle zur direkten Kontrolle der Genexpression von Nutzen. Die vorliegende Erfindung stellt ferner die für die erfin dungsgemäßen RNA-Moleküle abgeleitete DNA-Sequenz und diese enthaltende Vektoren bereit. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehenden RNA-Moleküle bzw. Vektoren enthalten, einen diese RNA-Moleküle spezifisch erkennenden Antikörper bzw. spezifisch an diese RNA-Moleküle binden de Antisense-RNA oder diese RNA-Moleküle spaltende Ribozyme. Außerdem betrifft die Erfindung nicht-menschliche transgene Säuger und daraus erhaltene Zellen.

Die Regulation der Genexpression bei Eukaryonten erfolgt in der Regel über Protei ne, die üblicherweise an bestimmte regulatorische Sequenzen stromaufwärts des zu exprimierenden Gens spezifisch binden und eine charakteristische Wirkung zeigen (RNA-Polymerasen, Transkriptionsfaktoren, Hormon-aktivierbare Rezeptoren etc.). Bisher sind nur wenige Beispiele für die Kontrolle der Genexpression direkt über RNA-Moleküle bekannt. Dazu zählen die für die Inaktivierung des gesamten X-Chromosoms verantwortliche RNA "XIST" ("X-Chromosome inactivation specific transcript"), eine mit IPW bezeichnete RNA ("imprinted in Prader-Willi syndrome") und die RNA H19, die einen Tumorsuppressor darstellt und an der Steuerung bestimmter Entwicklungsvorgänge beteiligt ist. Die artifizielle Kontrolle der Gen expression wird inzwischen durch die Verwendung von spezifisch an mRNAs bindende Antisense-RNAs bewirkt bzw. durch die Verwendung katalytisch aktiver RNA-Moleküle, sogenannter Ribozyme, die an die Ziel-RNA nicht nur spezifisch binden, sondern diese auch spalten und somit inaktivieren. Allerdings sind die Einsatzmöglichkeiten für diese Antisense-RNAs bzw. Ribozyme begrenzt, vor allem hinsichtlich des zu bindenden und inaktivierenden Liganden, bei dem es sich grundsätzlich nur um RNA handeln kann.

Somit besteht ein Bedarf nach der Bereitstellung von Verbindungen, die universell unterschiedlichste Zielmoleküle, beispielsweise DNA, RNA, Proteine oder nieder molekulare Substanzen, erkennen bzw. inaktivieren können und beispielsweise für die Kontrolle der Genexpression und damit natürlich auch die Prävention und Behandlung von Krankheiten, die mit einer Störung der Genexpression einherge hen, geeignet sind.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, solche Verbindungen bereitzustellen, die unter anderem für die Prävention oder Therapie (und auch Diagnose) von solchen Erkrankungen von Nutzen sind.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.

Von den Erfindern konnte ein RNA-Molekül identifiziert werden, das die vorstehend beschriebenen, erwünschten Eigenschaften aufweist. Dieses RNA-Molekül wird durch das Gen "NINTROX" (No INTROns X-chromosome) kodiert, das keine Introns besitzt, auf dem X-Chromosom lokalisiert ist und für kein Protein kodiert. Die genomische Sequenz des menschlichen NINTROX-Gens einschließlich des ver mutlichen Promotors ist in Fig. 1 gezeigt und die genomische Sequenz des murinen NINTROX-Gens einschließlich des vermutlichen Promotors in Fig. 2. In Fig. 3 wurde ein Sequenzvergleich zwischen humaner und muriner Sequenz durchgeführt. Daraus sieht man, daß es einige sehr sequenzkonservierte Bereiche gibt, die sich gemäß einer per Computer durchgeführten Energieanalyse durch eine hohe Energie auszeichnen (vgl. Fig. 4).

Während der Wirkungsmechanismus der vorstehend diskutierten, auf RNA-Ebene wirksamen Gene vollkommen unklar war, konnte durch die Analyse des NINTROX- Gens zum ersten Mal das Wirkprinzip eines solchen Gens, das nachstehend genau er beschrieben wird, ermittelt werden. Das NINTROX-Gen trägt wesentlich zur Aufrechterhaltung der Funktionen des ZNS insbesondere des Hippocampus bei. Defekte in diesem Gen führen zu Einschränkungen der ZNS-Funktionen, die bis zu mentalen Retardierungen reichen. Desweiteren übt das NINTROX-Gen eine wichti ge Funktion bei der Kontrolle der Zellproliferation aus. Dabei können Veränderun gen in diesem Gen zu Fehlern in der Kontrolle des Zellwachstums, beispielsweise zu Krebs, führen. Die weiteren Untersuchungen ergaben, daß das Expressions muster des NINTROX-Gens gewebe- und entwicklungsspezifisch erfolgt. Die Nort hern-Analysen zeigten eine Expression in allen untersuchten fötalen und adulten Geweben. Es konnten keine Sequenzhomologien mit bereits bekannten Sequenzen festgestellt werden.

Die Strategie, die zur Identifizierung dieses Nucleinsäuremoleküls führte, wird nachstehend beschrieben. Im Rahmen der systematischen Analyse der q28-Region des menschlichen X-Chromosoms konnten verschiedene exprimierte Sequenzen nachgewiesen und isoliert werden. Mit Hilfe dieser exprimierten Sequenzen konn ten einige bisher noch nicht bekannte Gene gemäß Standardmethoden identifiziert und charakterisiert werden, u. a. das der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegen de NINTROX-Gen. Nachdem das komplette Transkript dieses Gens isoliert war, konnten weder längere offene Leseraster innerhalb des Transkripts noch Introns im Gen nachgewiesen werden. Mit Hilfe der menschlichen Klone konnte das murine Homolog dieses Gens gemäß Standardmethoden isoliert werden. Auch dieses Gen zeigte keinen offenen Leserahmen oder Introns.

Interessanterweise zeigen die erfindungsgemäßen NINTROX-RNA-Moleküle einen modularen Aufbau, d. h., sie sind durch das Vorhandensein von zwei verschiedenen Sequenzbereichstypen gekennzeichnet. Während der eine Sequenzbereich die Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur erlaubt und, wie sich durch Vergleich der Sequenzen aus verschiedenen Spezies (Mensch, Hamster, Känguruh, Makaken, Orang-Utan, Schimpansen und Ratte; vgl. Fig. 5) ergibt, nur bedingt konserviert ist, ist der zweite Sequenzbereich, der für die spezifische Bindung an das Zielmolekül verantwortlich ist, sequenzkonserviert. Aufgrund dieser modularen Bauweise der NINTROX-RNA ist es möglich, diese so zu modifizieren, daß ihre Wirkung nicht nur auf die vorstehend beschriebene Kontrolle der Genexpression beschränkt ist, sondern für eine Vielzahl von Möglichkeiten eingesetzt werden kann. Neben der Kontrolle der Genexpression kann mit Hilfe solcher modular aufgebauter RNA-Moleküle auch die Struktur (z. B. Chromatinstruktur, Nuclear- Scaffold) von chromosomalen Bereichen verändert werden. Hierdurch ergibt sich die bisher nicht gekannte Möglichkeit, die Expression von größeren genomischen Bereichen gezielt beeinflussen zu können. So können bestimmte Sequenzbereiche der beiden Module des NINTROX-Gens durch andere Sequenzen oder sogar artifi zielle Sequenzen ersetzt werden, wodurch (a) die Wechselwirkung dieser RNA mit anderen Bindungspartnern (RNA, DNA, andere Makromoleküle und niedermolekula re Verbindungen) oder deren biochemische Umsetzung (z. B. Erhöhung oder Er niedrigung der Umsatzrate) gezielt verändert werden, wodurch das RNA-Molekül gezielt neuen Aufgaben angepaßt werden kann, und/oder (b) die dreidimensionale Struktur der NINTROX-RNA gezielt spezifischen Anforderungen angepaßt werden kann. Dadurch kann eine teilweise oder völlig neuartige Funktion des erfindungs gemäßen NINTROX-RNA-Moleküls erzielt werden.

Somit betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein RNA-Molekül, das an einen Liganden binden kann und folgende Sequenzbereiche umfaßt: (a) einen die dreidimensionale Struktur des RNA-Moleküls aufrechterhaltenden Se quenzbereich, und (b) einen Sequenzbereich für die spezifische Bindung des Liganden.

Der hier verwendete Ausdruck "einen die dreidimensionale Struktur des RNA- Moleküls aufrechterhaltenden Sequenzbereich" besitzt folgenden Begriffinhalt. Dreidimensionale RNA-Strukturen werden durch Basenpaarung verschiedener Basen innerhalb des RNA-Moleküls ermöglicht. Hierbei werden Strukturen wie "Stems" oder "Loops" gebildet. Viele dieser Strukturen ergeben so die Gesamt struktur des RNA-Moleküls. Eine Sequenzänderung innerhalb des RNA-Moleküls kann ohne Folgen für die räumliche Struktur bleiben, wenn die Sequenzverände rung die Basenpaarungen nicht verändert oder wenn die Sequenzänderung durch eine zweite Sequenzänderung ausgeglichen wird. Wird beispielsweise die Basen paarung A-T zerstört, indem das A zum G mutiert, so kann diese Mutation durch die weitere Mutation des T zum C ausgeglichen werden. Dadurch ändert sich zwar die Sequenz, aber die räumliche Struktur bleibt gleich. Dies hat zur Folge, daß die diesselbe RNA-Struktur durch extrem viele unterschiedliche RNA-Sequenzen gebildet werden kann. Hinweise auf bestimmte RNA-Strukturen ergibt die Analyse der darin enthaltenen Energie. Diese Analyse kann mittels kommerziell erhältlicher Computerprogramme (z. B. "FOLD"; Michael Zuker und P. Stiegler: Optimal Compu ter Folding of Large RNA Sequences using Thermodynamics and Auxiliary Informa tion, Nucleic Acids Research (81), 9(1), S. 133) durchgeführt werden. Je geringer der Energieinhalt einer bestimmten Sequenz ist, desto stabiler sind die dreidimen sionalen RNA-Strukturen. Die Analyse des NINTROX-Gens zeigte eine konservierte Verteilung dieser energiearmen Strukturen (vgl. Fig. 5). Die Basensequenz dieser RNA-Bereiche sind bei verschiedenen Spezies sehr unterschiedlich, der Energie inhalt ist aber äußerst konserviert. In Fig. 3 sind dies die Sequenzbereiche, die nicht durch einen schwarzen Balken am Rand gekennzeichnet sind. Dies bedeutet, daß der die dreidimensionale Struktur des RNA-Moleküls aufrechterhaltenden Sequenzbereich nicht sequenz-, aber energiekonserviert ist. So richten sich Modifi kationen dieses Sequenzbereichs auch nicht nach der Basensequenz, sondern nach der Erhaltung des ermittelten Energieinhalts.

Der hier verwendete Ausdruck "ein Sequenzbereich für die spezifische Bindung des Liganden" betrifft einen Sequenzbereich, der so beschaffen ist, daß er den ge wünschten Liganden spezifisch binden kann. Diese Sequenzbereiche sind sehr sequenzkonserviert. In Fig. 3 sind diese Bereiche durch einen schwarzen Balken am Rand gekennzeichnet und haben einen hohen Energieinhalt (vgl. Fig. 5). Dies deckt sich mit der Beobachtung, daß diese Sequenzbereiche nicht "verpackt" sind, sondern nach außen gerichtet sind und für die Bindung des Liganden, enzymati sche Reaktionen oder die Bindung an andere RNA- oder DNA-Sequenzen ver antwortlich sind. Falls es sich bei dem zu bindenden Liganden um ein RNA-Molekül oder ein DNA-Molekül handelt, wird dieser Sequenzbereich zu einem entsprechen den, ausreichend langen Abschnitt des RNA-Moleküls oder DNA-Moleküls Kom plementarität aufweisen. Falls es sich bei dem zu bindenden Liganden um ein Protein handelt, kann der Sequenzbereich (b) ganz oder teilweise durch eine DNA- Sequenz ausgetauscht oder ergänzt werden, von der bekannt ist, daß sie das gewünschte Protein spezifisch bindet.

Die beiden oben beschriebenen Sequenztypen kommen mehrere Male innerhalb der NINTROX-RNA vor. Der Austausch oder die Veränderung einzelner solcher Module ermöglicht die gezielte Veränderung der NINTROX-RNA. So ist bei einer Modifika tion des die dreidimensionale Struktur aufrechterhaltenden Moduls auf den er mittelten Energieinhalt zu achten, sodaß dieser einen minimalen Wert beibehält. Die Modifikation des anderen Sequenzbereichs, obwohl dieser gerade als sequenz konserviert gilt, unterliegt nur geringen Beschränkungen. So kann dieser Bereich ganz oder teilweise weggelassen werden oder kann Insertionen enthalten. Bei spielsweise können auch Sequenzen in das NINTROX-RNA-Molekül integriert werden, die bekannte biochemische Eigenschaften aufweisen oder bestimmte DNA-, RNA-Moleküle oder Proteine binden. Darüber hinaus können Zufallssequen zen unterschiedlicher Länge an verschiedenen Stellen des NINTROX-Gens einge baut werden und danach kann auf spezifische Eigenschaften wie biochemische Umsetzung, spezifische Bindung usw. selektioniert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen RNA-Moleküls umfaßt der Sequenzbereich (a) die in Fig. 3 nicht am Rand gekennzeichneten Sequenzbereiche oder dazu verwandte Sequenzen, die ebenfalls die Aufrechterhal tung der dreidimensionalen Struktur des RNA-Moleküls erlauben und von dem Sequenzbereich (a) in Fig. 3 abweicht. Diese Abweichungen betreffen die Ad dition, Deletion und/oder Insertion von Basen, wobei der für die Sequenz von Figur (3) ermittelte Energieinhalt zu mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85% und mehr bevorzugt zu mindestens 90% erhalten bleibt. Vorzugsweise bleibt bei diesen eingeführten Änderungen die ursprüngliche dreidimensionale Struktur erhalten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Sequenzbereich (b) des erfindungsgemäßen RNA-Moleküls die in Fig. 3 dargestellten Sequenzen, die am Rand mit schwarzen Balken versehen sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen RNA- Moleküls handelt es sich bei dem zu bindenden Liganden um ein DNA-Molekül oder ein Protein oder Enzym, z. B. DNA-Polymerase I. Vorzugsweise enthält das erfin dungsgemäße RNA-Molekül eine Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende, was zur Stabilität in einer gewünschten Wirtszelle beitragen kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße RNA- Molekül zur Kontrolle der Genexpression verwendet. Dazu wird der Sequenzbereich (b) so modifiziert, daß er ein für die Genexpression verantwortliches Protein bindet, oder an einen bestimmten DNA-Bereich des Zielgens, wodurch beispielsweise die Anlagerung von Proteinen, die einen die Genexpression hemmenden oder fördern den Einfluß haben, behindert oder unterbunden wird, oder auch direkt an die mRNA des Zielgens, wodurch beispielsweise die Translation behindert oder unter bunden wird. Der Fachmann kann ohne weiteres durch entsprechende Modifikatio nen des Sequenzbereichs (b) und evtl. auch des Sequenzbereichs (a) das erfin dungsgemäße RNA-Molekül so modifizieren, daß es den gewünschten Liganden bindet und so die Genexpression in dem gewünschten Maß kontrolliert.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine, das erfindungsgemäße RNA-Molekül kodierende DNA-Sequenz, sowie ein Gen mit folgenden Merkmalen: Es enthält einen Promotor, der die Transkription in einer gewünschten Wirtszelle erlaubt sowie eine damit funktionell verknüpfte, das erfindungsgemäße RNA-Molekül kodierende DNA-Sequenz. Vorzugsweise enthält das Gen zusätzlich ein Termina tionssignal und eine Polyadenylierungsstelle.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Gen die in Fig. 1 oder 2 dargestellte Sequenz.

Die das erfindungsgemäße RNA-Molekül kodierenden DNA-Sequenzen oder Gene können auch in einen Vektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen oder Gene enthaltende Vektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z. B. pUC18, pBR322, pBlueS cript), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die das erfindungsgemäße DNA-Molekül kodierende Sequenz im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Ex pression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulato rischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Bei spiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin- Promotor. Zu geeigneten Vektoren zählen beispielsweise auf T7 basierende Ex pressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56 (198-7), 125), pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol.Ch em. 263 (1988), 3521) und von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die erfindungsgemäßen RNA-Molekü le kodierenden Sequenzen enthaltende Vektor ein viraler Vektor, beispielsweise ein Vaccinia-Virus oder Adenovirus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Beson ders bevorzugt sind RNA-Viren, vor allem Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle kodierenden Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, syn thetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispiels weise in Sambrook et al., beschrieben sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Trans formation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle unter Verwen dung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die das erfindungsgemäße RNA- Molekül spezifisch erkennen. Die Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen monoclonalen Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das erfindungsgemäße RNA-Molekül oder ein Fragment davon als Immunogen dienen. Monoclonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus- Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Hemmung der Aktivität der erfindungsgemäßen RNA-Moleküle, beispielsweise zur Beeinflussung der Gen expression, verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise auch in diagnostischen Assays verwendet werden, um nachweisen zu können, ob eine Dysregulation der Genepression, beispielsweise durch einen Verlust oder Mangel der verantwortlichen NINTROX-RNA einhergeht. Die Antikörper können in Immu nassays in Flüssigphase vorliegen oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Ge eignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA.

Die Erfindung betrifft ferner Antisense-RNAs, die an ein erfindungsgemäßes RNA- Molekül spezifisch binden und zur Herabsetzung der Expression von Genen, die unter direkter Kontrolle von RNA, beispielsweise NINTROX-RNA, stehen, in vitro oder in vivo verwendet werden können. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Antisense-RNA an eine Zielzelle führt zu einer herabgesetzten Genexpression und ist für die Behandlung von Erkrankungen besonders nützlich, die durch eine zu hohe Genexpression des unter direkter RNA-Kontrolle stehenden Gens gekenn zeichnet sind (z. B. bei Krebserkrankungen). Dabei können die Antisense-RNAs direkt verabreicht werden oder als diese kodierende DNA, vorzugsweise in einen geeigneten Vektor inseriert. Zu den geeigneten Vektoren zählen alle bereits vor stehend in Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen RNA-Molekülen beschrie benen Vektoren.

Die erfindungsgemäßen Antisense-RNAs umfassen eine Antisense-Sequenz mit mindestens 7 bis 10 oder mehr Nucleotiden, die mit einer Sequenz des erfindungs gemäßen RNA-Moleküls, beispielsweise NINTROX-RNA, spezifisch hybridisieren. Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße Antisense-RNA eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nucleotiden oder von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden auf. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antisen se-RNAs um RNAs, die kürzer als etwa 100 Nucleotide oder kürzer als etwa 200 Nucleotide sind. Im allgemeinen sollten die Antisense-RNAs lang genug sein, um eine stabile Doppelhelix zu bilden, jedoch kurz genug (in Abhängigkeit von der Art der Zuführung) um, falls erwünscht, in vivo verabreicht werden zu können. Im allgemeinen ist die Antisense-Sequenz zur Gewährleistung einer spezifischen Hybridisierung zu der Ziel-Sequenz im wesentlichen komplementär. In bestimmten Ausführungsformen ist die Antisense-Sequenz genau komplementär zu der Zielse quenz. Die Antisense-RNAs können jedoch auch Nucleotid-Substitutionen, Ad ditionen, Deletionen, Transitionen, Transpositionen oder Modifikationen enthalten, solange die spezifische Bindung an die relevante Zielsequenz als eine funktionelle Eigenschaft der Antisense-RNA beibehalten wird. Die Antisense-RNAs können auch zusätzlich zu den Antisense-Sequenzen weitere Sequenzen enthalten. Die Antisense-RNAs (sowie die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle) können unter Verwendung jedes zur Herstellung von Nucleinsäuren geeigneten Verfahrens hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese de novo oder durch Clonierung. Eine Antisense-RNA kann beispielsweise auch dadurch hergestellt werden, daß eine Sequenz der Ziel-RNA oder eines Fragments davon in umgekehr ter Orientierung funktionell mit einem Promotor verknüpft in einen Vektor (z. B. ein Plasmid) inseriert wird. Unter der Voraussetzung, daß der Promotor und vorzugs weise Terminations- und Polyadenylierungssignale korrekt positioniert sind, wird der Strang der inserierten Sequenz, der dem nicht-codierenden Strang entspricht, transkribiert, und dieser wirkt als eine Antisense-RNA.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Ribozyme, die die erfindungsgemäßen RNA- Moleküle spezifisch spalten und somit auch zur Hemmung der Genexpression von Nutzen sind. Nützliche Ribozyme können 5'- und 3'-terminale Sequenzen um fassen, die zu der Ziel-RNA komplementär sind, und diese können vom Fachmann nach Standardverfahren konstruiert werden (siehe beispielsweise PCT-Veröffentli chung WO 93/23572). Zu den erfindungsgemäßen Ribozymen gehören beispiels weise Ribozyme mit den Merkmalen der Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech, Biotech nology 13 (1995), 323) und "hammerhead"-Ribozyme (Edgington, Biotechnology 10 (1992), 256).

In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Ribozyme per se als Arzneimittel verwendet. In einer anderen Ausführungsform werden Gentherapiever fahren zur Expression von Ribozymen in einer Zielzelle ex vivo oder in vivo ange wandt. Die Verfahren zur Verabreichung der Ribozyme bzw. zur Expression der Ribozyme in vivo entsprechen den vorstehend in Zusammenhang mit den erfin dungsgemäßen RNA-Molekülen beschriebenen Verfahren.

Die Isolierung und Charakterisierung des menschlichen NINTROX-Gens und ins besondere des Maushomologs des NINTROX-Gens erlaubt die Etablierung eines Tiermodells, das die Bereitstellung von Therapien und Arzneimitteln für die vor stehend diskutierten Krankheiten erlaubt. Durch die Bereitstellung der Sequenz des NINTROX-Gens ist sowohl eine Diagnose (post- oder pränatal) als auch eine Therapie von Erkrankungen möglich, bei denen die Genexpression durch das Fehlen von NINTROX-RNA oder einen Überschuß von NINTROX-RNA gekennzeichnet ist. Die therapeutische oder diagnostische Anwendung ist jedoch nicht nur auf Krank heiten beschränkt, die mit einer Fehlregulation der Expression eines Gens ein hergehen, das unter Kontrolle der NINTROX-RNA steht, sondern die entsprechend den vorstehend beschriebenen Möglichkeiten veränderten RNA-Moleküle bieten darüber hinaus die Möglichkeit völlig neuer Therapeutika.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ferner Arzneimittel, die die vorstehend beschriebenen RNA-Moleküle, Vektoren, Antikörper, Antisense-RNAs oder Ribozy me enthalten. Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharma zeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispiels weise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parentera le Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z. B. direkt zu einem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intrave nöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium eines Tumors, der Art der Verabreichung etc.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Prävention oder Be handlung von Erkrankungen verwendet, die mit einer Störung der Kontrolle der Genexpression in Zusammenhang stehen. Besonders bevorzugt wird das erfin dungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Erkran kungen des ZNS verwendet. Dabei kann das Arzneimittel in der Gentherapie Verwendung finden, wobei die vorstehend beschriebenen Verfahren bzw. Vektoren zur Einschleusung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren Anwendung finden können. Andererseits kann das erfindungsgemäße RNA-Molekül direkt verabreicht werden, um so in Zellen, die keine funktionalen Kopien des RNA-Moleküls mehr besitzen, normale Expression des Gens wiederherzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine diagnostische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße RNA-Molekül, die dieses kodierende DNA-Sequenz oder ein Fragment davon, den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, oder die erfindungsgemäße Antisense-RNA oder ein Fragment davon enthält oder Kombinationen davon, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Nachweis mittel. Mittels dieser diagnostischen Zusammensetzung kann der Nachweis dar über erfolgen, ob die direkt die Genexpression steuernde RNA, beispielsweise NINTROX-RNA vorhanden ist oder im Vergleich zu einer Kontrolle in zu hoher oder niedriger Konzentration oder mit einer abweichenden Länge vorliegt. Dabei wird vorzugsweise der Antikörper oder ein Fragment davon in den vorstehend beschrie benen Assays oder die Antisense-RNA oder ein Fragment davon als Sonde in Hybridisierungsexperimenten verwendet. Vorzugsweise weist dazu die Sonde eine Länge von mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 15 Basen auf. Ge eignete, auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit Radioisotopen, Biolumi neszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkern, Metallchelaten, Enzymen etc. Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A) + RNA aus biologischen Proben, der Auftrennung der RNAs auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybride, beispielsweise über "Northern-Blot"; angewandt werden. Vorzugsweise erfolgt dabei die Diagnose von Erkrankungen, wie sie vorstehend im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Arzneimitteln beschrieben wurden.

Eine Diagnose kann auch auf DNA-Ebene erfolgen. Dabei wird mit den vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen die Intaktheit des Gens, das die an der Regulation der Genexpression direkt beteiligte RNA, beispielsweise NINTROX-RNA, kodiert untersucht (beispielsweise hinsichtlich Vorhandensein, Länge oder Mutatio nen). Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispielsweise über "Southern-Blot"; angewandt werden. Der vorstehende Nachweis kann auch über PCR durchgeführt werden. Dabei werden Primer verwendet, die die kodierende Sequenz flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Amplifikationsprodukte von DNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich, beispielsweise hinsichtlich ihrer Länge oder Sequenz, von den Amplifikationsprodukten von DNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein nicht-menschliches Säugetier, dessen NINTROX-Gen verändert ist, z. B. durch Insertion einer heterologen Se quenz, insbesondere einer Selektionsmarkersequenz.

Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier, dessen NINTROX-Gen verändert sein kann. Beispiele solcher Säuge tiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.

Der Ausdruck "NINTROX-Gen, das verändert ist" bedeutet, daß in dem im nicht- menschlichen Säugetier natürlich vorkommenden NINTROX-Gen durch Standard methoden eine Deletion von ca. 1-2 kb durchgeführt und an dessen Stelle eine heterologe Sequenz, z. B. ein Konstrukt zur Vermittlung von Antibiotika-Resistenz (z. B. eine "neo-Kassette") eingefügt wird. Diese Methode ist allgemein in Schwar tzberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, S. 3210-3214, 1990 beschrie ben, worauf hier Bezug genommen wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen können in jeglicher Form vorliegen, z. B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.

Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Verfahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, enthaltend ein verändertes NINTROX-Gen, wobei das NINTROX-Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Markers, ver ändert worden ist;
b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-menschlichen Säuger (bevorzugt Maus);
c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA- Fragment von Schritt (a), wobei das NINTROX-Gen in den embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird,
d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhandensein der heterologen Sequenz, insbesondere des selektierbaren Markers,
f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastocysten (bevorzugt Maus-Blasto zysten), Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Ver änderung des NINTROX-Gens.

In Schritt (c) wird der Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R. M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) ausgenutzt, um embryonale Stammzellen zu transfizieren. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA-Sequenzen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Methode können bei Verwendung embryonaler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.

Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" betrifft jegliche embryonalen Stammzel len eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung des NINTROX- Gens eignen. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1 oder 129/SV.

Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung des NINTROX-Gens er möglicht. Vorzugsweise weist der Vektor einen Marker auf, mit dem auf vorhan dene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die gewünschte Rekom bination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z. B. die IoxP/tkneo-Cassette, die mit Hilfe des Cre/IoxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(f) durchzuführen.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitge stellt, dessen NINTROX-Gen verändert ist. Diese Veränderung kann ein Ausschal ten der Genexpression-regulierenden Funktion sein. Mit einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die Genexpression-kontrollierde Funktion von NINTROX untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arznei mittel und Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die kontrollierde Funktion von NINTROX eingewirkt werden kann. Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Basis, um auf die verschiedensten Erkrankungen einzuwirken.

Solche Erkrankungen sind z. B. Einschränkungen der ZNS-Funktionen, die bis zu mentalen Retardierungen reichen oder die Induktion von Krebs durch Fehler bei der Kontrolle der Zellproliferation. Ferner sollte es möglich sein, die Rolle des Hippocam pus näher zu untersuchen und zu charakterisieren.

Die folgenden Klone wurden am 4. Mai 1998 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, hinterlegt:
DSM 12153: E.coli JFC-484, Teilsequenz der humanen NINTROX- cDNA
DSM 12154: E.coli JFC-622, Teilsequenz der murinen NINTROX-cDNA
DSM 12155: E.coli JFC-8D3, Sequenz der humanen genomischen NINTROX-DNA
DSM 12156: E.coli JFC-P1-165, Sequenz der murinen genomischen NINTROX-DNA

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Humane Sequenz des NINTROX-Gens (einschließlich des vermutlichen Promotors)

Fig. 2: Murine Sequenz des NINTROX-Gens (einschließlich des ver mutlichen Promotors)

Fig. 3: Sequenzvergleich humane (oben) und murine (unten) Seq uenz
gestrichelt: Promotor
durchgezogener Balken: Sequenzkonservierte Bereiche (b)

Fig. 4: Energiediagramm der Sequenzen aus Fig. 3

Fig. 5: Homologievergleich von NINTROX aus verschiedenen Spe zies

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung:

Beispiel 1: Identifizierung und Charakterisierung des NINTROX-Gens

Zur Identifikation von transkribierten Sequenzen aus der Region Xq27.3 bis Xqter wurde zunächst aus verschiedenen Geweben des Schweins (Niere, Herz, Milz, Leber, Gehirn usw.) Gesamt-RNA isoliert und mit Hilfe von Oligo-dT in Erststrang-cDNA überschrie ben. Diese komplexen cDNA-Proben, die alle in dem jeweiligen Gewebe transkribierten Gene repräsentieren, wurden dann radio aktiv markiert und mit der Xq27.3-Xqter spezifischen Cosmid-Bi bliothek hybridisiert. Die Cosmid-Bibliothek wurde dabei in Form von systematisch auf Nylonmembranen angeordneten Cosmid- Klonen analysiert. Anschließend wurde von den Cosmid-Klonen, die mit den komplexen cDNA-Proben positive Hybridisierungssignale aufwiesen, die Cosmid-DNA isoliert, mit EcoRI verdaut, durch Gel elektrophorese getrennt und auf Nylonmembranen transferiert. Die Restriktionsfragmente, die dann eine positive Hybridisierung mit den komplexen, radioaktiv markierten cDNA-Proben aufwiesen, wurden dann isoliert und radioaktiv markiert und zum Durchsuchen einer fötalen humanen cDNA-Bank verwendet. Hierdurch konnten positive cDNA-Klone isoliert werden, die das Transkript des NIN- TROX-Gens repräsentierten.

Claims

1. RNA-Molekül, das an einen Liganden binden kann und folgende Sequenz bereiche umfaßt:

a) einen die dreidimensionale Struktur des RNA-Moleküls aufrechter haltenden bedingt konservierten Sequenzbereich; und
b) eine sequenzkonservierten Sequenzbereich für die spezifische Bindung des Liganden.

2. RNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei der Sequenzbereich (a) die in Fig. 3 ohne Balken am Rand dargestellte abgeleitete DNA-Sequenz umfaßt oder eine dazu ver wandte Sequenz, die ebenfalls die Aufrechterhaltung der dreidimensiona len Struktur des RNA-Moleküls erlaubt.

3. RNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Sequenzbereich (b) die in Fig. 3 mit Balken am Rand dargestellte abgeleitete DNA-Sequenz umfaßt.

4. RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Ligand ein DNA-Molekül oder ein Protein ist.

5. RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das zusätzlich eine Po ly(A)-Sequenz am 3'-Ende enthält.

6. RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Kontrolle der Genex pression.

7. DNA-Sequenz, die ein RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.

8. Gen, das die in Fig. 1 oder 2 dargestellte Sequenz umfaßt.

9. Vektor, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 oder das Gen nach An spruch 8 enthaltend.

10. Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor ein Plasmid ist.

11. Vektor nach Anspruch 10, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.

12. Vektor nach Anspruch 11, der ein RNA-Virus ist.

13. Vektor nach Anspruch 12, der ein Retrovirus ist.

14. Wirtszelle, den Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 13 enthaltend.

15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

16. Antikörper oder ein Fragment davon, die ein RNA-Molekül nach einem der Anspüche 1 bis 6 spezifisch binden.

17. Antikörper nach Anspruch 16, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

18. Antisense-RNA, die an ein RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 spezifisch bindet.

19. Verwendung des RNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6, des Vektors nach einem der Ansprüche 9 bis 13, des Antikörpers oder des Fragments davon nach Anspruch 16 oder 17, oder der Antisense-RNA nach Anspruch 18 zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten, die mit einer Störung der Kontrolle der Genexpression in Zusammenhang stehen.

20. Verwendung des RNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der DNA-Sequenz nach Anspruch 7 oder eines Fragments davon, des Antikör pers oder des Fragments davon nach Anspruch 16 oder 17, oder der Anti sense-RNA nach Anspruch 18 oder eines Fragments davon zur Diagnose von Krankheiten, die mit einer Störung der Kontrolle der Genexpression in Zusammenhang stehen.

21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei es sich bei der Krankheit um eine Tumorerkrankung oder einer Erkrankung des Zentralnervensy stems handelt.

22. Nicht-menschliches Säugetier, dessen NINTROX-Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz verändert ist.

23. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 22, wobei die heterologe Sequenz eine Selektionsmarkersequenz ist.

24. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Se lektionsmarkersequenz Resistenz gegen Neomycin vermittelt.

25. Verfahren zur Herstellung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach ei nem der Ansprüche 22-24, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Herstellung eines DNA-Fragments, enthaltend ein verändertes NINTROX-Gen, wobei das NINTROX- Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, verändert worden ist;
b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-mensch lichen Säuger;
c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA-Fragment von Schritt (a), wobei das NINTROX-Gen in den embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird,
d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhanden sein der heterologen Sequenz;
f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastocysten, Übertragen der Blastozysten in pseu do-schwangere weibliche Säuger und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des NINTROX- Gens.