DE69928960T2

DE69928960T2 - Herstellung eines retrovirus, welches den mel-lokus von streptomyces enthält, sowie dessen expression in säugetierzellen

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Publication number: DE69928960T2
Application number: DE69928960T
Authority: DE
Inventors: Ming Zhao
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 1998-10-27
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-10-28
Also published as: EP1127121A2; WO2000024895A3; DE69928960D1; AU1324100A; WO2000024895A2; EP1127121B1; ATE312916T1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln von Störungen bezüglich der Tyrosinasegenexpression und der Melaninbiosynthese. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Modell für die Haarpigmentierung.
Die Behandlung des Haars und der Haut mit verschiedenen Cremes oder Lotionen mit biologisch aktiven Bestandteilen zur Verbesserung des Haarwachstums und der Pigmentierung war im Allgemeinen nicht zufrieden stellend. Von vielen verschiedenen verfügbaren, äußerlich angewandten Mitteln wird behauptet, dass sie den Körper, die Flexibilität, die Lockenbildung und die Haarfarbe verbessern. Diese weisen jedoch einen beschränkten und nur kurzzeitigen Nutzen auf. Insbesondere erfordert das Färben des Haars mit verschiedenen Farbstoffen häufige Wiederholungen und stellt nicht immer ein natürliches Aussehen bereit. Die Erfindung stellt verbesserte Alternativen bereit, wobei Tyrosinase und Zellzyklusinhibitoren im Mittelpunkt stehen.
Tyrosinase ist eine ubiquitär verteilte Kupfer-enthaltende Monoxygenase, die für die Melaninbiosynthese in Pigmentzellen essentiell ist. Sie katalysiert die Umwandlung von Tyrosin in Dihydroxyphenylalanin (DOPA) und die Umwandlung von DOPA in Dopachinon, was als Tyrosinhydroxylaseaktivität bzw. als DOPA-Oxidaseaktivität bezeichnet wird.
Störungen der Tyrosinasegenexpression und der Melaninbiosynthese liegen bei vielen Krankheiten vor, an denen eine Pigmentierung beteiligt ist, wie z.B. Albinismus, Haarpigmentverlust und Vitiligo. Die Tyrosinase ist ein Schlüsselenzym für die Melaninsynthese in Pigmentzellen, Melanozyten und retinalen Pigmentepithelzellen bei Wirbeltieren. Tyrosinase fehlt in menschlichen weißen Haarzwiebeln sowie in Albino-Epithelzellen. Folglich könnte der Verlust an Tyrosinase die Basis eines Pigmentverlusts im Haar sein. Es wird auch angenommen, dass die Tyrosinaseaktivität bei der Parkinson-Krankheit anomal ist. Die Tyrosinase wird in Gehirnzellen in der Substantia nigra, dem Vorderhirn und dem Mittelhirn exprimiert, und folglich könnte Tyrosinase an der Neuromelaninbildung in der Substantia nigra beteiligt sein und deshalb mit neurodegenerativen Störungen zusammenhängen.
Die Tyrosinasegene der Maus und des Menschen wurden geklont (Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7473–7477; Yamamoto et al., Jpn. J. Genet. (1989) 64, 121–135; Ruppert et al., EMBO J. (1988) 7, 2715–2722). Die Strukturgene für die Tyrosinase vom Men schen und der Maus weisen lange DNA-Sequenzen auf. In Mäusen befindet sich das Strukturgen für Tyrosinase auf der c-Stelle von Chromosom 7, die einen Bereich von mehr als 70 kb umfasst. In Menschen befindet sich das Tyrosinasegen auf der c-Stelle auf dem Chromosom 11. Es wurde berichtet, dass nur das volle Komplement von fünf Exons Tyrosinasenegativen Zellen die Tyrosinaseenzymaktivität verleihen konnte.
Tyrosinase-cDNA's von der Maus und vom Menschen wurden in Säugerzellen nach der Transfektion exprimiert, vgl. Muller et al. (1988), Tomita et al. (1989), Yamamoto et al. (1989), vorstehend, Geibal et al. (1990), Porter et al., Gene (1991) 97, 277–282, Mishima et al. (1993) und US-Patent 5,753,263. Mehrere cDNA-Klone der Maus-Tyrosinase wurden unabhängig voneinander isoliert. Bei diesen cDNA-Klonen gibt es mehrere Unterschiede bei der abgeleiteten Aminosäuresequenz. Muller et al. (1988), vorstehend, haben berichtet, dass einer ihrer cDNA-Klone, pmcTYr1, das Kodierungsvermögen für Tyrosinase aufwies, und sie zeigten, dass pmcTYr1 in kultivierte menschliche amelanotische Melanomzellen insertiert werden konnte. Sie haben jedoch keinerlei Pigmenterzeugung beschrieben. Andererseits haben Yamamoto et al. (1989), vorstehend, das Maus-Tyrosinase-cDNA-Minigen mg-Tyr1-J konstruiert, das mit einer genomischen 5'-nicht-kodierenden flankierenden Sequenz ligiert wurde, und haben kultivierte Albino-Melanozyten transfiziert, die Tyrosinase und Melanin erzeugten.
Das Tyrosinasegen in Albino-Mäusen weist eine einzelne Basenpaar-Mutation im Exon 1 auf, die zu einem nicht-funktionellen Tyrosinaseprotein und einem Fehlen von Melanin in den Albino-Melanozyten führt. Melanin wurde in amelanotischen Melanozyten in transgenen Albino-Mäusen erzeugt, in deren befruchtete Eier ein Tyrosinase-Transgen einer normalen Maus insertiert wurde, und Melanin wurde in den Haarzwiebeln, den Haarschäften, der Aderhaut und dem Pigmentepithel festgestellt, Tanaka et al., Development (1990) 108, 223–227, Beerman et al., Pigment Cell Research (1992) 5, 295–299. Menschliche Tyrosinase-cDNA wurde verwendet, um amelanotische Melanomzellen zu transfizieren und eine Melaminerzeugung zu induzieren, Ando et al., J. Invest. Dermatol. (1993) 101, 864–870.
Die Tyrosinasekonstrukte vom Menschen und von der Maus können aufgrund ihrer Komplexität und Größe nur schwer gehandhabt werden. Viele Streptomyces-Arten können aufgrund der Expression von Tyrosinase von dem mel-Operon ebenfalls Melanin bilden, vgl. Kuster et al. (1976), Chromogenicity of actinomycetes, Actinomycetes: The Boundary Of Microorganisms, Hrsg. T. Arai, Tokio: Toppan Co., 43–45. Die 1,2 kb-mel-Stelle von S. antibioticus wurde geklont und sequenziert und es hat sich gezeigt, dass sie ein Tyrosinase-Strukturgen und ein offenes Leseraster ORF-438 enthält. Das ORF-438-Protein reguliert den Kupfereinbau, der für die Expression und Funktion der Tyrosinase und die Melaninerzeugung in Streptomyces essentiell ist. Das ORF-438-Gen und das Tyrosinasegen werden von dem gleichen Promotor transkribiert, der sich in der 5'-Region angrenzend an ORF-438 befindet, was zeigt, dass diese Gene ein Operon bilden, Bernan et al., Gene (1985) 37, 101–110. Das ORF-438-Protein wirkt als Transaktivator von Tyrosinase, vgl. Lee et al., Gene (1988) 65, 71–81. Das ORF-438-Protein führt Apotyrosinase auch Kupfer zu, so dass aktive Tyrosinase erzeugt wird. Die Erzeugung von Melanin in E. coli von der mel-Stelle von S. antibioticus hing von der Coexpression eines Volllängen-ORF-438-Gens sowie von dem Tyrosinasegen ab, vgl. Della-Cioppa et al., Biotechnology (1990) 8, 634–638.
Die Eigenschaften des mel-Operons, das eine geringere Größe aufweist, keine Introns besitzt und ein Potenzial für eine starke Expression zeigt, wurden zur Konstruktion von Vektoren genutzt, die zum Aufbau von Modellen für Pigmentierungsstörungen und zur Behandlung eines Tyrosinasemangels geeignet sind.
Die Verwendung von Zellzyklusinhibitoren, um den Effekten einer Alopezie entgegen zu wirken, durch die Abgabe von Genen, die solche Inhibitoren kodieren, in liposomalen Formulierungen an Haarfollikel wurde im US-Patent 5,753,263, veröffentlicht am 19. Mai 1998, vorgeschlagen. Die vorliegende Erfindung beschreibt die erfolgreiche Expression des p21-Gens in Haarfollikeln in einer Haut-Gewebekultur, die durch eine GFP-Fluoreszenz überwacht wurde. Die Verabreichung dieses Zellzyklusinhibitors oder anderer Zellzyklusinhibitoren zur Eindämmung von Alopezie kann zusammen mit einer Korrektur der Tyrosinaseeffizienz oder unabhängig davon durchgeführt werden.
Allgemein betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln von Störungen, die mit der Tyrosinasegenexpression und der Melaninbiosynthese zusammenhängen, und Modellsysteme für solche Störungen. Sie betrifft auch die Verwendung von Zellzyklusinhibitoren zur Eindämmung von Alopezie durch das Bewirken einer Expression dieser Inhibitoren in Haarfollikeln.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül zur effizienten Erzeugung einer funktionellen Streptomyces-Tyrosinase in Säugerzellen, das eine bicistronische Nukleotidsequenz umfasst, die eine Tyrosinase-kodierende Nukleotidsequenz und eine Nukleotidsequenz, die ein ORF-438 kodiert, umfasst, die durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle-Sequenz (IRES) gekoppelt sind.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Expressionssystem der Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln eines Tyrosinasemangels oder einer Pigmentierungsstörung in einem Lebewesen, wobei das Verfahren das Modifizieren der Zellen des Lebewesens mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die zu behandelnden Zellen Haarfollikelzellen und die Lebewesen sind Säuger, wie z.B. Primaten, einschließlich Menschen, domestizierte Tiere und Nager. Das Expressionssystem kann als einziges Behandlungsverfahren verwendet werden, jedoch kann das System auch in Kombination mit einer Verabreichung anderer nutzbringender Verbindungen verwendet werden, wie z.B. Proteine, Pigmente, Farbstoffe, Wachstumsregulatoren und andere Verbindungen, welche die Eigenschaften der Haut und der Haare beeinflussen. Folglich kann das Expressionssystem zusätzlich zu Zellzyklus-regulierenden Proteinen oder den Mehrfacharzneistoffresistenzproteinen verwendet werden, die eine Resistenz gegen eine durch eine Chemotherapie induzierte Alopezie verleihen.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Zellen, die so modifiziert sind, dass sie das erfindungsgemäße Expressionssystem zur Expression von aktiver Tyrosinase und zur Erzeugung von Melanin enthalten. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-menschliches Tier, das die modifizierten Zellen umfasst. Die Erfindung betrifft auch Vektoren, welche die Nukleotidsequenz umfassen, die Tyrosinase und ein Protein für das Einbringen von Kupfer kodiert.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Überwachen des Effekts von Verbindungen oder von Protokollen auf Pigmentstörungen unter Verwendung von Gewebekulturen von Zellen, welche die erfindungsgemäßen Expressionssysteme enthalten.
1 zeigt schematisch, wie der retrovirale Vektor pLmelSN konstruiert wurde.
2 zeigt die Nukleotidsequenz des bicistronischen pLmelSN-Inserts; wie es gezeigt worden ist, liegt vor der ORF-438-Sequenz und der Tyrosinase-Sequenz die Kozak-Sequenz vor und die ORF-438-Sequenz und die Tyrosinase-Sequenz enden mit TAA.
3 zeigt die Tyrosinaseaktivität in pLmelSN-transduzierten Verpackungszellen.
Tyrosinase ist das Schlüsselenzym für die Melaninbiosynthese. Störungen der Tyrosinaseaktivität umfassen Parkinson-Krankheit, Vitiligo und Albinismus. Wie es hier beschrieben ist, stellt diese Erfindung ein Verfahren zum genetischen Modifizieren der Tyrosinaseexpression und der Melaninerzeugung bereit.
Folglich stellt die Erfindung einzigartig effektive Protokolle und Materialien zum Behandeln von Störungen, die mit der Tyrosinaseaktivität zusammenhängen, sowie Testsysteme zum Überwachen der Erzeugung von Tyrosinase oder Melanin in Zellen bereit. Insbesondere stellt die Erfindung Protokolle und Materialien zum Behandeln von Pigmentierungsstörungen sowie Testsysteme zum Überwachen des Effekts verschiedener Behandlungen auf die Erzeugung von Tyrosinase oder Melanin in Haarfollikelzellen bereit.
Die Expressionssysteme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen im Allgemeinen eine bicistronische Nukleotidsequenz, die eine modifizierte Streptomyces mel-Stelle umfasst. Die bicistronische Nukleotidsequenz, die einen Tyrosinase-kodierenden Abschnitt, einen ORF438-kodierenden Abschnitt und eine IRES, welche die beiden Komponenten koppelt, umfasst, kann in einer beliebigen Reihenfolge angeordnet werden. D.h., gemäß der 2 kann das Konstrukt die ORF438-kodierende Sequenz gefolgt von IRES gefolgt von dem Tyrosinase-kodierenden Gen enthalten, oder umgekehrt können nach dem Tyrosinase-kodierenden Abschnitt IRES und dann ORF438 folgen. Typischerweise wird die bicistronische Nukleotidsequenz in einen Vektor insertiert, der Kontrollsequenzen enthält, die operabel mit der bicistronischen Sequenz verknüpft sind, um eine Abgabe in die vorgesehene Zelle, typischerweise Haarfollikel, zu bewirken. Wie es jedoch in dem Fachgebiet bekannt ist, kann die bicistronische Sequenz der Erfindung in eine Wirtszelle insertiert werden, so dass eine Expression unter der Kontrolle endogener Promotoren und Terminationssequenzen bewirkt wird. Vektoren zur Abgabe der Nukleotidsequenz können so gestaltet werden, dass sie extrachromosomal repliziert werden, jedoch vorzugsweise die Insertion der Nukleotidsequenz in das Genom des Wirts bewirken können, und sie können folglich endogene Steuersequenzen zum Bewirken einer Expression nutzen. Die zu insertierende Nukleotidsequenz kann mit Sequenzen gekoppelt werden, die eine homologe Rekombination an bekannten Zielstellen in dem Genom bewirken, es kann eine statistische Integration in das Genom genutzt werden oder es kann ein retroviraler Vektor eingesetzt werden. Die Verwendung viraler Vektoren, insbesondere retroviraler Vektoren, die das erfindungsgemäße Expressionssystem enthalten, ist ein bevorzugtes Verfahren.
Retrovirale Vektoren wurden in Gentherapiestudien verbreitet verwendet, vgl. Jolly et al. (1997), Viral Vector Systems for Gene Therapy, The Internet Book Of Gene Therapy, Hrsg. R. E. Sobol und K. J. Scanlon, Stamford, CT, Appleton and Lange, Seiten 3 bis 16. Retrovirale Vektoren integrieren eine DNA-Kopie ihres Genoms in das Wirtschromosom, wodurch eine stabile Übertragung von Vektorsequenzen auf Zellen der Nachkommenschaft möglich ist, was eine Langzeitexpression von Transgenen möglich macht. Während retrovirale Vektoren bevorzugt sind, können auch andere Verfahren auf viraler Basis eingesetzt werden, wie z.B. Herpes simplex-Vektoren, J. H. Wolfe et al., Nature Genetics (1992) 1, 379–384, oder Adenovirusvektoren, wie z.B. Ad2 oder Ad5. Diese Viren sind nicht onkogenisch und relativ stabil und leicht handhabbar. Die vollständigen Genome von Ad2 und Ad5 sind bekannt und es gibt eine Anzahl bekannter Mutanten, die zur genetischen Therapie im Allgemeinen zur Verfügung gestellt wurden, K. L. Berkner, Biotechniques (1988) 6, 612–629. Während Vektoren auf viraler Basis bevorzugt sind, kann jedweder geeignete Transformationsvektor eingesetzt werden.
Wenn virale Vektoren verwendet werden, kann die Spezifität der Infektiosität durch Einbeziehen von Rezeptor-bindenden Resten in den Vektor erhöht werden. Es ist in dem Fachgebiet bekannt, virale Oberflächenmoleküle mit bindenden Domänen von Liganden zu modifizieren, wie z.B. Erythropoietin, das auf Erythroleukämie gerichtet ist, Heregulin, das auf Brustkrebs gerichtet ist, und Neurotensin, das auf das Kolon gerichtet ist. Folglich können virale Oberflächenmoleküle so modifiziert werden, dass sie bindende Domänen von Liganden enthalten, die auf Haarfollikelzellen oder andere, mit dem Haar und der Hautpigmentierung zusammenhängende Zellen gerichtet sind.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem nutzt geeignete Promotoren und Verstärker. Allgemeine konstitutive Promotoren, wie z.B. SV40- oder CMV-Promotoren, können zusammen mit ihren Verstärkerelementen einbezogen werden, oder gewebespezifische Promotoren können zur Erhöhung der Spezifität verwendet werden. Mittel zur Konstruktion geeigneter Vektoren zur Abgabe eines Gens zusammen mit der Bereitstellung seiner Expression sind bekannt.
Um die Modifizierung von Zellen zur Expression von Tyrosinase und zur Erzeugung von Melanin zu bewirken, muss das Expressionssystem oder die integrierende kodierende Nukleotidsequenz so formuliert werden, dass es bzw. sie in die Zelle eintritt. Die Integration der gewünschten Nukleotidsequenzen in virale Vektoren stellt dieses Eintrittsmittel bereit. Es können jedoch auch andere Mediatoren der zellulären Aufnahme, wie z.B. Lipide oder verschiedene Zusammensetzungen oder Emulsionen des liposomalen Typs eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung, die eine Nukleotidsequenz, welche ein Protein mit einer Tyrosinaseaktivität kodiert, vorzugsweise operabel verknüpfte Kontrollsequenzen oder Sequenzen umfasst, die eine genomische Integration bewirken, kann folglich ein Mittel zum Bewirken einer zellulären Aufnahme enthalten. Diese Zusammensetzung wird den Zellen entweder in vitro oder in vivo zugeführt. Eine in vitro-Verabreichung ist besonders bei der Bewertung der Wirksamkeit des therapeutischen Ansatzes für ein bestimmtes Lebewesen sowie des Expressions- und Erzeugungsniveaus der Tyrosinase und des Melanins in den Zellen im Vorhinein hilfreich.
Darüber hinaus kann das Expressionssystem ohne einen Träger in die Haut abgegeben werden. Beispielsweise kann nackte DNA durch direkte Injektion mit einer Genpistole oder unter Verwendung eines elektrischen Impulses in die Haut eingebracht werden, vgl. Furth et al., Hybridoma (1996) 14, 149–152, Hengge et al., Nature Genet. (1995) 110, 161–166, Ciernik et al., Hum. Gene Ther. (1996) 7, 893–899, Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 2726–2730, Zhang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 220, 633–636. Die topische Anwendung des Expressionssystems als nackte Plasmid-DNA, die ein Tyrosinasegen und ein Gen umfasst, welches ein Protein kodiert, das den Kupfereinbau reguliert, wie z.B. ORF-438 von S. antibioticus, ist ebenfalls als Gentherapieverfahren zum Behandeln von Störungen vorgesehen, die mit der Tyrosinaseexpression und der Melaninerzeugung zusammenhängen. Das Expressionssystem kann mit den verschiedenen bekannten Verfahren direkt auf die Haut aufgebracht werden, vgl. Fan et al., Nature Biotech. (1990) 17, 870–872, Yu et al., J. Invest. Dermatology (1999) 112, 370–375, Tang et al., Nature (1997) 338, 729–730. Das Expressionssystem kann auch durch eine genetische Impfung oder eine Polynukleotid-Impfung abgegeben werden, wie es von Shi et al., Vaccine (1999) 17(17), 2136–41, L. D. Falo, Proc. Assoc. Am. Physicians (1999) 111(3), 211–9 und Tuting et al., J. Invest. Dermatol. (1998) 111(2), 183–8 beschrieben worden ist.
In manchen Zusammenhängen kann es vorteilhaft sein, das Protein mit einer Tyrosinaseaktivität als Fusionsprotein zu einer Reporter-Aminosäuresequenz zu verwenden, insbesondere einer Aminosäuresequenz, die dem Fusionsprotein eine Fluoreszenz verleiht. Die Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP), um einem Fusionsprotein eine Fluoreszenz zu verleihen, ist in dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. M. Chalfie et al., Science (1994) 263, 802–805. Das Expressionssystem kann unter Verwendung einer Liposom-vermittelten Abgabe, wie sie in dem US-Patent 5,641,508 beschrieben ist, gezielt zu den interessierenden Zellen, wie z.B. Haarfollikelzellen, gebracht werden.
Die Erfindung sieht die Verwendung der bicistronischen Nukleotidsequenz zur Behandlung von Krankheiten vor, die mit einer Tyrosinaseexpression zusammenhängen, wie z.B. Parkinson-Krankheit, Albinismus, Haarpigmentverlust und Vitiligo. Entsprechend sieht die Erfindung die Verwendung des Expressionssystems in in vitro-Modellen und in Tiermodellen vor, um die Effekte verschiedener Substanzen auf die Pigmentierung zu bestimmen. In beiden Fällen müssen Zellen, die Tyrosinase-Anomalitäten aufweisen, ungeachtet dessen, ob sie in vitro oder in vivo vorliegen, durch die bicistronische Nukleotidsequenz in einer Weise erreicht werden, dass sie deren Expression bewirken. Zur Verwendung bei der Bewertung von Protokollen oder Verbindungen bezüglich ihres Effekts auf die Pigmentierung werden die Zellen im Allgemeinen in vitro oder in vivo modifiziert und in einer Gewebekultur gehalten. Zellkulturen können in vitro mit verschiedenen Verfahren modifiziert werden, einschließlich Elektroporation, Lipofektion, virale Infektion, osmotische Veränderung und dergleichen. Sie können dann in einer dreidimensionalen Matrix kultiviert werden, wie es in dem Fachgebiet bekannt ist. Alternativ können Zellen entweder zur Behandlung oder zur Bildung von Gewebekulturen durch Verabreichen einer geeigneten Zusammensetzung, welche die erforderlichen Sequenzen enthält, an das Lebewesen, das solche Zellen enthält, in vivo modifiziert werden. Eine solche Verabreichung kann die Verwendung von „nackter DNA", von viralen Vektoren, die z.B. die Haut oder die Haarfollikel infizieren, wenn sie topisch verabreicht werden, oder eine Verabreichung mit anderen bekannten Verfahren umfassen. Schnitte der Haut, die vorzugsweise Haarfollikel enthalten, können dann die Basis für eine Gewebekultur bilden.
Die Erfindung umfasst auch die Behandlung von Zellen mit vielen verschiedenen nutzbringenden oder in anderer Weise therapeutischen Verbindungen zusätzlich zu dem Tyrosinaseexpressionssystem. Die therapeutischen Verbindungen können Nukleinsäuren, Hormone, Proteine, Enzyme, Vitamine und andere biochemische Cofaktoren sein, bei denen davon ausgegangen wird, dass sie einen therapeutischen Effekt auf das Wachstum, den Zustand, die Farbe und dergleichen einer Haar- oder Hautzelle haben. Besonders bevorzugt sind Mittel, die das Wachstum des Haarschafts verbessern, Mittel, welche die Erzeugung von Haarfarbgebungspigmenten im Haarfollikel stimulieren, Mittel, die das Pigment in der Follikelzelle oder dem Haarschaft ersetzen (d.h. die Haarfarbe wiederherstellen), Mittel, die das Haarwachstum stimulieren und Mittel, die einen Haarausfall verhindern. Am meisten bevorzugt sind Zellzyklusinhibitoren, die eine Alopezie verhindern. Andere Mittel, die bei Zuständen eines Haarausfalls (Alopezie) nützlich sind, sind diejenigen, die das Haarwachstum stimulieren, oder diejenigen, die den Haarausfall inhibieren. Haarwachstumsstimulatoren sind allgemein bekannt und umfassen Minoxidil, Cyclosporin und dergleichen bekannte Haarwachstumsstimulatoren.
Die Erfindung sieht zusätzlich die Verabreichung jedweden Gens vor, das für die Haarfollikel durch von einem viralen Vektor vermittelte Systeme nutzbringend ist, wie sie bezüglich der Tyrosinasestelle hier beschrieben worden sind. Ein Gen ist nutzbringend für Haarfollikel, wenn es bei einer selektiven Abgabe an die Haarfollikel mit den vorliegenden Verfahren einen nutzbringenden Effekt auf das Haarfollikel aufweist. Beispiele für nutzbringende Gene umfassen Gene, die normalerweise und vorzugsweise im Haarfollikel exprimiert werden und daher für die normale Genfunktion wichtig sind. Nutzbringende Gene können durch jedwedes von verschiedenen molekularbiologischen Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise kann eine cDNA-Bibliothek von exprimierten Genen aus Haarfollikelgewebe hergestellt werden, das gesundes Haar trägt, und sie kann durch eine subtraktive Hybridisierung gegen eine cDNA-Bibliothek angereichert werden, die von einem nicht-Haar-erzeugenden oder Vellushaar-erzeugenden Follikelgewebe abgeleitet ist, wodurch eine Bibliothek von cDNA-Molekülen erzeugt wird, deren Expression für Haarfollikel spezifisch ist. Individuelle cDNA-Moleküle von der haarspezifischen cDNA-Bibliothek können unter Verwendung des Haut-Gewebekulturtests, der im US-Patent 5,641,508 beschrieben ist, bezüglich einer therapeutischen Effektivität weiter gescreent werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung eine bicistronische Sequenz zur Verwendung in einem Verfahren zur Wiederherstellung der Haarfarbe in Säugern, insbesondere in einem Menschen, vor, bei dem die Haarfarbe aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen, einschließlich des Alters, grau wird. Das Verfahren umfasst das Aufbringen einer therapeutisch wirksamen Menge der bicistronischen Sequenz der Erfindung auf einen Hautbereich auf dem Säuger, der eine Mehrzahl von Haarfollikeln aufweist, die eine verblassende oder grau werdende Haarfarbe aufweisen. Eine „therapeutisch wirksame" Menge ist die Menge einer Nukleinsäure, die zur Expression von Tyrosinase und die Erzeugung von Melanin in den Zellen der Haarfollikel erforderlich ist. Es ist auch die Abgabe von Zellzyklusinhibitoren, wie z.B. p21, an Haarfollikel beschrieben, um eine Alopezie zu verhindern oder zu inhibieren. Wie es in dem Fachgebiet bekannt ist, werden die Zellen in der Haarmatrix, da sie sich schnell vermehren, d.h. anagen sind, von toxischen Mitteln, die auf sich schnell teilende Zellen gerichtet sind, wie z.B. solchen, die in der Chemotherapie verwendet werden, nachteilig beeinflusst. Durch Inhibieren der Vermehrung dieser Zellen, d.h. durch Zuführen von Zellzyklusinhibitoren, kann der Effekt dieser Mittel auf Haarzellen abgeschwächt werden. Es ist ein Verfahren zur genetischen Modifizierung von Haarzellen durch selektive Abgabe eines Gens, das einen Zellzyklusinhibitor kodiert, an ein Haarfollikel und Bewirken von dessen Expression beschrieben. Folglich kann, wie es in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist, das Gen, das den Zellzyklusinhibitor p21 kodiert (der im Vorhinein geklont und sequenziert worden ist), selektiv abgegeben und in diesen Zellen exprimiert werden. Folglich werden die Zellen in einen Zustand einer Telogen- oder Ruhephase gebracht, der sie gegen die Wirkungen chemotherapeutischer Mittel, wie z.B. Doxorubicin, Cytoxain und dergleichen, effektiv immunisiert.
Die Anwendung der bicistronischen Sequenzen oder eines anderen Expressionssystems der Erfindung kann gegebenenfalls bei definierten Intervallen wiederholt werden, um eine verlängerte Effektivität bereitzustellen.
Ausdrücke, wie z.B. „pharmazeutisch verträglich" und dergleichen, beziehen sich hier auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien und bedeuten, dass die Materialien an einen Säuger oder einen Menschen verabreicht werden können, ohne dass sie unerwünschte physiologische Effekte erzeugen, wie z.B. Übelkeit, Schwindel, Magenverstimmung und dergleichen.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die darin dispergierte Wirkstoffe enthält, ist bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als sterile Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, die wässrig oder nicht-wässrig sind, hergestellt, jedoch können auch Suspensionen in einer Flüssigkeit vor der Anwendung hergestellt werden.
Der Wirkstoff kann mit Vehikeln gemischt werden, die pharmazeutisch verträglich sind und mit dem Wirkstoff kompatibel sind, und zwar in Mengen, die zur Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Vehikel umfassen z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung gegebenenfalls kleinere Mengen von Hilfssubstanzen, wie z.B. Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffermittel und dergleichen, enthalten, welche die Wirksamkeit des Wirkstoffs erhöhen. Flüssige Zusammensetzungen können auch flüssige Phasen zusätzlich zu und zum Ausschluss von Wasser enthalten. Beispiele für solche zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle, wie z.B. Baumwollsaatöl, organische Ester, wie z.B. Ethyloleat, und Wasser-Öl-Emulsionen.
Eine therapeutische Zusammensetzung enthält eine therapeutisch effektive Menge des erfindungsgemäßen Expressionssystems und, falls diese vorliegen, andere nutzbringende Materialien, die in Mengen vorgegeben sind, sie so berechnet sind, dass sie die gewünschten Wirkungen erzielen, d.h. um die Pigmentierung der Haut- oder Haarzellen effektiv zu beeinflussen oder um eine Alopezie zu inhibieren. Folglich kann eine wirksame Menge an den Verbesserungen eines Symptoms oder mehrerer Symptome bezüglich Haut- oder Haarzellen in dem Lebewesen gemessen werden.
Die Dosierung kann von dem jeweiligen Arzt in dem Fall irgendeiner Komplikation eingestellt werden. Die Zusammensetzungen werden in einer Weise, die mit der Dosierungsformulie rung verträglich ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Lebewesen, dem Vermögen des Systems des Lebewesens, den Wirkstoff zu nutzen, und dem Grad des gewünschten therapeutischen Effekts ab. Die genauen Mengen des Wirkstoffs, der verabreicht werden soll, hängen von der Beurteilung des Anwenders ab und sind für jedes Lebewesen bzw. jede Person spezifisch. Geeignete Verabreichungsvorschriften sind ebenfalls variabel, umfassen jedoch typischerweise eine anfängliche Verabreichung gefolgt von wiederholten Dosen in ein- oder mehrstündigen Intervallen durch eine nachfolgende Verabreichung.
DNA-Segmente (d.h. synthetische Oligonukleotide), die verwendet werden, um ein größeres DNA-Segment zu erzeugen, das die bicistronische Kodierungsregion der Erfindung umfasst, können einfach durch chemische Techniken synthetisiert werden, z.B. mit dem Phosphotriesterverfahren von Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc., 103, 3185–3191, 1981) oder unter Verwendung automatisierter Syntheseverfahren. Darüber hinaus können größere DNA-Segmente einfach aus kleineren DNA-Segmenten mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch die Synthese einer Gruppe von Oligonukleotiden, die das DNA-Segment definieren, und anschließend Hybridisieren und Ligation von Oligonukleotiden zum Aufbau des vollständigen Segments. Die erforderlichen Sequenzen können z.B. auch aus nativen Kodierungsregionen amplifiziert werden.
Der hier verwendete Begriff „Vektor" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das in eine Zelle eindringen und diese modifizieren kann. Die Auswahl des Vektors, der ein DNA-Segment der vorliegenden Erfindung umfasst, hängt von dem Verabreichungsmodus ab. Der Vektor kann einfach nackte DNA, ein Plasmid oder ein viraler Vektor sein. Der Vektor kann ein „Expressionsvektor" sein, d.h. er kann Kontrollsequenzen zur Expression enthalten, die z.B. mit der bicistronischen Kassette der Erfindung operativ verknüpft sind.
Expressionsvektoren, die mit Säugerzellen und insbesondere Haarfollikelzellen verträglich sind, sind bekannt und von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich. Typischerweise enthalten solche Quellen zweckmäßige Restriktionsstellen zur Insertion des gewünschten DNA-Segments und stellen die Signale bereit, die für eine Genexpression in einer Säugerzelle erforderlich sind. Typisch für solche Vektoren sind die Vektoren der pREP-Reihe und pEBVhis, die von Invitrogen (San Diego, Kalif.) erhältlich sind, die Vektoren pTDT1 (ATCC #31255), pCP1 (ATCC #37351) und pJ4W (ATTC #37720), die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, und dergleichen Säuger-Expressionsvektoren.
Wenn Säuger-Expressionsvektoren zur Korrektur von Haarpigmentierungsstörungen verwendet werden, sind insbesondere Säuger-Expressionsvektoren bevorzugt, welche die Expression des Gens in einer gewebespezifischen Weise ermöglichen, in diesem Fall durch die Wirkung eines regulatorischen Promotors, der die Genexpression auf Haarfollikelzellen beschränkt.
Erfolgreich modifizierte Haarfollikelzellen, d.h. Follikelzellen, welche die bicistronische Kassette der vorliegenden Erfindung enthalten, können mit bekannten Techniken identifiziert werden, z.B. unter Verwendung eines Hybridisierungsverfahrens, wie z.B. demjenigen, das von Southern, J. Mol. Biol. (1975) 98, 503, oder von Berent et al., Biotech (1985) 3, 208, beschrieben worden ist. Zusätzlich zu einem direkten Testen bezüglich der Gegenwart der Nukleotidsequenz kann eine erfolgreiche Transformation mit bekannten immunologischen Verfahren bezüglich der Gegenwart eines exprimierten Proteins bestätigt werden.
Alternativ kann eine erfolgreiche Transformation des Zielgewebes durch die Bewertung des Zielgewebes bezüglich Indizien im Hinblick auf eine Funktion, die von der verabreichten Verbindung ausgeübt wird, bestätigt werden. Wenn die Verbindung beispielsweise eine Nukleinsäure ist, die Tyrosinase exprimiert, wie es in den Beispielen beschrieben ist, kann die ausgeübte Funktion der Pigmentierung oder das Vorliegen einer Tyrosinaseaktivität oder einer enzymatischen Umwandlung von L-Dopa in das Produkt direkt in dem Zielgewebe nachgewiesen werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, sind jedoch bezüglich der Erfindung nicht beschränkend aufzufassen.
Beispiel 1
Klonierung des Streptomyces-Tyrosinasegens, des stromaufwärts liegenden ORF-438 und der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES)
Die Sequenzen, die das Streptomyces antibioticus-Tyrosinasegen und ORF-438 kodieren, wurden mittels PCR von dem Plasmid pIJ702, das von der American Type Culture Collection (ATCC #35287) erhältlich ist, amplifiziert, vgl. E. Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129, 2703–2714.
Oligomere für die PCR-Amplifizierung wurden gemäß der Sequenz der S. antibioticus-Tyrosinasegen- und ORF-438-cDNA konstruiert, vgl. V. Berman et al., Gene (1985) 37, 101–110. Zur Verstärkung der Expression des bakteriellen Gens in Säugerzellen wurden die ORF-438- und Tyrosinasegen-TGA-Terminationscodons zu TAA verändert. Die Kozak-Consensus-Sequenz, GCCGCCACC, wurde in jedem Fall stromaufwärts unmittelbar vor dem ATG-Initiatorcodon hinzugefügt, um die Translationseffizienz zu erhöhen.
Die Sequenz des ORF-438-Stromaufwärtsprimers, der die Kozak-Consensus-Sequenz umfasst, war
Die Stromabwärtsprimer-Sequenz war
Die Sequenz des Tyrosinase-Stromaufwärtsprimers, der die Kozak-Consensus-Sequenz umfasst, war
Die Stromabwärtsprimer-Sequenz war
Die PCR-Reaktionsbedingungen sowohl für ORF-438 als auch für die Tyrosinase waren wie folgt: Zuerst Denaturierung bei 97°C für 10 min, dann 10 Zyklen Denaturierung bei 97°C für 30 s, Annealing bei 66°C für 30 s und Verlängerung bei 72°C für 45 s, dann eine letzte Verlängerung bei 72°C für 10 min.
PCR-Oligomere wurden gemäß der Sequenz der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) konstruiert, die in dem retroviralen Vektor pLISN enthalten ist, der von Clonetech (Palo Alto, CA) erhalten wurde. Die Sequenz des Stromaufwärtsprimers war
Die Stromabwärtsprimer-Sequenz war
Das IRES-Gen wurde mittels PCR von pLXIN als Templat amplifiziert. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Zuerst Denaturierung bei 96°C für 10 min, dann 30 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 30 s, Annealing bei 50°C für 30 s und Verlängerung bei 72°C für 45 s, dann eine letzte Verlängerung bei 72°C für 10 min.
Eine elektrophoretische Analyse zeigte, dass die amplifizierten Produkte die vorhergesagten Größen 438 bp, 800 bp und 580 bp für ORF-438, Tyrosinase bzw. IRES aufwiesen.
Beispiel 2
Konstruktion und Verpackung des retroviralen Vektors pLmelSN
Die Konstruktion von pLmelSN ist in der 1 gezeigt. Der retrovirale Vektor pLXSN (Clonetech, Palo Alto, CA) ist ein Vektor auf Mäuseleukämievirus-Basis, der zwei Promotoren umfasst: Die 5'-lange terminate Wiederholung (5'-LTR) zur Kontrolle der insertierten Gene und den SV40-Promotor zur Kontrolle der Neomycinphosphotransferase (neoR). Das 800 bp-Tyrosinase-PCR-Produkt wurde mit XhoI abgebaut und in die HapI/XhoI-Klonierungsstelle von pLXSN insertiert, um pLtySN zu erhalten. Die ORF-438- und IRES-PCR-Produkte wurden an der BclI-Stelle ligiert und dann in die EcoRI/XhoI-Klonierungsstelle von pLtyrSN insertiert, um pLmelSN zu erhalten. Sowohl das ORF-438-Gen als auch das Tyrosinase-Gen werden von der Moloney-Mäuseleukämievirus-5'-LTR in pLmelSN gesteuert, vgl. die 1. Die bicistronische Sequenz, welche die ORF-438-, IRES- und Tyrosinasegene unter der Kontrolle des 5'-LTR-Promotors enthält, ist in der 2 gezeigt.
pLmelSN wurde unter Verwendung von lipoTAXI (Clonetech, Palo Alto, CA; Stratagene, San Diego, CA) in die PT67-Verpackungszelllinie transfiziert. Die transfizierte PT67-Zelllinie wurde in DMEM-Medium, das 0,4 mg/ml G418 (Gibco BRL) enthielt, selektiert. Die G418-resistenten Zellen wurden geklont und expandiert. Nach zwei Wochen eines selektiven Kultivierens mit G418 wurden positiv transfizierte Zellen, PT67-mel, erhalten.
Beispiel 3
Expression in PT67-mel-Zellen
Um die Expression sowohl des ORF-438-Gens als auch des Tyrosinasegens zu bestätigen, wurde eine RT-PCR-Analyse eingesetzt, um deren mRNA in den transfizierten Verpackungszellen nachzuweisen. Die RT-PCR-Produkte zeigten, dass die Tyrosinase- und ORF-438-Gene von S. antibioticus spezifisch amplifizierte Produkte von der gesamten RNA pLmelSN-transduzierter PT-7-Zellen waren. Als Kontrolle wurde Mäuse-β-Actin sowohl von PT67-mel- als auch von PT67-Zellen mittels RT-PCR amplifiziert. Eine elektrophoretische Analyse zeigte, dass die amplifizierten Produkte von PT67-mel-Zellen die vorhergesagten Größen von 800 bp und 438 bp für Tyrosinase bzw. ORF-438 aufwiesen. Die RT-PCR-Reaktion mit der gesamten RNA von nicht infizierten PT67-Zellen amplifizierte diese Fragmente nicht.
Insbesondere wurden PT67-mel-Zellen mit Trypsin abgebaut und mittels Zentrifugation pelletiert. Die gesamte RNA wurde mit dem Guanidiniumthiocyanatverfahren (MicroRNA Reagent Kit, Stratagene, San Diego, CA) extrahiert. RNA wurde durch Messen der Absorption bei 260 nm quantifiziert. Etwa 10 μg der gesamten RNA wurde zu ersten cDNA-Ketten revers transkribiert. Die reverse Transkription wurde in 20 μl erster Strang-Puffer, jeweils 500 μM dNTP und 20 Einheiten AMV-reverse Transkriptase (Stratagene, San Diego, CA) durchgeführt. Der PCR-Primer für den ersten Strang war pORF-438-Antisense und pTyr-Antisense. Die Proben wurden 50 min bei 42°C inkubiert. Die Produkte der reversen Transkription wurden mit der PCR-Reaktion amplifiziert. Mäuse-β-Actin wurde als Standard verwendet, um die Qualität der RNA zu kontrollieren (Stratagene, San Diego, CA).
Beispiel 4
Tyrosinaseaktivitätstest
Die transfizierten Verpackungszellen wurden bezüglich der Expression von aktivem Tyrosinaseprotein durch Messen der Tyrosinaseaktivität in den Lysaten von Klonen von G418-resistenten Verpackungszellen gescreent. Die Tyrosinaseaktivität wurde mit dem von Nakajima et al., Pigment Cell Res. (1998) 11, 12–17, beschriebenen Verfahren bewertet. Die pLmelSN-infizierten PT67-Verpackungszellen wurden in einer Dichte von 2000 Zellen/Well in einer 96 Well-Platte ausplattiert. Nach 24 Stunden in Kultur wurden die Verpackungszellen mit PBS gewaschen und mit 1% Triton-100 (45 μl/Well) lysiert. Nach dem Mischen der Lysate durch Schütteln wurden jedem Well 5 μl 10 mM L-DOPA zugesetzt. Nach der Inkubation der Kultur bei 37°C für 30 min wurde die Extinktion bei 490 nm spektrophotometrisch gemessen.
Die DOPA-Oxidasereaktion wurde auch verwendet, um die Melaninerzeugung in intakten transfizierten PT67-Zellen nachzuweisen. Die Zellen wurden mit 1 mg/ml DOPA und 2 mg/ml Tyrosin in PBS (pH 7,4) für 12 Stunden bei 37°C inkubiert, wie es bereits beschrieben worden ist, vgl. T. Kugelman et al., J. Invest. Dermatol. (1961) 37, 66–73.
Unter Verwendung der gleichen Bedingungen wurden die Zellüberstände bezüglich des Melaningehalts bei 490 nm gemessen. Die 3 zeigt PT67-Klone 1 bis 4, die mehr Melanin erzeugen als die PT67-Kontrolle. Die Tyrosinase-positiven Zellen wurden durch die Erzeugung von braungefärbten Melaninkörnchen identifiziert, die mittels Hellfeldmikroskopie beobachtet wurden. Die braunen Pigmentkörnchen wurden nur in pLmelSN-transfizierten Zellen beobachtet.
Beispiel 5
Retrovirale Infektion von amelanotischen Melanom 695T-Zellen
Menschliche amelanotische Melanom 695T-Zellen (ATCC) wurden 12 Stunden mit retroviralen Überständen infiziert, die 8 μg/ml Polybrene (Sigma, St. Louis, MO) enthielten. Frisches MEM-Medium ersetzte den Überstand. Die Kulturen wurden dann 48 Stunden inkubiert. Zellen wurden dann für zwei Wochen in MEM-Medium selektiert, das 0,4 mg/ml G418 enthielt. Einzelne Klone wurden isoliert und expandiert.
Braune Melaninpigmente wurden in den infizierten 695T-Zellen erzeugt. Diese braunen Melaninkörnchen waren ohne die DOPA-Reaktion sichtbar. In den nicht transduzierten 695T-Zellen waren keine Pigmentkörnchen sichtbar.
Beispiel 6
Kultur von anagenen Albino-Maus-Haarfollikeln
8 Wochen alte weibliche Albino-Mäuse C57BU6J-Tyrosinase (c-2J) wurden vom Jackson Laboratory erworben. Die Wachstumsphase des Haarzyklus (Anagen) wurde in der Rückenhaut induziert, bei der alle Follikel in der Ruhephase des Haarzyklus vorlagen (Telogen). Nach einer Allgemeinanästhesie wurde ein warmes Wachs/Kolophonium-Gemisch aufgebracht und dann von der Haut abgelöst, wodurch alle telogenen Haarschäfte entfernt wurden und der Eintritt der Follikel in das Anagen induziert wurde, vgl. Schilli, J. Invest. Dermatol. (1998) 111, 598–604.
Am sechsten Tag nach der Enthaarung wurden, als sich alle Haarfollikel im Anagen befanden, die Rückenhäute der Mäuse nach der Tötung gesammelt. Kleine Stücke der Mäusehaut (2 × 5 × 2 mm) wurden mit einer Schere herausgeschnitten und dreimal in HBSS gewaschen. Die gewonnene Haut wurde 30 min bei 37°C in MEM mit Antibiotika (100 μg Gentamycin pro mol, 10 μg Ciprofloxacin pro ml, 2,5 μg Amphotericin-B pro ml, 100 IU-100 μg Penicillin-Streptomycin pro ml) (Sigma) inkubiert. Die Häute wurden dreimal mit HBSS-Medium gewaschen, um restliche Antibiotika zu entfernen und in Kollagen-enthaltende Gele für eine Gewebekultur in Eagle's Minimal Essentiell Medium (MEM), das mit 10% fetalem Rinderserum und Gentamycin ergänzt war, gelegt. Die Kulturen wurden bei 37°C in einem begasten Inkubator mit 5% CO₂ gehalten.
Beispiel 7
Infektion kultivierter Albino-Maus-Haarfollikel
Die in einer Gewebekultur gehaltene Albino-Mäusehaut von Beispiel 6 wurde mit PT67-mel-Zellen wie folgt cokultiviert:
Die PT67-mel-Zellen von dem am stärksten erzeugenden Klon wurden gezählt, in 24 Well-Platten ausgesät und bei 37°C bis zu 80% Konfluenz wachsen gelassen und mit der in einer Gewebekultur gehaltenen Albino-Mäusehaut in 24 Well-Platten 12, 24 und 72 Stunden cokultiviert. Die in Gewebekultur gehaltenen Häute wurden dann in 24 Well-Platten mit frischem MEM-Medium monokultiviert und weitere 4 bis 6 Tage inkubiert. Kleine Stücke von Virus-infizierter Haut wurden statistisch als Probe entnommen. Frische und gefrorene Schnitte wurden mittels Standardtechniken hergestellt.
Vier Tage nach der retroviralen Infektion wurde Melanin in der Haarmatrix tief in den Haarzwiebeln der Gewebekulturen festgestellt. Melanin wurde auch in dem oberen Teil der Haarfollikel gefunden und konnte sechs Tage nach der Infektion sowohl in der Haarmatrix als auch im Haarschaft festgestellt werden.
In den anfänglichen Experimenten, die ein Cokultivieren von in Gewebekultur gehaltener Albino-Mäusehaut mit PT67-mel-Zellen für 24 Stunden umfassten, enthielten etwa 2,5 bis 15% der Haut-Gewebekulturen Melanin-erzeugende Haarfollikel. In der in einer Gewebekultur gehaltenen Albino-Mäusehaut, die nicht mit PT67-mel cokultiviert worden ist, wurde kein Melanin festgestellt.
Dann wurde ein Zeitverlaufexperiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob längere Inkubationszeiten der Cokulturen der Albino-Haut und von PT67-mel die Effizienz der Tyrosinaseinfektion erhöhten. Die Effizienz der Infektion der in einer Gewebekultur gehaltenen Haut wurde bei einer längeren Cokultur signifikant erhöht. Nach 12 Stunden Cokultur erzeugten 7% (2 von 30 Stücken) der Haut Melanin und 15% der Haarfollikel (6 von 40) erzeugten Melanin. Nach 24 Stunden Cokultur erzeugten 25% der Hautstücke (5 von 20) und 35% der Haarfollikel (28 von 80) Melanin. Nach 72 Stunden Cokultur erzeugten 60% der Hautstücke (12 von 20) und 53% der Haarfollikel (42 von 80) Melanin.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Virustiter und die Zeit des Aussetzens gegenüber dem Virus die Transduktionsfrequenz erhöhen können.
Beispiel 8
Klonierung des menschlichen p21-Gens
Die Nukleotidsequenz, die das menschliche p21-Gen kodiert, wurde mittels PCR von dem Plasmid MBP-p21 amplifiziert, vgl. Zhang et al., Gene (1994) 3, 1750–1758 (1994). Oligomere wurden gemäß der Sequenz des menschlichen p21-Gens konstruiert, vgl. Xiong et al., Nature (1993) 366, 701. Der Stromaufwärtsprimer war
Der Stromabwärtsprimer war
Die PCR-Primerreaktionsbedingungen waren wie folgt: Zuerst Denaturierung bei 94°C für 10 min, dann 30 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 30 s, Annealing bei 50°C für 30 s und Verlängerung bei 72°C für 45 s, dann eine letzte Verlängerung bei 72°C für 10 min.
Eine elektrophoretische Analyse zeigte, dass die amplifizierten Produkte die vorhergesagte Größe von 500 bp aufwiesen.
Beispiel 9
Konstruktion von pEGFP-p21
Der Vektor pEGFP-C₃ (Clonetech, Palo Alto, CA) kodiert eine rotverschobene Variante von Wildtyp-GFP, die bezüglich einer helleren Fluoreszenz und einer stärkeren Expression in Säugerzellen optimiert worden ist. Die Mehrfachklonierungsstelle (MCS) in pEGFP-C₃ liegt zwischen den EGFP-kodierenden Sequenzen und dem SV40-polyA. Gene, die in die MCS kloniert worden sind, werden als Fusion an den C-Terminus von EGFP exprimiert, wenn sie sich im gleichen Leseraster (Neo^R) befinden, das in dem Vektor enthalten ist, was es ermöglicht, unter Verwendung von G418 stabile transfizierte eukaryotische Zellen zu selektieren.
Das amplifizierte 500 bp-p21-Gen wurde in die XhoI/BamHI-Klonierungsstelle des pEGFP-C₃-Vektors kloniert, um pEGFP-p21 zu erhalten, und eine korrekte Insertion wurde durch eine Restriktionsenzymanalyse bestätigt.
Beispiel 10
Haut-Gewebekultur und Transfektion von kultivierter Haut mit dem pEGFP-p21-Vektor
Baby-balb-c-Mäuse (2 Wochen) wurden mit einem Haarentferner behandelt. Kleine Stücke von Mäusehaut (2 × 5 × 2 mm) wurden mit einer Schere herausgeschnitten und auf Kollagenenthaltende Gele für eine Gewebekultur in Eagle's Minimal Essentiell Medium (MEM), das mit 10% fetalem Rinderserum und Gentamycin ergänzt war, gelegt, wie es von Li et al., PNAS USA (1991) 88, 1908–1912, beschrieben worden ist. Die Kulturen wurden bei 37°C in einem begasten Inkubator mit 5% CO₂ gehalten. Die Liposomenwechselwirkung mit der Haut wurde 24 Stunden nach der Gewebekultur initiiert.
40 ml LipoTAXI-Transfektionsreagenz (Stratagene, San Diego, CA) wurden 20 ml (10 μg) pEGFP-p21-Plasmid-DNA zugesetzt, dann gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. 400 μl serumfreies MEM wurden dem Gemisch zugesetzt und dann auf die Hautkulturschale unter Verwirbeln übertragen und die Gemische wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde durch 2 ml MEM mit 10% Serum ersetzt und 48 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
Zur Untersuchung der Expression wurde ein Nikon-Fluoreszenzmikroskop verwendet, das mit aGFP-Würfeln ausgestattet war. Das EGFP-p21-Gen wurde selektiv in Haarfollikeln exprimiert, wie es durch eine HelI-GFP-Fluoreszenz visualisiert wurde.

Claims

Ein Nukleinsäuremolekül zum effizienten Erzeugen einer funktionellen Tyrosinase in Säugerzellen, wobei das Molekül eine bicistronische Nukleotidsequenz umfasst, die eine Streptomyces-Tyrosinase-kodierende Nukleotidsequenz und eine Nukleotidsequenz, die ein Streptomyces-ORF-438 kodiert, umfasst, die durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle-Sequenz (IRES) gekoppelt sind.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, bei dem jede der kodierenden Sequenzen funktionell mit einer Kozak-Consensus-Sequenz verbunden ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, bei dem die kodierenden Sequenzen so modifiziert worden sind, dass sie TAA-Stoppcodons enthalten.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die kodierenden Sequenzen funktionell mit einer oder mehreren Steuersequenzen) verbunden sind, welche die Expression der kodierenden Sequenzen steuern.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, bei dem es sich um einen Vektor handelt.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, bei dem es sich um einen viralen Vektor handelt.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, bei dem es sich um einen retroviralen Vektor handelt.
Isolierte Sängerzellen, die so modifiziert sind, dass sie das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthalten.
Zellen nach Anspruch 8, bei denen es sich um Haarfollikelzellen handelt.
Zellen nach Anspruch 9, die in einer Haut-Gewebekultur enthalten sind.
Zellen nach Anspruch 10, die im Anagen synchronisiert worden sind.
Ein Modellsystem zur Bewertung des Effekts von Verbindungen oder Protokollen auf die Pigmentierung, das die Gewebekultur nach Anspruch 10 oder 11 umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch eine Therapie.
Verwendung des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung der Tyrosinasegenexpression und/oder der Melaninbiosynthese.
Verwendung nach Anspruch 14, bei der die Behandlung eine Behandlung von Zellen, welche die Störung aufweisen, durch direkte Transfektion, einen elektrischen Impuls, eine Lipofektion oder eine virale Infektion umfasst.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der die Zellen in einem Säuger enthalten sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei der das Medikament für eine topische Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 17, bei der die topische Verabreichung durch die Verwendung nackter DNA, eines viralen Vektors oder einer liposomalen Zusammensetzung stattfindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, bei der die Zellen Haarfollikelzellen oder Hautzellen sind.
Ein Verfahren zur Bestimmung des Effekts einer Verbindung auf die Pigmentierung, umfassend: (i) Kultivieren des Systems nach Anspruch 12 in der Gegenwart der Verbindung und ohne die Verbindung und (ii) Untersuchen einer Zunahme oder Abnahme der Melaninerzeugung, falls eine solche vorliegt, in der Gegenwart der Verbindung im Vergleich zum Fehlen der Verbindung.