DE60117641T2

DE60117641T2 - Modulierte sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) Reporter Gene und Polypeptide

Info

Publication number: DE60117641T2
Application number: DE60117641T
Authority: DE
Inventors: Vincent Piedmont Thuillier; Manping Fremont Wang; Cecile Orsini
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2021-06-23
Also published as: DE60117641D1; ATE319858T1; WO2002095068A3; WO2002095068A2; EP1270739A1; EP1417334A2; EP1270739B1; CA2448145A1; JP2004536588A

Description

Gebiet der Erfindung und Einführung
Die Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die Reportergene codieren, welche in Langzeitexpressionsstudien verwendet werden können, und Vektoren, die diese umfassen. Die Erfindung umfasst außerdem Verfahren zur Herstellung von Vektoren für Langzeitexpression und die Expressionssysteme, die diese Reportergene und andere Transgene enthalten, sowie die von diesen Reportergenen codierten rekombinanten Polypeptide.
Viele Gentransfervektoren und -systeme sind dafür vorgesehen, Gene für längere Zeiträume, d.h. über Wochen und Monate hinweg, zu exprimieren. Dies ist insbesondere der Fall, wenn das Transgen ein funktionelles Protein oder ein therapeutisches Protein codiert. Verfahren zum Evaluieren der Persistenz der Expression mithilfe dieser Gentransfervektoren verwenden in der Regel nachweisbare Reportergene. Den Proteinprodukten derzeit verwendeter Reportergene fehlt jedoch eines oder mehrere einiger Merkmale, weshalb sie zur Untersuchung einer Langzeitexpression in einem Tier ungeeignet sind. Diese Erfindung stellt neue und nützliche Reportergene, Nucleinsäuren, Expressionsvektoren, Polypeptide und Verfahren zum Exprimieren von Transgenen bereit, die sich besonders für Langzeitexpression eignen. Im Vergleich mit Reportergenen aus dem Stand der Technik, die etwa 20 Tage lang nachweisbares Protein exprimieren, exprimieren die erfindungsgemäßen Reportergene nachweisbare Proteinmengen ungefähr über einen Monat lang oder bis zu mindestens etwa 9 Monate lang. Außerdem ist der Grad der Expression über diesen Zeitraum stabil. Darüber hinaus lassen sich die Proteine von erfindungsgemäßen Reportergenen in einer Reihe von Zelltypen und Geweben feststellen, wo sich der Nachweis mithilfe anderer Reportergene als schwierig erwiesen hat.
Diskussion verwandter Technologie
Reportergene sind verwendet worden, um die Expression von Transgenen von verschiedenen Vektoren zu analysieren. Reportergene, die in Tiermodellen verwendet worden sind, codieren exogene zytoplasmatische oder sezernierte Proteine wie beispielsweise bakterielle β-Galaktosidase, Insektenluziferase, menschliches Wachstumshormon, menschliches Erythropoietin und menschliche sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP). Diese Reportergene werden häufig für die Untersuchung transienter Expression und Untersuchungen gewebespezifischer Expression eingesetzt. Die von ihnen codierten Proteine sind jedoch typischerweise immunogen. Sie können auch eine zytotoxische Antwort von T-Lymphozyten und eine neutralisierende Antikörperantwort hervorrufen, welche einen Nachweis unterdrückt, was zu ungenauen Reportergen-Expressionsdaten führt (siehe Tripathy et al., Nature Medicine 2: 545–50 (1996); und Yang et al., Gene Therapy 3: 137–44 (1996).
Schon aus diesen Mängeln allein kann der Schluss gezogen werden, dass derzeit verwendete Reportergene nicht wirklich für Studien längerfristiger Expression konzipiert worden sind und sich dafür auch nicht als geeignet erwiesen haben. Wenn Daten zu längerfristiger Expression gebraucht werden, braucht man ein Reportergen, das kontinuierlich exprimiert, sich feststellen lässt, den Immunreaktionsmechanismus des Tieres umgeht und die Zellphysiologie nicht verändert. Bislang wurde ein solches Reportergen nicht adäquat bereitgestellt. Vielmehr sind experimentelle Systeme modifiziert worden, um den existierenden Reportergenen entgegen zu kommen, beispielsweise durch Verwendung immundefizienter Tiere.
Ein Reportergen, das oben erwähnte SEAP-Gen, stammt von der nativen humanen plazentalen alkalischen Phosphatase (hPLAP) ab. Die typischerweise für seine Reportergenfunktion verwendete Aminosäuresequenz unterscheidet sich von dem nativen Gen durch eine Deletion C-terminaler Reste, was das membrangebundene Protein in ein sezerniertes Protein verwandelt, wie von Berger et al. (Gene 66, 1–10 (1988)) und in der europäischen Patentanmeldung EP 327 960 beschrieben ist. Obgleich das SEAP-Reportergen in einer Reihe von Expressionssystemen verwendet wurde, führt die Sekretion von der alkalischen Phosphatase abstammenden Reportergenen häufig zu relativ kurzfristiger Expression. Diesbezüglich prüften Bettan M. et al. (Anal. Biochemistry, Band 271, 1999, S. 187–189) die zirkulierende Aktivität dieses sezernierten humanen plazentalen alkalische Phosphataseproteins (SEAP) im Plasma nach einer Injektion eines Plasmids der Codierungssequenz von SEAP. Es wird beschrieben, dass die durchschnittliche SEAP-Aktivität an Tag 7 einen Spitzenwert erreicht und bis Tag 28 langsam bis auf 40% der maximalen Aktivität zurückgeht. Es besteht daher ein Bedarf für ein Reportergen, das ein Modell zur Untersuchung von Langzeitexpression wäre.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfasst alkalische Phosphatase(AP)-Reportergene und Nucleinsäuresequenzen, die eine alkalische Säuger-Phosphataseaktivität codieren. Die alkalische Phosphataseaktivität lässt sich mindestens einen Monat lang nach dem Einbringen in eine Zelle als ein Transgen feststellen. Vorzugsweise führt das Exprimieren der erfindungsgemäßen, die alkalische Phosphatase codierenden Sequenzen in einer Zelle zu einer alkalischen Phosphataseaktivität, die für mehr als etwa 40 Tage oder mehr als etwa 60 Tage oder mehr als etwa 90 Tage oder mehr als etwa 120 Tage oder mehr als etwa 180 Tage oder mehr als etwa 270 Tage festgestellt werden kann. Typischerweise, aber nicht notwendigerweise, wird die alkalische Phosphataseaktivität festgestellt, indem die Proteinmengen oder die AP-Aktivität einer Serum- oder Gewebeprobe von einem Säuger, welcher die Zelle mit dem Transgen enthält, gemessen wird, oder indem das Medium einer kultivierten Zelle gemessen wird, die das Transgen enthält. Es können weitere Verfahren des Feststellens verwendet werden, einschließlich immunochemische Assays.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die alkalische Säuger-Phosphataseaktivität aus, besteht die alkalische Säuger-Phosphataseaktivität im Wesentlichen aus oder umfasst die alkalische Säuger-Phosphataseaktivität eine Polypeptidaminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 1 oder SEQ.-ID Nr. 2. Ein Polypeptid oder Protein, welches im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 1 oder SEQ.-ID Nr. 2 besteht, enthält die Aminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 1 oder SEQ.-ID Nr. 2 und eine oder mehrere Aminosäureunterschiede in der Sequenz, welche die grundlegenden und neuartigen Merkmale des Proteins nicht verändern. Wie beschrieben ist, sind einige der grundlegenden und neuartigen Merkmale des mSEAP-Polypeptids von SEQ.-ID Nr. 2 oder die AP-Aktivität von SEQ.-ID Nr. 1 die Fähigkeit, exprimiert und in Untersuchungen der Langzeitexpression festgestellt werden zu können (Langzeit kann hier eines von über 30 Tage, 40 Tage, 60 Tage, 90 Tage, 180 Tage oder 270 Tage bedeuten), die Fähigkeit, lange Zeit in immunkompetenten Tieren festgestellt werden zu können und/oder die Fähigkeit, lange Zeit in stabilen Mengen exprimiert zu werden (Mengen, die sich nicht mehr als etwa um das 5-Fache oder mehr als etwa das 10-Fache verändern). Keine der alkalische Phosphatase-, embryonalen alkalische Phosphatase- oder sezernierten embryonalen alkalische Phosphataseproteine oder -polypeptide aus dem Stand der Technik besitzt auch nur eine dieser neuartigen Merkmale. Jede isolierte oder gereinigte cDNA oder Nucleinsäure, die ein Polypeptid von SEQ.-ID Nr. 1 oder SEQ.-ID Nr. 2 codiert, ist in der Erfindung enthalten. Das Polypeptid von SEQ.-ID Nr. 1 kann auch derart mit einer geeigneten Säuger- oder Maussignalsequenz verknüpft werden, dass AP-Aktivität aus der Zelle sezerniert wird. Es kann jede verschiedener Signalsequenzen verwendet werden, einschließlich die von SEQ.-ID Nr. 3, 9, 10, 11 oder 12.
Fusionsproteine, bei denen die Aminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 verwendet wird, sind ebenfalls in der Erfindung enthalten, vorausgesetzt, sie umfassen keine Fusion, welche die exakte Aminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 13 erzeugt oder codiert. Darüber hinaus umfasst die Erfindung Derivate und Mutanten von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2, und es werden spezifische nicht einschränkende Beispiele der Mutanten präsentiert. Eine Reihe von Mutanten umfasst Polypeptide, bei denen etwa 1 bis etwa 5 Aminosäuren vom C-terminalen Ende von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 deletiert sind. Ein Fachmann kann zahlreiche Verfahren verwenden, um andere Derivate oder Mutationen in SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 und die degenerierten Varianten, welche SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 codieren, sowie die abgeleiteten Polypeptide und mutanten Polypeptide selbst herzustellen. Die derivatisierten Polypeptide und die Nucleinsäuren, welche sie codieren, besitzen oder codieren außerdem Polypeptide, die eines oder mehrere der oben aufgeführten Langzeitexpressionsmerkmale besitzen, umfassen aber nicht ein Polypeptid oder SEQ.-ID Nr. 13.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung Verfahren zum Analysieren von Expressionssystemen und -vektoren zur Verwendung in Gentransferexperimenten und Protokollen. Beispielsweise kann ein Gentransfervektor, der ein Reportergen oder eine Nucleinsäuresequenz der Erfindung umfasst, in ein Tier eingeführt werden. Durch Feststellen des Expressionsgrades des Reportergens können die zum Einführen und Vorbereiten des Vektors für die Verabreichung verwendeten Komponenten und Verfahren getestet und/oder für die Langzeitanwendung bei der Expression eines Transgens optimiert werden. Die Verfahren können angewandt werden, um eine Art von Expressionsvektor, spezifische regulatorische Sequenzen oder Sequenzkombinationen, die in Expressionsvektoren verwendet werden, und Protokolle zur Verabreichung von Transgenen an Tiere auszuwählen. Beispielsweise können die Eigenschaften oder die Erwünschtheit ausgewählter Elemente zur Regulierung der Genexpression (DNA- oder RNA-Sequenzen in cis- oder Protein-, DNA- oder RNA-Faktoren in trans-Position) analysiert und/oder optimiert werden, indem die Nucleinsäuren und Verfahren der Erfindung verwendet werden. Sowohl die Selektion als auch die Analyseprozesse und die Vektoren und Zusammensetzungen, die ausgewählt sind oder aus den Prozessen resultieren, sind in dieser Erfindung spezifisch enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes wird ein Vektor hergestellt und in ein Tier oder eine Zelle eingeführt. Der Vektor umfasst ein Reportergen oder eine Nucleinsäure der Erfindung, die derart mit einem geeigneten Promotor oder Promotor/Enhancer verknüpft sind, dass das Reportergen exprimiert wird. Der Expressionsgrad der alkalischen Phosphatase wird mindestens etwa einen Monat lang analysiert und wahlweise mit Kontrollen verglichen, beispielsweise mit verschiedenen Vektoren, die das Reportergen umfassen. Die Expressionsgradergebnisse für den Zeitraum von mindestens etwa einem Monat werden dann verwendet, um auszuwählen oder zu bestätigen, dass ein Vektor für die Verabreichung eines bestimmten Transgenes geeignet oder wünschenswert ist. Dieselben Verfahren können für Zeiträume von mindestens etwa 40 Tage, etwa 60 Tage, etwa 90 Tage, etwa 120 Tage, etwa 180 Tage oder etwa 270 Tage verwendet werden. Der ausgewählte Vektor mit dem bestimmten Transgen kann dann für andere Zwecke eingesetzt werden, bei denen Langzeitexpression erwünscht ist, beispielsweise bei der Behandlung einer Erkrankung oder eines physiologischen Zustandes oder zur Herstellung eines bestimmten Phänotyps in einem Tier. Entsprechend können auch Verabreichungsverfahren analysiert und verglichen werden, beispielsweise intramuskuläre Injektion, intratumorale Injektion, intradermale Injektion, Inhalation oder andere Verabreichungswege. Auch der verwendete Vektortyp kann analysiert werden, beispielsweise nacktes Plamid, adenoviraler Vektor, adenoassoziierter Virusvektor, retroviraler Vektor und lentiviraler Vektor. Mithilfe dieses Verfahrens lässt sich auch jede Kombination von Vektoren, Verabreichungsverfahren und/oder für die Verabreichung verwendeter Zusammensetzungen auswählen oder optimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren der Expression eines Transgens, umfassend das Auswählen eines Vektors für das Exprimieren des Transgens, Einsetzen einer Nucleinsäure, welche eine mSEAP-Sequenz umfasst, im Wesentlichen aus einer mSEAP-Sequenz besteht oder aus einer mSEAP-Sequenz besteht, wie beispielsweise die von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2, in den Vektor, wobei der Vektor die Expression eines mSEAP-Polypeptids verursacht oder ein mSEAP-Polypeptid exprimieren kann, Verabreichung des die mSEAP-Sequenz enthaltenden Vektors an eine Zelle oder ein Säugetier, Feststellen der Expression von mSEAP-Polypeptid für einen Zeitraum von etwa 40 Tagen oder mehr nach dem Verabreichen des Vektors, Anwenden des ausgewählten Vektors ohne wesentliche Veränderungen in seiner Nucleotidsequenz, um einer Zelle oder einem Tier ein Transgenprodukt zu verabreichen. Bei dem Vektor ohne wesentliche Veränderungen in seiner Nucleotidsequenz handelt es sich um denselben Vektor mit wahlweisen Sequenzmodifikationen aufgrund des Einsetzens einer anderen Transgensequenz oder Verwendung anderer Insertionsstellen oder Sequenzmodifikationen, die nicht zu einer wesentlichen Änderung der Expression des Transgens führen, oder Sequenzmodifikationen, welche die Funktion des Vektors nicht wesentlich verändern. Wie für diesen Aspekt und jeden erfindungsgemäßen Aspekt beschrieben, kann es sich bei dem Transgen um jede Anzahl von Sequenzen handeln, die ein Polypeptid oder ein Protein codieren, oder um jede Anzahl von Sequenzen, die ein funktionelles Transkript codieren. Funktionelle Transkripte umfassen beispielsweise Antisense-Nucleinsäuren, Ribozyme und andere Nucleinsäuren, die in einer Zelle wirken sollen. Bei den protein- oder polypeptidcodierenden Sequenzen kann es sich um solche handeln, die eine therapeutische Aktivität oder eine Aktivität codieren, die in der Zelle eine Funktion ausübt. Es sind zahlreiche Transgene, die diese Aktivitäten aufweisen, verwendet worden und können für den Gebrauch mit dieser Erfindung ausgewählt werden, und die Auswahl des Transgens selbst schränkt den Umfang oder die Ausführung der Erfindung nicht ein.
Die verwendbaren Vektoren umfassen jede Zelle oder Zusammensetzung, die das Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle erlauben. Beispielsweise kann es sich bei den Vektoren um Nucleinsäuren, Plasmide, Kosmide, rekombinante virale Vektoren, mit Nucleinsäuren oder rekombinanten Viren beladene Liposomen, rekombinante oder genetisch modifizierte Zellen und Zusammensetzungen, welche diese Beispiele umfassen, oder eine beliebige Kombination dieser Beispiele handeln.
Die Erfindung stellt auch Nucleinsäuren bereit, welche AP-Aktivität codieren, und eine oder mehrere Änderungen einer Nucleotidsequenz umfassen, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 codiert, durch Nucleotidsubstitutionen, -deletionen oder -additionen sowie die AP-Proteine selbst. Die AP-Aktivität dieser Proteine ermöglicht die oben erwähnte Langzeitexpressionsanalyse über mehr als etwa einen Monat, oder mehr als etwa 40 Tage oder etwa 60 Tage oder etwa 90 Tage oder etwa 180 Tage oder etwa 270 Tage. Alternativ ist die AP-Aktivität in Zellen oder Tieren mit eingeführten Nucleinsäuresequenzen über diese Zeiträume relativ stabil, d.h. der Grad verändert sich nicht mehr als um etwa das 5-Fache oder um mehr als etwa das 10-Fache der nach Tag 10 feststellbaren Mengen. Diese Nucleinsäuren und Proteine können mit einer Beliebigen aus zahlreichen mutationserzeugenden Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Mit denselben Verfahren oder Verfahrenstypen, die in dieser gesamten Offenbarung beschrieben sind, können die Proteine und Nucleinsäuren hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Langzeitexpressionsaktivität zu besitzen oder zu codieren, getestet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine Sequenzausrichtung zwischen hSEAP (translatiert von GI 2190731 aus GenBank), dem alkalische Phosphatase(AP)-Protein in Volllänge der Maus, mEAP (translatiert von GI 192976 aus GenBank) und einer gentechnisch hergestellten Säuger-AP der Erfindung, mSEAP (wie translatiert aus den vom Erfinder geprüften Nucleotidsequenzdaten), dar. Die in der untersten Zeile aufgeführte Konsensussequenz entspricht der Sequenz von mSEAP.
2A ist eine Plasmidkarte von pMW19, beschrieben in Beispiel 1. Sie enthält die C-terminal trunkierte Form der EAP-Codierungsregion.
2B ist eine Plasmidkarte von pMW19, beschrieben in Beispiel 1. Sie enthält die C-terminal trunkierte Form der EAP-Codierungsregion.
2C ist eine Plasmidkarte von pXL3872, beschrieben in Beispiel 1. Sie enthält die mSEAP-cDNA. Exon 11 wurde trunkiert, wie in den Beispielen beschrieben ist (hier aufgeführt als „Exon 11 trunkiert").
3 zeigt den Expressionsgrad der alkalischen Phosphataseaktivität (AP) nach dem Einführen des Transgens in Balb/C-Mäuse. AP-Aktivität wird gemessen durch Entnahme von 12,5 μl Serum mit dem Phosphalight-Kit (Tropix; Bedford, MA, USA). Die schwarzen Kästchen geben die Expression nach Einführen von 25 μg Plasmid-DNA, umfassend das erfindungsgemäße mSEAP-Reportergen, wieder. Die schwarzen Dreiecke geben die Expression nach Einführen von 25 μg des aus dem Stand der Technik bekannten hSEAP-Reportergens wieder. Die schwarzen Kreise stellen Kontrollen dar, bei denen keine Plasmid-DNA im selben Injektionsvehikel verwendet wurde. Die Proben werden durch intramuskuläre Injektion, die durch elektrische Impulse verstärkt wurde, in die Mäuse eingeführt.
4 zeigt den Expressionsgrad der alkalischen Phosphataseaktivität nach dem Einführen von Transgen in C57/BL6-Mäuse. Die experimentellen Details sind dieselben wie in 3. Die schwarzen Kästchen geben den Expressionsgrad nach Einführen von 25 μg Plasmid-DNA, umfassend das aus dem Stand der Technik bekannte hSEAP-Reportergen, wieder. Die schwarzen Dreiecke geben den Expressionsgrad nach Einführen von 25 μg des erfindungsgemäßen mSEAP-Reporters wieder. Die schwarzen Kreise stellen Kontrollen dar, bei denen keine Plasmid-DNA im selben Vehikel verwendet wurde
5 zeigt die vergleichbare Halbwertszeit von mSEAP und hSEAP im Blut von Balb/C-Mäusen. Zwei Plasmide wurden nach dem Verfahren von Mir et al., PNAS 96: 4262–7 (1999) intramuskulär (i.m.) koinjiziert: 25 μg eines ersten Plasmids, das den Transkriptionsfaktor tTA codiert, der in Abwesenheit von Doxycyclin aktiv ist, und 25 μg eines zweiten Plasmids, das entweder mSEAP (pMW19) oder hSEAP codiert. Sowohl die mSEAP- als auch die hSEAP-Sequenz stehen unter der Kontrolle eines tTA-responsiven Promotors. Sieben (7) Tage nach dem Gentransfer wurde die alkalische Phosphataseaktivität bestimmt, anschließend erhielten die Mäuse Doxycyclin per Gavage. Danach erhielten die Mäuse 0,2 mg/ml Doxycyclin im Trinkwasser.
6 zeigt die Ergebnisse eines Verfahrens der Analyse der Langzeitexpression in einem Säuger. Balb/c-Mäuse werden i. m. mit 25 μg Plasmid-DNA, codierend mSEAP unter der Kontrolle eines CMV-Transkriptionspromotors, oder mit 25 μg Plasmid-DNA, codierend mSEAP unter der Kontrolle von rtTA2M2 in Kombination mit 25 μg Plasmid-DNA, codierend rtTA2M2, oder mit Salzlösung als Kontrolle injiziert. Siehe Urlinger et al., PNAS 97: 7963–68 (2000). Gentransfer wurde nach Mir et al. (1999), wie oben erwähnt, durch elektrische Impluse verstärkt. Die Mäuse erhielten 0,2 mg/ml Doxycyclin im Trinkwasser. Die AP-Aktivität wurde zu den angezeigten Zeitpunkten bestimmt.
7 zeigt die Aminosäuresequenz von mSEAP, wobei die Aminosäuren, die durch konservative Aminosäuresubstitutionen ersetzt werden können, um mutante oder von mSEAP abgeleitete Polypeptide zu erzeugen, unterstrichen sind.
Ausführliche Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen
Bei der Herstellung und Anwendung von Aspekten und Ausführungsformen dieser Erfindung kann ein Fachmann konventionelle Techniken aus der Molekularbiologie, Virologie, Mikrobiologie und DNA-Rekombination anwenden. Beispielhafte Techniken sind in der Literatur umfassend erklärt und aus dem Stand der Technik gut bekannt. Beispielsweise kann auf die folgenden allgemeinen Texte Bezug genommen werden, um die Erfindung herzustellen und zu verwenden: Sambrook et aP., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York und Sambrook et al. Dritte Auflage (2001); DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II (D. N. Glover Hrsg. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gaited. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1985)); Transcription And Translation Hames & Higgins, Hrsg. (1984); Animal Cell Culture (RI. Freshney, Hrsg. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2001), Coligan et al. (Hrsg.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. (2001); Dracopdi et al., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Inc. (2001), W. Paul et al. (Hrsg.) Fundamental Immunology, Raven Press; E. J. Murray et al. (Hrsg.) Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, The Humana Press Inc, (1991) und J. E. Celis et al., Cell Biology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1994).
Wie hierin verwendet, bedeutet ein „Vektor" jede Nucleinsäure oder jeden Nucleinsäure-tragenden Partikel, jede Zelle oder jeden Organismus, die verwendet werden können, um eine Nucleinsäure in eine Wirtszelle zu übertragen. Der Begriff „Vektor" umfasst sowohl virale als auch nicht-virale Produkte und Mittel zum Einführen der Nucleinsäure in eine Zelle. Ein „Vektor" kann in vitro, ex vivo oder in vivo verwendet werden. Nicht-virale Vektoren umfassen Plasmide, Kosmide und können beispielsweise Liposomen, elektrisch geladene Lipide (Zytofektine), DNA-Protein-Komplexe und Biopolymere umfassen. Virale Vektoren umfassen beispielsweise Retroviren, Lentiviren, adenoassoziiertes Virus, Pockenviren, Bakulovirus, Reoviren, Vakziniaviren, Herpes-Simplex-Viren, Epstein-Barr-Viren und Adenovirusvektoren.
Eine „Nucleinsäure" ist eine polymere Verbindung, die aus kovalent verknüpften Nucleotiden jedweder Herkunft zusammengesetzt ist. Nucleinsäuren umfassen Polyribonucleinsäure (RNA) und Polydesoxynucleinsäure (DNA), die beide entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein können. DNA umfasst cDNA, genomische DNA, synthetische DNA und halbsynthetische DNA. Der Begriff „Nucleinsäure" erfasst auch Sequenzen, die eine der bekannten Basenanaloge von DNA und RNA umfassen.
Prozentuale „Identität" zwischen zwei Nucleinsäuren oder zwei Polypeptidmolekülen betrifft den durch einen Vergleich durch eine einfache blastn- oder blastp-Suche mit Standardeinstellung (siehe z.B. die Homepage von NCBI BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) definierten Prozentanteil. „Homologie" kann durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformationen zwischen zwei Polypeptidmolekülen durch Ausrichtung (Aligning) der Sequenzinformationen und Verwendung leicht verfügbarer Computerprogramme bestimmt werden. Alternativ kann Homologie durch Hybridisierung von Polynucleotiden unter Bedingungen bestimmt werden, welche die Bildung stabiler Duplexe zwischen homologen Regionen und die Bestimmung der Identifizierung einer doppelsträngigen Nucleinsäure erlauben.
Ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste in einer Sequenz können durch eine andere Aminosäure gleicher Polarität ersetzt werden, welche als ein funktionelles Äquivalent dient, wenn die Substitution in keiner wesentlichen Änderung der Aktivität in mindestens einer ausgewählten biologischen Aktivität oder Funktion resultiert. Ein abgeleitetes Polypeptid ist ein funktionelles Äquivalent einer gegebenen Aminosäuresequenz. In SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 können eine oder mehrere Substitutionen an den in 7 (durch Unterstreichen) angezeigten Positionen vorgenommen werden, um ein funktionell äquivalentes, abgeleitetes Polypeptid herzustellen. Es können auch Trunkierungen des C-terminalen Endes von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 vorgenommen werden, um ein funktionell äquivalentes, abgeleitetes Polypeptid herzustellen. Konservative Substitutionen für eine Aminosäure in einer Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Beispielsweise umfassen die unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Aminosäuren, die aromatische Ringstrukturen enthalten, sind Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Amino säuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Änderungen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus derselben Klasse haben keinen wesentlichen Einfluss auf die Aktivität, das durch Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmte scheinbare Molekulargewicht und haben keinen wesentlichen Einfluss auf den isoelektrischen Punkt.
„Isoliert" in Bezug auf eine Nucleinsäure, ein Gen oder einen Vektor bedeutet, dass das jeweilige Molekül vorhanden ist und andere biologische Makromoleküle desselben Typs im Wesentlichen nicht vorhanden sind. Ein "isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein bestimmtes Polypeptid codiert" bezieht sich daher auf ein Nucleinsäuremolekül, das im Wesentlichen frei von anderen Nucleinsäuremolekülen ist, die nicht das entsprechende Polypeptid codieren. Die Zubereitung oder Probe, die das Molekül enthält, kann andere Bestandteile unterschiedlicher Typen umfassen. Darüber hinaus kann „isoliert von" einem bestimmten Molekül auch bedeuten, dass ein bestimmtes Molekül in einer Zubereitung oder Probe im Wesentlichen abwesend ist.
Wie hierin verwendet, kann sich ein „Reportergen" auf eine Nucleinsäure beziehen, die ein feststellbares Polypeptid oder Peptid codiert, wie beispielsweise AP, oder sich auf ein Proteinprodukt dieser exprimierten Nucleinsäuren beziehen. Das mSEAP-Reportergen und Protein kann die genomische DNA bedeuten, die EAP codiert und modifiziert ist, um ein mSEAP-Polypeptid zu werden oder zu codieren, oder eine modifizierte cDNA, die ein mSEAP codiert, oder das mSEAP-Protein selbst (das mSEAP-Reportergenprodukt). Das erfindungsgemäße neuartige mSEAP-Reportergen und -Protein der Erfindung umfasst insbesondere SEQ.-ID Nr. 1, SEQ.-ID Nr. 1 in Kombination mit einer Säugersignalsequenz am N-terminalen Ende, SEQ.-ID Nr. 1 in Kombination mit einer murinen Signalsequenz am N-terminalen Ende, SEQ.-ID Nr. 2, jedes der obigen, bei dem etwa 1 bis etwa 5 Aminosäuren vom C-terminalen Ende deletiert sind, und jedes Derivat oder jede Mutante von SEQ.-ID Nr. 1 oder 2, die zuvor nicht der Öffentlichkeit oder in einer Patentanmeldung offenbart worden sind, sowie die Nucleinsäuren, welche diese Sequenzen codieren. Wie hierin verwendet, kann ein Derivat oder eine Mutante eine Sequenz mit einer Identität von etwa 80%, etwa 90% oder etwa 95% mit SEQ.-ID Nr. 1 oder 2 sein, wobei blastp oder blastn mit den Standardeinstellungen verwendet werden, sowie Nucleotidsequenzen, welche diese codieren. Ein Polypeptidderivat kann auch die Langzeitexpressionsmerkmale besitzen, nämlich mindestens etwa 40 Tage lang nach dem Einbringen in eine Zelle feststellbar zu sein. Die erfindungsgemäßen mSEAP-Polypeptide oder Reportergenprodukte umfassen nicht ein Polypeptid mit der exakten Aminosäuresequenz von SEQ.-ID Nr. 13.
Über die spezifisch beschriebenen hinaus, können zahlreiche Gentransferverfahren und -techniken in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden. Viele der aufgeführten Bezüge können beim Auswählen einer geeigneten Gentransfertechnik oder Zusammensetzung oder einem geeigneten Abgabeverfahren verwendet werden. Reportergene sind in einer Reihe von Säugertestindividuen verwendet worden, einschließlich Maus, Kaninchen, Katze, Hund, Primaten und Menschen. Einem Fachmann sind die Techniken und Verfahren, die sich für diese Säugertestindividuen eignen, bekannt. Siehe beispielsweise Rosenberg et al., New Eng. J. Med. 323: 570–78 (1990); Cavazzana-Calvo et al., Science 288: 669–72 (2000); Dobson et al., Brit. Med. J. 320: 1225 (2000); Buckley et al., Nature Med. 6: 623–24 (2000) und die allgemeinen Texte und Bezugsquellen, die oben aufgeführt sind.
Einige experimentell bestimmte Eigenschaften und Kennzeichen von mSEAP
Wir haben das Gen der murinen embryonalen alkalischen Phosphatase (mEAP) gentechisch verändert, damit es für Langzeitexpressionsstudien und die Analyse von Gentransferverfahren und Vektoren geeignet ist. Dabei haben wir mehrere Probleme in Bezug auf die Verwendung von Reportergenen bei der Langzeitexpressionsanalyse angesprochen oder gelöst. Beispielsweise ist die AP-Hintergrundaktivität in manchen Tiergeweben, beispielsweise in Plasma von Mäusen, recht hoch. Das Erhitzen von Plasmaproben bei 65°C für 5 bis 30 Minuten kann den Hintergrund durch gewebeunspezifische alkalische Phosphatase(TNAP)-Aktivität reduzieren. Darüber hinaus können Inhibitoren wie beispielsweise L-Homoarginin verwendet werden, um TNAP-Hintergrundaktivität zu verringern. In AP-Aktivitätsassays wird üblicherweise eine Vorbehandlung mit Wärme und/oder Inhibitoren verwendet (Cullen und Malim, Meth. Enzymol. 216: 362–368 (1992).
Bislang war nicht bekannt, ob eine gentechnisch veränderte Form von mEAP thermostabil genug und resistent genug gegenüber TNAP-Inhibitoren sein würde, um als Reportergen verwendet werden zu können. Darüber hinaus war nicht bekannt, ob ein Reportergen und insbesondere ein AP-Reportergen über lange Zeiträume exprimiert und festgestellt werden könnte. Da das mEAP-Protein natürlicherweise in embryonalen Zellen in Mäusen exprimiert ist, kann die Expression von gentechnisch verändertem mSEAP-Protein einer endogenen oder physiologischen Regulation unterliegen, durch die es ausgeschaltet wird, wodurch es seinen Nutzen als Reportergen verliert.
Die erfindungsgemäßen mSEAP-Reportergensequenzen, -Nucleinsäuren und -Proteine sind die ersten, die in den klassischen immunkompetenten Laborsäugern nach somatischem Gentransfer über mehrere Monate hinweg exprimiert und festgestellt werden können. Dieselben Vektoren und Nucleinsäuren können bei einer Reihe von Tieren verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Säuger, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Maus, Ratte, Schwein, Kaninchen, Ziege, Kuh, Schaf, Makak, Langschwanzmakak und Mensch. Die Freiheit zur Verwendung immunkompetenter Tiere oder zur Vermeidung von Behandlungen, welche die Immunantwort hemmen, reduziert die Komplexität des Protokolls, verringert das zusätzliche Risiko für das Tier und reduziert die Kosten von Gentransferexperimenten. Die Erfindung bietet damit mindestens einen wirtschaftlichen Vorteil im Vergleich zu anderen verfügbaren Verfahren zur Analyse von Langzeitexpression. Die Erfindung bietet auch den Vorteil, Expression bei einem physiologisch normalen Patienten oder Tier analysieren zu können. Darüber hinaus kann die AP-Aktivität oder das Vorhandensein des mSEAP-Proteins durch mehrere einfache Techniken getestet werden, einschließlich denen, bei denen chemilumineszente, fluoreszente oder andere feststellbare Substarte oder Techniken verwendet werden.
Wir haben die Verwendung und Vorteile der Erfindung in einem Experiment intramuskulären Gentransfers gezeigt, in denen immunkompetente Mäuse verwendet wurden. Beispielsweise zeigt 3, dass der Expressionsgrad erfindungsgemäßer mSEAP-Reportergene mehr als 250 Tage lang stabil ist. Dagegen zeigen andere Reportergene einen Expressionsgrad, der nach 21 Tagen abfällt, und die Mengen variieren in dem Zeitraum exponenziell, nachdem die Aktivität zu Beginn festgestellt werden kann. Das Ergebnis ist in zwei Mausstämmen mit verschiedenem genetischem Hintergrund (Balb/C und C57/BL6) übereinstimmend. Die niedrigere Aktivität von mSEAP ist auf das Vorhandensein von Inhibitoren der alkalischen Phosphatase im Nachweiskit (PhosphaLight, Tropix; Bedford, MA, USA) zurückzuführen, welche die mSEAP-Aktivität, aber nicht die hSEAP-Aktivität beeinflussen (Daten nicht gezeigt).
Wir haben auch gezeigt, dass eine Immunantwort gegen hSEAP die wahrscheinliche Ursache des Abfalls der hSEAP-Aktivität ist, da wir in Mäusen, denen Plasmide injiziert wurden, welche hSEAP codieren, Anti-hSEAP-Antikörper festgestellt haben (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1
In Tabelle 1 ist die Feststellung von Anti-hSEAP-Antikörpern in Mausserum durch ELISA nach i.m. -Elektrotransfer von 25 μg Plasmid, das DNA enthält, welche hSEAP unter Kontrolle des Immediate-Early-Genpromotors von CMV codiert, gezeigt. Mikroplatten werden mit gereinigtem hPLAP (SIGMA, St. Louis, MO, USA) beschichtet und mit Serum von Mäusen, denen Salzlösung (negatives Serum: Reihe 2) oder hSEAP, codierend Plasmid (CMV-hSEAP, Reihe 3–7), injiziert wurde, oder mit monoklonalem Anti-hPLAP-Antikörper verdünnt in PBS (Reihe 1) oder mit Serum von nicht-injizierten Mäusen (Reihe 8) inkubiert. Anti-hSEAP-Antikörper werden mit einem Anti-Maus-Antikörper-HRP-Konjugat festgestellt. Nach Reaktion mit TMB wird die Absorption bei 450 nm gemessen. Ein Vergleich der Ergebnisse des negativen Kontrollserums, Reihe 2, mit denen von Reihe 3–7 zeigt, dass bei jeder der Proben, bei denen hSEAP-Plasmid injiziert und anschließend exprimiert wurde (Reihe 3–7) feststellbare Mengen von Anti-hSEAP-Antikörper vorhanden sind. Dies deutet darauf hin, dass die Verwendung des hSEAP-Reportergens schädlicherweise zur Produktion von Antikörpern führt, was die Ergebnisse von Expressionsassays durcheinander bringt und in den getesteten Tieren unangemessenerweise eine Immunantwort auslöst.
Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der in 3 gezeigte stabile Grad der Aktivität von mSEAP nicht auf dessen Stabilität im Blut, sondern vielmehr auf seine anhaltende und persistierende Synthese oder Expression durch die Zellen zurückzuführen ist, welche das Transgen enthalten. In 5 messen wir den Zerfall von mSEAP- und hSEAP-Aktivität nach dem Abschalten der Transkription. Um dies zu erreichen haben wir Mäusen zwei Plasmide koinjiziert: ein Plasmid, das den Transkriptionsfaktor tTA codiert, der in Abwesenheit von Doxycyclin aktiv ist, und ein zweites Plasmid, das mSEAP (pMW19) oder hSEAP unter der Kontrolle des tTA-responsiven Promotors codiert (siehe beispielsweise Urlinger, et al., PNAS 97: 7963–68 (2000)). Sieben (7) Tage nach dem Gentransfer erhalten die Mäuse Doxycylin und anschließend wird die alkalische Phosphataseaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass die Halbwertszeit von mSEAP-Aktivität weniger als 2 Tage beträgt und dass die Halbwertszeit von hSEAP-Aktivität weniger als 4 Tage beträgt. Diese Zahlen berücksichtigen die Halbwertszeit des Reporterproteins, seiner mRNA und den Zerfall der Transkriptionsrate nach Doxycyclinverabreichung. Die in 3 gezeigte anhaltende mSEAP-Aktivität lässt sich daher nicht durch eine verlängerte Halbwertszeit von mSEAP im Blut erklären.
Die Nützlichkeit dieser Erfindung wird weiter durch das in 6 gezeigte Experiment demonstriert. Wir haben den Einfluss des chimären Transkriptionsfaktors rtTA2M2 (siehe beispielsweise Urlinger, et al., PNAS 97: 7963–68 (2000)) auf die Dauer der mSEAP-Expression untersucht. In diesem Experiment wird Mäusen ein Plasmid, das mSEAP unter der Kontrolle eines konstitutiven Transkriptionspromotors (CMV) exprimiert, oder ein Plasmid, das mSEAP unter der Kontrolle eines rtTA2M2-responsiven Promotors exprimiert, in Kombination mit einem rtTA2M2-codierenden Plasmid injiziert. Die Tiere erhalten Doxycyclin (ein wasserlösliches Derivat von Tetracyclin) im Trinkwasser, da rtTA2M2 von diesem Molekül aktiviert wird. Dieses Experiment zeigt deutlich, dass rtTA2M2 nicht in der Lage ist, ein hohes Maß der Expression von mSEAP länger als 15 Tage aufrechtzuerhalten. Dies könnte auf eine zytotoxische Immunantwort gegen die Zellen zurückzuführen sein, die rtTA2M2 und mSEAP exprimieren. (rtTA2M2 ist ein Fusionsprotein, das aus Domänen bakteriellen und viralen Ursprungs besteht). Die CMV-gesteuerte Expression von mSEAP führt dagegen zu einem stabilen Expressionsgrad. Das Verfahren der Expression eines Transgens oder das Verfahren des Analysierens der Langzeitexpression eines Transgens, die von dieser Erfindung bereit gestellt werden, ermöglicht damit die Auswahl geeigneter regulatorischer Elemente und Vektoren für Langzeitexpressionsanwendungen. Es existieren zahlreiche regulatorische Elemente aus dem Stand der Technik, die zur Verwendung und Analyse ausgewählt werden können. Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung eines bestimmten regulatorischen Elementes oder die hierin als Beispiele spezifizierten regulatorischen Elemente beschränkt.
Die oben und in den folgenden spezifischen Beispielen diskutierten Ergebnisse sind lediglich eine Wiedergabe des Umfangs der Erfindung und des Inhalts dieser Beschreibung. Ein Fachmann kann die hierin enthaltenen Informationen verwenden, um zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung zu entwickeln, herzustellen und zu verwenden. Die hier gegebenen Beispiele sind demnach nicht als eine Einschränkung des Umfangs oder des Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen.
Beispiel 1: Herstellung von Plasmiden, die AP-Aktivität codierende Nucleinsäuren umfassen
Die Nucleinsäure, welche das erfindungsgemäße mSEAP-Reportergen oder -Polypeptid codiert, kann aus genomischer Maus-DNA abgeleitet werden, von einer GenBank-Sequenz synthetisiert werden oder von einem der Plasmid abgeleitet werden, die ein EAP-Gen enthalten (beispielsweise pSVT7-EAP von Narisawa et al., Development 116: 159–165 (1992), Manes et al., Genomics 8: 541–554 (1990); oder die aus Hahnel et al., Development 110: 555–564 (1990); Bao et al., Gynocologic Oncology 78: 373–379 (2000); Berger et al., Gene 66: 1–10 (1988)). Entweder aus der klonierten Gensequenz oder der genomischen Sequenz werden geeignete PCR-Oligos hergestellt, die zur Deletion von etwa 22 Codons von denen führen, die unmittelbar vor dem Stoppcodon liegen. Funktionell entfernt die Deletion der C-terminalen Codons die Membranverankerungsaktivität der nativen C-terminalen Aminosäuren. Entsprechend kann jede C-terminale Trunkierung, die zu einem Polypeptid führt, das funktionell keine Membranverankerungsaktivität besitzt, verwendet werden und ist in dieser Erfindung enthalten.
An das Ende der Codierungsregion wird ein Stoppcodon zugefügt oder eingeführt. Beispielsweise kann ein genomisches Mausfragment, das EAP codiert, mit den unten gezeigten Oligonucleotiden A und B durch PCR amplifiziert werden, um das mSEAP von SEQ.-ID Nr. 2 zu erzeugen. Alternativ können Oligo A und C verwendet werden, um das EAP codierende Fragment in voller Länge zu erzeugen. Das Volllängenfragment kann zur Erzeugung von Mutationen oder als Kontrolle verwendet werden.
In einem Verfahren werden die PCR-Fragmente mit HindIII und XbaI geschnitten und zwischen die HindIII- und AvrII-Schnittstellen von pXL3443 (ein von pBKSII abgeleitetes Plasmid, das den CMV-I/E-Promotor und das SV40-Late-Poly(A)-Signal, getrennt von einer multiplen Klonierungsstelle, enthält) eingesetzt, um pMW12 und pMW18 zu erzeugen (siehe 2A). Dasselbe Insert kann zwischen den HindIII- und XbaI-Schnittstellen von pTRE2 (Clontech) verwendet werden, um pMW19 zu erzeugen (siehe 2B). Plasmid pMW12 enthält das native EAP-Gen und pMW18 den genomischen Klon mit einer Trunkierung am C-terminalen Ende der EAP-Codierungsregion, beide unter der Kontrolle des CMV-I/E-Promotors (von etwa –522 bis etwa +74 von der Startstelle) und des SV40-Late-Poly(A)-Signals. Plasmid pMW19 steuert die Transkription des trunkierten murinen EAP-Gens durch einen minimalen CMV-I/E-Promotor (von etwa –51 bis etwa +70 von der Startstelle) unter Kontrolle eines Tetracyclin-responsiven Elementes (siehe beispielsweise, Gossen und Bujard, PNAS 89: 5547–5551 (1992); (Urlinger, et al., PNAS 97: 7963–68 (2000)) mit einem β-Globin-Poly(A)-Signal.
Eine cDNA, die mSEAP von SEQ.-ID Nr. 2 codiert, lässt sich wie folgt erhalten. Murine C2Cl2-Myoblasten werden transient mit pMW18 im Komplex mit LipofectAMINE (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) nach dem Protokoll des Herstellers transfiziert. PolyA⁺-RNA wird mit einem kommerziellen Kit (Dynal Dynabeads mRNA Direct Kit) aus transfizierten Zellen extrahiert. PolyA⁺-RNA wird revers transkribiert und durch PCR (RT-PCR-Kit Progema, Madi son, WI, USA) mit den unten gezeigten Oligonucleotiden C9415 und C9416 amplifiziert.
Die Oligos C9415 und C9416 sind so konzipiert, dass sie die mSEAP-Nucleinsäure amplifizieren, die an ihrem 5'-Ende von einer HindIII-Schnittstelle und am 3'-Ende von einer XbaI-Schnittstelle flankiert ist. Das Produkt der RT-PCR-Reaktion wird in pGEMT-Easy (Promega, Madison, WI, USA) ligiert und in E.coli DH5α transformiert. Das resultierende Plasmid enthält die mSEAP-cDNA, die von einer multiplen Klonierungsstelle umgeben ist. Ein Plasmid pCOR (siehe Soubrier et al., Gene Therapy 6: 1482–88 (1999)) kann verwendet werden, um ein Plasmid pXL3872 (2C) zu konstruieren, das die mSEAP-Nucleinsäure unter der Kontrolle des CMV-I/E-Promotors (–522/+74) und des SV40-Late-Poly(A)-Signals enthält, wobei die HindIII-bis XbaI-Schnittstellen von pXL3856 (ein pCOR-Plasmid, das den CMV-I/E-Promotor (–522/+74) und das SV40-Late-Poly(A)-Signal enthält) verwendet wurde. Die Expressionskassettenregion von Plasmid pXL3872 (2C) wird durch Sequenzierung verifiziert.
Plasmide, welche andere AP-Sequenzen codieren, sind für AP-Kontrollproteine, für andere erfindungsgemäße mSEAP-Polypeptide oder erfindungsgemäße abgeleitete mSEAP-Polypeptide in gleicher Weise konstruiert. Beispielsweise handelt es sich bei pXL3402 um ein pCOR-Plasmid (Soubrier et al., 1999), in dem die SEAP-cDNA unter der Kontrolle des CMV-I/E-Promotors (–522/+74) und des SV40-Late-Poly(A)-Signals steht. Andere Plasmide stellen SEAP unter die Kontrolle der Tetracyclinresponsiven Elemente (TRE) und des SV40-Late-Poly(A)- Signals. In einem anderen Beispiel kann das PstI-SpeI-Fragment, welches Luciferase in pBi-L codiert (Baron et al., Nucleic Acids Res. 23: 3605–06 (1995)) durch eine Nucleinsäure ersetzt werden, die eine AP-Aktivität, flankiert von den PstI- und SpeI-Schnittstellen, codiert. Es kann ein PCR-amplifiziertes Fragment von pSEAP2-basic (Clontech) verwendet werden. Ein Plasmid mit einer AP-Aktivität unter der Kontrolle des CMV-I/E-Promotors und des SV40-Late-Poly(A)-Signals kann auch konstruiert werden, indem das SacI-PvuII-Fragment von pBi-L (TRE) durch das SacI-StuI-Fragment von pXL3031 (CMV-I/E-Promotor, Soubrier et al., 1999) ersetzt und anschließend der ORF der Luciferase durch den ORF von SEAP ersetzt wird.
Die Plasmide können durch Reinigung mit dem endo-freien Mega-Prep-Kit (Qiagen) für die Gentransferverabreichung vorbereitet werden. Vorzugsweise ist die in den Proben festgestellte Endotoxinkonzentration weniger als 20 EU je mg DNA. Andere Verfahren und Techniken zum Reinigen von Vektoren und Nucleinsäuren für die Verabreichung an einen Säuger sind aus dem Stand der Technik bekannt und können verwendet werden.
Beispiel 2: Transfektion kultivierter Zellen
C2Cl2 (ATCC: CRL1772)- und HEK293 (ATCC: CRL1573)-Zellen werden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät (7,5 × 10⁴ Zellen je Vertiefung) und 24 Std. lang in DMEM, ergänzt durch 10% FKS, kultiviert. Anschließend werden die Zellen in DMEM ohne Serum gewaschen und in dreifacher Ausführung durch Zugabe von 0,5 ml OptiMEM, gemischt mit verschiedenen Mengen von AP-codierendem Plasmid, das mit einem Trägerplasmid und LipofectAMINE (2 μl für C2Cl2, 3 μl für HEK293) auf 500 ng supplementiert wurde, transfiziert. Fünf Stunden später wird das Medium mit der DNA und dem LipofectAMINE durch 1 ml DMEM, supplementiert mit FKS (2% für C2Cl2, 10% für HEK293), ersetzt. Zwei (2) Tage nach der Transfektion werden Aliquots des Kulturmediums abgenommen und zur Aufbewahrung bei –70°C eingefroren. Die Zellen werden zweimal mit PBS gespült, mit 100 μl 0,2% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl inkubiert, von der Platte mit einem Schaber abgelöst und durch wiederholtes Pipettieren homogenisiert. Das Lysat wird 2 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand bei –70°C aufbewahrt.
Beispiel 3: Intramuskulärer Gentransfer
Acht Wochen alte weibliche Balb/C- oder C57BL/6-Mäuse (Charles River Laboratories) werden durch intraperitoneale Injektion von 200 μl Ketamin (8,66 mg/ml), gemischt mit Xylazin (0,31 mg/ml), in 150 mM NaCl anästhesiert. Die Hinterbeine werden rasiert. Fünfundzwanzig Mikroliter einer Nucleinsäurevektor enthaltenden Lösung in 150 mM NaCl werden in den Musculus tibialis cranialis injiziert. Dreißig Sekunden nach der Injektion können transkutane elektrische Impulse durch Edelstahl-Parallelelektroden, verbunden mit einem Electro Square Porator, Modell T820 (BTX, San Diego, CA, USA), und einem Oszilloskop TDS 210 (Tektronix, Oregon, USA), verabreicht werden. Die gegebenenfalls verwendeten Plattenelektroden werden auf jeder Beinseite platziert (Plattenabstand 4 mm), und es werden 8 Rechteckimpulse (80 Volt, 20 ms pro Impuls, 1 Impuls pro Sekunde) verabreicht (Mir et al., 1999).
Zu verschiedenen Zeitpunkten relativ zu der DNA-Injektion werden aus der Vena saphena Blutproben von je 50 μl in heparinisierte Kapillarröhrchen abgenommen (Hem et al., Lab. Anim. 32: 364–68 (1998)). Die Proben werden 20 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert und das Plasma abgenommen und zur Aufbewahrung bei –70°C eingefroren.
Beispiel 4: Reportergenexpressionsanalyse
Beispielhafter Enzymassay
Die Feststellung der AP-Aktivität kann mit dem Phospha-Light-Kit (Tropix, Perkin-Elmer) nach den Anleitungen des Herstellers oder durch Anwendung der Modifikationen von Cullen und Malim, Meth. Enzymol. 216: 362–8 (1992) durchgeführt werden. Fünfzehn (15) μl Plasma oder Zellkulturmedium oder Zellextrakt werden in 45 μl 1 X Verdünnungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4; 150 mM NaCl) verdünnt, 5 Minuten bei 65°C erhitzt, anschließend in einem PCR-Blockthermocycler auf 4°C abgekühlt. Fünfzig (50) μl verdünnte Probe werden 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 μl Assaypuffer (1 M Diethanolamin pH 10,5–11, 1 mM MgCl₂, 10 mM L-Homoarginin) inkubiert, bevor 50 μl Reaktionspuffer (CSPD-Substrat mit Emerald-Enhancer) zugegeben werden. Die Reaktion wird anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Chemilumineszenz in einem MLX-Mikrotiterplattenluminometer (Dynex) gemessen wird (10 Sekunden je Vertiefung).
Beispielhafter ELISA-Assay
Die Feststellung von Antikörpern gegen AP, beispielsweise das hSEAP in Tabelle 1, kann mithilfe eines ELISA-Assays erfolgen. Es können aber auch ähnliche Assays für andere AP-Proteine, z.B. die erfindungsgemäßen, verwendet werden. Vertiefungen einer PVC-Mikrotiterplatte werden mit 50 μl einer Lösung mit 0,5 μg/ml humaner plazentaler alkalischer Phosphatase (PLAP, Sigma) in 0,2 M Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9,5 beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wird dann dreimal mit 250 μl eines 0,1 M Phosphatpuffers pH 7,5, 0,1 M NaCl (PBS), 0,05 Tween 20 (Gew./Vol.) gewaschen. Die verbleibenden Proteinbindungsstellen auf der PVC-Platte werden durch Inkubation mit PBS, 2% BSA (Gew./Vol.) für 2 Stunden bei Raumtemperatur gesättigt. Je Vertiefung werden 50 μl Testplasma oder Positiv- oder Negativkontrollen zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Negativkontrolle kann das Plasma einer unbehandelten Balb/c-Maus sein. Die Positivkontrolle wird erhalten, indem das Plasma einer negativen Kontrollmaus mit 64 ng/ml eines monoklonalen Mausantikörpers gegen PLAP (Klon 8B6, Sigma Immunochemicals) versetzt wird. Plasmaproben werden bei Verdünnung 1:1 bis 1:64 getestet (zweifache serielle Verdünnung in PBS). Die Proben werden dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Bio-Rad), in PBS, 2% BSA (Gew./Vol.), 0,05% Tween 20 inkubiert und dreimal mit 250 μl PBS, 0,05 Tween 20 gewaschen. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 100 μl 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (USB, Ohio, USA) umgesetzt und die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 0,5 N H₂SO₄ angehalten. Die Absorption wird bei 450 nm gemessen.
Beispiel 5: Analyse der Langzeitexpression
Mäusen werden 25 μg Plasmid-DNA, codierend hSEAP, erfindungsgemäßes mSEAP, oder Salzlösung als Kontrolle injiziert. Der Gentransfer wird durch elektrische Impulse nach Mir et al. PNAS 96: 4262–7 (1999) verstärkt. Blutproben werden zu den angegebenen Zeitpunkten durch Punktion der Vena saphena in heparinisierte Kapillaren abgenommen, 20 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute in einer klinischen Zentrifuge zentrifugiert, und 12,5 μl Serum werden nach den Anleitungen in dem Phosphalight-Kit (Tropix), außer dass verdünnte Plasmaproben 5 Minuten bei 65°C erhitzt wurden, auf alkalische Phosphataseaktivität untersucht. Ergebnisse für beispielhafte Experimente dieser Art sind in 3 gezeigt. Die mSEAP-Mengen oben in der Tabelle werden in der ersten Probe nach Gentransfer festgestellt und bleiben während des gesamten Probennahmezeitraumes (über 9 Monate) hinweg konstant hoch. Dagegen kann das hSEAP-Reportergen nur für etwa 20 Tage in Konzentrationen über der Kontrolle festgestellt werden, und die Mengen variieren stark. Die angegebenen Mengen und relativen Fehler weisen darauf hin, dass die erfin dungsgemäßen mSEAP-Reportergene für Studien extrem langer Expression verwendet werden können und dass der Grad der Expression einheitlich und reproduzierbar ist.
Beispiel 6: Herstellung von mSEAP-codierenden Nucleinsäuren und Polypeptidderivaten; Analyse von Expressionsvektoren
Die in Beispiel 1 erwähnten Nucleinsäuren, die von dem mEAP-Gen abstammen, können als Ausgangspunkt zur Erzeugung konservativer Aminosäuresubstitutionsmutanten der erfindungsgemäßen mSEAP-Proteine verwendet werden. Die mSEAP-Kodierungssequenz wird mit einem Oligo PCR-amplifiziert, das eine von mehreren Nucleotidveränderungen enthält, die zu Aminosäuresubstitutionen führen. Beispielsweise kann das Verfahren, beschreiben in Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (insbesondere Kapitel 3 und Einheit 3.17 und Kapitel 8 und Einheit 8.5) adaptiert werden. Die durch Unterstreichen in 7 hervorgehobenen Aminosäuren geben Stellen für konservative Aminosäureveränderungen wieder. Position 358, 357 oder 356 können modifiziert werden, um ein Isoleucin anstelle eines Valins und/oder eine Glutaminsäure anstelle einer Asparaginsäure und/oder ein Arginin anstelle eines Lysins zu codieren. Einmal in die Sequenz eingefügt, kann die Sequenz der Substitutionsmutante wie in Beispiel 1 in ein Plasmid eingebaut werden. Das mutierte mSEAP-Protein kann dann wie in Beispiel 5 exprimiert und getestet werden, um Langzeitexpression zu bestätigen, und/oder hinsichtlich der Fähigkeit, in immunkompetenten Tieren verwendet zu werden. Diese Erfindung umfasst jedes oben und in dieser gesamten Beschreibung erwähnte abgeleitete Polypeptid, das die Langzeitexpressionseigenschaften besitzt. Das Testen auf diese Eigenschaften kann wie hier beschrieben durchgeführt werden.
Beispielhafte abgeleitete Polypeptide können mit denselben Techniken, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, hergestellt werden, um mSEAP-Nucleinsäuren zu erzeugen. Der 3'-Primer „B", SEQ.-ID Nr. 5, codiert ein Stoppcodon, das zu einer Trunkierung von 22 Aminosäuren in dem eingebauten mit dem A-Primer PCR-amplifizierten Produkt, SEQ.-ID Nr. 4.
Translatierter B-Primer (SEQ.-ID Nr. 5) 3'5' Raster 2 Q S S A V S P G Stopp S R K
Die Auswahl eines neues 3'-Primers durch Verschieben des Stoppcodons weiter in die Codierungssequenz hinein führt zu einem amplifizierten Produkt, das weniger Codons aufweist. Aus den SEAP- oder EAP-cDNAs oder genomischen Klonnucleotiden werden also trunkierte Produkte hergestellt, die Trunkierungen von 27 Aminosäuren des murinen EPA-Gens, wie es in Manes et al., Genomics 8: 541554 (1990) erwähnt ist, entsprechen. Auf diese Weise werden Trunkierungen des mEAP von etwa 22 bis etwa 27 Aminosäuren hergestellt. Die resultierende amplifizierte DNA wird dann in einen Säuger-Expressionsvektor eingebaut, einer immunkompetenten Maus verabreicht, und die Langzeitexpressionseigenschaften der AP-Aktivität werden durch den Chemilumineszenz-Assay (Tropix, Bedform, MA, USA) getestet. Der Expressionsvektor kann viral sein, wie beispielsweise Adenovirus oder adenoassoziiertes Virus, oder es kann sich dabei um Plasmidvektoren handeln. Durch Testen der AP-Aktivität mit bestimmten Expressionsvektoren oder regulatorischen Sequenzen kann ein geeigneter Vektor für Transgenexpression ausgewählt oder optimiert werden. Auch ligand-abhängige regulatorische Sequenzen können auf ihre Fähigkeit zur Kontrolle der Expression über lange Zeiträume getestet werden (siehe beispielsweise Abruzzese, et al., Hum. Gene Ther. 10: 1499–1507 (1999); Urlinger et al., PNAS 97: 7963–68 (2000)), beispielsweise über die Zeiträume von 40 Tagen, 60 Tagen, 90 Tagen, 120 Tagen, 180 Tagen oder 270 Tagen, wie sie durch Anwendung der Erfindung möglich sind.
SEQUENZLISTE

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine alkalische Säuger-Phosphataseaktivität mit den Aminosäuresequenzen der SEQ.-ID. Nr. 1 oder 2 codiert, wobei die Nucleinsäure kein Polypeptid mit der gleichen Sequenz von Aminosäuren, die unter SEQ.-ID. Nr. 13 gelistet sind, codiert.
Expressionsvektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.
Viraler Vektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.
Plasmidvektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 1 umfasst.
Säugerzelle, in die eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder ein Vektor nach einem der Ansprüche 2–4 in vitro eingebracht wurde.
Zelle nach Anspruch 5, die eine Mauszelle ist.
Zelle nach Anspruch 5, die eine menschliche Zelle ist.
Nucleinsäure mit einer Sequenz, die ein alkalische Säuger-Phosphataseaktivität-aufweisendes Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid exprimiert und für einen Zeitraum von etwa 40 Tagen in einem Säuger nachgewiesen zu werden vermag und wobei die Nucleinsäure ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ.-ID. Nr. 1 oder 2, jedoch nicht mit derjenigen der SEQ.-ID. Nr. 13 codiert.
Expressionsvektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 8 umfasst.
Viraler Vektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 8 umfasst.
Plasmidvektor, der die Nucleinsäure nach Anspruch 8 umfasst.
Säugerzelle, in die eine Nucleinsäure nach Anspruch 8 oder ein Vektor nach einem der Ansprüche 9–11 eingebracht wurde.
Rekombinantes alkalisches Säuger-Phosphatase-Polypeptid, wobei das Polypeptid in einer Säugerzelle exprimiert und in einem Säuger etwa 40 Tage nach der ersten Expression in der Zelle des Säugers nachgewiesen zu werden vermag, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ.-ID. Nr. 1 oder 2 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine Sequenz mit einer Aminosäure-Identität zur SEQ.-ID. Nr. 1 oder 2 von mindestens 95 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine Sequenz mit einer Aminosäure-Identität zur SEQ.-ID. Nr. 1 oder 2 von mindestens 90 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid eine Sequenz mit einer Aminosäure-Identität zur SEQ.-ID. Nr. 1 oder 2 von mindestens 80 aufweist.
Säugerzelle, die das alkalische Phosphatase-Polypeptid nach Anspruch 13 umfasst.
Säugerzelle, die das alkalische Phosphatase-Polypeptid nach Anspruch 14 umfasst.
Säugerzelle, die das alkalische Phosphatase-Polypeptid nach Anspruch 15 umfasst.
Säugerzelle, die das alkalische Phosphatase-Polypeptid nach Anspruch 16 umfasst.
Maus, die eine Zelle nach einem der Ansprüche 17–20 umfasst.
Makak, der eine Zelle nach einem der Ansprüche 17–20 umfasst.