DE69432901T2

DE69432901T2 - Expressionssystem von antikörpern bei homologischer rekombinierung in murinezellen

Info

Publication number: DE69432901T2
Application number: DE69432901T
Authority: DE
Inventors: Franklin Gregory HOLLIS; E. George MARK
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2014-12-23
Also published as: HU9601467D0; US6750041B2; ATE244311T1; ES2202351T3; US20030124648A1; JPH09510865A; GB9613135D0; US20030082673A1; FI962268A0; EP0731845A1; EP0731845B1; FI119698B; CZ185996A3; HUT74844A; JP3654446B2; DE69432901D1; WO1995017516A1; CA2177959A1; DK0731845T3; AU691857B2

Description

Rekombinante Expressionskonstrukte werden routinemäßig dazu verwendet, stabile Säugerzellinien, die ein gewünschtes rekombinantes Protein exprimieren, zu erzeugen. Bei diesen rekombinanten Expressionskonstrukten kann es sich um solche, die als extrachromosomale Plasmide in einer transfizierten Wirtszelle bestehen bleiben, oder um solche, die in das Wirtsgenom integrieren, handeln. Säugerwirtszellen, die stabil integrierte Kopien rekombinanter Gene tragen, sind typischerweise zuverlässiger bezüglich Bewahrung und Integrität des rekombinanten Gens. Sobald eine rekombinante Säugerwirtszelle, die das rekombinante Protein produziert, identifiziert ist, dürften integrierte Kopien des rekombinanten Gens gegenüber extrachromosomalen Kopien des Gens attraktiver sein.
Jedoch ist die Häufigkeit von Zellinien, die stabil integrierte Kopien eines rekombinanten Gens tragen und ein gewünschtes rekombinantes Protein mit hohen Ausbeuten exprimieren, ziemlich niedrig. So muß typischerweise eine große Anzahl an stabil transfizierten Säugetierzellen einem Screening unterzogen werden, um Klone, die das rekombinante Protein mit hohen Ausbeuten exprimieren, zu identifizieren. Man nimmt allgemein an, daß dies an den Auswirkungen des Locus der Insertion des rekombinanten Gens in das Säugergenom liegt. Aufgrund der Größe des Säugergenoms ist es höchst unwahrscheinlich, daß ein willkürliches Integrationsereignis zur Insertion des rekombinanten Gens in einen für hohe Genexpressionsniveaus günstigen Locus führen würde.
Durch eine Erhöhung der Häufigkeit von Zellinien, die ein rekombinantes Gen auf hohem Niveau exprimieren, würde ein Pool von Zellen mit hoher Expression bereitgestellt werden, von dem man dann die rekombinante Proteinproduktionszelle für die nachfolgende Selektion wählen könnte. Darüber hinaus würde eine Erhöhung der Häufigkeit die Anzahl an stabilen Zellinien, die erzeugt werden müßten, um Zellen mit hoher Expression des rekombinanten Proteins identifizieren zu können, reduzieren.
KURZE BESCHREIUNG DER OFFENBARUNG
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Definition einer spezifischen Position im Säugergenom, die für hohe Expressionsniveaus eines rekombinanten Gens vorteilhaft ist, sowie ein effizientes Verfahren zur Erhöhung der Häufigkeit von Zellen mit hoher Expression, in dem das Expressionskonstrukt gezielt an eine vorteilhafte genomische Position gebracht wird.
Ebenfalls offenbart ist die Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, um eine stabile Zellinie zu etablieren, die ein rekombinantes Protein auf hohem Niveau exprimiert. In der Erfindung wird weiterhin gezeigt, daß die mit dieser Erfindung erzeugte Zellinie rekombinantes Protein auf extrem hohem Niveau exprimiert, wobei häufig die durch willkürliche Integration des Expressionskonstrukts in das Säugergenom produzierten Zellinien mit der besten Expression übertroffen werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 – Ein schematisches Diagramm des Plasmids p9014 ist gezeigt.
2 – Die Insertionsstelle von p9014 in das Mauschromosom ist gezeigt.
3, Tafeln A, B und C – Tafel A zeigt ein Diagramm des Antikörperexpressionsplasmids pIgG2A für die homologe Rekombination; Tafel B zeigt ein Diagramm des homologen Rekombinationsereignisses der Insertion des Antikörperexpressionsplasmids in das Chromosom; und Tafel C zeigt den das Homolog rekombinierte Antikörperexpressionsplasmid enthaltenden Teil des Chromosoms.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erreichung eines hohen Expressionsniveaus rekombinanter Gene in Säugetierzellen. Hohe Expressionsniveaus rekombinanter Gene entstehen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durch stellenspezifische Integration rekombinanter Gene in das Wirtszellengenom. Die Integrationsstelle wird vorher ausgewählt, wobei das Integrationsereignis durch homologe Rekombination eines DNA-Vektors erreicht wird, der spezifische DNA-Sequenzen enthält, die bekanntermaßen zu einer spezifischen Stelle innerhalb des Wirtsgenoms homolog sind. Die spezifische Stelle innerhalb des Wirtsgenoms wird auf Grundlage der Festellung, daß diese Stelle bezüglich der Gentranskription hochaktiv ist und daß homologe DNA-Segmente leicht in sie integriert werden können, zur Insertion des rekombinanten Gens ausgewählt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Säugetierzellen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, NS/0-Zellen und sind als Zellen ganz besonders bevorzugt.
NS/0-Zellen [Galfre, G. und Milstein, C. Methods in Enzymology (1981) 73B: 3–46.] werden bei etwa 37°C in Suspension in beispielsweise Dulbecco's Modified Minimal Essential Medium (Hazelton Research Products) mit etwa 10% fötalem Kälberserum (HyKlone, Definierte Seren ohne nachweisbares Endotoxin) oder Iscove's Modified Dulbecco's Medium (JRH Biosciences) mit etwa 9% Pferdeserum kultiviert. Die Zellen werden in Rollerflaschen, in 46 Liter fassenden Wheaton Turbolift Suspensionskolben (Wheaton) oder in 75, 200 oder 300 Liter fassenden Fermentern bei wöchentlichen Ernten von ungefähr 1–2 × 10⁶ Zellen/ml (3–4 Verdopplungen/Woche) kultiviert. Die für Suspensionskolben oder Fermenter verwendeten Medien können etwa 0,1–0,3% F68-Pluronic zur Reduzierung der auf die Zellen wirkenden Scherkräfte enthalten. Die Zellen werden typischerweise nicht länger als 3–4 Monate nach der Anfangskultur kultiviert.
Zellfreie Extrakte von NSO-Zellen werden hergestellt, indem die Zellen durch Dekompression mit Stickstoff, hypotonische Lyse u. ä. aufgeschlossen werden. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt und können in einer isotonischen Pufferlösung, wie z. B. Phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von etwa 7,4 gewaschen werden. Die hypotonische Lyse wird durchgeführt, indem die Zellen in etwa 10 Volumen hypotonischem Puffer (etwa 10 mM KCl, etwa 20 mM HEPES, ca. pH 7,4, etwa 1,5 mM MgCl₂, etwa 0,1 mM EDTA) bzw. (etwa 25 mM HEPES, ca. pH 7,5, etwa 5 mM MgCl₂ und 1 mM EGTA) gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt werden. Der Lysepuffer kann auch ein Reduktionsmittel, wie z. B. Dithiothreitol (DTT), enthalten. Der hypotonische Puffer enthält im allgemeinen Proteaseinhibitoren, wie z. B. PMSF, Leupeptin und Pepstatin. Die Zellen werden in etwa 3 Volumen hypotonischem Puffer resuspendiert, etwa 20 min auf Eis gestellt und dann mit etwa 20 Hüben in einem Dounce-Homogenisator lysiert. In einem 100 bzw. 300 ml fassenden dichtfüllenden Dounce-Homogenisator werden etwa 90 bis etwa 95% der Zellen mittels etwa 25 bzw. 15 Hüben aufgeschlossen. Der Druckaufschluß mit Stickstoff findet ebenfalls in einem hypotonischen Puffer statt. Die resuspendierten Zellen werden für etwa 30 min bei etwa 4°C unter Schütteln in einer Stickstoff-Druckzelle mit 400 psi Stickstoff gehalten. Der Aufschluß wird erreicht, indem der Druck abgelassen wird und die Zellen aus der Druckzelle entfernt werden. Das Zellysat wird durch aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte bei etwa 400 bis etwa 1000 × g (Überstand S1), bei etwa 30000 × g (Überstand S2) und bei etwa 300000 × g (Überstand S3) geklärt. Das Zellysat kann auch durch die folgende Vorgehensweise geklärt werden. Nicht aufgeschlossene Zellen werden durch 10minütige Zentrifugation bei etwa 3000 UpM und etwa 5°C in einer Beckmann-GPR-Zentrifuge abgetrennt. Die postnukleäre Überstandsflüssigkeit wird etwa 20 Minuten bei etwa 16000 UpM in einer Sorval-Zentrifuge mit einem SS34-Rotor zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeit wird durch etwa 60minütiges Zentrifugieren bei etwa 50000 UpM in einer Beckmann-Zentrifuge (50.2Ti-Rotor) oder 45000 UpM(45Ti-Rotor) weiter geklärt. Die erhaltene Überstandsflüssigkeit wird bei etwa –80°C nach Zugabe von etwa 2 mM DTT und 0,1% CHAPS gelagert.
Eine beliebige aus einer Viefalt von Vorgehensweisen läßt sich zur molekularen Klonierung von cDNA verwenden. Zu diesen Verfahren gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die direkte funktionelle Expression des rekombinanten Gens nach Konstruktion einer cDNA-Bibliothek in einem entsprechenden Expressionsvektorsystem. Ein weiteres Verfahren besteht im Screenen einer in einem Bakteriophagen-Vektor oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruierten cDNA-Bibliothek mit einer markierten, aus der Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins abgeleiteten Oligonukleotidsonde.
Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken läßt sich mittels im Fachgebiet allgemein bekannter Standardtechniken durchführen. Allgemein bekannte Techniken zur Konstruktion von cDNA-Bibliotheken sind beispielsweise bei Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., Molecular Kloning: A Laboratory Manual (Cold Spring 9 Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) zu finden. Dem Fachmann ist leicht ersichtlich, daß die das gewünschte Protein codierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bibliothek isoliert werden kann.
Die Konstruktion genomische DNA-Bibliotheken läßt sich mittels im Fachgebiet allgemein bekannter Standardtechniken durchführen. Allgemein bekannte Techniken zur Konstruktion genomischer DNA-Bibliotheken sind bei Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. in Molecular Kloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) zu finden.
Um ein rekombinantes Gen mit dem bevorzugten Verfahren zu klonieren, wird möglicherweise die Aminosäuresequenz des codierten Proteins benötigt, falls keine DNA-Sequenz zur Verfügung steht. Dazu kann das gewünschte Protein gereinigt und eine Aminosäure-Teilsequenz mittels automatischer Sequenziergeräte bestimmt werden. Dabei braucht nicht die gesamte Aminosäuresequenz bestimmt zu werden, sondern nur die lineare Sequenz eines oder mehrerer Bereiche von etwa 6 bis 8 für die PCR-Amplifikation eines DNA-Teilfragments bestimmten Aminosäuren.
Sobald geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert worden sind, werden die zu ihrer Codierung fähigen DNA-Sequenzen synthetisiert. Da der genetische Code degeneriert ist, läßt sich mehr als ein Codon zur Codierung einer bestimmten Aminosäure verwenden, so daß daher die Aminosäuresequenz durch ein beliebiges Oligonukleotid aus einem Satz ähnlicher DNA-Oligonukleotide codiert werden kann. Dabei ist lediglich ein Mitglied des Satzes identisch zu der DNA-Sequenz, doch kann an die DNA selbst in Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen hybridisieren. Die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide können noch ausreichend an die DNA hybridisieren, um die Identifizierung und Isolierung von das gewünschte Protein codierender DNA zu gestatten.
Alle Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen für Aminosäuren, wie sie hierin verwendet werden, entsprechen den Standardbezeichnungen im Fachgebiet und sind im folgenden aufgeführt:
Die mit den oben beschriebenen Verfahren erhaltene klonierte DNA kann durch molekulares Klonieren in einen Expressionsvektor mit geeignetem Promotor und weiteren entsprechenden Transkriptionsregulationselementen rekombinant exprimiert und in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen zur Produktion von rekombinantem Protein übertragen werden. Techniken für solche Manipulationen sind vollständig in Maniatis, T., et al., supra, beschrieben und sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Expressionsvektoren sind hierin als DNA-Sequenzen definiert, die für die Transkription klonierter Genkopien sowie die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt benötigt werden. Solche Vektoren lassen sich zur Expression eukaryontischer Gene in verschiedenen Wirten, wie z. B. Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Tierzellen, einsetzen.
Spezifisch konstruierte Vektoren gestatten das Hin- und Hertransportieren von DNA zwischen Wirten, z. B. Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen. Ein entsprechend konstruierter Expressionsvektor sollte daher enthalten: einen Replikationsursprung zur autonomen Replikation in Wirtszellen, selektionierbare Marker, eine beschränkte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl sowie aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, die die RNA-Polymerase so steuert, daß diese an DNA bindet und die RNA-Synthese initiiert. Bei einem starken Promotor handelt es sich um einen Promotor, durch den mRNAs mit hoher Frequenz initiiert werden. Zu den Expressionsvektoren sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, spezifisch konstruierte Plasmide oder Viren zu zählen.
Zur Expression rekombinanter Proteine in Säugetierzellen können verschiedene Säugerexpressionsvektoren eingesetzt werden. Zu den kommerziell erhältlichen Säugerexpressionsvektoren, die sich für die Expression rekombinanter Proteine eignen, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565).
Die das gewünschte Protein codierende DNA kann in einen Expressionsvektor zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle kloniert werden. Bei den rekombinanten Wirtszellen kann es sich um prokaryontische oder eukaryontische Zellen handeln, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Bakterien-, Hefe-, Säugetierzellen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Zellinien aus Mensch, Rind, Schwein, Affe und Nagern und Insektenzellen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, aus Drosophila stammende Zellinien. Zu den aus Säugerspezies stammenden Zellinien, die möglicherweise geeignet und kommerziell erhältlich sind, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
Der Expressionsvektor läßt sich mit einer beliebigen Anzahl von Techniken, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion und Elektroporation, in die Wirtszellen einführen. Die den Expressionsvektor enthaltenden Zellen werden durch Klonieren propagiert und einzeln analysiert, um zu bestimmen, ob sie das rekombinante Protein produzieren. Die Identifizierung von das rekombinante Protein exprimierenden Wirtszellklonen kann auf mehreren Wegen durchgeführt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, immunologischer Reaktivität mit Antikörpern sowie der Anwesenheit einer mit der Wirtszelle assoziierten rekombinanten Proteinaktivität.
Nach Expression des rekombinanten Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle kann das Protein zur Bereitstellung des Proteins in gereinigter Form gewonnen werden. Mehrere Reinigungsverfahren stehen zur Verfügung und sind zur Verwendung geeignet. Rekombinantes Protein kann aus Zelllysaten und -extrakten oder aus konditioniertem Kulturmedium durch unterschiedliche Kombinationen aus bzw. Einzelanwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hydroxylapatitabsorptionschromatographie und hydrophober Wechselwirkungschromatographie gereinigt werden.
Zusätzlich lassen sich rekombinante Proteine von anderen Zellproteinen unter Verwendung einer mit für das rekombinante Protein spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellten Immunoaffinitätssäule abtrennen. Antikörper werden gemäß im Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren hergestellt.
Monospezifische Antikörper werden aus Säuger-Antiseren, die gegen das rekombinante Protein reaktive Antikörper enthalten, gereinigt oder als gegen das rekombinante Protein reaktive monoklonale Antikörper unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975) hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper, wie er hierin verwendet wird, ist definiert als eine einzelne Antikörperspezies oder als mehrere Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für das rekombinante Protein. Homogene Bindung, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie z. B. solchen, die mit dem rekombinanten Protein assoziiert sind, wie oben beschrieben, zu binden. Spezifische Antikörper werden produziert, indem Tiere, wie z. B. Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferde u. ä., wobei Kaninchen bevorzugt sind, mit einer geeigneten Konzentration des rekombinanten Proteins entweder mit oder ohne ein Immunadjuvans immunisiert werden.
Die folgenden Verfahrensweisen sind bei der Herstellung rekombinanter DNA-Sequenzen, die die aus menschlichen B-Zellinien erhaltenen variablen Bereiche, leichten Ketten und schweren Ketten des Antikörpers in Kombination mit menschlichen konstanten Bereichen einschließen, bevorzugt. Diese rekombinanten DNAs lassen sich für die Transfektion von Säugetierzellen zur Expression eines rekombinanten menschlichen Antikörpers, in dem die Antigenspezifität des aus menschlichen B-Donorzellen stammenden Antikörpers erhalten ist, verwenden. Vorzugsweise werden die rekombinanten Immunoglobuline bei Verabreichung zu therapeutischen Zwecken als Eigenproteine erkannt. Gesamt-RNA wird aus den menschlichen Heterohybridomzellen, z. B. den beschriebenen menschlichen Heterohybridomzellen, unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. unter Beteiligung der Zellsolubilisierung mit Guanidiniumisothiocyanat, extrahiert (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294–5299 [1979]).
Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, daß Antikörper produzierende Zellen für die Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle, die das Antikörpermolekül teilweise oder ganz codieren, geeignet sind. Zu solchen Antikörper produzierenden Zellen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, die in ATCC Catalogue of Cell Lines And Hybridomas, 7. Auflage, 1992 beschriebenen. Schwere und leichte Immunoglobulinketten codierende DNAs sind offenbart und verfügbare Sequenzdaten für menschliche variable Antikörperdomänen zusammengestellt in Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Aufl., Bethesda, Maryland: National Institutes of Health, 1987, Aktualisierungen dieser Datenbank sowie anderen zugänglichen U.S.- und ausländischen Datenbanken (sowohl Nukleinsäure- als auch Proteinsequenzen).
Ein Expressionsplasmid, p9014 [Palladino et al., 1993, Biotechniques, 14, S. 754–755], das die von den unmittelbaren frühen Promotoren (Immediate Early Promotors) des menschlichen Cytomegalievirus gesteuerten Transkriptionseinheiten für die schwere und leichte Immunoglobulinkette enthält und in dem die Transkriptionseinheit für Glutaminsynthetase – als selektionierbarer Marker verwendet wird, wird mittels Standard-DNA-Klonierungsverfahren konstruiert ( 1). Eine Zellinie wurde erzeugt, indem ein mit Sal I linearisiertes p9014 mit Elektroporation in die Maus-Plasmacytoma-Zellinie NS/0 übertragen und eine Selektion auf stabile Integranten über das Wachstum in glutaminfreien Medien durchgeführt wurde [DeMartino et. al. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharamceuticals 1991 4: 829–835 und Singer et. al. Journal of Immunology 1993 150: 2844–2857]. Von den erzeugten Klonen wurde D12 für die weitere Untersuchung ausgewählt, wobei gezeigt werden konnte, daß dieser Klon rekombinanten Antikörper auf außergewöhnlich hohem Niveau (> 15 pg/Zelle/Tag) exprimiert. Die hohe spezifische Produktivität dieses Klons läßt darauf schließen, daß der p9014-Vektor an einer für die Expression bevorzugten Stelle in das Mausgenom integriert hatte. Als ein erster Schritt zur Charakterisierung der Integrationsstelle von p9014 in diesen Zellen wurde genomische DNA aus D12 isoliert, mit Xba I verdaut und mit dem Fragment des konstanten Kappa-Bereichs des menschlichen Immunoglobulins als Sonde hybridisiert. Unter stringenten Bedingungen hybridisiert dieses Fragment nur an das transfizierte Gen und identifiziert, da es sich in der Nähe der zur Linearisierung des Plasmids verwendeten Sal-I-Stelle befindet, das Restriktionsfragment, welches die Verbindungsstelle zwischen Plasmid und genomischer Maus-DNA enthält. Mit dieser Sonde wurde eine 3,3 kb große Bande in der genomischen D12-DNA identifiziert, die eine Kopie integriertes p9014 darstellt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß das in dem D12-Klon beobachtete hohe Expressionsniveau von einer einzigen p9014-Kopie herrührt, die unter Produktion eines 3,3 kb großen Xba-I-Verbindungsstellenfragments inseriert hatte.
Zur Charakterisierung dieser Insertionsstelle wurden genomische D12-Gesamt-DNA-Bibliotheken hergestellt, und rekombinante Bakteriophagenplaques wurden einem Screening mit der Sonde des konstanten Kappa-Bereichs von menschlichem Immunoglobulin sowie einer Plasmidsonde von der anderen Seite der zur Linearisierung des Originalplasmids vor der Transfektion verwendeten Sal-I-Stelle unterworfen. Rekombinante Bakteriophagenklone, die Fragmente der Verbindungsstellen zwischen p9014 und genomischer Maus-DNA von beiden Seiten der Insertionsstelle enthielten, wurden isoliert und in einem Plasmid subkloniert. Die Sequenzanalye der genomischen Maus-DNA an der Integrationsposition zeigte, daß der p9014-Vektor in den Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus integriert hatte. Durch die Insertion wurde eine 1,8 Kilobasen (kb) große Verdopplung des Immunoglobulin-gamma 2A-Gens erzeugt, die 48 Basenpaare (bp) stromaufwärts von Membran Exon 2 beginnt und bis stromabwärts vom Poly A-Additionssignal reicht. An der 3'-Verbindungsstelle zwischen Plasmid und genomischer Maus-DNA befanden sich 36 bp DNA, die weder von dem transfizierten Vektor noch dem Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus stammten. An dieser Verbindungsstelle waren 32 bp an Plasmidsequenz deletiert worden. Die Untersuchung der 5'-Verbindungsstelle zeigte, daß beim Insertionsvorgang 791 bp Vektorsequenz deletiert wurden und 16 bp nicht identifizierter DNA vorhanden waren (2).
Bei der ursprünglichen, für die Transfektion verwendeten Zellinie NS/0 handelt es sich um eine voll ausdifferenzierte B-Zelle, d. h. einen Zelltyp, der normalerweise äußerst hohe Niveaus an Immunoglobulin-RNA von dem Locus der Ig-schweren Kette exprimiert. Die Beobachtung, daß p9014 in diesen Locus inserierte, zeigt, daß sich der CMV-IEp-Promotor auf hohem Niveau in dieser chromosomalen Position exprimieren läßt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung der homologen Rekombination zur Insertion rekombinanter DNA-Expressionsvektoren in diesen Immunoglobulinlocus hohe Expressionsniveaus bei anderen rekombinanten Proteinen in dieser Zellinie fördern kann.
Zur Beurteilung dieses Ansatzes wurde ein Expressionskonstrukt erzeugt, daß das Keimbahngen des Immunoglobulin-gamma 2A aus Maus als Zielsequenz für die homologe Rekombination enthielt. Es wurde eine Bakteriophagenbibliothek von genomischer NS/0-DNA hergestellt, die einem Screening mit einer Sonde aus dem 3'-nichttranslatierten Bereich M2 des Maus-IgG2A-Gens unterzogen wurde, wobei gezeigt werden konnte, daß mehrere gereinigte Klone das gesamte IgG2A-Keimbahngen aus der Maus enthielten. Von einem dieser Bakteriophagen wurde ein 5,1 kb großes genomisches BamHI-Fragment subkloniert, das den gesamten codierenden Bereich des Ig-gamma 2A aus Maus enthielt, mit Ausnahme des äußersten 5'-Teils des CH1-Exons. Eine Sal I-Restriktionsstelle wurde an der 39 bp stromaufwärts von Membran Exon 2 liegenden, natürlich vorkommenden Stu I-Stelle inseriert, um so eine nur einmal vorkommende Stelle zur Linearisierung innerhalb der Immunoglobulin-gamma 2A-Sequenz aus Maus bereitzustellen. Dieses klonierte Fragment wurde zur Erzeugung eines komplexen Expressionsvektors verwendet, der: 1) von einem unmittelbaren frühen Promotor des menschlichen CMV transkribierte Gene für schwere und leichte Immunoglobulinketten; 2) eine als selektionierbarer Marker zu verwendenden Glutaminsynthetase; 3) Plasmidvektorsequenzen; und 4) das 5,1 kb große BamHI-Fragment des Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus enthielt (3A) [Yamawaki-Kataoka, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982 79: 2623–2627; Hall, B. et al. Molecular Immunology 1989 26: 819–826, Yamawaki-Kataoka, Y. t al. Nucleic Acid Research 1981 9: 1365–1381; Bebbington C. R. et. al. Biotechnology 1992 10: 169–175]. Dieser Vektor vom homologen Rekombinationstyp wurde zur Optimierung für Integrationsereignisse gestaltet, in denen der in dem Vektor enthaltene Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus mit dem endogenen Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus rekombinieren kann, wodurch der Expressionsvektor direkt und definiert inseriert wird (3B). Dabei wird erwartet, daß die Insertion dieses Vektors über homologe Rekombination an einer beliebigen Stelle innerhalb des Immunoglobulin-gamma 2A Locus zur Expression der den rekombinanten Antikörper codierenden DNA auf hohem Niveau führt.
NS/0-Zellen wurden mit dem mit Sal I linearisierten Immunoglobulin-Vektorkonstrukt mittels Elektroporation transfiziert und in 96-Well-Mikrotiterplatten ausplattiert. 147 Wells waren positiv für Zellwachstum unter GS-Selektionsmediumbedingungen. Stabile Zellinien, bei denen das Immunoglobulin-Konstrukt in den endogenen Immunoglobulin-gamma 2A Locus durch homologe Rekombination integriert ist, exprimieren hohe Niveaus an rekombinantem Antikörper. Zum schnellen Screening auf Klone, bei denen es sich um mögliche homologe Rekombinanten handelte, wurde ein ELISA als ein schneller erster Screeningvorgang auf Wells mit hohen Expressionsniveaus an rekombinantem Antikörper verwendet. Durch an den Überstellen aller 147 Wells durchgeführten ELISAs wurden 20 Wells mit hohen Expressionsniveaus an Antikörper identifiziert. Zellen aus diesen 20 Wells wurden vermehrt und nochmals auf Expression des Antikörpers getestet. Dabei exprimierten aus 12 der 20 Wells stammende Zellen weiterhin den Antikörper auf hohem Niveau. Diese 12 Zellinien bildeten den Pool an Klonen, die das pIgG2A/Immunoglobulin-Plasmid in ein Chromosom integriert hatten.
Zur Identifizierung stabiler Klone, in denen der transfizierte Vektor in den Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus integriert hatte, wurde ein genomischer Southern-Blot-Assay entwickelt. Es wurde ein Scanning eine großen Anzahl an Restriktionsenzymen durchgeführt, um ein geeignetes Enzym zum Nachweis homologer Rekombinanten zu identifizieren. HpaI ergibt eine 15 kb große Keimbahnbande, wenn genomische NS/0-DNA verdaut, geblottet und mit einer Sonde des Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus von der 3'-Seite des Locus hybridisiert wird. Im Gegensatz dazu ist ein 10 kb großes Hpa I-Fragment auf dem Blot vorhanden, falls der Immunoglobulin-Vektor durch homologe Rekombination in den IgG2A Locus inseriert hat (3C).
Eine Southern-Analyse der 12 Zellinien mit hoher Expression zeigte, daß 9 dieser Zellinien eine 10 kb große Bande aufwiesen, die mit der Insertion des Konstrukts in den IgG2A Locus der Maus durch homologe Rekombination übereinstimmte (Tabelle 1). Diese 9 Klone wurden über zusätzliche Southern-Blots unter Verwendung einer Hybridisierungssonde, die für den Immunoglobulin-Expressionsvektor einmalig ist, als homologe Rekombinanten bestätigt. Dieses Ergebnis deutet an, daß die homologe Rekombination in den Immunoglobulin-gamma 2A Locus der Maus mit einer extrem hohen Häufigkeit erfolgt. 75% der hoch exprimierenden Klone und 6%- der Gesamtanzahl an stabilen Zellinien waren homologe Rekombinanten.
Tabelle 1
Alle 12 hoch exprimierenden Klone wurden auf ihr rekombinantes Protein-Produktivitätsniveau hin untersucht. Die Zellkulturmedien wurden von den mit einer bekannten Dichte ausplattierten Zellen nach 24, 48 und 72 Stunden entfernt, wobei dann Poros-Assays durchgeführt wurden, um die Menge an produziertem rekombinantem Antikörper pro Zelle und Tag zu bestimmen. Diese Zellen produzieren äußerst hohe Niveaus an rekombinantem Antikörper im Bereich von 14 bis 43 pg/Zelle/Tag. Dieses Produktivitätsniveau entsprach der oder übertraf die Menge an von der ursprünglichen D12-Zellinie produziertem rekombinantem Antikörper.
Um zu bestimmen, ob der dreifache Unterschied bei der spezifischen Produktivität des rekombinanten Antikörpers in diesen Zellen an Unterschieden bei den RNA-Niveaus oder an einer klonalen Variation lag, wurden ausgewählte Zellinien ausplattiert und die spezifische Produktivität gemessen und RNA aus demselben ursprünglichen Zellpool isoliert. An der isolierten RNA wurde eine Northern-Analyse unter Verwendung von Genen des konstanten Bereichs der schweren und leichten Immunoglobulinkette als Hybridisierungssonden durchgeführt. Die Menge an pro Spur aufgetragener RNA wurde auf die Expression des beta-Actin der Maus normalisiert und die Stärke des Hybridisierungssignals quantifiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments deuten darauf hin, daß die Menge an RNA von Zellinie zu Zellinie relativ konstant ist. Dies läßt darauf schließen, daß die unterschiedliche Antikörperexpression in diesen Zellen an zellulären Faktoren liegt und nicht in erster Linie durch unterschiedliche RNA-Niveaus verursacht wird.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Konstruktion der Bibliothek
Eine Zellinie wurde durch Elektroporation eines mit Sal I linearisierten p9014-Plasmids [Palladino et al., 1993, Biotechniques, 14, S. 754–755] in die Plasmozytom-Zellinie NS/0 der Maus und Selektion auf stabile Integranten durch Wachstum in glutaminfreien Medien erzeugt [DeMartino et al. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 1991 4: 829-835 und Singer et. al. Journal of Immunology 1993 150: 2844–2857]. Es konnte gezeigt werden, daß unter den erzeugten Klonen die Zellinie D12 rekombinanten Antikörper auf außergewöhnlich hohem Niveau exprimiert (> 15 pg/Zelle/Tag). Die hohe spezifische Produktivität dieses Klons läßt darauf schließen, daß der p9014-Vektor an einer für die Expression bevorzugten Stelle in das Mausgenom inseriert hatte. Zur Klonierung der 5'-Verbindungsstelle zwischen genomischer DNA und Plasmid wurde eine genomische Bibliothek unter Verwendung des Lambda-Gem 11 Xho I Half-Site Arms Kloning System (Promega) gemäß der Vorschrift des Herstellers konstruiert. Genomische D12-DNA wurde mit Mbo I (Boehringer-Mannheim) teilverdaut. Positive Plaques wurden unter Verwendung zweier unterschiedlicher Sonden identifiziert: 1) dem Xmn I/Pst I-Fragment des Ampicillinresistenzgens (354 bp) und 2) einem 300 bp großen Fragment aus Exon 7 des Hamster-Glutaminsynthetasegens.
Zur Klonierung der 3'-Verbindungsstelle zwischen Plasmid und genomischer DNA wurde eine genomische Bibliothek unter Verwendung des Lambda/Zap II/Ligapack II Gold-Klonierungskits (Stratagene) konstruiert. Sowohl der Vektor als auch die genomische D12-DNA wurden vollständig mit Xba I (Boehringer-Mannheim) verdaut, die Produkte wurden ligiert (Ligation Kit, Stratagene) und gemäß den Vorschriften des Herstellers verpackt. Positive Plaques wurden mit dem Gen des menschlichen konstanten Kappa-Bereichs als Sonde identifiziert. Alle Sonden wurden durch Nick-Translation markiert. Phagen-DNA wurde mit LambdaSorb (Promega) gemäß der Vorschrift des Herstellers isoliert.
Phageninserts wurden in den Vektor pSP72 (Promega) subkloniert. Plasmid-DNA wurde aus Bakterien mit dem Standardverfahren der alkalischen Lyse isoliert. Die Insertionen wurden mit dem Didesoxykettenterminationsverfahren von Sanger sequenziert.
BEISPIEL 2
Isolierung des Keimbahngens IgG2A der Maus aus NS/0-Zellen
Eine aus der Plasmozytom-Zellinie NS/0 isolierte und mit MboI teilverdaute DNA wurde in den Lambda-Gem-11-Vektor von Promega inseriert, und 1,8 × 10⁶ unabhängige Plaques wurden einem Screening mit einer aus dem 3'-nichttranslatierten Bereich von IgG2A-M2 abgeleiteten Sonde (BgIII-BstX1) unterzogen. Vierzehn positive Bakteriophagen wurden Plaque-gereinigt und anschließend Lysate im Großmaßstab hergestellt. Die rekombinanten Bakteriophagen wurden mit Restriktionskartierung und Southern-Hybridisierung charakterisiert, wobei ein den gesamten Codierungsbereich des Ig-gamma 2A-Gens der Maus umfassender Klon identifiziert wurde. Ein 5,1 kb großes BamHI-Fragment, das den gesamten IgG2A codierenden Bereich (mit Ausnahme des äußersten 5'-Teils des CH1-Exons) sowie Membranexons und den 3'-nichttranslatierten Bereich enthielt, wurde ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle einer modifizierten Bluescript-Form (Stratagene), bei der die SalI-Stelle der multiplen Klonierungsstelle zerstört worden war, kloniert.
BEISPIEL 3
Konstruktion des IgG2A-Targeting-Plasmids
Das 5,1 kb des IgG2A-Gens der Maus enthaltende Plasmid wurde mit StuI teilverdaut, und das linearisierte Plasmid wurde über ein Gel gereinigt. Eine nur einmal vorkommende SalI-Stelle wurde in das IgG2A-Fragment über Linker-Ligation eingeführt, und ein Subklon, der die eingefügte SalI-Stelle 39 bp stromaufwärts des IgG2A-M2-Exons enthielt, wurde selektioniert. Das modifizierte 5,1 kb große IgG2R-Insert wurde durch Verdau mit BamHI ausgeschnitten, mittels T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht und die in ähnlicher Weise stumpfendig gemachte SalI-Stelle des Ig-Expressionsvektors kloniert. Das endgültige pIgG2A-Targeting-Plasmid wurde zur Elektroporation durch Verdau mit SalI linearisiert. Eine Karte des endgültigen Targeting-Plasmids ist in 3 gezeigt.
BEISPIEL 4
Elektroporationen
NS/0-Zellen wurden in mit 10% fötalem Kälberserum und 4 mM Glutamin supplementiertem Iscove's Modified Dulbecco's Medium (Sigma) kultiviert. 10 Millionen Zellen wurden mit 25 μg linearisiertem pIgG2A in einem Volumen von 800 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gemischt und unter Verwendung eines Bio-Rad Gene Pulser (1,5 kV; 3μF; Elektrodenabstand 0,4 cm) durch Elektroporation transfiziert. Transfizierte Zellen wurden in Iscove's-Medium mit 10% FCS und 1 mM Glutamin für GS-selektionierte Klone ausplattiert. Das Selektionsmedium (Glutamin-freies Iscove's GS-Selektionsmedium, 10% dialysiertes FCS, 1 × Nukleoside, 1 × Asparagin) wurde 24 Stunden später in die Wells gegeben. 147 Wells waren positiv hinsichtlich Zellwachstum und wurden mittels ELISA getestet.
BEISPIEL 5
ELISA
Das Screening von Klonen auf rekombinante Antikörperproduktion erfolgte mittels ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay). Die Kulturüberstände von Klonen wurden 1 : 10 und 1 : 100 in 1% BSA in PBS verdünnt. Die Proben wurden in mit monoklonalem Maus-Antikörper gegen menschliche Lambda-leichte Kette (Zymed) beschichtete 96-Well-Mikrotiterplatten (Immulon 2, Dynatech Laboratories, Inc.) gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Danach wurde an Meerrettichperoxidase konjugierter monoklonaler anti-Mensch-igG1 Maus-Antikörper (Zymed) zugegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde jeweils dreimal mit PBS nach jeder Inkubation gewaschen. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers wurde durch Zugabe des Substrats ABTS (2,2-Azino-di(3-Ethylbenzthiazolin)sulfonsäure) (Zymed) sichtbar gemacht. Man ließ die Farbe für zwanzig Minuten bei Raumtemperatur entwickeln. Die Absorption wurde bei 415 nm gemessen (BioRad Microplate Reader 3550) und die Antikörperkonzentration unter Verwendung der Datenanalysesoftware (BioRad) berechnet. Eine Eichkurve wurde mit doppelten Verdünnungsreihen des rekombinanten Antikörpers erzeugt.
BEISPIEL 6
Identifizierung homologer Rekombinanten durch Southern Blotting
Genomische DNA wurde aus Klonen entweder mit einem Proteinase K/SDS-Verfahren oder einem schnellen Guanidinhydrochloridverfahren isoliert (Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. in Molecular Kloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)).
Zur Identifizierung homologer Rekombinanten wurden 10 μg genomischer DNA aus Klonen mit hoher Expression ebenso wie aus nichtproduzierenden Kontrollklonen vollständig mit Hpa I verdaut, auf einem 0,8%igen Agarosegel laufen gelassen und mit dem Southern-Verfahren (Southern E. J. Mol. Biol. 1975 98: 503) auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden mit zwei verschiedenen Sonden hybridisiert, und zwar 1) einem ~3,5 kb großen Xba I-Fragment stromaufwärts vom IgG2a Locus der Maus und 2) einem SalI BamHI-Fragment (276 bp) aus dem pBR322 Plasmidrückgrat, hybridisiert. Die DNA-Sonden für die Hybridisierung wurden mittels Nick-Translation markiert (Rigby, P.J.J. Molec. Biol. 1977 113: 237–251). Es wurden zwanzig Wells mit hohen Antikörperexpressionsniveaus identifiziert. Nach dem Rescreening nach Vermehrung der Klonen produzierten 12 der 20 Wells weiterhin hohe Niveaus an Antikörper, wobei in allen dieser Klone der Expressionsvektor in die genomische DNA homolog rekombiniert worden war.
BEISPIEL 7
Spezifische Produktivität
Die spezifische Produktivität der Klone wurde durch Ausplattieren der Zellen mit einer Dichte von 3 × 10⁵ Zellen/Well in dreifacher Ausfertigung auf eine 6-Well-Gewebskulturplatte bestimmt. Das Medium wurde aus einem Well nach 24 Stunden, aus dem zweiten Well nach 48 Stunden und aus dem dritten Well nach 72 Stunden gesammelt. Zu jedem dieser Zeitpunkte wurden die Zellen gezählt. Das Medium wurde bezüglich der rekombinanten Antikörperkonzentration unter Verwendung einer POROS-Protein-A-Affinitätssäule analysiert. Die spezifische Produktivität, ausgedrückt in Picogramm/Zelle/Tag, wurde mit dem Programm Kaleidagraph berechnet. Die Antikörperproduktionsniveaus lagen zwischen ungefähr 14 und ungefähr 43 pg/Zelle/Tag.
BEISPIEL 8
RNA-Analyse
Für jede Zellinie wurden jeweils 10⁸ Zellen mit 1 × PBS gewaschen, in 4 M Guanidinisothiocyanat lysiert und mit einem Gewebehomogenisator aufgeschlossen. Das Lysat wurde auf ein 5,7 M CsCl-Kissen geschichtet und über Nacht in einem SW28-Rotor bei 20000 UpM und 20°C zentrifugiert. Die RNA wurde durch Auflösen des Pellets in dH₂O und anschließender Ethanolpräzipitation gewonnen. Die RNA-Konzentration wurde durch Ablesen der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.
Für jede Zellinie wurden jeweils 10 μg Gesamt-RNA auf einem Formaldehyd/Agarose-Gel in 1 × MOPS-Puffer drei Stunden bei 180 V laufen gelassen und dann, im wesentlichen wie beschrieben, auf Nitrocellulosepapier übertragen (Chirgwin et. al. Biochem. 18: 5294–5299 [1979]).
Die RNA-Blots wurden mit den folgenden ³²P-markierten Maus-DNA-Sonden hybridisiert: a.) einem 2 kb großen EcoR1-Xhol-Fragment, das den konstanten Bereich des menschlichen IgG1 enthält; b.) ein 600 bp EcoR1-Xba1-Fragment, das den konstanten C2-Bereich des menschlichen Iglambda enthält; c.) 1200 bp großes EcoR1-BamHI-Fragment aus dem beta-Actingen der Maus, das durch RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CUA CUA CUA CUA ATG GAT GAC GAT ATC GCT GC-3' (SEQ.ID.NO.: 1) und 5' CAU CAU CAU CAU ACG CAG CTC AGT AAC AGT CC-3' (SEQ.ID.NO.: 2) erzeugt wurde. Ein RNA-Blot wurde mit jedem der beiden Immunoglobulinsonden über Nacht bei 42°C in 10% Dextransulfat, 4 × SSC, 40% Formamid, 0,8% Denhardt's Tris-gepufferter Lösung hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter mit 2 × SSC, 0,1% SDS dreimal bei Raumtemperatur und mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS zweimal 20 Minuten bei 50°C vor der Autoradiographie gewaschen. Die Signalintensität wurde in einem Phosphorimager bestimmt. Nach Quantifizierung mit den beiden Immunoglobulinsonden wurde das Signal durch 15minütiges Waschen in dH₂O bei 70°C von den Filtern entfernt, die daraufhin mit der beta-Actinsonde rehybridisiert wurden, um so die Normalisierung der in jeder Spur jeweils aufgetragenen RNA-Menge zu gestatten. Jede der Zellinien produzierte ungefähr äquivalente Mengen an Antikörper-spezifischer RNA.
BEISPIEL 9
Transfektion der NS/0-Zellen
NS/0-Zellen wurden in dem folgenden Medium bei exponentiellem Wachstum kultiviert: Iscove's Minimum Essential Medium, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum und 4 mM Glutamin; sie wurden bei 37°C in einem luftbefeuchteten, auf 5% bis 6,5% CO₂ eingestellten Brutschrank gehalten.
Das Plasmid für die Transfektion wurde durch Verdau mit einem Restriktionsenzym an einer nur einmal vorkommenden Stelle linearisiert; dabei war eine außerhalb der Fremdgenexpressionssequenzen in den bakteriellen Sequenzen des Vektors gelegene, nur einmal vorkommende Stelle bevorzugt. Nach der Restriktion wurde die DNA durch Phenolextraktion, Phenol/Chloroform (1 : 1)-Extraktion sowie einer abschließenden Extraktion mit Chloroform deproteinisiert; danach wurde sie unter sterilen Bedingungen an einer biologischen Sicherheitswerkbank präzipitiert, wobei eine Endkonzentration von 0,2–0,4 M Natriumchlorid und 70% Ethanol verwendet wurde. Die DNA wurde in sterilem destilliertem Wasser mit einer berechneten Konzentration von 1 mg/1 ml resuspendiert. Die DNA wurde entweder sofort verwendet oder bis zur Verwendung eingefroren (–20°C).
Am Tag der Transfektion wurde die NS/0-Stammkultur einer Zellviabilitätszählung unterzogen. Pro Transfektionsküvette wurden insgesamt 1 × 10⁷ lebensfähige Zellen verwendet. Die Zellen wurden zunächst durch 5minütige Zentrifugation bei 3000 × g und Raumtemperatur gesammelt; die pelletierten Zellen wurden danach zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS) gewaschen und dann in PBS mit einer Konzentration von 10⁷ Zellen pro 800 ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde von diesem Zeitpunkt an auf Eis gehalten. 10⁷ Zellen wurden vorsichtig in eine 0,4-cm (Abstand zwischen Elektroden)-BioRad-Küvette an einer biologischen Sicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen übertragen. 40 mg der linearisierten Plasmid-DNA in Lösung wurden mit den Zellen vorsichtig gemischt und die Küvette 5 Minuten auf Eis stehen gelassen.
Vor der Elektroporation wurde die Außenseite der Küvette trockengewischt und die Küvette anschließend in den Küvettenhalter eines „BioRad Gene Pulser" gestellt. Das Gene-Pulser-Gerät wurde so eingestellt, daß 3 mF bei 1500 Volt pro Puls geliefert wurden. Es wurden zwei aufeinanderfolgende Pulse verwendet. Die Küvette wurde dann 2–5 Minuten auf Eis gestellt und die Zellen in 30 ml modifiziertes Wachstumsmedium mit 1 mM Glutamin anstelle von 4 mM Glutamin in einem 50 ml fassenden sterilen Einwegröhrchen überführt. 10 ml der 30 ml Zellsuspension wurden dann auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit ungefähr 100 μl pro Well verteilt; 10 ml (der restlichen 20 ml Zellsuspension) wurden mit 10 ml modifiziertem Wachstumsmedium verdünnt und auf zwei 96-Well-Mikrotiterplatten mit ungefähr 100 μl pro Well verteilt; die restlichen 10 ml Zellsuspension wurden mit 30 ml modifiziertem Wachstumsmedium verdünnt und auf vier 96-Well-Mikrotiterplatten mit ungefähr 100 μl pro Well verteilt. Diese Platten wurden dann über Nacht in einem luftbefeuchteten, auf 37°C und 5%–6,5% CO₂ eingestellten Brutschrank inkubiert.
Selektionsmedium
Das Selektionsmedium für die GS-Selektion war wie folgt zusammengesetzt:
Iscove's Minimum Essential Medium (Glutamin-frei; Sigma)
10% dialysiertes fötales Rinderserum (von Hyclone)
1 × Nukleoside
1 × Asparagin
Selektion:
24 Stunden nach Transfektion wurde jede 96-Well-Mikrotiterplatte jeweils mit 100 μl Selektionsmedium gefüttert und in einem luftbefeuchteten, auf 37°C und 5% bis 6,5% CO₂ eingestellten Brutschrank inkubiert, bis sich Kolonien zeigten, was ungefähr 3 bis 3,5 Wochen dauerte. Eine Fütterung war nicht erforderlich, außer wenn die Wells auszutrocknen beginnen; die Platten wurden im Zeitabstand von 3–4 Tagen beobachtet. Die Wells, in denen Kolonien wuchsen, färbten sich schließlich gelb, und zu diesem Zeitpunkt wurden diese Wells getestet, indem 50 bis 100 μl Kulturflüssigkeit entnommen und die Wells mit Selektionsmedium nachgefüttert wurden (um die Viabilität der Clone zu erhalten).

Claims

Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination zur Expression rekombinanter Gene in Säugetierzellen, wobei der Expressionsvektor einen Promotor für die Expression eines rekombinanten Gens, eine für einen selektionierbaren Marker codierende Transkriptionseinheit, und für den Immunoglobulin-Gamma 2A Locus der Maus spezifische DNA Sequenzen für die gezielte homologe Rekombination.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination nach Anspruch 1, worin der selektionierbare Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gpt, dhfr, Antibiotikaresistenz, oder einer Glutamine Synthetase Transkriptionseinheit.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination nach Anspruch 1 oder 2, worin das erwähnte rekombinante Gene ein Immunoglobulin Gen ist.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Expression rekombinanter Gene in Mauszellen.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination nach Anspruch 4 für die Expression rekombinanter Gene in NS/0 cells.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination zur Expression rekombinanter Immunoglobuline Gene in Säugetierzellen, wobei der erwähnte Expressionsvektor einen ersten Promoter zur Expression eines ersten rekombinanten Immunoglobulin Gens, einen zweiten Promoter für die Expresssion eines zweiten Immunoglobulin Gens, eine für einen selektionierbaren Marker codierende Transkriptionseinheit, und für den Immunoglobulin-Gamma 2A Locus der Maus spezifische DNA Sequenzen für die gezielte homologe Rekombination umfasst.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der erwähnte Promoter oder der erwähnte erste und zweite Promoter jeweils ein CMV-IE promoter ist.
Ein Expressionsvektor für die homologe Rekombination nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der selektionierbare Marker eine Glutamin-Synthetase-Transkriptionseinheit ist.
Wirtszelle, transfiziert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine voll ausdifferenzierte B-Zelle ist.
Ein in-vitro-Verfahren zur Expression rekombinanter Gene in einer Säugetier-Wirtszelle umfassend die Schritte: (a) Einbringen eines für den Immunoglobulin-Gamma 2A Locus der Maus spezifischen Vektors für die homologe Rekombination in die erwähnte Wirtszelle, welche Wirtszelle eine voll differenzierte B-Zelle ist, worin der erwähnte Vektor DNA kodierend für ein rekombinantes Gen umfasst und der erwähnte Vektor mit dem chromosomalen Gamma 2A Locus der Wirtszelle homolog rekombiniert; und (b) Kultivieren der erwähnten Wirtszelle unter für die Selektion und Expression des rekombinanten Gens geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die erwähnte Selektion der Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gpt, dhfr, Antibiotika Resistenz und Glutamine Synthetase Selektion.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der erwähnte Vektor mit dem chromosomalen Gamma 2A Locus der Wirtszelle an einer beliebigen Stelle innerhalb des erwähnten Gamma 2A Locus der Wirtszelle homolog rekombiniert.