DE69838062T2

DE69838062T2 - Menschliche monoklonale antikörper gegen den epidermalen wachstumsfaktorrezeptor

Info

Publication number: DE69838062T2
Application number: DE69838062T
Authority: DE
Inventors: Aya Menlo Park JAKOBOVITS; Xiao-Dong Palo Alto YANG; Michael San Jose GALLO; Xiao-Chi San Mateo JIA
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Current assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-05-05
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: KR100558110B1; JP2012158601A; JP2014185165A; JP2005225884A; JP2001523973A; JP5356287B2; WO1998050433A2; WO1998050433A3; JP2009051861A; NL300335I2; FR08C0006I1; EP1878746A2; ES2289779T3; DE69838062D1; DE122008000009I1; CA2288962C; CY2008003I2; EP1878746A3; ATE366747T1; JP2018076321A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden vollständig humane zusammenhängende Sequenzen der schweren und leichten Kette zur Verfügung gestellt, welche die komplementaritätsbestimmenden Bereiche monoklonaler Antikörper gegen den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF-r) umfassen. Nukleotidsequenzen, die für schwere und leichte Kette Immunglobulin-Moleküle kodieren und Aminosäuresequenzen, die schwere und leichte Kette Immunglobulin-Moleküle umfassen, insbesondere Sequenzen, die (CDRs) entsprechen, speziell von CDR1 bis CDR3, werden zur Verfügung gestellt. Hybridome, die derartige Immunglobulin-Moleküle und monoklonale Antikörper exprimieren, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
2. Hintergrund der Technik
Es wurde gezeigt, dass EGF-r auf vielen Arten humaner solider Tumoren überexprimiert wird. Mendelsohn Cancer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Zum Beispiel wurde eine Überexpression von EGF-r in bestimmten Karzinomen der Lunge, der Brust, des Kolons, des Gehirns, der Blase, des Kopfes und des Halses, des Ovars und der Prostata beobachtet. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Es wurde gezeigt, dass sowohl der epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF) als auch der transformierende Wachstumsfaktor alpha (TGF-α) an EGF-r bindet und zu einer zellulären Proliferation und zu einem Tumorwachstum führt.
Folglich haben einige Forschungsgruppen vorgeschlagen, dass Antikörper gegen EGF, TGF-α und EGF-r nützlich bei der Therapie von Tumoren sein könnten, die EGF-r exprimieren oder überexprimieren. Mendelsohn Cancer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994), Tosi et al. Int'l J. Cancer 62:643-650 (1995). Tatsächlich wurde gezeigt, dass anti-EGF-r-Antikörper, indem sie die Bindung von EGF und TGF-α an den Rezeptor blockieren, die Tumorzellproliferation zu inhibieren scheinen. Gleichzeitig jedoch schienen anti-EGF-r-Antikörper das EGF und TGF-α unabhängige Zellwachstum nicht zu inhibieren. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994).
Angesichts dieser Beobachtungen wurden eine ganze Anzahl monoklonaler Antikörper der Maus und der Ratte gegen EGF-r entwickelt und auf ihre Fähigkeit zur Inhibition des Wachstums von Tumorzellen in vitro und in vivo getestet. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Der Antikörper, der klinisch offensichtlich am weitesten fortentwickelt ist, ist ein chimärer Antikörper, der C225 genannt wird, der eine murine variable Region und eine humane IgG1 konstante Region aufweist. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Der murine Antikörper, der 225 genannt wird, auf dem der C225 Antikörper basiert, wurde von der Universität von Kalifornien und Rorer entwickelt. Siehe US-Patent Nr. 4,943,533 und europäisches Patent Nr. 359,282. Von dem C225 Antikörper wurde gezeigt, dass er das von EGF vermittelte Tumorzellwachstum in vitro inhibiert und die Bildung humaner Tumoren in vivo in Nacktmäusen inhibiert. Darüber hinaus schien der Antikörper in Mausmodellen für die Xenotransplantation synergistisch mit bestimmten chemotherapeutischen Mitteln bei der Eradikation humaner Tumoren in vivo zu wirken. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994).
ImClone hat humane klinische Studien unter Verwendung des anti-EGF-r Antikörpers, der C225 genannt wird, durchgeführt. Klinische Studien der Phase I und Phase I/II in Patienten mit Karzinomen des Kopfes und des Halses, der Prostata und der Lunge wurden offenbar mit C225 durchgeführt oder werden zur Zeit durchgeführt. In klinischen Studien der Phase I wurde keine Toxizität bei mehrfachen Injektionen und bei Dosen von bis zu vielleicht 400 mg/m² nachgewiesen, selbst in Fällen, in denen immungeschwächte Patienten beteiligt waren. Solche Studien wurden als Dosiseskalationssstudien durchgeführt, die 5 Dosen von etwa 5 bis etwa 200 mg/m² umfassten und wurden in Kombination mit Chemotherapie (d.h. Doxorubicin, Adriamycin, Taxol und Cisplatin) durchgeführt. Zusätzlich zu den offensichtlichen Sicherheitsdaten, die in diesen Studien erzeugt wurden, scheinen vorläufige Ergebnisse aus diesen Studien Hinweise auf ein Schrumpfen des Tumors in 80 % der Patienten mit Prostatakrebs zu geben.
Jeder dieser oben genannten Antikörper besitzt jedoch variable und/oder konstante Regionen der Maus oder der Ratte. Das Vorhandensein solcher von der Maus oder der Ratte abgeleiteten Proteine kann zu der raschen Clearance der Antikörper führen oder kann zu der Erzeugung einer Immunantwort gegen den Antikörper durch einen Patienten führen. Um die Verwendung der von der Maus oder der Ratte abgeleiteten Antikörper zu vermeiden, wurde postuliert, dass man eine humane Antikörperfunktion in ein Nagetier einführen könnte, so dass das Nagetier vollständig humane Antikörper produzieren würde.
Die Möglichkeit, Megabasen-große humane Loci in YACs zu klonieren und zu rekonstruieren und sie in die Keimbahnlinie der Maus einzuführen, stellt einen potenten Ansatz zur Aufklärung der funktionellen Komponenten sehr großer oder grob kartierter Loci ebenso wie zur Erzeugung nützlicher Modelle humaner Krankheiten zur Verfügung. Darüber hinaus könnte die Verwendung eines derartigen Verfahrens zur Substitution von Loci der Maus mit deren humanen Äquivalenten einzigartige Einsichten in die Expression und Regulation humaner Genprodukte während der Entwicklung, deren Kommunikation mit anderen Systemen und ihre Beteiligung an der Induktion und an dem Fortschreiten von Krankheiten zur Verfügung stellen.
Eine wichtige praktische Anwendung einer solchen Strategie ist die "Humanisierung" des humoralen Immunsystems der Maus. Das Einführen von humanen Immunglobulin (Ig) Loci in Mäuse, in denen die endogenen Ig-Gene inaktiviert wurden, bietet die Möglichkeit, die Mechanismen, die der programmierten Expression und dem Zusammenfügen von Antikörpern ebenso wie ihrer Rolle in der B-Zellentwicklung zugrunde liegen, zu untersuchen. Darüber hinaus könnte eine solche Strategie eine ideale Quelle zur Herstellung vollständig humaner monoklonaler Antikörper (Mabs) zur Verfügung stellen – ein wichtiger Meilenstein auf dem Weg zur Erfüllung des Versprechens einer Antikörpertherapie für humane Krankheiten. Von vollständig humanen Antikörpern wird erwartet, dass sie die immunogenen und allergischen Antworten, die Mabs der Maus oder von der Maus abgeleiteten Mabs innewohnen, zu minimieren und folglich die Effizienz und Sicherheit der verabreichen Antikörper zu erhöhen. Von der Verwendung vollständig humaner Antikörper kann erwartet werden, dass sie einen wesentlichen Vorteil bei der Behandlung chronischer und rezidivierender humaner Erkrankungen, wie z.B. der Entzündung, Autoimmunität und Krebs zur Verfügung stellen, welche die wiederholte Verabreichung von Antikörpern erfordern.
Ein Ansatz zum Erreichen dieses Ziels war die Modifikation von Mausstämmen, die eine Defizienz bei der Herstellung von Maus-Antikörpern aufwiesen, mit großen Fragmenten der humanen Ig Loci in der Erwartung, dass derartige Mäuse ein großes Repertoire an humanen Antikörpern in der Abwesenheit von Maus-Antikörpern produzieren würden. Große humane Ig-Fragmente würden die große Diversität der variablen Gene ebenso wie die richtige Regulierung der Antikörperherstellung und Antikörperexpression bewahren. Durch Ausnutzen der Mechanismen der Maus zur Antikörperdiversifizierung und Antikörperselektion und durch Ausnutzen des Fehlens einer immunologischen Toleranz gegenüber humanen Proteinen, sollte das reproduzierte humane Antikörper-Repertoire in diesen Mausstämmen hoch affine Antikörper gegen jegliches Antigen von Interesse hervorbringen, einschließlich humaner Antigene. Unter Verwendung der Hybridomtechnologie könnten Antigen-spezifische humane Mabs mit der gewünschten Spezifität einfach hergestellt und selektiert werden.
Diese allgemeine Strategie wurde im Zusammenhang mit unserer Erzeugung der ersten XenoMouse^TM-Stämme vorgestellt, die 1994 publiziert wurden. Siehe Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). Die XenoMouse^TM Stämme wurden mit Hilfe künstlicher Chromosomen der Hefe (yeast artificial chromosomes, YACs), die 245 kb und 190 kb große Fragmente zur Keimbahnkonfiguration des humanen Locus der schwere Ketten bzw. Kappa leichten Ketten, die Kernsequenzen der variablen und konstanten Region enthielten, modifiziert. YACs, die humanes Ig enthielten, zeigten sich sowohl beim Rearrangement als auch bei der Expression von Antikörpern kompatibel mit dem Maussystem und waren im Stande, die inaktivierten Ig-Gene der Maus zu substituieren. Dies wurde durch ihre Fähigkeit zur Induktion der B-Zellentwicklung, zur Erzeugung eines Erwachsenenähnlichen humanen Repertoires an vollständig humanen Antikörpern und zur Erzeugung Antigen-spezifischer humaner Mabs nachgewiesen. Diese Ergebnisse legten ferner nahe, dass die Einführung größerer Teile dieser humanen Ig Loci, die eine größere Anzahl von V-Genen, zusätzliche regulatorische Elemente und humane Ig konstante Regionen enthielten, im Wesentlichen das vollständige Repertoire rekapitulieren können, das für die humane humorale Antwort auf eine Infektion und Immunisierung kennzeichnend ist. Die Arbeit von Green et al. wurde kürzlich durch Einführung von Megabasen großen YAC-Fragmenten der humanen Loci der schweren Ketten bzw. der Kappa leichten Ketten zur Keimbahnkonfiguration auf die Einführung von mehr als etwa 80 % des humanen Antikörper-Repertoires erweitert. Siehe Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) und WO-A-98/24893 , die das Prioritätsdatum vom 03. Dezember 1996 beansprucht. In diesen Veröffentlichungen werden vollständig humane Antikörper, die spezifisch für EGF-r sind und als E.1.1, E.2.5, E.2.11 und E.2.4 bezeichnet werden, auf die in den vorliegenden Beispielen Bezug genommen wird, charakterisiert und im Detail besprochen. Siehe Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), europäisches Patent Nr. EP 0 463 151 B1 , Erteilung am 12. Juni 1996 veröffentlicht, internationale Patentanmeldung Nr. WO 94/02602 , veröffentlicht am 03. Februar 1994, internationale Patentanmeldung Nr. WO 96/34096 , veröffentlicht am 31. Oktober 1996 und PCT-Anmeldung Nr. WO-A-96/33795 , eingereicht am 29. April 1996.
In einem alternativen Ansatz haben andere, einschließlich GenPharm International, Inc., einen "Minilocus"-Ansatz verwendet. Bei dem Minilocus-Ansatz wird ein exogener Ig Locus über den Einschluss von Teilen (individuellen Genen) des Ig Locus imitiert. Folglich werden ein oder mehrere V_H-Gene, ein oder mehrere D_H-Gene, ein oder mehrere J_H-Gene, eine mu konstante Region und eine zweite konstante Region (vorzugsweise eine gamma konstante Region) zur Insertion in ein Tier in ein Konstrukt eingefügt. Dieser Ansatz wird in US-Patent Nr. 5,545,807 von Surani et al. und den US-Patent Nm. 5,545,806 und 5,625,825, beide von Lonberg und Kay, beschrieben. Siehe auch internationale Patentanmeldungen Nrn. WO 94/25585 , veröffentlicht am 10. November 1994, WO 93/12227 , veröffentlicht am 24. Juni 1993, WO 92/22645 , veröffentlicht am 23. Dezember 1992, WO 92/03918 , veröffentlicht am 19. März 1992. Siehe weiterhin Tayler et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) und Tuaillon et al., (1195).
Die Erfinder von Surani et al., die oben zitiert werden und in den Medical Research Counsel (den "MRC") berufen wurden, erzeugten unter Verwendung des Minilocus-Ansatzes eine transgene Maus, die einen Ig Locus besitzt. Die Erfinder der Arbeit von GenPharm International, die oben zitiert wird, Lonberg und Kay, schlugen die Inaktivierung des endogenen Ig Locus der Maus verbunden mit einer wesentlichen Wiederholung der Arbeit von Surani et al. vor, indem sie der Führung der Erfinder der vorliegenden Erfindung folgten.
Ein Vorteil des Minilocus-Ansatzes ist die Schnelligkeit, mit der Konstrukte erzeugt und in Tiere eingeführt werden können, die Teile des Ig Locus enthalten. Entsprechend ist jedoch ein signifikanter Nachteil des Minilocus-Ansatzes, dass theoretisch eine nicht ausreichende Diversität durch den Einschluss einer geringen Anzahl von V-, D- und J-Genen eingeführt wird. Tatsächlich scheint die veröffentlichte Arbeit diese Bedenken zu unterstützen. Die B-Zellentwicklung und Antikörperproduktion von Tieren, die durch Ver wendung des Minilocus-Ansatzes hergestellt wurden, scheint unterentwickelt. Daher zielte die Forschung im Bereich der vorliegenden Erfindung durchweg auf die Einführung größerer Teile des Ig Locus, um eine größere Diversität zu erreichen und in dem Bemühen, das Immunrepertoire der Tiere wieder herzustellen.
Humane Antworten gegen anti-Maus Antikörper (HAMA) führten dazu, dass die industrie chimäre oder anderweitig humanisierte Antikörper herstellte. Während der C225 Antikörper ein chimärer Antikörper ist, der eine humane konstante Region und eine murine variable Region aufweist, wird erwartet, dass bestimmte humane anti-chimäre Antikörper (HACH) Antworten beobachtet werden, insbesondere bei chronischen oder Multidosis-Anwendungen des Antikörpers.
Folglich wäre es wünschenswert, vollständig humane Antikörper gegen EGF-r zur Verfügung zu stellen, die ähnliche oder verstärkte Aktivitäten im Vergleich zu C225 besitzen, um die Bedenken und/oder Wirkungen der HAMA- oder HACH-Antwort zunichte zu machen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Aminosäuresequenz eines Immunglobulin-Moleküls der schweren Kette (eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls), das von dem Hybridom E1.1 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das variable Gen 4-31 der schweren Kette kodiert wird und der Sequenz der von E1.1 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichen gekennzeichnet, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichungen angegeben.
2 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 1 kodiert, die aus dem Hybridom E1.1 kloniert wurde.
3 ist eine Aminosäuresequenz eines Moleküls der Kappa leichten Kette, das von dem Hybridom E1.1 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E1.1 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buch staben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung dargestellt, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
4 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 3 kodiert, die aus dem Hybridom E1.1 kloniert wurde.
5 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E2.4 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben und die CDR1-, CDR2-und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
6 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 5 kodiert, die aus dem Hybridom E2.4 kloniert wurde.
7 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E2.4 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2-und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
8 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 7 kodiert, die aus dem Hybridom E2.4 kloniert wurde.
9 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.5 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Se quenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E2.5 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
10 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 9 kodiert, die aus dem Hybridom E2.5 kloniert wurde.
11 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.5 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E2.5 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
12 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 11 kodiert, die aus dem Hybridom E2.5 kloniert wurde.
13 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.2 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E6.2 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und CDR1-, CDR2-und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
14 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 13 kodiert, die aus dem Hybridom E6.2 kloniert wurde.
15 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.2 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E6.2 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
16 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 15 kodiert, die aus dem Hybridom E6.2 kloniert wurde.
17 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E6.4 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
18 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 17 kodiert, die aus dem Hybridom E6.2 kloniert wurde.
19 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E6.4 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2-und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
20 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 19 kodiert, die aus dem Hybridom E6.4 kloniert wurde.
21 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.11 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-61 kodiert wird und der Sequenz der von E2.11 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
22 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 21 kodiert, die aus dem Hybridom E2.11 kloniert wurde.
23 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.11 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E2.11 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
24 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 23 kodiert, die aus dem Hybridom E2.11 kloniert wurde.
25 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-61 kodiert wird und der Sequenz der von E6.3 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
26 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 25 kodiert, die aus dem Hybridom E6.3 kloniert wurde.
27 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E6.3 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
28 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 27 kodiert, die aus dem Hybridom E6.3 kloniert wurde.
29 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E7.6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-61 kodiert wird und der Sequenz der von E7.6.3 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
30 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 29 kodiert, die aus dem Hybridom E7.6.3 kloniert wurde.
31 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E7.6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E7.6.3 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
32 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 31 kodiert, die aus dem Hybridom E7.6.3 kloniert wurde.
33 stellt einen Vergleich der Aminosäuresequenz der schweren Kette des spezifischen anti-EGF-r Antikörpers mit den Aminosäuresequenzen des jeweiligen V_H-Gens zur Verfügung, das für die schwere Kette des jeweiligen Antikörpers kodiert.
34 stellt einen Vergleich der Aminosäuresequenz der leichten Kette des spezifischen anti-EGF-r Antikörpers mit den Aminosäuresequenzen des jeweiligen V_Κ-Gens zur Verfügung, das für die leichte Kette des jeweiligen Antikörpers kodiert.
35 zeigt die Blockierung der EGF-Bindung an humane Epidermoid-Karzinomzellen A431 durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro, wobei
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erzielt wurden,
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe des murinen monoklonalen Antikörper 225 erreicht wurden und
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines nicht spezifischen, humanen IgG2-Kontrollantikörpers erreicht wurden.
36 zeigt die Inhibition der EGF-Bindung an humane Epidermoid-Karzinomzellen A431 durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro, wobei
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe des murinen monoklonalen Antikörpers 225 erreicht wurden, (O) die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe des murinen monoklonalen Antikörpers 528 erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E1.1 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung E2.4 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnis se darstellt, die unter Verwendung des E2.5 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E2.6 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E2.11 Antikörpers Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden und
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung eines nicht spezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erreicht wurden.
37 zeigt die Inhibition der TGF-α Bindung an humane Epidermoid-Karzinomzellen A431 durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro, wobei
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe des murinen monoklonalen Antikörpers 225 erreicht wurden
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E6.2 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E6.3 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E7.2 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E7.10 Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E7.6.3 Antikörpers erreicht wurden und
die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung eines nicht spezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erreicht wurden.
38 zeigt die Inhibition der EGF-Bindung an humane Kolonkarzinom SW948-Zellen durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro, wobei
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe des murinen monoklonalen Antikörpers 225 erreicht wurden und
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines nicht spezifischen, humanen IgG2-Kontrollantikörpers erreicht wurden.
39 zeigt, dass von XenoMouse II Stämmen abgeleitete humane anti-EGF-r Antikörper das Wachstum von SW948-Zellen in vitro inhibieren, wobei
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erreicht wurden,
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe des murinen monoklonalen Antikörpers 225 erreicht wurden und
die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines nicht spezifischen, humanen IgG2-Kontrollantikörpers erreicht wurden.
40 zeigt die Inhibition des Wachstums humaner Epidermoid-Karzinom A431- Zellen in Nacktmäusen durch Verwendung von humanen anti-EGF-r Antikör per in Übereinstimmung mit der Erfindung in vivo. In der Figur stellt
die Ergebnisse dar, die mit einer Dosis von 1 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung erzielt wurden
stellt die Ergebnisse dar, die mit einer Dosis von 0,2 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit Hilfe eines nicht spezifischen, humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden und
stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung phosphatgepufferter Salzlösung als Kontrolle erzielt wurden.
41 zeigt Daten, die sich auf die Inhibition der Bildung des epidermoiden Karzinoms in Nacktmäusen durch Verwendung der humanen anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung in vivo beziehen und das Auftreten eines Tumors am Tag 19.
42 zeigt Daten, die sich auf die Inhibition der Bildung des epidermoiden Karzinoms in Nacktmäusen durch Verwendung von humanen anti-EGF-r Antikörpern in Übereinstimmung mit der Erfindung in vivo beziehen und zeigt das Auftreten eines Tumors am Tag 120.
43 zeigt Daten, die sich auf die Eradikation eines etablierten humanen epidermoiden Tumors in Nacktmäusen durch die Verwendung humaner anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung in vivo beziehen. In der Figur stellt
die Ergebnisse dar, die mit Mehrfachdosen von jeweils 1 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E7.6.3) erzielt wurden, (x) stellt die Ergebnisse dar, die mit zwei Dosen von jeweils 125 μg Doxorubicin erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit Mehrfachdosen von jeweils 1 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E7.6.3) in Kombination mit zwei Dosen von jeweils 125 μg Doxorubicin erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit Hilfe eines nicht spezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörers erzielt wurden, und
stellt die Erebnisse dar, die unter Verwendung phosphatgepufferter Salzlösung als Kontrolle erzielt wurden.
44 zeigt Daten, die sich auf die Eradikation eines etablierten humanen epidermoiden Tumors in Nacktmäusen durch Verwendung humaner anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung in vivo beziehen. In der Figur stellt
die Ergebnisse dar, die mit Mehrfachdosen von jeweils 0,5 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E2.5) erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit zwei Dosen von jeweils 125 μg Doxorubicin erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit Mehrfachdosen von jeweils 0,5 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E2.5) in Kombination mit zwei Dosen von jeweils 125 μg Doxorubicin erzielt wurden, (x) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung als Kontrolle erzielt wurden, und
stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung eines nicht spezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers mit einer Dosis von 1 mg erzielt wurden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen vollständig humanen monoklonalen Antikörper gegen den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGF-r) zur Verfügung, der

a) ein schwere Kette Immunglobulin-Molekül umfasst, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine cDNA kodiert wird, wie sie in 30 (SEQ ID NR: 17) dargestellt ist, und
b) ein Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül umfasst, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine cDNA kodiert wird, wie sie in 32 (SEQ ID NR: 18) dargestellt ist.

In einer Ausführungsform umfasst der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung

a) die Aminosäuresequenz, wie sie in 29 (SEQ ID NR: 37) dargestellt ist, und
b) die Aminosäuresequenz, wie sie in 31 (SEQ ID NR: 38) dargestellt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ein humaner IgG2 Antikörper.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Hybridomzelllinie zur Verfügung, die

a) eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine cDNA-Sequenz umfasst, wie sie in 30 (SEQ ID NR: 17) dargestellt ist, und
b) eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine cDNA-Sequenz umfasst, wie sie in 32 (SEQ ID NR: 18) dargestellt ist.

In einer Ausführungsform sezerniert die Hybridomzelllinie gemäß der vorliegenden Erfindung einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines soliden Tumors zur Verfügung.
Die weiteren Ausführungsformen, auf die sich die Beschreibung bezieht, sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung, sondern dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
Erstens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette umfasst, wobei ein Teil der Sequenz durch ein Gen der humanen V_H4-Familie kodiert wird sowie irgendeine der Mutationen darin, die in den Nukleotidsequenzen dargestellt sind, die in den 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26 und 30 gezeigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette eine Asparaginsäure-Aminosäuresubstitution bei Rest 10.
Zweitens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette um fasst, in der ein Teil der Sequenz durch ein humanes V_H 4-31 Gen kodiert wird sowie irgendeine der Mutationen dann, die von den in den 2, 6, 10, 14 und 18 gezeigten Nukleotidsequenzen darstellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 23 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region der leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 24 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 25 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region der leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 26 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 27 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, wie sie durch SEQ ID NR: 28 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 29 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 30 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 31 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 32 dargestellt wird.
Drittens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette umfasst, wobei ein Teil der Sequenz durch ein humanes V_H 4-61-Gen kodiert wird, sowie irgendeine der Mutationen darin, die durch die in den 22, 26 und 30 gezeigten Nukleotidsequenzen dargestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 33 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 34 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 35 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 36 dargestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der schweren Kette die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3, wie in SEQ ID NR: 37 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 38 dargestellt wird.
Viertens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine Aminosäuresequenz der variable Region der leichten Kette umfasst, wobei ein Teil der Sequenz durch ein Gen der V_k I-Familie kodiert wird, sowie irgendeine der Mutationen darin, die durch die in den 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 und 32 gezeigten Nukleotidsequenzen dargestellt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die in SEQ ID NR: 24 dargestellt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 26 dargestellt wird. in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 28 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 30 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 32 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 34 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 36 dargestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die variable Region der leichten Kette die Sequenz, die durch SEQ ID NR: 38 dargestellt wird.
Fünftens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 23 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 24 dargestellt wird.
Sechstens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 25 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine variable Region einer leichten Kette, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 26 dargestellt wird.
Siebtens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 27 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine leichte Kettevariable Region, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 28 dargestellt wird.
Achtens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 29 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine leichte Kettevariable Region, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 30 dargestellt wird.
Neuntens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 31 dargestellt. in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine leichte Kettevariable Region, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 32 dargestellt wird.
Zehntens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 33 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine leichte Kettevariable Region, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 34 dargestellt wird.
Elftens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 35 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine leichte Kettevariable Region, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 36 dargestellt wird.
Zwölftens wird ein Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, der eine variable Region einer schweren Kette umfasst, die eine zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 umfasst, wie in SEQ ID NR: 37 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Antikörper weiterhin eine leichte Kettevariable Region, welche die Sequenz umfasst, die durch SEQ ID NR: 38 dargestellt wird.
Dreizehntens wird ein Verfahren zur Behandlung eines soliden Tumors mit einem Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor beschrieben, die Verbesserung, die die Verabreichung eines der zuvor beschriebenen Antikörper an einen Patienten umfasst, der einen soliden Tumor hat.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es werden vollständig humane monoklonale Antikörper gegen den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGF-r) zur Verfügung gestellt. Nukleotidsequenzen, die für schwere und leichte Kette Immunglobulin-Moleküle kodieren und Aminosäuresequenzen, die schwere und leichte Kette Immunglobulin-Moleküle umfassen, insbesondere Sequenzen, die zusammenhängenden schwere und leichte Kette-Sequenzen von CDR1 bis CDR3 entsprechen, werden zur Verfügung gestellt. Hybridome, die derartige Immunglobulin-Moleküle und monoklonale Antikörper exprimieren, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
Definitionen
Soweit nicht anderweitig definiert, sollen die wissenschaftlichen und technischen Begriffe, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Bedeutungen haben, die im Allgemeinen von den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden. Darüber hinaus sollen, soweit es der Zusammenhang nicht anders erfordert, Begriffe im Singular den Plural umfassen und Begriffe im Plural sollen den Singular umfassen. Im Allgemeinen sind die im Zusammenhang mit der Zell- und Gewebskultur, der Molekularbiologie und der Proteinchemie und Oligo- oder Polynukleotidchemie und Hybridisierung verwendeten Nomenklaturen sowie die entsprechenden Ver fahren, die hierin beschriebenen werden, diejenigen die auf dem Gebiet wohlbekannt sind und gewöhnlich verwendet werden. Standardmethoden werden für die rekombinante DNA, Oligonukleotidsynthese und Gewebskultur sowie Transformation (z. B. Elektroporation, Lipofektion) verwendet. Enzymatische Reaktionen und Reinigungsmethoden werden gemäß den Angaben des Herstellers oder wie auf dem Gebiet gewöhnlicherweise ausgeführt durchgeführt oder wie hierin beschrieben. Die zuvor genannten Methoden und Verfahren werden üblicherweise in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren durchgeführt, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind und in verschiedenen allgemeinen und spezifischeren Referenzen beschrieben sind, die in der vorliegenden Beschreibung zitiert und diskutiert werden. Siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloninq; A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), das hiermit durch Referenz eingeschlossen wird. Die Nomenklaturen, die im Zusammenhang mit der analytischen Chemie, synthetischen organischen Chemie sowie medizinischen und pharmazeutischen Chemie verwendet werden und die entsprechenden Laborverfahren und Methoden, die hierin beschrieben werden, sind diejenigen, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind und gewöhnlicherweise verwendet werden. Standardmethoden werden für die chemische Synthese, die chemische Analyse, die pharmazeutische Präparation, die Formulierung und die Verabreichung sowie die Behandlung von Patienten verwendet.
Wie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung verwendet, sollen die folgenden Begriffe, soweit nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen haben: Der Begriff "isoliertes Polynukleotid", wie hierin verwendet, soll ein Polynukleotid mit genomischer, cDNA oder synthetischer Herkunft oder eine Kombination davon bezeichnen, wobei das "isolierte Polynukleotid" aufgrund seines Ursprungs (1) nicht mit dem Gesamt-Polynukleotid oder einem Teil eines Nukleotids assoziiert ist, in dem das "isolierte Polynukleotid" in der Natur vorkommt; (2) funktionell mit einem Polynukleotid verbunden ist, an das es in der Natur nicht gekoppelt ist; oder (3) in der Natur als Teil einer größeren Sequenz nicht vorkommt.
Der Begriff "isoliertes Protein", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Protein, das von einer cDNA oder einer rekombinanten RNA stammt oder synthetischer Herkunft ist oder eine Kombination daraus ist, wobei das "isolierte Protein" aufgrund seiner Herkunft, seiner Quelle, aus der es abgeleitet wurde (1) nicht mit Proteinen assoziiert ist, die in der Natur vorkommen; (2) frei von anderen Proteinen derselben Quelle ist, z. B. frei von murinen Proteinen; (3) von einer Zelle einer anderen Spezies exprimiert wird; oder (4) nicht in der Natur vorkommt.
Der Begriff "Polypeptid" wird hierin verwendet als ein generischer Begriff zur Bezeichnung eines nativen Proteins, von Fragmenten oder Analoga einer Polypeptidsequenz. Folglich sind ein natives Protein, Fragmente und analoge Arten dieser Polypeptidgattung. Bevorzugte Polypeptide in Übereinstimmung mit der Erfindung umfassen die humanen schwere Kette Immunglobulin-Moleküle, die in den 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25 und 29 dargestellt sind und die humanen Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküle, die in den 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27 und 31 dargestellt sind, ebenso wie Antikörpermoleküle, die durch Kombinationen gebildet werden, die die schwere Kette Immunglobulin-Moleküle zusammen mit leichte Kette Immunglobulin-Molekülen, wie z. B. die Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküle, umfassen und andersherum, ebenso wie Fragmente und Analoga davon.
Der Begriff "natürlich vorkommend", wie hierin verwendet, verweist bei der Verwendung für einen Gegenstand auf die Tatsache, dass ein Gegenstand in der Natur vorkommt. Zum Beispiel ist eine Polypeptidsequenz oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorhanden ist, die aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und die nicht absichtlich durch Menschenhand im Labor oder auf andere Weise modifiziert wurde, natürlich vorkommend.
Der Begriff "funktionell verbunden", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Positionen von so beschriebenen Komponenten, die in einer Beziehung zueinander stehen, die ihnen erlaubt, in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die "funktionell verbunden" mit einer kodierenden Sequenz ist, ist so ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen, die kompatibel mit der Kontrollsequenz sind, erreicht wird.
Der Begriff "Kontrollsequenz", wie hierin verwendet, bezeichnet Polynukleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression und Prozessierung von kodierenden Sequenzen, an die sie ligiert sind, zu bewirken. Die Art derartiger Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit von dem Wirtsorganismus; in Prokaryonten schließen derartige Kontrollsequenzen einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle und eine Transkrip tionsterminationssequenz ein; in Eukaryonten schließt eine derartige Kontrollsequenz im Allgemeinen Promotoren und eine Transkriptionsterminationssequenz ein. Der Begriff "Kontrollsequenzen" soll zumindest sämtliche Komponenten einschließen, deren Vorhandensein für die Expression und Prozessierung wesentlich sind, und kann außerdem zusätzliche Komponenten einschließen, deren Vorhandensein vorteilhaft ist, z. B. Leadersequenzen und Fusionspartnersequenzen.
Der Begriff "Polynukleotid", wie hierin verwendet, bezeichnet eine polymere Form von Nukleotiden mit einer Länge von wenigstens 10 Basen, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide oder eine modifizierte Form der beiden Arten von Nukleotiden. Der Begriff schließt einzelsträngige und doppelsträngige Formen der DNA ein.
Der Begriff "Oligonukleotid", wie hierin verwendet, umfasst natürlich vorkommende und modifizierte Nukleotide, die durch natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende Oligonukleotidverbindungen miteinander verbunden sind. Oligonukleotide stellen eine Untergruppe von Polynukleotiden dar, die im Allgemeinen eine Länge von 200 Basen oder weniger aufweisen. Bevorzugte Oligonukleotide sind 10 bis 60 Basen lang und am bevorzugtesten 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 bis 40 Basen lang. Oligonukleotide sind gewöhnlicherweise einzelsträngig, z. B. für Sonden; obwohl Oligonukleotide doppelsträngig sein können, z. B. zur Verwendung bei der Konstruktion einer Genmutante. Oligonukleotide gemäß der Erfindung können entweder Sense- oder Antisense-Oligonukleotide sein.
Der Begriff "natürlich vorkommende Nukleotide", wie hierin verwendet, umfasst Desoxyribonukleotide und Ribonukleotide. Der Begriff "modifizierte Nukleotide", wie hierin verwendet, umfasst Nukleotide mit modifizierten oder substituierten Zuckergruppen und dergleichen. Der Begriff "Oligonukleotidbindung", wie hierin verwendet, umfasst Oligonukleotidbindungen, wie z. B. Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphorselenoat, Phosphordiselenoat, Phosphoranilothioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat und dergleichen. Siehe z. B. LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analoques: A Practical Approach, Seiten 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., US-Patent Nr. 5,151,510 ; Uhlmann und Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), deren Offenbarungen hiermit durch Referenz eingeschlossen sind. Ein Nukleotid kann eine Markierung zum Nachweis enthalten, wenn dies gewünscht wird.
Der Begriff "selektiv hybridisieren', wie hierin verwendet, bedeutet nachweisbar und spezifisch bindend. Polynukleotide, Oligonukleotide und Fragmente davon in Übereinstimmung mit der Erfindung hybridisieren selektiv an Nukleinsäurestränge unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die die merklichen Mengen an nachweisbarer Bindung nichtspezifischer Nukleinsäuren minimieren. Hochstringente Bedingungen können verwendet werden, um selektive Hybridisierungsbedingungen zu erreichen, wie auf dem Gebiet bekannt ist und hierin beschrieben wird. Im Allgemeinen wird die Nukleinsäuresequenzhomologie zwischen den Polynukleotiden, Oligonukleotiden und Fragmenten gemäß der Erfindung und einer Nukleinsäuresequenz von Interesse wenigstens 80 % sein und typischerweise bevorzugt höhere Homologien von wenigstens 85 %, 90 %, 95 %, 99 % und 100 % aufweisen. Zwei Aminosäuresequenzen sind homolog, wenn es eine teilweise oder vollständige Identität zwischen ihren Sequenzen gibt. Zum Beispiel bedeutet 85 % Homologie, dass 85 % der Aminosäuren identisch sind, wenn die beiden Sequenzen zum Erzielen einer maximalen Übereinstimmung angeordnet (aligned) werden. Lücken (in einer der beiden Sequenzen, die in Übereinstimmung gebracht werden) sind erlaubt, um die Übereinstimmung zu maximieren; Lückenlängen von 5 oder weniger werden bevorzugt, wobei 2 oder weniger noch bevorzugter sind. Altemativ und bevorzugt sind zwei Proteinsequenzen (oder Polypeptidsequenzen, die von ihnen abgeleitet sind, mit wenigstens 30 Aminosäuren Länge) homolog, wie dieser Begriff hierin verwendet wird, wenn sie einen Alignmentwert von mehr als 5 erreichen (in Einheiten der Standardabweichung) unter Verwendung des Programms ALIGN mit der Mutation Data-Matrix und einer Gap Penalty von 6 oder mehr. Siehe Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, S. 101-110 (Band 5, National Biomedical Research Foundation (1972) und Anhang 2 zu diesem Band, S. 1-10. Die beiden Sequenzen oder Teile davon sind bevorzugter homolog, wenn ihre Aminosäuren mehr als oder gleich 50 % identisch sind, wenn sie unter Verwendung des ALIGN-Programms optimal aligned sind. Der Begriff "entspricht", wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine Polynukleotidsequenz homolog (d. h. identisch, nicht streng evolutionär verwandt) zu der gesamten Sequenz oder einem Teil der Sequenz eines Referenz-Polynukleotids ist oder dass eine Polynukleotidsequenz identisch zu einer Polypeptid-Referenzsequenz ist. Im Gegensatz dazu bedeutet der Begriff "komplementär zu", dass die komplementäre Sequenz homolog zu der gesamten Sequenz oder zu einem Teil einer Sequenz eines Referenz-Polynukleotids ist.
Zur Veranschaulichung entspricht die Nukleotidsequenz "TATAC" einer Referenzsequenz "TATAC" und ist komplementär zu einer Referenzsequenz "GTATA".
Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen zu beschreiben. "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität", "Prozent der Sequenzidentität" und "wesentliche Identität". Eine "Referenzsequenz" ist definiert als eine Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein, z. B. ein Segment einer vollständig langen cDNA oder Gensequenz, die in einem Sequenzprotokoll angegeben ist, oder kann eine vollständige cDNA-Sequenz oder Gensequenz umfassen. Im Allgemeinen ist eine Referenzsequenz wenigstens 18 Nukleotide oder 6 Aminosäuren lang, häufig wenigstens 24 Nukleotide oder 8 Aminosäuren lang und am häufigsten wenigstens 48 Nukleotide oder 16 Aminosäuren lang. Da zwei Polynukleotide oder Aminosäuresequenzen jeweils (1) eine Sequenz umfassen können (d. h. einen Teil der vollständigen Polynukleotid- oder Aminosäuresequenz), die zwischen den beiden Molekülen ähnlich ist und (2) weiterhin eine Sequenz umfassen können, die sich zwischen den beiden Polynukleotiden oder Aminosäuresequenzen unterscheidet, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Molekülen gewöhnlicherweise durch Vergleich der Sequenzen der beiden Moleküle in einem "Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Bereiche einer Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein "Vergleichsfenster", wie hierin verwendet, bezeichnet ein denkbares Segment von wenigstens 18 aufeinander folgenden Nukleotidpositionen oder 6 Aminosäuren, wobei eine Polynukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz mit einer Referenzsequenz von wenigstens 18 aufeinander folgenden Nukleotiden oder 6 Aminosäuren verglichen werden kann und wobei der Teil der Polynukleotidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen, Deletionen, Substitutionen und dergleichen (d. h. Lücken) von 20 % oder weniger im Vergleich zu der Referenzsequenz (welche die Additionen oder Deletionen nicht umfasst) für ein optimales Alignment der beiden Sequenzen umfassen kann. Ein optimales Alignment der Sequenzen zum Alignen eines Vergleichsfensters kann mit Hilfe des Local Homology Algorithmus von Smith und Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mit Hilfe des Homology Alignment Algorithmus von Needleman und Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mit Hilfe des Search for Similarity-Verfahrens von Pearson und Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), mit Hilfe computerisierter Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package-Version 7.0 (Gene tics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks oder MacVector Software Packages) oder mit Hilfe einer Untersuchung durchgeführt werden, und das beste Alignment (d. h., welches zu der höchsten prozentualen Homologie im Vergleichsfenster führt), das mit Hilfe der verschiedenen Verfahren erzeugt wird, wird ausgewählt.
Der Begriff "Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen in dem Vergleichsfenster identisch sind (d. h. auf einer Nukleotid-für-Nukleotid- oder Rest-für-Rest-Basis). Der Begriff "prozentuale Sequenzidentität" wird berechnet, indem zwei optimal alignte Sequenzen im Vergleichsfenster durch Bestimmung der Anzahl von Positionen, an denen die identische Nukleinsäurebase (z. B. A, T, C, G, U oder I) oder der identische Rest in beiden Sequenzen auftritt, verglichen werden, um die Anzahl der übereinstimmenden Positionen zu ergeben; die Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster (d. h. der Fenstergröße) geteilt wird; und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um die prozentuale Sequenzidentität zu bestimmen. Der Begriff "wesentliche Identität', wie hierin verwendet, bezeichnet eine Eigenschaft einer Polynukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz, wobei das Polynukleotid oder die Aminosäure eine Sequenz umfasst, die wenigstens 50 % Sequenzidentität, bevorzugter wenigstens 90 bis 95 % Sequenzidentitat, noch bevorzugter wenigstens 99 % Sequenzidentität im Vergleich zu einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von wenigstens 18 Nukleotidpositionen (6 Aminosäuren), häufig in einem Fenster von wenigstens 24-48 Nukleotidpositionen (8-16 Aminosäuren), aufweist, wobei die prozentuale Sequenzidentität berechnet wird durch Vergleichen der Referenzsequenz, die Deletionen oder Additionen von insgesamt 20 % oder weniger der Referenzsequenz in dem Vergleichsfenster umfassen kann. Die Referenzsequenz kann eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein.
Wie hierin verwendet, folgen die zwanzig konventionellen Aminosäuren und ihre Abkürzungen dem gewöhnlichen Gebrauch. Siehe Immunology – A Synthesis (2. Ausgabe, E.S. Golub und D.R. Gren, Hrsg., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), das hierin durch Referenz eingeschlossen ist. Stereoisomere (d. h. D-Aminosäuren) der zwanzig konventionellen Aminosäuren, nicht natürliche Aminosäuren wie z. B. a, α-disubstituierte Aminosäuren, N-Alkylaminosäuren, Milchsäure und weitere nicht konventionelle Aminosäuren können ebenfalls geeignete Komponenten für die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung sein. Beispiele für unkonventionelle Aminosäuren umfassen: 4-Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat, ε-N,N,N-Trimethyllysin, ε-N-Acetyllysin, O- Phosphoserin, N-Acetylserin, N-Formylmethionin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, σ-N-Methylarginin und andere ähnliche Aminosäuren und Iminosäuren (z. B. 4-Hydroxyprolin). In der Polypeptidnotation, wie hierin verwendet, ist die linke Richtung die aminoterminale Richtung und die rechte Richtung ist die carboxyterminale Richtung, in Übereinstimmung mit der Standardverwendung und der Konvention.
Sofern nicht anderweitig angegeben, ist in ähnlicher Weise das linke Ende einer einzelsträngigen Polynukleotidsequenz das 5'-Ende; die linke Richtung von doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen wird als die 5'-Richtung bezeichnet. Die Richtung von 5' nach 3' bei der Addition von im Entstehen begriffenen RNA-Transkripten wird als die Transkriptionsrichtung bezeichnet; Sequenzbereiche auf dem DNA-Strang, der dieselbe Sequenz wie die RNA hat und die 5' des 5'-Endes des RNA-Transkriptes liegen, werden als "Upstream-Sequenzen" (stromaufwärts gelegene Sequenzen) bezeichnet; Sequenzbereiche auf dem DNA-Strang, welche dieselben Sequenzen wie die RNA haben und die 3' des 3'-Endes des RNA-Transkriptes liegen, werden als "Downstream-Sequenzen" (stromabwärts gelegene Sequenzen) bezeichnet.
Auf Polypeptide angewandt bedeutet der Begriff "wesentliche Identität", dass zwei Peptidsequenzen, wenn sie optimal aligned sind, wie z. B. mit Hilfe des Programms GAP oder BESTFIT unter Verwendung der Standardwerte für gap weights (Lückengewichtung), wenigstens 80 % Sequenzidentität, bevorzugter wenigstens 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter wenigstens 95 % Sequenzidentität und am bevorzugtesten wenigstens 99 % Sequenzidentität teilen. Bevorzugter Weise unterscheiden sich Restepositionen, die nicht identisch sind, durch konservative Aminosäureaustausche. Konservative Aminosäureaustausche bezeichnen die Austauschbarkeit von Resten, die ähnliche Seitenketten aufweisen. Zum Beispiel besteht eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Seitenketten aufweisen, aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Hydroxylseitenketten aufweisen, ist Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren, die Amid enthaltende Seitenketten aufweisen, besteht aus Asparagin und Glutamin, eine Gruppe von Aminosäuren, die aromatische Seitenketten aufweisen, besteht auf Phenylanalin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäureresten, die basische Seitenketten aufweisen, besteht aus Lysin, Arginin und Histidin; und eine Gruppe von Aminosäuren, die Schwefel enthaltende Seitenketten aufweisen, besteht aus Cystein und Methionin. Bevorzugte Gruppen für konservative Aminosäurenaustausche sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin, Glutaminsäure-Asparaginsäure und Asparagin-Glutamin.
Der Begriff "Polypeptidfragment", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das eine aminoterminale und/oder carboxytemminale Deletion aufweist, in dem jedoch die verbleibende Aminosäuresequenz identisch mit den entsprechenden Positionen in der natürlich vorkommenden Sequenz ist, die z. B. von einer vollständig langen cDNA-Sequenz abgeleitet ist. Fragmente sind typischerweise wenigstens 5, 6, 8 oder 10 Aminosäuren lang, bevorzugter wenigstens 14 Aminosäuren lang, noch bevorzugter wenigstens 20 Aminosäuren lang, gewöhnlicherweise wenigstens 50 Aminosäuren lang und noch bevorzugter wenigstens 70 Aminosäuren lang. Der Begriff "analog", wie hierin verwendet, bezeichnet Polypeptide, die aus einem Segment von wenigstens 25 Aminosäuren bestehen, das eine wesentliche Identität mit einem Teil einer abgeleiteten Aminosäuresequenz aufweist und das wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist (1) spezifische Bindung an einen EGF-r unter geeigneten Bindungsbedingungen, (2) Fähigkeit zur Bindung von EGF an seinen Rezeptor, oder (3) Fähigkeit zur Inhibition des EGF-r exprimierenden Zellwachstums in vitro oder in vivo. Typischerweise umfassen Polypeptidanaloga eine konservative Aminosäuresubstitution (oder Addition oder Deletion) in Bezug auf die natürlich vorkommende Sequenz. Analoga sind typischerweise wenigstens 20 Aminosäuren lang, bevorzugter wenigstens 50 Aminosäuren lang oder länger und können häufig ebenso lang wie ein vollständig langes natürlich vorkommendes Polypeptid sein.
Peptidanaloga werden häufig in der pharmazeutischen Industrie als nicht-peptidische Arzneimittel verwendet, mit Eigenschaften, die zu denen des Template-Peptids analog sind. Diese Arten nicht-peptidischer Verbindungen werden als "Peptidmimetika" oder "Peptidomimetika" bezeichnet. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber und Freidinger TINS S. 392 (1985); und Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), die hiermit durch Referenz eingeschlossen sind. Solche Verbindungen werden häufig mit Hilfe der computergesteuerten Molekül-Modellbildung (molecular modeling) entwickelt. Peptidmimetika, die therapeutisch nützlichen Peptiden strukturell ähnlich sind, können verwendet werden, um einen äquivalenten therapeutischen oder prophylaktischen Effekt zu erzeugen. Im Allgemeinen sind Peptidomimetika einem Musterpolypeptid strukturell ähnlich (d.h. einem Polypeptid, das eine biochemische Eigenschaft oder eine pharmakologische Aktivität aufweist), wie z. B. einem humanen Antikörper, weisen jedoch ein oder mehrere Peptidbindungen auf, die optional durch eine Bindung ersetzt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, --CH=CH-(cis und trans), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂-- und -CH₂SO--; mit Hilfe von Verfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Die systematische Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren einer Konsensussequenz durch eine D-Aminosäure derselben Art (z. B. D-Lysin anstelle von L-Lysin) kann verwendet werden, um stabilere Peptide zu erzeugen. Darüber hinaus können konformativ eingeschränkte Peptide, die eine Konsensussequenz oder eine im Wesentlichen identische Konsensussequenzvariation umfassen, mit Hilfe von Verfahren erzeugt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind (Rizo und Gierasch Ann. Rec. Biochem. 61:387 (1992), hiermit durch Referenz eingeschlossen; z. B. durch Hinzufügen interner Cysteinreste, die in der Lage sind, intramolekulare Disulfidbrücken zu bilden, die das Peptid zyklisieren.
"Antikörper" oder "Antikörperpeptid(e)" bezeichnen einen intakten Antikörper oder ein bindendes Fragment davon, das mit dem intakten Antikörper um die spezifische Bindung kompetieren. Bindende Fragmente werden mit Hilfe rekombinanter DNA-Methoden hergestellt oder durch enzymatische oder chemische Spaltung intakter Antikörper. Bindende Fragmente schließen Fab, Fab', F(ab')₂, Fv und Einzelketten-Antikörper ein. Ein anderer Antikörper als ein "bispezifischer" oder "bifunktionaler" Antikörper wird als Antikörper verstanden, dessen Bindungsstellen jeweils identisch sind. Ein Antikörper inhibiert die Adhäsion eines Rezeptors an einen Gegenrezeptor wesentlich, wenn ein Überschuss an Antikörper die Menge des an den Gegenrezeptor gebundenen Rezeptors um wenigstens etwa 20 %, 40 %, 60 % oder 80 % und noch gewöhnlicher um mehr als 85 % reduziert (gemessen in einem in vitro kompetitiven Bindungsassay).
Der Begriff "Epitop" umfasst eine jegliche Proteindeterminante, die fähig ist, spezifisch an ein Immunglobulin oder einen T-Zell-Rezeptor zu binden. Epitopische Determinanten bestehen gewöhnlicherweise aus chemisch aktiven Gruppierungen von Oberflächenmolekülen, wie z. B. Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und weisen gewöhnlicherweise spezifische dreidimensionale strukturelle Eigenschaften auf, ebenso wie spezifische Ladungseigenschaften. Von einem Antikörper sagt man, dass er spezifisch an ein Antigen bindet, wenn die Dissoziationskonstante ≤ 1 μM, vorzugsweise ≤ 100 nM und am bevorzugtesten ≤ 10 nM ist.
Der Begriff "Agens" wird hierin verwendet, um eine chemische Verbindung, eine Mischung chemischer Verbindungen, ein biologisches Makromolekül oder einen aus biologischen Materialien hergestellten Extrakt zu bezeichnen.
Wie hierin verwendet, bezeichnen die Begriffe "Markierung" oder "markiert" die inkorporierung eines nachweisbaren Markers, z. B. durch Inkorporieren einer radioaktiv markierten Aminosäure oder durch Anfügen einer Polypeptid- oder Biotinyleinheit, die durch markiertes Avidin nachgewiesen werden kann (z. B. Streptavidin, das einen fluoreszenten Marker oder eine enzymatische Aktivität enthält, der/die mit Hilfe optischer oder colorimetrischer Verfahren nachgewiesen werden kann). In bestimmten Situationen können die Markierung oder der Marker auch therapeutisch sein. Verschiedene Verfahren zur Markierung von Polypeptiden und Glycoproteinen sind auf dem Gebiet bekannt und können verwendet werden. Beispiele für Markierungen für Polypeptide schließen die Folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Radioisotope oder Radionuklide (z. B. ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), fluoreszente Markierungen (z. B. FITC, Rhodamin, Lanthanidphosphor), enzymatische Markierungen (z. B. Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, Luciferase, alkalische Phosphatase), chemilumineszente, Biotinylgruppen, vorbestimmte Polypeptidepitope, die von einem sekundären Reporter erkannt werden (z. B. Leucin-Zipper-Paar-Sequenzen, Bindungsstellen für sekundäre Antikörper, Metallbindungsdomänen, Epitopmarkierungen). In einigen Ausführungsformen werden die Markierungen mit Hilfe von Spacer-Armen verschiedener Längen angefügt, um eine mögliche sterische Behinderung zu reduzieren.
Der Begriff "pharmazeutisches Mittel" oder "Arzneimittel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine chemische Verbindung oder Zusammensetzung, die im Stande ist, eine gewünschte therapeutische Wirkung zu induzieren, wenn sie einem Patienten in geeigneter Weise verabreicht wird. Weitere chemische Begriffe hierin werden in Übereinstimmung mit der konventionellen Verwendung auf dem Gebiet benutzt, wie von The Mc-Graw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Hrsg., McGraw-Rill, San Francisco (1985)), erläutert, das hierin durch Referenz eingeschlossen ist.
Der Begriff "antineoplastisches Mittel" wird hierin verwendet, um Agenzien zu bezeichnen, welche die funktionelle Eigenschaft aufweisen, eine Entwicklung oder ein Fortschreiten einer Neoplasie in einem Menschen zu inhibieren, insbesondere eine maligne (kanzeröse) Läsion, wie z. B. ein Karzinom, Sarkom, Lymphom oder eine Leukämie. Die Inhibition von Metastasen ist häufig eine Eigenschaft antineoplastischer Agenzien.
Wie hierin verwendet, bedeutet "im Wesentlichen rein", dass die Spezies eines Objektes die vorherrschende vorhandene Spezies ist (d. h. auf molarer Basis ist sie reichlicher vorhanden als irgendeine andere individuelle Spezies in der Zusammensetzung), und vorzugsweise ist eine im Wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung, in der die Spezies des Objektes wenigstens etwa 50 % (auf einer molaren Basis) sämtlicher vorhandener makromolekularer Spezies ausmacht. Im Allgemeinen wird eine im Wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 % sämtlicher makromolarer vorhandener Spezies in der Zusammensetzung ausmachen, bevorzugter mehr als etwa 85 %, 90 %, 95 % und 99 %. Am bevorzugtesten ist die Spezies des Objektes bis zu essenzieller Homogenität gereinigt (kontaminierende Spezies können in der Zusammensetzung mit Hilfe konventioneller Nachweisverfahren nicht nachgewiesen werden), wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht.
Der Begriff "Patient" schließt humane und tierärztliche Subjekte ein.
Antikörperstruktur
Es ist bekannt, dass die grundlegende strukturelle Einheit des Antikörpers ein Tetramer umfasst. Jedes Tetramer ist aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten zusammengesetzt, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kDa) und eine "schwere" Kette (etwa 50-70 kDa) umfasst. Der aminoterminale Teil jeder Kette umfasst eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die in erster Linie für die Antikörpererkennung verantwortlich sind. Der carboxyterminale Teil jeder Kette definiert eine konstante Region, die in erster Linie für die Effektorfunktion verantwortlich ist. Humane leichte Ketten werden in Kappa und Lambda leichte Ketten eingeteilt. Schwere Ketten werden als Mu, Delta, Alpha oder Epsilon klassifiziert und definieren den Isotyp des Antikörpers als IgM, IgD, IgA bzw. IgE. Innerhalb der leichten und schweren Ketten werden die variablen und konstanten Regionen durch eine "J"-Region mit etwa 12 oder mehr Aminosäuren verbunden, wobei die schwere Kette außerdem eine "D"-Region aus etwa 10 weiteren Aminosäuren enthält. Siehe im Allgemeinen Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., Hrsg., 2. Auflage Raven Press, N.Y. (1989)) (durch Referenz in seiner Ge samtheit zu allen Zwecken eingeschlossen). Die variablen Regionen eines jeden leichte/schwere Kettenpaars bilden die Antikörperbindungsstelle.
Folglich weist ein intakter Antikörper zwei Bindungsstellen auf. Außer bei bifunktionalen oder bispezifischen Antikörpern sind die beiden Bindungsstellen dieselben.
Die Ketten weisen alle die gleiche allgemeine Struktur mit relativ konservierten Gerüstregionen (framework regions FR), verbunden durch drei hypervariable Regionen, auch komplementaritätsbestimmende Regionen oder CDRs genannt. Die CDRs aus den beiden Ketten eines jeden Paares werden durch die Gerüstregionen ausgerichtet, was die Bindung an ein spezifisches Epitop ermöglicht. Von dem N-Terminus zum C-Terminus umfassen beide leichten und schweren Ketten die Domänen FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 und FR4. Die Zuordnung von Aminosäuren zu jeder Domäne erfolgt in Übereinstimmung mit den Definitionen von Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 und 1991)) oder Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Ein bispezifischer oder bifunktionaler Antikörper ist ein künstlicher Hybridantikörper, der zwei verschiedene schwere/leichte Kettenpaare und zwei verschiedene Bindungsstellen aufweist. Eispezifische Antikörper können mit Hilfe einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Fusion von Hybridomen oder der Verbindung von Fab'-Fragmenten. Siehe z. B. Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Die Herstellung bispezifischer Antikörper kann ein relativ arbeitsintensives Verfahren im Vergleich zu der Herstellung konventioneller Antikörper sein, und die Ausbeuten und der Reinheitsgrad sind im Allgemeinen geringer für bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper existieren nicht in der Form von Fragmenten, die eine einzige Bindungsstelle aufweisen (z. B. Fab, Fab' und Fv).
Herstellung von Antikörpern
Der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung wird vorzugsweise durch die Verwendung einer transgenen Maus hergestellt, die einen wesentlichen Teil des den humanen Antikörper produzierenden Genoms insertiert hat, die jedoch defizient in der Herstellung endogener, muriner Antikörper gemacht wurde. Solche Mäuse sind dann fähig, hu mane Immunglobulin-Moleküle und Antikörper zu produzieren, und sie weisen eine Defizienz bei der Produktion muriner Immunglobulin-Moleküle und Antikörper auf. Die zu ihrer Erzeugung verwendeten Technologien werden in den Patenten, Anmeldungen und in den im Abschnitt Hintergrund hierin offenbarten Referenzen offenbart. Insbesondere jedoch wird eine bevorzugte Ausführungsform der transgenen Herstellung von Mäusen und Antikörpern in der WO-A-98/24893 offenbart, die den Prioritätstag vom 3. Dezember 1996 beansprucht, siehe auch Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).
Durch Verwendung einer solchen Technologie haben wir vollständig humane monoklonale Antikörper für eine Vielzahl von Antigenen hergestellt. Im Wesentlichen immunisieren wir XenoMouse^TM Mäusestämme mit einem Antigen von Interesse, gewinnen die Lymphozyten (wie z. B. B-Zellen) aus den Mäusen, die Antikörper exprimieren, fusionieren die gewonnenen Zellen mit einer Zelllinie des myeloiden Typs, um unsterbliche Hybridom-Zelllinien herzustellen, und diese Hybridom-Zelllinien werden untersucht und selektiert, um Hybridom-Zelllinien zu identifizieren, die Antikörper produzieren, die für das Antigen von Interesse spezifisch sind. Wir verwendeten diese Methoden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Antikörpern, die spezifisch für EGF-r sind. Hierin beschreiben wir die Herstellung von acht Hybridom-Zelllinien, welche die für EGF-r spezifischen Antikörper produzieren. Darüber hinaus stellen wie eine Charakterisierung der durch derartige Zelllinien produzierten Antikörper zur Verfügung, einschließlich der Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzanalysen der schweren und leichten Ketten solcher Antikörper.
Die hierin beschriebenen Hybridom-Zelllinien werden als E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 und E7.6.3 bezeichnet. Nur E7.6.3 ist Teil der beanspruchten Erfindung. Jeder der von den oben genannten Zelllinien produzierten Antikörper besteht aus vollständig humanen IgG2 schweren Ketten mit humanen Kappa leichten Ketten. Im Allgemeinen besitzen die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung sehr hohe Affinitäten, gewöhnlicherweise besitzen sie Kd's von etwa 10^–9 bis etwa 10^–11 M, gemessen durch feste Phase und Lösungsphase.
Wie klar sein wird, können die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung in anderen Zelllinien als in Hybridom-Zelllinien exprimiert werden. Sequenzen, die für bestimmte Antikörper kodieren, können für die Transformation einer geeigneten Säugerwirtszelle verwendet werden. Die Transformation kann mit Hilfe eines jeden be kannten Verfahrens zur Einführung von Polynukleotiden in eine Wirtszelle durchgeführt werden, einschließlich z. B. der Verpackung des Polynukleotids in einem Virus (oder in einem viralen Vektor) und der Transduktion einer Wirtszelle mit dem Virus (oder Vektor) oder durch Transfektionsverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie in den US-Patentnummem 4,399,216 , 4,912,040 , 4,740,461 und 4,959,455 veranschaulicht. Das verwendete Transformationsverfahren ist abhängig von dem zu transformierenden Wirt. Verfahren zur Einführung heterologer Polynukleotide in Sängerzellen sind auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen die Dextran-vermittelte Transfektion, die Calciumphosphatpräzipitation, die Polybren-vermittelte Transfektion, die Protoplastenfusion, die Elektroporation, die Verkapselung des Polynukleotids/der Polynukleotide in Liposomen und die direkte Mikroinjektion der DNA in den Nukleus ein.
Säugerzelllinien, die als Wirte für die Expression zur Verfügung stehen, sind auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen viele immortalisierte Zelllinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, einschließlich der Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), der HeLa-Zellen, der Nierenzellen des Babyhamsters (BHK), der Nierenzellen des Affens (COS), der humanen hepatozellulären Karzinomzellen (z. B. Hep G2) und einer Anzahl weiterer Zelllinien, ohne auf diese beschränkt zu sein. Besonders bevorzugte Zelllinien werden ausgewählt, indem bestimmt wird, welche Zelllinien hohe Expressionslevel aufweisen und Antikörper mit konstitutiven EGF-r Bindungseigenschaften produzieren.
Die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind wirksame Inhibitoren für die Bindung von EGF und TGF-α an ihren Rezeptor, EGF-r. Diese Ergebnisse sind in den Beispielen 5 und 6 beschrieben und in den 35 – 38 gezeigt. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen und wie in 39 gezeigt und in Zusammenhang mit dem Beispiel 7 diskutiert, inhibiert der Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung außerdem das Wachstum bestimmter humaner Karzinomzelllinien in vitro und verhindert außerdem das Wachstum humaner Karzinome in vivo. Diese Ergebnisse sind in den 40 bis 42 gezeigt und in Zusammenhang mit dem Beispiel 8 diskutiert. In Beispiel 9 zeigen wir, dass ein Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, zumindest in Kombination mit einem antineoplastischen Agens, einen existierenden Tumor in einem Tier eradiziert. Darüber hinaus scheint die Antikörpertherapie, wie z. B. eine Monotherapie (d. h. nicht in Kombination mit einem antineoplastischen Agens) in Übereinstimmung mit den Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, z. B. durch die Verwendung des Antikörpers 225, während dies in dem Stand der Technik nicht möglich schien. Diese Ergebnisse werden in Zusammenhang mit dem Beispiel 9 diskutiert und sind in den 43 – 44 gezeigt.
Die Ergebnisse, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, weisen darauf hin, dass die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmte Qualitäten aufweisen, welche die vorliegenden Antikörper effizienter als die derzeitigen therapeutischen Antikörper EGF-r, z. B. 225, machen. Der 225 Antikörper in der klinischen Entwicklung von Imclone ist ein chimärer IgG1 Antikörper mit einer Affinität von 2 × 10^–10M, der nicht sehr wirksam in der Monotherapie erscheint, während er wirksam in Kombinationstherapie mit einem antineoplastischen Agens scheint. Dagegen weisen die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung, d. h. der E7.6.3 Antikörper gemäß der Erfindung, signifikant höhere Affinitäten auf (E2.5: 1,6 × 10^–11 M; E7.6.3: 5,7 × 10^–11 M) und scheinen in der Monotherapie zusätzlich zu der Kombinationstherapie mit einem antineoplastischen Agens und in geringeren Dosen als mit dem C225 Antikörper wirksam zu sein.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele, einschließlich der durchgeführten Experimente und der erzielten Ergebnisse, werden lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung zur Verfügung gestellt und sollten nicht als in irgendeiner Weise die vorliegende Erfindung limitierend betrachtet werden.
Beispiel 1
Erzeugen von Hybridomen, die den anti-EGF-r Antikörper produzieren
Die Antikörper gemäß der Erfindung wurden hergestellt, selektiert und in Übereinstimmung mit dem vorliegenden Beispiel untersucht.
Immunisierung und Hvbridomerzeugung: XenoMäuse (8 bis 10 Wochen alt) wurden intraperitoneal mit 2 × 10⁷ A431 (ATCC CRL-7907) Zellen immunisiert, die in phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) resuspendiert wurden. Diese Dosis wurde dreimal wiederholt. Vier Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse eine finale Injektion von Zellen in PBS. Lymphozyten der Milz und der Lymphknoten aus immuni sierten Mäusen wurden mit der nichtsekretorischen Myelomlinie NSO-bcI2 (Raqy und Diamond, 1994) fusioniert und einer HAT-Selektion wie zuvor beschrieben (Galfre und Milstein, 1981) unterzogen. Eine ganze Reihe von Hybridomen, die alle EGF-r-spezifische humane IgG₂Κ Antikörper (wie unten nachgewiesen) sezernieren, wurde gewonnen. Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden bestimmte aus der Reihe von Antikörpern ausgewählte Antikörper aufgrund ihrer Fähigkeit selektiert, mit dem 225 Antikörper zu kompetieren.
ELISA-Assav: Ein ELISA zur Bestimmung der Antigen-spezifischen Antikörper im Serum der Maus und in den Überständen der Hybridome wurde wie beschrieben (Coligan et al., 1994) unter Verwendung von affinitätsgereinigtem EGF-r aus A431-Zellen (Sigma, E-3641) durchgeführt, um die Antikörper abzufangen. Die Konzentrationen an humanen Immunglobulinen und Immunglobulinen der Maus wurden unter Verwendung der folgenden Bindungsantikörper bestimmt. Kaninchen anti-humanes IgG (Southern Biotechnology, 6145-01), Ziege anti-humanes IgK (Vector Laborstories, Al-3060), Maus antihumanes IgM (CGI/ATCC, HB-57) für humanes Gamma-, Kappa- bzw. Mu-Ig, und Ziege anti-Maus IgG (Caltag, M 30100), Ziege anti-Maus IgK (Southern Biotechnology, 1050-01), Ziege anti-Maus IgM (Southern Biotechnology, 1020-01) und Ziege anti-Maus λ (Southern Biotechnology, 1060-01) zur Bindung von Maus Gamma-, Kappa-, Mu- bzw. Lambda-lg. Die Nachweisantikörper, die in den ELISA-Experimenten verwendet wurden, waren Ziege anti-Maus IgG-HRP (Caltag, M-30107), Ziege anti-Maus IgK-HRP (Caltag, M 33007), Maus anti-humanes IgG2-HRP (Southern Biotechnology, 9070-05), Maus anti-humanes IgM-HRP (Southern Biotechnology, 9020-05) und Ziege anti-humanes Kappa-Biotin (Vector, BA-3060). Die zur Quantifizierung des humanen und Maus-Ig verwendeten Standards waren: humanes IgG₂κ (Calbiochem, 400122), humanes IgMK (Cappel 13000), Maus-IgGκ (Cappel 55939), Maus-IgMΚ (Sigma, M-3795) und Maus-IgG₃λ (Sigma, M-9019).
Bestimmung der Affinitätskonstanten der vollständig humanen Mabs mit Hilfe von BIAcore: Affinitätsmessungen der gereinigten humanen monoklonalen Antikörper, Fab-Fragmente oder Hybridomüberstände durch Plasmonresonanz wurde unter Verwendung des BIAcore 2000-Gerätes unter Verwendung allgemeiner Verfahren, wie sie von den Herstellern skizziert werden, ausgeführt.
Die kinetische Analyse der Antikörper wurde unter Verwendung von Antigenen durchgeführt, die auf der Sensoroberfläche in geringer Dichte immobilisiert wurden. Löslicher EGF-r, der aus A431-Zellmembranen gereinigt wurde (Sigma, E-3641), wurde im Allgemeinen mit einer Oberflächendichte von 228 RU verwendet. Die Dissoziationsraten (kd) und Assoziationsraten (ka) wurden unter Verwendung der von dem Hersteller zur Verfügung gestellten Software bestimmt (BIA Evaluation 2.1).
Bestimmung der Affinitätskonstanten in Lösung mit Hilfe des ELISA: Um die Bindungsaffinität des Antikörpers in Lösung mit Hilfe eines ELISA zu bestimmen, wurden verschiedene Konzentrationen der monoklonalen Antikörper gegen EGF-r mit EGF-r in einer gleichbleibenden Konzentration inkubiert, bis ein Äquilibrium erreicht wurde. Danach wurde die Konzentration des freien EGF-r in der Reaktionslösung mit Hilfe eines indirekten ELISA bestimmt. Entsprechend wurden die monoklonalen Antikörper in Konzentrationen zwischen 3,0 × 10^–11M bis 2,7 × 10^–7M mit EGF-r in einer Konzentration von 4 × 10^–10M in 200 μl PBS mit 0,5 % BSA 15 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 70 μl der jeweiligen Mischung in die Vertiefungen einer 96 Well-Mikrotiterplatte transferiert, die zuvor mit demselben monoklonalen Antikörper beschichtet wurde (100 μl/Vertiefung, mit einer Konzentration von 2 μg/ml in Beschichtungspuffer) und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit Waschpuffer wurde der auf der Platte verbleibende EGF-r mit Hilfe eines Maus anti-EGF-r-HRP nachgewiesen, der an das Kohlenhydrat des EGF-r-Proteins bindet. Die Konzentration an EGF-r wurde gegen seinen Standard berechnet und für die Berechnung der gebundenen und freien Antikörper in der ursprünglichen Antigen-Antikörper-Reaktionslösung verwendet. Die Bindungsaffinität des jeweiligen monoklonalen Antikörpers an EGF-r wurde unter Verwendung der Scatchard-Analyse berechnet.
Rezeptor-Bindungsassays: Das EGF-Rezeptor-Bindungsassay wurde mit A431-Zellen oder SW948-Zellen (0,4 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung) durchgeführt, die mit verschiedenen Konzentrationen an Antikörpern in PBS-Bindungspuffer 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert wurden. 0,1 nM [¹²⁵I]EGF (Amersham, IM-196) oder [¹²⁵I]TGF-α (Amersham) wurden zu jeder Vertiefung dazugegeben, und die Platten wurden 90 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden fünfmal gewaschen, luftgetrocknet und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Anti-EGF-r Maus Antikörper 225 und 528 (Calbiochem) wurden als Kontrollen verwendet.
BEISPIEL 2
Co-Selektion der anti-EGF-r Antikör^per mit dem m225 Antikörper
Wie oben beschrieben wurde gezeigt, dass der Antikörper 225 eine hohe Affinität für EGF-r besitzt und eine effektive Inhibition der Bindung von EGF und TGF-α an EGF-r bewirkt. Folglich erwarteten wir, dass, wenn wir humane Antikörper gegen EGF-r auswählten, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, mit dem Antikörper 225 in Kompetitionsassays Antikörper selektiert werden würden, die an dasselbe oder an ein ähnliches Epitop binden, an das der 225 Antikörper bindet.
Entsprechend haben wir BIAcore-Assays durchgeführt, in denen der aus A431-Zellmembranen (Sigma, E-3641) gereinigte lösliche EGF-r mit dem Antikörper 225 vorbehandelt wurde und anschließend mit den Antikörpern gemäß der Erfindung behandelt wurde. In Fällen, in denen die Antikörper gemäß der Erfindung nicht banden, wurden diese Antikörper gemäß der Erfindung wie oben beschrieben auf ihre Bindungsaffinität hin untersucht.

In der folgenden Tabelle werden die Affinitätsmessungen für bestimmte der auf diese Weise selektierten Antikörper zur Verfügung gestellt: Tabelle 1

	Feste Phase (durch BIAcore)				In Lösung (durch ELISA)
Hybridom	(M^–1S^–1)	Κ_off (S^–1)	Κ_D (M)	Oberflächendichte [RU]	KD (M)
E1.1	2,3 × 10⁶	1,7 × 10^–4	7,6 × 10^–11	228	1,1 × 10^–10
E2.4	2,8 × 10⁶	9,78 × 10^–5	3,5 × 10^–11	818	1,1 × 10^–10
E2.5	1,2 × 10⁶	1,9 × 10^–5	1,6 × 10^–11	228	3,6 × 10^–10
E2.11	1,9 × 106	3,0 × 10	1,6 × 10^–10	228	1,1 × 10^–10
E7.6.3	2,0 × 10⁶	1,1 × 10	5,7 × 10^–11	228	NB

Wie festzustellen ist, weisen die auf diese Weise selektierten Antikörper außergewöhnlich hohe Affinitäten und Bindungskonstanten auf.
BEISPIEL 3
Struktur der in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellten anti-EGF-r Antikörper
In der folgenden Diskussion werden strukturelle Informationen in Bezug auf die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellten Antikörper zur Verfügung gestellt.
Um die Strukturen der in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellten Antikörper zu analysieren, haben wir die Gene aus dem entsprechenden Hybridom kloniert, die für die schwere und leichte Kette Fragmente kodieren. Die Genklonierung und die Sequenzierung wurden wie folgt durchgeführt:
Poly(A)⁺ mRNA wurde aus etwa 2 × 10⁵ Hybridom-Zellen isoliert, die aus immunisierten XenoMäusen stammten, unter Verwendung eines Fast-Track-Kits (Invitrogen). Im Anschluss an die Erzeugung zufallsgeprimter cDNA folgte eine PCR. Primer, die spezifisch für die variable Region der humanen V_H oder humanen V_Κ-Familie sind (Marks et al., 1991) oder ein universeller humaner V_H-Primer, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) (SEQ ID NR: 1) wurden zusammen mit Primern verwendet, die spezifisch für die humane C2 konstante Region (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') (SEQ ID NR: 2) oder die Cκ konstante Region sind (hκP2; wie zuvor in Green et al., 1994, beschrieben). Die Sequenzen der Transkripte der von den humanen Mabs abgeleiteten schweren und leichten Kette aus den Hybridomen wurde durch direkte Sequenzierung der PCR-Produkte erhalten, die unter Verwendung der oben beschriebenen Primer von der Poly(A⁺) RNA erhalten wurden. Die PCR-Produkte wurden außerdem unter Verwendung eines TA-Klonierungskits (Invitrogen) in pCRII kloniert, und beide Strange wurden unter Verwendung des Prism Dye-Terminator-Sequenzierungskits und einer ABI 377 Sequenzierungsmaschine sequenziert. Sämtliche Sequenzen wurden durch Alignment mit dem "V BASE Sequence Directory" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) unter Verwendung der MacVector und Geneworks Softwareprogramme analysiert.
Hybridom E1.1
Der von dem Hybridom E1.1 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette aufweist. Die Antikörper wurden aufgrund der strukturellen Information in Bezug auf ihre Verwendung des schwere Kette und leichte Kette-Gens untersucht, ebenso wie aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen. Folglich wurde die Verwendung der V_H, D und J_H Gene der schweren Kette und der V_κ und J_κ Gene der leichten Kette analysiert, und die Unterschiede zwischen den kodierten Produkten und der entsprechenden Verwendung des Genes wurden ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E1.1 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-31
D-2
J_H-5
V_κ-018
J-4
Wie Wie in dem V BASE-Sequenzverzeichnis berichtet, wurde die von dem V_H 4-31 Gen kodierte Aminosäuresequenz wie folgt bestimmt:
(SEQ ID NR: 19)
Wie in dem V BASE-Sequenzverzeichnis berichtet, wurde die von dem VK (018) Gen kodierte Aminosäuresequenz wie folgt bestimmt:
(SEQ ID NR: 20).
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen in Bezug auf die schweren und leichten Ketten werden unten in Zusammenhang mit den 1 bis 4 bereitgestellt. 1 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E1.1 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das variable Gen 4-31 der schweren Kette kodiert wird und der Sequenz der von E1.1 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die fortlaufende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung und die Sequenzen CDR1, CDR2 und CDR3 sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
2 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 1 kodiert, die aus dem Hybridom E1.1 kloniert wurde.
3 ist eine Aminosäuresequenz eines Moleküls der Kappa leichten Kette, das von dem Hybridom E1.1 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E1.1 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung dargestellt, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
4 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 3 kodiert, die aus dem Hybridom E1.1 kloniert wurde.
Hybridom E2.4
Der von dem Hybridom E2.4 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette hat. Die Antikörper wurden aufgrund der strukturellen Information in Bezug auf die Genverwendung ihrer schweren und leichten Kette ebenso wie ihrer Aminosäuresequenzen analysiert. Folglich wurde die Verwendung der V_H, D und J_H Gene der schweren Kette und der V_Κ und J_Κ Gene der leichten Kette analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurde ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E2.4 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-31
D-A1/A4
J_H-3
V_Κ-018
J_Κ-4
Die Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten sind unten im Zusammenhang mit den 5 bis 8 bereitgestellt. 5 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E2.4 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
6 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette immunglobulin-Molekül der 5 kodiert, die aus dem Hybridom E2.4 kloniert wurde.
7 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E2.4 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
8 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 7 kodiert, die aus dem Hybridom E2.4 kloniert wurde.
Hybridom E2.5
Der von dem Hybridom E2.5 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette hat. Die Antikörper wurden aufgrund ihrer strukturellen Information in Bezug auf die Genverwendung ihrer schweren Kette und leichten Kette ebenso wie auf ihre Aminosäuresequenzen analysiert. Folglich wurde die Verwendung der V_H, D und J_H Gene der schweren Kette und der V_Κ und J_Κ Gene der leichten Kette analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurde ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E2.5 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-31
D-XP1/21-10
J_H-4
V_Κ-018
J_Κ-2
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten werden unten im Zusammenhang mit den 9 bis 12 bereitgestellt. 9 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.5 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E2.5 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
10 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 9 kodiert, die aus dem Hybridom E2.5 kloniert wurde.
11 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.5 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E2.5 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
12 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 11 kodiert, die aus dem Hybridom E2.5 kloniert wurde.
Hybridom E6.2
Der von dem Hybridom E6.2 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette aufweist. Die Antikörper wurden aufgrund ihrer strukturellen Information in Bezug auf die Genverwendung ihrer schweren Kette und leichten Kette analysiert, ebenso wie auf ihre Aminosäuresequenzen. Folglich wurde die Verwendung der Gene der schweren Kette V_H, D und J_H und die der Gene der leichten Kette V_Κ und J_Κ analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurde ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E6.2 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-31
D-? (CNTCCCTT)
J_H-6
V_Κ-018
J_Κ-1
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten werden unten im Zusammenhang mit den 13–16 zur Verfügung gestellt. 13 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.2 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E6.2 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
14 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 13 kodiert, die aus dem Hybridom E6.2 kloniert wurde.
15 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.2 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E6.2 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
16 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 15 kodiert, die aus dem Hybridom E6.2 kloniert wurde.
Hybridom E6.4
Der von dem Hybridom E6.4 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette aufweist. Die Antikörper wurden aufgrund der strukturellen Information in Bezug auf die Verwendung der Gene ihrer schweren Kette und leichten Kette ebenso wie auf ihre Aminosäuresequenzen analysiert. Folglich wurde die Verwendung der Gene der schweren Kette V_H, D und J_H und die der leichten Kette V_Κ und J_Κ und analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurde ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E6.4 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-31
D-A1/A4
JH-4
V_Κ-012
J_Κ-2
Wie in dem V BASE-Sequenzverzeichnis berichtet, wurde die von dem V_Κ012 Gen kodierte Aminosäuresequenz wie folgt bestimmt:
(SEQ ID NR: 21)
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten werden unten im Zusammenhang mit den 17 – 20 bereitgestellt. 17 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hvbridom E6.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-31 kodiert wird und der Sequenz der von E6.4 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
18 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 17 kodiert, die aus dem Hybridom E6.4 kloniert wurde.
19 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.4 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 012 kodiert wird und der Sequenz der von E6.4 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
20 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 19 kodiert, die aus dem Hybridom E6.4 kloniert wurde.
Hybridom E2.11
Der von dem Hybridom E2.11 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette hat. Die Antikörper wurden aufgrund der strukturellen Information in Bezug auf die Verwendung der Gene ihrer schweren Kette und leichten Kette analysiert, ebenso wie auf ihre Aminosäuresequenzen. Folglich wurde die Verwendung der V_H, D und J_H Gene der schweren Kette und der V_Κ und J_Κ Gene der leichten Kette analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurde ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E2.11 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-61
D-XP1/21-10
J_H - 4
V_Κ-018
J_Κ-4
Wie in dem V BASE-Sequenzverzeichnis berichtet, wurde die von dem V_H 4-61 Gen kodierte Aminosäuresequenz wie folgt bestimmt:
(SEQ ID NR: 22)
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten werden unten im Zusammenhang mit den 21 – 24 zur Verfügung gestellt. 21 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.11 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-61 kodiert wird und der Sequenz der von E2.11 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
22 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 21 kodiert, die aus dem Hybridom E2.11 kloniert wurde.
23 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E2.11 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E2.11 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
24 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 23 kodiert, die aus dem Hybridom E2.11 kloniert wurde.
Hybridom E6.3
Der von dem Hybridom E6.3 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette aufweist. Die Antikörper wurden aufgrund ihrer strukturellen Information in Bezug auf die Verwendung der Gene ihrer schweren Kette und leichten Kette analysiert, ebenso wie in Bezug auf ihre Aminosäuresequenzen. Folglich wurde die Verwendung der V_H, D und J_H Gene der schweren Kette und der V_Κ und J Gene der leichten Kette analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurden ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E6.3 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-61
D-1-2rc
J_H-4
V_Κ-018
J_Κ-4
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten werden unten im Zusammenhang mit den 25 – 28 bereitgestellt. 25 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-61 kodiert wird und der Sequenz der von E6.3 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
26 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette Immunglobulin-Molekül der 25 kodiert, die aus dem Hybridom E6.3 kloniert wurde.
27 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E6.3 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
28 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 27 kodiert, die aus dem Hybridom E6.3 kloniert wurde.
Hybridom E7.6.3
Der von dem Hybridom E7.6.3 sezernierte Antikörper umfasst einen humanen IgG2 Antikörper, der eine humane Kappa leichte Kette aufweist. Die Antikörper wurden aufgrund der strukturellen Information in Bezug auf die Verwendung der Gene ihrer schweren Kette und leichten Kette analysiert, ebenso wie in Bezug auf ihre Aminosäuresequenzen. Folglich wurde die Verwendung der V_H, D und J_H Gene der schweren Kette und der V_Κ und J_Κ Gene der leichten Kette analysiert, und die Unterschiede zwischen dem kodierten Produkt und der entsprechenden Genverwendung wurde ebenfalls analysiert. Dementsprechend zeigte der von dem Hybridom E7.6.3 sezernierte Antikörper die folgende Genverwendung:
V_H-4-61
D-XP4rc-XP1
J_H-3
V_Κ-018
J_Κ-4
Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzinformationen im Hinblick auf die schweren und leichten Ketten werden unten im Zusammenhang mit den 29 – 32 zur Verfügung gestellt. 29 ist eine Aminosäuresequenz eines schwere Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E7.6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das schwere Kette variable Gen 4-61 kodiert wird und der Sequenz der von E7.6.3 sezernierten schweren Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
30 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das schwere Kette immunglobulin-Molekül der 29 kodiert, die aus dem Hybridom E7.6.3 kloniert wurde.
31 ist eine Aminosäuresequenz eines Kappa leichte Kette Immunglobulin-Moleküls, das von dem Hybridom E7.6.3 sezerniert wird. Unterschiede zwischen der Sequenz, die durch das leichte Kette variable Gen 018 kodiert wird und der Sequenz der von E7.6.3 sezernierten leichten Kette sind in Fettdruck und vergrößerten Buchstaben dargestellt. Die zusammenhängende Sequenz von CDR1 bis CDR3 ist durch Unterstreichung angegeben, und die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen sind jeweils durch doppelte Unterstreichung angegeben.
32 ist eine Nukleotidsequenz der cDNA, die für das Kappa leichte Kette Immunglobulin-Molekül der 31 kodiert, die aus dem Hybridom E7.6.3 kloniert wurde.
BEISPIEL 4
Analyse der Aminosäuresubstitutionen der schweren und leichten Kette
33 stellt einen Vergleich spezifischer Aminosäuresequenzvergleiche der schweren Kette des anti-EGF-r Antikörpers mit der Aminosäuresequenz des jeweiligen V_H-Gens, das für die schwere Kette des jeweiligen Antikörpers kodiert, zur Verfügung. 34 stellt einen ähnlichen Vergleich spezifischer Aminosäuresequenzvergleiche der leichten Kette des anti-EGF-r Antikörpers mit der Aminosäuresequenz des jeweiligen V_Κ-Gens, das für die leichte Kette des jeweiligen Antikörpers kodiert, zur Verfügung. Wie zu beobachten ist, gibt es mehrere bemerkenswert konservierte Aminosäuresubstitutionen in den Sequenzen der schweren und leichten Kette. Insbesondere werden in den schweren Ketten der Antikörper sämtliche Moleküle der schweren Kette durch Gene der V_H 4-Familie kodiert und weisen ein Glycin an Position 10 in den von V_H 4-31 kodierten Antikörpern und ein Serin an Position 10 in den von V_H 4-61 kodierten Antikörpern auf, die jeweils durch eine Asparaginsäure ersetzt sind. Ebenfalls in den V_H 4-31 schweren Ketten enthalten alle bis auf ein Antikörper ein Serin an Position 7, das durch Asparagin ersetzt ist. Eine ähnliche, wenn auch nicht ganz so dominante Substitution wird an Position 35 beobachtet, an der in zwei der von V_H 4-31 kodierten Antikörpern und zwei der von V_H 4-61 kodierten Antikörpern ein Serin durch ein Asparagin ersetzt ist. Außerdem treten in zwei der von V_H 4-31 kodierten Antikörpern und zwei der von V_H 4-61 kodierten Antikörpern Substitutionen an Position 28 auf, in der jeweils ein Tyrosin durch ein Serin ersetzt wird (E2.4) oder durch ein Histidin (E6.4, E2.11 und E7.6.3). Fünf der Antikörper, von denen drei von V_H 4-31 kodierte Antikörper sind und zwei von V_H 4-61 kodierte Antikörper sind, besitzen einen Austausch von Valin zu Leucin (E2.4 und E2.11) oder zu Isoleucin (E2.5, E6.2 und E7.6.3) an Position 50.
Im Zusammenhang mit den Aminosäuresequenzen der Kappa leichten Kette werden sämtliche Sequenzen von Genen der V_Κ I-Familie kodiert, wobei sieben der Moleküle durch 018 Gene und ein Molekül (E6.4) durch ein 012 Gen kodiert wird. Es gibt einen hohen Grad an Homologie zwischen den 012- und 018-Genprodukten, was deutlich wird, wenn das E6.4 Molekül mit dem 018 Genprodukt verglichen wird, zusammen mit den anderen Molekülen, siehe 34. Das E6.4 Molekül besitzt nur zwei Substitutionen in Bezug auf das 012 Genprodukt, wie in 19 gezeigt wird, und nur 13 Substitutionen in Bezug auf das 018 Genprodukt. Sämtliche Antikörper besitzen eine Substitution an Position 74 in CDR3, an der ein Asparagin durch ein Serin ersetzt ist (E1.1, E2.5, E2.11 und E6.3), durch ein Histidin (E2.4, E6.2 und E7.6.3) oder durch ein Arginin (E6.4). Die restlichen Substitutionen sind weniger stark konserviert. Jedoch scheinen einige der Antikörper Substitutionen innerhalb der CDRs aufzuweisen. Es ist jedoch interessant festzustellen, dass E7.6.3, der ein Antikörper mit sehr hohen Affinitäten ist, keine Aminosäuresubstitutionen in der Aminosäuresequenz der leichten Kette bis kurz vor der CDR3 und innerhalb der CDR3 aufweist.
Es wird einem bewusst werden, dass jede der oben angegebenen Aminosäuresubstitutionen in enger Nachbarschaft zu einer CDR oder innerhalb einer CDR liegt. Es scheint so, dass solche Substitutionen eine Wirkung auf die Bindung des Antikörpers an das EFG-Rezeptormolekül mit sich bringen würde. Außerdem könnten solche Substitutionen einen signifikanten Effekt auf die Affinität der Antikörper haben.
Wie oben erwähnt, wurde gezeigt, dass anti-EGF-r Antikörper bestimmte Anti-Tumoraktivitäten besitzen. Die folgenden Experimente wurden ausgeführt, um zu bestimmen, ob die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung solche Anti-Tumoraktivitäten aufweisen.
BEISPIEL 5
Blockierung der EGF- und TGF-α-Bindung an humane Epidermoid-Karzinom A431-Zellen durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro
Ein in vitro-Assay wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung in der Lage waren, die EGF-Bindung an eine humane Karzinomzelllinie zu blockieren. Das Experiment wurde durchgeführt, um die Bindung der Antikörper gemäß der Erfindung mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 zu vergleichen, der wie oben erwähnt zuvor bereits eine Anti-Krebsaktivität gezeigt hatte.
In diesem Beispiel wurde die humane Epidermoid-Karzinom A431-Zelllinie verwendet. Die A431-Zelllinie ist bekannt für ihre hohen Expressionslevel von EGF-r (etwa 2 × 10⁶ EGF-r-Moleküle pro Zelle). Daher werden hohe Konzentrationen des anti-EGF-r Antikörpers benötigt, um sämtliche Bindungsstellen zu sättigen. Die Ergebnisse aus diesem Beispiel sind in 35 gezeigt. In der Figur wird die Blockierung der I¹²⁵-markierten EGF-Bindung an humane Epidermoid-Karzinom A431-Zellen durch einen humanen anti-EGF-r Antikörper in vitro gezeigt. In der Figur stellt
die Ergebnisse dar, die mit dem anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung (E7.6.3) erzielt wurden, (O) stellt die Ergebnisse dar, die mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 erzielt wurden, und (s) stellt die Ergebnisse dar, die mit Hilfe eines nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden.
36 zeigt die Inhibition der EGF-Bindung an humane Epidermoid-Karzinom A431-Zellen durch eine Reihe humaner anti-EGF-r Antikörper in vitro, im Vergleich zu den 225-, 528- und nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollen. In der Figur stellt
die Ergebnisse dar, die mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 erzielt wurden, (O) stellt die Ergebnisse dar, die mit dem murinen monoklonalen Antikörper 528 erzielt wurden, (t) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung des E1.1 Antikörpers erzielt wurden, (s) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung des E2.4 Antikörpers erzielt wurden, (4) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung des E2.5 Antikörpers erzielt wurden, (3) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung des E2.6 Antikörpers erzielt wurden, (u) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung des E2.11 Antikörpers erzielt wurden, und (_) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung eines nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung die EGF-Bindung an auf der Oberfläche exprimierten EGF-r auf A431-Zellen besser blockieren können als die 225 und 528 Antikörper. Die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung scheinen die Bindung bei einer Konzentration von 8 nM zu inhibieren zu beginnen, im Vergleich zu einer Konzentration von 10 nM für den 225 Antikörper.
Im Zusammenhang mit der Inhibition der TGF-α-Bindung wird eine ähnliche Effizienz durch Verwendung der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung beobachtet, wenn diese mit dem 225 Antikörper verglichen werden. 37 zeigt die Inhibition der TGF-α-Bindung an humane Epidermoid-Karzinom A431-Zellen durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro, wobei
die Ergebnisse darstellt, die mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 erzielt wurden, (u) die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E6.2 Antikörpers erzielt wurden, (I) die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E6.3 Antikörpers erzielt wurden, (s) die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E7.2 Antikörpers erzielt wurden, (n) die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E7.10 Antikörpers erzielt wurden, (t) die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung des E7.6.3 erzielt wurden und (') die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung eines nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung die TGF-α-Bindung an auf der Oberfläche exprimierten EGF-r auf A431-Zellen besser als der 225 Antikörper blockieren können. Die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung scheinen die Bindung bei einer Konzentration von 0,1 nM zu inhibieren zu beginnen, im Vergleich zu einer Konzentration von 1 nM für den 225 Antikörper.
BEISPIEL 6
Blockierung der EGF-Bindung an humane Kolon-Adenokarzinom SW948-Zellen durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro
Ein weiteres in vitro-Assay wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung imstande sind, die EGF-Bindung an noch eine andere humane Karzinomzelllinie zu blockieren. Das Experiment wurde durchgeführt, um die Bindung der Antikörper gemäß der Erfindung mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 zu vergleichen, der wie oben beschrieben zuvor eine Anti-Krebsaktivität gezeigt hatte.
In diesem Beispiel wurde die humane Kolon-Adenokarzinom SW948-Zelllinie verwendet. Im Gegensatz zu der A431-Zelllinie weist die SW948-Zelllinie eine relativ geringe Expression des EGF-r auf ihrer Oberfläche auf (etwa 40000 Moleküle pro Zelle). Daher werden weniger anti-EGF-r Antikörper benötigt, um sämtliche Bindungsstellen der Re zeptoren auf den Zellen zu sättigen. Die Ergebnisse aus diesem Beispiel werden in 38 gezeigt. In der Figur wird die Blockierung der I¹²⁵-markierten EGF-Bindung an humane Kolon-Adenokarzinom SW948-Zellen durch einen humanen anti-EGF-r Antikörper in vitro gezeigt. In der Figur stellt (m) die Ergebnisse dar, die mit einem anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung (E7.6.3) erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 erzielt wurden, und (s) stellt die Ergebnisse dar, die mit Hilfe eines nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung die EGF-Bindung an SW948-Zellen zumindest so gut wie der 225 Antikörper blockiert. Tatsächlich ist die Kurve im Hinblick auf den Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung leicht verbessert, da er eine Inhibition bei niedrigeren Konzentrationen als der 225 Antikörper zeigt.
BEISPIEL 7
Inhibition des Wachstums der humanen Kolon-Adenokarzinom SW948-Zellen durch humane anti-EGF-r Antikörper in vitro
Wir haben außerdem ein in vitro-Assay durchgeführt, um festzustellen, ob und in welchem Ausmaß die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung im Vergleich zu dem 225 Antikörper imstande waren, das Krebszellwachstum zu inhibieren. Das Experiment wurde durchgeführt, um die Inhibition durch die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung mit der Inhibition durch den murinen monoklonalen Antikörper 225 zu vergleichen, der wie oben erwähnt zuvor eine Anti-Krebsaktivität gezeigt hatte.
In diesem Beispiel wurde die humane Kolon-Adenokarzinom SW948-Zelllinie verwendet. In unseren Händen zeigte nur die SW948-Zelllinie ein EGF-abhängiges Zellwachstum. Dagegen zeigte die A431-Zelllinie in der Gegenwart von EGF in vitro eine Wachstumsinhibition. Die Ergebnisse werden in 39 dargestellt, in der gezeigt wird, dass humane anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung das Wachstum der SW948-Zellen in vitro inhibieren. In der Figur stellt (m) die Ergebnisse dar, die mit einem anti-EGF-r Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung (E7.6.3) erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit dem murinen monoklonalen Antikörper 225 erzielt wurden, und (s) stellt die Ergebnisse dar, die mit Hilfe eines nichtspezifischen humanen IgG2 Antikörpers erzielt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung das Wachstum der SW948-Zellen zumindest so gut wie der 225 Antikörper inhibiert. Tatsächlich ist die Kurve im Hinblick auf den Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung leicht verbessert, da er eine offensichtlich 100%ige Inhibition des Zellwachstums bei etwa 100 μg/ml zeigt, während der 225 Antikörper in demselben Dosisbereich ein Plateau bei einem Inhibitionslevel zwischen 80 und 90 % zu erreichen scheint.
BEISPIEL 8
Inhibition des Wachstums des humanen Epidermoid-Karzinoms in Nacktmäusen durch humane anti-EGF-r Antikörper in vivo
In dem vorliegenden Experiment wollten wir bestimmen, ob die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung im Stande waren, das Tumorzellwachstum in vivo zu inhibieren. In dem Experiment wurden Nacktmäuse in einem Alter von 8 Wochen subkutan mit der humanen Epidermoid-Karzinom A431-Zelllinie inokuliert. Den Mäusen wurden 5 × 10⁶ A431-Zellen injiziert. Eine von zwei Dosen eines Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung oder eine von zwei Kontrollen wurde intraperitoneal an dem gleichen Tag injiziert, an dem die A431-Zellen inokuliert wurden. Drei Verabreichungen eines jeden Antikörpers oder der Kontrolle folgten, und die Mäuse wurden aufgrund der subkutanen Tumorbildung und Tumorgröße untersucht. Die Dosierungen des verwendeten Antikörpers betrugen entweder 1,0 mg oder 0,2 mg. Die Kontrollen waren entweder phosphatgepufferte Salzlösung oder ein nichtspezifischer humaner IgG2 Antikörper.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 40 gezeigt. In der Figur ist die Inhibition des Wachstums der humanen Epidermoid-Karzinomzellen in Nacktmäusen durch die Verwendung von humanen anti-EGF-r Antikörpern in Übereinstimmung mit der Erfindung in vivo offensichtlich. In der Figur stellt (s) die Ergebnisse dar, die mit einer Dosierung von 1,0 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E7.6.3) (n=5) erzielt wurden, (t) stellt die Ergebnisse dar, die mit einer Dosierung von 0,2 mg des E7.6.3 Antikörpers (n=4) erzielt wurden,
stellt die Ergebnisse dar, die mit Hilfe eines nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers (n=6) erzielt wurden, und (m) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung als Kontrolle (n=6) erzielt wurden.
In Tieren, die mit dem E7.6.3 Antikörper behandelt wurden, wurde kein Tumorwachstum beobachtet, während in den Kontrolltieren innerhalb von 25 Tagen nach der Inokulation der Tumorzellen signifikante Tumore wuchsen.
In demselben Experiment wurden drei Antikörper gemäß der Erfindung verglichen. Die Ergebnisse sind in 41 gezeigt. Jeder der Antikörper zeigte eine Inhibition der Bildung des humanen Epidermoid-Karzinoms in den Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen, E7.6.3 mit 1 mg in fünf Mäusen und 0,2 mg in vier Mäusen, E2.5 mit 1 mg in drei Mäusen und 0,2 mg in drei Mäusen und E1.1 mit 1 mg in drei Mäusen. Sämtliche Kontrolltiere (einschließlich sechs mit PBS behandelten Tieren und sechs mit humanem IgG2 behandelten Tieren) entwickelten innerhalb von 19 Tagen nach der Inokulation signifikante Tumore, während keines der mit den humanen anti-EGF-r Antikörpern in Übereinstimmung mit der Erfindung behandelten Tiere innerhalb der 19 Tage nach der Inokulation Tumore entwickelte.
42 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Tiere aus dem oben erwähnten selben Experiment 130 Tage nach der Inokulation mit dem humanen Epidermoid-Karzinom. Die Ergebnisse aus diesem Experiment sind in 42 gezeigt. In der Figur ist zu erkennen, dass sämtliche Kontrollmäuse innerhalb von 20 Tagen nach der Inokulation der Tumorzellen Tumore entwickelt hatten. Dagegen entwickelte die erste mit einem Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung behandelte Maus an Tag 70 einen Tumor. Bis zum Tag 130 hatten nur 4 von 15 der Versuchstiere Tumore entwickelt. Interessanterweise entwickelte keines der Versuchstiere, die mit der 0,2 mg-Dosierung des E2.5 Antikörpers behandelt wurden, innerhalb der Testperiode Tumore.
Das obige Experiment in Zusammenhang mit diesem Beispiel 8 zeigt, dass die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung die Initiation des Tumorzellwachstums und die Initiation des Tumors fast vollständig zu verhindern scheinen, wenn sie gleichzeitig mit der Inokulation einer Tumorzelllinie verabreicht werden. Darüber hinaus ist zu beobachten, dass der inhibitorische Effekt auf das Tumorzellwachstum langfristig zu sein scheint.
BEISPIEL 9
Eradikation des Wachstums des humanen Epidermoid-Karzinoms in Nacktmäusen durch humane anti-EGF-r Antikör^per in vivo
Während die Verhinderung des Tumorzellwachstums und/oder der Etablierung eines Tumors, wie sie oben in Zusammenhang mit dem vorangehenden Beispiel beschrieben wird, aus therapeutischer Sicht ein positives Ergebnis darstellt, ist die Eradikation eines etablierten Tumors ebenfalls sehr wünschenswert. Dementsprechend untersuchten wir in den folgenden Experimenten, ob die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung imstande waren, einen etablierten Tumor in einem Säugetier zu beseitigen. Zuvor im Zusammenhang mit dem 225 Antikörper generierte Daten deuteten darauf hin, dass es zur effizienten Beseitigung eines etablierten Tumors unter Verwendung des 225 Antikörpers notwendig war, die Behandlung mit einem antineoplastischen Mittel zu ergänzen. Folglich untersuchten wir im Zusammenhang mit unseren Experimenten die Antikörperbehandlung sowohl allein als auch in Kombination mit der Behandlung mit einem antineoplastischen Mittel.
In dem Experiment wurden Nacktmäuse an Tag 0 subkutan mit 5 × 10⁶ A431 humanen Epidermoid-Karzinomzellen inokuliert. Nachdem der Tumor die Gelegenheit hatte, sich zu etablieren (Größe ≥ 0,4 cm³), wurden die Mäuse entweder mit Antikörpern, chemotherapeutischen Mitteln und/oder Kontrollen behandelt. Die Behandlungen wurden begonnen und an den Tagen 5, 8, 10, 14, 16 und 21 fortgesetzt, wobei die Chemotherapien nur an den Tagen 5 und 6 verabreicht wurden. Die Therapien bestanden aus einem Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung (E7.6.3), dem antineoplastischen Mittel Doxorubicin und einer Kombination aus dem Antikörper und Doxorubicin. Die Kontrollen waren phosphatgepufferte Salzlösung oder ein nichtspezifischer humaner IgG2 Antikörper. Jede Behandlungsgruppe bestand aus 5 Tieren. Die aus den Experimenten generierten Daten sind in 43 gezeigt, wobei (s) die Ergebnisse darstellt, die mit einer Dosierung von 1 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E7.6.3) (n=5) erzielt wurden, (5) die Ergebnisse darstellt, die mit einer Dosierung von 125 ug Doxorubicin erzielt wurden, (V) die Ergebnisse darstellt, die mit einer Dosierung von 1 mg des humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E7.6.3) in Kombination mit einer Dosierung von 125 μg Doxorubicin erzielt wurden, (n) die Ergebnisse darstellt, die mit Hilfe eines nichtspezifi schen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden, und (u) die Ergebnisse darstellt, die unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung als Kontrolle erzielt wurden.
Wie zu beobachten ist, führte die Verabreichung des E7.6.3 Antikörpers in Kombination mit Doxorubicin zu einer vollständigen Eradikation des Tumorwachstums. Darüber hinaus wurde das Tumorwachstum durch Verabreichung des E7.6.3- Antikörpers allein vollständig gestoppt.
In einem ähnlichen Experiment, dessen Ergebnisse in 44 gezeigt werden, wurden fünf Mäuse nach der Inokulation mit dem Tumor mit 0,5 mg des E2.5 Antikörpers an den Tagen 5, 8, 10, 14, 16 und 21 behandelt und fünf Mäuse wurden mit einer Kombination aus dem E2.5 Antikörper, der an den Tagen 5, 8, 10, 14, 16 und 21 verabreicht wurde und Doxorubicin, das an den Tagen 5 und 6 verabreicht wurde, behandelt. In der Figur stellt (u) die Ergebnisse dar, die mit einer Dosierung von 0,5 μg des humanen anti-EGF-r Antikörpers E2.5 erzielt wurden, (n) stellt die Ergebnisse dar, die mit einer Dosierung von 125 μg Doxorubicin erzielt wurden, (s) stellt die Ergebnisse dar, die mit einer Dosierung von 0,5 mg eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (E2.5) in Kombination mit einer Dosierung von 125 μg Doxorubicin erzielt wurden, (5) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung als Kontrolle erzielt wurden, und (V) stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung eines nichtspezifischen humanen IgG2-Kontrollantikörpers erzielt wurden.
Wie zu beobachten ist, führte die Verabreichung des E2.5 Antikörpers allein oder in Kombination mit Doxorubicin zu einer fast vollständigen Eradikation der Tumore in den Mäusen.
BEISPIEL 10
Humane klinische Versuche zur Behandlung und Diagnose humaner Karzinome durch die Verwendung humaner anti-EGF-r Antikörper in vivo
Einführung
Die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind bei der Behandlung bestimmter solider Tumore indiziert. Auf Grundlage einer Anzahl von Faktoren, ein schließlich unter anderem der EGF-r-Expressionslevel, scheinen die folgenden Tumorarten die bevorzugten Indikationen darzustellen: Brustkrebs, Ovarialkrebs, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs und nichtkleinzelliger Lungenkrebs. Im Zusammenhang mit jeder dieser Indikationen scheinen drei klinische Verabreichungswege ein eigenes Potenzial für einen klinischen Erfolg zu bieten.
Adjunktive Therapie:
Bei der adjunktiven Therapie würden die Patienten mit Antikörpern in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem chemotherapeutischen oder antineoplastischen Agens und/oder Bestrahlungstherapie behandelt werden. Die oben aufgeführten primären Zielerkrankungen werden nach Protokoll durch die Zugabe von Antikörpern gemäß der Erfindung zu Erst- und Zweitlinien-Standardtherapien behandelt werden. Der Protokollaufbau wird sowohl die Effektivität berücksichtigen, wie sie durch Reduktion der Tumormasse bestimmt wird, als auch die Fähigkeit zur Reduktion der gewöhnlichen Dosis der Standardchemotherapie. Diese Reduktionen der Dosierung werden eine zusätzliche und/oder verlängerte Therapie erlauben, indem die Dosisabhängige Toxizität des chemotherapeutischen Mittels reduziert wird. Die anti-EGF-r Antikörper aus dem Stand der Technik wurden oder werden in verschiedenen adjunktiven klinischen Versuchen in Kombination mit den chemotherapeutischen oder antineoplastischen Agenzien Adriamycin (C225: fortgeschrittenes Prostatakarzinom), Cisplatin (C225: fortgeschrittene Karzinome des Kopfes und des Halses und der Lunge), Taxol (C225: Brustkrebs) und Doxorubicin (C225: präklinisch) verwendet.
Monotherapie:
In Zusammenhang mit der Verwendung der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Monotherapie von Tumoren werden die Antikörper ohne ein chemotherapeutisches oder antineoplastisches Mittel an den Patienten verabreicht werden. Präklinische Ergebnisse, die durch Verwendung der Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden und hierin dargelegt werden, haben ähnliche Resultate sowohl mit der adjunktiven Therapie und/oder als Einzeltherapie gezeigt. Darüber hinaus wurde die Monotherapie offenbar klinisch bei Krebspatienten im Endstadium mit ausgedehnter metastatischer Erkrankung durchgeführt. Die Patienten schienen eine ge wisse Stabilisierung der Erkrankung zu zeigen. Id. Es werden Studien entwickelt werden, um eine Wirkung bei Patienten mit refraktärem (Krebs)-Tumor nachzuweisen.
Mittel zur Bildgebung:
Über die Bindung eines Radionuklids (z. B. Yttrium (⁹⁰Y)) an die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass die radioaktiv markierten Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung als ein diagnostisches Bildgebungsmittel verwendet werden können. In dieser Funktion werden die Antikörper gemäß der Erfindung sowohl an solide Tumore als auch an metastatische Läsionen von Zellen, die den EFG-Rezeptor exprimieren, binden. Im Zusammenhang mit der Verwendung der Antikörper gemäß der Erfindung als bildgebende Mittel können die Antikörper verwendet werden, um die chirurgische Behandlung solider Tumore zu unterstützen, sowohl bei der präoperativen Untersuchung als auch bei der postoperativen Untersuchung, um festzustellen, welcher Tumor bleibt und/oder wiederkehrt. Ein (¹¹¹In)-C225-Antikörper wurde als bildgebendes Mittel in einer Phase I humanen klinischen Studie in Patienten verwendet, die nicht resezierbare plattenepitheliale Lungenkarzinome haben. Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991). Die Patienten wurden mit Hilfe einer Standardanterior- und -posterior-Gammakamera untersucht. Die vorläufigen Daten zeigten, dass sämtliche primären Läsionen und großen metastatischen Läsionen identifiziert wurden, während nur die Hälfte kleine metastatische Läsionen (unter 1 cm) nachgewiesen wurde.
Dosis und Verabreichungsweg
Während die spezifische Dosierung für die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung noch nicht bestimmt wurde, können bestimmte Dosierungsfaktoren durch Vergleich mit dem ähnlichen Produkt (ImClone C225), das sich in der klinischen Studie befindet, bestimmt werden. Der C225 Antikörper wird typischerweise mit einer Dosis im Bereich von 5 bis 400 mg/m² verabreicht, wobei die niedrigeren Dosen nur im Zusammenhang mit den Dosisfindungsstudien (safety studies) verwendet wurden. Die Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung weisen eine um eine Zehnerpotenz höhere Affinität auf als der C225 Antikörper. Darüber hinaus sind die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung vollständig humane Antikörper, im Vergleich zu der chimären Art des C225 Antikörpers und folglich würde man erwarten, dass die Antikörper- Clearance langsamer ist. Dementsprechend würden wir erwarten, dass die Dosierung in Patienten mit den Antikörpern in Übereinstimmung mit der Erfindung geringer sein kann, vielleicht in dem Bereich von 50 bis 300 mg/m², und dennoch effizient bleibt. Die Dosierung in mg/m² ist im Gegensatz zu der herkömmlichen Messung der Dosis in mg/kg eine Messung, die auf Grundlage der Oberflächengröße basiert und stellt eine praktische Dosierungsmessung dar, die so gestaltet ist, dass sie Patienten sämtlicher Größen von dem Säugling bis zum Erwachsenen umfasst.
Drei verschiedene Ansätze der Verabreichung werden als nützlich zur Verabreichung der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung erachtet. Die konventionelle intravenöse Verabreichung wird vermutlich die Standardverabreichungsmethode für die Mehrzahl der Tumore sein. Jedoch kann sich die intraperitoneale Verabreichung im Zusammenhang mit Tumoren in der Peritonealhöhle, wie z. B. Tumoren der Ovarien, des Gallengangs, anderer Gänge und dergleichen, als günstig erweisen, um eine hohe Dosis des Antikörpers im Tumor zu erhalten und die Clearance des Antikörpers zu minimieren. In ähnlicher Weise besitzen bestimmte solide Tumore eine Vaskularisierung, die für die regionale Perfusion geeignet ist. Die regionale Perfusion wird es erlauben, eine hohe Dosis des Antikörpers an der Stelle eines Tumors zu erhalten und wird die kurzfristige Clearance des Antikörpers minimieren.
Klinischer Entwicklungsplan (Clinical Development Plan, CDP)
Übersicht: Der CDP wird die Behandlung mit anti-EGF-r Antikörpern in Übereinstimmung mit der Erfindung zusammen mit der adjunktiven Therapie, Monotherapie und als bildgebendes Mittel untersuchen und entwickeln. Studien werden zunächst verwendet werden, um die Sicherheit zu belegen und werden anschließend verwendet werden, um die Effizienz in wiederholten Dosen zu untersuchen. Die Studien werden nicht verblindet sein und die Standardchemotherapie mit der Standardtherapie plus den Antikörpern in Übereinstimmung mit der Erfindung vergleichen. Wie klar sein wird, könnte ein Kriterium, das im Zusammenhang mit dem Einschluss der Patienten verwendet wird, die EGF-r-Expressionslevel der Tumore der Patienten sein, wie durch eine Biopsie bestimmt wurden.
Wie bei jedem auf der Infusion eines Proteins oder Antikörpers basierenden Therapeutikum beziehen sich die Sicherheitsbedenken in erster Linie auf (i) das Zytokinfreiset zungssyndrom, d. h. Hypotension, Fieber, Zittern, Schüttelfrost, (ii) die Entwicklung einer Immunantwort gegen das Material (d. h. die Entwicklung humaner Antikörper gegen das humane Antikörpertherapeutikum durch den Patienten, oder eine HAHA-Antwort) und (iii) die Toxizität gegenüber normalen Zellen, die den EGF-Rezeptor exprimieren, z. B. Hepatocyten, die EGF-r exprimieren. Standardtests und Nachuntersuchungen werden verwendet werden, um diese Sicherheitsbedenken zu untersuchen. Insbesondere wird die Leberfunktion häufig während der klinischen Studie beobachtet werden, um Schäden an der Leber festzustellen, sofern welche auftreten.
Humane klinische Studie: Adjunktive Therapie mit dem humanen anti-EGF-r Antikörper und einem chemotherapeutischen Mittel
Eine humane klinische Phase I Studie wird begonnen werden, um die Sicherheit von sechs intravenösen Dosen eines humanen anti-EGF-r Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung im Zusammenhang mit der Behandlung eines soliden Tumors, z. B. eines Brustkrebses, zu untersuchen. In der Studie wird die Sicherheit einer Einzeldosis der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung untersucht werden, wenn diese als adjunktive Therapie zu einem antineoplastischen oder chemotherapeutischen Agens, wie z. B. Cisplatin, Topotecan, Doxorubicin, Adriamycin, Taxol oder dergleichen verwendet wird. Das Design der Studie wird die Verabreichung von sechs Einzeldosen eines Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung umfassen, wobei die Dosierung des Antikörpers von etwa 25 mg/m² bis etwa 275 mg/m² im Laufe der Behandlung in Übereinstimmung mit dem folgenden Schema ansteigen wird:

Tag 0 Tag 7 Tag 14 Tag 21 Tag 28 Tag 35

Mab-Dosis 25 mg/m² 75 mg/m² 125 mg/m² 175 mg/m² 225 mg/m² 275 mg/m²

Chemotherapie (Standarddosis) + + + + + +
Die Patienten werden eine Woche lang nach der Verabreichung des Antikörpers und der Chemotherapie engmaschig überwacht werden. Insbesondere werden die Patienten aufgrund der oben genannten Sicherheitsbedenken untersucht werden: (i) Zytokinfreisetzungssyndrom, d. h. Hypotension, Fieber, Zittern, Schüttelfrost, (ii) die Entwicklung einer Immunantwort gegen das Material (d. h. die Entwicklung humaner Antikörper gegen das humane Antikörpertherapeutikum durch den Patienten, oder eine HAHA- Antwort) und (iii) die Toxizität gegenüber normalen Zellen, die den EGF-Rezeptor exprimieren, z. B. Hepatocyten, die EGF-r exprimieren. Standardtests und Nachuntersuchungen werden verwendet werden, um alle diese Sicherheitsbedenken zu beobachten. Insbesondere wird die Leberfunktion während der klinischen Versuche häufig untersucht werden, um den Schaden an der Leber festzustellen, sofern einer auftritt.
Die Patienten werden außerdem im Hinblick auf das klinische Ergebnis untersucht werden und insbesondere im Hinblick auf die Reduktion der Tumormasse, wie mit Hilfe des MRT oder anderer Bildgebung sichtbar gemacht werden kann.
In der Annahme, dass die Sicherheit nachgewiesen werden kann und die Effizienz gezeigt wird, würden wahrscheinlich Phase 11 Studien initiiert werden, um die Effizienz weiter zu untersuchen und die optimale Dosierung zu bestimmen.
Humane klinische Studien: Monotherapie mit einem humanen anti-EGF-r Antikörper
Unter der Annahme, dass die Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang mit der oben erwähnten adjunktiven Studie sicher scheinen, würde eine humane klinische Studie durchgeführt, um die Effizienz und die optimale Dosierung für die Monotherapie zu bestimmen. Eine solche Studie könnte in Übereinstimmung mit der oben beschriebenen adjunktiven Studie durchgeführt werden und würde dieselben Sicherheitsanalysen und Ergebnisanalysen mit sich bringen, mit der Ausnahme, dass die Patienten keine Chemotherapie gleichzeitig mit der Verabreichung von Dosen der Antikörper in Übereinstimmung mit der Erfindung erhalten werden.
Humane klinische Studie: Diagnostische Bildgebung mit dem anti-EGF-r Antikör-per
Erneut unter der Annahme, dass die oben beschriebene adjunktive Therapie innerhalb der oben erwähnten Sicherheitskriterien sicher erscheint, kann eine humane klinische Studie durchgeführt werden, welche die Verwendung der Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung als diagnostisches Bildgebungsmittel betrifft. Es wird erwartet, dass das Protokoll auf im Wesentlichen ähnliche Weise wie das in Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991) beschriebene gestaltet werden würde.
EINSCHLUSS DURCH REFERENZ
Sämtliche hierin zitierten Referenzen, einschließlich Patenten, Patentanmeldungen, Veröffentlichungen, Lehrbüchern und dergleichen und der dann zitierten Referenzen, werden – soweit sie es noch nicht sind – hiermit durch Referenz in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Darüber hinaus werden die folgenden Referenzen ebenfalls hierin in ihrer Gesamtheit durch Referenz eingeschlossen, einschließlich der in diesen Referenzen zitierten Referenzen:

Abertsen et al., "Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library containing seven haploid human genome equivalents." Proc. Natl. Acad. Sci. 87:4256 (1990).
Anand et al., "Construction of yeast artificial chromosome libraries with large inserts using fractionation by pulsed-field gel electrophoresis." Nucl. Acids Res. 17:3425-3433 (1989).
Berman et al. "Content and organization of the human Ig VH locus: definition of three new V_H families and linkage to the Ig C_H locus." EMBO J. 7:727-738 (1988).
Brezinschek et al., "Analysis of the heavy chain repertoire of human peripheral B-cells using single-cell polymerase chainreaction." J. Immunol. 155:190-202 (1995).
Brownstein et al., "Isolation of single-copy human genes from a library of yeast artificial chromosome clones." Science 244:1348-1351 (1989).
Bruggeman et al. PNAS USA 86:6709-6713 (1989).
Bruggeman et al., " Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus." Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991).
Bruggeman, M. and Neuberger, M.S. in Methods: A companion to Methods in Enzymology 2:159-165 (Lemer et al. eds. Academic Press (1991)).
Bruggemann, M. and Neuberger, M.S. "Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice." Immunology Today 17:391-397 (1996).
Chef et al. "Immunoglobulin gene qreanangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the J_H locus" International Immunology 5:647-656 (1993)
Choi et al. "Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome" Nature Genetics 4:117-123 (1993)
Coligan et al., Unit 2.1, "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current protocols in immunology (1994).
Cook, G.P. and Tomlinson, I.M., "The human immunoglobulin V_H repertoire." Immunology Today 16:237-242 (1995).
Cox et al., "A directory of human germ-line Vx segments reveals a strong bias in their usage." Eur. J. Immunol. 24:827-836 (1994)
Dariavach et al., "The mouse IgH3'-enhancer." Eur. J. Immunol. 21:1499-1504 (1991)
Den Dunnen et al., "Reconstruction of the 2.4 Mb human DMD-gene by homologous YAC recombination." Human Molecular Genetics 1:19-28 (1992).
Feeney, A.J. "Lack of N regions in fetal and neonatal mouse immunoglobulin V-D-J junctional sequences." J. Exp. Med. 172:137-1390 (1990).
Fishwild et al., "High-avidity human IgGκ monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice." Nature Biotech. 14:845-851 (1996).
Flanagan, J.G. and Rabbitts, T.H., "Arrangement of human immunoglobulin heavy chain constant region genes implies evolutionary duplication of a segment containing g, e, and a genes." Nature 300:709-713 (1982).
Galfre, G. and Milstein, C., "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures." Methods Enzymol. 73:3-46 (1981).
Gemmill et al., "Protocols for pulsed field gel electrophoresis: Separation and detection of large DNA molecules." Advances in Genome Biology 1:217-251 (1991).
Gill et al., "Monoclonal anti-epidermal growth factor receptor antibodies which are inhibitors of epidermal growth factor binding and antagonists of epidermal growth factor stimulated tyrosine protein kinase activity." J. Biol. Chem. 259:7755 (1984).
Green et al., "Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs." Nature Genetics 7:13-21 (1994).
Hermanson et al., "Rescue of end fragments of yeast artificial chromosomes by homologous recombination in yeast." Nucleic Acids Res. 19:4943-4948 (1991).
Huber et al., "The human immunoglobulin K locus. Characterization of the partially duplicated L Regions." Eur. J. Immunol. 23:2860-2967 (1993).
Jakobovits, A., "Humanizing the mouse genome." Current Biology 4:761-763 (1994).
Jakobovits, A., "Production of fully human antibodies by transgenic mice." Current Opinion in Biotechnology 6:561-566 (1995).
Jakobovits et al., "Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome." Nature 362:255-258 (1993).
Jakobovits, A. et al., "Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555 (1993).
Kawamoto et al., "Growth stimulation of A431 cells by epidermal growth factor: Identification of high affinity receptors for EGF by an anti-receptor monoclonal antibody." Proc. Nat. Acad. Sci., USA 80:1337-1341 (1983).
Lonberg et al., "Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications." Nature 368:856-859 (1994).
Lusti-Marasimhan et al., "Mutation of Leu25 and Val27 introduces CC chemokine activity into interleukin-8." J. Biol. Chem. q270:2716-2721 (1995).
Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific Oligonucleotide probes." Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991).
Matsuda et al., "Structure and physical map of 64 variable segments in the 3' 0.8- megabase region of the human immunoglobulin heavy-chain locus." Nature Genetics 3:88-94 (1993).
Max, E. Molecular genetics of immunoglobulins. Fundamental Immunology. 315-382 (Paul, WE, ed., New York: Raven Press (1993)).
Mendez et al., "A set of YAC targeting vectors for the interconversion of centric and acentric arms." Cold Spring Harbor Laboratory Press, Genome Mapping and Sequencing meeting, 163 (1993).
Mendez et al., "Analysis of the structural integrity of YACs comprising human immunoglobulin genes in yeast and in embryonic stemcells." Genomics 26:294-307 (1995).
Ray, S. and Diamond, B., "Generation of a fusion partner to sample the repertoire of Splenic B-cells destined forapoptosis." Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:5548-5551 (1994).
Sato et al., "Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors" Mol. Biol. Med. 1:511-529 (1983).
Schiestl, R.H. and Gietz, R.B., "High efficiency transformation of intact yeast cells using stranded nucleic acids as a carrier." Curr. Genet. 16:339-346 (1989).
Sherman et al., "Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics." (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1986)).
Silverman et al., "Meiotic recombination between yeast artificial chromosomes yields a single clone containing the entire BCL2 protooncogene." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9913-9917 (19_).
Srivastava, A. and Schiessinger, D., "Vectors for inserting selectable markers in vector arms and human DNA inserts of yeast artificial chromosomes (YACs)." Gene 103:53-59 (1991).
Taylor et al., "A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins." Nucleic Acids Research 20:6287-6295 (1992).
Taylor et al., "Human immunogiobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM." International Immunology 6:579-591 (1994).
Tuailion et al., "Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in m and g transcripts." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724 (1993).
Tuaillon et al. "Analysis of direct and inverted DJ_H rearrangements in a human Ig heavy chain transgenic minilocus" J. Immunol. 154:6453-6465 (1995).
Vaughan et al., "Human antibodies with subnanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library." Nature Biotech. 14:309-314 (1996).
Wagner et al., "The diversity of antigen-specific monoclonal antibodies from transgenic mice bearing human immunoglobulin gene miniloci." Eur. J. Immunol. 24:2672-2681 (1994).
Weichhold et al., "The human immunoglobulin κ locus consists of two copies that are organized in opposite polarity." Genomics 16:503-511 (1993).
Yamada, M. et al., "Preferential utilization of specific immunoglobulin heavy chain diversity and joining segments in adult human peripheral blood B lymphocytes." J. Exp. Med. 173:395-407 (1991).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vollständig humaner monoklonaler Antikörper gegen den humanen Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-r), umfassend: a) eine schwere Kette eines Immunglobulin-Moleküls, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine cDNA kodiert wird, wie sie in 30 (SEQ ID NO: 17) dargestellt ist, und b) eine leichte Kappa-Kette eines Immunglobulin-Moleküls, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine cDNA kodiert wird, wie sie in 32 (SEQ ID NO: 18) dargestellt ist.
Antikörper gemäß Anspruch 1, umfassend a) die Aminosäuresequenz wie in 29 (SEQ ID NO: 37) dargestellt, und b) die Aminosäuresequenz wie in 31 (SEQ ID NO: 39) dargestellt.
Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der genannte Antikörper ein humaner IgG2 Antikörper ist.
Hybridom-Zelllinie, umfassend a) eine Nukleotidsequenz, die eine cDNA-Sequenz umfasst, wie sie in 30 (SEQ ID NO: 17) dargestellt ist, und b) eine Nukleotidsequenz, die eine cDNA-Sequenz umfasst, wie sie in 32 (SEQ ID NO: 18) dargestellt ist.
Hybridom-Zelllinie gemäß Anspruch 4, die einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 sezerniert.
Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln eines soliden Tumors.