ES2289779T3

ES2289779T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor dfl factor de crecimiento epidermico.

Info

Publication number: ES2289779T3
Application number: ES98920254T
Authority: ES
Inventors: Aya Jakobovits; Xiao-Dong Yang; Michael Gallo; Xiao-Chi Jia
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Current assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-05-05
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2018-05-05
Also published as: KR100558110B1; JP2012158601A; JP2014185165A; JP2005225884A; JP2001523973A; JP5356287B2; WO1998050433A2; WO1998050433A3; JP2009051861A; NL300335I2; FR08C0006I1; EP1878746A2; DE69838062D1; DE69838062T2; DE122008000009I1; CA2288962C; CY2008003I2; EP1878746A3; ATE366747T1; JP2018076321A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal totalmente humano contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF-r), que comprende a) una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc mostrado en la Fig. 30 (SEQ ID NO: 17), y b) una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera kappa que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc mostrado en la Fig. 32 (SEQ ID NO: 18).

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico.

Antecedentes de la invención 1. Compendio de la invención

Según la presente invención, se proporcionan secuencias de las cadenas pesada y ligera contiguas completamente humanas que abarcan los anticuerpos monoclonales de las regiones determinantes de la complementariedad contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF-r). Se proporcionan las secuencias de nucleótidos codificantes y las secuencias de aminoácidos que comprenden moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera, concretamente secuencias correspondientes a (CDR), específicamente de CDR1 a CDR3. Asimismo se proporcionan hibridomas que expresan tales moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales.

2. Antecedentes de la tecnología

Se ha demostrado que el EGF-r es sobreexpresado en muchos tipos de tumores sólidos humanos. Mendelsohn Cancer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Por ejemplo, se ha observado la sobreexpresión de EGF-r en ciertos carcinomas de pulmón, mama, colon, gástricos, de cerebro, vejiga, cabeza y cuello, ovario, y próstata. Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Se ha demostrado que tanto el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-\alpha) se unen a EGF-r y conducen a la proliferación celular y al crecimiento
tumoral.

De este modo, ciertos grupos han propuesto que los anticuerpos contra EGF, TGF-\alpha, y EGF-r pueden ser útiles en la terapia de tumores que expresan o sobreexpresan EGF-r. Mendelsohn Cancer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994), Tosi et al. Int'l J. Cancer 62:643-650 (1995). En efecto, se ha demostrado que los anticuerpos anti-EGF-r a la vez que bloquean la unión de EGF y TGF-\alpha al receptor parecen inhibir la proliferación de las células tumorales. No obstante, al mismo tiempo, los anticuerpos anti-EGF-r no parecen inhibir el crecimiento celular independiente de EGF y TGF-\alpha. Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994).

A la vista de estos descubrimientos, se han desarrollado numerosos anticuerpos monoclonales de ratón y rata contra EGF-r y se han sometido a ensayo en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento de las células tumorales in vitro e in vivo. Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). El anticuerpo que aparentemente ha llegado más lejos en medicina clínica es un anticuerpo quimérico, denominado C225, que tiene una región variable de ratón y una región constante de IgG1 humana. Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). El anticuerpo de ratón, denominado 225, en el cual se basa el anticuerpo C225, fue desarrollado por la Universidad de California y Rorer. Véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 943.533 y la Patente Europea Núm. 359,282. Se demostró que el anticuerpo C225 inhibía el crecimiento de las células tumorales mediado por EGF e inhibía la formación de tumores humanos in vivo en ratones atímicos. El anticuerpo, por otra parte, parecía actuar sinérgicamente con ciertos agentes quimioterapéuticos para erradicar tumores humanos in vivo en modelos de ratón con xenoinjertos. Modjtahedi y Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994).

ImClone ha estado realizando pruebas clínicas en humanos utilizando el anticuerpo anti-EGF-r designado C225. Aparentemente se han realizado, o se están realizando actualmente pruebas clínicas en Fase I y Fase I/II en pacientes con carcinomas de cabeza y cuello, próstata, y pulmón con C225. En las pruebas clínicas en fase I, no se detectó toxicidad con múltiples inyecciones y con dosis de hasta quizás 400 mg/m^{2}, ni siquiera en casos que implicaban a pacientes inmunocomprometidos. Tales estudios se realizaron en forma de estudios con dosis graduales que comprendían 5 dosis desde aproximadamente 5 a aproximadamente 200 mg/m^{2} y se realizaron combinados con quimioterapia (esto es, doxorrubicina, adriamicina, taxol, y cisplatino). Además de los datos de aparente seguridad que se han generado en estos estudios, los resultados preliminares de los estudios parecen indicar cierta evidencia de arrugamiento de los tumores en un 80% de los pacientes que tenían cáncer de próstata.

Cada uno de estos anticuerpos mencionados antes, no obstante, posee regiones variables y/o constantes de ratón o rata. La presencia de tales proteínas derivadas de ratón o rata puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por el paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de ratón o rata, se ha postulado que se podría introducir una función de anticuerpo humano en un roedor de manera que el roedor produjera anticuerpos totalmente humanos.

La capacidad para clonar y reconstruir loci humanos de un tamaño de mega-bases en YAC e introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona un potente enfoque para elucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o cartografiados a groso modo así como para generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, la utilización de semejante tecnología para la sustitución de loci de ratón por sus equivalentes humanos podría proporcionar nuevas percepciones únicas en la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y el progreso de las enfermedades.

Una importante aplicación práctica de semejante estrategia es la "humanización" del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que los genes de Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y el ensamblaje de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de las células B. Además, semejante estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales totalmente humanos (Mac) - un importante hito hacia el cumplimiento de la promesa de la terapia con anticuerpos en las enfermedades humanas. Se espera que los anticuerpos totalmente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a Mac de ratón o derivados de ratón y de este modo incrementen la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos totalmente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de las enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como la inflamación, la autoinmunidad, y el cáncer, que requieren administraciones repetidas de anticuerpos.

Un acercamiento hacia este objetivo fue diseñar cepas de ratón con una producción deficiente de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de loci de Ig humanos con la esperanza de que semejantes ratones pudieran producir un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos grandes de Ig humana conservarían la gran diversidad génica variable así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos. Explotando la maquinaria de ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la carencia de tolerancia inmunológica a las proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas cepas de ratón debe producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Utilizando la tecnología de los hibridomas, los Mac humanos específicos de los antígenos con la especificidad deseada podrían ser producidos y seleccionados fácilmente.

Esta estrategia general fue demostrado con relación a la generación por parte de los autores de la presente invención de las primeras cepas XenoMouse® publicada en 1994. Véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). Las cepas XenoMouse® fueron diseñadas con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de 245 kb y 190 kb de tamaño del locus de la cadena pesada humana y del locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían las secuencias de la región variable y constante del núcleo. Id. Se demostró que la Ig humana que contenía los YAC era compatible con el sistema inmunitario del ratón tanto para la transposición como para la expresión de anticuerpos y era capaz de sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró mediante su capacidad para inducir el desarrollo de las células B, para producir un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y para generar Mac humanos específicos de los antígenos. Estos resultados también sugerían que la introducción de porciones más grandes de los loci de Ig humana que contenían números más grandes de genes V, elementos reguladores adicionales, y regiones constantes de Ig humana podrían recapitular sustancialmente todo el repertorio que es característico de la respuesta humoral humana a la infección e inmunización. El trabajo de Green et al. fue ampliado recientemente para la introducción de más de aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos por medio de la introducción de fragmentos YAC de configuración de la línea germinal, con un tamaño de megabases de los loci de la cadena pesada humana y los loci de la cadena ligera kappa, respectivamente. Véase Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y WO-A-98/24853, que reivindican la prioridad del 3 de Diciembre de 1996.

En estas publicaciones, los anticuerpos totalmente humanos específicos para EGF-r, denominados E.1.1, E.2.5, E.2.11 y E.2.4, que son referidos en los presentes ejemplos, se caracterizan y estudian con detalle.

Tal enfoque lo discuten y definen adicionalmente Mendez et al. en Nature Genetics 15:146-156 (1997), Patente Europea Núm. EP 0 463 151 B1, publicación de la concesión el 12 de Junio, 1996, Solicitud de Patente Internacional Núm., WO 94/02602, publicada el 3 de Febrero, 1994, Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 96/34096, publicada el 31 de Octubre, 1996, y Publicación PCT Núm. WO-A-96/33735 presentada el 29 de Abril, 1996.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, un locus de Ig exógeno es imitado por medio de la inclusión de piezas (genes individuales) de loci de Ig. De este modo, se forman uno o más genes V_{H}, uno o más genes D_{H}, uno o más genes J_{H}, una región constante mu, y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) en un constructo para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.807 de Surani et al. y en la Patente de los Estados Unidos Núms. 5.545.806 y 5.625.825, ambas de Lonberg y Kay. Véanse también las Solicitudes de Patente Internacionales Núms. WO 94/25585, publicada el 10 de Noviembre, 1994, WO 93/12227, publicada el 24 de Junio, 1993, WO 92/22645, publicada el 23 de Diciembre, 1992, WO 92/03918, publicada el 19 de Marzo, 1992. Véanse adicionalmente Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995).

Los autores de la invención de Surani et al., citados antes y asignados al Medical Research Counsel ("MRC"), produjeron un ratón transgénico que poseía un locus Ig por medio del uso del enfoque de minilocus. Los autores de la invención del trabajo de GenPharm International, citado antes, Lonberg y Kay, siguiendo la iniciativa de los autores de la presente invención, propusieron la inactivación del locus Ig de ratón endógeno asociada a una duplicación sustancial del trabajo de Surani et al.

Una ventaja del enfoque de minilocus es la rapidez con la que los constructos que incluyen porciones del locus de Ig pueden ser generados e introducidos en los animales. Proporcionalmente, sin embargo, una desventaja significativa del enfoque de minilocus es que, en teoría, se introduce una diversidad insuficiente a través de la inclusión de un pequeño número de genes V, D, y J. En efecto, el trabajo publicado parece apoyar esta cuestión. El desarrollo de células B y la producción de anticuerpos de animales producidos por medio del uso del enfoque del minilocus parecían atrofiados. Por lo tanto, la investigación que rodea la presente invención se ha dirigido consecuentemente hacia la introducción de grandes porciones del locus de Ig con el fin de obtener una mayor diversidad y en un esfuerzo por reconstituir el repertorio inmunitario de los animales.

Las respuestas de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA) han conducido a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Si bien el anticuerpo C225 es un anticuerpo quimérico, que tiene una región constante humana y una región variable de ratón, se espera observar ciertas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), concretamente en utilizaciones crónicas o de múltiples dosis del anticuerpo.

De este modo, sería deseable proporcionar anticuerpos totalmente humanos contra EGF-r que posean actividades similares o intensificadas en comparación con C225 con el fin de quitar valor a los asuntos y/o efectos de la respuesta de HAMA o HACA.

Breve descripción de las figuras de los dibujos

La Figura 1 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que es secretada por el hibridoma E1.1. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-31 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E1.1 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua de CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 se indica mediante un doble subrayado.

La Figura 2 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 1 que fue clonada fuera del hibridoma E1.1.

La Figura 3 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E1.1. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E1.1 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua de CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 se indican mediante doble subrayado.

La Figura 4 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 3 que fue clonada fuera del hibridoma E1.1.

La Figura 5 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que es secretada por el hibridoma E2.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-31 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E2-4 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado, y cada una de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 se indica mediante doble subrayado.

La Figura 6 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de cadena pesada de la Figura 5 que fue clonada fuera del hibridoma E2.4.

La Figura 7 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E2.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E2.4 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 se indican mediante doble subrayado.

La Figura 8 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 7 que fue clonada fuera del hibridoma E2.4.

La Figura 9 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E2.5. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-31 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E2.5 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua de CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 se indican mediante doble subrayado.

La Figura 10 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 9 que fue clonada fuera del hibridoma E2.5.

La Figura 11 es una secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E2.5. Las diferencias entre la secuencia codificada el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E2.5 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua de CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 se indica mediante doble subrayado.

La Figura 12 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 11 que fue clonada fuera del hibridoma E2.5.

La Figura 13 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E6.2. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-31 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E6.2 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 se indican mediante doble subrayado.

La Figura 14 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 13 que fue clonada fuera del hibridoma E6.2.

La Figura 15 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E6.2. Las diferencias entre la secuencia que codifica el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E6.2 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 se indican mediante doble subrayado.

La Figura 16 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 15 que fue clonada fuera del hibridoma E6.2.

La Figura 17 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E6.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen de la cadena variable 4-31 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E6.4 se indican en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 se indica mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 se indica mediante doble subrayado.

La Figura 18 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura17 que fue clonada fuera del hibridoma E6.2.

La Figura 19 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E6.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E6.4 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 20 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 19 que fue clonada fuera del hibridoma E6.4.

La Figura 21 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E2.11. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-61 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E2.11 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 22 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 21 que fue clonada fuera del hibridoma E2.11.

La Figura 23 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E2.11. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E2.11 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 24 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 23 que fue clonada fuera del hibridoma E2.11.

La Figura 25 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-61 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 26 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 25 que fue clonada fuera del hibridoma E6.3.

La Figura 27 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 28 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 27 que fue clonada fuera del hibridoma E6.3.

La Figura 29 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E7.6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-61 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E7.6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 30 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 29 que fue clonada fuera del hibridoma E7.6.3.

La Figura 31 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E7.6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E7.6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado, y cada una de las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 32 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 31 que fue clonada fuera del hibridoma E7.6.3.

La Figura 33 proporciona una comparación de las comparaciones de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-EGF-r específica con la secuencia de aminoácidos del gen V_{H} concreto que codifica la cadena pesada del anticuerpo concreto.

La Figura 34 proporciona una comparación de las comparaciones de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera anti-EGF-2 con la secuencia de aminoácidos del gen V\kappa concreto que codifica la cadena ligera del anticuerpo concreto.

La Figura 35 muestra el bloqueo de la unión de EGF a células A431 de carcinoma epidermoide humano mediante anticuerpos anti-EGF-r in vitro, donde (\Box) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo anti-EGF-r según la invención, (\bullet) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, y (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control.

La Figura 36 muestra la inhibición de la unión de EGF a células A431 de carcinoma epidermoide humano por medio de anticuerpos anti-EGF-r humano in vitro, donde (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal 225 de ratón, (O) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 528, (\blacktriangledown) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E1.1 según la invención, (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.4 según la invención, (\blacktriangleright) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.5 según la invención, (\blacktriangleleft) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.6 según la invención, (\Box) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.11 según la invención, y 1 representa los resultados utilizando un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control.

La Figura 37 muestra la inhibición de la unión de TGF-\alpha a células A431 de carcinoma epidermoide humano por medio de anticuerpos anti-EGF-r in vitro, donde (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, (\oblong) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E6.2 según la invención, (\bullet) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E6.3 según la invención, (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E7.2 según la invención, (\blacksquare) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E7.10 según la invención, (\blacktriangledown) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E7.6.3, y 2 representa los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo IgG2 humano no específico, de control.

La Figura 38 muestra la inhibición de la unión de EGF a células SW948 de carcinoma de colon humano por medio de anticuerpos anti-EGF-r humanos in vitro, donde (\bullet) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo anti-EGF-r según la invención, (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, y (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de
control.

La Figura 39 muestra que los anticuerpos anti-EGF-r humanos derivados de cepas XenoMouse II inhiben el crecimiento de las células SW948 in vitro, donde (O) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo anti-EGF-r según la invención, (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, y (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control.

La Figura 40 muestra la inhibición del crecimiento de las células A431 de carcinoma epidermoide humano en ratones atímicos por medio del uso de anticuerpos anti-EGF-r humanos según la invención in vivo. En la Figura, (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 1 mg de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención, (\blacktriangledown) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 0,2 mg de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención, (\Box) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control, y (O) representa los resultados obtenidos utilizando solución salina tamponada con fosfato como control.

La Figura 41 muestra los datos relacionado con la inhibición de la formación de carcinoma epidermoide en ratones atímicos por medio del uso de anticuerpos anti-EGF-r humanos según la invención in vivo que muestran una incidencia tumoral el día 19.

La Figura 42 muestra los datos relacionados con la inhibición de la formación de carcinoma epidermoide en ratones atímicos por medio del uso de anticuerpos anti-EGF-r humanos según la invención in vivo que muestran la incidencia tumoral el día 120.

La Figura 43 muestra los datos relacionados con la erradicación de un tumor epidermoide humano establecido en ratones atímicos por medio del uso de anticuerpos anti-EGFR-r humanos según la invención in vivo. En la Figura, (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos con múltiples dosis de 1 mg cada una de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E7.6.3), (\times) representa los resultados obtenidos con dos dosis de 125 \mug cada una de doxorrubicina, (*) representa los resultados obtenidos con múltiples dosis de 1 mg cada una de anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E7.6.3) combinado con dos dosis de 125 \mug cada una de doxorrubicina, (\blacksquare) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control, y (\oblong) representa los resultados obtenidos utilizando solución salina tamponada con fosfato como control.

La Figura 44 muestra los datos relacionados con la erradicación de un tumor epidermoide humano establecido en ratones atímicos por medio del uso de anticuerpos anti-EGF-r humanos según la invención in vivo. En la Figura, (\oblong) representa los resultados obtenidos con múltiples dosis de 0,5 mg cada una de anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E2.5), (\blacksquare) representa los resultados obtenidos con dos dosis de 125 \mug cada una de doxorrubicina, (\blacktriangle) representa los resultados obtenidos con múltiples dosis de 0,5 mg cada una de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E2.5) combinado con dos dosis de 125 \mug cada una de doxorrubicina, (\times) representa los resultados obtenidos utilizando solución salina tamponada con fosfato como control, y (*) representa los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control a una dosis de
1 mg.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF-r), que comprende

a) una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc que se muestra en la Fig. 30 (SEQ ID NO: 17), y

b) una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera kappa que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc que se muestra en la Fig. 32 (SEQ ID NO: 18).

En una realización, el anticuerpo de la presente invención comprende

a) la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Fig. 29 (SEQ ID NO: 37), y

b) la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Fig. 31 (SEQ ID NO: 38).

En una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgG2 humano.

La presente invención también proporciona una línea celular de hibridoma, que comprende

a) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ADNc que se muestra en la Fig. 30 (SEQ ID NO: 17), y

b) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ADNc que se muestra en la Fig. 32 (SEQ ID NO: 18).

En una realización, la línea celular de hibridoma de la presente invención secreta un anticuerpo de la presente invención.

La presente invención proporciona adicionalmente el uso de un anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor sólido.

Las otras realizaciones referidas en la descripción no son parte de la invención reivindicada pero sirven para ilustrar la invención.

En primer lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada donde una porción de la secuencia está codificada por un gen de la familia V_{H} 4 humana y cualquiera de las mutaciones representadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, y 30. En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada comprende una sustitución de aminoácidos de Ácido Aspartico en el resto 10.

En segundo lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada donde una porción de la secuencia está codificada por un gen V_{H} 4-31 humano y cualquiera de las mutaciones representadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras 2, 6, 10, 14, y 18. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 que se representa en el SEQ ID NO: 23. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 24. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 25. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 26. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 27. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 28. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 29. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 30. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 31. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 32.

En tercer lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada donde una porción de la secuencia está codificada por un gen V_{H} 4-61 humano y cualquiera de las mutaciones representadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras 22, 26, y 30. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 33. En una realización preferida, el anticuerpo adicional comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 34. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 35. En una realización preferida, el anticuerpo adicional comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 36. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 37. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 38.

En cuarto lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera donde una porción de la secuencia está codificada por un gen de la familia V\kappa I humana y cualquiera de las mutaciones representadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, y 32. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 24. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 26. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 28. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 30. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 32. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 34. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 36. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 38.

En quinto lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 23. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 24.

En sexto lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 25. En una realización preferida, el anticuerpo adicional comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 26.

En séptimo lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 27. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 28.

En octavo lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 29. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente la secuencia representada por el SEQ ID NO: 30.

En noveno lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 31. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 32.

En décimo lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 33. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 34.

En decimoprimer lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 35. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 36.

En decimosegundo lugar, se describe un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende a una secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 representada en el SEQ ID NO: 37. En una realización preferida, el anticuerpo comprende adicionalmente una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia representada por el SEQ ID NO: 38.

En decimotercer lugar, se describe un método para tratar un tumor sólido con un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico, comprendiendo la mejora administrar a un paciente que tiene un tumor sólido uno de los anticuerpos anteriores.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se proporcionan anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-r). Se proporcionan secuencias de nucleótidos codificantes y secuencias de aminoácidos que comprenden moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, concretamente secuencias que corresponden a secuencias de la cadena pesada y ligera contiguas desde CDR1 a CDR3. También se proporcionan hibridomas que expresan tales moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos utilizados con relación a la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos normales en la técnica. Adicionalmente, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas con relación a, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, y química e hibridación de proteínas y oligo- o polinucleótidos descritas en la presente memoria son las conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Los mecanismos normalizados se utilizan para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y la transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante o como se efectúa comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan en toda la presente memoria. Véase p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que se incorpora aquí como referencia. Las nomenclaturas utilizadas con relación a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio, la química analítica, la química orgánica sintética, y la química médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Se utilizan las técnicas normalizadas para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación, y la liberación, y el tratamiento de los pacientes.

Según se utiliza en la presente descripción, se deberá entender que, los siguientes términos, a menos que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados:

El término "polinucleótido aislado" según se utiliza en la presente memoria representará un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) se conecta operablemente a un polinucleótido al que no está conectado en la naturaleza, o (3) no existe en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "proteína aislada" referido en la presente memoria representa una proteína de origen de ADNc, ARN recombinante, o sintético o alguna combinación de los mismos, en virtud de su origen, o fuente de transformación, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, p. ej., libre de proteínas de ratón, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no existe en la naturaleza.

El término "polipéptido" se utiliza en la presente memoria como un término genérico para hacer referencia a una proteína nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, la proteína nativa, los fragmentos, y los análogos son especies del género polipeptídico. Los polipéptidos preferidos según la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana representadas por las Figuras 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, y 29 y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa representadas por las Figuras 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, y 31, así como moléculas de anticuerpo formadas mediante combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y vice versa, así como fragmentos y análogos de los mismos.

El término de "origen natural" según se utiliza en la presente memoria aplicado a un objeto hace referencia al hecho de un objeto que puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente de la naturaleza y que no ha sido modificado por el hombre en el laboratorio o de otro modo es de origen natural.

El término "conectado operablemente" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a que las posiciones de los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia de control "conectada operablemente" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se obtiene en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El término "secuencia de control" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y procesar las secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo de los organismos anfitriones; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión al ribosoma, y una secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.

El término "polinucleótido" referido en la presente memoria representa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de hebra sencilla y doble.

El término "oligonucleótido" referido en la presente memoria incluye nucleótidos de origen natural, y modificados conectados por medio de conexiones de oligonucleótidos de origen natural, y no natural. Los oligonucleótidos son un subgrupo de polinucleótidos que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y muy preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son normalmente de hebra sencilla, p. ej., para sondas; aunque los oligonucleótidos puede ser de doble hebra, p. ej., para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos efectores o antisentido.

El término "nucleótidos de origen natural" referido en la presente memoria incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente memoria incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "conexiones de oligonucleótidos" referido en la presente memoria incluye conexiones de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fósforoselenoato, fósforodiselenoato, fósforoanilotioato, fosforaniladato, fosforamidato, y similares. Véase p. ej., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides y Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. Un oligonucleótido puede incluir una marca para su detección, si se desea.

El término "hibridar selectivamente" referido en la presente memoria representa unir detectablemente y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos según la invención hibridan selectivamente con hebras de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones muy restrictivas para obtener condiciones de hibridación selectivas como es sabido en la técnica y tratado en la presente memoria. Generalmente, la homología de secuencia de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será de al menos el 80%, y más típicamente con homologías crecientes preferiblemente de al menos el 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias están alineadas para su máximo emparejamiento. Los espacios (que están emparejados en cualquiera de las dos secuencias) se permiten en el emparejamiento máximo; se prefieren longitudes de los espacios de 5 o menos siendo más preferidos 2 o menos. Alternativamente y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se utiliza este término en la presente memoria, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación típica) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutaciones y una penalización del espacio de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el Suplemento 2 a este, pág. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas su sus aminoácidos son idénticos en un 50% o más cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se utiliza en la presente memoria para significar que una secuencia de polinucleótido es homóloga (esto es, es idéntica, no estrictamente relacionada evolutivamente) a toda o a una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. Por el contrario, el término "complementario a" se utiliza en la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o a una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Como ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de la secuencia", e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más grande, por ejemplo, en forma de un segmento de una secuencia de ADNc o génica completa dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia de ADNc o génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos pueden comprender cada una (1) una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótidos o aminoácidos completa) que es similar entre dos moléculas, y (2) puede comprender adicionalmente una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, las comparaciones entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente comparando las secuencias de las dos moléculas a lo largo de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótidos o 6 de aminoácidos contiguas donde una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos se puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos contiguos y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones, y similares (esto es, espacios) de un 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por medio del algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por medio de la búsqueda para el método de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por medio de implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), paquetes de soporte lógico Geneworks, o MacVector), o por medio de la inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (esto es, resultante en el mayor porcentaje de homología sobre la ventana

\hbox{de comparación) generado mediante los diversos
métodos.}

El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (esto es, nucleótido por nucleótido o resto por resto) a lo largo de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales existe la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, U, o I) o resto en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación (esto es, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia. El término "identidad sustancial" según se utiliza en la presente memoria indica una característica de una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos, donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85 por ciento, preferiblemente al menos el 90 al 95 por ciento de identidad de secuencia, más normalmente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), donde el porcentaje de identidad de la secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subgrupo de una secuencia más grande.

Según se utiliza en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que se incorpora aquí como referencia. Los estereoisómeros (p. ej., D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como los aminoácidos \alpha,\alpha-disustituidos, los N-alquilaminoácidos, el ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplo los aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, \varepsilon-N,N,N-trimetil-lisina, \varepsilon-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, \sigma-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej., 4-hidroxiprolina). En la notación de los polipéptidos utilizada en la presente memoria, la dirección a mano izquierda es la dirección amino terminal y la dirección a mano derecha es la dirección carboxi terminal, según el uso normalizado y la convención.

De un modo similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos de hebra sencilla es el extremo 5'; la dirección a mano izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble hebra es referida como dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de los transcritos de ARN nacientes es referida como dirección de transcripción; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas arriba"; las regiones de la secuencia de la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN que están 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias aguas abajo".

Según se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, por ejemplo por medio de los programas GAP o BESTFIT utilizando los pesos del espacio por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento, y muy preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento. Preferiblemente, las posiciones de los restos que no son idénticos difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas hacen referencia a la intercambiabilidad de los restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas hidroxiladas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparragina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáicas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alcalinas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico, y asparragina-glutamina.

El término "fragmento polipeptídico" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las correspondientes posiciones en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, a partir de la secuencia de ADNc completa. Los fragmentos tienen típicamente al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de longitud, normalmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a polipéptidos que están formados por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a EGF-r, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para unir EGF a su receptor, o (3) capacidad para inhibir el crecimiento de las células que expresan EGF-r in vitro o in vivo. Típicamente, los análogos polipeptídicos comprenden una sustitución (o adición o deleción) de aminoácidos conservativa con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos tienen típicamente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como el polipéptido de origen natural completo.

Los análogos peptídicos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan en la presente memoria como referencia. Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda del modelado molecular computarizado. Los peptidomiméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (esto es, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o farmacológica), tal como un anticuerpo humano, pero tiene una o más conexiones peptídicas opcionalmente remplazadas por una conexión seleccionada del grupo que consiste en: - -CH_{2}NH- -, - -CH_{2}S- -, - -CH_{2}-CH_{2}- -, -CH=CH- - (cis y trans), - -COCH_{2}- -, - -CH(OH)CH_{2}- -, y -CH_{2}SO- -, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica pueden ser generados mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporada en la presente memoria como referencia); por ejemplo, añadiendo restos cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

"Anticuerpo" o "péptido o péptidos anticuerpo" hace referencia a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Los fragmentos se unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv, y anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que un anticuerpo distinto de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adherencia de un receptor a un contra-receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido a un contra-receptor al menos aproximadamente un 20%, 40%, 60% o 80%, y más normalmente más de aproximadamente un 85% (medido en un análisis de unión competitiva in vitro).

El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o un receptor de las células T. Los determinantes epitópicos consisten normalmente en agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es \leq1 \muM, preferiblemente \leq 100 nM y muy preferiblemente \leq 10 nM.

El término "agente" se utiliza en la presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "etiqueta" o "etiquetado" hacen referencia a la incorporación de un marcador detectable, p. ej., mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o anclado a un polipéptido de radicales biotinilados que pueden ser detectados por avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada mediante métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o el marcador también pueden ser terapéuticos. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar varios métodos de etiquetar polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de etiquetas para los polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., H^{3}, C^{14}, N^{15}, S^{35}, Y^{90}, Tc^{99}, In^{111}, I^{125}, I^{131}), etiquetas fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos lantánidos), etiquetas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), agentes quimioluminiscentes, grupos biotinilados, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (p. ej., secuencias con pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión metálicos, etiquetas epitópicas). En algunas realizaciones, las etiquetas están ancladas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

El término "agente farmacéutico o fármaco" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. Otros términos químicos de la presente memoria se utilizan según el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), incorporado en la presente memoria como referencia).

El término "agente antineoplásico" se utiliza en la presente memoria para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o progreso de un neoplasma en un ser humano, concretamente una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma, o leucemia. La inhibición de la metástasis es frecuentemente una propiedad de los agentes antineoplásicos.

Según se utiliza en la presente memoria, "sustancialmente puro" significa que una especie objetivo es la especie predominante presente (esto es, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual de la composición), y preferiblemente una fracción purificada sustancialmente es una composición en la que la especie objetivo comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, 90%, 95%, y 99%. Muy preferiblemente, la especie objetivo se purifica hasta la homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición mediante métodos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.

Estructura del Anticuerpo

La unidad básica estructural del anticuerpo es conocida por comprender un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican en cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase generalmente, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada como referencia en su totalidad para todos los fines). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo.

De este modo, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales.

Las cadenas muestran todas la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par son alineadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N al extremo C, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos incluyendo la fusión de hibridomas o la conexión de fragmentos Fab'. Véase, p. ej., Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un procedimiento intenso relativamente laborioso en comparación con la producción de anticuerpos convencionales y los rendimientos y los grados de pureza son generalmente más bajos para los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (p. ej., Fab, Fab', y Fv).

Preparación de Anticuerpos

El anticuerpo según la invención se prepara preferiblemente por medio de la utilización de un ratón transgénico que tiene insertada una porción sustancial del genoma productor de anticuerpo humano pero que es deficiente en la producción de anticuerpos endógenos, de ratón. Tales ratones, son capaces después de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos de ratón. Las tecnologías utilizadas para obtenerlos se describen en patentes, solicitudes y referencias descritas en los Antecedentes, en la presente memoria. En particular, sin embargo, una realización preferida de producción transgénica de ratones y anticuerpos de los mismos se describe en WO-A-98/24893, que reivindica la prioridad de la presentada el 3 de Diciembre, 1996, véase también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Por medio del uso de semejante tecnología, los autores han producido anticuerpos monoclonales totalmente humanos para una variedad de antígenos. Esencialmente, los autores inmunizan líneas XenoMouse® de ratones con un antígeno de interés, recuperan las células linfáticas (tales como las células B) de los ratones que expresan los anticuerpos, fusionan tales células recuperadas con una línea celular mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y escrutan tales líneas celulares de hibridoma y las seleccionan para identificar las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. Los autores de la presente invención utilizan estas técnicas según la presente invención para la preparación de anticuerpos específicos para EGF-r. En la presente memoria, los autores describen la producción de ocho líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para EGF-r. Adicionalmente, los autores proporcionan una caracterización de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares, incluyendo los análisis de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos.

Las líneas celulares de hibridoma estudiadas en la presente memoria se denominan E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3, y E7.6.3. Solamente E7.6.3 es parte de la invención reivindicada. Cada uno de los anticuerpos producidos por las líneas celulares anteriormente mencionadas es una cadena pesada IgG2 totalmente humana con cadenas ligeras kappa humanas. En general, los anticuerpos según la invención poseen afinidades muy altas, poseyendo típicamente Kd de aproximadamente 10^{-9} a aproximadamente 10^{-11} M, cuando se miden en fase sólida y en fase de solución.

Como se apreciará, los anticuerpos según la presente invención pueden ser expresados en líneas celulares distintas de las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos concretos se pueden utilizar para la transformación de una célula anfitriona de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona, incluyendo, por ejemplo el empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y la transducción de una célula anfitriona con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. El procedimiento de transformación utilizado depende del anfitrión que se vaya a transformar. Los métodos de introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la encapsulación de uno o varios polinucleótidos en liposomas, y la microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamífero asequibles como anfitriones para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas asequibles de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), incluyendo pero no limitadas a, células de ovario de hámster Chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), y otras numerosas líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia concreta se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen elevados niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión a EGF-r constitutivas.

Los anticuerpos según la presente invención son potentes inhibidores de la unión de EGF y TGF-\alpha a su receptor, EGF-r. Tales resultados se discuten en los Ejemplos 5 y 6 y se muestran en las Figuras 35 a 38. Coincidiendo con estos resultados, y como se muestra en la Figura 39 y se discute con relación al Ejemplo 7, el anticuerpo según la presente invención también inhibe el crecimiento de ciertas líneas celulares de carcinoma humano in vitro, y también evita el crecimiento de ciertos carcinomas humanos in vivo. Tales resultados se muestran en las Figuras 40 a 42 y se discuten con relación al Ejemplo 8. En el Ejemplo 9, los autores de la presente invención demuestran que un anticuerpo según la presente invención, al menos combinado con un agente antineoplásico, erradicará un tumor existente en un animal. Por otra parte, la terapia con anticuerpos, como monoterapia (esto es, sin combinar con un agente antineoplásico) parece posible según los anticuerpos de la presente invención, lo que no parecía posible en la técnica anterior, por ejemplo por medio del uso del anticuerpo 225. Tales resultados se discuten con relación al Ejemplo 9 y se muestran en las Figuras 43-44.

Los resultados demostrados según la presente invención indican que los anticuerpos de la presente invención poseen ciertas cualidades que pueden hacer los presentes anticuerpos más eficaces que los anticuerpos terapéuticos actuales contra el EGF-r, 225. El anticuerpo 225 en desarrollo clínico por Imclone es un anticuerpo IgG1 quimérico con una afinidad de 2 X 10^{-10} M, que, si bien parece eficaz en la terapia combinada con un agente antineoplásico, no parece muy eficaz en la monoterapia. Por el contrario, los anticuerpos según la invención, esto es el anticuerpo E7.6.3 de la invención tienen afinidades significativamente superiores (E2.5: 1,6 X 10^{-11} M; E7.6.3: 5.7 X 10^{-11} M) y parecen eficaces en la monoterapia además de en la terapia combinada con un agente antineoplásico y a dosis más bajas que con el anticuerpo C225.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los resultados obtenidos se proporcionan con fines meramente ilustrativos y no se deben considerar limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1

Generación de Hibridomas Productores de Anticuerpo Anti-EGF-r

Los anticuerpos de la invención se prepararon, seleccionaron y analizaron según el presente Ejemplo.

Inmunización y generación del hibridoma: Se inmunizaron intraperitonealmente XenoMice (8 a 10 semanas de edad) con 2x10^{7} células A431 (ATCC CRL-7907) resuspendidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esta dosis se repitió tres veces. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección final de células en PBS. Los linfocitos del bazo y los nódulos linfáticos de los ratones inmunizados se fusionaron con la línea de mieloma no secretora NSO-bcl2 (Ray y Diamond, 1994) y se sometieron a selección HAT como se ha descrito previamente (Galfre y Milstein, 1981). Se recuperó un gran panel de hibridomas que secretaban todos anticuerpos IgG_{2}K humanos específicos de EGF-r (como se detecta más abajo). Como se describe en el Ejemplo 2, algunos de los anticuerpos seleccionados del panel fueron escogidos por su capacidad para competir con el anticuerpo 225.

Análisis ELISA: El ELISA para la determinación de los anticuerpos específicos del antígeno en suero de ratón y en sobrenadantes de hibridoma se llevó a cabo como se describe (Coligan et al., 1994) utilizando EGF-r purificado por afinidad de células A431 (Sigma, E-3641) para capturar los anticuerpos. Las concentraciones de inmunoglobulinas humana y de ratón se determinaron utilizando los siguientes anticuerpos de captura: IgG anti-humana de conejo (Southern Biotechnology, 6145-01), Igk anti-humana de cabra (Vector Laboratories, AI-3060), IgM anti-humana de ratón (CGI/ATCC, HB-57), para Ig gamma, kappa, y mu humana, respectivamente, y IgG de ratón de cabra (Caltag, M 30100), Igk anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology, 1050-01), IgM anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology, 1020-01), y \lambda anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology, 1060-01) para capturar Ig gamma, kappa, mu, y lambda de ratón, respectivamente. Los anticuerpos de detección utilizados en los experimentos de ELISA fueron IgH-HRP anti-ratón de cabra (Caltag, M-30107), Igk-HRP anti-ratón de cabra (Caltag, M 33007), IgG2-HRP anti-humana de ratón (Southern Biotechnology, 9070-05), IgM-HRP anti-humana de ratón (Southern Biotechnology, 9020-05), y kappa-biotina anti-humana de cabra (Vector, BA-3060). Los patrones utilizados para la cuantificación de la Ig humana y de ratón fueron: IgG_{2}\kappa humana (Calbiochem, 400122), IgM\kappa humana (Cappel, 13000), IgG\kappa de ratón (Cappel 55939), IgM\kappa de ratón (Sigma, M-3795), e IgG_{3}\lambda de ratón (Sigma, M-9019).

Determinación de las constantes de afinidad de Mac totalmente humanos mediante BIAcore: La medida de la afinidad de los anticuerpos monoclonales humanos purificados, fragmentos Fab, o sobrenadantes de hibridoma mediante resonancia de plasmón se llevó a cabo utilizando el aparato BIAcore 2000, empleando los procedimientos generales esbozados por los fabricantes.

El análisis cinético de los anticuerpos se llevó a cabo utilizando antígenos inmovilizados sobre la superficie del sensor a una densidad baja. El EGF-r soluble purificado de las membranas de células A431 (Sigma, E-3641) se utilizó generalmente a una densidad de superficie de 228 RU. Las velocidades de disociación (kd) y asociación (ka) se determinaron utilizando el soporte lógico proporcionado por el fabricante (evaluación BIA 2.1).

Determinación de las constantes de afinidad en solución mediante ELISA: Con el fin de determinar la afinidad de unión del anticuerpo en solución mediante ELISA, se incubaron diversas concentraciones de los anticuerpos monoclonales para EGF-r con EGF-r a una concentración constante hasta alcanzar el equilibrio. Después de eso, se determinó la concentración del EGF-r libre en la solución de reacción por medio de un ELISA indirecto. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales a concentraciones entre 3,0 x 10^{-11} M y 2,7 x 10^{-7} M se incubaron con EGF-r a una concentración de 4 x 10^{-10} M en 200 \mul de PBS con 0,5% de BSA durante 15 horas a la temperatura ambiente. Después de la incubación, se transfirieron 70 \mul de cada mezcla a los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos previamente recubiertos con el mismo anticuerpo monoclonal (100 \mul/pocillo, a 2 \mug/ml en tampón de recubrimiento) y se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Después de lavar con tampón de lavado, el EGF-r retenido sobre la placa se detectó mediante anti-EGF-r-HRP de ratón, que se une al carbohidrato de la proteína EGF-r. La concentración de EGF-r se calculó frente a su patrón y se utilizó para el cálculo de los anticuerpos unidos y libres en la solución de reacción de antígeno-anticuerpo original. La afinidad de unión de cada anticuerpo monoclonal a EGF-r se calculó utilizando el análisis de Scatchard.

Análisis de unión al receptor: El análisis de unión al receptor de EGF se llevó a cabo con células A413 o células SW948 (0,4 x 10^{6} células por pocillo) que fueron incubadas con concentraciones variables de anticuerpos en tampón de unión con PBS durante 30 minutos a 4ºC. Se añadió EGF [I^{125}] 0,1 nM (Amersham, IM-196) o TGF-\alpha [I^{125}] (Amersham) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 90 minutos a 4ºC. Las placas se lavaron cinco veces, se secaron al aire y se sometieron a recuento en un contador de centelleo. Se utilizaron los anticuerpos anti-EGF-r de ratón 225 y 528 (Calbiochem) como controles.

Ejemplo 2

Selección Simultánea de Anticuerpos Anti-EGF-r con el Anticuerpo m225

Como se ha mencionado antes, se ha demostrado que el anticuerpo 225 posee una elevada afinidad hacia, y una inhibición eficaz de la unión de EGF y TGF-\alpha a EGF-r. De este modo, los autores de la presente invención esperaban que si se seleccionaban anticuerpos humanos contra el EGF-r que se prepara según la presente invención con el anticuerpo 225 en un análisis competitivo, se seleccionarían anticuerpos para el mismo epítopo o uno similar al cual se une el anticuerpo 225.

Por consiguiente, los autores realizaron análisis BIAcore en los que el EGF-r soluble purificado a partir de las membranas de células A431 (Sigma, E-3641) se trataba previamente con el anticuerpo 225 y después de eso se trataba con los anticuerpos de la invención. Cuando los anticuerpos de la invención no se unían, tales anticuerpos de la invención eran escrutados en cuanto a la afinidad de unión como se ha descrito antes.

En la siguiente Tabla, se proporcionan las medidas de afinidad por algunos de los anticuerpos seleccionados de esta manera:

TABLA I

3

Como se observará, los anticuerpos seleccionados de esta manera poseen afinidades y constantes de unión excepcionalmente altas.

Ejemplo 3

Estructuras de Anticuerpos Anti-EGF-r Preparados Según la Invención

En la siguiente discusión, se proporciona información estructural relacionada con los anticuerpos preparados según la invención.

Con el fin de analizar las estructuras de los anticuerpos producidos según la invención, los autores clonaron los genes que codifican los fragmentos de las cadenas pesada y ligera del hibridoma concreto. La clonación y secuenciación de los genes se completaron como sigue:

Se aisló ARNm poli(A)^{+} de aproximadamente 2 X 10^{5} células de hibridoma derivadas de XenoMice inmunizados utilizando un kit Fast-Track (Invitrogen). La generación de ADNc cebado al azar se siguió mediante PCR. Se utilizaron cebadores de la región variable específica de la familia V_{H} humana o V_{K} humana (Marks et. al., 1991) o un cebador V_{H} humano universal, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) (SEQ ID NO:1) junto con cebadores específicos para la región constante C\gamma2 humana (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') (SEQ ID NO:2) o la región constante C\kappa (h\kappaP2; como han descrito previamente Green et al., 1994). Se obtuvieron las secuencias de los transcritos de la cadena pesada y kappa derivada de Mac humanos a partir de los hibridomas por medio de la secuenciación directa de los productos de la PCR generados a partir del ARN poli(A^{+}) utilizando los cebadores descritos antes. Los productos de la PCR también se clonaron en pCRII utilizando un kit de clonación TA (Invitrogen) y ambas hebras se secuenciaron utilizando kits de secuenciación de Dye-Terminator Prism y una máquina de secuenciación ABI 377. Todas las secuencias fueron analizadas mediante alineamientos con el "V BASE Sequence Directory" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) utilizando los programas de soporte lógico MacVector y Geneworks.

Hibridoma E1.1

El anticuerpo secretado por el hibridoma E1.1 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de los genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E1.1 evidenciaba la siguiente utilización de los genes:

: V_{H} - 4-31

: D - 2

: J_{H} - 5

: V\kappa - 018

: J\kappa - 4

Como se informa en el directorio de secuencias V BASE, se determinó que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen V_{H} 4-31 era:

4

\vskip1.000000\baselineskip

Como se informa en el directorio de secuencias V BASE, se determinó que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen V\kappa (018) era:

5

\vskip1.000000\baselineskip

La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 1-4. Figura 1 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E1.1. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena pesada 4-31 y la secuencia de la cadena pesada secretada por E1.1 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 está indicada mediante doble subrayado.

La Figura 2 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 1 que fue clonada del hibridoma E1.1.

La Figura 3 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E1.1. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E1.1 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 4 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 3 que fue clonada del hibridoma E1.1.

Hibridoma E2.4

El anticuerpo secretado por el hibridoma E2.4 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y ligera, así como en cuanto a sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y de la cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de los genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E2.4 evidenciaba la siguiente utilización de los genes:

: V_{H} - 4-31

: D - A1/A4

: J_{H} - 3

: V\kappa - 018

: J\kappa - 4

La información de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesada y ligera se proporcionan más abajo con relación a las Figuras 5-8. La Figura 5 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E2.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-31 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E2.4 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 6 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 5 que fue clonada del hibridoma E2.4.

La Figura 7 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E2.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E2.4 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 8 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura7 que fue clonada del hibridoma E2.4.

Hibridoma E2.5

El anticuerpo secretado por el hibridoma E2.5 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E2.5 evidenciaba la siguiente utilización de genes:

: V_{H} - 4-31

: D - XP1/21-10

: J_{H} - 4

: V\kappa - 018

: J\kappa - 2

La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 9-12. La Figura 9 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E2.5. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-31 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E2.5 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 10 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 9 que fue clonada del hibridoma E2.5.

La Figura 11 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E2.5. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E2.5 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 12 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 11 que fue clonada del hibridoma E2.5.

Hibridoma E6.2

El anticuerpo secretado por el hibridoma E6.2 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y la cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E6.2 evidenciaba la siguiente utilización de genes:

: V_{H} - 4-31

: D - ? (CNTCCCTT)

: J_{H} - 6

: V\kappa- 018

: J\kappa - 1

La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 13-16. La Figura 13 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E6.2. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-31 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E6.2 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 14 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 13 que fue clonada del hibridoma E6.2.

La Figura 15 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E6.2. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E6.2 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 16 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 15 que fue clonada del hibridoma E6.2.

Hibridoma E6.4

El anticuerpo secretado por el hibridoma E6.4 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y la cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E6.4 evidenciaba la siguiente utilización de genes:

: V_{H} - 4-31

: D - A1/A4

: J_{H} - 4

: V\kappa - 012

: J\kappa - 2

Como se informa en el directorio de secuencias BASE V, se determinó que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen V\kappa era:

6

La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 17-20. La Figura 17 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E6.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-31 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E6.4 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 18 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 17 que fue clonada del hibridoma E6.4.

La Figura 19 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E6.4. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 012 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E6.4 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 20 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura19 que fue clonada del hibridoma E6.4.

Hibridoma E2.11

El anticuerpo secretado por el hibridoma E2.11 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como su secuencia de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H}, y la cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E2.11 evidenciaba la siguiente utilización de genes:

: V_{H} - 4-61

: D - XP1/21-10

: J_{H} - 4

: V\kappa - 018

: J\kappa - 4

Como se informa en el directorio de secuencias V BASE, se determinó que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen V_{H} 4-61 era:

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7

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La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 21-24. La Figura 21 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E2.11. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-61 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E2.11 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 22 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 21 que fue clonada del hibridoma E2.11.

La Figura 23 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E2.11. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E2.11 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 24 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 23 que fue clonada del hibridoma E2.11.

Hibridoma E6.3

El anticuerpo secretado por el hibridoma E6.3 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizo la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y la cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E6.3 evidenciaba la siguiente utilización de genes:

: V_{H} - 4-61

: D - 1-2rc

: J_{H} - 4

: V\kappa - 018

: J\kappa - 4

La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 25-28. La Figura 25 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-61 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 26 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 25 que fue clonada del hibridoma E6.3.

La Figura 27 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 es indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 28 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 27 que fue clonada del hibridoma E6.3.

Hibridoma E7.6.3

El anticuerpo secretado por el hibridoma E7.6.3 comprende un anticuerpo IgG2 humano que tiene una cadena ligera kappa humana. Los anticuerpos fueron analizados en cuanto a la información estructural relacionada con su utilización de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera, así como sus secuencias de aminoácidos. De este modo, se analizó la utilización de los genes de la cadena pesada V_{H}, D, y J_{H} y la cadena ligera V\kappa y J\kappa y también se analizaron las diferencias entre el producto codificado y la utilización de genes concreta. Por consiguiente, el anticuerpo secretado por el hibridoma E7.6.3 evidenciaba la siguiente utilización de genes:

: V_{H} 4-61

: D - XP4rc-XP1

: J_{H} - 3

: V\kappa - 018

: J\kappa - 4

La información de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos respecto a las cadenas pesadas y ligeras se proporciona más abajo con relación a las Figuras 29-32. La Figura 29 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada que es secretada por el hibridoma E7.6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable 4-61 de la cadena pesada y la secuencia de la cadena pesada secretada por E7.6. están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 30 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena pesada de la Figura 29 que fue clonada del hibridoma E7.6.3.

La Figura 31 es una secuencia de aminoácidos de una molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa que es secretada por el hibridoma E7.6.3. Las diferencias entre la secuencia codificada por el gen variable de la cadena ligera 018 y la secuencia de la cadena ligera secretada por E7.6.3 están indicadas en negrita y agrandadas. La secuencia contigua desde CDR1 a CDR3 está indicada mediante subrayado y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 están indicadas mediante doble subrayado.

La Figura 32 es una secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la molécula de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa de la Figura 31 que fue clonada del hibridoma E7.6.3.

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Ejemplo 4

Análisis de las Sustituciones de Aminoácidos de las Cadenas Pesadas y Ligeras

La Figura 33 proporciona una comparación de las comparaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo anti-EGF-r específico con la secuencia de aminoácidos del gen V_{H} concreto que codifica la cadena pesada del anticuerpo concreto. La Figura 34 proporciona una comparación similar de las comparaciones de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-EGF-r específico con la secuencia de aminoácidos del gen V\kappa concreto que codifica la cadena ligera del anticuerpo concreto. Como se observará, existen numerosas sustituciones de aminoácidos notablemente conservadas entre las secuencias de la cadena pesada y ligera. En particular, en las cadenas pesadas de los anticuerpos, todas las moléculas de la cadena pesada que están codificadas por genes de la familia V_{H} 4 y tienen una Glicina en la posición 10 en los anticuerpos codificados por V_{H} 4-31 y una Serina en la posición 10 en los anticuerpos codificados por V_{H} 4-61 están sustituidas con un Ácido Aspártico. Asimismo en las cadenas pesadas de V_{H} 4-31, todos los anticuerpos menos uno incluyen una Serina en la posición 7 en sustitución de Asparragina. Se observa una sustitución similar, aunque no tan predominante en la posición 35, donde una Serina en dos de los anticuerpos codificados por V_{H} 4-31 y dos de los anticuerpos codificados por V_{H} 4-61 es sustituida por una Asparragina. Asimismo, en dos de los anticuerpos codificados por V_{H} 4-31 y dos de los anticuerpos codificados por V_{H} 4-61 existen sustituciones en la posición 28, donde en cada caso, una Tirosina es sustituida por una Serina (E2.4) o una Histidina (E6.4, E2.11, y E7.6.3). Cinco de los anticuerpos, tres de los anticuerpos codificados por V_{H} 4-31 y dos de los anticuerpos codificados por V_{H} 4-61, poseen Valina por Leucina (E2.4 y E2.11) o Isoleucina (E2.5, E6.2, y E7.6.3) en la posición
50.

Con relación a las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras kappa, todas las secuencias están codificadas por genes de la familia V\kappa I, estando codificadas siete de las moléculas por genes 018 y una (E6.4) por un gen 012. Existe un alto grado de homología entre los productos de los genes 012 y 018, como se demuestra cuando se compara la molécula E6.4 con el producto del gen 018, junto con las otras moléculas, en la Figura 34. La molécula de E6.4 posee solamente dos sustituciones con relación al producto del gen 012, como se muestra en la Figura 19, y solamente 13 sustituciones con relación al producto del gen 018. Todos los anticuerpos poseen una sustitución en la posición 74 de CDR3 donde una Asparragina es sustituida por una Serina (E1.1, E2.5, E2.11, y E6.3), Histidina (E2.4, E6.2, y E7.6.3), o Arginina (E6.4). El resto de las sustituciones están menos conservadas. Sin embargo, numerosos anticuerpos parecen poseer sustituciones en las CDR. No obstante, es interesante observar que E7.6.3, que es un anticuerpo con afinidades muy altas, no posee sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera hasta cerca de CDR3 y dentro de CDR3.

Se apreciará que cada una de las sustituciones de aminoácidos identificada antes existe en íntima proximidad o dentro de una CDR. Podía parecer que tales sustituciones aportan cierto efecto sobre la unión del anticuerpo a la molécula receptora de EGF. Adicionalmente, tales sustituciones podrían tener un efecto significativo sobre la afinidad de los anticuerpos.

Como se ha discutido antes, se ha demostrado que los anticuerpos anti-EGF-r poseen ciertas actividades anti-tumorales. Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para determinar si los anticuerpos según la presente invención poseían tales actividades anti-tumorales.

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Ejemplo 5

Bloqueo de la unión de EGF y TGF-\alpha a Células A431 de Carcinoma Epidermoide Humano por Anticuerpos Anti-EGF-r in vitro

Se realizó un análisis in vitro para determinar si los anticuerpos según la presente invención eran capaces de bloquear la unión de EGF a una línea celular de carcinoma humano. El experimento se realizó para comparar la unión de los anticuerpos según la invención con el anticuerpo monoclonal de ratón 225 que, como se ha tratado antes, ha demostrado previamente actividad anti-cancerosa.

En este ejemplo, se utilizó la línea celular A431 de carcinoma epidermoide humano. La línea celular A431 es conocida por su elevado nivel de expresión de EGF-r (aproximadamente 2 X 10^{6} moléculas de EGF-r por célula). Por lo tanto, se requieren elevadas concentraciones de anticuerpos anti-EGF-r para saturar todos los sitios de unión. Los resultados de este ejemplo se muestran en la Figura 35. En la Figura, se demuestra el bloqueo de EGF marcado con I^{125} que se une a las células A431 de carcinoma epidermoide humano por medio de un anticuerpo anti-EGF-r humano in vitro. En la Figura, (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo anti-EGF-r según la invención (E7.6.3), (O) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, y (s) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico de control.

La Figura 36 muestra la inhibición de la unión de EGF a las células A431 de carcinoma epidermoide humano por medio de un panel de anticuerpos anti-EGF-r humanos in vitro cuando se compara con los controles 225, 528, e IgG2 humana no específica. En la Figura, (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, (o) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 528, (t) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E1.1, (s) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.4, (4) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.5, (3) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.6, (u) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E2.11, y (_) representa los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo IgG2 humano no específico, de control.

Los resultados indican que los anticuerpos según la invención pueden bloquear la unión de EGF a un EGF-r expresado en la superficie en células A431 mejor que los anticuerpos 225 y 528. Los anticuerpos según la invención parecen empezar la inhibición de la unión a una concentración 8 nM en comparación con una concentración 10 nM para el anticuerpo 225.

Con relación a la inhibición de la unión de TGF-\alpha, se observa una eficacia similar por medio del uso de anticuerpos según la invención cuando se comparan con el anticuerpo 225. La Figura 37 muestra la inhibición de la unión de TGF-\alpha a células A431 de carcinoma epidermoide humano por anticuerpos anti-EGF-r humanos in vitro, donde (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, (u) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E6.2, (1) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E6.3, (s) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E7.2, (n) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E7.10, (t) representa los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo E7.6.3, y (') representa los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo IgG2 humano no específico de control.

Los resultados indican que los anticuerpos según la invención pueden bloquear la unión de TGF-\alpha a un EGF-r expresado en la superficie en células mejor que el anticuerpo 225. Los anticuerpos según la invención parecen comenzar la inhibición de la unión a una concentración 0,1 nM en comparación con una concentración 1 nM para el anticuerpo 225.

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Ejemplo 6

Bloqueo de la Unión de EGF a Células SW948 de Adenocarcinoma de Colon Humano por Anticuerpos Anti-EGF-r Humanos in vitro

Se realizó otro análisis in vitro para determinar si los anticuerpos según la presente invención eran capaces de bloquear la unión de EGF a otra línea celular de carcinoma humano más. El experimento se realizó para comparar la unión de los anticuerpos según la invención con el anticuerpo monoclonal de ratón 225 que, como se ha comentado antes, tiene una actividad anti-cancerosa.

En este ejemplo, se utilizó la línea celular SW948 de adenocarcinoma de colon humano. Al contrario que la línea celular A431, la línea celular SW948 tiene una expresión de EGF-r relativamente baja sobre su superficie (aproximadamente 40.000 moléculas por célula). Por lo tanto, se requieren menos anticuerpos anti-EGF-r para saturar todos los sitios de unión de los receptores de las células. Los resultados de este ejemplo se muestran en la Figura 38. En la Figura, se demuestra el bloqueo de EGF marcado con I^{125} que se une a las células SW948 de adenocarcinoma de colon humano por un anticuerpo anti-EGF-r humano in vitro. En la Figura, (m) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo anti-EGF-r según la invención (E7.6.3), (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, y (s) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano no específico, de control.

Los resultados indican que el anticuerpo según la invención bloquea la unión de EGF a las células SW948 al menos tanto como el anticuerpo 225. De hecho, la curva mejora ligeramente con respecto al anticuerpo según la invención, mostrando inhibición a concentraciones más bajas que el anticuerpo 225.

Ejemplo 7

Inhibición del Crecimiento de Células SW948 de Adenocarcinoma de Colon Humano por Anticuerpos Anti-EGF-r Humanos in vitro

Los autores también llevaron a cabo un análisis in vitro para determinar si los anticuerpos según la invención eran capaces de inhibir el crecimiento de las células cancerosas, y hasta qué punto. El experimento se realizó para comparar la inhibición por los anticuerpos según la invención con la inhibición por el anticuerpo monoclonal de ratón 225 que, como se ha comentado antes, ha demostrado previamente actividad anti-cancerosa.

En este ejemplo, se utilizó la línea celular SW948 de adenocarcinoma de colon humano. En manos de los autores de la presente invención, solamente la línea celular SW948 mostraba un crecimiento celular dependiente de EGF. Por el contrario, la línea celular A431 mostraba una inhibición del crecimiento en presencia de EGF in vitro. Los resultados se muestran en la Figura 39 donde se demuestra que los anticuerpos anti-EGF-r humanos según la presente invención inhiben el crecimiento de las células SW948 in vitro. En la Figura, (m) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo anti-EGF-r según la invención (E7.6.3), (\Box) representa los resultados obtenidos por medio del anticuerpo monoclonal de ratón 225, y (s) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano no específico, de control.

Los resultados indican que el anticuerpo según la invención inhibe el crecimiento de las células SW948 al menos tanto como el anticuerpo 225. De hecho, la curva mejora ligeramente con respecto al anticuerpo según la invención, mostrando una inhibición aparente del 100% del crecimiento celular a aproximadamente 100 \mug/ml mientras el anticuerpo 225 parece estabilizarse a un nivel de inhibición entre el 80 y el 90% en el mismo intervalo de dosificación.

Ejemplo 8

Inhibición del Crecimiento de Carcinoma Epidermoide Humano en Ratones Atímicos por Anticuerpos Anti-EGF-r in vivo

En el presente experimento, los autores pretendían determinar si los anticuerpos según la presente invención eran capaces de inhibir el crecimiento de las células tumorales in vivo. En el experimento, se inoculó subcutáneamente la línea celular de carcinoma epidermoide humano A431 en ratones atímicos de 8 semanas. Se inyectaron 5 X 10^{6} células A431 en los ratones. Una de las dos dosificaciones de anticuerpo según la invención o uno de los dos controles se inyectaron intraperitonealmente el mismo día que se inocularon las células A431. Siguieron tres administraciones de anticuerpo o control y se realizó un seguimiento de los ratones en cuanto a la formación y tamaño de los tumores subcutáneos. Las dosificaciones de anticuerpo utilizadas fueron 1,0 mg o 0,2 mg. Los controles fueron o bien solución salina tamponada con fosfato o bien un anticuerpo IgG2 humano no específico.

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 40. En la Figura, la inhibición del crecimiento de las células de carcinoma epidermoide humano en ratones atímicos por medio del uso de anticuerpos anti-EGF-r humano según la invención in vivo es evidente. En la Figura, (s) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 1,0 mg de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E7.6.3) (n=5), (t) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 0,2 mg del anticuerpo E.7.6.3 (n=4), (\Box) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control (n=6), y (m) representa los resultados obtenidos utilizando solución salina tamponada con fosfato como control (n=6).

No se observó crecimiento tumoral en los animales tratados con el anticuerpo E7.6.3 mientras en los animales de control los tumores crecían significativamente a los 25 días de la inoculación de las células tumorales.

En el mismo experimento, se compararon tres anticuerpos según la invención. Los resultados se muestran en la Figura 41. Cada uno de los anticuerpos, E7.6.3 a 1 mg en 5 ratones y 0,2 mg en 4 ratones, E2.5 a 1 mg en 3 ratones y 0,2 mg en 3 ratones, y E1.1 a 1 mg en 3 ratones, demostraron inhibición de la formación de carcinoma epidermoide humano en los ratones en comparación con los controles. Todos los animales de control (incluyendo 6 animales tratados con PBS y 6 animales tratados con IgG2 humana) desarrollaron tumores significativos a los 19 días de la inoculación mientras ninguno de los animales tratados con los anticuerpos anti-EGF-r humanos según la invención desarrolló tumores a los 19 días de la inoculación.

La Figura 42 muestra los resultados del seguimiento de los animales de este mismo experimento mencionado antes durante 130 días después de la inoculación con el carcinoma epidermoide humano. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 42. En la Figura, se observará que todos los ratones de control habían desarrollado tumores a los 20 días de la inoculación de las células tumorales. En cambio, el primer ratón tratado con un anticuerpo según la presente invención que desarrolló un tumor lo hizo el día 70. El día 130, solamente 4 de los 15 animales experimentales habían desarrollado tumores. Interesantemente, ninguno de los animales experimentales tratados con la dosis de 0,2 mg del anticuerpo E2.5 desarrolló tumores en el período del ensayo.

El experimento anterior con relación a este Ejemplo 8 demuestra que los anticuerpos según la presente invención si se administran contemporáneamente a la inoculación de una línea celular tumoral parecen evitar casi completamente el inicio del crecimiento de las células tumorales y el inicio del tumor. Por otra parte, se observará que el efecto inhibidor del crecimiento de las células tumorales parece ser de larga duración.

Ejemplo 9

Erradicación del Crecimiento de Carcinoma Epidermoide Humano en Ratones Atímicos por Anticuerpos Anti-EGF-r in vivo

Si bien la prevención del crecimiento de las células tumorales y/o el establecimiento de un tumor, como se ha discutido antes con relación al ejemplo precedente, es un descubrimiento positivo, desde un punto de vista terapéutico, la erradicación de un tumor establecido es también muy deseable. Por consiguiente, en los siguientes experimentos los autores de la invención examinaron si los anticuerpos según la invención eran capaces de erradicar un tumor establecido en un mamífero. Los datos previos generados con relación al anticuerpo 225 indicaban que con el fin de erradicar eficazmente un tumor establecido por medio del uso del anticuerpo 225 era necesario complementar el tratamiento con un agente antineoplásico. De este modo, con relación a los experimentos de los autores de la presente invención, ellos consideraron el tratamiento con el anticuerpo solo y combinado con un tratamiento con agente antineoplásico.

En el experimento, se inocularon 5 x 10^{6} células de carcinoma epidermoide humano A431 subcutáneamente en ratones atímicos el día 0. Los ratones se trataron con anticuerpos, agentes quimioterapéuticos, y/o controles una vez que el tumor había tenido la oportunidad de establecerse (tamaño \geq 0,4 cm^{3}). Los tratamientos comenzaron y continuaron los días 5, 8, 10, 14, 16, y 21, administrándose la quimioterapia solamente los días 5 y 6. Las terapias consistían en un anticuerpo según la invención (E7.6.3), el agente antineoplásico doxorrubicina, y una combinación de anticuerpo y doxorrubicina. Los controles eran solución salina tamponada con fosfato o un anticuerpo IgG2 humano no específico. Cada grupo de tratamiento consistía en 5 animales. Los datos generados en los experimentos se muestran en la Figura 43, donde (s) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 1 mg de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E7.6.3) (n=5), (5) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 125 \mug of doxorrubicina, (V) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 1 mg de un anticuerpo anti-EGF-r según la presente invención (E7.6.3) combinado con una dosificación de 125 \mug of doxorrubicina, (n) representa los resultados obtenidos por medio de un anticuerpo IgG2 humano, no específico, de control, y (u) representa los resultados obtenidos utilizando solución salina tamponada con fosfato como control.

Como se observará, la administración del anticuerpo E7.6.3 combinado con doxorrubicina daba como resultado la completa erradicación del crecimiento tumoral. Adicionalmente, el crecimiento tumoral era completamente detenido por la administración del anticuerpo E7.6.3 solo.

En un experimento similar, cuyos resultados se muestran en la Figura 44, tras la inoculación del tumor, cinco ratones fueron tratados con 0,5 mg del anticuerpo E2.5 los días 5, 8, 10, 14, 16, y 21 y cinco ratones fueron tratados con una combinación del anticuerpo E2.5 administrado los días 5, 8, 10, 14, 16, y 21 y doxorrubicina administrada los días 5 y 6. En la Figura, (u) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 0,5 mg del anticuerpo anti-EGF-r humano E2.5, (n) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 125 \mug de doxorrubicina, (s) representa los resultados obtenidos con una dosificación de 0,5 mg de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la presente invención (E2.5) combinado con una dosificación de 125 \mug de doxorrubicina, (5) representa los resultados obtenidos utilizando solución salina tamponada con fosfato como control, y (V) representa los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo IgG2 humano no específico, de control.

Como se observará, la administración del anticuerpo E2.5 por sí mismo, o combinado con doxorrubicina, daba como resultado una erradicación casi completa de los tumores en ratones.

Ejemplo 10

Pruebas Clínicas en Humanos para el Tratamiento y la Diagnosis de Carcinomas Humanos por medio del uso de Anticuerpos Anti-EGF-r in vivo Introducción

Los anticuerpos según la presente invención están indicados en el tratamiento de ciertos tumores sólidos. Basándose en numerosos factores, incluyendo los niveles de expresión de EGF-r, entre otros, los siguientes tipos de tumores parecen presentar indicaciones preferidas: mama, ovario, colon, próstata, vejiga y cáncer de pulmón de células no pequeñas. Con relación a cada una de estas indicaciones, tres rutas clínicas parecen ofrecer distintos potenciales para el éxito clínico:

Terapia Accesoria: En la terapia accesoria, los pacientes serían tratados con anticuerpos según la presente invención combinados con un agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o terapia de radiación. Las dianas principales enumeradas antes se tratarán con el protocolo de adición de anticuerpos de la invención a la terapia de primera y segunda línea normalizada. Los diseños de protocolos proclamarán su eficacia evaluada por la reducción de la masa tumoral así como por la capacidad para reducir las dosis normales de quimioterapia normalizada. Estas reducciones de la dosificación permitirán una terapia adicional y/o prolongada reduciendo la toxicidad relacionada con la dosis del agente quimioterapéutico. Los anticuerpos anti-EGF-r de la técnica anterior han sido, o están siendo, utilizados en pruebas clínicas accesorias combinadas con los agentes quimioterapéuticos o antineoplásicos adriamicina (C225: carcinoma de próstata avanzado), cisplatino (C225: carcinomas de cabeza y cuello y pulmón avanzados), taxol (C225: cáncer de mama), y doxorrubicina (C225: preclínico).

Monoterapia: Con relación al uso de los anticuerpos según la presente invención en la monoterapia de tumores, los anticuerpos se administrarán a los pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. Los resultados preclínicos generados por medio del uso de los anticuerpos según la presente invención y tratados en la presente memoria han demostrado resultados similares con la terapia accesoria y/o la terapia única. Por otra parte, aparentemente la monoterapia se ha realizado clínicamente en paciente con cáncer en fase terminal con enfermedad metastásica extensa. Los pacientes parecían mostrar cierta estabilización de la enfermedad. Id. Las pruebas fueron diseñadas para demostrar un efecto en pacientes refractarios con tumores (cáncer).

Agente de Formación de Imágenes: Por medio de la unión de un radionúclido (p. ej., ytrio (Y^{90})) a los anticuerpos según la presente invención, se espera que los anticuerpos radiomarcados según la presente invención puedan ser utilizados como agentes para la formación de imágenes, para el diagnóstico. En semejante papel, los anticuerpos de la invención se localizarán tanto en los tumores sólidos, como en las lesiones metastásicas de las células que expresan el receptor de EGF. Con relación al uso de los anticuerpos de la invención como agentes formadores de imágenes, los anticuerpos pueden ser utilizados para ayudar en el tratamiento quirúrgico de los tumores sólidos, como escrutinio pre-quirúrgico y como post-operatorio después de determinar qué tumor permanece y/o reaparece. Se ha utilizado un anticuerpo C225-(I^{125}) como agente para la formación de imágenes en una prueba clínica en seres humanos en Fase I en pacientes que tienen carcinomas de pulmón de células escamosas no susceptibles de resección. Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991). Los pacientes fueron sometidos a seguimiento con una cámara gamma anterior y posterior normalizada. Los datos preliminares indicaban que todas las lesiones primarias y las lesiones metastásicas grandes fueron identificadas, mientras solamente la mitad de las lesiones metastásicas pequeñas (menos de 1 cm) fueron detectadas.

Dosis y Ruta de Administración

Si bien la dosificación específica para los anticuerpos según la invención todavía no ha sido determinada, ciertas consideraciones de la dosificación pueden ser determinadas por medio de la comparación con un producto similar (ImClone C225) que se encuentra en la medicina clínica. El anticuerpo C225 está siendo administrado típicamente con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m^{2}, utilizando las dosis más bajas solamente con relación a los estudios de seguridad. Los anticuerpos según la invención tienen una afinidad un orden logarítmico superior a la del anticuerpo C225. Adicionalmente, los anticuerpos según la presente invención son totalmente humanos, en comparación con la naturaleza quimérica del anticuerpo C225 y, de este modo, cabría esperar que el aclaramiento del anticuerpo fuera más lento. Por consiguiente, los autores de la presente invención podrían esperar que la dosificación en pacientes con los anticuerpos según la invención pueda ser menor, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m^{2}, y todavía ser eficaz. La dosificación en mg/m^{2}, en oposición a la medida convencional de las dosis en mg/kg, es una medición basada en el área de superficie y es una medición de la dosificación conveniente que está diseñada para incluir pacientes de todas las edades desde lactantes a adultos.

Se espera que tres enfoques de liberación distintos sean útiles para la liberación de los anticuerpos según la invención. La liberación intravenosa convencional será presumiblemente la técnica de liberación normalizada para la mayoría de los tumores. Sin embargo, con relación a los tumores en la cavidad peritoneal, tales como los tumores de ovarios, conducto biliar, otros conductos, y similares, se puede demostrar que la administración intraperitoneal es favorable para obtener una elevada dosis de anticuerpos en el tumor y minimizar el aclaramiento de anticuerpos. De una manera similar ciertos tumores sólidos poseen una vasculatura que es apropiada para la perfusión regional. La perfusión regional permitirá la obtención de una elevada dosis del anticuerpo en el sitio del tumor y minimizará el aclaramiento a corto plazo del anticuerpo.

Plan de Desarrollo Clínico (PDC)

Visión de Conjunto: El PDC seguirá y desarrollará tratamientos de anticuerpos anti-EGF-r según la invención con relación a la terapia accesoria, la monoterapia, y como agente para la formación de imágenes. Las pruebas se utilizarán inicialmente para demostrar la seguridad y después de eso se utilizarán para estudiar la eficacia a dosis repetidas. Las pruebas serán de marca abierta comparando la quimioterapia normalizada con la terapia normalizada más los anticuerpos según la invención. Como se apreciará, un criterio que se puede utilizar con relación a la inscripción de los pacientes puede ser el nivel de expresión de EGF-r de los tumores de los pacientes determinados en las
biopsias.

Como con cualquier infusión de proteína o anticuerpo, los asuntos terapéuticos, de seguridad están relacionados principalmente con (i) el síndrome de liberación de citocinas, esto es, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos, (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica a la sustancia (esto es, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente frente al anticuerpo terapéutico humano, o respuesta HAHA), y (iii) toxicidad a las células normales que expresan el receptor de EGF, p. ej., hepatocitos que expresan el EGF-r. Se utilizarán ensayos y seguimientos normalizados para controlar cada uno de estos asuntos de seguridad. En particular, la función del hígado será controlada frecuentemente durante las pruebas clínicas con el fin de evaluar la lesión del hígado, si la hubiera.

Prueba Clínica en Seres Humanos: Terapia Accesoria con Anticuerpo Anti-EGF-r Humano y Agente Quimioterapéutico

Se iniciará una prueba clínica en seres humanos en fase I para evaluar la seguridad de seis dosis intravenosas de un anticuerpo anti-EGF-r humano según la invención con relación al tratamiento de un tumor sólido, p. ej., cáncer de mama. En el estudio, se evaluará la seguridad de las dosis individuales de los anticuerpos según la invención cuando se utilizan como terapia accesoria a un agente antineoplásico o quimioterapéutico, tal como cisplatino, topotecan, doxorrubicina, adriamicina, taxol, o similares. El diseño de la prueba incluirá la liberación de seis dosis individuales de un anticuerpo según la invención con la dosificación a escala del anticuerpo desde aproximadamente 25 mg/m^{2} a aproximadamente 275 mg/m^{2} a lo largo del transcurso del tratamiento según el siguiente programa:

8

Los pacientes serán seguidos atentamente durante una semana después de cada administración del anticuerpo y la quimioterapia. En particular, los pacientes serán evaluados por las cuestiones de seguridad mencionadas antes: (i) síndrome de liberación e citocinas, esto es, hipotensión, fiebre, temblores, escalofríos, (ii) desarrollo de una respuesta inmunogénica a la sustancia (esto es, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente frente al anticuerpo terapéutico humano, o respuesta HAHA), y (iii) toxicidad a las células normales que expresan el receptor de EGF, p. ej., hepatocitos que expresan EGF-r. Se utilizarán ensayos y seguimientos normalizados para controlar cada una de estas cuestiones de seguridad. En particular, se controlará la función del hígado frecuentemente durante las pruebas clínicas con el fin de evaluar la lesión del hígado, si la hubiera.

Los pacientes también serán evaluados en cuanto a las consecuencias clínicas, y concretamente la reducción de la masa tumoral evidenciada por MRI u otra formación de imágenes.

Dando por sentada la demostración de la seguridad y una indicación de la eficacia, se iniciarían probablemente las pruebas en Fase II para explorar adicionalmente la eficacia y determinar la dosificación óptima.

Prueba Clínica en Seres Humanos: Monoterapia con Anticuerpo Anti-EGF-r Humano

Suponiendo que los anticuerpos según la presente invención parecen seguros con relación a la prueba accesoria mencionada antes, una prueba clínica en seres humanos para evaluar la eficacia y la dosificación óptima para la monoterapia. Semejante prueba se podría completar, y acarrearía los mismos análisis de seguridad y resultados, que la prueba accesoria descrita antes con la excepción de que los pacientes no recibirán quimioterapia concurrentemente con la recepción de dosis de anticuerpos según la invención.

Prueba Clínica en Seres Humanos: Formación de Imágenes de Diagnóstico con Anticuerpo Anti-EGF-r

Una vez más, suponiendo que la terapia accesoria mencionada antes parezca segura dentro de los criterios de seguridad mencionados antes, se puede realizar una prueba clínica en seres humanos referente al uso de los anticuerpos según la presente invención como agente para la formación de imágenes de diagnóstico. Se espera que el protocolo sea diseñado de una manera sustancialmente similar a la descrita por Divgi et al. en J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991).

Incorporación como referencia

Todas las referencias citadas en la presente memoria, incluyendo las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, libros de texto, y similares, y las referencias citadas en ellas, hasta el punto de que no están listas, se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad. Además, las siguientes referencias también se incorporan como referencia en la presente memoria en su totalidad, incluyendo las referencias citadas en tales referencias:

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Abgenix, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 38

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Abgenix, Inc.

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(B): CALLE: 7601 Dumbarton Circle

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUIDAD: Fremont

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(D): ESTADO: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: USA

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(F): CÓDIGO POSTAL: 94555

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(v): FORMA LEGIBLE CON EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: FastSEQ Versión 1.5

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD: 08/851,362

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-MAYO-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NUMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Hare, Christophe A

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NUMERO DE REGISTRO: 37,637

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: Cell 4.20

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 510-608-6533

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 510-608-6511

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTGCAGC TGGAGCAGTC IGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGAGGGAG TAGAGTCCTG AGGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 294 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 291 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 288 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 262 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 291 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 291 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 270 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 291 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 288 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 288 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 76 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 76 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 76 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 76 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 98 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

45

Claims

1. Un anticuerpo monoclonal totalmente humano contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF-r), que comprende

a): una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc mostrado en la Fig. 30 (SEQ ID NO: 17), y

b): una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera kappa que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADNc mostrado en la Fig. 32 (SEQ ID NO: 18).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende

a): la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 29 (SEQ ID NO: 37), y

b): la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 31 (SEQ ID NO: 38).

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG2 humano.

4. Una línea celular de hibridoma, que comprende

a): una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ADNc mostrada en la Fig. 30 (SEQ ID NO: 17), y

b): una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ADNc mostrada en la Fig. 32 (SEQ ID NO: 18).

5. La línea celular de hibridoma de la reivindicación 4, que secreta un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. El uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un tumor sólido.