PT1976877E - Anticorpos monoclonais contra proteína beta-amilóide e suas utilizações - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 976 877/ΡΤ DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais contra proteína beta-amilóide e suas utilizações" ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO Campo Técnico A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais (por exemplo, 8F5) que podem ser utilizados, por exemplo, na prevenção, tratamento e diagnóstico da doença de Alzheimer ou outros transtornos neurodegenerativos.
Estado da Técnica A doença de Alzheimer (DA) é um transtorno neurodegenerativo caracterizado por uma perda progressiva das capacidades cognitivas e por aspectos neuropatológicos caracteristicos compreendendo depósitos de amilóide, emaranhados neurofibrilares e perda neuronal em várias regiões do cérebro, vide Hardy e Selkoe (Science 297, 353 (2002); Mattson (Nature 431, 7004 (2004). Os principais constituintes dos depósitos de amilóide são os péptidos de beta-amilóide (A ) , sendo o tipo de 42 aminoácidos de comprimento (A 1-42) o mais proeminente.
Em particular, a proteína amilóide (1-42) é um polipéptido possuindo 42 aminoácidos que é derivada da proteína precursora de amilóide (APP) por processamento proteolítico. Isto também inclui, além das variantes humanas, isoformas da proteína amilóide fl2) presentes em organismos que não os humanos, em particular, outros mamíferos, especialmente ratos. Esta proteína, que tende a polimerizar num ambiente aquoso, pode estar presente em formas moleculares muito diferentes.
Uma correlação simples entre a deposição de proteína insolúvel e a ocorrência ou progressão de transtornos de demência tais como, por exemplo, a doença de Alzheimer, não se provou convincente (Terry e outros, Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991); Dickson e outros, Neurobiol. Aging 16, 285-298 (1995)). Em contraste, a perda de sinapses e de percepção 2 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ cognitiva parece correlacionar-se melhor com formas solúveis de A (1-42) (Lue e outros^m. J. Pathol. 155, 853-862 (1999);
McLean e outros, Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999 }) .
Embora tenham surgido no passado anticorpos policlonais e monoclonais contra A (1-42), nenhum provou produzir o efeito terapêutico desejado sem também causar sérios efeitos secundários em animais e/ou seres humanos. Por exemplo, resultados de imunização passiva de estudos pré-clínicos em ratinhos APP23 muito idosos que receberam um anticorpo anti-A (1-42) direccionado ao terminal N, uma vez por semana, durante 5 meses, indicaram um efeito secundário terapeuticamente relevante. Em particular, estes ratinhos apresentaram um aumento no número e na gravidade de micro-
hemorragias em comparação com ratinhos tratados com solução salina (Pfeifer e outros, Science 2002 298:1379) . Um aumento semelhante na hemorragia foi recentemente também descrito para ratinhos Tg2576 e PDAPP muito idosos (> 24 meses) (Wilcock e outros, J Neuroscience 2003, 23: 3745-51; Racke e outros, J
Neuroscience 2005, 25:629-636). Em ambas as estirpes, a injecção de anti-A (1-42) resultou num aumento significativo de micro-hemorragias. Assim, existe uma enorme necessidade terapêutica de desenvolvimento de substâncias biológicas que previnam ou retardem a progressão da doença sem induzir efeitos negativos e potencialmente letais no corpo humano.
Esta necessidade é particularmente evidente em face da crescente longevidade da população em geral e, com esse aumento, de uma elevação associada do número de pacientes diagnosticados anualmente com a doença de Alzheimer.
Adicionalmente, estes anticorpos permitirão o diagnóstico correcto da doença de Alzheimer num paciente que experimenta sintomas da mesma, um diagnóstico que, actualmente, apenas pode ser confirmado por autópsia. Adicionalmente, os anticorpos permitirão a elucidação das propriedades biológicas das proteínas e outros factores biológicos responsáveis por esta doença debilitante. WO 2004/067561 e WO 2004/067561 descrevem oligómeros A (1-42) estáveis (globulómeros A (1-42)) e anticorpos dirigidos especificamente contra os globulómeros (vide também Barghorn et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847). 3 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à matéria objecto definida nas reivindicações.
Assim, a presente invenção inclui um anticorpo isolado que se liga com especificidade maior a um globulómero da proteina beta-amilóide (A ) do que a um monómero da proteína beta-amilóide. Assim, é observada ligação preferencial. 0 anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, tal como, 8F5. A razão de especificidade de ligação ao globulómero versus ao monómero é de pelo menos 1,4. Em particular, a razão é preferivelmente de, pelo menos, cerca de 1,4 a, pelo menos, cerca de 16,9. (Uma razão de 1,0-17,5 incluindo os pontos finais é também considerada como estando dentro do escopo da presente invenção bem como as percentagens decimais entre as mesmas. Por exemplo, 1,1, 1,2, 1,3, ..., 2,0, 2,1, 2,2, ..., 17,1, 17,2, 17,3, 17,4, 17,5, bem como todos os números inteiros entre os mesmos e suas percentagens são considerados como estando dentro do escopo da presente invenção.) O monómero da proteína beta-amilóide pode ser, por exemplo, monómero A -f42) ou monómero A -flO) .
Adicionalmente, a presente invenção também engloba um anticorpo monoclonal (referido aqui como "8F5") produzido por um hibridoma possuindo número de designação na American Type Culture Collection, PTA-7238, bem como o hibridoma que produz esse anticorpo monoclonal (isto é, 8F5).
Adicionalmente, a presente invenção inclui um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada variável codificada pela SEQ ID NO: 1. Esse anticorpo pode ser murino, humano ou humanizado.
Adicionalmente, a presente invenção inclui um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia leve variável codificada pela SEQ ID NO: 2. Esse anticorpo pode ser também murino, humano ou humanizado. O anticorpo pode compreender, adicionalmente, uma cadeia leve-pesada variável codificada pela SEQ ID NO:l e pode ser humano ou humanizado.
Além disso, a presente invenção inclui um anticorpo monoclonal compreendendo a SEQ ID NO:3. O anticorpo pode ser murino, humano ou humanizado. 4 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Adicionalmente, a presente invenção engloba um anticorpo monoclonal compreendendo a SEQ ID NO:4. Esse anticorpo pode ser murino, humano ou humanizado. Esse anticorpo pode compreender, adicionalmente, a SEQ ID NO: 3 e pode ser murino, humano ou humanizado. A presente invenção também inclui um anticorpo isolado que se liga com especificidade maior a um globulómero de proteina beta-amilóide do que a uma fibrilha de proteina beta-amilóide. Esse anticorpo pode ser, por exemplo, monoclonal e pode ser o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma possuindo o número de designação na American Type Culture
Collection, PTA-7243. Os hibridomas que produzem esses anticorpos monoclonais também se encontram dentro do escopo da presente invenção.
Adicionalmente, a presente invenção inclui um anticorpo no qual pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade (CDR) da cadeia pesada variável é seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7.
Além disso, a presente invenção também inclui um anticorpo no qual pelo menos uma das CDR da cadeia leve variável é seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10. Esse anticorpo pode compreender, adicionalmente, pelo menos uma CDR da cadeia pesada variável seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7.
Adicionalmente, a presente invenção refere-se aos anticorpos da invenção para utilização num método para tratar ou prevenir a doença de Alzheimer num paciente que precise do tratamento ou prevenção. Esse método compreende a administração ao paciente, de qualquer um ou mais dos anticorpos isolados descritos acima, numa quantidade suficiente para efectuar o tratamento ou prevenção. O anticorpo isolado pode ser administrado, por exemplo, através de uma via seleccionada do grupo que consiste em administração intramuscular, administração intravenosa e administração subcutânea. A presente invenção também inclui um método para diagnosticar a doença de Alzheimer num paciente com suspeita 5
ΕΡ 1 976 877/PT dessa doença. Esse método compreende as etapas de: 1) contacto de uma amostra biológica do referido paciente com pelo menos um dos anticorpos descritos acima por um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos antigénio/anticorpo; e 2) detecção da presença dos complexos antigénio/anticorpo na referida amostra, a presença dos complexos indicando um diagnóstico de doença de Alzheimer no paciente. 0 antigénio pode ser, por exemplo, um globulómero ou uma porção ou fragmento do mesmo que possua as mesmas propriedades funcionais do globulómero completo (por exemplo, actividade de ligação)
Adicionalmente, a presente invenção inclui outro método para o diagnóstico da doença de Alzheimer num paciente com suspeita dessa doença. Esse método compreende as etapas de: 1) contacto de uma amostra biológica do referido paciente com um antigénio por um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos anticorpo/antigénio; 2) adição de um conjugado aos complexos anticorpo/antigénio resultantes por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o conjugado se ligue ao anticorpo ligado, onde o conjugado compreende um dos anticorpos descritos acima, ligado a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e 3) detecção da presença de um anticorpo que possa estar presente na amostra biológica, por detecção de um sinal gerado pelo composto gerador de sinal, o sinal indicando um diagnóstico de doença de Alzheimer no paciente. 0 antigénio pode ser um globulómero ou uma porção ou fragmento do mesmo possuindo as mesmas propriedades funcionais que o globulómero completo (por exemplo, actividade de ligação) A presente invenção inclui um método adicional para o diagnóstico da doença de Alzheimer num paciente suspeito de sofrer de doença de Alzheimer. Esse método compreende as etapas de: 1) contacto de uma amostra biológica do referido paciente com anti-anticorpo, onde o anti-anticorpo é especifico para um dos anticorpos descritos acima, por um tempo e sob condições suficientes para permitir a formação de complexos anti-anticorpo/anticorpo, os complexos contendo anticorpo presente na amostra biológica; 2) adição de um conjugado aos complexos anti-anticorpo/anticorpo resultantes, por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o conjugado se ligue ao anticorpo ligado, onde o conjugado 6 ΕΡ 1 976 877/PT compreende um antigénio, que se liga a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e 3) detecção de um sinal gerado pelo composto gerador de sinal, o sinal indicando um diagnóstico de doença de Alzheimer no paciente.
Adicionalmente, a presente invenção inclui uma composição compreendendo um ou mais dos anticorpos descritos acima (por exemplo, 8F5), em particular para utilização num método para prevenir ou tratar a doença de Alzheimer num paciente que precise de tal prevenção ou tratamento. Esse método compreende a etapa de administração ao paciente da composição descrita imediatamente acima, numa quantidade suficiente para efectuar a prevenção ou tratamento.
Adicionalmente, a presente invenção engloba uma vacina compreendendo pelo menos um dos anticorpos descritos acima e um adjuvante farmaceuticamente aceitável, em particular para utilização num método adicional para prevenir ou tratar a doença de Alzheimer num paciente que precise de tal prevenção ou tratamento. Esse método compreende a etapa de administração ao paciente da vacina citada acima, numa quantidade suficiente para efectuar a prevenção ou tratamento.
Adicionalmente, a presente invenção engloba um método para identificação de compostos apropriados para imunização activa de um paciente com previsão de desenvolvimento da doença de Alzheimer. Esse método compreende: 1) exposição de um ou mais compostos de interesse a um ou mais dos anticorpos descritos acima por um tempo e sob condições suficientes para que o um ou mais compostos se liguem ao anticorpo ou aos anticorpos; 2) identificação dos compostos que se ligam ao anticorpo ou aos anticorpos, sendo os compostos identificados destinados a serem usados em imunização activa num paciente com previsão de desenvolvimento da doença de Alzheimer.
Também, a presente invenção inclui um kit compreendendo: a) pelo menos um dos anticorpos isolados descritos acima e b) um conjugado compreendendo um anticorpo ligado a um composto gerador de sinal, onde o anticorpo do conjugado é diferente do anticorpo isolado. 0 kit pode incluir também uma bula de embalagem com instruções sobre como os componentes do kit devem ser utilizados. 7
ΕΡ 1 976 877/PT A presente invenção também engloba um kit compreendendo: a) um anti-anticorpo para um dos anticorpos descritos acima e b) um conjugado compreendendo um antigénio ligado a um composto gerador de sinal. 0 antigénio pode ser um globulómero ou um fragmento ou porção do mesmo possuindo as mesmas caracteristicas funcionais que o globulómero (por exemplo, actividade de ligação). Novamente, o kit pode incluir também uma bula de embalagem com instruções sobre como os componentes do kit devem ser utilizados.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra a selectividade de 8F5 para globulómeros versus monómeros de A (1-42), A (1-40) e sAPP. Os factores de selectividade para 8F5 podem ser calculados como as razões entre os valores de EC50 (versus monómero A -(-12) em HFIP: 555, 8/90, 74 = 6, 1; versus monómero A (1-42) em ]p]H: 1007/90, 74 = 11, 1 ; versus monómero A -(-40): 667, 8/90, 74 = 7,4 versus sAPP: >100) A Figura 2 ilustra a análise SDS-PAGE de anticorpos de cadeia leve e pesada ligados a fibrilhas (pistas 4, 6, 8) e fracções livres não ligadas correspondentes (pistas 3, 5, 7) nos sobrenadantes. A Figura 3 ilustra o teor de A 42 e A 40 em amostras de FCE de pacientes com Comprometimento Cognitivo Leve (CCL, esquerda) ou doença de Alzheimer (DA, direita). Em ambos os grupos, pode ser observado que o 8F5 capta uma proporção maior de A (1-42) e uma quantidade menor ou igual de A (1-40), se comparado com o anticorpo padrão 6E10 ou comparado com a análise directa da amostra com os mesmos ELISA. A Figura 4 ilustra um índice de reconhecimento de novos objectos como o tempo despendido com um objecto desconhecido versus um objecto familiar em três grupos de ratinhos transgénicos para APP (isto é, 6G1, 8F5, PBS) e um grupo da mesma ninhada não transgénicos (tipo selvagem). Os animais (número dado abaixo das colunas) foram imunizados com anticorpos monoclonais 6G1 ou 8F5 ou tratados com veículo (isto é, solução salina tamponada com fosfato; PBS e tipo selvagem) por injecção intraperitoneal uma vez por semana durante três semanas. No dia da última injecção, foi realizada uma tarefa de reconhecimento de novos objectos. A diferença 8 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ entre os grupos de PBS e tipo selvagem indicou um défice cognitivo dos ratinhos transgénicos para APP nesse paradigma. Os ratinhos que receberam injecção de PBS tiveram um desempenho de nível aleatório (isto é, não significativamente diferente de 50), enquanto todos os outros ratinhos mostraram reconhecimento do objecto (teste t, estrelas). Quando o desempenho dos ratinhos APP tratados com anticorpo foi comparado com grupos de controlo, foi observada uma diferença significativa versus ratinhos tratados com PBS, mas não versus ratinhos do tipo selvagem (ANOVA com teste-t post-hoc; círculos) indicando que o tratamento com anticorpo inverteu o défice cognitivo nesses ratinhos transgénicos para APP. A Figura 5(A) ilustra a sequência de ADN (SEQ ID NO:l) da cadeia pesada variável que codifica o anticorpo monoclonal referido aqui como "8F5", e a Figura 5(B) ilustra a sequência de ADN (SEQ ID N0:2) da cadeia leve variável que codifica o anticorpo monoclonal 8F5. (Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) são sublinhadas em cada sequência; vide também a Figura 6.) A Figura 6 (A) ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) da cadeia pesada variável do anticorpo monoclonal 8F5 e a Figura 6(B) ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) da cadeia leve variável do anticorpo monoclonal 8F5. Uma CDR da cadeia pesada variável é representada pela sequência de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO:5). Outra CDR da cadeia pesada variável é representada pela sequência de aminoácidos ASINSNGGSTYYPDSVKG (SEQ ID NO:6) e outra CDR da cadeia pesada variável é representada pela sequência de aminoácidos SGDY (SEQ ID NO:7). Uma CDR da cadeia leve variável é representada pela sequência de aminoácidos RSSQSLVYSNGDTYLH (SEQ ID NO:8). Outra CDR da cadeia leve variável é representada pela sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO:9) e outra CDR da cadeia leve variável é representada pela sequência de aminoácidos SQSTHVPWT (SEQ ID NO:10). Todas as CDR descritas acima estão sublinhadas nas figuras 6(A) e 6(B). A Figura 7 mostra a ligação dos anticorpos, em diferentes concentrações, a secções transversais dos neocórtices de pacientes da doença de Alzheimer (DA) ou ratinhos transgénicos APP idosos. Em particular, a Figura 7 (A) ilustra a verificação de depósitos de amilóide por coloração com 9 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Vermelho do Congo como placas no tecido cerebral e como angiopatia amilóide cerebral (CAA) nos vasos cerebrais na linhagem de ratinho transgénico APP Tg2576 e num paciente de DA (RZ55). A Figura 7(B) ilustra que a coloração dos depósitos parenquimatosos de A (placas amilóides) num paciente de DA (RZ16) ocorre apenas com 6G1 e com o anticorpo comercialmente disponível 6E10, enquanto 8F5 e 8C5 (anticorpo de referência) mostram coloração consideravelmente mais fraca. A Figura 7(C) mostra que a coloração forte dos depósitos parenquimatosos de A (placas amilóides) em ratinhos TG2576 ocorre apenas com 6G1 e com o anticorpo comercialmente disponível 6E10, enquanto 8F5 e 8C5 mostram coloração consideravelmente mais fraca. As figuras 7(D)-(G) ilustram a quantificação da análise da coloração da placa A nas imagens histológicas empregando análise de imagens. Os valores de densidade óptica (0% = ausência de coloração) foram calculados a partir dos valores de escala de cinzentos de placas subtraídos dos valores de escala de cinzentos do tecido de fundo. (Fig. (D) = ligação de 0,7 g/ml de anticorpo no ratinho Tg2576; Fig. (E) = ligação de 0,07-0,7 g/ml de anticorpo no ratinho APP/L; Fig. (F) = ligação de 0,7 gií de anticorpo num paciente de DA (RZ55) ; e Fig. (G) = ligação de 0,07-0,7 g/ml de anticorpo num paciente de DA (RZ16)). As diferenças entre a coloração dos anticorpos disponíveis comercialmente 6E10 (estrelas) e 4G8 (círculos) e os anticorpos 6G1, 8C5 e 8F5 (um asterisco/círculo: p < 0,05, dois asteriscos/círculos: p < 0,01 e três asteriscos/círculos: p < 0,001 versus controlo; teste-t de Bonferroni post-hoc após ANOVA com p < 0,001) foram estatisticamente avaliadas (Fig. (D) e Fig. (E) ) . Nas Figuras (E) e (G) , os anticorpos 8C5 e 8F5 mostraram sempre coloração menos significativa do que os anticorpos 6E10 e 4G8 disponíveis comercialmente (p < 0,05 no teste-t post-hoc após p < 0,001 em ANOVA) . A Figura (H) ilustra que a coloração mais forte dos depósitos vasculares de A (setas) ocorre apenas com 6G1 e com o anticorpo 6E10 disponível comercialmente, enquanto a coloração com 8F5 ou 8C5 foi muito mais fraca. Uma situação qualitativamente semelhante foi encontrada no ratinho Tg2576 (não mostrado aqui) . A Figura 8 ilustra a selectividade de 8C5 (anticorpo de referência) para globulómeros versus monómeros de A (1-42), A (1-40) e sAPP. Os factores de selectividade para 8C5 podem ser calculados como razões entre valores de EC50 (versus 10 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ monómero A (1-42) em HFIP: 2346/568,2 = 4, 1 yersus monómero A (1-42) em |IHH: >100; versus monómero A (1-40) : >100 versus sAPP : >100) A Figura 9(A) ilustra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:11) que codifica a cadeia pesada de 8C5 (anticorpo de referência) e a figura 9(B) ilustra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:12) que codifica a cadeia leve de 8C5. As sequências de nucleótidos que codificam as CDR correspondentes, referidas nas Figuras 10(A) e 10(B), estão sublinhadas.
A Figura 10 (B) ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:19) da cadeia pesada variável do anticorpo monoclonal 8C5 (anticorpo de referência), e a figura 10(B) ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:20) da cadeia leve variável do anticorpo monoclonal 8F5. Uma CDR da cadeia pesada variável é representada pela sequência de aminoácidos SYGMS (SEQ ID NO:13). Outra CDR da cadeia pesada variável é representada pela sequência de aminoácidos SIKNNGGSTYYPOSLKG (SEQ ID NO:14), e outra CDR da cadeia pesada variável é representada pela sequência de aminoácidos SGDY (SEQ ID NO: 15) . Uma CDR da cadeia leve variável é representada pela sequência de aminoácidos RSSQSLVHSNGDTFLH (SEQ ID NO:16). Outra CDR da cadeia leve variável é representada pela sequência de aminoácidos KVSNRFS (SEQ ID NO:17), e outra CDR da cadeia leve variável é representada pela sequência de aminoácidos SQSIHVPWT (SEQ ID NO:18). Todas as CDR descritas acima estão sublinhadas nas Figuras 10(A) e 10 (B).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal, referido aqui como "8F5", bem como a outros anticorpos relacionados. Esses anticorpos podem ser usados, por exemplo, no diagnóstico, prevenção e tratamento da doença de Alzheimer e de outros transtornos neurodegenerativos. O anticorpo monoclonal 8F5 possui muitas propriedades interessantes que lhe permitem ser um candidato terapêutico extremamente interessante, bem como, um candidato para diagnóstico extremamente útil. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 8F5 apresenta ligação preferencial aos globulómeros A (1-42) em comparação com monómeros ou fibrilhas. 11
ΕΡ 1 976 877/PT Ο termo "A (X-Y)" refere-se aqui à sequência de aminoácidos desde a posição de aminoácido X até à posição de aminoácido Y da proteína -amilóide humana incluindo X e Y e, em particular, refere-se à sequência de aminoácidos desde a posição de aminoácido X até à posição de aminoácido Y da sequência de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA ou qualquer uma de suas variantes de ocorrência natural, em particular aquelas com pelo menos uma mutação seleccionada do grupo consistindo em A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T e A42V, onde os números são relativos à posição inicial do péptido A , incluindo tanto a posição X como a posição Y ou uma sequência com até três substituições de aminoácido adicionais, nenhuma das quais podendo impedir a formação do globulómero. Uma substituição de aminoácido "adicional" é definida aqui como qualquer desvio à sequência canónica que não é encontrado na natureza.
Mais especificamente, o termo "A (1-42)" refere-se aqui à sequência de aminoácidos desde a posição de aminoácido 1 à posição de aminoácido 42 da proteína -amilóide humana incluindo 1 e 42 e, em particular, refere-se até à sequência de aminoácidos desde a posição de aminoácido 1 até à posição de aminoácido 42 da sequência de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA (correspondendo às posições de aminoácidos 1 a 42) ou qualquer uma de suas variantes de ocorrência natural. Tais variantes podem ser, por exemplo, aquelas com pelo menos uma mutação seleccionada do grupo consistindo em A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T e A42V onde os números são relativos ao inicio do péptido A , incluindo 1 e 42 ou uma sequência com até três substituições de aminoácido adicionais, nenhuma das quais podendo impedir a formação do globulómero. Da mesma forma, o termo "A (1-40)" refere-se aqui à sequência de aminoácidos desde a posição de aminoácido 1 até à posição de aminoácido 40 da proteína -amilóide humana incluindo 1 e 40 e refere-se, em particular, à sequência de aminoácidos desde a posição de aminoácido 1 até à posição de aminoácido 40 da sequência de aminoácidos DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV ou qualquer uma de suas variantes de ocorrência natural. Tais variantes incluem, por exemplo, aquelas com pelo menos um mutação seleccionada do grupo consistindo em A2T, H6R, D7N, 12
ΕΡ 1 976 877/PT A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian") e D23N ("Iowa") onde os números são relativos à posição inicial do péptido A , incluindo 1 e 40 ou uma sequência com até três substituições de aminoácido adicionais, nenhuma das quais podendo impedir a formação do globulómero. O termo "globulómero A (X-Y)" (também conhecido como "oligómero globular A (X-Y)") refere-se aqui a uma associação solúvel, globular, não covalente de péptidos A (X-Y), conforme definido acima, possuindo homogeneidade e caracteristicas físicas distintas. Os globulómeros A (X-Y) são agrupamentos oligoméricos estáveis, não fibrilares de péptidos A (X-Y) que são obtidos por incubação com detergentes aniónicos. Em contraste com o monómero e com as fibrilhas, estes globulómeros são caracterizados por números agrupados definidos de subunidades (por exemplo, formas agrupadas iniciais, n=3-6, "oligómeros A", e formas agrupadas tardias, n=12-14, "oligómeros B", conforme descrito na Publicação de Pedido Internacional PCT número WO 04/067561). Os globulómeros possuem uma estrutura tridimensional do tipo globular ("glóbulo fundido", vide Barghorn e outros, 2005, J. Neurochem, 95, 834-847). Podem ser adicionalmente caracterizados por um ou mais dos seguintes aspectos: • susceptibilidade de clivagem de aminoácidos N-terminais X-23 por proteases promíscuas (tais como termolisina ou endoproteinase GluC) originando formas truncadas dos globulómeros A (X-Y); • não acessibilidade dos aminoácidos C-terminais 24-Y pelas proteases promíscuas e anticorpos; e • formas truncadas destes globulómeros mantêm a estrutura tridimensional nuclear dos globulómeros com uma acessibilidade melhor ao epítopo nuclear A (20-Y) na sua conformação do globulómero.
De acordo com a invenção e, em particular, com a finalidade de avaliar as afinidades de ligação dos anticorpos da presente invenção, o termo "globulómero A (X-Y)" refere-se aqui a um produto que é obtido por um processo conforme descrito na Publicação de Pedido Internacional número WO 04/067561. O processo compreende o desdobramento de um péptido A (X-Y) natural, recombinante ou sintético, ou um seu derivado; a exposição do péptido A (X-Y) parcialmente 13 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ desdobrado ou seu derivado, a um detergente, a redução da acção do detergente e a continuação da incubação.
Para a finalidade de desdobramento do péptido podem-se deixar actuar sobre a proteina agentes que quebram as ligações de hidrogénio, tais como, por exemplo, hexafluoro-isopropanol (HFIP). Tempos de acção de alguns minutos, por exemplo cerca de 10 a 60 minutos, são suficientes quando a temperatura de acção é de cerca de 20 a 50°C e, em particular, cerca de 35 a 40°C. A dissolução subsequente do resíduo evaporado até à secura, preferivelmente na forma concentrada, em solventes orgânicos apropriados miscíveis com tampões aquosos, tais como, por exemplo, sulfóxido de dimetilo (DMSO), resulta numa suspensão do péptido pelo menos parcialmente desdobrado, ou seu derivado, que pode ser usada subsequentemente. Caso necessário, a suspensão-mãe pode ser armazenada a uma temperatura baixa, por exemplo, cerca de -20°C, por um período transitório.
Alternativamente, o péptido ou o seu derivado podem ser tomados em solução ligeiramente ácida, preferivelmente aquosa, por exemplo, uma solução aquosa de HC1 a cerca de 10 mM . Após um tempo de incubação de cerca de alguns minutos, os componentes insolúveis são removidos por centrifugação. Alguns minutos a 10 000 g são recomendáveis. Estas etapas do método são preferivelmente realizadas à temperatura ambiente, isto é, uma temperatura na gama de 20 a 30°C. O sobrenadante obtido após centrifugação contém o péptido A (X-Y) ou um seu derivado e pode ser armazenado a baixa temperatura, por exemplo, a cerca de -20°C, por um período transitório. A exposição seguinte a um detergente refere-se à oligomerização do péptido ou do seu derivado para originar o tipo intermediário de oligómeros (na Publicação de Pedido Internacional número WO 04/067561 referidos como oligómeros A). Para essa finalidade, deixa-se um detergente actuar sobre o péptido, opcionalmente, pelo menos parcialmente desdobrado ou seu derivado, até ser produzido oligómero intermediário suficiente. É dada preferência à utilização de detergentes iónicos, em particular detergentes aniónicos.
De acordo com uma concretização particular, é utilizado um detergente com a fórmula (I): 14
ΕΡ 1 976 877/PT R-X, onde o radical "R" é um alquilo ramificado ou não ramificado possuindo 6 a 20 e preferivelmente 10 a 14 átomos de carbono ou alcenilo ramificado ou não ramificado possuindo 6 a 20 e preferivelmente 10 a 14 átomos de carbono, e o radical "X" é um grupo ácido ou seu sal, sendo X preferivelmente seleccionado entre -COCTM+, -S03dyi+ e é, mais preferivelmente, -OSC>3-M+, e M+ é um catião de hidrogénio ou um catião inorgânico ou orgânico preferivelmente seleccionado dos catiões de metais alcalinos, catiões de metais alcalino-terrosos e catiões amónio. São mais vantajosos os detergentes com a fórmula (I) nos quais R é um alquilo não ramificado dos quais se mencionam em particular os radicais alqu-l-ilo. É dada preferência particular ao dodecilsulfato de sódio (SDS). O ácido láurico e o ácido oleico podem também ser utilizados com vantagem. O sal de sódio do detergente lauroilsarcosina (também conhecido como sarcosilo NL-30 ou Gardol®) é também particularmente vantajoso. O tempo de acção do detergente, em particular, depende se ou não, e em caso afirmativo, em que extensão, o péptido ou seu derivado submetidos a oligomerização sofreram desdobramento. Se, de acordo com a etapa de desdobramento, o péptido ou o seu derivado tiverem sido tratados antecipadamente com um agente que quebra ligações de hidrogénio (isto é, em particular com hexafluoro-isopropanol), tempos de acção na gama de algumas horas, vantajosamente de cerca de 1 a 20 e, em particular de cerca de 2 a 10 horas, são suficientes quando a temperatura de acção é de cerca de 20 a 50°C e, em particular, de cerca de 35 a 40°C. Se um péptido menos desdobrado ou essencialmente não desdobrado, ou um seu derivado, forem o ponto de partida, são recomendáveis tempos de acção correspondentemente mais longos. Se o péptido ou o seu derivado tiverem sido pré-tratados, por exemplo, de acordo com o procedimento indicado acima como alternativa ao tratamento com HFIP ou o péptido ou o seu derivado forem submetidos directamente à oligomerização, tempos de acção na gama de cerca de 5 a 30 horas e, em particular de cerca de 10 a 20 horas são suficientes quando a temperatura de acção for de cerca de 20 a 50°C e, em particular de cerca de 35 a 40°C. Após incubação, os componentes insolúveis são vantajosamente 15 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ removidos por centrifugação. São recomendáveis alguns minutos a 10 000 g. A concentração de detergente a escolher depende do detergente usado. Se for utilizado SDS, é recomendável uma concentração na gama de 0,01 a 1% em peso, preferivelmente de 0,05 a 0,5% em peso, por exemplo, de cerca de 0,2% em peso. Se for utilizado ácido láurico ou ácido oleico, são recomendáveis concentrações um pouco maiores, por exemplo na gama de 0,05 a 2% em peso, preferivelmente de 0,1 a 0,5% em peso, por exemplo, de cerca de 0,5% em peso. A acção do detergente deverá ter lugar a uma concentração salina aproximadamente na gama fisiológica. Assim, em particular, são recomendáveis concentrações de NaCl na gama de 50 a 500 mM, preferivelmente de 100 a 200 mM e mais particularmente de cerca de 140 mM.
A redução subsequente da acção do detergente e a continuação da incubação referem-se à oligomerização adicional para originar o globulómero A (X-Y) da invenção (na Publicação de Pedido Internacional número WO 04/067561 referido como oligómero B). Uma vez que a composição obtida da etapa precedente contém regularmente detergente e uma concentração salina na gama fisiológica, é portanto recomendável reduzir a acção do detergente e, preferivelmente, também a concentração salina. Isto pode ser realizado por redução da concentração do detergente e do sal, por exemplo, por diluição apropriada com água ou com um tampão de menor concentração salina, por exemplo, Tris-HCl, pH 7,3. Factores de diluição na gama de cerca de 2 a 10, vantajosamente na gama de cerca de 3 a 8 e, em particular, de cerca de 4, provaram-se apropriados. A redução na acção do detergente pode também ser obtida por adição de substâncias que podem neutralizar essa acção do detergente. Exemplos destas incluem substâncias capazes de complexar com os detergentes, como substâncias capazes de estabilizar células no decurso de medidas de purificação e extracção, por exemplo, copolímeros de blocos EO/PO particulares, em particular o copolímero de blocos com a marca registada Pluronic® F68. Podem ser igualmente usados alquilfenóis alcoxilados, e em particular etoxilados, tais como, os t-octilfenóis etoxilados da série Triton® X, em particular Triton® X100, 3-(3-colamidopropildimetilamónio)-1- propanossulfonato (CHAPS®) ou ésteres gordos de sorbitano alcoxilados, e em particular etoxilados, tais como os da série 16 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Tween®, em particular, Tween® 20, em gamas de concentração ao redor ou acima da concentração micelar critica especifica.
Subsequentemente, a solução é incubada até ter sido produzido suficiente globulómero A (X-Y). Tempos de acção na gama de várias horas, preferivelmente na gama de cerca de 10 a 30 horas e, em particular, na gama de cerca de 15 a 25 horas, são suficientes quando a temperatura de acção é de cerca de 20 a 50°C e, em particular, de cerca de 35 a 40°C. A solução pode ser então concentrada e os possíveis resíduos podem ser removidos por centrifugação. Novamente, são recomendáveis alguns minutos a 10 000 g. O sobrenadante obtido após centrifugação contém um globulómero A tX) conforme aqui descrito.
Um globulómero A -fX) pode ser finalmente recuperado, por exemplo, por ultrafiltração, diálise, precipitação ou centrifugação. É adicionalmente preferido que a separação electroforética dos globulómeros A (X-Y) sob condições desnaturantes, por exemplo, por SDS-PAGE, produza uma banda dupla (por exemplo, com um peso molecular aparente de 38/48 kDa para A (1-42) e especialmente preferido que mediante tratamento com glutardialdeído dos oligómeros, antes da separação, essas duas bandas se fundam numa só. É também preferido que a cromatografia de exclusão por tamanho dos globulómeros resulte num único pico (por exemplo, correspondendo a um peso molecular de aproximadamente 60 kDa para A (1-42)). Partindo do péptido Al-f42) , o processo é, em particular, apropriado para obtenção dos globulómeros A (1-42).
Preferivelmente, o globulómero apresenta afinidade para células neuronais e exibe também efeitos neuromoduladores.
Um "efeito neuromodulador" é definido como um efeito inibidor de longa duração de um neurónio conduzindo a uma disfunção do neurónio em relação a plasticidade neuronal.
De acordo com outro aspecto da invenção, o termo "globulómero A (X-Y)" refere-se aqui a um globulómero consistindo essencialmente em subunidades A (X-Y), onde é preferido que, em média, pelo menos 11 de 12 subunidades sejam do tipo A (X-Y) , mais preferivelmente, que menos do que 10% dos globulómeros compreendam quaisquer péptidos diferentes de 17
ΕΡ 1 976 877/PT A (X-Y) e, mais preferivelmente, que o teor de péptidos diferentes de A (X-Y) na preparação esteja abaixo do limite de detecção. Mais especificamente, o termo "globulómero A (1-42)" refere-se aqui a um globulómero compreendendo unidades A (1-42) conforme definido acima; o termo "globulómero A (12-42) refere-se aqui a um globulómero compreendendo unidades A (12-42) conforme definido acima; e o termo "globulómero A (20-42)" refere-se aqui a um globulómero compreendendo unidades A (20-42) conforme definido acima. O termo "globulómero A (X-Y) reticulado" refere-se aqui a uma molécula que pode ser obtida a partir de um globulómero A (X-Y) conforme descrito acima por reticulação, preferivelmente, reticulação química, mais preferivelmente reticulação por aldeído e, mais preferivelmente, reticulação por glutardialdeído, das unidades constituintes do globulómero. Em outro aspecto da invenção, um globulómero reticulado é essencialmente um globulómero onde as unidades estão, pelo menos parcialmente, unidas por ligações covalentes, ao invés de estarem mantidas unidas apenas por interacções não covalentes. A expressão "derivado de globulómero A -(-¥) " refere-se aqui, em particular, a um globulómero que é marcado por ligação covalente a um grupo que facilita a detecção, preferivelmente, um fluoróforo, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, proteína fluorescente de Aequorea victoria, proteína fluorescente de Dictyosoma ou qualquer sua combinação ou seus derivados activos em termos de fluorescência; um cromóforo; um quimioluminóforo, por exemplo, luciferase, preferivelmente luciferase de Photinus pyralis, luciferase de Vibrio fischeri ou qualquer sua combinação ou seus derivados activos em termos de quimioluminescência; um grupo enzimaticamente activo, por exemplo, peroxidase tal como, peroxidase de rábano ou um seu derivado enzimaticamente activo; um grupo electronicamente denso, por exemplo, um grupo contendo metais pesados, tal como, um grupo contendo ouro; um hapteno, por exemplo, um hapteno derivado de fenol; uma estrutura fortemente antigénica, por exemplo, sequência peptídica que se prevê ser antigénica, tal como pelo algoritmo de Kolaskar e Tongaonkari; um aptâmero para outra molécula; um grupo quelante, por exemplo, hexa-histidinilo; uma estrutura de proteína natural ou derivada da natureza que medeia 18 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ interacções proteína-proteína especificas adicionais, por exemplo, um membro do par fos/jun; um grupo magnético, por exemplo, um grupo ferromagnético; ou um grupo radioactivo, tal como, um grupo compreendendo ΧΗ, 14C, 32P, 35S ou 125I ou qualquer sua combinação; ou a um globulómero sinalizado por ligação covalente ou interacção de alta afinidade não covalente, preferivelmente, ligação covalente a um grupo que facilita a inactivação, o sequestro, a degradação e/ou a precipitação, preferivelmente sinalizado com um grupo que promove degradação in vivo, mais preferivelmente, com ubiquitina, onde é particularmente preferido que este oligómero sinalizado seja montado in vivo; ou a um globulómero modificado por qualquer combinação dos anteriores. Estes grupos de marcação e sinalização e os métodos para a sua ligação às proteínas são conhecidos na técnica. A marcação e/ou a sinalização podem ser realizadas antes, durante ou após a globulomerização. Em outro aspecto da invenção, um derivado de globulómero é uma molécula obtida a partir de um globulómero por uma reacção de marcação e/ou sinalização. Correspondentemente, a expressão "derivado de monómero A (X-Y) " refere-se aqui, em particular, a um monómero A que é marcado ou sinalizado conforme descrito para o globulómero. A expressão "afinidade maior" refere-se aqui a um grau de interacção onde o equilíbrio entre anticorpo não ligado e globulómero não ligado, por um lado, e complexo anticorpo-globulómero, por outro lado, está mais a favor do complexo. Da mesma forma, a expressão "afinidade menor" refere-se aqui a um grau de interacção onde o equilíbrio entre anticorpo não ligado e globulómero não ligado, por um lado, e complexo anticorpo-globulómero, por outro lado, está mais a favor do anticorpo não ligado e do globulómero não ligado. 0 termo "monómero A (X-Y)" refere-se aqui à forma isolada do péptido A fXj , preferivelmente, uma forma do péptido A (X-Y) que não está comprometida em interacções essencialmente não covalentes com outros péptidos A . Na prática, o monómero A -fX) é geralmente proporcionado na forma de uma solução aquosa. Preferivelmente, a solução aquosa de monómero contém 0,05% a 0,2%, mais preferivelmente, cerca de 0,1% de NaOH quando usada, por exemplo, para determinar a afinidade de ligação do anticorpo da presente invenção. Em outra situação preferida, a solução aquosa de monómero contém 19 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 0,05% a 0,2%, mais preferivelmente, cerca de 0,1% de NaOH. Quando utilizada, pode ser expedito diluir a solução de um modo apropriado. Adicionalmente, é geralmente recomendável utilizar a solução dentro de duas horas, em particular dentro de uma hora e, especialmente, dentro de 30 minutos após sua preparação. O termo "fibrilha" refere-se aqui a uma estrutura molecular que compreende agrupamentos de péptidos A (X-Y) individuais, associados não covalentemente, que apresentam uma estrutura fibrilar ao microscópio electrónico, que ligam vermelho do Congo, exibem bi-refringência sob luz polarizada e cujo padrão de difracção de raios-X é uma estrutura cruzada. A fibrilha pode também ser definida como uma estrutura molecular que pode ser obtida por um processo que compreende a agregação polimérica auto-induzida de um péptido A apropriado, na ausência de detergentes, por exemplo, em HC1 0,1 M, conduzindo à formação de agregados com mais de 24, preferivelmente com mais de 100 unidades. Esse processo é conhecido na especialidade. De modo recomendável, a fibrilha A (X-Y) é utilizada na forma de uma solução aquosa. Numa concretização particularmente preferida da invenção, a solução aquosa de fibrilhas é produzida por dissolução do péptido A em |HH a 0,1%, diluição 1:4 com NaH2P04 20 mM,
NaCl 140 mM, pH 7,4, seguidas por reajuste do pH para 7,4, incubação da solução a 37°C por 20 horas, seguida por centrifugação a 10 000 g por 10 minutos e ressuspensão em NaH2P04 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. O termo "fibrilha de A (X-Y)" refere-se aqui a uma fibrilha compreendendo subunidades A (X-Y) onde é preferido que, em média, pelo menos 90% das subunidades sejam do tipo A (X-Y) , é mais preferido que pelo menos 98% das subunidades sejam do tipo A (X-Y) e, mais preferido, que o teor dos péptidos diferentes de A (X-Y) estejam abaixo do limite de detecção.
Voltando ao 8F5, conforme evidenciado pela Figura 1, bem como ao 8C5 (Figura 8), os anticorpos específicos para globulómeros A (1-42), anticorpos monoclonais 8F5 e 8C5 reconhecem predominantemente formas de globulómero A (1-42) e não preparações padrão de monómeros A (1-40) ou A (1-42) incluindo A (1-42) agregado, ao contrário dos anticorpos não 20 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ específicos 6G1 e 6Ε10. Em particular, o 8F5 detecta globulómeros A (1-42) apenas por PAGE nativWestern blot e não por análise de SDS-PAGE-Pi/estern blot indicando ligação a um epítopo de inter-subunidade dissociável por detergente mais complexo na estrutura do globulómero A (1-42) nuclear. Um epítopo de inter-subunidade é definido como um epítopo complexo, não linear no espaço, localizado em pelo menos duas subunidades. Mais especificamente, a análise dot-blot contra várias preparações padrão de A (1-42) e A (1-40) mostrou diferenças significativas no reconhecimento das formas de globulómero A (1-42)versus A não globulomérica (preparação padrão de monómero A (1-40)/(1-42), A (1-42) agregado) para 8FS e 8C5 específicos, mas não para os anticorpos 6G1 e 6E10 não específicos para isoformas. A especificidade para o globulómero de 8F5 e de 8C5, mas não de 6G1 e 6E10, foi confirmada por quantificação da ligação do globulómero A (1-42), do monómero A (1-42), do monómero A (1-40) e da proteína alfa precursora amilóide solúvel em ensaios ELISA em sanduíche. Adicionalmente, uma vez que estes anticorpos acedem ao globulómero após Western blotting nativo mas não após SDS Western blotting, é provável que cada anticorpo reconheça um epitopo não linear estrutural entre as subunidades na região dos aminoácidos 20 a 30 de A (1-42). Esta especificidade para com globulómeros é importante porque atingir especificamente a forma globulomérica de A com um anticorpo com preferência para globulómeros, tal como, por exemplo, 8F5 ou 8C5: 1) evitará atingir depósitos amilóides insolúveis, aos quais a ligação pode ser responsável por efeitos secundários inflamatórios observados durante as imunizações com A insolúvel; 2) poupará os monómeros de A e APP que são reportados como possuindo funções fisiológicas pré-cognitivas (Plan e outros, J. of Neuroscience 23:5531-5535 (2003); e 3) aumentará a biodisponibilidade do anticorpo, uma vez que ele não será obscurecido ou inacessível através de ligação extensa aos depósitos insolúveis. A presente invenção também divulga sequências de nucleótidos isoladas (ou seus fragmentos) que codificam as cadeias leve e pesada variáveis do anticorpo monoclonal 8F5, bem como as sequências de nucleótidos (ou seus fragmentos) que possuem sequências compreendendo, correspondendo, idênticas, hibridáveis ou complementares em pelo menos cerca de 70% (por exemplo, 70% 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% ou 79%), 21 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ preferivelmente pelo menos cerca de 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% ou 89%), e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade, com essas sequências de nucleótidos de codificação. (Todos os números inteiros (e suas porções ) entre, e incluindo, 70% e 100% são considerados como estando dentro do escopo da presente invenção em relação à percentagem de identidade). Estas sequências podem ser derivadas de qualquer fonte (por exemplo, isoladas de uma fonte natural, produzidas através de uma via semi-sintética, ou sintetizadas de novo). Em particular, estas sequências podem ser isoladas ou derivadas de fontes que não as descritas nos exemplos (por exemplo, bactérias, fungos, algas, ratinho ou seres humanos)
Além das sequências de nucleótidos descritas acima, a presente invenção também divulga sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada variáveis do anticorpo monoclonal 8F5 (ou fragmentos dessas sequências de aminoácidos). Adicionalmente, a presente invenção também divulga sequências de aminoácidos (ou seus fragmentos) compreendendo, correspondendo, idênticas ou complementares em pelo menos cerca de 70%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade em relação às sequências de aminoácidos das proteínas da presente invenção. (Novamente, todos os números inteiros (e suas porções) entre e incluindo 70% e 100% (conforme citado em relação às identidades de sequências de nucleótidos citadas acima) são também consideradas como estando dentro do escopo da presente invenção em relação à percentagem de identidade).
Para fins da presente invenção, um "fragmento" de uma sequência de nucleótidos é definido como uma sequência contígua de aproximadamente pelo menos 6, preferivelmente pelo menos cerca de 8, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 nucleótidos e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 15 nucleótidos correspondendo a uma região da sequência de nucleótidos especificada. O termo "identidade" refere-se à relação entre duas sequências numa base nucleótido-a-nucleótido ao longo de uma janela ou segmento de comparação específico. Assim, a identidade é definida como o grau de semelhança, 22 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ correspondência ou equivalência entre as mesmas cadeias (de sentido directo ou anti-sentido) de dois segmentos de ADN (ou duas sequências de aminoácidos) . A "percentagem de identidade de sequência" é calculada por comparação de duas sequências optimamente alinhadas ao longo de uma região especifica, determinando o número de posições nas quais a base ou aminoácido idênticos ocorrem em ambas as sequências, a fim de obter o número de posições coincidentes, dividindo o número destas posições pelo número total de posições no segmento que se está a comparar e multiplicando o resultado por 100. O alinhamento óptimo das sequências pode ser conduzido pelo algoritmo de Smith & Waterman, Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:2444 (1988) e pelos programas de computador que implementam os algoritmos relevantes (por exemplo, Clustal Macaw Pileup (http://cmgm.stanford.edu/biochem218/llMultiple.pdf; Higgins e outros, CABI0S. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul e outros, Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) ou GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). (vide a Patente US 5,912,120).
Para fins da presente invenção, "complementaridade" é definida como o grau de relação entre dois segmentos de ADN. É determinada por medição da capacidade da cadeia de sentido directo de um segmento de ADN de hibridar com a cadeia anti-sentido de outro segmento de ADN, sob condições apropriadas para formar uma hélice dupla. Um "complemento" é definido como uma sequência que emparelha com uma dada sequência com base nas regras de emparelhamento de bases canónicas. Por exemplo, uma sequência A-G-T numa cadeia nucleotídica é "complementar" a T-C-A na outra cadeia.
Na hélice dupla, a adenina aparece numa cadeia, a timina aparece na outra cadeia. Similarmente, sempre que a guanina se encontra numa cadeia, a citosina encontra-se na outra. Quando maior a relação entre as sequências de nucleótidos de dois segmentos de ADN, maior a capacidade de formar dúplices híbridos entre as cadeias dos dois segmentos de ADN. 23 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ "Similaridade" entre duas sequências de aminoácidos é definida como a presença de uma série de resíduos de aminoácido idênticos, bem como conservados, em ambas as sequências. Quanto maior o grau de similaridade entre duas sequências de aminoácidos, maior a correspondência, semelhança ou equivalência das duas sequências. ("Identidade entre duas sequências de aminoácidos é definida como a presença de uma série de resíduos de aminoácido exactamente semelhantes ou invariantes em ambas as sequências). As definições de "complementaridade", "identidade" e "semelhança" são bem conhecidas das pessoas competentes na matéria. "Codificado por" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma sequência polipeptídica, onde a sequência polipeptídica ou uma sua porção contêm uma sequência de aminoácidos de pelo menos 3 aminoácidos, mais preferivelmente de pelo menos 8 aminoácidos e, ainda mais preferivelmente pelo menos 15 aminoácidos de um polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico.
Adicionalmente, uma molécula de ácido nucleico é "hibridável" com outra molécula de ácido nucleico quando uma forma em cadeia simples da molécula do ácido nucleico pode hibridar com outra molécula de ácido nucleico sob condições apropriadas de temperatura e força iónica (vide Sambrook e outros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)). As condições de temperatura e força iónica determinam o "rigor" ou "estringência" da hibridação. 0 termo "hibridação", conforme usado aqui, é usado genericamente para significar hibridação de ácidos nucleicos em condições apropriadas de estringência, conforme será prontamente evidente para os peritos na especialidade dependendo da natureza da sequência sonda e das sequências alvo. As condições de hibridação e lavagem são bem conhecidas na especialidade e o ajuste das condições dependendo da estringência desejada por variação do tempo de incubação, da temperatura e/ou da força iónica da solução é prontamente conseguido. Vide, por exemplo, Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, conforme citado acima. (Vide também Short Protocols in Molecular Biology, ed. 24
ΕΡ 1 976 877/PT
Ausubel e outros e Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "OverView of Principies of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays" (1993). Especificamente, a escolha das condições é ditada pelo comprimento das sequências que estão a ser hibridadas, em particular, o comprimento da sequência sonda, o teor relativo de G-C dos ácidos nucleicos e a quantidade de erros de emparelhamento a serem permitidos. Condições de baixa estringência, ou baixo rigor, são preferidas quando se deseja hibridação parcial entre cadeias que possuem graus menores de complementaridade. Quando é desejada uma complementaridade perfeita ou quase perfeita, são preferidas condições de alta estringência, ou alto rigor. Para as condições típicas de estringência alta, a solução de hibridação contém S.S.C. 6X, EDTA 0,01 M, solução de Denhardt lx e SDS a 0,5%. A hibridação é realizada a cerca de 68 graus Celcius durante cerca de 3 a 4 horas para fragmentos de ADN clonados e durante cerca de 12 a cerca de 16 horas para ADN eucariota total. Para estringências moderadas, pode ser utilizada pré-hibridação em filtros e hibridação com uma solução de cloreto de sódio 3x, citrato de sódio (SSC), formamida a 50% (0,1 M desse tampão a pH 7,5) e solução de Denhardt 5x. Pode-se então pré-hibridar a 37 graus Celcius durante 4 horas, seguindo-se hibridação a 37 graus Celcius com uma quantidade de sonda marcada igual a 3 000 000 cpm no total durante 16 horas, seguindo-se uma lavagem com SSC 2x e solução de SDS a 0,1%, uma lavagem de 4 vezes, durante 1 minuto cada, à temperatura ambiente e 4 vezes a 60 graus Celcius durante 30 minutos cada. Após a secagem segue-se a exposição à película. Para estringências inferiores, a temperatura de hibridação é reduzida para cerca de 12 graus Celcius abaixo da temperatura de fusão (Tm) do dúplex. Sabe-se que a Tm é uma função do teor de G-C e do comprimento do dúplex, bem como da força iónica da solução. A "hibridação" requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares. Contudo, dependendo da estringência da hibridação, podem ocorrer erros de emparelhamento entre bases. Conforme citado acima, a estringência apropriada para hibridação de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação. Estas variáveis são bem conhecidas na especialidade. Mais especificamente, quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas 25
ΕΡ 1 976 877/PT sequências nucleotídicas, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos possuindo essas sequências. Para o cálculo de Tm para híbridos de mais de 100 nucleótidos de comprimento foram deduzidas equações (vide Sambrook e outros, supra). Para hibridação com ácidos nucleicos mais curtos, a posição de erros de emparelhamento torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleótido determina sua especificidade (vide Sambrook e outros, supra).
Conforme usado aqui, um "fragmento ou uma sequência de ácido nucleico isolados" são polímeros de ARN ou ADN que são em cadeia simples ou dupla, opcionalmente contendo bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucleico isolado na forma de um polímero de ADN pode ser constituído por um ou mais segmentos de ADNc, ADN genómico ou ADN sintético. (Um "fragmento" de um polinucleótido especifico refere-se a uma sequência polinucleotídica que compreende uma sequência contígua de aproximadamente de pelo menos 6 nucleótidos , preferivelmente pelo menos cerca de 8 nucleótidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 nucleótidos e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 15 nucleótidos e, o mais preferível, pelo menos cerca de 25 nucleótidos idênticos ou complementares a uma região da sequência de nucleótidos especifica). Os nucleótidos (geralmente na sua forma de 5' -monofosfato) são referidos pela sua designação de uma letra como se segue: "A" para adenilato ou desoxiadenilato (para ARN ou ADN, respectivamente), "C" para citidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato ou desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G) , "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina e "N" para qualquer nucleótido.
As expressões "fragmento ou subfragmento que é funcionalmente equivalente" e "fragmento ou subfragmento funcionalmente equivalentes" são usadas aqui indiferentemente. Estas expressões refere-se a uma porção ou subsequência de um fragmento de ácido nucleico isolado no qual a capacidade de alterar a expressão génica ou produzir um determinado fenótipo é mantida quer o fragmento ou subfragmento codifique ou não uma enzima activa. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento pode ser usado no desenho de construções quiméricas para produzir o fenótipo desejado numa planta transformada. 26 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Construções quiméricas podem ser desenhadas para uso em co-supressão ou anti-sentido por ligação a um fragmento de ácido nucleico ou seu subfragmento, quer codifique ou não uma enzima activa, na orientação apropriada em relação a uma sequência promotora da planta.
Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente semelhante" e "substancialmente correspondente" são usados aqui indiferentemente. Referem-se a fragmentos de ácido nucleico onde alterações numa ou mais bases nucleotidicas não afectam a capacidade do fragmento do ácido nucleico de mediar a expressão génica ou produzir um determinado fenótipo. Estes termos também se referem a modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente invenção, tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos, que substancialmente não alteram as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante em relação ao fragmento inicial, não modificado. Fica portanto entendido, conforme os peritos na especialidade notarão, que a invenção engloba mais do que as sequências exemplificativas especificas. "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteina especifica, incluindo sequências reguladoras precedendo (sequências não codificantes a 5') e seguindo (sequências não codificantes a 3') a sequência de codificação. "Gene nativo" refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. Em contraste "construção quimérica" refere-se a uma combinação de fragmentos de ácido nucleico que não são normalmente encontrados juntos na natureza. Consequentemente, uma construção quimérica pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, porém dispostas de modo diferente em relação ao modo normalmente encontrado na natureza. (0 termo "isolada" significa que a sequência está removida de seu ambiente natural) .
Um gene "estranho" refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência génica. Genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos num 27 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ organismo não nativo ou construções quiméricas. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. "Sequência de codificação" refere-se a uma sequência de ADN que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras" refere-se às sequências de nucleótidos localizadas a montante (sequências não codificantes a 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes a 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, o processamento ou a estabilidade do ARN, ou a tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir, porém não lhes estão limitadas, promotores, sequências de comendo de tradução, intrões e sequências de reconhecimento de poliadenilação. "Promotor" ou "sequência génica reguladora" refere-se a uma sequência de ADN capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou ARN funcional. A sequência consiste em elementos a montante proximais e mais distais, estes últimos elementos frequentemente referidos como melhoradores. Consequentemente, um "melhorador" é uma sequência de ADN que pode estimular a actividade da sequência génica reguladora ou promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para melhorar o nivel ou especificidade relativamente ao tecido de um promotor. As sequências promotoras podem também estar localizadas dentro das porções transcritas dos genes e/ou a jusante das sequências transcritas. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo ou ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de ADN sintéticos. Fica entendido pelos peritos na especialidade que promotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em tecidos ou tipos de célula diferentes ou em estágios diferentes de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de célula hospedeira na maioria das vezes são geralmente referidos como "promotores constitutivos". Novos promotores de vários tipos úteis nas células de plantas estão contentemente a ser descobertos; vários exemplos podem ser encontrados na compilação de Okamuro e Goldberg, Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989) É 28
ΕΡ 1 976 877/PT adicionalmente reconhecido que uma vez que na maioria dos casos os limites exactos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de ADN com alguma variação podem ter actividade promotora idêntica.
Um "intrão" é uma sequência interveniente num gene que não codifica uma porção da sequência da proteína. Assim, estas sequências são transcritas para o ARN mas são depois excisadas e não são traduzidas. 0 termo é também usado para as sequências de ARN excisadas. Um "exão" é uma porção da sequência génica que é transcrita e é encontrada no ARN mensageiro maduro derivado do gene, porém não é necessariamente uma parte da sequência que codifica o produto génico final. A "sequência de comando de tradução" refere-se a uma sequência de ADN localizada entre a sequência promotora de um gene e a sequência de codificação. A sequência de comando de tradução está presente no ARNm completamente processado a montante da sequência de início de tradução. A sequência de comando de tradução pode afectar o processamento do transcrito primário em ARNm, a estabilidade ou a eficiência de tradução do ARNm. Exemplos de sequências de comando de tradução foram descritos (Turner, R. e Foster, G.D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225).
As "sequências não codificantes a 3'" referem-se às sequências de ADN localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificando sinais reguladores capazes de afectar o processamento do ARNm ou expressão génica. 0 sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado por afectar a adição dos traços do ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de ARNm. 0 uso de diferentes sequências não codificantes a 3' é exemplificado por Ingelbrecht e outros, Plant Cell 1:671-680 (1989). "Transcrito de ARN" refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada por ARN-polimerase de uma sequência de ADN. Quando o transcrito de ARN é uma cópia complementar perfeita da sequência de ADN, é referido como transcrito primário, ou pode ser uma sequência de ARN derivada de processamento pós-transcrição do transcrito primário e é referido como ARN maduro. "ARN mensageiro (ARNm)" refere-se ao 29
ΕΡ 1 976 877/PT ARN que está sem intrões e que pode ser traduzido na proteína pela célula. "ADNc" refere-se a um ADN que é complementar a, e é sintetizado a partir de um molde de ARNm usando a enzima transcriptase inversa. 0 ADNc pode ser de cadeia simples ou convertido na forma de cadeia dupla usando o fragmento de Klenow da ADN-polimerase I. ARN de "sentido directo" refere-se ao transcrito de ARN que inclui o ARNm e pode ser traduzido na proteína dentro de uma célula ou in vitro. "ARN anti-sentido" refere-se a um transcrito de ARN que é complementar a todo ou parte de um transcrito primário ou ARNm alvo e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente US 5,107,065). A complementaridade de um ARN anti-sentido pode ser com qualquer parte do transcrito do gene específico, isto é, na sequência não codificante a 5', na sequência não codificante a 3', nos intrões ou na sequência de codificação. "ARN funcional" refere-se ao ARN anti-sentido, ao ARN de ribozimas ou a outro ARN que não possa ser traduzido mas ainda possui efeito nos processos celulares. Os termos "complemento" e "complemento inverso" são utilizados aqui indiferentemente em relação a transcritos de ARNm e destina-se a definir o ARN anti-sentido da mensagem. A expressão "ARN endógeno" refere-se a qualquer ARN que é codificado por qualquer sequência de ácido nucleico presente no genoma do hospedeiro antes da transformação com a construção recombinante da presente invenção, seja de ocorrência natural ou não natural, isto é, introduzido por meios recombinantes, mutagénese, etc. A expressão "não de ocorrência natural" significa artificial, não consistente com o que é normalmente encontrado na natureza. A expressão "ligado operativamente" refere-se à associação de sequências do ácido nucleico num único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de uma é regulada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de regular a expressão dessa sequência de codificação (isto é, a transcrição da sequência de codificação está sob controlo do promotor). As sequências de codificação podem estar ligadas operativamente às sequências reguladoras numa orientação de sentido directo ou anti-sentido. Em outro exemplo, as regiões 30 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ de ARN complementares da invenção podem estar ligadas operativamente, tanto directa como indirectamente, a 5' do ARNm alvo ou a 3' do ARNm alvo ou dentro do ARNm alvo, ou uma primeira região complementar está a 5' e o seu complemento está a 3' em relação ao ARNm alvo. O termo "expressão", conforme usado aqui, refere-se à produção de um produto final funcional. A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do ARNm num precursor ou numa proteina madura. "Inibição anti-sentido" refere-se à produção de transcritos de ARN de anti-sentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. "Co-supressão" refere-se à produção dos transcritos de ARN de sentido directo capazes de suprimir a expressão de genes idênticos ou substancialmente semelhantes, estranhos ou endógenos (Patente US 5,231,020)
Proteína "madura" refere-se a um polipéptido processado pós-tradução ; isto é, um do qual quaisquer pré- ou pró-péptidos presentes no produto de tradução primário tenham sido removidos. Proteína "precursora" refere-se ao produto primário de tradução do ARNm; isto é, com pré- e pró-péptidos ainda presentes. Os pré- e pró-péptidos podem ser, porém não lhes estão limitados, os sinais de localização intracelular. "Transformação estável" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para um genoma de um organismo hospedeiro, resultando em hereditariedade geneticamente estável. Em contraste, "transformação transitória" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo, ou organelos contendo ADN, de um organismo hospedeiro, resultando em expressão génica sem integração ou hereditariedade estável. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgénicos". O termo "transformação" como usado aqui refere-se tanto à transformação estável como à transformação transitória.
As técnicas padrão de ADN recombinante e de clonagem molecular usadas aqui são bem conhecidas na especialidade e estão descritas mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (doravante "Sambrook"). 31 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ Ο termo "recombinante" refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de sequência de outro modo separados, por exemplo, por sintese química ou por manipulação de segmentos isolados dos ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética. "PCR" ou "Reacção em Cadeia pela Polimerase" é uma técnica para a síntese de grandes quantidades de segmentos de ADN específicos, consiste numa série de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT) . Tipicamente, o ADN em cadeia dupla é desnaturado por calor, os dois iniciadores complementares às fronteiras a 3' do segmento alvo são hibridados a temperatura baixa e depois alongados a uma temperatura intermédia. Um conjunto destas três etapas consecutivas é referido como um ciclo. A reacção em cadeia pela polimerase ("PCR") é uma técnica poderosa usada para ampliar ADN milhões de vezes, por replicação repetida de um molde, num curto período de tempo. (Mullis e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich e outros, Pedido de Patente Europeia número 50 424; Pedido de Patente Europeia número 84 796; Pedido de Patente Europeia número 258 017; Pedido de Patente Europeia número 237 362; Mullis, Pedido de Patente Europeia número 201 184; Mullis e outros, Patente US 4,683,202; Erlich, Patente US 4,582,788; e Saiki e outros, Patente US 4,683,194) O processo utiliza conjuntos de oligonucleótidos sintetizados in vitro, específicos, para iniciar a síntese de ADN. O desenho dos iniciadores depende das sequências de ADN que vão ser analisadas. A técnica é realizada através de muitos ciclos (geralmente 20-50) de fusão do molde a alta temperatura, permissão para que os iniciadores hibridem com sequências complementares dentro do molde e depois replicação do molde com ADN-polimerase.
Os produtos das reacções de PCR são analisados por separação em géis de agarose seguida por coloração com brometo de etídio e visualização com transiluminação de UV. Alternativamente, podem ser adicionados dNTP radioactivos à PCR a fim de incorporar um marcador nos produtos. Nesse caso, os produtos da PCR são visualizados por exposição do gel à película de raio x. A vantagem adicional da radiomarcação dos 32 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ produtos da PCR é que os níveis dos produtos de ampliação individuais podem ser quantificados.
As expressões "construção recombinante", "construção de expressão" e "construção de expressão recombinante" são usadas aqui indiferentemente. Essas expressões referem-se a uma unidade funcional de material genético que pode ser inserida no genoma de uma célula usando metodologia padrão bem conhecida de um perito na especialidade. Esta construção pode ser ela própria, ou ser usada em conjunto com, um vector. Se for usado um vector, então a escolha do vector depende do método que será usado para transformar as plantas hospedeiras, como é bem conhecido dos peritos na especialidade. Por exemplo, pode ser usado um plasmídeo. 0 perito na especialidade tem conhecimento dos elementos genéticos que têm que estar presentes no vector a fim de transformar, seleccionar e propagar com sucesso as células hospedeiras compreendendo qualquer dos fragmentos de ácido nucleico isolados da invenção. 0 perito na especialidade também reconhecerá que eventos de transformação independentes e diferentes resultarão em níveis e padrões de expressão diferentes (Jones e outros, (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida e outros, (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), e portanto que terão que ser rastreados múltiplos eventos a fim de se obter linhas que apresentam o nível e o padrão de expressão desejados. Tal rastreio pode ser realizado por análise Southern do ADN, análise Northern da expressão de ARNm, análise Western da expressão da proteína ou análise fenotípica.
Um "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a uma entre uma preparação de moléculas de anticorpo contendo anticorpos que partilham uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada comum e de cadeia leve comum, em contraste com um anticorpo de uma preparação de anticorpos "policlonais" que contém uma mistura de diferentes anticorpos. Os anticorpos monoclonais podem ser gerados por várias novas tecnologias como exibição em fagos, bactérias, leveduras ou ribossomas, bem como métodos clássicos exemplificados por anticorpos derivados de hibridomas (por exemplo, um anticorpo segregado por um hibridoma preparado por tecnologia de hibridomas, tal como a metodologia de hibridomas padrão de Kohler e Milstein ((1975) Nature 256:495-497). Assim, um anticorpo agonista não 33 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ derivado de hibridomas da invenção ainda é referido como um anticorpo monoclonal embora possa ter sido derivado por metodologias não clássicas.
Um "anticorpo isolado", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos possuindo especificidades antigénicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a um globulómero está substancialmente isento de anticorpos que se ligam especif icamente a antigénios que não um globulómero). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um globulómero pode, contudo, possuir reactividade cruzada em relação a outros antigénios. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou substâncias químicas. A expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), conforme usada aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio. Foi mostrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Estas concretizações de anticorpos podem também ser de formatos biespecíficos, duplamente específicos ou multiespecíficos; que se ligam especificamente a dois ou mais antigénios diferentes. Os exemplos de fragmentos de ligação englobados na expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2/ um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto na região de charneira; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAB (Ward e outros, (1989) Nature 341:544-546), que compreende um único domínio variável; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam produzidos na forma de uma única cadeia de proteína onde o par de regiões VL e VH formam moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia 34 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ única (scFv); vide por exemplo, Bird e outros (1988) Science 242:423-426; e Huston e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA: 85:5879-5883). Estes anticorpos de cadeia única também se pretendem englobados na expressão "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos, estão também englobados. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos, onde os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptídica, porém usando um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios a emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (vide, por exemplo, Holliger, P., e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448;
Poljak, R.J., e outros (1994) Structure 2: 1121-1123). Estas porções de ligação de anticorpos são conhecidas na especialidade (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Ainda adicionalmente, um anticorpo ou porção de ligação ao antigénio podem fazer parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou péptidos. Os exemplos destas moléculas de imunoadesão incluem o uso da região nuclear de estreptavidina para produzir uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., e outros (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e o uso de um resíduo de cisteína, um péptido marcador e um marcador de poli-histidina C-terminal para produzir moléculas de scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, S. M., e outros (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). As porções de anticorpo, tais como, fragmentos de Fab e F(ab')2 podem ser preparadas a partir de anticorpos completos usando técnicas convencionais, tais como, digestão com papaína ou pepsina, respectivamente, dos anticorpos completos. Além disso, os anticorpos, as porções de anticorpo e as moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas padrão de ADN recombinante, conforme descrito aqui.
Na expressão "anticorpo humano recombinante", conforme usada aqui, pretende-se incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios 35 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ recombinantes, tais como, anticorpos expressos usando um vector de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatória, recombinante (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., e Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., e Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., e Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico para genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor, L.D., e outros (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295;
Kellermann S-A., e Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. e outros (2000) Immunology Today 21:364-370) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam splicing de sequências génicas de imunoglobulina humana com outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Em determinadas concretizações, contudo, estes anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagénese in vitro (ou, quando é usado um animal transgénico para sequências Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de, e relacionadas com, sequências VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente no repertório in vivo da linha germinal de anticorpos humanos. (Vide também, Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242, 1991). Os anticorpos humanos da presente invenção, contudo, podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo). (Vide também, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Gold Spring Harbor Press, 1990). A expressão "anticorpo quimérico" refere-se aos anticorpos que compreendem sequências da região variável da cadeia pesada e leve de uma espécie e sequências da região constante de outra espécie, tais como, anticorpos possuindo 36
ΕΡ 1 976 877/PT regiões variáveis de cadeia leve e pesada murinas ligadas a regiões constantes humanas. A expressão "anticorpo enxertado com CDR" refere-se aos anticorpos que compreendem sequências da região variável de cadeia leve e pesada de uma espécie, porém onde as sequências de uma ou mais das regiões CDR de VH e/ou VL estão substituídos por sequências de CDR de outra espécie, tais como, anticorpos possuindo regiões variáveis de cadeia leve e pesada de murino onde uma ou mais das CDR de murino (por exemplo, CDR3) foram substituídas por sequências de CDR humanas.
Os anticorpos humanos recombinantes da presente invenção possuem regiões variáveis, e também podem incluir regiões constantes, derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. (Vide Kabat e outros (1991) supra). Em determinadas concretizações, contudo, estes anticorpos humanos recombinantes são sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando for empregado um animal transgénico para sequências Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de, e relacionadas com, as sequências VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinal humana de anticorpos in vivo. Contudo, em determinadas concretizações, estes anticorpos recombinantes são o resultado de mutagénese selectiva ou retromutação ou ambos. 0 termo "retromutação" refere-se a um processo no qual alguns ou todos os aminoácidos somaticamente mutados de um anticorpo humano são substituídos pelos resíduos correspondentes da linha germinal de uma sequência de anticorpo homóloga da linha germinal. As sequências da cadeia leve e pesada de um anticorpo humano da invenção são alinhados separadamente com as sequências da linha germinal na base de dados VBASE para identificar a sequência com a maior homologia. A VBASE é um directório compreensivo de todas sequências de região variável da linha germinal humana compiladas a partir de sequências publicadas, incluindo as edições actuais das bibliotecas de dados GenBank e EMBL. A base de dados foi desenvolvida no MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido) como depositório de genes 37 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ de anticorpos humanos sequenciados (website: http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-intro.php?menu=901). As diferenças no anticorpo humano da invenção são retornadas à sequência da linha germinal por mutação de posições definidas de nucleótidos que codificam esses aminoácidos diferentes. 0 papel de cada aminoácido assim identificado como um candidato à retromutação deverá ser investigado quanto a um papel directo ou indirecto na ligação ao antigénio, e qualquer aminoácido que se verifique que após a mutação afecta quaisquer caracteristicas desejáveis do anticorpo humano não deverá ser incluído no anticorpo humano final. Para minimizar o número de aminoácidos sujeitos a retromutação, as posições de aminoácidos que se verifica serem diferentes da sequência mais próxima da linha germinal, mas idênticas ao aminoácido correspondente numa segunda sequência da linha germinal, podem permanecer, desde que a segunda sequência da linha germinal seja idêntica e co-linear relativamente à sequência do anticorpo humano da invenção, em pelo menos 10, preferivelmente 12, aminoácidos de ambos os lados do aminoácido em questão. A retromutação pode ocorrer em qualquer estágio da optimização do anticorpo.
Uma "proteína de ligação marcada" é uma proteína onde um anticorpo ou uma porção de anticorpo da invenção são derivatizados ou ligados a outra molécula funcional (por exemplo, outro péptido ou proteína). Por exemplo, uma proteína de ligação marcada da invenção pode ser derivada por ligação funcional de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como, outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou um péptido que possam mediar a associação do anticorpo ou da porção de anticorpo a outra molécula (tal como uma região nuclear de estreptavidina ou um marcador de poli-histidina) .
Para os fins da presente invenção, uma "proteína de ligação glicosilada" compreende uma proteína onde o anticorpo ou a sua porção de ligação ao antigénio compreende um ou mais resíduos de hidrato de carbono. A produção da proteína nascente in vivo pode sofrer processamento adicional, conhecido como modificação pós-tradução. Em particular, 38 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ resíduos de açúcar (glicosilo) podem ser adicionados enzimaticamente, um processo conhecido como glicosilação. As proteínas resultantes portadoras de cadeias laterais de oligossacárido ligadas covalentemente são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas. Os anticorpos são glicoproteínas com um ou mais resíduos de hidrato de carbono no domínio Fc, bem como no domínio variável. Os resíduos de hidrato de carbono no domínio Fc possuem um efeito importante na função efectora do domínio Fc, com efeito mínimo na ligação
ao antigénio ou na semivida do anticorpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. . 21 (2005), pp. H-16) . Em contraste, a glicosilação do domínio variável pode ter um efeito na actividade de ligação ao antigénio do anticorpo. A gl icosilação no domínio variável pode ter um efeito negativo na afinidade de ligação do anticorpo, provavelmente devido a impedimento estereoquímico (Co, M.S., e outros, Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), ou resultar em afinidade aumentada para com o antigénio (Wallick, S.C., e outros, Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., e outros, EMBO J. (1991) 10:2717 2723). Adicionalmente, podem ser produzidos mutantes em locais de glicosilação, onde o local de glicosilação ligada a O ou a N da proteína de ligação foi mutado. Um perito na especialidade pode gerar tais mutantes usando tecnologias padrão bem conhecidas. Os mutantes em locais de glicosilação gue retêm a actividade biológica mas que aumentaram ou diminuíram a actividade de ligação estão também contemplados.
Adicionalmente, a glicosilação do anticorpo ou da porção de ligação ao antigénio da invenção pode ser modificada. Por exemplo, pode ser produzido um anticorpo não glicosilado (isto é, o anticorpo não possui glicosilação) . A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo para com o antigénio. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser realizadas, por exemplo, por alteração de um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácido que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação na região variável para dessa forma eliminar a glicosilação nesse local. Esta glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para com o antigénio. Esta abordagem é descrita com mais detalhes na Publicação de Pedido de Internacional WO 03/016466A2 e nas Patentes US 5, 714, 350 e 6,350,861. 39 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Adicional ou alternativamente, pode ser produzido um anticorpo modificado possuindo um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado possuindo quantidades reduzidas de resíduos fucosilo ou um anticorpo possuindo estruturas GlcNAc de bissecção aumentadas. Foi demonstrado que estes padrões de glicosilação alterados aumentam a capacidade de ADCC dos anticorpos. Estas modificações de hidratos de carbono podem ser realizadas, por exemplo, por expressão do anticorpo numa célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes da invenção e dessa forma produzir um anticorpo com glicosilação alterada. (Vide, por exemplo, Shields, R.L. e outros (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana e outros (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, bem como, na Patente Europeia ΕΡ 1 176 195; na Publicação de Pedido Internacional WO 03/035835 e WO 99/5434280) . A glicosilação das proteínas depende da sequência de aminoácidos da proteína de interesse, bem como da célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Organismos diferentes podem produzir diferentes enzimas de glicosilação (por exemplo, glicosiltransferases e glicosidases) e possuem diferentes substratos (açúcares nucleotídicos) disponíveis. Devido a estes factores, o padrão de glicosilação das proteínas e a composição de resíduos glicosilo podem diferir dependendo do sistema hospedeiro no qual a proteína particular é expressa. Os resíduos glicosilo úteis na invenção podem incluir porém não lhes estando limitados, glicose, galactose, manose, fucose, n-acetilglicosamina e ácido siálico.
Preferivelmente a proteína de ligação glicosilada compreende resíduos glicosilo, tais que o padrão de glicosilação é humano.
Os peritos na especialidade têm conhecimento de que a diferente glicosilação das proteínas pode resultar em características da proteína diferentes. Por exemplo, a eficácia de uma proteína terapêutica produzida num microorganismo hospedeiro, tal como uma levedura, e glicosilada usando a via endógena da levedura, pode ser reduzida em comparação com a da mesma proteína expressa numa célula de mamífero, tal como uma linha celular de CHO. Estas 40 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ glicoproteínas podem também ser imunogénicas em seres humanos e apresentar uma semivida reduzida in vivo após administração. Receptores específicos em seres humanos e outros animais podem reconhecer resíduos glicosilo específicos e promover a rápida depuração da proteína da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos podem incluir alterações na dobragem, solubilidade, susceptibilidade às proteases, tráfego, transporte, compartimentalização, secreção, reconhecimento por outras proteínas ou factores, antigenicidade ou alergenicidade da proteína. Consequentemente, um praticante pode preferir uma proteína terapêutica com uma composição e um padrão de glicosilação específicos, por exemplo, composição de glicosilação e padrão idêntico, ou pelo menos semelhante, ao produzido nas células humanas ou nas células específicas da espécie do animal alvo pretendido. A expressão de proteínas glicosiladas diferentes das de uma célula hospedeira pode ser conseguida por modificação genética da célula hospedeira para expressar enzimas de glicosilação heterólogas. Usando técnicas conhecidas na especialidade, um técnico pode gerar anticorpos ou suas porções de ligação ao antigénio exibindo glicosilação de proteínas humanas. Por exemplo, estirpes de levedura foram geneticamente modificadas para expressar enzimas de gl icosilação que nao de ocorrência natural, de modo que proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas nestas estirpes de levedura exibem glicosilação de proteínas idêntica à das células de animais, especialmente células humanas (Publicação de Pedido de Patente US 20040018590 e 20020137134 e Publicação de Pedido Internacional WO 05/100584 A2).
Adicionalmente, será notado por um perito na especialidade que uma proteína de interesse pode ser expressa usando uma biblioteca de células hospedeiras geneticamente manipuladas para expressar várias enzimas de glicosilação, tal que as células hospedeiras membros da biblioteca produzem a proteína de interesse com padrões de glicosilação variados. Um técnico pode então seleccionar e isolar a proteína de interesse com novos padrões de glicosilação específicos. Preferivelmente, a proteína possuindo um novo padrão de glicosilação particularmente seleccionado exibe propriedades biológicas aperfeiçoadas ou alteradas. 41 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ A invenção também proporciona um método para produzir anticorpos monoclonais da invenção a partir de animais não humanos, e que não ratinhos, por imunização dos animais transgénicos não humanos que compreendem loci de imunoglobulina humana. Pode-se produzir estes animais usando métodos conhecidos na especialidade. Numa concretização preferida, os animais não humanos podem ser ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado vacum ou cavalos. Os hibridomas imortalizados que produzem anticorpos podem ser preparados a partir do animal imunizado. Após imunização, o animal é sacrificado e as células B do baço são fundidas com células de mieloma imortalizadas como é bem conhecido na especialidade. Vide, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Numa concretização preferida, as células de mieloma não segregam polipéptidos de imunoglobulina (uma linha celular não secretora). Após fusão e selecção com antibióticos, os hibridomas são rastreados usando um antigénio (por exemplo, um globulómero) ou uma sua porção, ou uma célula que expressa o antigénio de interesse. Numa concretização preferida, o rastreio inicial é realizado usando um imunoensaio com ligação a enzimas (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferivelmente um ELISA. Um exemplo de rastreio por ELISA é proporcionado na Publicação do Pedido Internacional WO 00/37504.
Os hibridomas que produzem o anticorpo são seleccionados, clonados e adicionalmente rastreados quanto às caracteristicas desejáveis incluindo crescimento de hibridomas robustos, alta produção de anticorpo e caracteristicas desejáveis do anticorpo, conforme discutido adicionalmente a seguir. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singénicos, em animais que não possuem sistema imunitário, tais como, ratinhos nus, ou em cultura celular in vitro. Os métodos de selecção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos das pessoas competentes na matéria. Preferivelmente, o animal imunizado é um animal não humano que expressa genes de imunoglobulina humana e as células B esplénicas são fundidas com um mieloma derivado da mesma espécie do animal não humano.
Em outro aspecto, a invenção proporciona hibridomas que produzem anticorpos monoclonais para serem usados no tratamento, diagnóstico e prevenção da doença de Alzheimer. Numa concretização preferida, os hibridomas são hibridomas de 42 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ ratinho. Em outra concretização preferida, os hibridomas são produzidos numa espécie não humana, que não ratinho, tal como, rato, ovelha, porco, cabra, gado vacum ou cavalo. Em outra concretização, os hibridomas são hibridomas humanos, nos quais um mieloma não secretor humano é fundido com uma célula humana que expressa um anticorpo contra um globulómero.
Anticorpos recombinantes podem ser gerados a partir de linfócitos únicos isolados usando um procedimento referido na técnica como o método de anticorpos de linfócitos seleccionados (SLAM), conforme descrito na Patente US 5,627,052, na Publicação de Pedido Internacional WO 92/02551 e em Babcock, J.S. e outros (1996) Prac. Natl. Acad. Sei. USA 9-3: 7843-7848. Neste método, células individuais que segregam anticorpos de interesse (por exemplo, linfócitos derivados do animal imunizado) são rastreadas usando um ensaio de formação de placas hemolíticas especificas do antigénio, onde o antigénio (por exemplo, globulómero) ou um seu fragmento, é acoplado a hemácias de ovelha usando um ligante, tal como biotina, e é usado para identificar células individuais que segregam anticorpos com especificidade para com o antigénio. Após a identificação das células que segregam o anticorpo de interesse, os ADNc da região variável de cadeia leve e pesada são recuperados das células por PCR com transcriptase inversa e essas regiões variáveis podem então ser expressas, no contexto de regiões constantes de imunoglobulina apropriadas (por exemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamífero, tais como, células COS ou CHO. As células hospedeiras transfectadas com as sequências de imunoglobulina amplificadas, derivadas dos linfócitos seleccionados in vivo, podem então ser submetidas a análise adicional e selecção in vitro, por exemplo, por selecção ("panning") das células transfectadas para isolar células que expressam anticorpos contra IL-18. As sequências de imunoglobulina ampliadas podem ainda ser manipuladas in vitro, tal como por métodos de maturação de afinidade in vitro como aqueles descritos na Publicação de Pedido Internacional WO 97/29131 e na Publicação de Pedido Internacional WO 00/56772. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se aos anticorpos que compreendem sequências da região variável de cadeia pesada e leve de espécies não humanas (por exemplo, um 43 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ ratinho) mas onde pelo menos uma porção da sequência de VH e/ou VL foi alterada para ser mais "semelhante à humana", isto é, mais semelhante às sequências variáveis da linha germinal humana. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo enxertado com CDR onde as sequências de CDR humanas são introduzidas nas sequências de VH e VL não humanas, para substituir as sequências de CDR não humanas correspondentes. Em particular, a expressão "anticorpo humanizado" é um anticorpo ou uma variante, um seu derivado, análogo ou fragmento que se liga imunoespecificamente a um antigénio de interesse e que compreende uma região de estrutura (FR) possuindo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante de complementaridade (CDR) possuindo substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Conforme usado aqui, o termo "substancialmente", no contexto de uma CDR, refere-se a uma CDR possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de um anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2 , FabC, Fv) onde todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões de estrutura são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Preferivelmente, um anticorpo humanizado também compreende, pelo menos, uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado contém tanto a cadeia leve assim como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo pode incluir também as regiões CHI, de charneira, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em outras concretizações, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Nas concretizações específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada.
O anticorpo humanizado pode ser seleccionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE 44 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ e de qualquer isotipo incluindo, sem limitação, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. 0 anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais do que uma classe ou isotipo e, em particular, os domínios constantes podem ser seleccionados para optimizar as funções efectoras desejadas usando técnicas bem conhecidas na especialidade. A estrutura e as regiões CDR de um anticorpo humanizado não precisam de corresponder precisamente às sequências de origem, por exemplo, a CDR do anticorpo doador ou a estrutura de consenso podem ser mutadas por substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido, de modo que os resíduos da CDR ou estrutura naquele local não correspondem nem ao anticorpo doador nem estrutura de consenso. Numa concretização preferida, estas mutações, contudo, não serão extensivas. Geralmente, pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e o mais preferivelmente pelo menos 95% dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão àqueles das sequências de FR e CDR de origem. Conforme usado aqui, a expressão "estrutura de consenso" refere-se à região de estrutura na sequência de imunoglobulina de consenso. Adicionalmente, conforme empregado aqui, a expressão "sequência de imunoglobulina de consenso" refere-se à sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleótidos) que ocorrem mais frequentemente numa família de sequências de imunoglobulina relacionadas (vide, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1987) . Numa família de imunoglobulinas, cada posição na sequência de consenso é ocupada pelo aminoácido que ocorre mais frequentemente naquela posição na família. Se dois aminoácidos ocorrerem com igual frequência, ambos poderão ser incluído na sequência de consenso. O termo "actividade" inclui actividades, tais como, especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo relativamente a um antigénio. O termo "epítopo" inclui qualquer polipéptido determinante capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou a um receptor de células T. Em determinadas concretizações, os determinantes epitópicos incluem agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente activos, tais como, aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforilo 45 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ ou sulfonilo e, em determinadas concretizações, podem ter caracteristicas estruturais tridimensionais especificas e/ou caracteristicas de carga especificas. Um epítopo é uma região de um antigénio que é ligada por um anticorpo. Em determinadas concretizações, diz-se que um anticorpo liga especificamente um antigénio quando reconhece preferencialmente o seu antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. A expressão "ressonância plasmónica de superfície", conforme usada aqui, refere-se a um fenómeno óptico que permite a análise de interacções bioespecíficas em tempo real por detecção das alterações nas concentrações de proteínas dentro de uma matriz biossensora, por exemplo, usando um sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para descrições adicionais vide Jõnsson, U. e outros (1993 ) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jõnsson, U., e outros (1991) Biotechnigues 11: 620-627; Johnsson, B., e outros (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., e outros (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
Com o termo "kon", conforme utilizado aqui, pretende-se referir a constante de velocidade "on-rate" para a associação de um anticorpo ao antigénio para formar um complexo anticorpo/antigénio como é conhecido na técnica.
Com o termo "k0ff", conforme utilizado aqui, pretende-se referir a constante de velocidade "off-rate" para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antigénio como é conhecido na técnica.
Com o termo "Kd", conforme utilizado aqui, pretende-se referir a "constante de dissociação" de uma interacção anticorpo-antigénio particular como é conhecido na técnica. A expressão "proteína de ligação marcada", conforme empregado aqui, refere-se a uma proteína com um marcador incorporado que proporciona a identificação da proteína de ligação. Preferivelmente, o marcador é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido radiomarcado ou a ligação a um polipéptido de porções biotinilo que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Os 46 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, porém não lhes estão limitados, os que se seguem: radioisótopos ou radionuclidos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99TC, 711In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho ou 153Sm) ; marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina ou lantanídeos luminescentes),· marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano, luciferase ou fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; qrupos biotinilo; epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares "fecho de correr" de leucinas, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais ou marcadores epitópicos); e agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio. A expressão "conjugado de anticorpo" refere-se a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, quimicamente ligada a uma segunda porção química, tal como um agente terapêutico ou citotóxico. 0 termo "agente" é usado aqui para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto produzido a partir de materiais biológicos. Preferivelmente, os agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem, porém não lhes estão limitados, a toxina da coqueluche, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi-antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, bem como análogos e homólogos destes agentes.
Os termos "cristal" e "cristalizado" conforme usados aqui referem-se a um anticorpo ou uma sua porção de ligação ao antigénio, que existe na forma de um cristal. Os cristais são uma forma do estado sólido da matéria. 0 termo "imunização" refere-se ao processo de apresentação de um antigénio a um repertório imunitário, quer esse repertório exista num organismo natural não alterado geneticamente ou um organismo transgénico modificado para exibir um repertório imunitário humano artificial. De modo semelhante, uma "preparação imunogénica" é uma formulação de antigénio que contém adjuvantes ou outros aditivos que 47 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ melhorariam a imunogenicidade do antigénio. Um exemplo disto seria a co-injecção de uma forma purificada do receptor de GLP-1 com adjuvante completo de Freund num ratinho. "Hiper-imunização" conforme definido aqui é o acto de apresentações múltiplas, em série, de um antigénio numa preparação imunogénica a um animal hospedeiro com a intenção de desenvolver uma resposta imunitária forte.
Um modo de medir a cinética de ligação de um anticorpo é utilizando a ressonância plasmónica de superfície. A expressão "ressonância plasmónica de superfície" conforme empregado aqui, refere-se a um fenómeno óptico que permite a análise de interacções bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações nas concentrações das proteínas dentro de uma matriz biossensora, por exemplo, usando um sistema Biacore (Biacore International, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para descrições adicionais vide Jõnsson e outros (1993) Annales de Biologie Clinique (Paris) 51:19-26; Jõnsson e outros (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson e outros (1995) Journal of Molecular Recognition 8: 125-131; e Johnnson e outros (1991) Analytical Biochemistry 198:268-277.
Um "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes, que sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais entre água, solução salina, solução salina tamponada de fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como, manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender, adicionalmente, quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como, agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que melhoram a vida em prateleira ou a eficácia do anticorpo ou da porção de anticorpo.
As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilacticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de 48 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo pode ser determinada por um perito na especialidade e pode variar de acordo com factores, tais como, o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção do anticorpo para eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma com a qual, qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo ou da porção de anticorpo é anulado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é usada nos indivíduos antes, ou num estágio precoce da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será menor em relação à quantidade terapeuticamente eficaz.
Os anticorpos e porções de anticorpos da invenção podem ser incorporados numa composição farmacêutica apropriada, por exemplo, para administração parentérica. Preferivelmente o anticorpo ou porções de anticorpo serão preparados sob a forma de uma solução injectável contendo 0,1-250 mg/ml de anticorpo. A solução injectável pode ser composta por um líquido ou por uma forma de dosagem liofilizada num frasco de sílex ou âmbar, ampola ou seringa pré-cheia. O tampão pode ser L-histidina (1-50 mM), optimamente 5-10 mM, a pH de 5,0 a 7,0 (optimamente pH 6,0). Outros tampões apropriados incluem, porém não lhes estando limitados, succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Pode ser usado cloreto de sódio para modificar a toxicidade da solução numa concentração de 0-300 mM (optimamente 150 mM para uma forma de dosagem líquida). Podem ser incluídos crioprotectores para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 0-10% de sacarose (optimamente 0,5-1,0%). Outros crioprotectores apropriados incluem trealose e lactose. Podem ser incluídos agentes avolumantes para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 1-10% de manitol (optimamente 2-4%). Podem ser usados estabilizante em ambas as formas de dosagem, líquida e liofilizada, principalmente L-metionina 1-50 mM (optimamente 5-10 mM) . Outros agentes avolumantes apropriados incluem 49 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ glicina, arginina, e podendo ser incluídos como 0-0,05% de polissorbato 80 (optimamente 0,005-0,01%). Agentes tensioactivos adicionais incluem, porém não lhes estando limitados, o polissorbato 20 e agentes tensioactivos BRIJ.
As composições da presente invenção podem estar numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como, soluções líquidas (por exemplo, soluções injectáveis e infundíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidos. Composições típicas preferidas estão na forma de soluções injectáveis ou infundíveis, tais como composições semelhantes àquelas usadas para imunização passiva de seres humanos com outros anticorpos. O modo preferido de administração é parentérico (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Numa concretização preferida, o anticorpo é administrado por infusão intravenosa ou injecção. Em outra concretização preferida, o anticorpo é administrado por injecção intramuscular ou subcutânea.
As composições terapêuticas tipicamente têm que ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formuladas sob a forma de uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada apropriada para alta concentração do fármaco. Soluções estéreis injectáveis podem ser preparadas por incorporação do composto activo (isto é, anticorpo ou porção de anticorpo) na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguida por esterilização por filtração. De modo geral, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis, liofilizados para a preparação das soluções estéreis injectáveis, os métodos preferidos de preparação são a secagem sob vácuo e a secagem por pulverização que originam um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração . A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, por emprego de um revestimento, tal como 50
ΕΡ 1 976 877/PT lecitina, pela manutenção do tamanho de particula necessário no caso de dispersão e por uso de agentes tensioactivos. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser obtida por inclusão, na composição, de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.
Os anticorpos e porções de anticorpos da presente invenção podem ser administrados por vários métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo preferido de administração é por injecção subcutânea, injecção intravenosa ou infusão. Conforme será notado pelo técnico especialista, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Em determinadas concretizações, o composto activo pode ser preparado com um transportador que protegerá o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros dérmicos e sistemas de liberação microencapsulada. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como, etileno - acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos dos peritos na especialidade. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.
Em determinadas concretizações, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem ser administrados oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador assimilável e comestível. O composto (e outros ingredientes, caso desejado) pode também ser encerrado numa cápsula de gelatina mole ou dura, prensado em comprimidos ou incorporado directamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trocistos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e semelhantes. Para administrar um composto da invenção por outra via que não a administração parentérica, pode ser necessário revestir o composto, ou co-administrar o composto com, um material, para prevenir a sua inactivação.
Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições. Em determinadas concretizações, 51 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ um anticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção, é co-formulado com, e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, que são úteis para tratamento da doença de Alzheimer ou doenças ou condições relacionadas. Por exemplo, um dos anticorpos da presente invenção, ou sua porção de anticorpo, pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos.
Em determinadas concretizações, um anticorpo monoclonal da presente invenção, ou um seu fragmento, pode ser ligado a um veículo que prolonga a semivida conhecido na técnica. Tais veículos incluem, mas não lhes são limitados, o domínio Fc, polietilenoglicol e dextrano. Tais veículos são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US com número de série 09/428,082 e no Pedido PCT publicado com o número WO 99/25044.
Para além dos procedimentos discutidos acima, os praticantes estão familiarizados com os materiais de documentação padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de ADN, plasmídeos, etc.), geração de organismos recombinantes e rastreio e isolamento de clones (vide por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga e outros, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren e outros, Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, New York (1998); Birren e outros, Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, New York (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, New York (1997)).
Utilizações do Anticorpo Monoclonal
Os anticorpos monoclonais da presente invenção (por exemplo, 8F5 e 8CF) possuem muitas utilidades interessantes. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser usados na prevenção, tratamento e diagnóstico da Doença de Alzheimer, conforme descrito acima. Adicionalmente, os anticorpos podem ser utilizados no desenvolvimento de anti-anticorpos. Adicionalmente, o hibridoma que produz o anticorpo respectivo permite a produção estável de uma fonte contínua de anticorpos monoclonais idênticos (isto é, reagentes) desse modo 52 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ garantindo a identidade entre os anticorpos nas várias experiências, bem como usos terapêuticos.
Também, os métodos da presente invenção permitem que se preparem as quantidades apropriadas de material de partida para uso na preparação de materiais adicionais que, por sua vez, podem ser utilizados na produção de anticorpos monoclonais (ou outros anticorpos) para o tratamento da doença de Alzheimer. Conforme citado acima, os anticorpos podem ser também utilizados para imunização passiva a fim de prevenir a doença de Alzheimer ou outras condições neurológicas relacionadas, caracterizadas pelos mesmos sintomas da doença de Alzheimer, tais como, comprometimento cognitivo.
Numa concretização de diagnóstico da presente invenção, um anticorpo da presente invenção (por exemplo, 8F5) ou uma sua porção, reveste uma fase sólida (ou está presente numa fase liquida). A amostra de teste ou biológica (por exemplo, sangue completo, fluido cerebrospinal, soro, etc.) é então colocada em contacto com a fase sólida. Se o antigénio (por exemplo, globulómero) estiver presente na amostra, esses antigénios ligam-se aos anticorpos na fase sólida e são depois detectados por um método directo ou indirecto. 0 método directo compreende simplesmente a detecção da presença do próprio complexo e assim da presença dos antigénios. No método indirecto, um conjugado é adicionado ao antigénio ligado. 0 conjugado compreende um segundo anticorpo, que se liga ao antigénio ligado, ligado a um composto gerador de sinal ou marcador. Se o segundo anticorpo se ligar ao antigénio ligado, o composto gerador de sinal gerará um sinal mensurável. Tal sinal indicará então a presença do antigénio na amostra de teste.
Os exemplos de fases sólidas usadas nos imunoensaios de diagnóstico são materiais porosos e não porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas (vide, por exemplo, Patente US 5,705,330), contas, membranas, poços de microtitulação e tubos de plástico. A escolha do material de fase sólida e do método de marcação do antigénio ou do anticorpo presente no conjugado, caso desejado, é determinada com base nas características de desempenho do formato do ensaio desejado. 53 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Conforme observado acima, o conjugado (ou reagente indicador) compreenderá um anticorpo (ou talvez anti-anticorpo, dependendo do ensaio), ligado a um composto gerador de sinal ou marcador. Este composto gerador de sinal ou "marcador" é ele próprio detectável ou pode ser feito reagir com um ou mais compostos adicionais para gerar um produto detectável. Exemplos de compostos geradores de sinal incluem cromogénios, radioisótopos (por exemplo, 125I, 131I, 32P, 3H, 35S e 14C), compostos quimioluminescentes (por exemplo, acridínio), partículas (visíveis ou fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes complexantes ou catalisadores, tais como, enzimas (por exemplo, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, peroxidase de rábano, beta-galactosidase e ribonuclease). No caso do uso da enzima (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano), adição de um substrato cromogénico, fluorogénico ou luminogénico resulta na geração de um sinal detectável. Outros sistemas de detecção, tais como, fluorescência decomposta com o tempo, fluorescência de reflexão interna, amplificação (por exemplo, reacção em cadeia pela polimerase) e espectroscopia de Raman são também úteis.
Os exemplos de fluidos biológicos que podem ser testados pelos imunoensaios acima incluem plasma, sangue completo, sangue completo seco, soro, fluido cerebrospinal ou extractos aquosos ou organoaquosos de tecidos e células. A presente invenção também engloba um método para detectar a presença de anticorpos numa amostra de teste. Este método compreende as etapas de: (a) contacto da amostra de teste suspeita de conter anticorpos com o anti-anticorpo específico para os anticorpos na amostra do paciente, sob condições e tempo suficientes para permitir a formação de complexos anti-anticorpo/anticorpo, onde o anti-anticorpo é um anticorpo da presente invenção que se liga a um anticorpo na amostra do paciente; (b) adição de um conjugado aos complexos anti-anticorpo/anticorpo resultantes, o conjugado compreendendo um antigénio (que se liga ao anti-anticorpo) ligado a um composto gerador de sinal capaz de detectar um sinal detectável; e (d) detecção da presença dos anticorpos que podem estar presentes na amostra de teste por detecção do sinal gerado pelo composto gerador de sinal. Pode ser usado um controlo ou calibrador, que compreende anticorpo para o anti-anticorpo . 54 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ A presente invenção também inclui uma vacina compreendendo um ou mais dos anticorpos descritos aqui, ou uma porção dos mesmos, e um adjuvante farmaceuticamente aceitável (por exemplo, adjuvante de Freund ou solução salina tamponada de fosfato) .
Também estão incluídos kits no escopo da presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção inclui kits para determinar a presença de antigénios (por exemplo, globulómeros) num paciente suspeito de sofrer de doença de Alzheimer ou outra condição caracterizada por comprometimento cognitivo. Em particular, um kit para determinar a presença de antigénios numa amostra de teste compreende: a) um anticorpo conforme definido aqui ou uma sua porção; e b) um conjugado compreendendo um segundo anticorpo (possuindo especificidade para o antigénio) ligado a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável. 0 kit também pode conter um controlo ou calibrador que compreende um reagente que se liga ao antigénio, bem como uma folha de instruções detalhando como o kit deve ser utilizado e os componentes do kit. A presente invenção também inclui um kit para detectar os anticorpos numa amostra de teste. 0 kit pode compreender a) um anti-anticorpo específico (por exemplo, um da presente invenção) para o anticorpo de interesse e b) um antigénio ou uma sua porção conforme definido acima. Um controlo ou calibrador compreendendo um reagente que se liga ao antigénio pode também ser incluído. Mais especificamente, o kit pode compreender: a) um anti-anticorpo (tal como o da presente invenção) específico para o anticorpo e b) um conjugado compreendendo um antigénio (por exemplo, globulómero) ligado a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável. Novamente, o kit pode também compreender um controlo de calibrador compreendendo um reagente que se liga ao antigénio e pode também compreender uma folha de instruções ou bula de embalagem descrevendo como o kit deverá ser usado e os componentes do kit. 0 kit também pode compreender um recipiente tal como um frasco, garrafas ou uma tira, cada recipiente com uma fase sólida preestabelecida, e outros recipientes contendo os respectivos conjugados. Esses kits podem também conter frascos ou recipientes com outros reagentes necessários para a 55 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ realização do ensaio, tais como, reagentes para lavagem, processamento e indicadores.
Também deve ser observado que a presente invenção não inclui apenas os anticorpos de comprimento completo descritos acima, mas também suas porções ou seus fragmentos, por exemplo, a sua porção Fab. Adicionalmente, a presente invenção engloba qualquer anticorpo possuindo as mesmas propriedades que os presentes anticorpos em termos, por exemplo, de especificidade de ligação, estrutura, etc.
Informação sobre o Depósito: 0 hibridoma (ML5- 8F5.1F2.2A2) que produz o anticorpo monoclonal 8F5 foi depositado na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110 em 1 de Dezembro de 2005 segundo os termos do Tratado de Budapeste e recebeu o número ATCC PTA-7238. O hibridoma (ML5-8C5.2C1.8E6.2D5) que produz o anticorpo monoclonal 8C5 foi depositado na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110 em 28 de Fevereiro de 2006, segundo os termos do Tratado de Budapeste e recebeu o número ATCC PTA-7407. A presente invenção pode ser ilustrada por utilização dos exemplos não limitantes que se seguem, sendo o anticorpo monoclonal 8C5 utilizado como anticorpo de referência. EXEMPLO I(a) PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS 8F5 E 8C5
Ratinhos balb/c foram imunizados subcutaneamente com 50 microgramas de globulómero A-beta(1-42) , conforme descrito em Barghorn e outros, 2005, J Neurochem, 95, 834-847 em CFA (Sigma) e receberam dois reforços com intervalos de um mês. Os baços foram colhidos e as células do baço foram fundidas com células SP2/0 de mieloma de ratinho numa razão de 5:1 através de um procedimento com PEG. As células da fusão foram colocadas em placas de 96 poços em meio de selecção de Azasserina/Hipoxantina a 2 x 105 células/ml, 200 ml por poço. Deixaram-se as células crescer para formar colónias visíveis e os sobrenadantes foram ensaiados quanto a reactividade com o oligómero A-beta através de um ensaio ELISA directo. Os 56 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ hibridomas que segregam anticorpos para os oligómeros A-beta foram subclonados por diluição limitante, até a expressão do anticorpo parecer estável.
EXEMPLO II LIGAÇÃO PREFERENCIAL DE 8F5 E 8C5 AO GLOBULÓMERO EM COMPARAÇÃO COM PREPARAÇÕES DE MONÓMERO, DE AB(l-40) E AB(142)
De modo a testar a selectividade de 8F5, utilizaram-se duas preparações de monómero A (1-42) dissolvido de forma diferente, bem como A (1-40) preparado de fresco como substitutos para monómeros. Foram realizados dois tipos de experiências. Numa primeira experiência, o 8F5 foi testado quanto à selectividade para o globulómero de A através de um ELISA em sanduíche com Mab 6G1 não especifico derivado do globulómero, porém confórmero (vide S. Barghorn e outros J. Neurochemistry, 95:834 (2005)) como um anticorpo de captura. Utilizou-se 8F5 biotinilado como segundo anticorpo e selectivo para o confórmero. Esta experiência está descrita no Exemplo 2.1 adiante.
Num segundo exemplo, descrito no Exemplo 2.2 a seguir, a selectividade relativamente ao oligómero versus monómero A (1-42) e monómero A (1-40) foi examinada por imunoensdibé blot. Nesta experiência, o 8F5 exibiu ligação preferencial ao globulómero A (1-42) (em comparação com um anticorpo conhecido 4G8 mapeando numa região semelhante ao 8F5, porém derivado de imunização com um péptido linear A (124) (Abeam Ltd., Cambridge, MA)), quando comparado com o monómero A (1-42), assim como comparado com o monómero A (1-40) . O 8C5 foi testado com um protocolo idêntico ao de 8F5.
EXEMPLO 2.1: SELECTIVIDADE DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS 8F5 E 8C5 PARA COM O OLIGÓMERO a) Preparação do globulómero A (1-42):
Dissolveram-se 9 mg de A (1-42) Fa. Bachem, em 1,5 ml de HFIP (1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol) e incubou-se por uma hora e meia a 37°C. A solução foi evaporada num SpeedVac e suspensa em 396 1 de DMSO (solução-mãe de A 5 mM). A amostra foi tratada com ultra-sons durante 20 minutos num banho de 57 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ água sónica, agitada por 10 minutos e armazenada durante a noite a -20°C. A amostra foi diluída com 4,5 ml de PBS (Naf^PCg 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4) e foram adicionados 0,5 ml de solução aquosa de SDS a 2% (teor de SDS de 0,2%) . A mistura foi incubada por 7 horas a 3 7°C, diluída com 16 ml de H20 e adicionalmente incubada por 16 horas a 37°C. Após isso, a solução de globulómero A (1-42) foi centrifugada durante 20 minutos a 3000 g. 0 sobrenadante foi concentrado para 0,5 ml por centriprep de 30 kDa. O concentrado foi dialisado contra NaH2P04 5 mM; NaCl 35 mM; pH 7,4, durante a noite a 6°C. Subsequentemente, o concentrado de globulómero A (1-42) foi centrifugado durante 10 minutos a 1000 g. O sobrenadante foi então dividido em alíquotas e armazenado a -20°C. b) Preparação de monómero A (1-42), pré-tratado com HFIP:
Dissolveram-se 3 mg de A (1-42) humano, (Bachem Inc.). Número de cat. H-1368, em 0,5 ml de HFIP (suspensão a 6 mg/ml) num tubo Eppendorff de 1,7 ml e agitou-se (misturador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) por uma hora e meia a 37°C até ser obtida uma solução límpida. A amostra foi seca num concentrador Speedvac (uma hora e meia) e ressuspensa em 13,2 1 de DMSO, agitada por 10 segundos, seguindo-se tratamento com ultra-sons em banho de ultra-sons (20 segundos) e agitação (por exemplo, no misturador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) por 10 minutos.
Adicionaram-se 6 ml de NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM; Pluronic F68 a 0,1%; pH 7,4, e agitou-se por uma hora à temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada durante 20 minutos a 3000 g. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi dissolvido em 0,6 ml de NaH2PC>4 20 mM; NaCl 140 mM; Pluronic F68 a 1%; pH 7,4. Adicionaram-se 3,4 ml de água e agitou-se por uma hora à temperatura ambiente, seguindo-se 20 minutos de centrifugação a 3000 g. Oito alíquotas de 0,5 ml do sobrenadante foram armazenadas a -20°C. c) Preparação de monómero A (1-42) em $DH:
Dissolveu-se 1 mg de pó sólido de A (1-42) (Bachem Inc., número de cat. H-1368) em 0,5 ml de NH4OH a 0,1% em água (preparado de fresco) (2 mg/ml) e agitou-se imediatamente por 58 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 30 segundos à temperatura ambiente para obter uma solução límpida. A amostra foi armazenada a -20°C para uso posterior. d) Preparação de monómero A (1-40):
Suspendeu-se 1 mg de A (1-40) humano, (Bachem Inc) número de cat. H-1194, em 0,25 ml de HFIP (suspensão a 4 mg/ml) num tubo Eppendorff. O tubo foi agitado (por exemplo, num misturador Eppendorff Thermo, 1400 rpm) por uma hora e meia a 37°C para obter uma solução límpida e posteriormente secou-se num concentrador Speedvac (uma hora e meia) . A amostra foi redissolvida em 46 1 de DMSO (so$ão a 21,7 mg/ml), foi agitada durante 10 segundos, seguindo-se tratamento com ultra-sons durante 20 segundos em banho de ultra-sons. Após 10 minutos de agitação (por exemplo, no misturador Eppendorff Thermo, 1400 rpm), a amostra foi armazenada a -20°C para uso posterior. e) Biotinilação de Mab 8F5 anti-A de ratinho:
Adicionaram-se 500 1 de Mab 8F5 anti-A de ratinho (0,64 mg/ml) em PBS a 2 1 de Sulfo-NHS-Biotina a 20 mg/ml (Pierce Inc., número de cat. 21420) dissolveram-se em água e agitou-se (por exemplo, num misturador Eppendorff Thermo, 1400 rpm), por 30 minutos, dialisou-se 16 horas a 6°C num tubo de diálise contra 500 ml de Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM: pH 7,4. 0 dialisado foi armazenado a -20°C para uso posterior. O 8C5 biotinilado da mesma forma. f) ELISA em sanduíche para amostras de A : g) Lista de Reagentes: 1. Placa F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno, número de Cat.: 439454 2. Anticorpo de ligação:
Mab 6G1 anti-A de ratinho, dissolvido em PBS:
concentração: 0,4 mg/ml; armazenamento a -20°C 3. Tampão de revestimento:
Hidrogenocarbonato de sódio 100 mM; pH 9,6 59 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 4. Reagente de bloqueio para ELISA; Roche Diagnostics GmbH, número de Cat.: 1112589 5. Tampão PBST:
NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM: Tween 20 a 0,05%; pH 7,4 6. Fracção V de albumina bovina, isenta de protease; Serva, número de Cat11926.03; armazenamento a 4°C. 7. Tampao PBST + BSA a 0,5%:
NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM: Tween 20 a 0,05%; pH 7,4 + BSA a 0,5% 8. Reserva Padrao de globulómero A (1-42):
solução em NaH2P04 5 mM; NaCl 35 mM; pH 7,4; concentração: 10,77 mg/ml; armazenamento a -20°C 9. Reserva Padrao de monómero A (1-42) tratado com HFIP:
solução em NaH2P04 3 mM; NaCl 21 mM; Pluronic F68 a 0,15%; pH 7,4; concentração: 0,45 mg/ml; armazenamento a -20°C 10. Reserva Padrao em NH40H de Monómero A (1-42): solução em NH40H a 0,1%; concentração: 2 mg/ml;
armazenamento a -20°C 11. Reserva Padrao de monómero A (1-40) tratado com HFIP:
solução em DMSO; concentração: 21,7 mg/ml; armazenamento a -20°C
12. Clone 8F5 de mAb anti-A de ratinho biotinilado; solução em PBS; concentração: 0,24 mg/ml; armazenamento a -80°C 13. Conjugado estreptavidina-POD; Fa. Roche, número de Cat.: 1089153 14. Coloração: TMB; Roche Diagnostics GmbH, número de Cat.: 92817060; 42 mM em DMSO; H202 a 3% em água; acetato de sódio 100 mM, pH 4,9 60
ΕΡ 1 976 877/PT
15. Paragem da coloração por adiçao de solução de ácido sulfónico 2 M
Preparação de reagentes:
Foi utilizado o protocolo que se segue: 1. Anticorpo de ligaçao
Descongelar solução-mãe de mMAb 6G1 e diluir 1:400 em tampão de revestimento. 2. Reagente de bloqueio:
Dissolver o reagente de bloqueio em 100 ml de água para preparar a solução-mãe de bloqueio e armazenar alíquotas de 10 ml a -20°C. Diluir 3 ml da solução-mãe de bloqueio com 27 ml de água para cada placa a bloquear. 3. Soluções Padrão de A : a) globulómero A (1-42) - Adicionar 1 1 de solução de reserva padrão de globulómero A (1-42) a 1076 1 de PBST + BSA a 0,5% = 10 g/ml - Adicionar 50 1 de solução padrão de globulómero A (1-42) a 10 g/ml a 4950 1 de PBST + BSA a 0,5% = 100 ng/ml
b) monómero A (1-42) tratado com HFIP - Adicionar 10 1 de solução de reserva padrao pré-tratada com HFIP de monómero A (1-42) a 440 1 de PBST + BSA a 0,5% = 10 g/ml - Adicionar 50 1 de solução padrão pré-tratada com HFIP de monómero A (1-42) a 4950 1 de PBST + BSA a 0,5% = 100 ng/ml
c) monómero A (1-42) em ipH - Adicionar 5 1 de solução de reserva padrão em 1HH de monómero A (1-42) a 995 1 de PBST + BSA a 0,5% = 10 g/ml 61 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ - Adicionar 50 1 de solução de reserva em |IMH de
monómero de A (1-42) a 10 g/ml a 4950 1 de PBST + BSA 0,5% = 100 ng/ml
d) Monómero A (1-40) pré-tratado com HFIP - Adicionar 1 1 de solução de reserva padrão pré-tratada com HFIP de monómero de A (1-40) a 49 1 de PBST + BSA a 0,5% = 430 g/ml - Adicionar 10 1 de solução padrão pré-tratada com HFIP de monómero A (1-40) a 430 g/ml a 420 1 de PBST + BSA a 0,5 = 10 g/ml - Adicionar 50 1 de solução padrão pré-tratada com HFIP de monómero A (1-40) a 10 g/ml a 4950 1 de PBST + BSA a 0,5 = 100 ng/ml
Curvas padrão: N. 0 Reserva PBST + BSA a Cone. Final 1 2ml S l-1 e o 10 Ong/ml 2 0,633ml (D 1,367ml 31,6ng/ml 3 0,633ml (2) 1,367ml 1Ong/ml 4 0,633ml (3) 1,367ml 3,16ng/ml 5 0,633ml (4) 1,36 7ml lng/ml 6 0,633ml (5) 1,367ml 0,32ng/ml 7 0,633ml (6) 1,367ml 0, lng/ml 8 Oml 2ml 0, Ong/ml 1. Anticorpo primário: mMAb 8F5 biotinilado: O mAb 8F5 anti-A biotinilado concentrado foi diluido em tampão PBST + BSA a 0,5%. O factor de diluição foi de 1/1200 = 0,2 g/ml. O anticorpo foi usado imediatamente. 62
ΕΡ 1 976 877/PT 2. Reagente marcador:
Reconstituir o liofilizado de conjugado estreptavidina-POD em 0,5 ml de água. Adicionar 500 1 de glicerol e armazenar alíquotas de 100 1 a -20°C para uso posterior.
Diluir o reagente marcador concentrado em tampão PBST. 0 factor de diluição é de 1/10 000. Utilizar imediatamente. 3. Solução de Coloração de TMB:
Misturar 20 ml de acetato de sódio 100 mM, pH 4,9 com 200 1 da solução de TMB e 29,5 1 de solução de peróxido a 3%. Utilizar imediatamente.
Montagem da Placa de Amostras: (Observe que todos os padrões são operados em duplicado) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 B 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 31,6 C 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 D 3,16 3, 16 3, 16 3,16 3,16 3,16 3,16 3, 16 3, 16 3,16 3, 16 3,16 E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 0,32 G 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1, 0,1 0,1 0,1 H 0,0 0,0 0,0 0, 0 0,0 0,0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0
Procedimento Utilizado: 1. Aplicar 100 1 de solução de mMAb 6G1 anti-A por poço e incubar durante a noite a 4°C. 2. Descartar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST; 3. Adicionar 260 1 de solução de bloqueio por poço e incubar por duas horas à temperatura ambiente. 4. Descartar a solução de bloqueio e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 63 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 5. Após preparação dos padrões, aplicar 100 1 por poço dos padrões na placa. Incubar por duas horas à temperatura ambiente e durante a noite a 4°C. 6. Descartar a solução padrão e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 7. Adicionar 200 1 de solução de anticorpo 8F5 biotinilado primário por poço e incubar por uma hora e meia à temperatura ambiente. 8. Descartar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 9. Adicionar 200 1 de solução de marcador por poço e incubar uma hora à temperatura ambiente. 10. Descartar a solução de marcador e lavar três vezes os poços com 250 1 de tampão PBST. 11. Adicionar 100 1 da solução de TMB a cada poço e incubar à temperatura ambiente (5-15 minutos) . 12. Observar a coloração e aplicar 50 1 da Solução de Paragem por poço após o inicio da coloração de fundo. 13. Ler sob UV a 450 nm. 14. Calcular os resultados a partir da curva padrão. 15. Avaliação. A Figura 1 mostra os resultados para o anticorpo 8F5 e a Figura 8 para o anticorpo 8C5. Os valores de Log EC50 são significativamente mais baixos para o antigénio contra o globulómero A (1-42) (1958) em comparação com os valores reduzidos para dois monómeros A (1-42) preparados de forma diferente (2745 e 3003, respectivamente) e para o monómero A (1-40) (2825). Esses dados indicam uma selectividade de cerca de dez vezes do anticorpo 8F5 para o globulómero A (l-42^ersus monómero A (1-42).
Resultados quase idênticos foram obtidos com anticorpo 8C5 e são mostrados na Figura 8. 64 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
EXEMPLO 2.2: SELECTIVIDADE DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS 8F5 E 8C5 PARA COM O OLIGÓMERO
- Discriminação do monómero de A contra globulómero de A pelo método dot blot: Comparação de 8F5 e 8C5 versus 4G8.
Foram realizadas diluições em série de globulómero A (1-42), monómero A (1-42) e monómero A (1-40) na gama de 100 pmol/ 1-0,01 pmol/ 1 em PBS. De cada amostra, 1 1 foi pontilhado sobre uma membrana de nitrocelulose. Os anticorpos monoclonais de ratinho 4G8 e 8F5 (0,2 g/ml) foram usados para detecção com uma IgG anti-ratinho acoplada a fosfatase alcalina como anticorpo secundário e o reagente de coloração NBT/BCIP (Roche Diagnostics, Mannheim). O sinal de detecção foi analisado na sua intensidade (densidade reflectiva = RD) através de um densitómetro (GS 800, Biorad, Hercules, CA, EUA) a uma concentração de antigénio de 10 pmol. Nessa concentração para cada forma de A , a densidade reflectiva medida estava na gama linear de detecção do densitómetro. O outro anticorpo 8C5 foi empregado num protocolo análogo. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo:
Tabela 1: Discriminação de anticorpos anti-A de mómero A 1-40 e monómero A 1-42. A discriminação foi calculada como a razão do sinal de detecção do globulómero A 1-42 e do monómero A 1-42, respectivamente monómero A 1-40.
Densidade Reflectiva (RD) [ lOpmol ] globulómero Αβ (1-42) monómero Αβ(1-42) monómero Αβ(1-40) Razão RD do globulómero Αβ(1-42) / RD do monómero Αβ (1-42) Razão RD do globulómero Αβ(1-42) / RD do monómero Αβ (1-40) 8F5 1,6 1,1 0,1 1,4 16,9 8C5 1,3 0,2 0,3 5,1 4,1 4G8 3 3,1 0,7 1 4,2
Em particular, os resultados acima indicam que 8F5 e 8C5 apresentam um perfil de ligação diferente em comparação com o anticorpo anti-A 1-42 disponível comercialmente 4G8, que se mapeia para A (17-24) (isto é, uma sequência linear). Mais especificamente, o 8F5 e o 8C5 apresentam uma preferência por ligação ao globulómero versus monómero A 42 vide coluna 4; 65 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ compare 1,4 versus 1) bem como uma preferência por ligação ao globulómero versus A 40 (coluna 5; compare 16, Versus 4,2). Estas duas selectividades de ligação melhoradas relativamente ao 4G8 padrão deverão resultar na produção de menos efeitos secundários pela utilização de 8F5 e/ou 8C5, como descrito acima (e.g., ligação de placas).
EXEMPLO III LIGAÇÃO DE 8F5 E 8C5 A FIBRILHAS DE Αβ(1-42)
Como o anticorpo 8F5 foi gerado contra globulómeros solúveis, colocou-se a hipótese de que o 8F5 não se deveria ligar a material de placas depositadas ou fibrilhas. Portanto, a ligação de 8F5 a suspensões de fibrilhas de Αβ polimerizadas foi testada como descrito no exemplo seguinte: - Preparação de fibrilhas de Αβ(1-42):
Dissolveu-se 1 mg de A (1-42) (Bachem Inc., número de Catálogo: H-1368) em 500 1 de IpH aquoso a 0,1% (tubo
Eppendorff) e agitou-se a amostra por 1 minuto à temperatura ambiente, seguindo-se 5 minutos de centrifugação a 10 000 g. O sobrenadante foi pipetado para um novo tubo Eppendorff e a concentração de A (1-42) foi medida de acordo com o ensaio da concentração de proteína de Bradford (procedimento de ensaio da BIO-RAD Inc.).
Neutralizaram-se 100 1 dessa solução de A (1-42) preparada de fresco com 300 1 de NgffD4 20 mM ; NaCl 140 mM; pH 7,4; seguidos por HC1 a 2% para ajustar o pH para 7,4. A amostra foi incubada por mais 20 horas a 37°C e foi centrifugada (10 minutos, 10 000 g). O sobrenadante foi descartado e a pelete de fibrilhas foi ressuspensa com 400 1 de NaH2PC>4 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4; com 1 minuto de agitação num misturador Vortex seguida por centrifugação (10 min, 10 000 g) . Após descarte do sobrenadante, repetiu-se este procedimento de ressuspensão e a suspensão de fibrilhas final foi novamente centrifugada (10 minutos, 10 000 g) . O sobrenadante foi mais uma vez descartado e a pelete final foi ressuspensa em 380 1 de N§BD4 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4; com agitação por 1 minuto num misturador Vortex. As alíquotas da amostra foram armazenadas a -20°C num congelador. 66 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Misturaram-se 80 1 de suspensão de fibrilhas com 320 1
de NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 a 0,05%; pH a 7,4, tampão e agitou-se por 5 minutos à temperatura ambiente seguindo-se um tratamento com ultra-sons (20 segundos). Após centrifugação (10 minutos, 10 000 g) , a pelete foi ressuspensa com 190 1 de NgffD4 20 mM ; NaCl 140 mM; Tween 20 a 0,05%; pH 7,4; sob agitação num misturador Vortex. - Ligação de anticorpos a fibrilhas de A (1-42)
Aliquotas de 10 1 desta suspensão de fibrilhas foram incubados com: a) 10 1 de Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4 b) 10 1 de mMAb 6E10 a 0,1 g/ 1, Signet Inc. número de
Cat. 9320 em NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4 d) 10 1 de mMAb 4GS a 0,1 g/ 1, Signet Inc. número de
Cat. 9220 em Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4 e) 10 1 de mMAb 8F5 (8C5) a 0,1 g/ 1 em Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4.
As amostras foram incubadas por 20 horas a 37°C. Finalmente as amostras foram centrifugadas (10 minutos a 10 000 g). Os sobrenadantes contendo a fracção de anticorpo não ligado foram recolhidos e misturados com 20 1 de tampão de amostra de SDS-PAGE. As fracções de pelete foram lavadas com 50 1 de tampão de NgffiD4 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4, sob 1 minuto de agitação num misturador Vortex, seguida por centrifugação (10 minutos, 10 000 g) . As peletes finais foram ressuspensas em 20 1 de tampão de NaPi 20 mM; NaCl 140 mM;
Tween 20 a 0,025%; pH 7,4, e dissolvidas em 20 1 de tampão de SDS-PAGE.
- Análise SDS-PAGE
Os sobrenadantes e amostras de peletes ressuspensas foram aquecidos por 5 minutos a 98 °C e carregados num gel Tris/Glicina 4-20% sob as condições que se seguem:
Tampão de Amostra de SDS: 0,3 g de SDS; 0,77 g de DTT; 4 ml de Tris 1M/HC1 , pH 6,8; 8 ml de glicerol; 1 ml de azul de Bromofenol a 1% em Etanol; adiciona-se água até 50 ml 67 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Gel de Tris/Glicina a 4-20%: Invitrogen Inc., número:
EC6025BOX
Tampão de operação: 7,5 g de Tris; 36 g de Glicina; 2,5 g de SDS; adiciona-se água até 2,5 1. A PAGE foi operada em 20 mA. Os géis foram corados com azul de Coomassie R250.
Resultados: A coloração com Coomassie da SDS-PAGE indicou a presença de cadeias pesadas e leves de anticorpos predominantemente no sobrenadante da suspensão de fibrilhas (pista 7, Figura 2), a suspensão de fibrilhas que permaneceu mostrou muito pouco material de anticorpo, enquanto também mostrou Abeta parcialmente despolimerizada a 4,5 kDa. Em contraste com 8F5 e 8C5, outros anticorpos anti-A não apareceram na fracção solúvel (6E10, pista 3, Figura 2) ou apareceram apenas parcialmente (4G8, pista 5, Figura 2) em comparação com a fracção ligada às fibrilhas (pista 6, Figura 2) . A ligação relativa às fibrilhas tipo Abeta foi avaliada a partir da análise SDS-PAGE por medição dos valores de Densidade Reflectiva da cadeia pesada dos anticorpos nas fracções ligada a fibrilhas e de sobrenadante e foi calculada de acordo com a fórmula que se segue:
Fracção de A ligada a fibrilhas = RQCÇão de fibrilhas X 100%/ (RDfracção de fibrilhas + FDfraCçg0 de sobrenadante)
Foram obtidos os valores que se seguem: anticorpo Fracçao de Ab ligado a fibrilhas 6E10 98% 8F5 16% 8C5 21%
Estes dados indicam uma redução significativa de 8F5 e 8CS ligados em comparação com o anticorpo padrão 6E10. 68 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
EXEMPLO IV
LIGAÇÃO PREFERENCIAL DE GLOBULÓMEROS A (1-42) ENDÓGENOS EM COMPARAÇÃO COM A (1-40)
Com base no conceito de oligómero de A , é importante que os anticorpos anti-oligómero de A também possam demonstrar ligação preferencial aos oligómeros A (l-42)in vivo, em particular, em face de A (1-40) em pacientes com comprometimento cognitivo leve e doença de Alzheimer. O conceito de diminuição das espécies de A 412) em face de A (1-40) é usado numa abordagem terapêutica para o tratamento da doença de Alzheimer através dos ΑΙΝΕ (Weggen e outros,
Nature 414, 212-216 (2001)). Presume-se que os ΑΙΝΕ que diminuem o A (1-42) em relação ao A (-10) apresentam a melhor eficácia no tratamento da Doença de Alzheimer. A razão A (1-42)/A (1-40) é importante para uma terapia selectiva bem como para fins de diagnóstico.
Foi realizada uma análise com amostras de FCE de pacientes de doença de Alzheimer e pacientes com CCL. A partir dos resultados mostrados na Figura 3 e descritos abaixo conclui-se que o 8F5 possui uma grande vantagem sobre os anticorpos para A semelhantes ao 6E10 pois o 8F5 detecta uma razão maior de A (1-42) em relação ao A (1-40) menos agregante. Essa vantagem permitirá diagnosticar e neutralizar mais selectivamente oligómeros do tipo A (1-42) em pacientes sofrendo de CCL e de DA.
A) NÍVEIS ENDÓGENOS DE AMILÓIDE (1-42) E AMILÓIDE (1-40) NO FCE DE PACIENTES DE CCL E DE DOENÇA DE ALZHEIMER APÓS IMUNOPRECIPITAÇÃO COM MAB 8F5 ΑΝΤΙ-A DE MURINO SELECTIVOS
PARA OLIGÓMEROS
Imobilização dos mMAB anti-A_em Sepharose AB activada por CNBr: a) mMAb 6E10, Signet Inc., número de Cat. 9320 b) mMAb 8 F 5
Adicionaram-se 0,4 g de Sepharose 4B activada por CNBr (Amersham Pharmacia Bio-tech AB, Uppsala, Suécia, Inc., número: 17-0430-01) a 10 ml de HC1 lmM aquoso e incubou-se por 30 minutos à temperatura ambiente. A Sepharose 4B activada por 69 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ CNBr foi lavada três vezes com 10 ml de HC1 lmM e duas vezes com 10 ml de NaHCC>3 100 mM; NaCl 50 0 mM; pH 8,3. Para cada um dos anticorpos imobilizados, foram adicionados 100 1 de
Matriz de Sepharose 4B activada por CNBr a 950 1 de solução a 0,5 mg/ml de mMAb anti-A em NaHCOlOO mM; NaCl 500 mM; pH 8,3. Após duas horas de agitação à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 10 000 g. Então, adicionaram-se às contas 500 1 de etanolamina 100 mM; tampão de NaHCCg 100 mM; NaCl 500 mM; pH 8,3, e as amostras foram agitadas por uma hora à temperatura ambiente. As amostras de mMAb anti-A -Sepharose foram centrifugadas por 5 minutos a 10 000 g e lavadas cinco vezes com 500 1 de NgffD4 20 mM;
NaCl 140 mM; pH 7,4. Antes do armazenamento a 6°C, as amostras foram estabilizadas por adição de azida de sódio até uma concentração final de 0,02%.
Imunoprecipitação: a) mMAb 6E10 - Sepharose b) mMAb 8F5 - Sepharose
Diluiram-se 200 1 das amostras de fluido cerebrospinal humano com 200 1 de NiffiD4 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 a 0,05%; pH 7,4. Essas amostras foram adicionadas a 2 1 de mMAb anti-A -Matriz de Sepharose e agitadas por duas horas à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 10 000 g. Os sobrenadantes foram descartados e o mMAb anti-A -Sepharose foi lavado duas vezes com 50 1 de PBS, agitado por 1 minuto e centrifugado (5 minutos a 10 000 g). Os sobrenadantes foram descartados e as contas de Sepharose foram agora suspensas em 50 1 de NgffD4 2 mM; NaCl 14 mM, pH 7,4, seguindo-se 1 minuto de agitação à temperatura ambiente e 5 minutos de centrifugação a 10 000 g. Numa etapa seguinte, as contas de mMAb anti-A -Sepharose foram tratadas com 50 1 de CH3CN a 50%; TFA a 0,2% em água. Após 10 minutos de agitação à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas 5 minutos a 10 000 g. Os sobrenadantes foram recolhidos e transferidos para tubos Eppendorff de 1,5 ml. As amostras foram misturadas com 50 1 de água e evaporadas num concentrador SpeedVac. A pelete foi redissolvida em 4 1 de HCOOH a 70%, agitada por 10 minutos à temperatura ambiente e neutralizada com 76 1 70 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ de solução 1Μ de Tris e 720 1 de NfffD4 20 mM; NaCl 140 mM;
Tween 20 a 0,05%; pH 7,4.
Amostras para a determinação de formas de monómeros A (1-40); A (1-42) em FCE: a) teor de A em amostras de FCE sem imunoprecipitação:
Diluíram-se 158 1 de FCE com 342 1 de 2Μ^Η 20 mM;
NaCl 140 mM; Tween 20 a 0,05%; pH 7,4. Esta diluição de 1:3,16 foi tomada para os ELISA em sanduíche e tida em consideração durante a avaliação. b) teor de A em amostras de FCE após imunoprecipitação:
As amostras do procedimento mencionado acima foram tomadas para análise.
Protocolo de ELISA em Sanduíche utilizado para determinação de A (1-40) em FCE:
Lista de Reagentes: 1. Placa F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno número de Cat.: 439454 2. Anticorpo de ligação: 6E10 clone de mAb anti-A , Signet número de Cat.: 9320; concentração: 0,4 mg/ml Bradford (BioRad); armazenamento a
-20 °C 3. Tampão de acoplamento: hidrogenocarbonato de sódio 100 mM; pH 9,6 4. Reagente de bloqueio para ELISA; Roche Diagnostics GmbH número de Cat.: 1112589 5. Tampão PBST:
NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 a 0,05%; pH 7,4 6. Padrão de A (1-40): Η119 4; Pó sólido de A (1-40); Bachem, número de Cat.: armazenamento a -20°C. 71 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 7. Anticorpo primário: pAb de coelho anti-A (1-40); afinidade purificada; solução em PBS; concentração: 0,039 mg/ml; Signet, número de Cat.: 9130-005; armazenamento a -20°C. 8. Reagente marcador:
Conjugado anti-coelho-POD; Fa. Jackson ImmunoResearch número de cat.: 111-036-045; 9. Coloração: TMB; Roche Diagnostics GmbH, número de Cat.: 92817060; 42 mM em DMSO; H202 a 3% em água; acetato de sódio 100 mM, pH 4,9 10. Solução de paragem: ácido sulfónico 2M Protocolos utilizados para preparação dos reagentes: 1. Anticorpo de ligação 0 mMAb 6E10 anti-A (Signet Inc, número de catálogo 9320) é diluído até uma concentração final de 0,7 g/ml. 2. Reagente de bloqueio:
Para preparar a solução-mãe de bloqueio, o reagente de bloqueio foi dissolvido em 100 ml de água e armazenado em alíquotas de 10 ml a -20°C. Diluíram-se 3 ml da solução-mãe de bloqueio com 2 7 ml de água para bloqueio de uma placa de ELISA. 3. Diluição padrão da forma de monómero A (1-40): A) Reserva padrão de monómero A (1-40): dissolver 0,5 mg de A (1-40) em 250 1 deOWHa 0,1%, concentração: 2 mg/ml; preparado de fresco; utilizar imediatamente B) Adicionar 5 1 de solução de reserva padrão de monómero A (1-40) a 995 1 de PBST = 10 g/ml. C) Adicionar 5 10 g/ml a 4995 1 de solução padrão de monómero A (1-40) a 1 de PBST = 10 ng/ml. 72
ΕΡ 1 976 877/PT
Curva padrao: N. 0 Cone. Final Reserva PBST 1 lOOOOpg/ml 2ml B Oml 2 3160pg/ml 0,633ml (D 1,367ml 3 10 0 Opg/ml 0,633ml (2) 1,367ml 4 316pg/ml 0,633ml (3) 1,367ml 5 10 Opg/ml 0,633ml (4) 1,367ml 6 31.6pg/ml 0,633ml (5) 1,367ml 7 1Opg/ml 0,633ml (6) 1,367ml 8 0,Opg/ml Amostras: Oml 2ml IP: amostra de imunoprecipitado N. 0 Factor de diluição amostra PBST 1 directamente 0,4ml IP Oml 2 1:5 0,ml (1) 0, 4ml 3 1: 25 0, lml (2) 0, 4ml 4 1:125 0,lml (3) 0, 4ml 4. Anticorpo primário:
Diluir o pAb anti-A (1-40) concentrado em tampão PBST. O factor de diluição é de 1/200 = 0,2 g/ml. Utilizar imediatamente. 73 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 5. Anticorpo secundário:
Conjugado anti-coelho-POD liofilizado é dissolvido em 0,5 ml de H20 e misturado com 500 1 de glicerol O concentrado
de anticorpo é então armazenado a -20°C em aliquotas de 100 .10 concentrado é diluído de 1:10 000 em tampão PBST. A solução de anticorpo é utilizada imediatamente. 6. Solução de TMB:
Misturam-se 20 ml de acetato de sódio 100 mM, pH 4,9 com 200 1 de solução de TMB e 29,5 de peróxido de hidrogénio a 3%. Essa solução é utilizada imediatamente.
Montagem da Placa de Amostras: (Observe que todos os padrões e amostras são operados em duplicado) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 10000 10000 UI UI B 3160 3160 U2 U2 C 1000 1000 U3 U3 D 316 316 U4 U4 E 100 100 U5 U5 F 31,6 31,6 U6 U6 G 10 10 U7 U7 H O O O O U8 U8
Ul-U# = amostras desconhecidas
Procedimento Utilizado: 1. Aplicar 100 1 de solução de anticorpo de ligação por poço e incubar durante a noite a 4°C. 2. Descartar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 3. Adicionar 260 1 de solução de bloqueio por poço e incubar por duas horas à temperatura ambiente. 4. Descartar a solução de bloqueio e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 74 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 5. Após preparação dos padrões e das amostras, aplicar 100 1 por poço dos padrões e das amostras na placa e incubar por duas horas à temperatura ambiente e durante a noite a 4°C. 6. Descartar a solução de padrão/amostras e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 7. Adicionar 200 1 da solução de anticorpo primário por poço e incubar por uma hora e meia à temperatura ambiente. 8. Descartar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 9. Adicionar 200 1 de solução de marcador por poço e incubar uma hora à temperatura ambiente. 10. Descarte a solução de marcador e lavar três vezes os poços com 250 1 de tampão PBST. 11. Adicionar 100 1 de solução de TMB a cada poço e incubar à temperatura ambiente (5-15 minutos). 12. Observar o desenvolvimento da cor e aplicar 50 1 da
Solução de Paragem por poço. 13. Ler a 450 nm. 14. Calcular os resultados a partir da curva padrão. 15. Avaliação:
Se a extinção das amostras desconhecidas não estiver na gama de linearidade da curva de calibração, repetir o ELISA com diluição apropriada da amostra.
Protocolo de ELISA em Sanduíche utilizado para a determinação da forma de monómero A em FCE
Lista de Reagentes: 1. Placa F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno número de Cat.: 439454 2. Anticorpo de ligação:
Clone 6E10 de mAb anti-A , Signet número de Cat.: 9320; concentração: 0,4 mg/ml Bradford (BioRad); armazenamento a -20 °C 75 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 3. Tampão de revestimento:
Hidrogenocarbonato de sódio 100 mM; pH 9,6 4. Reagente de bloqueio para ELISA; Roche Diagnostics GmbH número de Cat.: 1112589 5. Tampão PBST:
NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM; Tween 20 a 0,05%; pH 7,4 6. Padrão de A (1-42): Pó sólido de A (1-42); Bachem, número de Cat.: H1368; armazenamento a -20°C. 7. Anticorpo primário: pAb de coelho anti-A (1-42); afinidade purificada; biotinilado; solução em PBS com glicerol a 50%; concentração: 0,25 mg/ml; Signet, número de Cat.: 9137-005; armazenamento a -20 °C. 8. Reagente marcador:
Conjugado anti-coelho-POD; Fa. Jackson ImmunoResearch número de cat.: 111-036-045; 9. Coloração: TMB; Roche Diagnostics GmbH, número de Cat.: 92817060; 42 mM em DMSO; H202 a 3% em água; acetato de sódio 100 mM, pH 4, 9
Solução de paragem: ácido sulfónico 2M Método utilizado na preparação de reagentes: 1. Anticorpo de ligação:
Diluir o clone 6E10 de mAb anti-A de 1:400 em tampão de revestimento. 2. Reagente de bloqueio:
Dissolver o reagente de bloqueio em 100 ml de água para preparar a solução-mãe de bloqueio e armazenar alíquotas de 76
ΕΡ 1 9 76 877/PT 10 ml a -20°C. Diluir 3 ml da solução-mãe de bloqueio com 27 ml de água para bloqueio de cada placa. 3. Diluição padrão, forma de monómero A (1-42):
Reserva padrão de monómero A (1-42) : dissolver 0,5 mg de A (1-42) em 250 1 d^OMHa 0,1%, concentração: 2 mg/ml; preparado de fresco; utilizar imediatamente.
Adicionar 5 1 de so$ão de reserva padrão de monómero A (1-42) a 995 1 de PBST = 1 Adicionar 5 1 de solução 10 g/ml a 4995 1 de PBST = Curva padrão: N. 0 Cone. Final Reserva 1 2ml B 10 0 0 Opg/ml 2 3160pg/ml 0,633ml 3 0,633ml lOOOpg/ml 4 0,633ml 316pg/ml 5 0,633ml 10Opg/ml 6 31,6pg/ml 0,633ml 7 0,633ml 1Opg/ml 8 Oml 0,Opg/ml 0 g/ml. padrão de monómero A (1-42) a 10 ng/ml. PBST Oml (D 1,367ml (2) 1,367ml (3) 1,36 7ml (4) 1,367ml (5) 1,36 7ml (6) 1,367ml 2ml 77 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Amostras : IP: amostras de imunoprecipitado N. 0 amostra PBST Factor de diluição 1 Directamente 0, 4ml IP Oml 2 1:5 0, lml (1) 0, 4ml 3 1:25 0, lml (2) 0, 4ml 4 1:125 0, lml (3) 0, 4ml
Procedimento Utilizado: 1. Anticorpo primário:
Diluir o pAb anti-A (1-42) concentrado em tampão PBST. 0 factor de diluição é de 1/1250 = 0,2 g/ml. Utilizar imediatamente. 2. Reagente Marcador:
Reconstituir o liofilizado de conjugado anti-coelho-POD em 0,5 ml de água. Adicionar 500 1 de glicerol e armazenar em aliquotas de 100 1 a -20°C para uso posterior.
Diluir o reagente Marcador concentrado em tampão PBST. O factor de diluição é de 1/5000. Utilizar imediatamente. 3. Solução de TMB:
Misturar 20 ml de acetato de sódio 100 mM, pH 4,9 com 200 1 da solução de TMB e 29,5 1 de solução de peróxido 3%. Utilizar imediatamente. 78 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Montagem da Placa de Amostras: (Observe que todos os padrões e amostras são operados em duplicado) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 10000 10000 UI UI B 3160 3160 U2 U2 C 1000 1000 U3 U3 D 316 316 U4 U4 E 100 100 U5 U5 F 31,6 31,6 U6 U6 G 10 10 U7 U7 H O o O o U8 U8
Ul-U# = amostras desconhecidas
Procedimento Utilizado: 1. Aplicar 100 1 de solução de anticorpo de ligação por poço e incubar durante a noite a 4°C. 2. Descartar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 3. Adicionar 260 1 de solução de bloqueio por poço e incubar por duas horas à temperatura ambiente. 4. Descartar a solução de bloqueio e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 5. Após preparação dos padrões e das amostras, aplicar 100 1 por poço de padrões e amostras na placa. Incubar por duas horas à temperatura ambiente e durante a noite a 4°C. 6. Descartar a solução de padrão/amostras e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 7. Adicionar 200 1 da solução de anticorpo primário por poço e incubar por uma hora e meia à temperatura ambiente. 8. Descartar a solução de anticorpo e lavar os poços três vezes com 250 1 de tampão PBST. 9. Adicionar 200 1 de solução de marcador por poço e incubar uma hora à temperatura ambiente. 79
ΕΡ 1 976 877/PT 10. Descartar a solução de marcador e lavar três vezes os poços com 250 1 de tampão PBST. 11. Adicionar 100 1 da solução de TMB a cada poço e incubar à temperatura ambiente (5-15 minutos). 12. Observar a coloração e aplicar 50 1 da Solução de Paragem por poço. 13. Ler a 450 nm. 14. Calcular os resultados a partir da curva padrão. 15. Avaliação:
Se a extinção das amostras desconhecidas não estiver na
gama de linearidade da curva de calibração, repetir o ELISA com diluição apropriada da amostra. RESULTADOS: Αβ40 ELISA Αβ42 ELISA A542/40 (Signet) (Signet)
Amostras de CCL (n=4) Αβ (1-40) SEM Αβ(1-42) SEM Sem IP 11678,9 2879,4 1242,0 353,5 7, 84% 6E10 IP 8282,4 2185,7 2035,1 280,9 17,35% 8F5 IP 8586, 1 2396,8 2654,6 411,4 20,95% Amostras de DA (n=2) Αβ(1-40) SEM Αβ(1-42) SEM Sem IP 7297,5 1464,5 843,0 157,5 10,95% 6E10 IP 5610,2 28, 3 1453,0 14, 5 20,57% 8F5 IP 4133,9 86, 9 1670,2 12, 3 28,78%
Os resultados acima indicam o que se segue: a. Um anticorpo com preferência para globulómeros semelhante a 8F5 (ou 8C5), em comparação com um anticorpo não selectivo para globulómeros semelhante a 6E10 liga-se preferencialmente a A 42 em comparação com A 40 independente do estado da doença. Este resultado é indicativo de um tratamento de sucesso para a doença de Alzheimer, uma vez que a eliminação preferencial de A 42 relativamente a A 40 está a ser seguida como um conceito no tratamento de DA, por exemplo, por utilização de R-flubiprofeno, Flurizan, que demonstrou eficácia no tratamento de DA num ensaio clinico publicado por Myriad Inc. Este conceito foi publicado por S. Weggen e outros 80 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ (J Biol Chem. (2003) 278(34) :31831-7). Os resultados sao mostrados na Figura 3. b. Um anticorpo com preferência para globulómeros semelhante a 8F5 (ou 8C5) liga-se a ainda mais A 42 do que A 40 pacientes comparativamente com controlos saudáveis. Este resultado é ainda mais indicativo de um tratamento de sucesso para a doença de Alzheimer, uma vez que, conforme observado acima, a eliminação preferencial de A 42 relativamente a A está a ser seguida como um conceito no tratamento de DA (por exemplo, por utilização de fármacos anti-inflamatórios não esteróides, como R-flubiprofeno). (Vide a Figura 3).
B) NÍVEIS ENDÓGENOS DE AMILÓIDE (1-42) E AMILÓIDE (1-40) EM FCE HUMANO APÓS IMUNOPRECIPITAÇÃO COM MAB 8F5 OU 8C5 DE MURINO ΑΝΤΙ—A SELECTIVO PARA GLOBULÓMEROS EM COMPARAÇÃO COM O ANTICORPO 6E10 NÃO SELECTIVO PARA GLOBULÓMEROS: bl) Imunoprecipitação (IP) com IgG de ovelha anti-ratinho em Dynabeads M-280
Soluções de Abeta-anticorpo:
Os seguintes anticorpos puros foram obtidos de hibridomas de acordo com procedimentos de purificação padrão:
- mMAb 6E10; Fa. Signet, número 9320; 1 mg/ml em tampão PBS
- mMAb 8F5; 1,65 mg/ml em tampão PBS
- mMAb 8C5; 1,44 mg/ml em tampão PBS
IgG de ovelha anti-ratinho em Dynabeads M-280: A IgG de ovelha anti-ratinho (Invitrogen Inc., número de Cat. : 112.02) é covalentemente ligada a contas magnéticas (Dynabeads).
Activação de Dynabeads com anticorpos monoclonais de ratinhos - A suspensão de reserva de Dynabeads (IgG de ovelha anti-ratinho em Dynabeads M-280; Produto número 112.02) foi agitada cuidadosamente para prevenir a formação de espuma. - 1 ml foi assepticamente removido e transferido para um frasco de reacção de 1,5 ml. em 40 81 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ - As dynabeads foram lavadas três vezes por cinco minutos com 1 ml de tampão de lavagem de imunoprecipitação (IP) (tampão de lavagem-IP: PBS (NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7,4), BSA a 0,1% (peso/volume)). Durante o procedimento de lavagem, o sobrenadante foi cuidadosamente removido enquanto as dynabeads foram imobilizadas na lateral do frasco de reacção com um suporte separador magnético (MSS). - As dynabeads lavadas foram incubadas com 40 g de Abeta-anticorpo em 1 ml de PBS, 0,1% (peso/volume) de BSA. - A activação foi realizada por incubação durante a noite sob agitação a 4°C. - As dynabeads activadas foram lavadas 4 vezes por 30 minutos (novamente usando o MSS) com 1 ml de tampão de lavagem-IP (PBS (NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM, pH 7,4), BSA a 0,1% (peso/volume)). - As dynabeads activadas foram ressuspensas com 1 ml de PBS, BSA a 0,1% (peso/volume), Azida-Na a 0,02% (peso/volume); rapidamente agitadas com vórtex e centrifugadas. - As dynabeads activadas de anticorpo foram armazenadas a 4°C até serem utilizadas.
Preparação da amostra de FCE:
Adicionaram-se 400 1 de FCE de um paciente de doença de
Alzheimer a 4 1 d€ocktail de Inibidor de Protease Completo (Roche Inc. número de Cat.: 1697498, 1 comprimido dissolvido em 1 ml de água) e 0,8 1 de PMSF 500 mM dissolvido em metanol. Após 10 minutos, foram adicionados 1,6 ml de NaH2P04 20 mM; NaCl 140 mM, Tween 20 a 0,05%, pH 7,4 (PBST).
Imunoprecipitação de espécies de Abeta a partir de DA-FCE humano:
Uma aliquota de 250 1 da amostra de FCE preparada foi
adicionada a 25 1 da suspensão de Dynabeads anti-A - A imunoprecipitação ocorreu sob agitação a 6°C por 16 horas. A lavagem subsequente das contas foi realizada 3 vezes por 5 minutos com 1 ml de PBS/BSA a 0,1% (peso/volume) e finalmente uma vez por 3 minutos com 1 ml de tampão Tris 82 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 10 mM/HCl, ρΗ 7,5. Durante ο procedimento de lavagem, ο sobrenadante foi cuidadosamente removido, enquanto as dynabeads foram imobilizadas na lateral do frasco de reacção com um suporte separador magnético (MSS). O sobrenadante residual foi completamente removido após a etapa de lavagem final. Os péptidos de Abeta e o anticorpo correspondente foram removidos das Dynabeads por adição de 25 1 de tampão de amostra, sem -Mercaptoetanol (Bistris 0,36 M, Bicina 0,16 M, SDS a 1% (peso/volume) , sacarose a 15% (peso/volume), azul de Bromofenol a 0,004% (peso/volume) ao tubo Eppendorff e aquecimento por 5 minutos a 95°C num bloco de aquecimento. Após arrefecimento à temperatura ambiente, as dynabeads foram imobilizadas na lateral do frasco de reacção com um suporte separador magnético (MSS) e o sobrenadante foi transferido para outro tubo Eppendorff (eluato de IP).
Análise de imunoprecipitados de Abeta por ureia-PAGE seguido por procedimento Western Blot: A quantificação de espécies A 1-40 e A 1-42 foi realizada através de um sistema de Electroforese em Gel de
Poliacrilamida e Ureia 8 M e subsequente análise Western Blot de acordo com o procedimento descrito pela primeira vez por H.W. Klafki e outros, Analytical Biochemistry 237, 24-29 (1996) e mais tarde também usado por J. Wiltfang e outros, J. of Neurochemistry 81, 481-496, 2002. Foram feitas apenas duas pequenas alterações no procedimento experimental: 1) a concentração de SDS no gel de concentração (" stacking gel") foi ajustada para 0,25% (peso/volume) ao invés de 0,1% (peso/volume) 2) Para a Western blot, o anticorpo 1E8 (Senetek Drug Delivery
Technologies Inc. St.Louis, MO, EUA) foi substituído por mAb IgG de ratinho anti-Amilóide humana (N) (82E1) (IBL, número de Cat.: 10323)
Aliquotas de 15 1 de eluato de IP das amostras imunoprecipitadas foram carregadas no Ureia 8M-PAGE. A electroforese foi realizada a 100 V (15 minutos) e continuou a 60 V. A electroforese foi parada quando a frente da corrida do corante azul de carga da amostra ainda estava a 0,5 cm da extremidade do gel. 83 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Procedimento de Western blot: A análise Western blot foi realizada numa câmara
Semi Dry Blotting (BioRad Inc., 45 minutos a 75 mA) em 7,5 cm x 9 cm de Nitrocelulose de 0,45 m (BioRad Inc.).
Tampão de transferência (blotting): 6 g de Tris; 28,1 g de Glicina; 500 ml de Metanol; ajuste para 2,5 L com água. A membrana de nitrocelulose (blot) foi fervida por 10 minutos em PBS a 100°C. A membrana foi saturada por tratamento com 50 ml BSA a 5% (peso/volume) em PBST por 1 hora à temperatura ambiente. Após remoção da fase fluida, a etapa de lavagem que se segue foi realizada duas vezes com: 50 ml de TTBS (tampão Tris 25 mM/HCl; NaCl 150 mM; Tween 20 a 0,05%; pH 7,5) por 10 minutos à temperatura ambiente e subsequentemente com 50 ml de TBS (tampão Tris 25 mM/HCl; NaCl 150 mM; pH 7,5) por 10 minutos à temperatura ambiente.
Para revelação adicional, o tampão da lavagem final foi descartado da membrana e foram adicionados 15 ml de solução de anticorpo I (0,2 g/ml de 82E1 = 1:500 em leite em pó desnatado a 3% (peso/volume) (Lasana Inc.), em 15 ml de TBS) por 20 horas a 6°C. A remoção do tampão foi seguida pelas três etapas de lavagem conforme descrito acima. A membrana foi incubada com solução de anticorpo II (diluição de 1:10 000 de ant i-rat inho-POD em 15 ml de leite em pó desnatado a 3% (peso/volume) em 15 ml de TBS) por 1 hora à temperatura ambiente. A remoção do tampão foi seguida pelas três etapas de lavagem conforme descrito acima.
Após remoção do último tampão de lavagem, foram adicionados 2 ml de "SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Enhancer" e 2 ml de solução de peróxido.
A solução preparada de fresco foi vertida sobre a membrana que foi pré-incubada no escuro por 5 minutos. A quimioluminescência foi registada usando um sistema de imageologia VersaDoc Imaging (BioRad).
Parâmetros de imageologia: - tempo de exposição: 180 segundos
Registos de imagem após 30 segundos, 60 segundos, 120 segundos e 180 segundos. 84 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Os resultados foram obtidos a partir da imagem com tempo de exposição de 180 segundos. AB40 ureia-PAGE [pg/ml] AB42 ureia-PAGE [pg/ml] Razão AB42/AB40+42 xl00% 6E10 IP 4389 202 4, 4% 8F5 IP 1260 112 8, 1% 8C5 IP 1202 211 14,9%
Os resultados acima indicam que um anticorpo com preferência para globulómeros semelhante a 8F5 ou 8C5, em comparação com um anticorpo não selectivo para globulómeros semelhante a 6E10 liga-se a mais A 42 do que A 40 no FCE humano. Este resultado é indicativo de um tratamento de sucesso para doença de Alzheimer uma vez que, conforme citado acima, a eliminação preferencial de A 42 relativamente a A 40 está a ser seguida como um conceito no tratamento de DA (por exemplo, por uso de R-flubipofeno (vide acima)) .
EXEMPLO V
O 8F5 APERFEIÇOA O RECONHECIMENTO DE NOVOS OBJECTOS EM RATINHOS TRANSGÉNICOS PARA APP A fim de testar um efeito positivo na cognição por neutralização do epítopo do globulómero A (1-42) interno com anticorpo 8F5, foi realizada uma experiência de imunização passiva com ratinhos transgénicos para APP na qual os ratinhos foram testados quanto à sua capacidade de relembrar objectos que já haviam investigado anteriormente. Após algum tempo entre o primeiro e o segundo encontro com os objectos, os ratinhos transgénicos para APP não foram capazes de reconhecer o objecto já investigado. Esta experiência baseia-se na curiosidade natural dos animais e uma falta de interesse significativa no objecto já investigado demonstra o reconhecimento do objecto. 85 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ EXEMPLO V.1: ÍNDICE DE RECONHECIMENTO AUMENTADO PELO ANTICORPO MONOCLONAL 8F5:
Animais:
Foram utilizados ratinhos fêmea de um modelo de ratinho transgénico simples de Doença de Alzheimer em fundo FVB x C57B1 (APP/L, ReMYND, Leuven, Bélgica) e parceiros de ninhada negativos como controlos do tipo selvagem em fundo FVB x C57B1 com idade de 3 meses. Todos os ratinhos foram genotipados por reacção em cadeia pela polimerase (PCR) na idade de três semanas e receberam um número de identidade único, uma vez conhecidos os resultados da PCR que foram duplamente verificados através de uma segunda PCR antes do inicio do estudo. Todos os ratinhos foram divididos aleatoriamente e combinados por idades, isto é, receberam um número aleatório atribuído por computador e foram alocados aleatoriamente a um tratamento. Os animais foram engaiolados por grupo de tratamento 18 dias antes do início do estudo, a fim de permitir-lhes familiarizar-se com o novo contexto da gaiola.
Os ratinhos tinham livre acesso a água pré-filtrada e estéril (lâmpada UV) e ração padrão para ratinhos. 0 alimento foi armazenado em condições secas e frias num compartimento de armazenamento bem ventilado. A quantidade de água e alimento foi verificada diariamente, fornecida quando necessário e renovada duas vezes por semana. Os ratinhos foram alojados sob um ritmo de dia-noite invertido: 14 horas de luz/10 horas de escuridão com início às 7 horas da tarde em gaiolas de metal padrão tipo RVS T2 (área de 540 cm2) . As gaiolas estavam equipadas com pisos sólidos e uma camada de material de cama. O número de ratinhos por gaiola foi limitado de acordo com a legislação sobre o bem-estar dos animais. Cinco dias antes do início do teste de comportamento, os ratinhos foram passados para duas gaiolas do tipo Macrolon e transportados para o laboratório a fim de se adaptarem ao ambiente do laboratório na preparação para o teste de comportamento.
Tratamento (Imunização Passiva):
Foram realizadas três experiências individuais nas quais os ratinhos (pelo menos 9 por grupo) receberam injecções intraperitoneais (500 g em 240 1/ratinho) nos dias 1, 8 e 86 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 15. Os ratinhos foram tratados com os anticorpos monoclonais 6G1, 8F5 e outros anticorpos não divulgados, todos dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato, ou com 320 1 de solução salina tamponada com fosfato.
Teste de Reconhecimento de Novos Objectos: O teste de reconhecimento de novos objectos foi realizado no dia do terceiro tratamento. O protocolo empregado seguiu o método conforme descrito por Dewachter e outros (Journal of Neuroscience, 2002, 22 (9):3445-3453). Os ratinhos foram familiarizados por uma hora com uma caixa de campo aberto de Plexiglas (52 x 52 x 40 cm) com paredes verticais pretas e um piso translúcido, vagamente iluminado por uma lâmpada colocada por baixo da caixa. No dia seguinte, os animais foram colocados na mesma caixa e submetidos a um ensaio de aquisição de 10 minutos. Durante este ensaio, os ratinhos foram colocados individualmente no campo aberto na presença de 2 objectos idênticos A (cilindro laranja ou cubo verde, de tamanhos semelhantes de ± 4cm) e a duração (tempoM) e a frequência (FreqM) da exploração do objecto A (quando o focinho dos animais estava direccionado para o objecto a uma distância <1 cm e os ratinhos estavam a cheirar activamente na direcção do objecto) foram registados através de um sistema computadorizado (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Holanda). Durante um ensaio de retenção de 10 minutos (segundo ensaio) realizado duas hora e meia mais tarde, um novo objecto (objecto B, cubo verde ou cilindro laranja) foi colocado em conjunto com o objecto familiar (objecto A) no campo aberto (FreqA e FreqB e TempoA e TempoB, respectivamente). O índice de reconhecimento (IR) definido como a razão entre a duração de tempo em que o novo objecto foi explorado e a duração de tempo em que ambos os objectos foram explorados (TempoB/ (TempoA + TempoB) x 100] foi usado para medir a memória não espacial. A duração e a frequência com que o objecto A foi explorado durante o ensaio de aquisição (tempo^ e FreqM) foram usados para medir a curiosidade. A análise dos dados foi realizada por combinação dos ratinhos transgénicos para APP que receberam anticorpos monoclonais 6G1 ou 8F5 ou solução salina tamponada com fosfato e parceiros de ninhada não transgénicos que receberam solução 87 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ salina tamponada com fosfato, de todos os três estudos (Figura 4). Os ratinhos que não distinguem entre um objecto antigo e um objecto novo têm um índice de reconhecimento de 50. Os ratinhos que reconhecem o objecto antigo irão preferivelmente explorar o novo objecto e consequentemente o índice de reconhecimento tornar-se-á superior a 50. Os ratinhos que exploram exclusivamente o novo objecto têm um Índice de reconhecimento de 100. O índice de reconhecimento médio por grupo foi comparado contra o nível de probabilidade, isto é, 50, pelo teste t. O índice de reconhecimento médio para todos os grupos foi também comparado por ANOVA seguido por um teste t post-hoc. A diferença entre os grupos de PBS e do tipo selvagem indicou um défice cognitivo dos ratinhos transgénicos para APP neste paradigma. Os ratinhos que receberam injecção de PBS tiveram um desempenho ao nível das probabilidades (isto é, não significativamente diferente de 50), enquanto todos os outros ratinhos mostraram reconhecimento do objecto (Figura 4: estrelas). Quando o desempenho dos ratinhos para APP tratados com anticorpo foi comparado com os grupos de controlo, foi observada uma diferença significativa versus os ratinhos tratados com PBS mas não versus os ratinhos do tipo selvagem (Figura 4: círculos) indicando que o tratamento com anticorpo 8F5 inverteu o défice cognitivo nesses ratinhos transgénicos para APP.
EXEMPLO VI
ANÁLISE IN SITU DA REACÇÃO ESPECÍFICA DOS ANTICORPOS 8F5 E 8C5 AO PÉPTIDO BETA—AMILÓIDE FIBRILAR NA FORMA DE PLACAS AMILÓIDES E AMILÓIDE NOS VASOS MENÍNGEOS EM RATINHOS TRANSGÉNICOS PARA APP IDOSOS E EM PACIENTES COM DOENÇA DE ALZHEIMER
Os anticorpos 8F5 e 8C5 apresentaram coloração reduzida em face de depósitos de péptido A fibrilar sugerindo que o seu efeito terapêutico é mediado por ligação a formas globuloméricas solúveis e não a formas depositadas fibrilares do péptido A . Uma vez que a ligação do anticorpo ao péptido A fibrilar pode conduzir à rápida dissolução dos
agregados e um aumento subsequente da concentração de A solúvel, que por sua vez se acredita ser neurotóxico e poder conduzir a micro-hemorragias, é preferida uma terapia com anticorpos que afecte o globulómero solúvel e não o monómero. 88 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ Métodos :
Para estas experiências foram utilizadas várias amostras de material cerebral: tecido cortical de 2 pacientes com DA (RX16 e RZ55) e tecido cortical de ratinhos Tg2576 de 19 meses de idade (APPSWE #001349, Taconic, Hudson, NY, EUA) ou ratinhos APP/L com 12 meses de idade (ReMYND, Leuven, Bélgica).
Os ratinhos sobre-expressam APP humana com uma mutação de doença de Alzheimer familiar e formam depósitos de amilóide no parênquima cerebral aos cerca de 11 meses de idade e depósitos de amilóide em vasos cerebrais maiores aos cerca de 18 meses de idade. Os animais foram anestesiados profundamente e receberam perfusão transcardiaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,1 M para lavar o sangue. Depois, o cérebro foi removido do crânio e dividido longitudinalmente. Um hemisfério do cérebro foi congelado por congelação rápida e o outro foi fixado por imersão em paraformaldeido a 4%. O hemisfério fixado por imersão foi crioprotegido por embebimento em sacarose a 30% em PBS e foi montado num micrótomo de congelamento. Todo o prosencéfalo foi cortado em secções transversais de 40 m que foram colhidas em PBS e utilizadas para o procedimento de coloração subsequente.
As amostras de neocórtex dos pacientes com doença de Alzheimer foram obtidas de Brain-Net, Munich, Alemanha, como tecido congelado, fixadas por imersão em paraformaldeido a 4% durante o descongelamento e subsequentemente tratadas da mesma forma que o tecido de ratinho. AS secções individuais foram coradas com Vermelho do Congo usando o protocolo que se segue:
Material: - Kit de corante Vermelho do Congo para amilóide (Sigma-Aldrich; HT-60), consistindo em solução alcoólica de NaCl, solução de NaOH e solução de Vermelho do Congo - cuvetes para coloração - lâminas para microscópio SuperfrostPlus e lamelas 89
ΕΡ 1 976 877/PT - Etanol, xilol, meio de embebimento Reagentes: - NaOH diluído de 1:100 com solução de NaCl origina solução salina alcalina - solução salina alcalina diluída de 1:100 com solução de Vermelho do Congo origina solução alcalina de Vermelho do Congo (preparar não mais de 15 minutos antes do uso, filtrado) - montar as secções sobre a lâmina e deixar que sequem - incubar a lâmina na cuvete para coloração, primeiro por 30-40 minutos em solução salina alcalina, depois por 30-40 minutos em solução alcalina de Vermelho do Congo - enxaguar três vezes com etanol fresco e embeber em xilol A coloração foi fotografada primeiro usando um microscópio Zeiss Axioplan (Zeiss, Jena, Alemanha) e avaliada qualitativamente. A cor vermelha indicou depósitos de amilóide tanto na forma de placas como em vasos meníngeos maiores. Mais tarde, a avaliação da coloração do anticorpo foi focada nestas estruturas. A coloração foi realizada por incubação das secções com uma solução contendo 0,07 -0,7 g/ml do respectivo anticorpo de acordo com o protocolo que se segue:
Materiais: - Solução de lavagem de TBST (Solução salina Tamponada com Tris, com Tween 20; concentrada lOx; DakoCytomation S3306, DAKO, Hamburg, Alemanha) 1:10 em água bidestilada) - H2O2 a 0,3% em metanol - soro de burro (Serotec, Dusseldorf, Alemanha), 5% em TBST, como soro de bloqueio
- anticorpos monoclonais de ratinho anti-globulómero diluídos em concentrações determinadas em TBST 90 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ - anticorpo secundário: anticorpo de burro anti-ratinho biotinilado (Jackson Immuno/Dianova, Hamburg, Alemanha; 715-065-150; diluido 1:500 em TBST) - StreptABComplex (DakoCytomation K 0377, DAKO, Hamburg, Alemanha) - Diaminobenzidina do kit de substrato para peroxidase (=DAB; SK-4100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) - Lâminas de microscópio SuperFrost Plus e lamelas - Meio de embebimento isento de xilol (Medite, Burgdorf, Alemanha; X-tra Kitt)
Procedimento: - transferir as secções flutuantes para H202 a 0,3% arrefecida em gelo e incubar por 30 minutos
- lavar por 5 minutos com tampão TBST - incubar com soro de burro/TBST por 20 minutos - incubar com anticorpo primário por 24 horas à temperatura ambiente - lavar com tampão TBST por 5 minutos - incubar com soro de bloqueio por 20 minutos - lavar com tampão TBST por 5 minutos - incubar com anticorpo secundário por 60 minutos à temperatura ambiente - lavar com tampão TBST por 5 minutos - incubar com StreptABComplex por 60 minutos à temperatura ambiente - lavar com tampão TBST por 5 minutos - incubar com DAB por 20 minutos - montar a secção em lâminas, secar as lâminas ao ar, desidratar as lâminas com álcool e embeber as lâminas 91 ΕΡ 1 976 877/ΡΤ
Para além da inspecção visual das secções ao microscópio, a coloração do amilóide foi adicionalmente quantificada por excisão óptica de 10 placas seleccionadas aleatoriamente das imagens histológicas usando o sistema de análise de imagem ImagePro 5.0 e determinando o seu valor médio em escala de cinzentos. Os valores de densidade óptica (foram calculados a partir dos valores em escala de cinzentos por subtracção da densidade média de fundo do material corado da densidade das placas de amilóide (0% - nenhuma coloração da placa acima do fundo circundante, 100% - nenhuma transmissão/coloração máxima). As diferenças entre os anticorpos 6E10/4G8 e 6G1, 8C5 e 8F5, respectivamente, foram testadas quanto à significância estatística com ANOVA.
Resultados:
Todo o material corado com o anticorpo descrito provou ser de depósitos amilóides congofilicos (Figura 7(A)). Os anticorpos 8F5 e 8C5 com preferência para globulómeros, coraram os depósitos parenquimatosos e congofilicos meníngeos de péptido A significativamente menos do que os anticorpos 6G1 e 6E10 (Figuras 7(B) -(C), (H)). A análise quantitativa da coloração da placa amilóide parenquimatosa revelou ligação de todos os anticorpos às placas (densidade estatisticamente significativa acima do controlo), porém a ligação dos anticorpos 8F5 e 8C5 foi significativamente inferior à ligação do anticorpo de referência 6E10 (criado contra a sequência N-terminal de A ) e igualou ou foi inferior ao anticorpo de referência 4G8 (criado contra a sequência N-terminal de A ) (Figura 7(D) -figura(G)).
Os anticorpos 8F5 e 8C5 ligam-se menos aos depósitos de amilóide do que os anticorpos que reconhecem o monómero A ou parte da sequência de A .0 tratamento com anticorpos que se ligam ao péptido A fibrilar pode conduzir à dissolução rápida das placas amilóides no tecido cerebral e a um aumento subsequente da concentração de A solúvel, o que por sua vez se acredita ser neurotóxico e poder levar a micro-hemorragias e/ou a uma dissolução rápida do amilóide vascular, o que também levaria a micro-hemorragias. Portanto, é preferida uma terapia com anticorpos que afecte o globulómero solúvel e não o monómero.
Lisboa, 2014-04-15
Claims (16)
- ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada e leve variáveis, em que: as três CDR da referida cadeia pesada variável são SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6 e SEQ ID NO: 7, e as três CDR da referida cadeia leve variável são SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO:10, em que o anticorpo se liga com maior especificidade a um globulómero de proteína beta-amilóide do que a um monómero de proteína beta-amilóide.
- 2. Anticorpo monoclonal da reivindicação 1, que é um anticorpo humanizado.
- 3. Anticorpo monoclonal da reivindicação 1, em que a cadeia pesada variável compreende SEQ ID NO:3, e a cadeia leve variável compreende SEQ ID NO:4.
- 4. Anticorpo humanizado da reivindicação 2, em que todas, ou substancialmente todas, as regiões de estrutura correspondem às de uma sequência de consenso da imunoglobulina humana.
- 5. Hibridoma possuindo o número de designação PTA-7238 na American Type Culture Collection.
- 6. Anticorpo monoclonal (8F5) produzido pelo referido hibridoma da reivindicação 5.
- 7. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, para utilização no tratamento ou prevenção da Doença de Alzheimer.
- 8. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6.
- 9. Vacina compreendendo um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, e um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
- 10. Utilização de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, no fabrico de um medicamento para tratamento ou prevenção da Doença de Alzheimer. ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 2/3
- 11. Método de diagnóstico da Doença de Alzheimer num paciente que se suspeita que tenha esta doença, compreendendo as etapas de: a) contacto de uma amostra biológica do referido paciente com um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, durante um tempo e sob condições suficientes para formação de complexos antigénio/anticorpo; e b) detecção da presença dos referidos complexos antigénio/anticorpo na referida amostra, a presença dos referidos complexos indicando um diagnóstico de Doença de Alzheimer no referido paciente.
- 12. Método de diagnóstico da Doença de Alzheimer num paciente que se suspeita que tenha esta doença, compreendendo as etapas de: a) contacto de uma amostra biológica do referido paciente com um antigénio, que é um globulómero de proteína beta-amilóide (Αβ), durante um tempo e sob condições suficientes para a formação de complexos antigénio/anticorpo; b) adição de um conjugado aos resultantes complexos anticorpo/antigénio durante um tempo e sob condições suficientes para permitir que o referido conjugado se ligue ao anticorpo ligado, em que o referido conjugado compreende um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, c) detecção da presença dos referidos complexos antigénio/anticorpo na referida amostra, a presença dos referidos complexos indicando um diagnóstico de Doença de Alzheimer no referido paciente.
- 13. Método de diagnóstico da Doença de Alzheimer num paciente que se suspeita que tenha esta doença, compreendendo as etapas de: a) contacto de uma amostra biológica do referido paciente com anti-anticorpo, em que o referido anti-anticorpo é específico para o referido anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, durante um tempo e sob condições suficientes para permitir a formação de complexos anti-anticorpo/anticorpo, os referidos complexos contendo anticorpo presente na referida amostra biológica; ΕΡ 1 976 877/ΡΤ 3/3 b) adição de um conjugado aos resultantes complexos anti-anticorpo /anticorpo durante um tempo e sob condições suficientes para permitir que o referido conjugado se ligue ao anticorpo ligado, em que o referido conjugado compreende um antigénio, que se liga a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável; e c) detecção de um sinal gerado pelo referido composto gerador de sinal, o referido sinal indicando um diagnóstico de Doença de Alzheimer no referido paciente.
- 14. Método de identificação de compostos adequados para imunização activa de um paciente que se prevê que desenvolva Doença de Alzheimer compreendendo as etapas de: a) exposição de um ou mais compostos de interesse a um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, durante um tempo e sob condições suficientes para que os referidos um ou mais compostos se liguem ao referido anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6; e b) identificação dos compostos que se ligam ao referido anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, destinando-se os referidos compostos identificados a utilização em imunização activa num paciente que se prevê que desenvolva Doença de Alzheimer.
- 15. Kit compreendendo: a) um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, e b) um conjugado compreendendo um segundo anticorpo especifico para globulómeros de proteína Αβ ligado a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável, em que o referido segundo anticorpo do referido conjugado é diferente do referido anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6.
- 16. Kit compreendendo: a) um anti-anticorpo contra um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-4, ou 6, e b) um conjugado compreendendo um globulómero de proteína Αβ ligado a um composto gerador de sinal capaz de gerar um sinal detectável. Lisboa, 2014-04-15
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