ES2307396B1

ES2307396B1 - Sistemas de eliminacion de sustancias neurotoxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas mediante su atrapamiento selectivo por inmunoafinidad en el liquido cefalo-raquideo circulante.

Info

Publication number: ES2307396B1
Application number: ES200602339A
Authority: ES
Inventors: Justo Garcia De Yebenes Prous; Isabel Rubio Gomez
Original assignee: FUNDACION PARA INVESTIGACIONES; FUNDACION PARA INVESTIGACIONES NEUROLOGICAS (FIN)
Current assignee: FUNDACION PARA INVESTIGACIONES; FUNDACION PARA INVESTIGACIONES NEUROLOGICAS (FIN)
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2009-09-30
Anticipated expiration: 2026-09-14
Also published as: ES2307396A1; WO2008031911A1

Abstract

Sistemas de eliminación de sustancias neurotóxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas mediante su atrapamiento selectivo por inmuniafinidad en el líquido cefalorraquídeo circulante. La presente invención se refiere a un dispositivo para la eliminación de sustancias neurotóxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas mediante su atrapamiento selectivo por inmunoafinidad en el líquido cefalorraquídeo circulante.

Description

Sistemas de eliminación de sustancias neurotóxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas mediante su atrapamiento selectivo por inmunoafinidad en el líquido céfalo-raquídeo circulante.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo para la eliminación de sustancias neurotóxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas mediante su atrapamiento selectivo por inmunoafinidad en el líquido cefalorraquídeo circulante. Por lo tanto, puede se englobada en el campo de la medicina concretamente en el sector referido a patologías neurodegenerativas.

Estado de la técnica

No existen sistemas implantables de purificación de líquido cefalorraquídeo sino solo sistemas de drenaje. No se ha utilizado el principio de inmunoafinidad para atrapar sustancias neurotóxicas para el cerebro.

El concepto de enfermedades neuro-degenerativas fue acuñado a finales del siglo XIX, con elementos fundamentalmente negativos, y ha ido variando durante los últimos años. Básicamente incluye los siguientes elementos:

-: Enfermedades sin evidencia de lesión exógena (infección, isquemia, trauma, tumor, etc.).

-: Afectación sistémica preferente de uno o varios sistemas neuronales (sustancia nigra, estriado, cerebelo, córtex hipocámpico y entorrinal, córtex frontal y temporal, motoneuronas, etc.).

-: Curso insidioso, carácter progresivo.

-: Inicio tardío, aumento de prevalencia con el envejecimiento.

Existe un número muy importante de enfermedades neurodegenerativas, algunas de las cuales comparten elementos clínicos y patogénicos pero, si utilizamos el criterio de los sistemas neuronales fundamentalmente afectos, podríamos clasificarlas en los siguientes grupos:

-: De la corteza cerebral.

-: Demencias, tipo Alzheimer, tipo Pick y otras

-: Epilepsias mioclónicas progresivas (enfermedad de Lafora, Unverrich Lumborg, etc.).

-: De los ganglios basales.

-: Enfermedad de Parkinson y síndromes acinéticos.

-: Enfermedad de Huntington y otras coreas.

-: Distonías degenerativas.

-: Del cerebelo.

-: Ataxias espino cerebelosas familiares dominantes y recesivas.

-: Ataxias cerebelosas esporádicas.

-: De las motoneuronas.

-: Esclerosis lateral amiotrófica.

-: Paraparesias espásticas familiares.

-: Atrofia espinal y bulbar.

En la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, con algunas excepciones relacionadas sobre todo con las enfermedades atribuibles a mutaciones conocidas de determinados genes, se desconocen las causas que la producen y los mecanismos a través de los cuales se afecta el sistema nervioso. Sin embargo, hasta la fecha se han identificado en la mayoría de estas enfermedades una serie de proteínas cuyo depósito en las zonas lesionadas del cerebro se asocia con la enfermedad. Esas proteínas incluyen como elementos más importantes los que se expresan en la tabla adjunta:

1

Con independencia de estos tipos de enfermedades neurodegenerativas que se asocian a acúmulo de proteínas existen otras en las que se acumulan sustancias fisiológicas que en exceso se vuelven tóxicas. Entre estas habría que incluir, por ejemplo, la enfermedad de Wilson, que se produce por una acúmulo excesivo de cobre en los órganos afectos o las de acúmulo (glucogenosis, lipidosis, amino acidopatías, etc). Todas estas enfermedades son susceptibles de beneficiarse del procedimiento de purificación que describimos a continuación y que patentamos aunque se necesitan modificaciones técnicas que describimos a continuación.

La enfermedad mas prevalente, en la que mas hemos trabajado y en la que el desarrollo del producto está mas avanzado es la enfermedad de Alzheimer por lo que realizaremos una descripción detallada del mecanismo de producción de esta enfermedad y del sistema de tratamiento que deseamos proteger con esta patente.

La enfermedad de Alzheimer fue descrita por este neurólogo alemán hace ahora un siglo en una paciente de 53 años de edad que había empezado tres años antes con un delirio de celos con su esposo y que durante la evolución de la enfermedad presentó pérdida de memoria, trastorno del lenguaje, desorientación, agitación, trastornos motores graves que la condujeron a la inmovilidad y muerte. La autopsia practicada en el cerebro de esta paciente, Auguste D., mostró un espectro característico muy diferente de lo que entonces se conocían como las demencias mas frecuentes, la sifilítica, y la arteriosclerótica. El maestro de Alzheimer, Kaepelin, quien describió las lesiones cerebrales observables en los esquizofrénicos, la llamó "enfermedad de Alzheimer", nombre con el que ha llegado a nuestros días. El propio Kraepelin llamó a la esquizofrenia "demencia precoz" por su aparición en la juventud. En consecuencia con esta terminología la enfermedad de Alzheimer (EA) recibió el nombre de "demencia senil" por presentarse en épocas tardías de la vida.

Durante la primera mitad del siglo XX la EA fue considerada una enfermedad rara. Durante muchos años se distinguió entre la demencia senil, que aparecía en personas mayores de 65 años y tenía causas diversas y la demencia presenil, considerada como la genuina EA, de aparición anterior a ese límite. Luego se ha visto que ambas son indistinguibles desde el punto de vista clínico y anatómico. En los últimos años se ha demostrado que la EA es la demencia mas frecuente en Occidente y que supone algo más de la mitad del número total de pacientes con demencia. Su prevalencia aumenta con la edad y, aunque no existen datos seguros y universales, se estima que afecta a un 5% de los sujetos mayores de 65 años. El número de casos con EA se dobla cada 5 años lo que nos lleva a una prevalencia de 40-45% en sujetos mayores de 85 años y a unas cifras aproximadas de 600.000 casos en España, 6.000.000 en la unión europea y unos 15 millones en el mundo occidental desarrollado. La supervivencia es de unos 3 años por lo que podríamos decir que entran en el campo de pacientes con esta enfermedad unos 5.000.000 de pacientes al año.

Las demencias constituyen, en este momento, una de las causas mas frecuentes de muerte en el mundo y su número aumenta rápidamente. Con un costo aproximado de unos 40.000

\euro

por paciente y año, de los que la mayor parte corresponden a pérdida de salarios, personal cuidador, cuidados especiales no sanitarios, ingreso en residencias, etc, y solo una pequeña parte a gasto sanitario -atención médica, medicinas y asistencia hospitalaria solo suponen un 8,7% del total- puede calcularse que el costo socio-sanitario de las demencias en el mundo occidental puede alcanzar los 600.000 millones de euros, es decir, mas del cuádruplo de los gastos e ingresos del Estado Español según los presupuestos generales del año 2006. Por esto, si se encontrara algún mecanismo para aliviar estas enfermedades no hay duda de que este tendría un gran impacto productivo y financiero.

La causa de la EA es desconocida en la mayor parte de los casos. Un pequeño porcentaje de pacientes presentan mutaciones de una serie de genes que juegan un papel importante en la producción y procesamiento de una proteína, el \beta-amiloide, que se deposita en el cerebro de estos pacientes y que constituye una de las lesiones características, las placas seniles. Hasta ahora se conocen tres genes cuya mutación produce EA. Uno de ellos, el de la proteína precursora del amiloide, en inglés APP, puede producir fragmentos de amiloide anormales, difíciles de manejar por la célula, que tienden a agregarse y depositarse en el cerebro. Los otros dos genes, de las presenilinas 1 y 2, producen unas proteínas que intervienen en el procesamiento del amiloide. Las mutaciones de estos dos genes alteran el procesamiento del amiloide y favorecen su depósito.

En el cerebro de los pacientes con EA se deposita otra proteína importante para las neuronas, la proteína tau, que produce unas lesiones intraneuronales características que se llaman los ovillos neurofibrilares. La proteína tau que se encuentra en el cerebro de los pacientes con EA es anormal, está hiperfosforilada y tiende a agregarse. Pero las mutaciones de proteína tau no producen enfermedad de Alzheimer sino otro tipo de demencia. De modo que parece que, aunque la tau juega un papel muy importante en

\hbox{la  producción de la EA, el papel
patogénico del amiloide es necesario.}

En este momento no existe tratamiento curativo de la enfermedad de Alzheimer ni tratamiento neuroprotector aunque podemos mejorar, de manera transitoria, con fármacos y con estimulación, determinadas funciones cerebrales como la memoria, el lenguaje, la orientación, las praxias y otras. También podemos aliviar importantes trastornos que con frecuencia aparecen y que perturban mucho la calidad de vida de los pacientes: el insomnio, la irritabilidad, la depresión, la agitación, el delirio y otros.

La mayoría de los tratamientos curativos o neuroprotectores que se han investigado o se están investigando intentan disminuir la carga de amiloide o disminuir la fosforilación de la proteína tau o ambos. Empiezan a sintetizarse fármacos que pueden actuar sobre la proteína tau pero los intentos de disminuir la carga de amiloide tienen una tradición mas larga. Las estrategias curativas o neuroprotectoras mas empleadas basadas en la hipótesis del amiloide son las que se describen en la tabla adjunta:

TABLA 1 Estrategias terapéuticas en la enfermedad de Alzheimer basadas en la hipótesis amiloide

2

Existe un gran interés en la utilización de sustancias químicas que cambien la configuración de la proteína amiloide, impidan su depósito y faciliten su eliminación (Rzepecki P, Nagel-Steger L, Feuerstein S, Linne U, Molt O, Zadmard R, Aschermann K, Wehner M, Schrader T, Riesner D. Prevention of Alzheimer's disease-associated Abeta aggregation by rationally designed nonpeptidic beta-sheet ligands. J Biol Chem. 2004 Nov 12;279(46):47497-505; Nguyen KV, Gendrault JL, Wolff CM. Poly-L-lysine dissolves fibrillar aggregation of the Alzheimer beta-amyloid peptide in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Mar 8;291(4):764-8.). Pero estos productos tienen problemas. En general son sustancias polares, potencialmente tóxicas, que no penetran bien en el cerebro y que por tanto pueden no ser efectivas. Otra estrategia consiste en utilizar sustancias que intervienen en el transporte del amiloide. El polietilenglicol es una de ellas y en animales experimentales ha mostrado capacidad de mejorar la acumulación de amiloide y el trastorno de función neuronal que se produce tras el traumatismo craneal (Koob AO, Borgens RB. Polyethylene glycol treatment after traumatic brain injury reduces beta-amyloid precursor protein accumulation in degenerating axons. J Neurosci Res. 2006 Mar 22; [Epub ahead of print]). La penetración de estas sustancias en el cerebro traumatizado es mas fácil que en el caso de las demencias puesto que en el primero de los casos existe una ruptura de la barrera hematoencefálica y en el segundo, no.

Hace algunos años se acogió con gran interés y expectación el desarrollo de vacunas contra el amiloide en la enfermedad de Alzheimer. La racionalidad de este procedimiento consiste en inmunizar a los pacientes con el péptido patógeno y esperar la producción de anticuerpos que atrapen ese péptido, impidan su depósito en estructuras \beta, y faciliten su eliminación. Se realizó un ensayo a gran escala inmunizando pacientes con \beta-amiloide pero el estudio debió de ser suspendido porque un 6% de los pacientes desarrollaron meningo-encefalitis. Sin embargo, pudo demostrarse que el procedimiento podría ser útil puesto que los pacientes que desarrollaron anticuerpos presentaron mejoría clínica y cambios en los niveles de proteínas en el líquido cefalorraquídeo que sugerían que el procedimiento podría ser útil si se conseguía eliminar las complicaciones (Schenk D, Barbour R, Dunn W, Gordon G, Grajeda H, Guido T, Hu K, Huang J, Johnson-Wood K, Khan K, Kholodenko D, Lee M, Liao Z, Lieberburg I, Motter R, Mutter L, Soriano F, Shopp G, Vasquez N, Vandevert C, Walker S, Wogulis M, Yednock T, Games D, Seubert P. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature. 1999 Jul 8;400(6740):173-7; Fox NC, Black RS, Gilman S, Rossor MN, Griffith SG, Jenkins L, Koller M; AN1792(QS-21)-201 Study. Effects of Abeta immunization (AN1792) on MRI measures of cerebral volume in Alzheimer disease. Neurology. 2005 May 10;64(9):1563-72; Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, Griffith SG, Fox NC, Eisner L, Kirby L, Rovira MB, Forette F, Orgogozo JM; AN1792(QS-21)-201. Clinical effects of Abeta immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology. 2005 May 10;64(9):1553-62). Desde entonces se ha intentado modificar el tratamiento con diversas estrategias de inmunización, bien pasiva, administrando anticuerpos (Dodel RC, Hampel H, Du Y. Immunotherapy for Alzheimer's disease. Lancet Neurol. 2003 Apr; 2(4):215-20), o bien con ideas tan originales como producir patatas transgénicas que producen amiloide y pueden mantener una administración oral continuada de baja intensidad (Youm JW, Kim H, Han JH, Jang CH, Ha HJ, Mook-Jung I, Jeon JH, Choi CY, Kim YH, Kim HS, Joung H. Transgenic potato expressing Abeta reduce Abeta burden in Alzheimer's disease mouse model FEBS Lett. 2005 Dec 19;579(30):6737-44. Epub 2005 Nov 21). El interés por disminuir los niveles cerebrales de amiloide es tan grande que algunos grupos han llegado al extremo de implantar en el cerebro de animales hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra el péptido amiloide (Gaugler MN, Tracy J, Kuhnle K, Crameri A, Nitsch RM, Mohajeri MH. Modulation of Alzheimer's pathology by cerebro-ventricular grafting of hybridoma cells expressing antibodies against Abeta in vivo. FEBS Lett. 2005 Jan 31; 579(3):753-6), método que nos parece absolutamente inviable desde el punto de vista terapéutico.

Estos intentos terapéuticos solo sirven para poner de manifiesto un hecho muy relevante. El amiloide se puede movilizar de la sangre al cerebro y viceversa y los niveles cerebrales de amiloide pueden disminuir si se consigue extraer amiloide cerebral (DeMattos RB, Bales KR, Cummins DJ, Dodart JC, Paul SM, Holtzman DM. Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17; 98(15):8850-5. Epub 2001 Jul 3; DeMattos RB, Bales KR, Cummins DJ, Paul SM, Holtzman DM. Brain to plasma amyloid-beta efflux: a measure of brain amyloid burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Science. 2002 Mar 22; 295(5563):2264-7). El transporte de amiloide tiene lugar sobre todo a través del plexo coroide, se media por megalina y por factor de crecimiento similar a la insulina (IGF). La manipulación de estos sistemas de transporte tiene carácter beneficioso en modelos experimentales de EA y se considera de gran interés terapéutico en la propia enfermedad (Carro E, Trejo JL, Gomez-Isla T, LeRoith D, Torres-Aleman I. Serum insulin-like growth factor I regulates brain amyloid-beta levels. Nat Med. 2002 Dec; 8(12):1390-7; Carro E, Trejo JL, Gerber A, Loetscher H, Torrado J, Metzger F, Torres-Aleman I. Therapeutic actions of insulin-like growth factor I on APP/PS2 mice with severe brain amyloidosis. Neurobiol Aging. 2005 Sep 22; [Epub ahead of print]; Carro E, Spuch C, Trejo JL, Antequera D, Torres-Aleman I. Related Articles, Links Choroid plexus megalin is involved in neuroprotection by serum insulin-like growth factor I. J Neurosci. 2005 Nov 23; 25(47):10884-93).

De modo que si el aumento de extracción del \beta-amiloide cerebral a través del plexo coroide y el líquido cefalorraquídeo (LCR), mediado por IGF disminuye los niveles cerebrales de este péptido y produce una mejoría clínica en los animales, pero es de difícil aplicación por los efectos secundarios que produciría la administración continua de productos parecidas a la insulina, habría que buscar métodos eficientes y seguros de extraer el amiloide cerebral. Sobre esto es sobre lo que hemos trabajado y sobre lo que reclamamos nuestra patente.

En condiciones normales el cerebro humano produce un volumen de LCR de alrededor de 0,42 \pm 0,13 ml/min, es decir, poco mas de medio litro diario. Esa producción está disminuida a la mitad en pacientes con EA y con hidrocefalia a presión normal. En un estudio preliminar se ha demostrado que un grupo de pacientes tratados con una derivación ventrículo-peritoneal de baja presión presentaban una estabilización de su situación neurológica durante el periodo de seguimiento, 1 año, mientras que el grupo no tratado continuaba empeorando. Por otra parte, en el grupo tratado los niveles de proteína amiloide y tau en el LCR disminuían con el drenaje (Silverberg GD, Mayo M, Saul T, Carvalho J, McGuire D. Novel ventriculo-peritoneal shunt in Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers. Expert Rev Neurother. 2004 Jan;4(1):97-107).

Si el drenaje de LCR aumenta la extracción de amiloide cerebral y esto condiciona una mejoría de la evolución de los pacientes con EA, la implantación de válvulas debería mejorar a los pacientes con esta enfermedad. El tratamiento de la EA con derivación ventricular no es, sin embargo, un tratamiento reconocido por la comunidad neurológica a pesar de que existen estudios que demuestran que los pacientes implantados con derivaciones mejoraban de manera significativa incluso en los casos en los que la biopsia cerebral preoperatoria demostraba cambios degenerativos compatibles con enfermedad de Alzheimer (Bech RA, Waldemar G, Gjerris F, Klinken L, Juhler M. Shunting effects in patients with idiopathic normal pressure hydrocephalus; correlation with cerebral and leptomeningeal biopsy findings. Acta Neurochir (Wien). 1999;141(6):633-9; Golomb J, Wisoff J, Miller DC, Boksay I, Kluger A, Weiner H, Salton J, Graves W. Alzheimer's disease comorbidity in normal pressure hydrocephalus: prevalence and shunt response. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2000 Jun; 68(6):778-81).

Por otra parte, es fácil imaginar que el procedimiento de derivación de LCR pueda no ser efectivo, aunque sus fundamentos científicos sean sólidos, en dos circunstancias: a) cuando la derivación de LCR sea insuficiente, y b) cuando la reentrada de proteínas al cerebro sea un fenómeno importante. El transporte de amiloide de la sangre al cerebro ha sido demostrado (Zlokovic BV. Cearing amyloid through the blood brain barrier. J Neurochem 2004; 89: 807-811) y se han diseñado estrategias para limitarlo pero hasta ahora esas estrategias son escasamente eficaces.

Las derivaciones ventrículo peritoneales pueden ser de distinta presión y las de presión media o alta pueden no drenar suficiente líquido. Por otra parte el amiloide extraído puede reentrar rápidamente en el cerebro si no es neutralizado o eliminado (Deane R, Sagare A, Hamm K, Parisi M, LaRue B, Guo H, Wu Z, Holtzman DM, Zlokovic BV. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 2005 Dec 14;25(50):11495-503). Nosotros hemos demostrado que el amiloide puede ser eliminado y sus niveles plasmáticos disminuidos por hemodiálisis (Rubio I, Caramelo C, Lopez D, Gil A, de Yébenes A. Amyloid plasma levels, \beta 1-42, are reduced by haemodialysis. J Alzheimer Dis, en prensa) pero este procedimiento se asocia a una notable morbilidad y a molestias. El otro mecanismo de eliminación consiste en la neutralización del amiloide con anticuerpos de alta afinidad (Deane R, Sagare A, Hamm K, Parisi M, LaRue B, Guo H, Wu Z, Holtzman DM, Zlokovic BV. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 2005 Dec 14;25(50):11495-503). En esta última estrategia se basa nuestra invención cuyo objetivo último es evitar los niveles altos de péptido \beta-amiloide en cerebro mediados por su recuperación a través de la barrera hematoencefálica (Andreasen N, Vanmechelen E, Vanderstichele H, Davidsson P, Blennow K. Cerebrospinal fluid levels of total-tau, phospho-tau and A beta 42 predicts development of Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment. Acta Neurol Scand Suppl. 2003;179:47-51; Strazielle N, Ghersi-Egea JF, Ghiso J, Dehouck MP, Frangione B, Patlak C, Fenstermacher J, Gorevic P. In vitro evidence that beta-amyloid peptide 1-40 diffuses across the blood-brain barrier and affects its permeability. J Neuropathol Exp Neurol. 2000 Jan; 59(1):29-38).

Descripción de la invención Breve descripción de la invención

La invención consiste en un sistema de drenaje del líquido céfalo-raquídeo asociado a un sistema de eliminación de moléculas productoras enfermedades degenerativas del sistema nervioso. La purificación del líquido céfalo-raquídeo se realiza mediante un sistema de inmunoafinidad completamente renovable por vía subcutánea.

Descripción de las figuras

Figura 1. Retención del péptido amiloide por columna de afinidad. En el eje de abscisas (X) se muestran los siete experimentos realizados. En el eje de ordenadas (Y) se representa el porcentaje de retención del péptido \beta-amiloide. En los distintos experimentos se modificó el volumen de carga, la temperatura y las condiciones de la columna. Las columnas claras corresponden a la retención del péptido \beta-amiloide mediante el anticuerpo. Las columnas oscuras corresponden a los experimentos sin anticuerpo.

Figura 2. Dibujo esquemático del cerebro y el sistema ventricular. El catéter intra-ventricular se colocó bien desde la región frontal (como en el esquema), bien desde la región occipital y recorre el ventrículo en sentido antero-posterior. El catéter se hizo subcutáneo a través de un agujero de trépano perforado en el cráneo.

Figura 3. Dibujo esquemático de la unión de los dos catéteres ventriculares en el tejido subcutáneo de la región occipital mediante un tubo en Y. Los dos catéteres pueden incorporar puertos para la extracción atraumática del LCR.

Figura 4. Dibujo esquemático del sistema CAPA. Se trata de una columna enrollada de afinidad llena de partículas de agarosa a las que se ha ligado un anticuerpo de alta afinidad por el péptido \beta-amiloide. La columna (C) se cierra con un tapón de lana de vidrio (B) y con un filtro de Millipore de 10 kD (A).

Figura 5.

A. Dibujo esquemático del sistema DAPA. Se trata de una columna enrollada de un tubo de diálisis con poros de tamaño molecular de 10 kD a través de los cuales puede filtrase el péptido \beta-amiloide. El dializador está inmerso en una solución de un anticuerpo de alta afinidad por el péptido \beta-amiloide. El dializador se conecta por su porción proximal a los catéteres ventriculares y por su porción distal al peritoneo.

B. La tapa del dializador contiene un puerto estéril a través de la cual puede cambiarse el anticuerpo cuando se considere necesario.

Descripción detallada de la invención

Sistema de eliminación de amiloide mediante atrapamiento selectivo con anticuerpos de alta afinidad en líquido cefalorraquídeo: este sistema incluye dos posibilidades basadas, en el mismo principio, cuya eficacia relativa debe ser investigada in vivo. Estas dos versiones serán denominadas respectivamente columna de afinidad para purificación de amiloide (CAPA) y dializador de afinidad para purificación de amiloide (DAPA). El objetivo de ambos sistemas es atrapar el amiloide existente en el líquido céfalo-raquídeo de forma irreversible y contribuir a su eliminación y de forma indirecta a la disminución de esté péptido en cerebro. Nosotros hemos demostrado que se puede extraer de manera eficiente péptido \beta-amiloide (1-42) mediante un sistema de inmunoafinidad, haciendo circular el líquido céfalo-raquídeo en contacto con un anticuerpo (Figura 1).

En ambos casos el dispositivo CAPA o DAPA se conecta a un sistema de derivación ventrículo peritoneal de baja presión y de flujo constante (hay varios disponibles en el mercado). El sistema de derivación es el convencional con la única excepción de que se colocan catéteres ventriculares en los dos ventrículos laterales y esos dos catéteres se conectan mediante un tubo en Y al sistema CAPA o DAPA (Figuras 2 y 3). El catéter puede introducirse por la región frontal, como aparece en las figuras adjuntas, o por la porción occipital, menos deseable por la frecuencia existencia de variantes anatómicas, pero en todo caso se pretende que el catéter recorra los ventrículos laterales en sentido antero posterior, el diámetro mayor del ventrículo, con objeto de que la porción fenestrada del catéter esté en contacto con el líquido céfalo-raquídeo de todo el ventrículo, pero especialmente de la región cercana al hipocampo, región cerebral de máxima afectación en la enfermedad de Alzheimer. La derivación se coloca con el propósito de extraer entre 50 y 150 ml de líquido céfalo-raquídeo de cada

\hbox{ventrículo, es 
decir un flujo total de 100 a 300 ml diarios a través de todo el
sistema.}

El sistema CAPA consiste en una columna de inmunoafinidad de agarosa ligada a un anticuerpo monoclonal IgGI contra el péptido \beta-amiloide (ver mas abajo, Figura 4). La columna va enrollada en un contenedor cúbico que se conecta por su porción proximal a la parte distal del sistema de derivación ventricular y por su parte distal al tubo de desagüe en el peritoneo (Figura 4). El extremo distal del sistema CAPA se cierra con un filtro de poro de 10 kD, tipo Milipore o similares, que no permite el paso de moléculas de tamaño mayor de 10000 y que por lo tanto excluye el paso del anticuerpo en el caso de que este se liberase de la resina. El sistema CAPA va inserto en un cubo de material biocompatible de 10 cm de lado y 5 cm de altura, que se implanta debajo de la piel y que puede ser recambiado de forma periódica.

El sistema DAPA es un cubo de material biocompatible de 10 cm de lado y 5 cm de diámetro que está recorrido a lo largo de toda su longitud por tubos de diálisis con un poro de 10 kD (Figura 5 A). El extremo proximal del sistema DAPA se conecta al distal del sistema de derivación ventrículo-peritoneal. El extremo distal del sistema DAPA se cierra con un filtro de poro de 10 kD, tipo Milipore o similares, que no permite el paso de moléculas de tamaño mayor de 10000 de manera que impide, en caso de ruptura de algún tubo de diálisis, el paso de material del implante al peritoneo. En el punto intermedio del sistema DAPA existe un puerto con un filtro estéril (Figura 5 B) que permite insertar una aguja para cambiar la solución de anticuerpo monoclonal IgG1 contra el péptido \beta-amiloide.

Entre los sistemas CAPA y DAPA y las partes proximal y distal del sistema de derivación ventrículo-peritoneal pueden insertarse conectores con puertos para su punción. Estos puertos estériles pueden utilizarse para obtener LCR de forma periódica y atraumática y realizar las medidas correspondientes en el LCR que permitan establecer la conveniencia de cambiar la columna CAPA o la solución de anticuerpo monoclonal IgG1 contra el péptido \beta-amiloide. Los sistemas CAPA y DAPA se implantan en el tejido celular subcutáneo de la pared anterior del tórax, conectados a los componentes proximal y distal del sistema de derivación ventrículoperitoneal.

En el sistema CAPA el LCR fluye a través de una columna de resina cargada con anticuerpo monoclonal IgG1 de alta afinidad contra el péptido \beta-amiloide. El péptido \beta-amiloide es atrapado por el anticuerpo. Cuando la extracción del péptido disminuye es necesario proceder a sustituir la columna, lo que puede hacerse con una mera incisión subcutánea con anestesia local. En el sistema DAPA el LCR fluye a través de tubos de diálisis inmersos en una solución que contiene anticuerpo monoclonal IgG1 de alta afinidad contra el péptido \beta-amiloide. Este péptido difunde a través de los poros de los tubos de diálisis y se fijan al anticuerpo que, por su gran tamaño, no puede entrar en el tubo. El péptido es atrapado. Cuando el anticuerpo se satura de antígeno basta cambiar la solución de anticuerpo de una manera tan simple como insertando una aguja conectada a una jeringa, extrayendo la solución saturada y sustituyéndola por nueva. En este caso no es necesaria ni siquiera anestesia local. El sistema CAPA es previsiblemente más eficiente, el sistema DAPA es previsiblemente más sencillo de mantener.

Otras posibles aplicaciones de los sistemas de eliminación de de sustancias neurotóxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas mediante su atrapamiento selectivo en líquido cefalorraquídeo circulante: este sistema es previsiblemente aplicable al tratamiento de otras enfermedades del sistema nervioso y a estas aplicaciones alternativas queremos extender la patente:

Entre otras podemos citar las siguientes:

1.: Otras enfermedades neurodegenerativas causadas por acúmulo de otras proteínas: Taupatías, como demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresivas, y otras, podrían tratarse con sistemas CAPA y DAPA en los que se utiliza un anticuerpo contra tau, generado bien contra la proteína endógena, contra la fosforilada, o contra la mutada, en los casos de mutaciones.

2.: Enfermedad de Parkinson atribuible a aumento de dosis de sinucleína, mutación de esta proteína o alteración postranslacional de la misma. El anticuerpo, en estos casos, se dirige contra la sinucleína.

3.: Enfermedades neurodegenerativas atribuibles a expansiones de tripletes: Enfermedad de Huntington, ataxias autonómicas dominantes, DRPLA y otras en las que la proteína responsable está mutada y el efecto patógeno se produce por ganancia de función. En estos casos el anticuerpo utilizado también se dirige de forma selectiva a la proteína mutada.

4.: Enfermedades de acúmulo por trastornos metabólicos. Los ejemplos mas típicos son las gangliosidosis, otras lipidosis, amino academias, etc. En estos casos el anticuerpo se dirige contra el producto tóxico. Por ejemplo en la gangliosidosis GM2 contra esta sustancia.

5.: Enfermedades por depósitos de metales, como la enfermedad de Wilson o la enfermedad de Hallerworden- Spatz en las que los sistemas CAPA y DAPA no se rellenan con anticuerpos sino con resinas atrapadoras de cobre o hierro, respectivamente.

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Ejemplo 1

Captura de amiloide por inmunoafinidad 1. Preparación de la columna de inmunoafinidad Resina

Affi-Gel® Hydrazide Gel de Bio-Rad. Es una matriz de agarosa que reacciona con los grupos aldehidos de los carbohidratos oxidados para formar enlaces covalentes estables.

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Anticuerpo

Anticuerpo monoclonal de ratón antiproteína beta amiloide, IgG1, ej: clon 6E10 (1 mg/ml) de Chemicon o similares.

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Intercambio del tampón del anticuerpo

Para optimizar la oxidación del anticuerpo y la inmovilización a la resina se intercambia el tampón en el que viene disuelto el anticuerpo (PBS) por el recomendado por el fabricante de la resina, Affi-Gel Hz tampón de acoplamiento, pH 5.5.

Partimos de 45 \mul de IgG1-6E10. Se lleva hasta un volumen de 3 mL de Affi-Gel Hz tampón de acoplamiento, pH 5.5. Se pasa por la columna Econo-Pac 10 DG desalting (Bio-Rad). Eluimos de la columna con el Affi-Gel Hz tampón de acoplamiento, pH 5.5, (120% del volumen inicial). Se recoge el eluído, con lo que tenemos el anticuerpo preparado para la oxidación.

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Oxidación de la IgG

El anticuerpo se oxida con periodato sódico (NaIO_{4}). A la solución de IgG purificada se le añade NaIO_{4} en una proporción 10:1 (v/v). Se pone en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente y protegido de la luz.

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Intercambio del tampón de la IgG oxidada

Para eliminar el NaIO_{4} de la solución de IgG que pueda interferir en la unión de la IgG a la resina se pasa de nuevo por la columna de intercambio desaladora Econo-Pac 10 DG (Bio-Rad) previamente equilibrada con el tampón de acoplamiento Affi-Gel Hz, pH 5.5. Se recoge el eluído y se guarda para posteriormente unirlo a la resina.

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Preparación de la resina

La resina Affi-Gel® Hydrazide Gel esta resuspendida en isopropanol.

En primer lugar hay que eliminar el isopropanol.

En 2 tubos se ponen 5 ml de la suspensión de Affi-Gel® Hydrazide Gel, uno se utiliza para la columna de inmunoafinidad y el otro para la columna control (la que no llevará unida la IgG). Se procesan en paralelo.

Se deja reposar y se elimina el sobrenadante de isopropanol. Se añaden 10 ml de tampón de acoplamiento Affi-Gel Hz, pH 5.5, se agita y se deja reposar de nuevo.

Se elimina el sobrenadante y se repite este proceso.

Se añaden 5 ml de tampón de acoplamiento Affi-Gel Hz, pH 5.5, con lo que la resina queda preparada para pegarla a la IgG.

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Unión de la IgG oxidada a Affi-Gel Hz hydrazide gel y preparación de las columnas

Se incuba la resina con la solución de IgG oxidada o/n (17 h.) a temperatura ambiente con agitación.

Transcurrido este tiempo se carga la resina en la columna de vidrio de 1x10 cm.

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Se recoge el eluyente para determinar el volumen del lecho. Se equilibra la columna con el volumen de PBS 0.5 M NaCl pH 7. Se eluye este tampón y se lava de nuevo con PBS pH 7 y ácida sódica 0.02%. Se guardan las dos columnas en estas condiciones a 4°C hasta su utilización.

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2. Aplicación de la muestra

Se equilibran las columnas a temperatura ambiente. Se lavan las columnas con 4 volúmenes de citrato sódico 0.15 M pH 3 que es el tampón elegido para eluir el antígeno. Se regeneran las columnas con 10 ml de PBS pH 7. Se pasan por cada columna 3 ml de LCR (de esta misma muestra se guardan a -20°C 500 \mul para determinar la cantidad inicial de \beta-amiloide que cargamos). Se cierran las columnas y se agitan durante 2 horas a temperatura ambiente.

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Elusión de la muestra

Se deja eluir la muestra de las columnas. Recogemos distintas fracciones:

1.- Eluído de la columna antes de aplicar el tampón, se recoge un volumen de 2.5 ml. Se aplican 4 ml de PBS 0.5 M NaCl pH 7, se recogen las fracciones: de la 2-6, 0.5 ml cada una. Se deja salir el tampón restante. Se añaden 4 ml de PBS 0.1 M NaCl pH 7. Una vez eluído el segundo tampón se procede a eluir el antígeno que queda pegado a la resina de inmunoafinidad. Se aplican 4 ml de citrato sódico 0.15 M pH 3, se recoge el eluído.

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Equilibrado de las columnas

Se lavan las columnas con 4 ml de PBS pH 7. Se guardan en PBS pH 7 y ácida sódica 0.02% a 4°C para usos sucesivos.

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Resultados

La cuantificación de \beta-amiloide se hace por medio de ELISA. Se utiliza el kit INNOTEST^{TM} \beta-amiloide (1-42) de alta sensibilidad de INNOGENETICS. Se realiza según las instrucciones del fabricante. En los distintos experimentos realizados se observa que incluso la resina, sin anticuerpo ligado a ella, tiene una cierta capacidad para ligar el \beta-amiloide (1-42) pero que la columna cargada con anticuerpo tiene una capacidad de atrapar el \beta-amiloide (1-42) del doble 73,4\pm24,9% (media \pm desviación estándar) que la resina sola, 37,9\pm31,3% (media \pm desviación estándar). Las diferencias son estadísticamente significativas (p<0,05). Los resultados se expresan en la figura 1.

Claims

1. Aparato de eliminación de sustancias neurotóxicas causantes de enfermedades neurodegenerativas en humanos caracterizado por disponer de 2 catéteres implantados, respectivamente en cada uno de los ventrículos laterales del cerebro, izquierdo (I) o derecho (D), catéteres conectados a la salida de dichos ventrículos mediante una conexión en Y, a un sistema de bombeo de baja presión y flujo constante que extrae el líquido cefalorraquídeo de los ventrículos y lo evacua en el peritoneo, y también por disponer, antes del peritoneo, de un dispositivo de atrapamiento de la sustancia neurotóxica mediante unión de la misma a un anticuerpo monoclonal IgG1 que forma parte, bien de una columna de afinidad, bien de un sistema de diálisis con capilares de tamaño de poro de 10 kDa, colocándose, en ambos casos, en su extremo distal respectivo de evacuación al peritoneo, un filtro de tamaño de poro de 10 kDa.

2. Aparato según la reivindicación 1 de eliminación de péptido amiloide en humanos que dispone de 2 catéteres implantados, respectivamente en cada uno de los ventrículos laterales del cerebro, izquierdo (I) o derecho (D), catéteres conectados a la salida de dichos ventrículos mediante una conexión en Y, a un sistema de bombeo de baja presión y flujo constante que extrae el líquido cefalorraquídeo de los ventrículos y lo evacua en el peritoneo, y que también dispone, antes del peritoneo, de un dispositivo de atrapamiento del péptido amiloide mediante unión del mismo a un anticuerpo monoclonal IgG1 que forma parte, bien de una columna de afinidad, bien de un sistema de diálisis con capilares de tamaño de poro de 10 kDa, colocándose, en ambos casos, en su extremo distal respectivo de evacuación al peritoneo, un filtro de tamaño de poro de 10 kDa.