DE60226036T9

DE60226036T9 - ANTIKÖRPER, DER DAS GM1-GANGLIOSID-GEBUNDENE AMYLOID-b-PROTEIN ERKENNT, UND DNA, DIE FÜR DIESEN ANTIKÖRPER CODIERT

Info

Publication number: DE60226036T9
Application number: DE60226036.1T
Authority: DE
Inventors: Katsuhiko Yanagisawa; Masao Shibata
Original assignee: JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR OF CHUBU NATIONAL HOSPITAL; Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR OF CHUBU NATIONAL HOSPITAL; Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2002-08-01
Publication date: 2016-09-29
Also published as: EP1420032A1; US20040181042A1; EP1420032B1; JP4102850B2; EP1420032A4; WO2003014162A1; DE60226036D1; JP2008074854A; DE60226036T2; JPWO2003014162A1; DE60226036T3; EP1420032B2; US7339035B2; JP4729717B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper und ein den Antikörper kodierendes Gen. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung einen mit der Alzheimer-Krankheit assoziierten Antikörper sowie ein den Antikörper kodierendes Gen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In Japan schreitet derzeit die Alterung der Bevölkerung mit der höchsten Geschwindigkeit voran, die man jemals erfahren hat, und damit einhergehend erhöht sich die Anzahl der Patienten mit Demenz. Gemäß einer vom National Institute of Population und Social Security Research durchgeführten Studie wird geschätzt, dass sich die Anzahl der Patienten mit Demenz bis zum Jahr 2000 auf 1,65 Millionen und bis zum Jahr 2015 auf 2,64 Millionen beläuft. Da die Versorgung von solchen an Demenz leidenden Patienten eine große wirtschaftliche Belastung mit sich bringt, besteht ein Bedarf an einer möglichst baldigen Entwicklung einer wirksamen Behandlungsmethode für die Krankheit.
Eine hauptsächlich vorkommende Krankheit seniler Demenzkrankheiten ist die Alzheimer-Krankheit (AK). Wenngleich ein Überblick über die Pathologie dieser Krankheit noch immer nicht vorhanden ist, so schreiten Studien dennoch rapide voran. Häufig in Patienten mit der Alzheimer-Krankheit vorzufindende Symptome sind: (1) Atrophie des Gehirns; (2) Ablagerung von plaqueartigen Substanzen, bezeichnet als senile Plaques; und (3) neurofibrilläre Bündel, in denen fibrilläre Substanzen im Inneren der Neuronen abgelagert werden. Werden diese drei Symptome festgestellt, so wird bei dem Patienten die Alzheimer-Krankheit diagnostiziert. Außer dem Symptom (1), der Atrophie des Gehirns, können jedoch die Bildung von senilen Plaques sowie das neurofibrilläre Bündel nicht durch eine äußerliche Betrachtung festgestellt werden. Dies erschwert die Diagnose der Alzheimer-Krankheit. Es besteht folglich ein Bedarf an einer Entwicklung von biologischen Markern, so wie molekulargenetischen Markern und biochemischen Markern, die über eine für die Diagnose der Alzheimer-Krankheit ausreichende Spezifität und Sensitivität verfügen.
Ein klinisches Symptom der Alzheimer-Krankheit, d. h. die Demenz, wird eng mit dem Verlust von Neuronen assoziiert. Hinsichtlich des Grundes für das Auftreten dieses Verlustes von Neuronen bieten die zuvor genannten pathologischen Veränderungen wichtige Hinweise. Gemäß den Fortschritten der Studien seit der zweiten Hälfte der 1990er wurde inzwischen geklärt, dass es sich bei den senilen Plaques um eine Ablagerung angesammelter Peptide handelt, bezeichnet als Amyloid-β-Protein (Aβ). Auf der anderen Seite wurde das Auftreten der neurofibrillären Bündel dadurch erklärt, dass Tau-Protein, bei dem es sich um eines der Gerüstproteine des Neurons handelt, phosphoryliert und im Inneren des Neurons angelagert wird.
Es ist bekannt, dass die Alzheimer-Krankheit in zwei Formen auftritt, und zwar als familiär auftretende Alzheimer-Krankheit, verursacht durch genetische Faktoren, und als sporadisch auftretende Alzheimer-Krankheit, unabhängig von genetischen Auslösern. Man ist derzeit dabei, die kausativen Gene oder Risikofaktoren der familiär auftretenden Alzheimer-Krankheit aufzuklären. Bei einem der kausativen Gene für die familiär auftretende Alzheimer-Krankheit handelt es sich um ein Gen, das Amyloid-Vorläuferprotein (AVP) kodiert. Es ist bekannt, dass die Alzheimer-Krankheit ohne Ausnahme ausgelöst wird, wenn in diesem Gen eine Mutation vorliegt. Es wird folglich angenommen, dass der klinische Mechanismus der Alzheimer-Krankheit aufgeklärt werden würde, wenn es möglich wäre, die Wirkung und Funktion dieser Mutante herauszufinden. Da erwartet wird, dass der familiär auftretenden Alzheimer-Krankheit und der sporadisch auftretenden Alzheimer-Krankheit der gleiche Mechanismus zu Grunde liegt, wird davon ausgegangen, dass einige der Forschungsergebnisse hinsichtlich der klinischen Mechanismen der familiär auftretenden Alzheimer-Krankheit auf die Fälle der sporadisch auftretenden Alzheimer-Krankheit angewandt werden kann.
Aβ wird mit β- und γ-Sekretasen von einem APP abgespalten. Es wurde berichtet, dass Aβ Aβ₄₀ und Aβ₄₂ in Abhängigkeit von den Abspaltungsstellen, an denen sich Aβ₄₂ mit höherer Wahrscheinlichkeit ansammelt als Aβ₄₀, einschließt und dass gemäß pathologischer Beobachtung Aβ₄₂ sich als erstes, gefolgt von Aβ₄₀, als ein Kern zur Bildung von Fibrillen um Aβ₄₀ anlagert. Jüngste Studien der Erfinder der vorliegenden Erfindung stellen Ergebnisse bereit, die besagen, dass die Ablagerung von Aβ im an der Alzheimer-Krankheit erkrankten Gehirn über die Bindung an GM1-Gangliosid (GM1) (K. Yanagisawa, A. Odaka, N. Suzuki, Y. Ihara, Nat. Med. 1, 1062 (1995); K. Yanagisawa, Y. Ihara, Neurobiol. Aging 19, S65 (1998)) beginnt. Des Weiteren berichteten die Erfinder der vorliegenden Erfindung von der erfolgreichen Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers (Antikörper 4396), der an GM1 gebundenes Aβ spezifisch erkennt (FEBS Letters 420, 43–46 (1997)). Auf der Grundlage der einzigartigen molekularen Charakteristika dieses an GM1 gebundenen Aβ, stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Hypothese auf, dass Aβ über die Bindung an GM1 eine veränderte Konformation annehme und als ein Keim für die Bildung von Amyloidfibrillen fungiere. Im Anschluss daran führten einige Forscher Studien in vitro durch und die zuvor genannte Hypothese wird durch deren Ergebnisse unterstützt; d. h. Aβ bindet auf den Membranen spezifisch an GM1; lösliches Aβ beginnt im Anschluss an die Zugabe von GM1 enthaltenden Liposomen mit der Anlagerung und der Bildung von Amyloidfibrillen (J. McLaurin, A. Chakrabartty, J. Biol. Chem. 271, 26482 (1996); P. Choo-Smith, W. K. Surewicz, FEBS Lett. 402, 95 (1997); P. Choo-Smith, W. Garzon-Rodriguez, C. G. Globe, W. K. Sutrewicz, J. Biol. Chem. 272, 22987 (1997); K. Matsuzaki, C. Horikiri, Biochemistry 38, 4137 (1999); V. Koppaka, P. H. Axelsen, Biochemistry 39, 10011 (2000)).
Im Hinblick auf den molekularen Mechanismus, in dem an GM1 gebundenes Aβ gebildet wird, wurde auf der anderen Seite berichtet, dass die Bindung von Aβ an GM1 von der Konzentration des zu bindenden Cholesterins in den Membranen abhängt; d. h. eine hohe Konzentration von Cholesterin fördert die Bindung von Aβ an GM1 darüber, dass die Bildung von GM1-Clustern in den Membranen unterstützt wird (A. Kakio, S. Nishimoto, K. Yanagisawa, Y. Kozutumi, K. Matsuzaki, J. Biol. Chem. 276, 24985 (2001)). Des Weiteren kann Aβ an GM1 auf synaptischen Membranen des alternden Gehirns binden, da die sich Cholesterinkonzentration in den exofacialen Blättchen der synaptischen Membranen mit zunehmendem Alter und/oder einhergehend mit einem Mangel an Apolipoprotein E (Apo E) signifikant erhöht (U. Igbavboa, N. A. Avdulov, F. Schroeder, W. G. Wood, J. Neurochem. 66, 1717 (1996); U. Igbavboa, N. A. Avdulov, S. V. Chochina, W. G. Wood, J. Neurochem. 69, 1661 (1997)). Dennoch kann Aβ in GM1-reichen und cholesterinreichen Membrandomänen (bezeichnet als Rafts) an GM1 binden, da die Rafts in physiologischer Hinsicht eine große Menge an Aβ enthalten und in den Rafts nicht lösliches Aβ in einer Art eines murinen Modells mit familiär auftretender Alzheimer-Krankheit abgelagert wird (R. G. Parton, J. Histochem. Cytochem. 42, 155 (1994); K. Simons, E. Ikonen, Nature 387, 569 (1997); S. J. Lee et al., Nat. Med. 4, 730 81998); M. Morishima-Kawashima, Y. Ihara, Biochemistry 37, 15274 (1998); N. Sawamura et al., J. Biol. Chem. 275, 27901 (2000)).
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfindungen wurden angesichts des zuvor erwähnten Hintergrunds bewerkstelligt. Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindungen, ein effektives Mittel zur Behandlung, Diagnose oder Vermeidung der Alzheimer-Krankheit bereitzustellen. Genauer gesagt ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindungen, einen Antikörper, der z. B. bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit effektiv ist, sowie besagten Antikörper kodierende DNA ebenso wie ein Verfahren zum Screening eines oder mehrerer Wirkstoffe bereitzustellen.
Zum Ersten identifizierten die Erfinder der vorliegenden Erfindungen die Klasse des Antikörpers (Antikörper 4396), der an GM1 gebundenes Aβ erkennt. Die Klasse des Antikörpers erwies sich als IgM und bei der L-Kette handelte es sich um eine λ-Kette. Dann versuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindungen, die Sequenzen von DNAs zu bestimmen, die variable Regionen einer H-Kette (schweren Kette) und einer L-Kette (leichten Kette) kodieren, und bestimmten auch erfolgreich deren Sequenzen. Es wurde ebenfalls eine Identifikation von DNA-Sequenzen von CDRs der H-Kette und der L-Kette durchgeführt. Im Anschluss daran wurde die die variable Region der H-Kette kodierende DNA synthetisiert und es wurde eine die konstante Region von murinem IgG2a kodierende DNA ligiert und danach in einen Expressionsvektor integriert, um einen H-Ketten-Expressionsvektor zu bilden. In ähnlicher Weise wurde ein Vektor hergestellt, in den eine die L-Kette kodierende DNA integriert wurde (L-Ketten-Expressionsvektor). Die besagten Vektoren wurden in eine CHO-Zelle transfiziert, um Transformanten zu bilden. Unter den daraus resultierenden Transformanten wurde ein Transformant mit einer hohen Kapazität zur Erzeugung von Antikörpern selektioniert und es wurde dessen Kulturüberstand gesammelt und aufgereinigt. Auf diese Weise wurde erfolgreich ein IgG-Antikörper mit einer variablen Region des Antikörpers 4396 (hierin nachfolgend auch als „Antikörper 4396C” bezeichnet) erhalten.
Während die immunologischen Charakteristika des Antikörpers 4396C untersucht wurden, unternahm man unter Verwendung des Antikörpers einen Versuch zur Klärung des molekularen Mechanismus, der der Initiation der Bildung von Amyloidfibrillen durch GM1 zu Grunde liegt. Zunächst wurde ein Liposom hergestellt, das eine den Rafts sehr ähnliche Lipidzusammensetzung aufweist und GM1-Gangliosid (hierin nachfolgend auch als „GM1” bezeichnet), Cholesterin und Sphingomyelin enthält. Als unter Verwendung der zuvor hergestellten Liposome untersucht wurde, ob der Antikörper 4396C das an GM1 in den Liposomen gebundene Amyloid-β-Protein (hierin nachfolgend auch als „Aβ” bezeichnet) erkennt oder nicht, wurde eine spezifische Bindung beobachtet. Als im Anschluss daran untersucht wurde, ob die Bildung von Amyloidfibrillen in der Gegenwart der Liposome durch den Antikörper 4396C inhibiert wurde oder nicht, wurde der Effekt der ausreichenden und von der zugegebenen Menge abhängigen Inhibition der Bildung von Amyloidfibrillen beobachtet. Auf der anderen Seite wurde bei der Durchführung eines ähnlichen Experiments unter Verwendung eines wohl bekannten anderen anti-Aβ-Antikörpers keine Inhibition der Bildung von Amyloidfibrillen beobachtet. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der besagte andere anti-Aβ-Antikörper an das Ende der neu gebildeten Amyloidfibrillen band. Diese Ergebnisse unterstützen die zuvor erwähnte Keimhypothese. Das heißt es wurde gezeigt, dass an GM1 gebundenes Aβ (hierin nachfolgend auch als „GM1-Aβ” bezeichnet) als Keim bei der Bildung von Amyloidfibrillen fungiert. Da der Antikörper 4396C im Gegensatz zu dem wohl bekannten anti-Aβ-Antikörper spezifisch an diesen Keim bindet, wurde des Weiteren gefunden, dass die Struktur der variablen Region in dem Antikörper 4396C (d. h. die Struktur der variablen Region des Antikörpers 4396), insbesondere die Struktur der CDR, nützlich für Diagnose, Behandlung und dergleichen der Alzheimer-Krankheit ist. Anhand solcher Ergebnisse ging man davon aus, dass die Erzeugung eines humanisierten Antikörpers mit der Struktur der variablen Region des Antikörpers 4396C, insbesondere der Struktur der CDR, eine äußerst effektive Diagnose, Behandlung und dergleichen der Alzheimer-Krankheit gestatten würde.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der zuvor erwähnten Ergebnisse bewerkstelligt; ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die folgende Konfiguration ein.

[1] Ein Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β-inhibiert, wobei der Antikörper eine variable Region einer schweren Kette umfasst, wobei die variable Region einer schweren Kette mindestens eine der in a), b) und c) beschriebenen Regionen umfasst:
a) eine erste Region bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 1, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 1 resultierende Aminosäure;
b) eine zweite Region bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 2 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 2 resultierende Aminosäure; und
c) eine dritte Region bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 3 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 3 resultierende Aminosäure.
[2] Ein Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β-inhibiert, wobei der Antikörper eine variable Region einer leichten Kette umfasst, wobei die variable Region einer leichten Kette mindestens eine der in d), e) und f) beschriebenen Regionen umfasst:
d) eine vierte Region bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 4, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 4 resultierende Aminosäure;
e) eine fünfte Region bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 5 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 5 resultierende Aminosäure; und
f) eine sechste Region bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 6 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 6 resultierende Aminosäure.
[3] Ein Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β-inhibiert, umfassend: eine variable Region einer schweren Kette; und eine variable Region einer leichten Kette, wobei die variable Region einer schweren Kette in g), h) und i) beschriebene komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) umfasst und die variable Region einer leichten Kette in j), k) und l) beschriebene CDRs umfasst;
g) CDR 1 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 1, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 1 resultierende Aminosäuresequenz;
h) CDR 2 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 2, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 2 resultierende Aminosäuresequenz;
i) CDR 3 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 3, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 3 resultierende Aminosäuresequenz;
j) CDR 1 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 4, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 4 resultierende Aminosäuresequenz;
k) CDR 2 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 5, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 5 resultierende Aminosäuresequenz;
l) CDR 3 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 6, oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 6 resultierende Aminosäuresequenz;
[4] Ein Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β-inhibiert, wobei der Antikörper eine variable Region einer schweren Kette umfasst, wobei die variable Region einer schweren Kette eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 7 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 7 resultierende Aminosäuresequenz umfasst.
[5] Ein Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β-inhibiert, wobei der Antikörper eine variable Region einer leichten Kette umfasst, wobei die variable Region einer leichten Kette eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 8 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 8 resultierende Aminosäuresequenz umfasst.
[6] Ein Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β-inhibiert, umfassend: eine variable Region einer schweren Kette; und eine variable Region einer leichten Kette, wobei die variable Region einer schweren Kette eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 7 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 7 resultierende Aminosäuresequenz umfasst; und wobei die variable Region einer leichten Kette eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 8 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 8 resultierende Aminosäuresequenz umfasst.
[7] Der in einem beliebigen der Punkte [1] bis [6] beschriebene Antikörper, bei dem es sich um einen humanisierten Antikörper handelt.
[8] Der in einem beliebigen der Punkte [1] bis [7] beschriebene Antikörper, bei dem es sich um ein Antikörper-Fab, -Fab', -F(ab')₂, -scFv oder -dsFv handelt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Gensequenz und eine Aminosäuresequenz eine variablen Region einer H-Kette eines Antikörpers, der an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt. CDR steht für eine komplementaritätsbestimmende Region; und bei einer Signalsequenz handelt es sich um eine Sequenz eines Signalabschnitts.
2 zeigt eine Gensequenz und eine Aminosäuresequenz einer variablen Region einer L-Kette eines Antikörpers, der an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennt. CDR steht für eine komplementaritätsbestimmende Region; und bei einer Signalsequenz handelt es sich um eine Sequenz eines Signalabschnitts.
3 ist eine Ansicht einer Konfiguration eines Expressionsvektors in Beispiel 1. 3A zeigt eine Konfiguration eines H-Ketten-Expressionsvektors (BCMGSneo-H); und 3B zeigt eine Konfiguration eines L-Ketten-Expressionsvektors (BCMGSneo-L).
4 ist eine graphische Darstellung der Messergebnisse des ThT-Assays in Beispiel 2. In 4A bezeichnet
die Fluoreszenz bei der Inkubation einer Aβ-Lösung mit Liposomen, und Δ bezeichnet die Fluoreszenz bei der Inkubation der Aβ-Lösung mit fAβ. Es wird gezeigt, dass die Fluoreszenz bei der Durchführung der Inkubation in der Anwesenheit von Liposomen ohne Phasenverzögerung unmittelbar anstieg und hyperbolisch ein Gleichgewicht erreichte. Bei der Durchführung der Inkubation in der Abwesenheit von Liposomen oder fAβ (in dem durch (o) dargestellten Fall) wurde überhaupt kein Anstieg der Fluoreszenz beobachtet. 4B zeigt ein semilogarithmisches Plot der Differenz: F(8) – F(t) gegen die Inkubationszeit (0–24 Stunden). F(t) repräsentiert den Anstieg der Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit bei der Inkubation von Aβ mit Liposomen und F(8) wurde experimentell bestimmt. 4C zeigt Elektronenmikrographen des für 24 Stunden inkubierten Gemischs im Anschluss an die Zugabe von fAβ (oberer Mikrograph) und des für 96 Stunden inkubierten Gemischs im Anschluss an die Zugabe von Liposomen (unterer Mikrograph). Der Balken zeigt eine Länge von 100 nm an.
5 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 3. 5A zeigt Elektronenmikrographen eines gefärbten Bilds. Der linke Teil zeigt einen Elektronenmikrographen einer Probe bei der Inkubation von GM1 enthaltenden Liposomen (CH (Cholesterin), SM (Sphingomyelin) und GM1 (GM1-Gangliosid) und einer Aβ-Lösung und deren anschließender Färbung mit einem Antikörper 4396C; ein mittlerer Teil zeigt einen Elektronenmikrographen einer Probe bei der Inkubation von GM1 enthaltenden Liposomen und der Aβ-Lösung und deren anschließender Färbung mit einem Antikörper 4G8; und ein rechter Teil zeigt einen Elektronenmikrographen einer Probe bei der Inkubation von Liposomen ohne GM1 (CH: Cholesterin und SM: Sphingomyelin) und der Aβ-Lösung und deren anschließender Färbung mit dem Antikörper 4396C. Die Ergebnisse zeigen, dass die GM1 enthaltenden Liposome mit dem Antikörper 4396C (siehe linker Teil) aber nicht mit dem Antikörper 4G8 (siehe mittlerer Teil) markiert sind. Des Weiteren ist gezeigt, dass der Antikörper 4396 Liposome ohne GM1 nicht erkennt (siehe rechter Teil). Der Balken zeigt eine Länge von 50 nm an. 5B zeigt Ergebnisse der Reaktivität zwischen dem Antikörper 4396C und GM1 oder löslichem Aβ, was mittels Western Blotting untersucht wurde. 5C zeigt Ergebnisse der Untersuchung der Reaktivität zwischen dem Antikörper 4396C und angelagertem Aβ. 5C zeigt, dass aufeinander folgende Sektionen des zerebralen Kortex nach der Behandlung mit Formaldehyd etc. mit dem Antikörper 4396C oder dem Antikörper 4G8 immunmarkiert waren. Es wird gezeigt, dass unter Verwendung des Antikörpers 4G8 die neurotischen Plaques stark immungefärbt waren (rechte Hälfte), jedoch überhaupt nicht unter Verwendung des Antikörpers 4396C (linke Hälfte). Die Pfeile zeigen Gefäße in den aufeinander folgenden Sektionen.
6A ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse des ThT-Assays, in dem eine Aβ-Lösung, GM1 enthaltende Liposome und der Antikörper 4396C gleichzeitig inkubiert wurden und die Bildung von Amyloidfibrillen untersucht wurde. Das Verhältnis von Antikörper 4396C-Molekülen zu Aβ-Molekülen beträgt jeweils 0,3:50 (Δ), 1,3:50 (o) und 4:50 (☐). Des Weiteren beträgt das Verhältnis von Antikörper 4G8-Molekülen zu Aβ-Molekülen 4:50 (♢).
bezeichnet ein Ergebnis bei der Durchführung der Inkubation ohne die Zugabe jeglicher Antikörper. 6B zeigt Ergebnisse des Immunelektronenmikrographs eines Gemischs aus synthetischem Aβ_1-40 und 4G8, die im Anschluss an die Zugabe der GM1 enthaltenden Liposome gleichzeitig für 24 Stunden inkubiert wurden. Die Probe wurde mit immungoldmarkiertem anti-murinem IgG markiert. Der Balken zeigt eine Länge von 100 nm an.
7 ist eine schematische Ansicht eines Verfahrens zur Synthese von DNA der variablen Region des humanen CDR-okulierten Antikörpers in Beispiel 6.
GEEIGNETSTE ART UND WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
In der gesamten Spezifikation bedeutet der Begriff „partielle Veränderung der Aminosäuresequenz”, dass eine Aminosäuresequenz durch Deletion oder Substitution einer bis mehrerer der die Aminosäuresequenz konstituierenden Aminosäuren oder durch eine Addition oder Insertion einer bis mehrerer Aminosäuren oder durch eine Kombination daraus verändert wird.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper mit einer Aktivität, durch die er an GM1-Gangliosid (GM1) gebundenes Amyloid-β-Protein (Aβ) (GM1-Aβ) erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β inhibiert.
Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen ein: einen Antikörper aus nicht humanen Tieren so wie Mäusen, Ratten etc., einen chimären Antikörper, in dem ein Teil einer Region mit dem entsprechenden Teil von verschiedenen Tieren (einschließend Menschen) substituiert wurde, einen humanisierten Antikörper sowie einen humanen Antikörper. Des Weiteren ist eine Klasse eines Antikörpers nicht spezifisch beschränkt. Bevorzugt werden jedoch Antikörper der IgG-Klasse, z. B. Antikörper der humanen Unterklassen von Antikörpern IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4.
Als variable Region kann eine variable Region eines murinen anti-GM1-Aβ-Antikörpers verwendet werden. Als der murine anti-GM1-Aβ-Antikörper kann z. B. ein muriner anti-GM1-Aβ-Antikörper, der durch die Immunisierung einer Maus mit GM1-Aβ erhalten wurde und der aus dem Gehirn eines an der Alzheimer-Krankheit erkrankten Patienten aufgereinigt wurde (z. B. ein in einer Veröffentlichung beschriebener Antikörper 4396 (K. Yanagisawa, J. McLaurin, M. Michikawa, A. Chakrabartty, Y. Ihara, FEBS Lett., 420, 43 (1997)), als ein Antigen verwendet werden.
Es wird bevorzugt, dass die variable Region der schweren Kette eine oder mehrere beliebige Regionen einer ersten Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 1, einer zweiten Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 2, sowie einer dritten Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 3, einschließt. Die erste, zweite und dritte Region entsprechen hierin jeweils der CDR1, CDR2 und CDR2 der schweren Kette des Antikörpers 4396. Mehr bevorzugt schließt die variable Region der schweren Kette alle Regionen von der ersten bis zur dritten Region ein. Noch mehr bevorzugt schließt die variable Region der schweren Kette jeweils die erste Region als CDR1, die zweite Region als CDR2 und die dritte Region als CDR3 ein.
Es wird bevorzugt, dass die variable Region der leichten Kette eine oder mehrere beliebige Regionen einer vierten Region, bestehend aus der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 4, einer fünften Region, bestehend aus der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 5 sowie einer sechsten Region, bestehend aus der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 6 einschließt. Die vierte, fünfte und sechste Region entsprechen hierin jeweils der CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette des Antikörpers 4396. Mehr bevorzugt schließt die variable Region der leichten Kette alle Regionen von der vierten bis zur sechsten Region ein. Noch mehr bevorzugt schließt die variable Region der leichten Kette jeweils die vierte Region als CDR1, die fünfte Region als CDR2 und die sechste Region als CDR3 ein.
An Stelle der Aminosäuresequenzen der zuvor erwähnten ersten bis sechsten Region können die aus einer partiellen Veränderung dieser Aminosäuresequenzen resultierenden Aminosäuresequenzen verwendet werden. Die Veränderung der Aminosäuresequenzen kann jedoch nur innerhalb eines Bereichs durchgeführt werden, in dem der Antikörper der vorliegenden Erfindung eine Aktivität aufweist, durch die er GM1-Aβ erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β inhibiert. So lange der Antikörper eine Aktivität aufweist, kann diese Aktivität durch die Veränderung der Aminosäuresequenz gesteigert oder reduziert werden. Die Anzahl der zu verändernden Aminosäuren beträgt jeweils bevorzugt 30% oder weniger, mehr bevorzugt 20% oder weniger und noch mehr bevorzugt 10% oder weniger in Bezug auf die gesamten Aminosäuren.
Ein bevorzugtes Beispiel für den Antikörper der vorliegenden Erfindung kann ein Antikörper sein, der eine variable Region einer schweren Kette und eine variable Region einer leichten Kette einschließt, wobei die variable Region der schweren Kette aufweist: g) CDR1 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 1 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 1 resultierende Aminosäuresequenz; h) CDR2 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 2 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 2 resultierende Aminosäuresequenz; i) CDR3 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 3 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 3 resultierende Aminosäuresequenz; und wobei die variable Region der leichten Kette aufweist: j) CDR1 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 4 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 4 resultierende Aminosäuresequenz; k) CDR2 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 5 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 5 resultierende Aminosäuresequenz; und l) CDR31 bestehend aus einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 6 oder die aus einer partiellen Veränderung von SEQ ID NR: 6 resultierende Aminosäuresequenz. Beispiele für die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette und der variablen Region der leichten Kette können Aminosäuresequenzen nach SEQ ID NR: 7 bzw. SEQ ID NR: 8 einschließen. In diesem Fall kann eine Aminosäuresequenz verwendet werden, die durch den Ausschluss des signalgebenden Teils konfiguriert wurde. Hier ist zu beachten, dass die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NR: 7 und SEQ ID NR: 8 jeweils den Aminosäuresequenzen der variablen Region der schweren Kette und der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers 4396 entsprechen.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung schließt einen humanisierten Antikörper ein. Der humanisierte Antikörper bezeichnet hierin einen Antikörper, dessen Struktur der eines humanen Antikörpers ähnlich ist, und schließt einen humanen chimären Antikörper ein, in dem lediglich eine konstante Region mit der eines humanen Antikörpers substituiert ist, sowie einen humanen CDR-okulierten Antikörper, in dem die konstante Region und ein Teil der Region, die nicht einer in der variablen Region vorhandenen CDR (komplementaritätsbestimmenden Region) entspricht, mit der eines humanen Antikörpers substituiert sind (P. T. Johons et al., Nature 321, 522 (1986)).
Ein humaner chimärer Antikörper kann erzeugt werden durch die Substitution einer konstanten Region eines Antikörpers, der z. B. eine Struktur einer variablen Region einer schweren Kette und/oder eine Struktur einer variablen Region einer leichten Kette aufweist (z. B. ein muriner anti-GM1-Aβ-Antikörper der IgG-Klasse (Antikörper 4396C), erzeugt aus einem Antikörper 4396 mittels eines gentechnologischen Klassen-Switch-Verfahrens (M. M. Bending, S. T. Jones, in Antibody Engineering, J. McMafferty, H. R. Hoogenboon und D. J. Chiswell, Hrsg. (IRL Press, 1996), Seiten 147–165), durch die konstante Region des humanen Antikörpers. Die konstante Region eines humanen Antikörpers, die üblicherweise bekannt ist, kann verwendet werden.
Im Nachfolgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Erzeugung eines humanen chimären Antikörpers genannt werden.
Zunächst wird mRNA aus einem Hybridom extrahiert, das einen murinen anti-GM1-Aβ-Antikörper erzeugt, und es wird mittels einer gebräuchlichen Technik eine cDNA synthetisiert. The synthetisierte cDNA wird in einen Vektor integriert und es wird eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Aus der besagten cDNA-Bibliothek wird unter Verwendung eines H-Ketten-Genfragments und eines L-Ketten-Genfragments als Sonden ein Vektor enthaltend ein H-Ketten-Gen und ein L-Ketten-Gen selektioniert. Durch Sequenzierung einer Insertionssequenz des selektionierten Vektors werden Gensequenzen der variablen Region der H-Kette und der variablen Region der L-Kette bestimmt. Auf der Grundlage der auf diese Weise erhaltenen Sequenzdaten wird mittels einer chemischen Synthese, biochemischer Abspaltung/Neubindung und dergleichen eine die variable Region der H-Kette kodierende DNA hergestellt. Die erhaltene die variable Region der H-Kette kodierende DNA wird mit einer eine konstante Region einer humanen H-Kette kodierenden DNA ligiert und in einen Expressionsvektor integriert, um einen H-Ketten-Expressionsvektor zu bilden. Als ein Expressionsvektor kann z. B. ein auf dem SV40-Virus basierender Vektor, ein auf dem EB-Virus basierender Vektor, ein auf dem BPV (Papillomavirus) basierender Vektor etc. verwendet werden, jedoch ist der Expressionsvektor nicht notwendigerweise darauf beschränkt. Unterdessen wird mittels eines ähnlichen Verfahrens ein L-Ketten-Expressionsvektor hergestellt. Eine Wirtszelle wird mit diesen H-Ketten- und L-Ketten-Expressionsvektoren kotransformiert. Zur Verwendung als eine Wirtszelle eignen sich eine CHO(Chinese Hamster Ovary)-Zelle (A. Wright & S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393–3402 (1998)), eine SP2/0(Maus-Myelom)-Zelle (K. Motmans et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 512–519 (1996), R. P. Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495–1502 (1990)) und dergleichen. Des Weiteren eignen sich zur Verwendung bei der Transformation das Lipofectin-Verfahren (R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6077 (1989); P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413 (1987)), ein Elektroporationsverfahren, ein Kalziumphosphatverfahren (F. L. Graham & A. J. van der Eb, Virology 52, 456–467 (1973)), ein DEAE-Dextranverfahren und dergleichen.
Im Anschluss daran wird ein humaner chimärer Antikörper aus dem Inneren der Zelle oder einem Kulturmedium des besagten Transformanten erhalten. Der Antikörper kann durch eine geeignete Kombination von Verfahren isoliert und aufgereinigt werden, z. B. Zentrifugation, Ammoniumsulfatfraktionierung, Aussalzen, Ultrafiltration, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen.
Auf der anderen Seite kann ein humaner CDR-okulierter Antikörper z. B. mittels des nachfolgenden Verfahrens erzeugt werden.
Zunächst wird durch das im Bezug auf das Verfahren zur Erzeugung eines chimären Antikörpers erwähnte Verfahren eine Aminosäuresequenz der variablen Region der H-Kette und der variablen Region der L-Kette eines murinen anti-GM1-Aβ-Antikörpers sowie eine kodierende Basensequenz davon bestimmt. Des Weiteren wird ebenfalls die Aminosäuresequenz sowie eine Basensequenz einer jeden CDR-Region bestimmt.
Als spezifische Basensequenzen der CDRs können jeweils z. B. für CDR1, CDR2 und CDR3 der H-Kette die in SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12 und SEQ ID NR: 13 dargestellten Sequenzen verwendet werden; und für CDR1, CDR2 und CDR3 der L-Kette können jeweils die in SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 16 dargestellten Sequenzen verwendet werden.
Im Anschluss daran werden in der Umgebung der CDR-Region vorhandene FRs (Framework-Regionen) selektioniert. Zur Selektionierung der FRs können im Wesentlichen drei Verfahren angewandt werden. In dem ersten Verfahren wird ein Frame eines humanen Antikörpers, so wie NEWM, REI und dergleichen verwendet, deren dreidimensionale Strukturen aufgeklärt wurden (Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Tempst, P. R. et al., Protein Engineering 7, 1501–1507 (1994); Ellis, J. H. et al., J. Immunol. 155, 925–937 (1995)). In dem zweiten Verfahren wird die variable Region eines humanen Antikörpers, die die größte Homologie zu dem murinen Zielantikörper aufweist, aus der Datenbank selektioniert und deren FR wird verwendet (Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029–10033 (1989); Rozak, M. J. et al., J. Biol. Chem. 271, 22611–22618 (1996); Shearman, C. W. et al., J. Immunol. 147, 4366–4373 (1991)). In dem dritten Verfahren wird eine Aminosäure selektioniert, die am häufigsten in der FR eines humanen Antikörpers verwendet wird (Sato, K. et al., Mol. Immunol. 31, 371–381 (1994); Kobinger, F. et al., Protein Engineering 6, 971–980 (1993); Kettleborough, C. A. et al., Protein Engineering 4, 773–783 (1991)). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige der besagten Verfahren angewandt werden.
Hier ist zu beachten, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine aus einer partiellen Veränderung der selektionierten humanen FR resultierende Aminosäuresequenz ebenfalls als eine Aminosäuresequenz der FR verwendet werden kann, vorausgesetzt dass der letztendlich erhaltene humane CDR-okulierte Antikörper eine Aktivität aufweist, durch die er GM1-Aβ erkennt und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β steuert. Insbesondere in dem Fall, wenn ein Teil der Aminosäuren der selektionierten humanen FR in die Aminosäuren der FR des Antikörpers, von dem die CDR abgeleitet ist, umgeändert wird, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass die Charakteristika des Antikörpers beibehalten werden. Die Anzahl der zu verändernden Aminosäuren beträgt jeweils bevorzugt 30% oder weniger, mehr bevorzugt 20% oder weniger und noch mehr bevorzugt 10% oder weniger in Bezug auf die gesamten FRs.
Im Anschluss daran werden DNAs konstruiert, die die variable Region der H-Kette und die variable Region der L-Kette kodieren, indem man die durch ein beliebiges der zuvor genannten Verfahren selektionierte FR mit der CDR kombiniert. Auf der Grundlage des Designs werden die die variable Region der H-Kette kodierenden DNAs und die die variable Region der L-Kette kodierende DNA mittels einer chemischen Synthese, einer biochemischen Abspaltung/Neubindung und dergleichen hergestellt. Dann wird die die variable Region der H-Kette kodierende DNA zusammen mit der eine konstante Region einer humanen Immunglobulin-H-Kette kodierenden DNA in einen Expressionsvektor integriert, um einen H-Ketten-Expressionsvektor zu bilden. In ähnlicher Weise wird die die variable Region der L-Kette kodierende DNA zusammen mit einer eine konstante Region einer humanen Immunglobulin-L-Kette kodierenden DNA in einen Expressionsvektor integriert, um einen L-Ketten-Expressionsvektor zu bilden. Als ein Expressionsvektor können z. B. ein auf dem SV40-Virus basierender Vektor, ein auf dem EB-Virus basierender Vektor, ein auf BPV (Papillomavirus) basierender Vektor etc. verwendet werden, jedoch ist der Expressionsvektor nicht notwendigerweise darauf beschränkt.
Eine Wirtszelle wird mit dem H-Ketten-Expressionsvektor und dem L-Ketten-Expressionsvektor kotransformiert, die durch das zuvor erwähnte Verfahren hergestellt wurden. Zur Verwendung als eine Wirtszelle eignen sich eine CHO(Chinese Hamster Ovary)-Zelle (A. Wright & S. L. Morrison, J. Immunol. 160, 3393–3402 (1998)), eine SP2/0(Maus-Myelom)-Zelle (K. Motmans et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 512–519 (1996), R. P. Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495–1502 (1990)) und dergleichen. Des Weiteren eignen sich zur Verwendung bei der Transformation das Lipofectin-Verfahren (R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6077 (1989); P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413 (1987)), ein Elektroporationsverfahren, ein Kalziumphosphatverfahren (F. L. Graham & A. J. van der Eb, Virology 52, 456–467 (1973)), ein DEAE-Dextranverfahren und dergleichen. Im Anschluss daran wird ein humaner CDR-okulierter Antikörper aus dem Inneren der Zelle oder einem Kulturmedium des besagten Transformanten erhalten. Der Antikörper kann durch eine geeignete Kombination von Verfahren isoliert und aufgereinigt werden, z. B. Zentrifugation, Ammoniumsulfatfraktionierung, Aussalzen, Ultrafiltration, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen.
Auf der Grundlage des Antikörpers der vorliegenden Erfindung oder auf der Grundlage der Sequenzinformation eines den Antikörper kodierenden Gens kann ein Antikörperfragment erzeugt werden. Beispiele für die Antikörperfragmente schließen Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, dsFv und dergleichen ein.
Fab wird durch Verdau von IgG mit Papain in der Anwesenheit von Systein erhalten. Bei Fab handelt es sich um ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 und schließt die variablen Regionen der L-Kette und der H-Kette sowie ein H-Kettenfragment ein, das sich aus einer C_H1-Domäne und einem Teil eines Gelenkabschnitts zusammensetzt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Fab durch Verdau des zuvor erwähnten Antikörpers mit Papain erhalten werden. Des Weiteren kann Fab ebenfalls aus einem Transformanten hergestellt werden, der unter Verwendung eines Vektors gebildet wird, in dem DNAs integriert sind, die einen Teil der H-Kette und der L-Kette kodieren.
Bei Fab' handelt es sich um ein Antikörperfragment mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000, das durch Spaltung der Disulfidbrücke zwischen den H-Ketten von F(ab')₂, wie nachfolgend erwähnt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird Fab' durch Verdau des zuvor erwähnten Antikörpers mit Pepsin und durch Spaltung der Disulfidbrücke unter Verwendung eines Reduktionsmittels hergestellt. Des Weiteren kann Fab', ähnlich wie Fab, ebenfalls gentechnologisch unter Verwendung einer Fab' kodierenden DNA hergestellt werden.
F(ab')₂ wird durch Verdau von IgG mit Pepsin erhalten. Bei F(ab')₂ handelt es sich um ein Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 100.000, in dem F(ab')s einschließend die variablen Regionen der L-Kette und der H-Kette sowie ein H-Kettenfragment, das sich aus einer CH1-Domäne und einem Teil eines Gelenkabschnitts zusammensetzt, über die Disulfidbrücke aneinander gebunden sind. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann F(ab')₂ durch Verdau des zuvor erwähnten Antikörpers mit Pepsin erhalten werden. Des Weiteren kann F(ab')₂, ähnlich wie Fab, ebenfalls gentechnologisch unter Verwendung einer F(ab')₂ kodierenden DNA hergestellt werden.
Bei scFv handelt es sich um ein Antikörperfragment, das in Form einer einzelsträngigen Konformation durch die Verknüpfung von zwei Ketten von Fv gebildet wird, und das sich zusammensetzt aus der variablen Region der H-Kette und der variablen Region der L-Kette, und zwar derart, dass das C-terminale Ende einer Kette über einen geeigneten Peptidlinker an das N-terminale Ende der anderen Kette gebunden ist. Als ein Peptidlinker kann z. B. (GGGGS)₃ etc. mit einer hohen Flexibilität verwendet werden. So wird z. B. unter Verwendung von DNAs, die die variable Region der H-Kette und die variable Region der L-Kette kodieren, sowie einer einen Peptidlinker kodierenden DNA eine einen scFv-Antikörper kodierende DNA konstruiert und in einen geeigneten Vektor integriert, um einen Transformanten zu bilden. Aus dem Transformanten kann ebenfalls scFv hergestellt werden.
Bei dsFv handelt es sich um ein Fv-Fragment, in dem Cys-Reste in geeignete Positionen der variablen Region der H-Kette und der variablen Region der L-Kette eingeführt werden, und die variable Region der H-Kette und die variable Region der L-Kette werden über die Disulfidbrücke stabilisiert. Die Position, in die der Cys-Rest einer jeden Kette eingeführt wird, kann auf der Grundlage der durch Molekülmodellierung vorhergesagten Konformation bestimmt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Konformation z. B. aus den Aminosäuresequenzen der variable Region der H-Kette und der variable Region der L-Kette vorhergesagt. Auf der Grundlage einer solchen Vorhersage werden DNAs, die jeweils die variable Region der H-Kette und die variable Region der L-Kette kodieren, in die eine Mutation eingeführt wird, konstruiert und in einen geeigneten Vektor integriert, um einen Transformanten zu bilden. Aus dem Transformanten kann ebenfalls dsFv hergestellt werden.
Hier ist zu beachten, dass Antikörperfragmente durch Verknüpfung eines scFv-Antikörpers, dcFv-Antikörpers und dergleichen unter Verwendung eines geeigneten Linkers oder durch Fusion mit Streptavidin multimerisiert werden können.
Durch Fusion oder Bindung einer niedermolekularen Verbindung, eines niedermolekularen Proteins, Zielmaterials und dergleichen an den Antikörper (einschließend das Antikörperfragment) gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein fusionierter Antikörper oder markierter Antikörper konstruiert werden. Als ein markiertes Material kann ein radioaktives Material, so wie ¹²⁵I, Peroxidase, β-D-Galaktosidase, Microperoxidase, Meerrettichperoxidase (HRP), Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Rhodaminisothiocyanat (RITC), alkalische Phosphatase, Biotin und dergleichen verwendet werden.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine den Antikörper des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung kodierende DNA. Das heißt, der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA eines Antikörpers mit einer Aktivität, durch die dieser GM1-Aβ erkennen und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β inhibieren kann. Insbesondere schließt die DNA DNAs ein, die einen humanen chimären Antikörper und einen humanen CDR-okulierten Antikörper kodieren, die die zuvor erwähnte Aktivität aufweisen, sowie eine ein Antikörperfragment kodierende DNA. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls DNAs ein, die die H-Kette oder die L-Kette dieser Antikörper oder Antikörperfragmente kodieren. Des Weiteren schließt die vorliegende Erfindung DNAs ein, die die variable Region der H-Kette oder die variable Region der L-Kette dieser Antikörper oder Antikörperfragmente kodieren. In diesem Fall kann die DNA unter Ausschluss eines signalgebenden Abschnitts konfiguriert werden. Ein konkretes Beispiel der DNA-Sequenz der variable Region der H-Kette schließt eine in SEQ ID NR: 9 dargestellte Sequenz ein. Des Weiteren schließt ein Beispiel für die DNA-Sequenz der spezifischen variablen Region der L-Kette eine in SEQ ID NR: 10 dargestellte Sequenz ein.
Des Weiteren schließt die vorliegende Erfindung eine Sequenz eines Gens ein, das eine variable Region CDR eines Antikörpers kodiert, der eine Aktivität aufweist, durch die er GM1-Aβ erkennen und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β inhibieren kann. Konkrete Beispiele einer solchen Sequenz schließen ein: eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 1 kodiert (z. B. eine Sequenz nach SEQ ID NR: 11), eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 2 kodiert (z. B. eine Sequenz nach SEQ ID NR: 12), eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 3 kodiert (z. B. eine Sequenz nach SEQ ID NR: 13), eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 4 kodiert (z. B. eine Sequenz nach SEQ ID NR: 14), eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 5 kodiert (z. B. eine Sequenz nach SEQ ID NR: 15) oder eine Sequenz, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 6 kodiert (z. B. eine Sequenz nach SEQ ID NR: 16). Die zuvor erwähnte DNA kann durch eine chemische Synthese, biochemische Spaltung/Neubindung und dergleichen hergestellt werden, und kann z. B. bei der Erzeugung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten verwendet werden, die eine Aktivität aufweisen, durch die sie GM1-Aβ erkennen und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β inhibieren.
Die DNA der vorliegenden Erfindung wird in einen Vektor integriert; dann kann unter Verwendung dieses Vektors eine Wirtszelle transformiert werden. Des Weiteren wird in den DNAs der vorliegenden Erfindung eine DNA, die eine schwere Kette eines Antikörpers (oder eine variable Region einer schweren Kette) kodiert, in einen Vektor integriert und eine DNA, die eine leichte Kette eines Antikörpers (oder eine variable Region einer leichten Kette) kodiert wird in einen weiteren Vektor integriert, so dass zwei Expressionsvektoren gebildet werden. Im Anschluss daran kann eine Wirtszelle mit den beiden resultierenden Expressionsvektoren kotransformiert werden. Des Weiteren werden in den DNAs der vorliegenden Erfindung die DNA, die die schwere Kette eines Antikörpers (oder die variable Region der schweren Kette) kodiert, und die DNA, die die leichte Kette eines Antikörpers (oder die variable Region der leichten Kette) kodiert, in einen identischen Vektor integriert, und es kann dann unter Verwendung dieses Vektors eine Wirtszelle transformiert werden.
Die Art der Vektoren, die verwendet werden können, ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt, vorausgesetzt die DNA der vorliegenden Erfindung kann auf eine Art und Weise integriert werden, dass sie noch zur Expression in der Lage ist, und sie kann tatsächlich in einer Wirtszelle exprimiert werden.
Die Art der Wirtszellen ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt, vorausgesetzt sie kann durch einen zu verwendenden Vektor transformiert werden und ist dazu in der Lage, die DNA der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. So können z. B. Bakterien so wie Escherichia coli, Hefen so wie Saccharomyces cerevisiae und eine tierische Zelle so wie eine COS-Zelle, eine CHO-Zelle etc. verwendet werden.
Durch die Kultivierung eines Transformanten, kann ein Antikörper oder Antikörperfragment mit einer Aktivität, durch die er/es GM1-Aβ erkennen und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β inhibieren kann, in einer Zelle oder in einem Kulturmedium erzeugt (exprimiert) werden. Dann kann durch Sammeln des erzeugten Antikörpers (einschließend Antikörperfragment) der Antikörper des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Der erhaltene Antikörper kann durch eine geeignete Kombination von Verfahren isoliert und aufgereinigt werden, z. B. Zentrifugation, Ammoniumsulfatfraktionierung, Aussalzen, Ultrafiltration, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen.
Ob der Antikörper der vorliegenden Erfindung eine Aktivität aufweist, durch die er GM1-Aβ erkennen kann, oder nicht, kann durch Beobachtung der Bindungseigenschaften zwischen einem relevanten Antikörper und GM1-Aβ bestätigt werden, wenn der relevante Antikörper mit GM1-Aβ in Kontakt gebracht wird. So wird z. B. eine Lipidmembran enthaltend an GM1-Gangliosid (GM1) gebundenes Amyloid-β-Protein (Aβ) (GM1-Aβ) gebildet und die Bindungsfähigkeit von GM1-Aβ an den relevanten Antikörper wird beobachtet. Des Weiteren wird eine Lipidmembran enthaltend GM1 hergestellt und es werden Lösungen enthaltend Aβ und den relevanten Antikörper gleichzeitig mit der hergestellten Lipidmembran in Kontakt gebracht (in diese gegeben), wodurch die Bindungskapazität des relevanten Antikörpers an GM1-Aβ untersucht werden kann. Die Lipidmembran enthaltend GM1-Aβ kann dadurch hergestellt werden, dass man eine Lösung enthaltend Aβ mit der Lipidmembran enthaltend GM1 in Kontakt bringt (durch Zugabe). In diesem Fall ist es bevorzugt, dass das Inkontaktbringen der Lipidmembran enthaltend GM1 und der Lösung enthaltend Aβ nur für eine kurze Zeit erfolgt. Mehr bevorzugt kann das Inkontaktbringen der beiden Komponenten sofort erfolgen.
Die Lipidmembran enthaltend GM1 ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt, vorausgesetzt dass sie GM1 und ein Lipidmaterial als Komponenten enthält. Es wird jedoch bevorzugt eine Lipidmembran einschließend Sphingomyelin als eine Lipidkomponente verwendet. Des Weiteren wird bevorzugt eine Lipidmembran verwendet, die darüber hinaus Cholesterin einschließt. Die Konfiguration solcher Lipidmembranen ist ähnlich der der Neuronenmembran im Gehirn, in der Amyloidfibrillen gebildet werden. Folglich wird es durch die Verwendung der Lipidmembran mit einer solchen Konfiguration möglich zu bestätigen, dass es sich bei dem Antikörper der vorliegenden Erfindung um einen Antikörper handelt, der dazu in der Lage ist, die Bildung von Amyloidfibrillen in vivo effektiv zu inhibieren.
Als GM1 kann z. B. ein kommerziell erhältliches Material (ein Material zu beziehen von Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan, etc.) verwendet werden. Als Aβ kann z. B. kommerziell erhältliches Aβ_1-40 (Lot. 501001, zu beziehen von Peptide Inst., Osaka, Japan; Lot. 519599, zu beziehen von Bachem AG, Schweiz, etc.) verwendet werden.
Die Lipidmembran enthaltend GM1 kann in Form von Liposomen hergestellt werden. Des Weiteren kann die Lipidmembran enthaltend GM1 in einem an einen nicht löslichen Träger gebundenen Zustand verwendet werden, z. B. an Beads aus Harz so wie Polystyrolharz, Polycarbonatharz, Siliconharz, Nylonharz etc, Glas oder dergleichen sowie an eine Mikroplatte.
Hier ist zu beachten, dass es, wenn die Bildung von Amyloidfibrillen bei Inkontaktbringen des relevanten Antikörpers mit GM1-Aβ in der Anwesenheit von Aβ inhibiert werden kann, bestätigt werden kann, dass der relevante Antikörper an GM1-Aβ bindet und eine Aktivität aufweist, durch die er die Bildung von Amyloidfibrillen inhibieren kann.
Eine Lipidmembran enthaltend GM1-Aβ kann ebenfalls dazu verwendet werden, eine Verbindung mit einer Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ zu screenen. Das heißt, es kann durch Einbeziehen der nachfolgenden Schritte ein Verfahren zum Screening einer Verbindung mit einer Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ erhalten werden:

1) ein Schritt zum Inkontaktbringen einer Probe mit einer Lipidmembran enthaltend an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein, und 2) ein Schritt zum Sammeln einer an die Lipidmembran bindenden Verbindung.

In Schritt 1) kann eine Lipidmembran enthaltend an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein (GM1-Aβ) in Form von Liposomen oder in einem an einen nicht löslichen Träger (z. B. eine Mikroplatte) gebundenen Zustand verwendet werden. Im Fall der Verwendung der Lipidmembran in Form von Liposomen kann eine an GM1-Aβ gebundenen Verbindung durch Zentrifugation in Schritt 2) isoliert und aufgereinigt werden, wodurch eine Zielverbindung erhalten werden kann. Des Weiteren werden in dem Fall, wenn es sich bei einer in Frage kommenden Verbindung um einen Antikörper handelt, GM1-Aβ enthaltende Liposome einschließend Calcein als eine Lipidmembran nach Schritt 1) verwendet, und es kann eine Menge an Calcein gemessen werden, die aus dem Liposom freigesetzt wird, wenn dieses durch die Wirkung des Komplementsystems zerrissen wird, wodurch eine Bindungsaktivität der in Frage kommenden Verbindung an GM1-Aβ bestimmt wird. Auf der anderen Seite ist es in dem Fall der Verwendung einer an einen nicht löslichen Träger gebundenen Lipidmembran, wenn es sich bei der in Frage kommenden Verbindung um einen Antikörper handelt, möglich, die Bindungsaktivität der in Frage kommenden Verbindung an GM1-Aβ mittels EIA, ELISA und dergleichen zu messen.
An Stelle des zuvor erwähnten Schritts 1) können die nachfolgenden Schritte 1-1) und 1-2) durchgeführt werden:

1-1) ein Schritt zum Inkontaktbringen einer Lipidmembran enthaltend GM1-Gangliosid mit Amyloid-β-Protein zur Herstellung von an GM1-Gangliosid gebundenem Amyloid-β-Protein; und 1-2) ein Schritt zum Inkontaktbringen einer Probe mit den Lipidmembranen.

Die Lipidmembran enthaltend GM1-Gangliosid (GM1) kann in Schritt 1-1) z. B. durch Zugabe einer Lösung enthaltend Aβ in eine Lipidmembran dispergierende Lösung mit Amyloid-β-Protein (Aβ) in Kontakt gebracht werden. Des Weiteren kann dies durch das Inkontaktbringen einer Lösung enthaltend Aβ mit der auf einer festen Phase fixierten Lipidmembran erfolgen (z. B. mit einer an eine Mikroplatte gebundenen Lipidmembran).
Die zuvor erwähnten Schritte 1-1) und 1-2) können im Wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden. Das heißt, durch Einbeziehen des nachfolgenden Schritts kann ein Verfahren zum Screening einer Verbindung mit einer Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ konfiguriert werden:

1') ein Schritt der Zugabe von Amyloid-β-Protein und einer Probe in eine Lösung, die eine Lipidmembran enthaltend GM1-Gangliosid enthält.

Mittels der Durchführung eines Schritts, der bestätigt, dass die Bildung von Amyloidfibrillen inhibiert werden kann (Schritt 3), ist es zusätzlich zu den zuvor erwähnten Schritten möglich zu bestätigen, dass eine durch das Screeningverfahren selektionierte Verbindung eine Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ sowie eine Aktivität aufweist, durch die sie die Bildung von Amyloidfibrillen inhibieren kann. Es wird z. B. einer gesammelten Verbindung mit Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ gestattet, in der Umgebung, in der Amyloidfibrillen gebildet werden, zu koexistieren, wodurch der Einfluss und die Wirkung der Verbindung auf die Bildung von Amyloidfibrillen bestätigt werden. Des Weiteren kann, wenn der Schritt 1) oder 1-2) durchgeführt wird, der Schritt 3) durchgeführt werden, indem Aβ zusammen mit einer Probe zugegeben und die Bildung von Amyloidfibrillen beobachtet wird.
Die durch das zuvor erwähnte Screeningverfahren selektionierte Verbindung weist eine Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ auf. Daher kann die Verbindung dazu verwendet werden, die Polymerisation von Aβ zu GM1-Aβ sowie die Bildung von Amyloidfibrillen zu inhibieren oder zu verhindern.
Als eine zu screenende Probe kann ein natürliches oder synthetisches Protein, ein Peptid, ein Antikörper (einschließend einen Antikörper der vorliegenden Erfindung), ein Zellextrakt, ein Kulturüberstand und dergleichen verwendet werden.
Die Verwendung des Antikörpers (einschließend ein Antikörperfragment) des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, ein Verfahren zum Screening einer Verbindung mit einer Bindungsaktivität an GM1-Aβ zu konfigurieren. Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Screening einer Verbindung mit einer Bindungsaktivität an GM1-Aβ bereit. Das Verfahren schließt die folgenden Schritte ein:

i) ein Schritt zur Selektionierung einer ersten Verbindung, die an einen Antikörper oder an ein Antikörperfragment gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bindet; und ii) ein Schritt zur Selektionierung einer zweiten Verbindung, die an die erste Verbindung bindet. Durch Einbeziehen eines Schritts zur Bestätigung, dass die Bildung von Amyloidfibrillen inhibiert werden kann, ist es in diesem Screeningverfahren ebenfalls möglich zu bestätigen, dass die durch das Screeningverfahren selektionierte Verbindung eine Bindungsaktivität an GM1-Aβ sowie eine Aktivität, durch die sie die Bildung von Amyloidfibrillen inhibiert, aufweist.

In Schritt i) wird die Bindungsfähigkeit zwischen einem Antikörper oder einem Antikörperfragment und einer Probe untersucht und es wird eine erste Verbindung mit Bindungsfähigkeit selektioniert. Hierin kann, wie in dem zuvor erwähnten Fall, ein natürliches oder synthetisches Protein, ein Peptid, ein Antikörper (einschließend einen Antikörper der vorliegenden Erfindung), ein Zellextrakt, ein Kulturüberstand und dergleichen als Probe verwendet werden.
In Schritt i) kann ein zu verwendender Antikörper an einer festen Phase fixiert werden und es kann eine Probe mit dem fixierten Antikörper in Kontakt gebracht werden. Es kann jedoch auch die Seite einer Probe an einer festen Phase fixiert werden.
Durch vorheriges Markieren eines zu verwendenden Antikörpers wird die Selektionierung (Detektion) erleichtert und es wird die Effizienz der Selektionierung (Detektion) verbessert. Zur Markierung kann ein radioaktives Material so wie ¹²⁵I und ein Enzym so wie Peroxidase, β-D-Galaktosidase etc. verwendet werden. Des Weiteren kann durch die Verwendung eines sekundären Antikörpers, der einen zu verwendenden Antikörper erkennt, die Effizienz der Selektionierung (Detektion) verbessert werden.
Der Antikörper (einschließend ein Antikörperfragment) des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, eine Verbindung zu screenen, die an einen Antikörper bindet, der GM1-Aβ erkennt. Das heißt, es kann ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die an einen Antikörper bindet, der GM1-Aβ erkennt, konfiguriert werden und das besagte Verfahren schließt die nachfolgenden Schritte A) und B) ein:

A) ein Schritt zum Inkontaktbringen einer Probe mit dem Antikörper der vorliegenden Erfindung; und
B) ein Schritt zum Sammeln einer an den Antikörper bindenden Verbindung.

Als Probe kann hierin ein natürliches oder synthetisches Protein, ein Peptid, ein Zellextrakt, ein Kulturüberstand und dergleichen verwendet werden.
Des Weiteren kann ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die an einen Antikörper bindet, der GM1-Aβ erkennt, konfiguriert werden und das besagte Verfahren schließt die nachfolgenden Schritte ein:

C) ein Schritt zur Vorhersage einer Konformation einer variablen Region des Antikörpers der vorliegenden Erfindung; und
D) ein Schritt zur Selektionierung einer Verbindung mit einer Konformation, die zu der vorhergesagten Konformation komplementär ist.

Die Konformation einer variablen Region eines Antikörpers kann durch ein NMR(Nuklearmagnetresonanz)-Verfahren (Wuthrich, K.: NMR of Protein and Nucleic Acids, John Wiley & Sons, New York, 1986), eine Röntgenkristallographie (Blundell, T. L. und John, L. N.: Protein Crystallography, Academic Press, Oxford, Seiten 1–565, 1976, McPherson, A.: Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley & Sons, New York, Seiten 1–371, 1982; Masaaki Matsushima et al.: Study method of Protein Engineering, Kapitel 7, Conformation Analysis, Hirokawa Shoten, Tokio, 160–200, 1990) und dergleichen vorhergesagt werden.
Ein Beispiel für eine in Frage kommende Verbindung in Schritt D) kann ein natürliches Protein, ein natürliches Peptid, eine natürliche hochmolekulare Verbindung und dergleichen einschließen, die aus Pflanzen, Tieren sowie Bakterien etc. extrahiert werden, sowie ein synthetisches Protein, ein synthetisches Peptid, eine synthetische hochmolekulare Verbindung, eine synthetische niedermolekulare Verbindung und dergleichen einschließen.
Da die durch das zuvor erwähnte Screeningverfahren erhaltene Verbindung eine Aktivität der Bindung an einen anti-GM1-Aβ-Antikörper aufweist, wird angenommen, dass sie bei der Verabreichung an einen lebenden Körper die Produktion eines anti-GM1-Aβ-Antikörpers auslösen kann. Das heißt, sie ist dazu in der Lage, derart auf den Immunabwehrmechanismus des lebenden Körpers einzuwirken, dass dieser einen anti-GM1-Aβ-Antikörper produziert. Demzufolge wird angenommen, dass durch die Wirkung dieses Antikörpers die Polymerisation von Aβ zu im lebenden Körper gebildetem GM1-Aβ sowie die Bildung von Amyloidfibrillen inhibiert werden kann. Daher wird angenommen, dass durch die Verwendung der Verbindung die Alzheimer-Krankheit verhindert oder behandelt werden kann. Anders ausgedrückt kann durch die Verwendung der Verbindung ein Verfahren zur Vermeidung und zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit bereitgestellt werden. Des Weiteren können Medikamente, d. h. Vakzine oder therapeutische Medikamente gegen die Alzheimer-Krankheit, die die Verbindung als wirksamen Bestandteil enthalten, entworfen werden. Da die Lipidmembran enthaltend GM1-Aβ, die für das zuvor erwähnte Screeningverfahren etc. verwendet wird, ebenfalls bei der Verabreichung an den lebenden Körper durch den anti-GM1-Aβ-Antikörper erkannt wird, kann sie die Produktion eines anti-GM1-Aβ-Antikörpers auslösen. Daher kann auch die Lipidmembran für den gleichen Zweck verwendet werden.
Bei der Wirkstoffformulierung können weitere pharmazeutisch verträgliche Bestandteile (z. B. physiologische Salzlösung, Hilfsstoffe, Konservierungsstoffe) enthalten sein. Des Weiteren können Wirkstoffe in verschiedenen Formen formuliert werden, z. B. in Form einer Kapsel, eines Sirups, einer Tablette, eines Granulats etc. Die Wirkstoffe können auf dem Weg der oralen Verabreichung oder der parenteralen Verabreichung (intravenöse, intraarterielle, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale Injektionen und dergleichen) verabreicht werden.
Eine Dosierung wird je nach den Symptomen, dem Alter, dem Gewicht etc. eines Patienten variieren. Der Fachmann ist jedoch in der Lage, die geeignete Dosis auszuwählen und einzustellen.
Da der Antikörper (einschließend das Antikörperfragment) der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, spezifisch an GM1-Aβ zu binden und die Bildung von Amyloidfibrillen durch Amyloid-β zu inhibieren, ist er auf der anderen Seite nützlich für die Diagnose, Prävention und Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Das heißt, es wird angenommen, dass durch die Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung eine Diagnose, Prävention oder Behandlung der Alzheimer-Krankheit durchgeführt werden kann. Anders ausgedrückt können durch die Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Diagnose, Prävention und Behandlung der Alzheimer-Krankheit bereitgestellt werden. Des Weiteren können durch die Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung Medikamente (diagnostische Medikamente, präventive Medikamente oder therapeutische Medikamente) gegen die Alzheimer-Krankheit entworfen werden. Wird ein humanisierter Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet, selbst in dem Fall, dass der Antikörper an einen humanen Körper verabreicht wird, so wird dieser hierin als ein humanes Protein erkannt. Da er aller Wahrscheinlichkeit nach nicht vom Kreislaufsystem abgesondert wird und das Auftreten einer allergischen Reaktion unwahrscheinlich ist, kann folglich davon ausgegangen werden, dass der Antikörper als ein geeignetes diagnostisches Medikament etc. verwendet werden kann. Auf der anderen Seite kann eine Verbindung mit einer Bindungsfähigkeit in Bezug auf GM1-Aβ, die in dem zuvor erwähnten Screeningverfahren selektioniert wird, in Verfahren zur Diagnose, Prävention und Behandlung der Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Des Weiteren können durch die Verwendung der Verbindung Medikamente (diagnostische Medikamente, präventive Medikamente oder therapeutische Medikamente) gegen die Alzheimer-Krankheit entworfen werden.
In den Medikamenten der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch verträgliche Bestandteile (z. B. physiologische Salzlösung, Hilfsstoffe, Konservierungsstoffe) enthalten sein. Des Weiteren können Wirkstoffe in verschiedenen Formen formuliert werden, z. B. in Form einer Kapsel, eines Sirups, einer Tablette, eines Granulats und dergleichen, und sie können auf dem Weg der oralen Verabreichung oder der parenteralen Verabreichung (intravenöse, intraarterielle, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale Injektionen und dergleichen) verabreicht werden. Hier ist zu beachten, dass die Wirkstoffe unter Kombination von mehreren Antikörpern der vorliegenden Erfindung formuliert werden können.
Eine Dosierung wird je nach den Symptomen, dem Alter, dem Gewicht etc. eines Patienten variieren. Der Fachmann ist jedoch in der Lage, die geeignete Dosis auszuwählen und einzustellen.
[Beispiel 1] Erzeugung eines IgG-Antikörper
1.1) Bestimmung der Gensequenz der variablen Region
Eine Gensequenz einer variablen Region eines Hybridoms (hierin im Nachfolgenden bezeichnet als „Aβ1-42C”), die den in der zuvor erwähnten Veröffentlichung beschriebenen Antikörper (Antikörper 4396) (K. Yanagisawa, J. McLaurin, M. Michikawa, A. Chakrabartty, Y. Ihara, FEBS Lett., 420, 43 (1997)) produziert, wurde mittels des nachfolgenden Verfahrens bestimmt. Hier ist zu beachten, dass es sich bei Aβ1-42C um ein Hybridom handelt, das unter Verwendung von aus dem Gehirn gereinigtem GM1-Aβ als ein Immunogen hergestellt wurde, und dass es sich bei dem Antikörper 4396 um einen Antikörper der IgM-Klasse handelt, der GM1-Aβ spezifisch erkennt.
Zunächst wurde unter Verwendung des „ZAPcDNA-Kit” (Stratagene Corporate) eine cDNA-Bibliothek von Aβ1-42C konstruiert. Das Konstruktionsverfahren folgte dem Protokoll des Kits. Aβ1-42C wurde in DMEM/10% FKS kultiviert und es wurde aus etwa 3 × 10⁷ Zellen poly A⁺RNA hergestellt. Nach der Synthese einer ersten Kette von cDNA aus 5 μg A⁺RNA wurde eine zweite Kette von cDNA synthetisiert. Im Anschluss daran wurde ein Linker (mit EcoRI- und XhoI-Stellen) daran ligiert und die cDNA wurde in die EcoRI-/XhoI-Stellen des „Uni-ZAP-XR-Vektors” des Kits integriert. Der Vektor wurde dann unter Verwendung des „ZAP-cDNA-Gigapack III Gold Cloning Kit” (Stratagene Corporate) in einen VCMG13-Phagen verpackt.
Durch Infektion des Phagen mit E. coli/XL-I-Blau in „ZAPcDNA-Gigapack III Gold Cloning Kit” wurden Plaques in einem Kulturmedium gebildet. Im Anschluss daran wurde wie nachfolgend beschrieben eine Plaque-Hybridisierung durchgeführt. Als Sonden wurden ein Fragment eines μ-Kettengens (konstante Region der H-Kette) und ein Fragment eines λ-Kettengens (konstante Region der L-Kette) verwendet, die zuvor mittels PCR vermehrt worden waren.
Auf ein NZY-Kulturmedium, in dem Plaques gebildet wurden, wurde eine „Hybond-N⁺-Membran” (Amersham) geladen und die Plaques wurden auf eine Membran übertragen. Im Anschluss daran wurde die Membran mit 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH für zwei Minuten, mit 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) für fünf Minuten und mit 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5)/2 × SSC für 30 Sekunden behandelt und dann an der Luft getrocknet. Eine DNA-Sonde wurde unter Verwendung des „ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System” (Amersham) markiert. Diese markierte Sonde und die Membran wurden bei 42°C für 4 Stunden inkubiert, dann gewaschen und in ein chromogenes Substrat getaucht. Die Membran wurde dann in engen Kontakt mit „Hyper-Film ECL” (Amersham) gebracht und für fünf Minuten exponiert. Auf der Grundlage des Films wurden positive Plaques aus dem Kulturmedium isoliert. Nach der Selektionierung positiver Phagen unter Verwendung des „Uni-ZAP XR Vector Cloning Kit” (Stratagene Corporate) wurden die positiven Phagen mit dem Kit beigefügten E. coli/SOLR-Strang infiziert und Phagmiden wurden in dem Phagen durch „Uni-ZAP XR DNA” gespalten. Aus E. coli/SOLR-Strang wurde mittels des alkalischen SDS-Verfahrens Phagmid-DNA aufgereinigt. Dann wurde mittels des Didesoxy-Verfahrens die Insertionssequenz in der Phagmid-DNA bestimmt.
Demzufolge schlossen diese DNAs ein μ-Kettengen (konstante Region der H-Kette) bzw. ein λ-Kettengen (konstante Region der L-Kette) ein. Dann wurden aus jeder DNA jeweils die Gensequenzen und die Aminosäuresequenzen der variablen Region der H-Kette (V_H) und der variablen Region der L-Kette (V_L) bestimmt, wie in den 1 und 2 dargestellt. In den 1 und 2 repräsentiert CDR eine komplementaritätsbestimmende Region. Eine Aminosäuresequenz der variablen Region der H-Kette ist in SEQ ID NR: 7 dargestellt (die Sequenz von Position 1 bis 19 kodiert eine Signalsequenz); eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 9 dargestellt (die Sequenz von Position 1 bis 57 kodiert eine Signalsequenz); eine Aminosäuresequenz der variablen Region der L-Kette ist in SEQ ID NR: 8 dargestellt (die Sequenz von Position 1 bis 19 kodiert eine Signalsequenz) und eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 10 dargestellt (die Sequenz von Position 1 bis 57 kodiert eine Signalsequenz). Des Weiteren, in der variablen Region der H-Kette, ist eine Aminosäuresequenz von CDR1 in SEQ ID NR: 1 dargestellt; eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 11 dargestellt; eine Aminosäuresequenz von CDR2 ist in SEQ ID NR: 2 dargestellt; eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 12 dargestellt; eine Aminosäuresequenz von CDR3 ist in SEQ ID NR: 3 dargestellt; und eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 13 dargestellt. In ähnlicher Weise ist, in der variablen Region der L-Kette, eine Aminosäuresequenz von CDR1 in SEQ ID NR: 4 dargestellt; eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 14 dargestellt; eine Aminosäuresequenz von CDR2 ist in SEQ ID NR: 5 dargestellt; eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 15 dargestellt; eine Aminosäuresequenz von CDR3 ist in SEQ ID NR: 6 dargestellt; und eine die Aminosäuresequenz kodierende Basensequenz ist in SEQ ID NR: 16 dargestellt.
1-2) Herstellung eines H-Ketten-Expressionsvektors und eines L-Ketten-Expressionsvektors
Die zuvor erwähnte von dem Antikörper 4396 abgeleitete DNA der variablen Region der H-Kette wurde an die DNA der konstanten Region der H-Kette eines murinen IgG2a-Antikörpers ligiert und in einen Expressionsvektor „BCMGS Neo Vektor” (Hajime Toriyama, Bovine papillomavirus vector, Experimental Medicine (Ergänzungsband), Genetic Engineering Handbook veröffentlicht von Masami Muramatsu und Hirohito Okayama, YODOSHA CO. LTD., Seiten 297–299 (1991)) (gespalten mit XhoI- und NotI-Stellen) integriert, um einen H-Ketten-Expressionsvektor (BCMGSneo-H) (siehe 3A) zu bilden. In ähnlicher Weise wurde die zuvor erwähnte, von dem Antikörper 4396 abgeleitete DNA der variablen Region der L-Kette an die DNA der konstanten Region der L-Kette eines murinen IgG2a-Antikörpers ligiert, und in einen Expressionsvektor „BCMGS Neo Vektor” (gespalten mit XhoI- und NotI-Stellen) integriert, um einen L-Ketten-Expressionsvektor (BCMGSneo-L) (siehe 3B) zu bilden.
1-3) Transfektion
Der H-Ketten-Expressionsvektor und der L-Ketten-Expressionsvektor wurden gleichzeitig mittels des Lipofectin-Verfahrens in ein CHO(Chinese Hamster Ovary)-Zelle transfiziert, bei 37°C für 12 Stunden kultiviert, in eine 96-Well-Platte transplantiert und in DMEM/10% FKS enthaltend 500 μg/ml G-418 selektioniert.
Die Menge an IgG in dem Kulturmedium wurde wie folgt gemessen. Es wurde eine anti-Maus-γ-Kette (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.: Code 303G) mit PBS auf 10 μg/ml verdünnt, in Mengen von 100 μl pro Well auf eine Polystyrol-Mikroplatte dispensiert und bei 4°C über Nacht sensibilisiert. Im Anschluss daran erfolgte eine Blockierung unter Verwendung von 5% BSA/5% Saccharose/PBS bei 4°C über Nacht. 100 μl der Probe wurden bei 37°C für eine Stunde zur Reaktion gebracht, gefolgt von Waschen mit PBS/0,05% Tween 20. Nach dem Waschen wurde 4000-fach verdünntes, mit Peroxidase markiertes anti-Maus-IgG (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.: Code 330) bei 37°C für eine Stunde zur Reaktion gebracht, gefolgt von Waschen mit PBS/0,05% Tween 20. Nach dem Waschen wurden 100 μl der Enzym-Substratlösung dispensiert und für 15 Minuten bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Im Anschluss daran wurden 100 μl 2 N Schwefelsäure in jedes Well dispensiert und A₄₉₂ wurde gemessen. Als Kontrolle wurden murine Seren (Menge an IgG: 200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml und 0,2 ng/ml) verwendet. Dementsprechend wurde ein Klon, der die höchste Expression aufwies, selektioniert und dessen Kulturüberstand wurde gesammelt. Aus dem gesammelten Kulturüberstand wurde unter Verwendung einer Protein A-Agarose-Säule ein Antikörper aufgereinigt. Der daraus resultierende Antikörper wurde als Antikörper 4396C definiert.
[Beispiel 2] Untersuchung der Bindungsfähigkeit von Antikörper 4396C an GM1-Aβ
Zur Aufklärung des molekularen Mechanismus der Initiation der Bildung von Amyloidfibrillen durch GM1 wurden unter Verwendung von GM1 enthaltenden Liposomen eine kinetische Analyse und eine morphologische Analyse durchgeführt.
2-1) Herstellung einer Aβ-Lösung
Zunächst wurde synthetisches Aβ_1-40 (Peptide Inst., Osaka, Japan; Lot. 501001) in 0,002% Ammoniaklösung von etwa 500 μM aufgelöst und die Lösung wurde bei 100.000 U/min für 3 Stunden zentrifugiert (TLA 120.0 Rotor, Optima TL, Beckman, CA, USA). Es wurden nur die oberen zwei Drittel des Überstands gesammelt und die Konzentration von Aβ wurde bestimmt. Aliquots der Aβ-Lösung wurden bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wurde die Aβ-Lösung aufgelöst und mit physiologischem Tris-Puffer verdünnt (TBS: 150 mM NaCl und 10 mM Tris-HCl, pH 7,4), bis eine optimale Konzentration erreicht war.
2-2) Herstellung von GM1 enthaltenden Liposomen
Cholesterin, Sphingomyelin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und GM1 (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) wurden in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol (1:1) im Verhältnis von 2:2:1 bis zu einer 1 molaren Konzentration aufgelöst. Dieses Gemisch wurde unter einem Stickstoffstrom für eine Stunde getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei –40°C gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wurde das getrocknete Lipid-Gemisch in TBS resuspendiert, so dass die GM1-Konzentration 2,5 mM betrug, und 10 Zyklen von Einfrieren/Auftauen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen. Die besagte Lipidsuspension wurde für 15 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert (MX-160, TOMY, Tokio, Japan) und das daraus resultierende Pellet wurde in TBS resuspendiert, so dass die GM1-Konzentration wieder so war wie zuvor. Schließlich wurde diese Suspension unter Verwendung eines Ultraschall-Zelldisruptors (DU-201, Leistungsstufe: 2, TOMY, Tokio, Japan), der mit einer Mikrospitze (TP-030, TOMY, Tokio, Japan) ausgestattet war, für 5 Minuten auf Eis sonifiziert.
2-3) Herstellung von Fibrillen-Aβ (fAβ) als Kern für die Bildung von Fibrillen
Synthetisiertes Aβ_1-40 (Bachem AG, Schweiz; Lot. 519599;) wurde durch kurzes Vortexen in etwa 500 μM Ammoniaklösung bei 4°C aufgelöst und im Inkubationspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5; 100 mM NaCl) auf 50 μM verdünnt. Nach der Inkubation bei 37°C für 24 Stunden wurden 1,6 × 10⁴ g des Gemischs bei 4°C für drei Stunden zentrifugiert. Die daraus resultierenden Pellets wurden in eiskaltem Inkubationspuffer enthaltend 0,005% NaN₃ in einem Eppendorf-Gefäß resuspendiert, unter Verwendung eines Ultraschall-Zelldisruptors (DU-201, Leistungsstufe: 2, TOMY, Tokio, Japan), der mit einer Mikrospitze (TP-030, TOMY, Tokio, Japan) ausgestattet war, auf Eis sonifiziert und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
2-4) ThT(Thioflavin T)-Assay
Der ThT-Assay wurde gemäß eines in dem Dokument (H. Naiki, F. Gejyo, Methods Enzymol. 309, 305 (1999)) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung eines Spektrofluorometers (RF-5300PC; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) durchgeführt. Zunächst wurde die in 2-1) hergestellte Lösung mit Liposomen bei einer Aβ-Konzentration von 50 μM (GM1:Aβ = 10:1) oder mit 10 μg/ml in 2-3) hergestelltem fAβ in PCR-Gefäßen (ELT-0,5, Ryocou) bei 37°C unter Verwendung eines Dry Thermo Unit Inkubators (DTU-1B, TIETECH Co. Ltd., Koshigaya, Japan) inkubiert. Unmittelbar vor der Messung wurden aus jedem Gefäß 5 μl des Inkubationsgemischs entnommen und mit 995 μl 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 8,5) enthaltend 5 μM ThT vermischt. Dann wurde die optimale Fluoreszenz von Amyloidfibrillen (Anregungswellenlänge: 450 nm und Emissionswellenlänge: 490 nm) gemessen. 4 ist eine graphische Darstellung der Messergebnisse. In 4A bezeichnet
die Fluoreszenz bei Inkubation der Aβ-Lösung mit Liposomen; und Δ bezeichnet die Fluoreszenz bei Inkubation der Aβ-Lösung mit fAβ. Es ist gezeigt, dass bei der Durchführung der Inkubation in der Anwesenheit von Liposomen die Fluoreszenz ohne Phasenverzögerung unmittelbar anstieg und hyperbolisch ein Gleichgewicht erreichte.
Hier ist zu beachten, dass überhaupt kein Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten war, wenn die Inkubation in der Abwesenheit von Liposomen oder fAβ (der durch (o) dargestellte Fall) durchgeführt wurde. 4B zeigt ein semilogarithmisches Plot der Differenz: F(8) – F(t) gegen die Inkubationszeit (0–24 Stunden). F(t) repräsentiert den Anstieg der Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit, wenn Aβ mit Liposomen inkubiert wurde und F(8) wurde experimentell bestimmt. Die lineare Regression und der Korrelationskoeffizient wurden berechnet (r = 0,997). Es wird gefunden, dass F(t) durch eine Gleichung: F'(t) = B – CF(t) ausgedrückt wird, d. h. F(t) folgt dem primären Regressionsmodell (siehe Referenzdokument 18). Es wurde folglich gezeigt, dass die Bildung von Fibrillen in der Anwesenheit von Liposomen wie das primäre Regressionsmodell verläuft.
4C zeigt Elektronenmikrographen des für 24 Stunden im Anschluss an die Zugabe von fAβ inkubierten Gemischs (oberer Mikrograph) und des für 96 Stunden im Anschluss an die Zugabe von Liposomen inkubierten Gemischs (unterer Mikrograph). Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass typische Amyloidfibrillen in der Anwesenheit von Liposomen gebildet werden. Hier ist zu beachten, dass der Balken in 4C eine Länge von 100 nm anzeigt.
Die zuvor erwähnten Ergebnisse legen nahe: erstens, dass lösliches Aβ unverzüglich an GM1 auf der Membran band, um einen GM1-Aβ-Komplex (GM1-Aβ) zu bilden. Nachfolgend band das lösliche Aβ an GM1-Aβ als ein heterologer Keim. Durch die Bindung des löslichen Aβ an das Ende der sich kontinuierlich verlängernden Fibrille schreitet die Bildung von Amyloidfibrillen voran.
[Beispiel 3] Nachweis der Fähigkeit des Antikörpers 4396C zur Inhibition der Bildung von Amyloidfibrillen
3-1) Untersuchung der Bindungskapazität von Antikörper 4396C
Es wurde untersucht, ob der in Beispiel 1 erzeugte Antikörper 4396C an GM1 gebundenes Aβ (GM1-Aβ) in Liposomen spezifisch erkennt oder nicht. Zunächst wurden Liposomen enthaltend das in Beispiel 2 hergestellte GM1 oder Liposomen ohne GM1 (Kontrolle) mit der in Beispiel 2 hergestellten Aβ-Lösung inkubiert. Das inkubierte Gemisch wurde auf Eis gelagert, bis es auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Ormvar-Nickel-Gitter geladen wurde. Es wurde mit 1% bovinem Serumalbumin bei 12°C für fünf Minuten inkubiert, wodurch nicht spezifische Bindungen blockiert wurden. Dann wurde jedes Gitter mit dem Antikörper 4396C oder einem Antikörper 4G8 (ein wohl bekannter Antikörper, der Aβ erkennt: K. S. Kim et al., Neurosci. Res. Commun. 2, 121 (1988)) bei einer Endkonzentration von 20 μg/ml für 45 Minuten bei 12°C behandelt. Im Anschluss daran wurde das Gitter mit 5 nm von auf 1/20 verdünntem, mit Gold markiertem anti-Maus-IgG (British BioCell International Ltd.) für 60 Minuten bei 12°C behandelt. Dann wurde mit 2% Uranacetat eine Negativfärbung durchgeführt.
5A zeigt einen Elektronenmikrographen eines gefärbten Bildes. Der linke Teil zeigt einen Elektronenmikrographen einer Probe bei der Inkubation von GM1 enthaltenden Liposomen (CH (Cholesterin), SM (Sphingomyelin) und GM1 (GM1-Gangliosid)) und einer Aβ-Lösung und deren nachfolgender Färbung mit dem Antikörper 4396C; ein mittlerer Teil zeigt einen Elektronenmikrographen einer Probe bei der Inkubation von GM1 enthaltenden Liposomen und einer Aβ-Lösung und deren nachfolgender Färbung mit einem Antikörper 4G8; und ein rechter Teil zeigt einen Elektronenmikrographen einer Probe bei der Inkubation von Liposomen ohne GM1 (CH (Cholesterin) und SM (Sphingomyelin)) und einer Aβ-Lösung und deren nachfolgender Färbung mit einem Antikörper 4396C. Die Ergebnisse zeigen, dass die GM1 enthaltenden Liposomen mit dem Antikörper 4396C markiert sind (siehe linker Teil), jedoch nicht mit dem Antikörper 4G8 (siehe mittlerer Teil). Des Weiteren ist gezeigt, dass der Antikörper 4396C Liposomen ohne GM1 nicht erkennt (siehe rechter Teil). Der Balken zeigt eine Länge von 50 nm an. Ausgehend von den zuvor erwähnten Ergebnissen wurde gezeigt, dass der Antikörper 4396C das im Liposom gebildete GM1-Aβ spezifisch erkennt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Antikörper 4G8, der einer der wohl bekannten anti-Aβ-Antikörper ist, GM1-Aβ nicht erkennen konnte.
Dann wurde mittels Western Blotting die Reaktivität zwischen dem Antikörper 4396C und GM1 oder löslichem Aβ untersucht. Die in Beispiel 2 hergestellte und auf eine Nitrozellulosemembran geblottete (1 ng) Aβ-Lösung wurde mit dem Antikörper 4396C oder dem Antikörper 4G8 inkubiert und dann wie zuvor erwähnt markiert. So wurde die Reaktivität zwischen Aβ und dem jeweiligen Antikörper untersucht. In ähnlicher Weise wurde die Reaktivität des Antikörpers 4396C in Bezug auf GM1 (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) untersucht. Als Kontrolle zum Vergleich wurde eine Inkubation unter Verwendung von einer POD-markierten Untereinheit von Choleratoxin (CTX) (Sigma) an Stelle des Antikörpers 4396C durchgeführt. 5B zeigt einen Zustand der Membran nach der Inkubation, der zeigt, dass der Antikörper 4396C weder mit löslichem Aβ noch mit GM1 zur Reaktion gebracht wurde.
Im Anschluss daran wurde die Reaktivität zwischen dem Antikörper 4396C und dem aggregierten Aβ untersucht. Es wurde eine Sektion des zerebralen Kortex des Gehirns eines an der Alzheimer-Krankheit leidenden Patienten in 4% Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und dann mit Ameisensäure vorbehandelt. Im Anschluss daran wurde mit dem Antikörper 4396C oder mit dem Antikörper 4G8 eine Immunmarkierung durchgeführt. Wie in 5C gezeigt, wurden die neurotischen Plaques bei der Verwendung des Antikörpers 4G8 stark gefärbt (rechte Hälfte), bei der Verwendung des Antikörpers 4396C wurden sie dagegen überhaupt nicht gefärbt (linke Hälfte). Die Pfeile zeigen Gefäße in den seriellen Sektionen an.
Die zuvor erwähnte Reihe von Ergebnissen zeigt, dass durch die Bindung von Aβ an GM1 ein intermediäres Aβ, d. h. eine transiente Form zwischen löslichem Aβ und aggregiertem Aβ, erzeugt wurde und dass, im Gegensatz zu anderen wohl bekannten anti-Aβ-Antikörpern, der Antikörper 4396C zwar kein lösliches Aβ und aggregiertes Aβ spezifisch erkannte, wohl aber an GM1 gebundenes Aβ, das heißt GM1-Aβ.
[Beispiel 4]
Es wurde untersucht, ob die Bildung von Amyloidfibrillen in der Anwesenheit von GM1 enthaltenden Liposomen durch den Antikörper 4396C inhibiert werden konnte oder nicht.
Es wurden eine Aβ-Lösung und GM1 enthaltende Liposomen, wie in Beispiel 2 hergestellt, sowie der Antikörper 4396C gleichzeitig inkubiert und die Bildung von Amyloidfibrillen wurde mittels des ThT-Assays untersucht. Als eine Kontrolle zum Vergleich wurde die Inkubation unter Verwendung eines Antikörpers 4G8 an Stelle des Antikörpers 4396C durchgeführt. 6A zeigt die Ergebnisse. Das Verhältnis von Antikörper 4396C-Molekülen zu Aβ-Molekülen beträgt jeweils 0,3:50 (Δ), 1,3:50 (o) beziehungsweise 4:50 (☐). Des Weiteren beträgt das Verhältnis von Antikörper 4G8-Molekülen zu Aβ-Molekülen 4:50 (♢).
bezeichnet ein Ergebnis bei der Durchführung der Inkubation ohne die Zugabe jeglicher Antikörper. Wie in 6A gezeigt, inhibiert der Antikörper 4396C den Anstieg der Fluoreszenz von ThT in einer von der Dosierung abhängigen Art und Weise. Auf der anderen Seite inhibierte der Antikörper 4G8, d. h. ein anderer anti-Aβ-Antikörper, den Anstieg der Fluoreszenz überhaupt nicht.
6B zeigt einen Immunelektronenmikrographen eines Gemischs von synthetischem Aβ_1-40 und 4G8, die im Anschluss an die Zugabe von GM1 enthaltenden Liposomen gleichzeitig für 24 Stunden inkubiert wurden. Die Probe wurde auf ein Gitter geladen und im Anschluss an die Blockierung mit bovinem Serumalbumin direkt mit Immungold-markiertem anti-Maus-IgG markiert. Der Balken zeigt eine Länge von 100 nm an. Aus den Ergebnissen wird offensichtlich, dass der Antikörper 4G8 an das Ende einer neu gebildeten Amyloidfibrille bindet.
[Beispiel 5] Herstellung von humanen chimären Antikörpern
5-1) Isolierung eines Gens der konstanten Region einer humanen γ-Kette und eines Gens der konstanten Region einer humanen λ-Kette
Die DNA der konstanten Region der humanen γ-Kette und die DNA der konstanten Region der humanen λ-Kette wurden aus einer humanen Lymphozyten-DNA-Bibliothek als ein Template der DNA erhalten, die zu einem Teil einer jeden DNA komplementär ist.
5-2) Herstellung eines chimären H-Kettenvektors und eines chimären L-Kettenvektors
Zunächst wurden die DNA der konstanten Region der humanen γ-Kette und die DNA der variablen Region der murinen H-Kette, erhalten in Beispiel 1, miteinander ligiert und in einen Expressionsvektor „BCMGS Neo Vektor” (Hajime Toriyama, Bovine papillomavirus vector, Experimental Medicine (Ergänzungsband), Genetic Engineering Handbook herausgegeben von Masami Muramatsu und Hirohito Okayama, YODOSHA CO. LTD., Seiten 297–299 (1991)) integriert, um einen chimären H-Kettenvektor zu bilden. In ähnlicher Weise wurden die DNA der konstanten Region der humanen γ-Kette und die DNA der variablen Region der murinen L-Kette, erhalten in Beispiel 1, miteinander ligiert und in einen Expressionsvektor „BCMGS Neo Vektor” integriert, um einen chimären L-Kettenvektor zu bilden.
5-3) Transfektion
Es wurden mittels des Lipofectin-Verfahrens zwei Arten von Vektoren (ein chimärer H-Kettenvektor und ein chimärer L-Kettenvektor) gleichzeitig in eine CHO(Chinese Hamster Ovary)-Zelle transfiziert, für eine vorbestimmte Zeit bei 37°C kultiviert, in eine 96-Well-Platte transplantiert und in DMEM/10% FKS, enthaltend 500 μg/ml Neomycin selektioniert.
Die Menge an IgG in dem Kulturmedium wird wie folgt gemessen. Eine anti-humane γ-Kette (Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.: Code 103AG) wird mit PBS auf 10 μg/ml verdünnt, in Mengen von 100 μl pro Well in eine Polystyrol-Mikroplatte dispensiert und bei 4°C über Nacht sensibilisiert. Im Anschluss daran erfolgte eine Blockierung unter Verwendung von 5% BSA/5% Saccharose/PBS bei 4°C über Nacht. 100 μl der Probe wurden bei 37°C für eine Stunde zur Reaktion gebracht, gefolgt von Waschen mit PBS/0,05% Tween 20. Nach dem Waschen wurde 4000-fach verdünntes, mit Peroxidase markiertes anti-humanes-IgG (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.: Code 208) bei 37°C für eine Stunde reagiert, gefolgt von Waschen mit PBS/0,05% Tween 20. Nach dem Waschen wurden 100 μl der Enzym-Substratlösung dispensiert und für 15 Minuten bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Im Anschluss daran werden 100 μl 2 N Schwefelsäure in jedes Well dispensiert und A₄₉₂ wird gemessen. Als Kontrolle werden humane Seren (Menge an IgG: 200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml und 0,2 ng/ml) verwendet. Dementsprechend wird ein Klon, der die höchste Expression aufweist, selektioniert und dessen Kulturüberstand wird gesammelt. Aus dem gesammelten Kulturüberstand wird unter Verwendung einer Protein A-Agarose-Säule ein Antikörper aufgereinigt.
[Beispiel 6] Herstellung von humanem CDR-grafted Antikörper
6-1) Design des humanen CDR-grafted Antikörpers
Für die H-Kette und die L-Kette werden Sequenzen mit einer hohen Homologie zu jeweils der H-Kette und der L-Kette des Antikörpers 4396C aus einer wohl bekannten Datenbank (z. B. Fasta Database Search) selektioniert. Dann wird eine Sequenz mit FRs dieser Sequenzen und einer CDR des Antikörpers 4396C entworfen.
6-2) Herstellung eines humanen CDR-grafted Antikörper-Expressionsvektors
Die DNA der variablen Region der H-Kette und die DNA der variablen Region der L-Kette, die in 6-1) konstruiert wurden, können wie folgt hergestellt werden.
Zunächst wurden, wie in 7 gezeigt, acht synthetische DNAs hergestellt. Diese synthetischen DNAs werden so hergestellt, dass sie etwa 400 bp der variablen Regionen abdecken, wobei sich etwa 20 bp einer jeden DNA miteinander überschneiden. Es werden 10 pmol/10 μl dieser synthetischen DNAs bei 100°C für fünf Minuten behandelt, gefolgt von Quenching. Es werden jeweils die synthetischen DNAs 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6 sowie 7 und 8 miteinander vermischt, in einem Hitzeblock für 30 Minuten bei 65°C erhitzt, für 12 Stunden stehen gelassen und dann einem langsamen Annealing unterworfen. Dann werden 1 μl 20 mM dNTP, 1 μl Sequenase (Amersham), 10 μl 5 × Sequenasepuffer zugegeben und es wird abschließend mit sterilem Wasser bis zu einer Gesamtmenge von 50 μl aufgefüllt. Das Gemisch wird für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die DNA-Fragmente (1-2, 3-4, 5-6 und 7-8) werden einer Elektrophorese mit 2% Agarose unterzogen, abgespalten und in 30 μl sterilen Wassers aufgelöst. Dann werden 1 μl Pfu-Polymerase, 5 μl DMSO und 9 μl 10 × Pfu-Puffer zu 2 μl eines jeden der gespaltenen DNA-Fragmente 1-2 und 3-4, 5-6 und 7-8 zugegeben. Dann wird mit sterilem Wasser zu einer Gesamtmenge von 90 μl aufgefüllt und das Gemisch wird unter den folgenden Bedingungen 6 PCR-Zyklen unterworfen: bei 94°C für eine Minute, 55°C für eine Minute und 72°C für zwei Minuten. Dann werden jeweils 1 μl 10 × Puffer und jeweils 5 μl der 20 μM Primer (a und b oder c und d) zugegeben und unter den folgenden Bedingungen weiteren 25 PCR-Zyklen unterworfen: bei 94°C für eine Minute, 55°C für eine Minute und 72°C für zwei Minuten. Die durch PCR amplifizierten DNA-Fragmente (1-2-3-4 und 5-6-7-8) werden abgespalten, in 30 μl sterilen Wassers aufgelöst und unter den zuvor erwähnten Bedingungen unter Verwendung von 2 μl der jeweiligen DNAs 6 Zyklen unterworfen. Dann werden des Weiteren die Primer e und f zugegeben und es werden 25 PCR-Zyklen unter den zuvor erwähnten Bedingungen durchgeführt. Die daraus resultierenden Fragmente werden abgespalten, in einen pT7blueT-Vektor kloniert und die Sequenz wird bestätigt.
Im Anschluss daran werden, ähnlich wie in Beispiel 5, ein Expressionsvektor „BCMGS Neo Vektor”, eine synthetische DNA der variablen Region der H-Kette, versehen mit einer Restriktionsenzymstelle durch PCR, und die DNA der humanen γ-Kette miteinander ligiert, um somit einen CDR-H-Kettenvektor herzustellen. In ähnlicher Weise wird ein CDR-L-Kettenvektor hergestellt, in den die synthetische DNA der variablen Region der L-Kette und die DNA der humanen λ-Kette integriert wurden.
6-3) Transfektion
Der CDR-H-Kettenvektor und der CDR-L-Kettenvektor werden mittels des Lipofectin-Verfahrens gleichzeitig in eine CHO-Zelle transfiziert, bei 37°C für 12 Stunden kultiviert, wieder in eine 96-Well-Platte überführt und in DMEM/10% FKS enthaltend 500 μg/ml Neomycin selektioniert. Im Anschluss daran wird mittels ELISA ein Klon selektioniert, der die höchsten Expression aufweist. Der Kulturüberstand wird gesammelt und es wird unter Verwendung einer Protein A-Agarose-Säule ein Antikörper aufgereinigt.
Wenngleich eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Verwendung spezifischer Begriffe beschrieben wurde, so dient eine solche Beschreibung lediglich illustrativen Zwecken und es soll erkannt werden, dass Veränderungen und Variationen vorgenommen werden können, vorausgesetzt dass von dem Rahmen der nachfolgenden Ansprüche nicht abgewichen wird.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung stellt Informationen (Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz) über einen Antikörper bereit, der sich von einem üblicherweise bekannten Antikörper, der gegen ein Amyloid-β-Protein erzeugt wird, unterscheidet und eine Aktivität aufweist, durch die er zwar kein lösliches Amyloid-β-Protein, jedoch ein an GM1-Gangliosid gebundenes Amyloid-β-Protein erkennen und die Bildung von Amyloidfibrillen inhibieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Antikörper (einschließend ein Antikörperfragment) bereit, der eine solche Aktivität aufweist. Insbesondere kann, auf der Grundlage der Information der CDR, ein humanisierter Antikörper erzeugt werden. Bei den besagten Antikörpern handelt es sich um wirksame Mittel zur Diagnose, Prävention und Behandlung der Alzheimer-Krankheit. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Antikörper der eine Aktivität aufweist, GM1 Gangliosid-gebundenes Amyloid-β-Protein zu erkennen und die Bildung von amyloiden Fibrillen durch Amyloid-β zu inhibieren, wobei der Antikörper ein rekombinantes IgG, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv oder dsFv ist, umfassend eine variable Region der schweren Kette und/oder eine variable Region der leichten Kette, wobei (i) die variable Region der schweren Kette mindestens eine Region der in a), b) und c) beschriebenen Regionen umfasst: a) eine erste Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 1 resultiert; b) eine zweite Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 2 resultiert; und c) eine dritte Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 3 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 3 resultiert; (ii) die variable Region der leichten Kette mindestens eine der in d), e) und f) beschriebenen Regionen umfasst: d) eine vierte Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 4 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 4 resultiert; e) eine fünfte Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 5 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 5 resultiert; und f) eine sechste Region, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 6 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 6 resultiert; (iii) die variable Region der schweren Kette die in g), h) und i) beschriebenen komplementäritätsbestimmenden Regionen (CDRs) umfasst, und die variable Region der leichten Kette die in j), k) und l) beschriebenen CDRs umfasst; g) CDR 1, bestehend aus einer Aminsäuresequenz von SEQ ID NR: 1 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 1 resultiert; h) CDR 2, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 2 resultiert; i) CDR 3, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 3 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 3 resultiert; j) CDR 1, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 4 oder der Aminosäuresequenz die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 4 resultiert; k) CDR 2, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 5 oder der Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 5 resultiert; und l) CDR 3, bestehend aus einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 6 oder der Aminosäuresequenz die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 6 resultiert; (iv) die variable Region der schweren Kette eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 7 oder die Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 7 resultiert, umfasst; (v) die variable Region der leichten Kette eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 8 oder die Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 8 resultiert, umfasst; oder (vi) die variable Region der schweren Kette eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 7 oder die Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 7 resultiert, umfasst; und die variable Region der leichten Kette eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 8 oder die Aminosäuresequenz, die aus einer teilweisen Änderung von SEQ ID NR: 8 resultiert, umfasst.
Der Antikörper nach Anspruch 1, welcher ein humanisierter Antikörper ist.
Eine DNA, die den in Anspruch 1 oder 2 beschriebenen Antikörper oder die variable Region der schweren Kette oder eine variable Region der leichten Kette des Antikörpers kodiert.
Die DNA nach Anspruch 3, bestehend aus einer Basensequenz von SEQ ID NR: 9 oder 10.
Eine DNA, die die in Anspruch 3 oder 4 beschriebene DNA umfasst, welche eine schwere oder leichte Antikörper-Kette kodiert.
Eine DNA, die eine Aminosäuresequenz von einer der SEQ ID NRn: 1 bis 6 kodiert.
Ein Vektor, der die in einem der Ansprüche 3 bis 6 beschriebene DNA in einer Art und Weise enthält, die ihre Expression ermöglicht.
Der Vektor von Anspruch 7, wobei die DNA, die die schwere Kette des Antikörpers (oder die variable Region der schweren Kette) kodiert, und die DNA, die die leichte Kette des Antikörpers (oder die variable Region der leichten Kette) kodiert, in den selben Vektor eingebaut sind, in einer Art und Weise, die ihre Expression ermöglicht.
Ein Transformant, der mit dem in Anspruch 7 oder 8 beschriebenen Vektor transformiert ist.
Der Transformant von Anspruch 9, der mit einem Vektor co-transformiert ist, der die DNA, die eine schwere Kette des Antikörpers (oder eine variable Region der schweren Kette) enthält, und einem Vektor, der eine DNA, die eine leichte Kette des Antikörpers (oder eine variable Region der leichten Kette) kodiert, enthält, beide in einer Art und Weise, die ihre Expression ermöglicht.
Ein Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren des in Anspruch 9 oder 10 beschriebenen Transformanten; und Einsammeln eines exprimierten Antikörpers oder Fragmenten davon.
Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die eine Aktivität aufweist, an GM1-Aβ zu binden und die Bildung von amyloiden Fibrillen zu inhibieren, umfassend die Schritte: (i) Auswählen einer ersten Verbindung, die an einen Antikörper von Anspruch 1 oder 2 oder ein Fragment davon bindet; (ii) Auswählen einer zweiten Verbindung, die an die erste Verbindung bindet; und (iii) Bestimmen, ob die zweite Verbindung die Bildung von amyloiden Fibrillen inhibiert.
Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die an einen Antikörper bindet, der GM1-Aβ erkennt, beinhaltend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Antikörper nach Anspruch 1 bis 2; und (b) Einsammeln einer Verbindung, die an den Antikörper bindet.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper von Anspruch 1 oder 2; und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Eine diagnostische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper von Anspruch 1 oder 2.
Verwendung eines Antikörpers von Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Diagnostizieren, Verhindern oder Behandeln der Alzheimerschen Krankheit.