CN114929274A

CN114929274A - 琥珀酸作为用于癌症诊断和治疗的生物标记的用途

Info

Publication number: CN114929274A
Application number: CN202080073102.XA
Authority: CN
Inventors: 郭呈钦; 吴京颖
Original assignee: Taiwan Institute Of Health
Current assignee: Taiwan Institute Of Health
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2022-08-19
Also published as: EP4045086A4; TW202128760A; US20220389117A1; CA3158125A1; TWI756870B; AU2020366222B2; JP7513709B2; JP2022552000A; WO2021076942A1; AU2020366222A1; EP4045086A1

Abstract

本发明揭示了癌细胞会分泌琥珀酸至细胞外环境中，进而增加巨噬细胞的迁移能力并介导癌症相关巨噬细胞(TAM)极化；除此之外，在小鼠实验模型中发现，琥珀酸不但可诱导癌细胞上皮细胞间质转化(EMT)、增强癌细胞迁移能力，还可促进癌症转移。本发明亦指出，相较于健康的受试者，肺癌患者血清中的琥珀酸浓度较高，此意味在癌症的发展和进程中，癌细胞会释放大量的琥珀酸至循环系统中。如本发明所示，血清琥珀酸具有很高的鉴别力，可作为新一类具有预测非小细胞肺癌(NSCLC)潜在价值的循环代谢性致癌物(circulating oncometabolite)；此外，由于在LLC肿瘤模型中，琥珀酸浓度的上升伴随着皮下肿瘤中TAM的增加与更严重的癌症转移，因此血清中的琥珀酸可能为治疗NSCLC的有效治疗生物标记。于是，本发明亦提供一种可作为癌症治疗剂的抗‑琥珀酸抗体。

Description

琥珀酸作为用于癌症诊断和治疗的生物标记的用途

相互引用的相关申请

本发明主张美国临时申请62/916，376号(申请日为2019年10月17日)的优先权，其完整内容以引用文献的方式纳入本文。

技术领域

本发明关于一种琥珀酸用于作为诊断或治疗癌症的新颖生物标记的用途。较特别地，本发明关于一种使用琥珀酸的拮抗剂，例如抗琥珀酸的单株抗体或SUCNR1抑制剂，以治疗癌症的方法；以及一种通过检测血清中琥珀酸浓度，以诊断癌症的方法。

背景技术

免疫系统已进化至可区别正常细胞和恶性细胞，被激活的免疫系统会启动免疫反应，消除受损的细胞与恶性细胞以保护宿主，根据免疫监控(immunosurveillance)的古典概念，免疫系统应该可预防健康人体内的肿瘤生成与发展。确实，有越来越多的证据显示，癌症免疫监控的存在不仅可保护宿主免于原发性癌症的侵袭，还可塑造肿瘤的免疫原性(de Visser et al.,2006；Dunn et al.,2004)。然而，一旦肿瘤开始形成，肿瘤细胞便会激活致耐受性信息传递路径(tolerogenic signaling pathway)，进而损坏免疫系统的自我调节，导致肿瘤具有免疫耐受的能力而不受免疫攻击。除此之外，免疫细胞、内皮细胞与纤维母细胞会被召集至肿瘤微环境中并被激活成肿瘤相关细胞，从而促进肿瘤的生长与转移。

在肿瘤微环境中，癌细胞不仅会释放可溶性分子启动致癌基因的信息传递，以利于其生长、存活与转移，还会影响包含免疫细胞在内的周遭细胞以增强肿瘤的发展。然而，宿主的细胞会将肿瘤细胞视为外来细胞，并对其进行免疫监控，因此，肿瘤与免疫细胞之间的动态相互作用，对于调节肿瘤的发生和发展至关重要。巨噬细胞(macrophage)，是肿瘤微环境中的主要细胞族群，在免疫的自我调节与防御中扮演着重要角色，此外，亦会被微环境中的信号激活与极化，造成其功能上的不同表现型，例如典型的活化巨噬细胞(M1)与另类活化巨噬细胞(M2)。许多证据都显示，肿瘤微环境中的巨噬细胞会被肿瘤分泌的细胞激素激活，而变为M2-极化的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)，进而促进肿瘤的进程并抑制抗肿瘤的免疫反应。癌细胞会产生用于控制其周围多种非癌细胞的功能性表现型的信号，以帮助肿瘤的发展。了解肿瘤细胞将细胞招集至其微环境并改变周围细胞表现型的机制，将有助于提供更有效的治疗策略。

细胞的代谢物组成情形被认为是生理或病理状态的重要指标，例如健康或癌化。除此之外，内源代谢物会参与调控许多细胞生物学上所定义的进程，例如免疫自我调节与肿瘤发展。换句话说，人体需要特定的代谢物以维持正常的生理过程；相反的，某些代谢物在压力下会诱发有害的反应。举例来说，肿瘤细胞所释放的色胺酸代谢物犬尿胺酸(kynurenine)会促进癌细胞的进展，然而，宿主细胞为了抑制肿瘤进程会释放防御性的代谢物，像是纤维母细胞不论是在体内或是在体外，皆会通过旁分泌的方式生产与释放一种新型的色胺酸代谢物：5-甲氧基色胺酸(5-methoxytryptophan)至细胞外环境，以抑制COX-2的过度表现及肿瘤的发生。而值得注意的是，这类代谢物的产生在癌症相关的纤维母细胞中是被抑制的，表示肿瘤细胞可能会通过影响宿主细胞的表现型而消除其抗肿瘤的反应。因此，癌细胞很可能可以产生并释放内源性因子，借以通过抑制抗肿瘤的免疫反应，进而促进肿瘤的发展进程。

因此，本发明提供一种通过检测血清中琥珀酸的表现程度做为新的癌症生物标记用以诊断癌症的方法。另外，本发明亦提供一种使用琥珀酸拮抗剂，例如抗琥珀酸的单株抗体或SUCNR1抑制剂，以治疗癌症的方法。

发明内容

基于上述目的，本发明揭示，肿瘤分泌的琥珀酸可活化琥珀酸受器(SUCNR1)的信息传递路径，使巨噬细胞极化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)以利于肿瘤转移，从而提高癌症病患体内中的琥珀酸表现程度。

于是，本发明于一方面提供一种抗-琥珀酸单株抗体，其包含一具有如SEQ ID NO:2或6所记载的胺基酸序列的重链；与一具有如SEQ ID NO:4或8所记载的胺基酸序列的轻链。

于部分实施例中，所述的抗-琥珀酸单株抗体是一种人源化抗-琥珀酸抗体。

于一较佳的实施例中，所述的人源化抗-琥珀酸抗体包含重链可变结构域VH1-VH5，其分别包含如SEQ ID NO:9-13所记载的胺基酸序列；与轻链可变结构域VL1-VL8，其分别包含如SEQ ID NO:14-21所记载的胺基酸序列。

于本发明的部分实施例中，所述的单株抗体可中和血清中的琥珀酸。

于另一实施例中，所述的单株抗体可抑制癌症转移与抑制巨噬细胞转化成肿瘤相关巨噬细胞。

于另一实施例中，所述的单株抗体可抑制SUCNR1信息传递路径，并抑制ARG1的表现。

于部分实施例中，所述的单株抗体具有一如SEQ ID NO:2所记载的胺基酸序列的重链，与一如SEQ ID NO:4所记载的胺基酸序列的轻链。

于部分实施例中，所述的单株抗体具有一如SEQ ID NO:6所记载的胺基酸序列的重链，与一如SEQ ID NO:8所记载的胺基酸序列的轻链。

于部分实施例中，所述的人源化抗-琥珀酸抗体包含重链可变结构域VH1-VH5，其分别包含如SEQ ID NO:9、10、11、12、13所记载的胺基酸序列；与轻链可变结构域VL1-VL8，其分别包含如SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21所记载的胺基酸序列。

于其他实施例中，所述的人源化抗-琥珀酸抗体包含重链可变结构域VH1-VH5，其分别包含由如SEQ ID NO:22、23、24、25、26所记载的DNA序列编码的氨基酸序列；与轻链可变结构域VL1-VL8，其分别包含由如SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33、34所记载的DNA序列编码的氨基酸序列。

另一方面，本发明关于一种治疗癌症的方法，其包含将一琥珀酸拮抗剂给予一有其需要的患者。

于部分实施例中，所述的癌症为非小细胞肺癌、肺癌、前列腺癌、乳癌或大肠癌。

于部分实施例中，所述的琥珀酸拮抗剂为一抗-琥珀酸单株抗体。

于其他实施例中，所述的琥珀酸拮抗剂为一SUCNR1抑制剂。于部分实施例中，所述的SUCNR1抑制剂为一SUCNR1 siRNA。

本发明的另一方面中，关于一种诊断癌症的方法，包含检测受试者血清中的琥珀酸含量浓度。

附图说明

图1A-1F显示，在癌细胞条件培养基中存有一种可溶性因子，其可诱导巨噬细胞表现TAM标记。图1A显示培养于控制组培养基、LCC-CM(conditioned medium，条件培养基)或A459-CM中的腹膜巨噬细胞的ARG1蛋白表现量；图1B显示培养于控制组培养基、LCC-CM或A459-CM中的腹膜巨噬细胞的Arg1 mRNA表现量；图1C显示经控制组培养基或PC3-CM处理的巨噬细胞的ARG1表现量水平；图1D显示培养于控制组培养基、从MCF-7收集的条件培养基(MCF7-CM)或从HT29收集的条件培养基(HT29-CM)中24小时的巨噬细胞的Arg1mRNA表现量；图1E显示培养于SCM或PCM中24小时的腹膜巨噬细胞的Arg1、Fizz1、Mgl1 mRNA表现量；图1F显示培养于控制组培养基、LLC-CM、LLC-SCM或LLC-PCM中三天的巨噬细胞中，VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low–巨噬细胞所占的比例。

图2A-2E显示从肺癌条件培养基中的小分子片段中所检测到的琥珀酸。图2A显示由控制组培养基与LLC-SCM的液相层析质谱(LC-MS)的结果所得的主成分分析图(PCA)；图2B显示从正交偏最小平方判别分析(orthogonal partial least squares discriminantanalysis,OPLS-DA)结果所生成的S-plot；图2C、2D显示LLC-CM、A549-SCM、控制组培养基DMEM或纯琥珀酸的代表性的质谱数据(停留时间1.8分钟，m/z 50-400)；图2E显示通过液相层析串联质谱仪(LC-MSMS，MS2)分析纯琥珀酸与LLC-SCM MS1的m/z 117.0的子图谱。

图3A-3B显示在不同的癌细胞条件培养基与原发性皮下肿瘤中的琥珀酸浓度。图3A显示控制组培养基、LLC-CM、A549-CM、PC3-CM、MCF-7-CM、HT-29-CM或腹膜巨噬细胞-CM中的琥珀酸浓度；图3B显示从经皮下注射LLC细胞的C57BL/6J小鼠身上切除下来的原发性皮下肿瘤中的琥珀酸浓度。

图4A-4D显示，琥珀酸可促使巨噬细胞极化为TAM。图4A显示经不同浓度的琥珀酸处理过后的巨噬细胞，其ARG1的表现量；图4B显示培养于琥珀酸(1mM)中24小时的巨噬细胞内的Arg1、Fizz1、Mgl1与Mgl2 mRNA表现量；图4C显示经琥珀酸刺激3天后(1mM)，巨噬细胞中VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low–TAM所占的比例；图4D显示从经注射LLC与腹腔注射琥珀酸(20与100mg/kg)的小鼠身上所得的原发性皮下肿瘤中的TAM的百分比。

图5A-5D显示血清中的琥珀酸与肿瘤SUCNR1在非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)中的临床相关性。图5A显示SUCNR1 mRNA于无肿瘤的肺组织和肺癌组织中的表现量；图5B显示小鼠于接种LLC之前与16天后的血清中琥珀酸浓度；图5C显示健康受试者与NSCLC患者的血清琥珀酸浓度；图5D显示通过AUROC曲线分析NSCLC患者血清中琥珀酸的鉴别力。

图6A-6C显示抗琥珀酸抗体于中和琥珀酸的能力与其特异性。图6A显示抗琥珀酸抗体的特异性；图6B显示培养于不同浓度的抗琥珀酸抗体的LLC-CM或A549-CM的琥珀酸表现量；图6C显示经控制组IgG或抗琥珀酸抗体(Succ Ab)处理24小时的LLC细胞的细胞迁移检测结果。

图7A-7F显示，单株抗体可有效的抑制TAM极化与癌症转移，并改善患有肿瘤的小鼠的存活率。图7A显示经LLC-CM处理的

与对照组IgG或抗琥珀酸抗体培养24小时后的ARG1表现量；图7B显示经抗琥珀酸抗体或对照组IgG预处理过的

于琥珀酸(1mM)处理3天后的

中VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM所占比例；图7C显示经琥珀酸(1mM)处理过的巨噬细胞，在有或没有对照组IgG、抗琥珀酸抗体处理24小时后的迁移检测结果；图7D-7F显示患有LLC肿瘤的C57BL/6J小鼠经6G10F6单株抗体(1、5mg/kg)或对照组IgG抗体(5mg/kg)后，其TAM极化程度、结节数量与存活时间。

图8显示抗体6G10F6的DNA与胺基酸序列。

图9显示抗体6G10G5的DNA与胺基酸序列。

图10显示人源化单株抗体6G10F6的选殖策略。

图11显示小鼠单株抗体Fv片段的同源性模拟。

图12A-12C展示6G10F6嵌合式抗体的结合确认。图12A显示6G10F6嵌合式抗体的SDS胶体电泳(SDS-PAGE)分析结果，其中lane M1为蛋白质标记(TaKaRa,Cat.No.3452)、lane 1为还原性条件、lane 2为非还原性条件；与6G10F6嵌合式抗体的西方墨点法分析结果，其中lane 2为蛋白质标记(GenScript,Cat.No.M00521)、lane P为作为阳性对照组的人类IgG1(Kappa,Sigma,Cat.No.I5154)、lane 1为还原性条件、lane 2为非还原性条件；图12B-12C显示该嵌合式抗体的亲和力检测结果。

图13显示使用Biacore进行人源化抗体亲和力的排序。

图14A-14B显示所选定回复突变抗体的制备。图14A显示在非还原条件和还原条件下选择的抗体的结果；图14B显示纯化的IgG的纯度和产率。

图15A-15B显示嵌合式抗体与三种人源化抗体的亲和力检测结果。图15A显示使用Biacore的1:1相互作用模型的结果；图15B显示其对亲代嵌合式抗体的抗原结合亲和力。

图16A-16B显示所选定可针对抗原的抗体的热稳定评估结果，所有抗体皆在-80℃、4℃、25℃、40℃下处理一至两个月。图16A显示4种纯化抗体的热稳定结果；图16B显示9种未处理IgG样品的热稳定结果。

图17A-17E指出，琥珀酸所诱导的巨噬细胞极化需要SUCNR1的参与。图17A显示经琥珀酸处理的巨噬细胞与对照组IgG或抗SUCNR1抗体培养1小时后，其中VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM所占比的倍数变化；图17B与17C显示经扰码对照组siRNA、小鼠SUCNR1 siRNA-278、559或758转染48小时的巨噬细胞中的Sucnr1 mRNA表现量与SUCNR1蛋白质表现量；图17D显示经扰码对照组siRNA、小鼠SUCNR1 siRNA-278、559或758转染16小时的巨噬细胞中的Arg1、Fizz1、Mgl1、Mgl2 mRNA表现量；图17E显示经琥珀酸处理的巨噬细胞经不同siRNA处理过后的VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM所占比例。

图18A-18E显示，肿瘤所释放的琥珀酸会活化SUCNR1，以利于腹膜巨噬细胞迁移。图18A显示培养于对照组培养基(DMEM)或A549的条件培养基(A549-CM)中的巨噬细胞的细胞迁移检测结果；图18B显示培养于对照组培养基(DMEM)或A549-CM中的巨噬细胞，在含有或不含有对照组IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，其细胞迁移检测结果；图18C显示经不同浓度的琥珀酸处理过的巨噬细胞的细胞迁移检测结果；图18D显示经琥珀酸(1mM)处理过的巨噬细胞，在含有或不含有对照组IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，其细胞迁移检测结果；图18E显示经不同浓度的琥珀酸与PDGF处理的巨噬细胞在底室(bottom chamber)的细胞迁移检测结果。

图19A-19F显示，琥珀酸可促进肿瘤细胞的迁移与侵袭能力。图19A显示经不同浓度的琥珀酸处理过的LLC细胞的细胞迁移和侵袭能力检测结果；图19B、19C显示经不同浓度的琥珀酸处理过的A549、HT-29、MCF-7、PC3细胞的细胞迁移和侵袭能力检测结果；图19D显示经琥珀酸(0.5、1、2.5mM)或空白对照处理24小时的A549细胞中，E-黏附蛋白(E-cadherin)、N-黏附蛋白(N-cadherin)与波形蛋白(vimentin)的表现量；图19E显示显示经琥珀酸(1mM)或空白对照处理一段指定时间的A549细胞中，E-黏附蛋白(E-cadherin)、N-黏附蛋白(N-cadherin)与波形蛋白(vimentin)的表现量；图19F显示在给予或没有给予metformin(2mM)的情况下，经琥珀酸处理的A549细胞的细胞迁移检测结果。

图20A-20C显示琥珀酸可促进肿瘤转移。图20A显示从患有肿瘤的C57BL/6J小鼠上切除的肺脏，并且计算其中的转移结节；图20B、20C显示从患有肿瘤的C57BL/6J小鼠上切除的肝脏、脾脏、肾上腺中的转移结节。

图21A-21E显示，由琥珀酸所诱导的极化巨噬细胞会增强癌细胞的迁移。图21A、21B显示单株培养的LLC以及与琥珀酸诱导的极化巨噬细胞共培养的LLC的细胞迁移检测结果与其IL-6表现量；图21C、21D显示单株培养的LLC以及有添加抗IL-6中和抗体或对照组IgG(2.5μg/ml)并与琥珀酸诱导的极化巨噬细胞共培养的LLC的细胞迁移检测结果与其IL-6表现量；图21E显示与经干扰对照组siRNA(sc)或SUCNR1 siRNA-758转染的巨噬细胞共培养的LLC细胞的IL-6表现量。

图22A-22C显示琥珀酸对于细胞内钙的浓度变化、ERK1/2活化与前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)制造的作用效果。图22A显示经琥珀酸(1mM)处理一段指定时间后的A549/shNC与A549/shSUCNR1细胞中的ERK1/2与磷酸化ERK1/2的表现量；图22B、22C显示经琥珀酸(1mM)处理2小时的LLC/shNC、LLC/shSUCNR1、A549/shNC与A549/shSUCNR1细胞中的细胞内钙含量与其条件性培养基中PGE2含量。

图23A-23B显示，琥珀酸可通过SUCNR1信息传递路径而促进肿瘤细胞的迁移与侵袭能力。图23A显示在含有或不含对照组IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，经琥珀酸(1mM)处理的LLC、A549、PC3、HT-29细胞的细胞迁移检测结果；图23B显示在含有或不含对照组IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，经琥珀酸(1mM)处理的LLC、HT-29细胞的侵袭能力检测结果。

图24A-24F显示，肿瘤分泌的琥珀酸可通过SUCNR1信息传递路径而促进肿瘤转移。图24A显示稳定表达shSUCNR1或shNC的A549细胞株(A549/shSUCNR1、A549/shNC)中的SUCNR1表现量；图24B显示已稳定转染对照shRNA或SUCNR1 shRNA的A549细胞(A549/shNC、A549/shSUCNR1)，经琥珀酸(1mM)刺激24小时后的细胞迁移与侵袭能力检测结果；图24C显示稳定表达shSUCNR1的LLC细胞株(LLC/shSUCNR1)的Sucnr1 mRNA表现量；图24D显示LLC细胞与LLC/shSUCNR1细胞经琥珀酸(1mM)刺激24小时后，其细胞迁移检测结果；图24E显示经注射A549/shNC细胞或A549/shSUCNR1细胞的小鼠，接受每周两次的腹膜内注射琥珀酸(100mg/kg)共8周后，进行肺脏转移结节的检测结果；图24F显示经注射LLC细胞或LLC/shSUCNR1细胞的小鼠，接受每周两次腹膜内注射琥珀酸(100mg/kg)共8周，再进行肺脏转移结节的检测结果。

图25A-25E显示琥珀酸对于A549与LLC细胞内HIF-1α与激酶磷酸化的影响。图25A显示A549细胞与LLC细胞经琥珀酸(1mM)处理一段特定时间后，其HIF-1α、Akt、磷酸化Akt、AMPK、磷酸化AMPK、p38 MAPK与磷酸化p38 MAPK的表现量；图25B显示LLC细胞经琥珀酸(1mM)处理一段特定时间后，其HIF-1αmRNA表现量；图25C显示LLC细胞经不同浓度的LY294002或SB202190处理12小时后，其HIF-1αmRNA表现量；图25D显示经LY294002或SB202190预处理过的LLC细胞，再经琥珀酸(1mM)处理12小时后，其HIF-1αmRNA表现量；图25E显示A549/shNC、A549/shSUCNR1经琥珀酸(1mM)或二甲酯琥珀酸(dimethyl-estersuccinate，DMS，20mM)处理12小时后，其HIF-1αmRNA表现量。

图26A-26F显示，PI3K所参与的HIF-1α正调控对于琥珀酸诱导的癌症转移与EMT至关重要。图26A显示在含有或不含各式浓度的HIF-1α抑制剂、2-MeOE2、Bay 87-2243的情况下，LLC细胞与A549细胞经琥珀酸处理24小时后的细胞迁移检测结果；图26B、26C显示在含有或不含a-KG(1mM)或DMOG(200μM)的情况下，A549细胞经琥珀酸(1mM)处理24小时后的细胞迁移检测结果；图26D显示A549/shNC或A549/HIF-1α细胞中的HIF-1αmRNA表现量，以及经琥珀酸(1mM)处理或未经琥珀酸处理的A549/shNC或A549/HIF-1α细胞的细胞迁移检测结果；图26E、26F显示经LY294002或Bay 87-2243预处理过的A549细胞再以空白对照或琥珀酸(1mM)处理24小时后，其E黏附蛋白与波形蛋白的表现量。

图27A-27B显示HIF-1α在体内由琥珀酸所诱导的肿瘤转移中所扮演的角色。图27A显示经注射A549/shNC或A549/HIF-1α细胞，接受每周两次腹膜内注射琥珀酸(100mg/kg)共8周，再进行肺脏转移结节的检测；图27B显示从A549/shNC或A549/HIF-1α原发性皮下肿瘤所纯化的总蛋白中，其E黏附蛋白与波形蛋白的表现量。

具体实施方式

在以下的实施例中，将进一步举例说明本发明的其他特征和优点，以下实施例仅作为范例说明，而非用于限制本发明的范围。

实施例1、癌细胞分泌的琥珀酸可诱导巨噬细胞极化

癌症条件培养基中的可溶性因子可诱导巨噬细胞中的TAM标记

先将腹膜巨噬细胞培养于对照组培养基，或是从LLC细胞或A549细胞收集得到的条件培养基(LLC-CM、A549-CM)中24小时，接着分别通过西方墨点法与实时聚合酶连锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)，测量巨噬细胞中的ARG1蛋白质与Arg1mRNA表现量。将从人类前列腺癌PC3细胞收集的条件培养基(PC3-CM)，分别与腹膜巨噬细胞培养于含10％(v/v)FBS的RPMI1640培养基中24小时、48小时、72小时，再将经对照组培养基或PC3-CM处理过的巨噬细胞的细胞裂解物，进行ARGI或β-actin抗体的免疫墨点检测。上述实验共重复进行3次，其结果皆显示，相较于对照组培养基，培养于肺癌细胞株(小鼠LLC细胞与人类A549细胞)的条件培养基中的巨噬细胞的ARG1蛋白质与mRNA表现量均上升(图1A与1B)，且人类前列腺癌细胞(PC3)的条件培养基也可达到类似的效果，提升巨噬细胞中的ARG1蛋白质表现量(图1C)。另一方面，分别将腹膜巨噬细胞培养于对照组培养基、从MCF-7收集的条件培养基(MCF7-CM)或从HT29收集的条件培养基(HT29-CM)共24小时，并以qPCR进行巨噬细胞中Arg1 mRNA表现量的检测，其显示人类乳癌细胞(MCF-7)与大肠癌细胞(HT-29)皆会提升巨噬细胞内的Arg1与其他TAM标记，如Fizz1、Mgl1 mRNA表现量(图1D)。

为鉴定其中的活性分子，将LLC-CM与A549-CM分成具有小分子(<3kDa)的SCM，与具有蛋白质-胜肽片段(>3kDa)的PCM，并以qPCR分析经过于SCM或PCM中培养24小时的腹膜巨噬细胞的Arg1、Fizz1、Mgl1 mRNA表现量；另外，将腹膜巨噬细胞培养于对照培养基、LLC-CM、LLC-SCM或LLC-PCM共三天。将LLC与A549细胞的条件培养基(LLC-CM、A549-CM)依分子大小(<3kDa与>3kDa)进行区分，并检测其对于巨噬细胞的Arg1表现量的影响。结果显示，小分子的片段(<3kDa)不仅可正调控Arg1、Fizz1、Mgl1的表现量，还可增加VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM所占比例。然而，蛋白质-胜肽片段(>3kDa，PCM)并不具有相同的效果(图1E、1F)(通过流式细胞仪测量VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-巨噬细胞所占比例，并以对照组培养基处理的细胞数进行标准化，所有数据皆表示三次独立实验的平均值±SEM，**为P<0.005；***为P<0.0005)。

接着，以液相层析质谱仪(LC-MS)，鉴别LLC-SCM与A549-SCM中的可溶性分子，由其主成分分析(principal component analysis,PCA)显示，LLC-SCM与对照培养基相比，在其成分分布上有明显的不同(图2A)，代表这两组之间的代谢物组成具有差异。为了鉴定由癌症细胞所分泌的代谢物，使用正交偏最小平方判别分析(orthogonal partial leastsquares discriminant analysis,OPLS-DA)模型所生成的S-plot进行分析，根据S-plot的结果，可见11种LLC细胞所分泌的代谢物具有显著性的倍数变化与较大的p(corr)[1]、CoeffCS值(大于0.001)(图2B与表1)，通过检索内部的代谢物数据库和纯化合物的验证，三种LLC细胞所分泌的代谢物经确定为琥珀酸、乳酸、柠檬酸，而目前尚不清楚其他八种代谢物的化学特性。此外，通过质谱分析(滞留时间1.8分钟，m/z 50-400)，可见肿瘤细胞-SCM与对照培养基之间有显著差异，在LLC-SCM(图2C)与A549-SCM(图2D)可见一主要的m/z 117.0的峰值，但在对照培养基中并不见此峰值，且该m/z 117.0峰值的子离子图谱也与纯琥珀酸相同(图2E)。

表1.通过由OPLS-DA所生成的S-plot分析LLC-SCM中强度较对照培养基高的代谢物

为进一步确认癌症细胞的条件培养基中是否含有琥珀酸，使用琥珀酸比色分析法套组(Succinate Colorimetric Assay Kit)分析条件培养基。其结果显示，在LLC-CM(0.57mM)、A549-CM(0.43mM)、PC3-CM(0.41mM)、MCF-7-CM(0.28mM)、HT-29-CM(0.25mM)中皆能侦测到相当的琥珀酸浓度，而在巨噬细胞条件培养基与新鲜的对照培养基中，则仅侦测到少量的琥珀酸(皆为0.07mM)。这些结果显示，琥珀酸是癌症细胞的条件培养基中主要的代谢物，可促进巨噬细胞极化。另外，将C57BL/6J小鼠经皮下注射LLC细胞，于21天后在其身上诱发肿瘤形成，接着将其肿瘤切除并进行分析。其结果显示，在皮下肿瘤中的琥珀酸浓度为0.65±0.039mM(n＝11，数据显示为平均值±SEM，***为P<0.0005)(图3B)，表示癌症细胞可释放琥珀酸至细胞外环境中，此可能为正调控TAM标记与造成TAM极化的原因。

癌细胞分泌的琥珀酸可诱导巨噬细胞极化

以琥珀酸处理小鼠腹膜巨噬细胞，并检测其TAM标记的表现量，其结果显示琥珀酸可提升小鼠腹膜巨噬细胞内的ARG1蛋白质表现量，且其呈现浓度依赖性(图4A)。除此之外，进一步分析腹膜巨噬细胞内的TAM特异性基因的转录，结果显示琥珀酸可提升TAM标记相关基因的表现量，包括Arg1、Fizz1、Mgl1、Mgl2，且呈现浓度依赖性(图4B)；另外，琥珀酸亦可正调控TAM表面标记，包括CD11c与VCAM1(VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low)(图4C)，这表示琥珀酸可使巨噬细胞极化为VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM。接着，使用一种LLC的同源小鼠肿瘤模型，评估琥珀酸对于体内的TAM极化的作用。将LLC细胞经皮下注射至C57BL/J6小鼠，后续接受每周两次的腹膜内注射琥珀酸(20、100mg/kg)或空白对照(赋形剂)，共3周，且于第21天时采集其原发性皮下肿瘤，并通过流式细胞仪分析从不同组别采集的肿瘤(生理食盐水组的n＝11；20mg/kg琥珀酸组的n＝8；100mg/kg琥珀酸组的n＝10)，评估其中TAM所占比例(数据为三次实验的平均值±SEM，其中*为P<0.05、**为P<0.005、***P<0.0005)。结果显示，从给予琥珀酸处理的小鼠采集的原发性皮下肿瘤，其中所含的VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM数量，明显高于给予生理食盐水的小鼠(图4D)。总体而言，以上结果显示琥珀酸可促进TAM的功能性极化。

实施例2、以血清中的琥珀酸作为诊断癌症的生物标记

人类肺癌中的琥珀酸受器表现量上升

为提供关于SUCNR1的临床相关性，使用qPCR检测213个人类肝癌组织与78个无肿瘤的肝脏组织中的受器mRNA表现量(表2)，结果显示肝癌组织中的平均受器mRNA表现量明显高于无肿瘤的肝脏组织(图5A)，表示肿瘤的SUCNR1表现量上升有助于琥珀酸的促进肿瘤的能力。

表2.用于分析SUCNR1的患者人口统计

血清琥珀酸为潜在的肺癌生物标记

C57BL/6J小鼠经注射LLC细胞，并分析其于接种LLC细胞前、后的血清中琥珀酸浓度。在LLC细胞注射前，可侦测到琥珀酸(平均值为0.17±0.037mM，n＝7)，而在LLC细胞接种后16天则有所上升(平均值为0.36±0.059mM，小鼠患有177.6mm³的肿瘤，其n＝7)(图5B)。此结果表示，患有肿瘤的小鼠的血清中琥珀酸表现量有上升。另外，检测21位健康受试者与97位非小细胞肺癌患者，以确认血清中琥珀酸浓度在临床上的意义(表3)，肺癌患者的平均血清中琥珀酸浓度(0.53±0.038mM)显著性的高于健康受试者(图5C)，表示于非小细胞癌患者的血清中琥珀酸浓度上升可能与肿瘤的进程有关，且有可能为癌症进程的标记。除此之外，通过接受者操作特征曲线下面积(area under the receiver operatingcharacteristic，AUROC)以确认此组患者的鉴别力(图5D)，琥珀酸的曲线下面积(AUC)为0.70(95％信赖区间:0.594-0.813，p＝0.0036)，从AUROC曲线中所得的具有最佳诊断效率的琥珀酸的截止值(cutoff level)为0.34mM(其灵敏度为53.61％与特异性为85.71％)，因此，AUROC分析显示血清中琥珀酸对非小细胞肺癌患者具有更高的预测值。综合以上，这些结果显示血清琥珀酸可作为非小细胞肺癌患者的预测生物标记。

表3.用于分析血清琥珀酸的患者人口统计

结果以患者数量表现

IQR，四分位距

实施例3、抗琥珀酸的单株抗体的开发和治疗效果

开发抗琥珀酸的单株抗体作为抗癌的治疗性抗体

有鉴于癌细胞会分泌琥珀酸至肿瘤微环境中，以促进TAM极化与癌细胞转移，且肺癌患者血清中的琥珀酸浓度显著性的提升，因此，为了进一步检测通过使用抗琥珀酸抗体中和血清中的琥珀酸，以达到抑制肿瘤发生的可能性，遂制备以接合琥珀酸的载体胜肽作为抗原，来产生对抗琥珀酸的多株抗体，并检测其对于LLC细胞迁移的影响。使用琥珀酸-牛血清白蛋白共轭物免疫纽西兰兔，于第三次免疫时，将免疫血清预吸附于蛋白质在体上，并以蛋白质A管柱(GenScript)进行纯化，再使用琥珀酸-KLH(赖氨酸-精氨酸-粗胺酸)共轭物进行抗体的间接ELISA试验(GenScript)，以分析其抗体特异性(图6A)。此外，为了确认抗琥珀酸抗体中和癌症条件培养基中琥珀酸的能力，亦测量分别经抗-琥珀酸抗体或对照抗体处理过的癌症条件培养基中的琥珀酸浓度。先将LLC-CM或A549-CM与不同浓度的抗琥珀酸抗体共同培养于37℃过夜，再使用琥珀酸比色分析法套组(Succinate ColorimetricAssay Kit)测量LLC-CM或A549CM中的琥珀酸浓度。结果显示，抗琥珀酸抗体可显著性的降低癌症条件培养基中的琥珀酸浓度，而对照抗体则无此效果(图6B)。除此之外，将LLC细胞种于transwell盘的上室中，分别以对照IgG或抗琥珀酸抗体(Succ Ab)处理24小时，并使用PDGF-BB作为趋化因子(chemoattractant)。其结果显示，抗琥珀酸抗体可抑制LLC细胞的迁移，而对照抗体则无此效果(图6C)。

因此，进一步制备具潜力的治疗性单株琥珀酸抗体。共计生产并挑选出20种小鼠单株抗体用于ELISA测试。于20株单株抗体中，挑选结合亲和力最高的前五株进行后续的抗癌能力评估。其结果显示，由五种细胞株所衍生的这五株单株抗体，可有效的抑制A549细胞的细胞迁移，尤其是由6G10细胞株所产的单株抗体，具有最佳的抗细胞迁移活性。为了确定肿瘤分泌琥珀酸为造成，癌症条件培养基会诱导巨噬细胞表现ARG1的原因，将进一步检测6G10单株抗体对ARG1表现的影响。将经LLC-CM处理过的

与对照IgG或抗琥珀酸抗体共培养24小时，再将其细胞裂解液进行ARG1或β-actin抗体的免疫墨点法，其显示F5单株抗体可抑制由LLC-CM引起的ARG1正调控，而对照IgG则无此效果(图7A)；另外，先将

以抗琥珀酸抗体或对照IgG预处理1小时，再以琥珀酸(1mM)刺激3天，并通过流式细胞仪测定其中VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low-TAM所占比例，并以对照组培养基的细胞数进行标准化；将经琥珀酸(1mM)处理的巨噬细胞，在有或没有对照组IgG、抗琥珀酸抗体处理24小时后进行transwell检测，其结果显示F6单株抗体不仅可抑制因琥珀酸而上升的TAM表面标记，包含CD11c与VCAM1(VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low)(图7B)，还可抑制琥珀酸所诱导的巨噬细胞迁移，而对照IgG则无此效果(图7C)。因此，选择6G10单株抗体作为第一候选抗体，评估其对LLC的同源小鼠肿瘤模型的治疗效果。先将LLC细胞经皮下注射至C57BL/6J小鼠中，使小鼠带有平均约50mm³的皮下肿瘤(LLC肿瘤接种后8天)，再每周给予小鼠两次腹腔注射6G10F6单株抗体(1、5mg/kg)或对照抗体IgG(5mg/kg)，共5周，于LLC注射后第3周以外科手术切除皮下肿瘤，以评估TAM极化，并于肿瘤切除后的2周后采集小鼠的肺脏、肝脏、脾脏和肾上腺，以评估肿瘤转移。结果显示，6G10F6单株抗体不但可有效的抑制皮下肿瘤中的TAM族群(图7D)，还可抑制肺部肿瘤的重复性(图7E)，而IgG抗体则无此效果。其中值得注意的是，6G10F6单株抗体还可显著的延长患有LLC肿瘤的小鼠的生存期(图7F)。这些结果表示，6G10F6单株抗体可作为一具有治疗性的抗癌单株抗体。

定序融合瘤6G10F6与6G10G5的单株抗体

为确定6G10细胞株所产生的抗琥珀酸抗体的序列，遂将两种融合瘤6G10F6与6G10G5的抗体进行定序。参照TRIzolR试剂的操作说明，从融合瘤细胞中分离出总RNA，再根据PrimeScript^TM 1st Strand cDNA合成套组的操作说明，使用同种型-特异性的反义引子(isotype-specific anti-sense primer)或通用引子(universal primer)，将总RNA反转录为cDNA，并以GenScript的cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)的标准操作程序，扩增VH与VL的抗体片段，再分别将完成扩增的抗体片段转殖到标准选殖载体，之后再以群落PCR，筛选具有正确大小的插入片段的细胞群落，每个片段都将定序至少5个带有正确大小的片段的群落。经比对不同群落的序列后，这些群落所共有的序列如图8和图9所示，编码6G10F6抗体的重链的DNA序列具有如SEQ ID NO:1所记载的序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:2所记载的序列；编码6G10F6抗体的轻链的DNA序列具有如SEQ ID NO:3所记载的序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:4所记载的序列；另一方面，编码6G10G5抗体的重链的DNA序列具有如SEQ ID NO:5所记载的序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:6所记载的序列；编码6G10F6抗体的轻链的DNA序列具有如SEQ ID NO:7所记载的序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:8所记载的序列。

小鼠6G10F6单株抗体的抗体人源化与回复突变设计

通过对6G10F6单株抗体的功能性评估后，可知其具有中和琥珀酸、抑制TAM极化和癌症转移的功能，因此，将通过使用移植互补决定区(complementarity-determiningregion，CDR)与回复突变方法，在不牺牲其亲代(嵌合)抗体的结合亲和力的前提下，进一步将小鼠6G10F6单株抗体人源化。为了降低免疫原性(immunogenicity)，将小鼠6G10F6单株抗体的恒定区置换为人类IgG4(重链)与λ链(轻链)的恒定区，以生成用于开发人源化抗体的嵌合性小鼠-人类6G10F6抗体(图10)。为了进行人源化，使用CDR移植的方式设计人源化抗体，并随后以经移植抗体上的推测性回复突变点位替换，简言之，将嵌合性6G10F6抗体的CDR移植至人类受体(免疫球蛋白μ重链VH与免疫球蛋白λ链可变区VL；图10)以产生每一嵌合性抗体的人源化轻链与人源化重链，选择对结合活性较重要的CDR中的典型残基、骨架区(framework region)与VH-VL接合处(interface)的残基，用于取代亲代抗体上的相对处(counterpart)。

通过计算机辅助的同源性建模程序仿真嵌合性小鼠-人类6G10F6抗体的结构，以鉴定其回复突变的位置。简言之，先于PDB抗体数据库进行小鼠6G10F6抗体序列的BLAST搜寻，以确定Fv片段的最佳模板，尤其是用于建构结构域接口模板，而选定了一具有66％一致性的结构模板2BJM(SPE7的晶体结构：葱酮(anthrone)错合物)，小鼠单株抗体与2BJM模板的氨基酸序列比对如图11所示，基于2BJM的同源性模型，选择了内核中的所有骨架残基，为了将这些残基突变回小鼠单株抗体，相对处(counterpart)保留了内部疏水性相互作用，并降低由回复突变所导致的潜在免疫原性。重链中的人源化可变区被命名为VH1、VH2、VH3、VH4、VH5，其分别包含如SEQ ID NOs:9、10、11、12、13所记载的胺基酸序列；而轻链中的人源化可变区被命名为VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8，其分别包含如SEQ ID NOs:14、15、16、17、18、19、20、21所记载的胺基酸序列；另一方面，重链中的人源化可变区VH1、VH2、VH3、VH4、VH5分别包含如SEQ ID NOs:22、23、24、25、26所记载的DNA序列；而轻链中的人源化可变区VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8分别包含如SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33、34所记载的DNA序列。

测定嵌合型6G10F6抗体与人源化抗体的结合亲和力

为了建构与生产嵌合型6G10F6抗体与人源化抗体，遂合成含有编码人源化IgG重链和轻链的DNA序列，并将其插入pCDNA3.4载体中以建构出全长IgG的表达质体(如图11所示)。于HEK293细胞中表现40种人源化抗体，并离心分离出细胞后，使用ELISA检测上清液的表现量评估，并使用Biacore 8K进行表面电浆共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)，确认其结合与测试出亲和力的排序。纯化嵌合型6G10F6抗体(图12A)，并以表面电浆共振的生物传感器测定琥珀酸抗体对Ag的亲和力，其中一抗分别为山羊抗人的IgG-HRP(GgeScript，Cat.No.A00166)与山羊抗人的λ-HRP(SouthernBiotech，Cat.No.2070-05)。嵌合型抗体对于BSA-琥珀酸的亲和力与动力总结列示于图12B中，而其sensor-grams则显示于图12C中。将表达抗体与亲代抗体进行亲和力的排序，BSA-琥珀酸对于24种表达各式人源化抗体的HEK293细胞的上清液的亲和力呈现于图13中，而无法与标定物结合的群落则以灰色标记显示。

基于亲和力排序结果，将按照GenScript的标准操作程序表达与纯化排序前三的人源化抗体(VH3+VL3、VH4+VL2、VH4+VL3)。通过SDS-PAGE进行评估，人源化IgG纯度约为85％(图14A)，经纯化的IgG产量列于图14B中。进一步挑选出纯度排序前三的纯化抗体，进行在不同浓度下的亲和力测试。通过Biacore 8K检测软件拟合每种抗体的结合数据至1:1相互作用模型，所有数据皆可良好的拟合至模型中(参见图15A)。如图15B所示，三种人源化抗体皆保留了与亲代嵌合性抗体相当的抗源结合亲和力。

经纯化的人源化IgG的热稳定性测定

另外，使用ELISA进行四种经纯化的抗体(包括嵌合型抗体与人源化抗体VH3+VL3、VH4+VL2、VH4+VL3)，及9种表现各个人源化抗体的HEK293细胞的上清液的稳定性评估，ELISA结果显示三种人源化抗体经不同温度处理2个月后仍可与抗原稳固的结合(图16)。

综合以上，小鼠单株抗体(mAb)可成功的被人源化，已成功设计、合成出五种重链与八种人源化轻链，并将其插入pCDNA3.4表达载体进行表达。

实施例4、琥珀酸可通过一特异的膜受器SUCNR1诱导癌细胞迁移并增强癌症转移

SUCNR1信息传递路径参与了琥珀酸所介导的TAM极化

琥珀酸为已知的SUCNR1配体，因此，进一步检测琥珀酸是否可通过SUCNR1促进TAM极化。首先，以对照组IgG与抗SUCNR1抗体预处理腹膜巨噬细胞1小时之后，再以琥珀酸(1mM)刺激细胞3天，之后使用流式细胞仪定量VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low，而数据是以相对于对照培养基处理组的倍数呈现，经抗SUCNR1抗体处理的巨噬细胞可消除由琥珀酸所介导的VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low数量的正调控(图17A)，此外，腹膜巨噬细胞分别经扰码对照组siRNA(scrambled control siRNA)、小鼠SUCNR1 siRNA-278、559或758转染48小时后，再分为经1mM琥珀酸(Succ)刺激或无处理共16小时或3天，之后分别以qPCR测定Sucnr1mRNA表现量和使用ARG1或β-actin进行西方墨点法测定SUCNR1蛋白质表现量(数据代表三次实验的平均值±SEM，*P<0.05；**P<0.005；***P<0.005)，结果显示使用特异性siRNA(si-278、si-559与si-758)而非对照siRNA抑制SUCNR1表现量(图17B、17C)可抑制琥珀酸所诱导的Arg1、Fizz1、Mgl1、Mgl2 mRNA表现量(图17D)，且三个不同的SUCNR1 siRNA可消除由琥珀酸所介导的VCAM1⁺CD11c⁺CD11b^low数量的正调控，而扰码对照组siRNA则无此效果(图17E)。这些结果表示，琥珀酸会通过SUCNR1信息传递路径而促进TAM极化。

琥珀酸激活的SUCNR1可促进巨噬细胞迁移

为进一步检测癌症条件培养基与琥珀酸是否会引发巨噬细胞迁移，将腹膜巨噬细胞接种于transwell盘的上室中，并分别培养于对照培养基(DMEM)或A549细胞的条件培养基(A549-CM)共24小时；另外，将腹膜巨噬细胞接种于transwell盘的上室中，并分别在含有或不含对照IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，培养于对照培养基(DMEM)或A549细胞的条件培养基(A549-CM)共24小时。后续以PDGF-BB为趋化因子以进行细胞迁移测试，并计算迁移的细胞，其结果以基础对照的倍数形式表示，如图18A与18B所示，相较于对照培养基，A549-CM与A549-SCM可促进巨噬细胞的迁移，但抗SUCNR1抗体则可抑制该促进效果，而对照IgG则无此功效；除此之外，以不同浓度的琥珀酸处理巨噬细胞共24小时，其结果显示抗SUCNR1抗体可抑制琥珀酸所诱导的巨噬细胞迁移，而对照IgG则无此效果(图18C)，其表示琥珀酸/SUCNR1信息传递路径对于巨噬细胞的迁移至关重要。

为了确定肿瘤分泌的琥珀酸对巨噬细胞而言，是否为一可溶性的趋化因子，遂于含有或不含对照IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，以琥珀酸(1mM)处理腹膜巨噬细胞共24小时后，再以transwell试验分析细胞迁移情形，其于transwell盘的下室添加PDGF与不同浓度的琥珀酸。相较于对照组，琥珀酸显著性的增强巨噬细胞的迁移(图18D)，且琥珀酸所诱导的迁移程度效果类似于PDGF，此结果表示肿瘤细胞可分泌琥珀酸以促进巨噬细胞聚集与迁移，以及后续的TAM极化。

琥珀酸诱导癌细胞迁移与上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)并增强癌症转移

由于琥珀酸可促进巨噬细胞迁移，因此将进一步检测琥珀酸是否可调节癌细胞迁移，将LLC细胞接种于常规膜或基质胶包覆的膜上，并以不同浓度的琥珀酸处理24小时后，进行transwell迁移检测与侵袭能力检测，于光学显微镜下的3个视野中计算相对的迁移或侵袭能力；同样的，亦将A549、HT-29、MCF-7、PC3细胞接种于transwell盘的上室，并以不同浓度的琥珀酸处理24小时。于迁移检测与侵袭能力检测中，皆以PDGF-BB为趋化因子，并计算迁移的细胞，其结果以基础对照的倍数形式表示，结果显示琥珀酸可促进LLC肺癌细胞(图19A)、A549肺癌细胞、HT-29大肠癌细胞、MCF-7乳癌细胞与PC3前列腺癌细胞(图19B、19C)的细胞迁移与侵袭能力，且呈现剂量依赖关系。

琥珀酸亦影响癌细胞的EMT，简言之，以空白对照或琥珀酸(0.5、1、2.5mM)处理A549细胞共24小时，后续细胞会再经空白对照或琥珀酸(1mM)处理一段特定时间，细胞经裂解后，使用E-黏附蛋白(E-cadherin)、N-黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)或β-actin的特异性抗体进行细胞裂解液的免疫墨点法；另一方面，于含有或不含二甲双胍(2mM)的情况下，使用琥珀酸处理A549细胞共24小时，以评估其抑制EMT效果，并使用transwell试验测定其细胞迁移能力。结果显示琥珀酸可抑制E-黏附蛋白，并增加N-黏附蛋白、波形蛋白表现量，且其效果呈现时间与剂量依赖关系(图19D、19E)，重要的是，EMT抑制剂二甲双胍可消除琥珀酸诱导的A549细胞迁移(图19F)，这些结果表示癌细胞所分泌的琥珀酸可以自分泌或旁分泌的方式通过EMT相关机制促进癌细胞的迁移与侵袭能力。

接着使用同源小鼠LLC肿瘤模型，检测肿瘤分泌的琥珀酸于肿瘤转移中的生理相关性。将LLC细胞经皮下注射至C57BL/6J小鼠，接着通过腹膜内注射的方式给予小鼠每周两次的空白对照或琥珀酸(20、100mg/kg)，并于3周后手术切除皮下原发性肿瘤，再继续饲养小鼠两周后进行牺牲，采集其肺脏、肝脏、脾脏与肾上腺，以评估癌症转移。结果显示，经琥珀酸处理的小鼠的肺脏中，癌症转移结节数量高于经生理食盐水处理的小鼠，并呈现剂量依赖性关系(图20A)，而且于经琥珀酸处理的小鼠的肺脏和脾脏中，其癌症转移结节的数量也同样的偏高(图20B)；另外，于经琥珀酸处理的小鼠的肾上腺中，其转移的发生率也较高，但是并没有达到统计学上的显著性差异(p＝0.088)(图20C)。

因琥珀酸而极化的巨噬细胞会增强癌细胞迁移

由于琥珀酸可通过巨噬细胞表现型的改变而增强癌细胞的转移，因此将检测因琥珀酸而极化的巨噬细胞对于癌细胞迁移的影响。巨噬细胞经琥珀酸处理三天后可得到极化的巨噬细胞，将其与LLC癌细胞共培养于transwell培养盘中，并以transwell试验来分析癌细胞的迁移。其结果显示，相较于将LLC细胞独自培养，极化的巨噬细胞可增强LLC细胞的迁移(图21A)；另一方面，在共培养的培养盘中可见IL-6的浓度上升，但于独自培养的培养基中则无此现象(图21B)。值得注意的是，通过添加抗IL-6中和抗体消除共培养的培养基中的IL-6(图21D)，可消除与极化巨噬细胞共培养的LLC细胞所具备已增强的迁移能力(图21C)。这些结果显示，由极化的巨噬细胞所介导的IL-6分泌在LLC细胞的迁移中至关重要。

将经SUCNR1 siRNA758瞬间转染的巨噬细胞与LLC细胞共培养，并以琥珀酸处理3天后，相较于仅转染对照siRNA的巨噬细胞，经SUCNR1 siRNA758转染的巨噬细胞的细胞迁移能力显著性下降(图21E)，此结果表示琥珀酸所诱导的巨噬细胞极化有助于促进癌细胞迁移。

琥珀酸可通过SUCNR1信息传递路径促进癌症转移

琥珀酸可与SUCNR1结合以激活多个信息传递路径标的，特别是丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，以及增加细胞内钙离子和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)。为了确定琥珀酸可活化癌细胞的SUCNR1，将分析A549细胞中会被琥珀酸激活的典型标的。以琥珀酸(1mM)处理A549/shNC、A549/shSUCNR1细胞一特定时间，取得将细胞裂解后所得的细胞裂解液，以ERK1/2、磷酸化ERK1/2的特异性抗体进行免疫墨点法。显示于琥珀酸处理后，在两分钟的时点可见经对照RNA转染的A549细胞中的磷酸化ERK1/2迅速增加，但此现象在经SUCNR1 shRNA转染的A549细胞中则被抑制了(图22A)。进一步以琥珀酸(1mM)处理LLC/shNC、LLC/shSUCNR1、A549/shNC、A549/shSUCNR1细胞2小时，并分别以钙比色法套组(Calcium Colorimetric Assay Kit)与PGE2 ELISA套组，检测其细胞内的钙浓度与条件培养基中的PGE2含量。其结果显示，A549或LLC细胞在经琥珀酸处理2小时后，其细胞内钙离子浓度上升(图22B)，然而，经SUCNR1 shRNA转染的两种细胞中，其细胞内钙离子浓度皆未升高(图22B)；另外，于经对照shRNA转染的LLC细胞中，可见其释放至培养基中的PGE2含量上升，然而经SUCNR1 shRNA转染的LLC细胞则无此现象(图22C)，这些结果与琥珀酸可激活SUCNR1信息传递的标的的解释一致。

进一步检测琥珀酸通过SUCNR1而诱导癌细胞迁移的能力。于含有或不含对照IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，以琥珀酸(1mM)处理LLC、A549、PC3与HT-29细胞共24小时，后续以transwell试验分析其细胞迁移情形。结果显示，抗SUCNR1抗体可阻断由琥珀酸所诱导的LLCA549、PC3与HT-29细胞迁移，而对照IgG则无此效果(图23A)。除此的外，于含有或不含对照IgG或抗SUCNR1抗体的情况下，以琥珀酸(1mM)处理LLC与HT-29细胞共24小时，后续以基质胶侵袭试验检测其侵袭能力。结果显示，琥珀酸所诱导的LLC与HT-29细胞的侵袭能力同样可被SUCNR1抗体抑制，而IgG抗体则无此抑制效果(图23B)。

接着将分析，于经SUCNR1 shRNA稳定转染后其SUCNR1表现量降低的A549细胞(#3与#8，图24A)中，由琥珀酸所诱导的细胞迁移与细胞侵袭能力。以琥珀酸(1mM)处理经对照shRNA(A549/shNC)或SUCNR1 shRNA(A549/shSUCNR1)转染的A549细胞共24小时，后续以transwell试验与基质胶侵袭试验检测其细胞迁移与侵袭能力。其结果显示，琥珀酸所诱导的A549细胞迁移与侵袭，可因SUCNR1的基因减弱而被抑制(图24B)，此外，与对照组相比，经稳定转染shSUCNR1而Sucnr1表现量下降的的LLC细胞(LLC/shSUCNR1)，被琥珀酸所诱导的细胞迁移与现象也有所降低(图24C及24D)。

为了探讨SUCNR1于体内对琥珀酸所增强的转移的影响，将A549/shNC或A549/shSUCNR1细胞经皮下接种至裸鼠，接着给予小鼠每周\两次的腹膜内注射琥珀酸(100mg/kg)，共持续8周，并于第56天安乐死小鼠，并切除其肺脏组织以检查转移结节。其结果显示，于接种A549/shSUCNR1细胞的小鼠中，其肺脏的转移结节明显低于接种A549/shNC的小鼠(图24E)；于接种LLC/shSUCNR1的小鼠身上也有类似的情况，其肺脏的转移结节也明显下降(图24F)。这些结果显示，琥珀酸会通过SUCNR1而促进癌症转移。

琥珀酸通过PI3K/AKT与HIF-1α信息传递路径而诱导癌症转移

MAPK-、磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT-TOR与AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)所藉导的缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)正调控，在巨噬细胞的活化与癌症进程中扮演重要的角色。因此，进一步探讨这些信息传递因子是否也与琥珀酸的作用相关。以琥珀酸(1mM)处理A549与LLC细胞一段特定时间后，将细胞裂解以取得细胞裂解液，并以HIF-1α、Akt、磷酸化Akt、AMPK、磷酸化AMPK、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK或β-actin的特异性抗体进行免疫墨点法；另外，也以qPCR检测经琥珀酸(1mM)处理一段特定时间后的LLC细胞中的Hif-1αmRNA表现量。结果显示，于LLC与A549细胞中，琥珀酸可诱导p38 MAPK、AKT与AMPK的磷酸化，且其呈现时间相关性，并可增加HIF-1α的蛋白质(图25A)与mRNA表现量(图25B)。使用不同浓度的选择性激酶抑制剂LY294002或SB202190处理LLC细胞共12小时，并测量其Hif-1αmRNA表现量；另外一部分，先以LY294002或SB202190预处理LLC细胞共1小时，接着以琥珀酸(1mM)刺激LLC细胞共12小时，再测量其Hif-1αmRNA表现量。结果显示，PI3K/AKT的抑制剂可抑制细胞本身的Hif-1α表现量，以及琥珀酸所诱导的Hif-1α表现量，而p38 MAPK的抑制剂则无此效果(图25C与25D)。为了解SUCNR1于驱动细胞表现HIF-1α中所扮演的角色，遂进一步检测于A549/shSUCNR1细胞中的HIF-1α表现量。以qPCR检测于经琥珀酸(1mM)或琥珀酸二甲酯(dimethyl-ester succinate，DMS，20mM)处理12小时后的A549/shNC与A549/shSUCNR1细胞中HIF-1α的表现量。结果显示，在经琥珀酸处理的A549/shNC细胞中，出现HIF-1α的正调控(图25E)，而经膜穿透性DMS处理的A549/shNC细胞，则出现HIF-1α的表现量上升。然而，于A549/shSUCNR1细胞中，由琥珀酸所诱导的HIF-1α表现被抑制，但并无抑制由DMS所诱导的HIF-1α表现(图25F)。表示，琥珀酸是以SUCNR1相关性的方式诱导HIF-1α表现，而DMS则不需要SUCNR1介入即可诱导HIF-1α表现。

由于已知HIF-1α路径可通过诱导EMT而介导癌症转移，因此将进一步检测琥珀酸是否可通过HIF-1α依赖性的信息传递路径，而促进肺癌细胞迁移与EMT。以不同浓度的HIF-1α特异性抑制剂处理LLC与A549肺癌细胞，再以transwell试验检测其细胞迁移能力。结果显示，药理上的HIF-1α抑制剂2-MeOE2与Bay 87-2243可抑制LLC与A549细胞因琥珀酸而诱导的细胞迁移，且其呈现剂量依赖关系(图26A)。脯胺酰基羟化酶(Prolyl hydroxylase，PHD)可通过将HIF-1α中的两个保守性脯胺酸残基羟化并加速其降解，而控制HIF-1α蛋白质的稳定性。为了提供更多证据以支持HIF-1α在琥珀酸所诱导的癌细胞迁移中扮演关键角色，遂使用PHD活化剂α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)或抑制剂二甲基草酰甘胺酸(dimethyloxalyl glycine，DMOG)处理细胞，以分析其细胞迁移情形。结果显示，α-KG可抑制琥珀酸所诱导的癌细胞迁移，而DMOG则会促进琥珀酸所诱导的癌细胞迁移(图26B、26C)。此外，亦使用qPCR测量A549/shNC或A549/HIF-1α细胞中的HIF-1α表现量，并以transwell试验检测经琥珀酸处理或未经琥珀酸处理的A549/shNC或A549/HIF-1α细胞的细胞迁移能力。结果显示，HIF-1α的基因削弱(A549/HIF-1α)可抑制A549细胞的由琥珀酸所诱导的细胞迁移能力，但对照组中(A549/shNC)并无此现象(图26D)。另外，以LY294002或Bay 87-2243预处理A549细胞一小时，再以空白对照或琥珀酸(1mM)处理24小时，将细胞裂解后，以E-黏附蛋白、N-黏附蛋白、波形蛋白或β-actin的特异性抗体进行其细胞裂解液的免疫墨点检测，其结果显示，通过LY294002阻断PI3K，或通过Bay 87-2243阻断HIF-1α信息传递路径，皆可抑制琥珀酸所导致的波形蛋白增强，及E-黏附蛋白减少(图26E、26F)。

使用异种移植(xenograft)A549/shHIF-1α肿瘤模型确认，于体内由琥珀酸诱导的转移中，HIF-1α所扮演的角色。将A549/shNC或A549/HIF-1α细胞经由皮下接种至裸鼠，接着给予小鼠每周两次腹膜内注射琥珀酸(100mg/kg)，共8周。结果显示，接种A549/HIF-1α的小鼠的肺脏中，其转移结节数量明显低于接种A549/shNC的小鼠(图27A)，另一方面，进一步利用E-黏附蛋白、波形蛋白或β-actin的特异性抗体，进行从A549/shNC或A549/HIF-1α的原发性皮下肿瘤中萃取的总蛋白质的免疫墨点试验，其结果显示，相较于A549/shNC原发性皮下肿瘤，在A549/HIF-1α原发性皮下肿瘤中，因琥珀酸而导致E-黏附蛋白减少及波形蛋白增强的现象被逆转(图27B)。综上所述，这些结果显示，琥珀酸所活化的SUCNR1可通过PI3K/AKT信息传递路径，诱导由HIF-1α所介导的EMT，进而促进癌症转移。

SEQUENCE LISTING

<110> 台湾卫生研究院

<120> 琥珀酸作为用于癌症诊断和治疗的生物标记的用途

<150> US 62/916,376

<151> 2019-10-17

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aagctgagct ccgtgaccgc agcagataca gccgtgtact attgtgcccg ggaggtgacc 360

acattcggct actttgacta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tagcgcctct 420

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gtgtccaaca agggcctgcc tagcagcatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggacag 1080

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gtgtccctga cctgcctggt taagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1200

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tgcacagtgt ctggctacag catcacatcc gattatgcct ggaactggat caggcagcca 180

cctggcaagg gactggagtg gatcggctac acctcctatt ctggcagcac atcctacaac 240

ccctctctga agagccgggt gaccatcagc agagacacat ccaagaatca gttctttctg 300

aagctgagct ccgtgaccgc cgccgataca gccgtgtact attgtgcccg ggaggtgacc 360

acattcggct actttgacta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tagcgcctct 420

acaaagggcc ccagcgtttt cccactggct ccctgtagca gaagcaccag cgaatctaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcctgagc cagtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatctgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcaatc tagcggcctg 600

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gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaacagcac ctacagagtg 960

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 1020

gtgtccaaca agggcctgcc tagcagcatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggacag 1080

cccagggaac cccaggttta cacactgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaatcag 1140

gtgtccctga cctgcctggt taagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1200

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<210> 24

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<213> Artificial sequence（人工序列）

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<223> VH3 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VH3)

<400> 24

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

gtgcagctgc aggagtctgg accaggactg gtgaagccat cccagaccct gtctctgacc 120

tgcacagtgt ctggctacag catcacatcc gattatgcct ggaactggtt caggcagccc 180

cctggcaaga agctggagtg gatgggctac acctcctatt ctggcagcac atcctacaac 240

ccctctctga agagccgggt gaccatcagc agagacacat ccaagaatca gatcagcctg 300

aagctgagct ccgtgaccgc agcagatacc gcaacatact attgtgcccg ggaggtgacc 360

acattcggct actttgacta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tagcgcctct 420

acaaagggcc ccagcgtttt cccactggct ccctgtagca gaagcaccag cgaatctaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcctgagc cagtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatctgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcaatc tagcggcctg 600

tactctctga gcagcgtggt cacagtgcct agctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 660

tgtaatgtgg atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagtgga atctaagtac 720

ggccctcctt gtcctagctg ccccgctcct gaatttctcg gcggaccttc cgtgttcctg 780

tttcctccaa agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccctgaagt gacctgcgtg 840

gtggtggacg tgtcccaaga ggatcctgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 900

gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaacagcac ctacagagtg 960

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 1020

gtgtccaaca agggcctgcc tagcagcatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggacag 1080

cccagggaac cccaggttta cacactgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaatcag 1140

gtgtccctga cctgcctggt taagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1200

agcaatggcc agcctgagaa caactacaag acaacccctc ctgtgctgga cagcgacggc 1260

tcattcttcc tgtacagcag actgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1320

ttctcctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtct 1380

ctgtccctgg gcaaatga 1398

<210> 25

<211> 1398

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VH4 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VH4)

<400> 25

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

gtgcagctgc aggagtctgg accaggactg gtgaagccat cccagaccct gtctctgacc 120

tgcacagtgt ctggctacag catcacatcc gattatgcat ggaactggtt caggcagcca 180

cctggcaaga agctggagtg gatgggctac acctcctatt ctggcagcac atcctacaac 240

ccctctctga agagcagagt gaccatcagc gtggacacat ccaagaatca gtttagcctg 300

aagctgagct ccgtgaccgc agcagataca gccgtgtact attgtgcccg ggaggtgacc 360

acattcggct actttgacta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tagcgcctct 420

acaaagggcc ccagcgtttt cccactggct ccctgtagca gaagcaccag cgaatctaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcctgagc cagtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatctgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcaatc tagcggcctg 600

tactctctga gcagcgtggt cacagtgcct agctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 660

tgtaatgtgg atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagtgga atctaagtac 720

ggccctcctt gtcctagctg ccccgctcct gaatttctcg gcggaccttc cgtgttcctg 780

tttcctccaa agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccctgaagt gacctgcgtg 840

gtggtggacg tgtcccaaga ggatcctgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 900

gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaacagcac ctacagagtg 960

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 1020

gtgtccaaca agggcctgcc tagcagcatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggacag 1080

cccagggaac cccaggttta cacactgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaatcag 1140

gtgtccctga cctgcctggt taagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1200

agcaatggcc agcctgagaa caactacaag acaacccctc ctgtgctgga cagcgacggc 1260

tcattcttcc tgtacagcag actgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1320

ttctcctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtct 1380

ctgtccctgg gcaaatga 1398

<210> 26

<211> 1398

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VH5 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VH5)

<400> 26

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

gtgcagctgc aggagtctgg accaggactg gtgaagccat cccagaccct gtctctgacc 120

tgcacagtgt ctggctacag catcacatcc gattatgcct ggaactggat caggcagcca 180

cctggcaagg gactggagtg gatcggctac acctcctatt ctggcagcac atcctacaac 240

ccctctctga agagccgggt gaccatcagc agagacacat ccaagaatca gatcagcctg 300

aagctgagct ccgtgaccgc agcagatacc gcaacatact attgtgcccg ggaggtgacc 360

acattcggct actttgacta ttggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc tagcgcctct 420

acaaagggcc ccagcgtttt cccactggct ccctgtagca gaagcaccag cgaatctaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac tttcctgagc cagtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatctgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcaatc tagcggcctg 600

tactctctga gcagcgtggt cacagtgcct agctctagcc tgggcaccaa gacctacacc 660

tgtaatgtgg atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagtgga atctaagtac 720

ggccctcctt gtcctagctg ccccgctcct gaatttctcg gcggaccttc cgtgttcctg 780

tttcctccaa agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccctgaagt gacctgcgtg 840

gtggtggacg tgtcccaaga ggatcctgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 900

gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaacagcac ctacagagtg 960

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 1020

gtgtccaaca agggcctgcc tagcagcatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggacag 1080

cccagggaac cccaggttta cacactgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaatcag 1140

gtgtccctga cctgcctggt taagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1200

agcaatggcc agcctgagaa caactacaag acaacccctc ctgtgctgga cagcgacggc 1260

tcattcttcc tgtacagcag actgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1320

ttctcctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtct 1380

ctgtccctgg gcaaatga 1398

<210> 27

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL1 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL1)

<400> 27

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc ttccctgaca gtgtctccag gcggcaccgt gacactgacc 120

tgcaggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattggtt ccagcagaag 180

ccaggacagg caccacgggc cctgatctat ggcacatcca acagggcacc atggacccct 240

gccagatttt ctggaagcct gctgggaggc aaggccgccc tgaccctgag cggcgtgcag 300

cccgaggacg aggccgagta ctattgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 28

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL2 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL2)

<400> 28

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc ttccctgaca gtgtctccag gcggcaccgt gacactgacc 120

tgcaggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattggtt ccagcagaag 180

ccaggacagg caccaagggg actgatcgga ggcacatcca acagggcacc atggacccct 240

gccagatttt ctggaagcct gctgggaggc aaggccgccc tgaccctgag cggcgtgcag 300

cccgaggacg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 29

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL3 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL3)

<400> 29

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc ttccctgaca gtgtctccag gcggcaccgt gacactgacc 120

tgcaggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattggtt ccagcagaag 180

ccaggacagg caccaagggg actgatcgga ggcacatcca acagggcacc aggagtgcct 240

gcaagatttt ctggaagcct gctgggcgac aaggccgccc tgaccctgag cggagtgcag 300

ccagaggatg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 30

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL4 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL4)

<400> 30

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc atccctgaca gtgtctccag gaggaaccgt gacactgacc 120

tgccggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattggtt ccagcagaag 180

cctggccacg cctttacagg cctgatcgga ggcacctcca acagggcacc atggacacct 240

gccagattct ctggaagcct gctgggaggc aaggccgccc tgaccctgag cggcgtgcag 300

cccgaggacg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 31

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL5 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL5)

<400> 31

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc atccctgaca gtgtctccag gaggaaccgt gacactgacc 120

tgccggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattgggt gcaggagaag 180

cctggacacg ccttcacagg actgatcgga ggcacctcca acagggcacc atggacacct 240

gccagatttt ctggaagcct gctgggaggc aaggccgccc tgaccctgag cggcgtgcag 300

cccgaggacg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 32

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL6 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL6)

<400> 32

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc ttccctgaca gtgtctccag gcggcaccgt gacactgacc 120

tgcaggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattgggt gcaggagaag 180

ccaggacagg caccaagggg actgatcgga ggcacatcca accgggcccc cggcgtgcct 240

gccagattct ctggaagcct gctgggcgac aaggccgccc tgaccctgag cggagtgcag 300

ccagaggatg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 33

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL7 of the humanized 6G10F6 antibody (6G10F6单株抗体的人源化VL7)

<400> 33

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc atccctgaca gtgtctccag gaggaaccgt gacactgacc 120

tgccggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattggtt ccagcagaag 180

cctggccacg cctttacagg cctgatcgga ggcacctcca acagggcacc aggagtgcct 240

gccagattct ctggaagcct gctgggcgac aaggccgccc tgaccctgag cggagtgcag 300

ccagaggatg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

<210> 34

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<223> VL8 of the humanized antibody (人源化抗体的VL8)

<400> 34

atgggctggt cctgcatcat tctgtttctg gtggccacag ccaccggcgt gcactctcag 60

acagtggtga cccaggagcc atccctgaca gtgtctccag gaggaaccgt gacactgacc 120

tgccggagct ccaccggagc agtgaccaca tctaactacg ccaattgggt gcaggagaag 180

cctggacacg ccttcacagg actgatcgga ggcacctcca acagggcacc aggagtgcct 240

gcaagatttt ctggaagcct gctgggcgac aaggccgccc tgaccctgag cggagtgcag 300

ccagaggatg aggccgagta tttctgtgcc ctgtggtact ccacacacta cgtgttcggc 360

acaggcacca aggtgaccgt gctgggacag cctaaggccg ctcctagcgt gacactgttt 420

cctccaagca gcgaggaact gcaggccaac aaagccacac tcgtgtgcct gatcagcgac 480

ttctatcccg gcgctgtgac agtggcctgg aaggctgata gctctcctgt gaaagccggc 540

gtggaaacca ccacacctag caagcagagc aacaacaaat acgccgccag cagctacctg 600

agcctgacac ctgagcagtg gaagtcccac agatcctaca gctgccaagt gacccacgag 660

ggcagcaccg tggaaaaaac agtggcccct accgagtgca gctga 705

Claims

1.一种抗琥珀酸单株抗体，其特征在于，包含一具有如SEQ ID NO:2或6所记载的胺基酸序列的重链；及一具有如SEQ ID NO:4或8所记载的胺基酸序列的轻链。

2.如权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该抗体具有一如SEQ ID NO:2所记载的胺基酸序列的重链；及一如SEQ ID NO:4所记载的胺基酸序列的轻链。

3.如权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该抗体具有一如SEQ ID NO:2所记载的胺基酸序列的重链；及一如SEQ ID NO:4所记载的胺基酸序列的轻链。

4.如权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可中和琥珀酸。

5.如权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可抑制癌症转移及抑制巨噬细胞转化为肿瘤相关的巨噬细胞。

6.如权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可抑制SUCNR1信息传递路径。

7.如权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可抑制ARG1的表现。

8.一种人源化抗琥珀酸单株抗体，其特征在于，包含重链可变区VH1-VH5，其具有如SEQID NOs:9-13所记载的胺基酸序列；及轻链可变区VL1-VL8，其具有如SEQ ID NOs:14-21所记载的胺基酸序列。

9.如权利要求8所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可中和琥珀酸。

10.如权利要求8所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可抑制癌症转移及抑制巨噬细胞转化为肿瘤相关的巨噬细胞。

11.如权利要求8所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可抑制SUCNR1信息传递路径。

12.如权利要求8所述的单株抗体，其特征在于，该抗体可抑制ARG1的表现。

13.一种治疗癌症的方法，其特征在于，包含给予受试者一琥珀酸拮抗剂。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该琥珀酸拮抗剂为一抗琥珀酸单株抗体。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该琥珀酸拮抗剂为一SUCNR1抑制剂。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该SUCNR1抑制剂为一SUCNR1 siRNA。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该癌症为非小细胞肺癌、肺癌、前列腺癌、乳癌或大肠癌。

18.一种用于诊断癌症的方法，其特征在于，包含检测受试者血清中的琥珀酸浓度。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该癌症为非小细胞肺癌、肺癌、前列腺癌、乳癌或大肠癌。