TWI756870B - 琥珀酸作為用於癌症診斷和治療之生物標記的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示了癌細胞會分泌琥珀酸至細胞外環境中，進而增加巨噬細胞的遷移能力並介導癌症相關巨噬細胞(TAM)極化；除此之外，在小鼠實驗模型中發現，琥珀酸不但可誘導癌細胞上皮細胞間質轉化(EMT)、增強癌細胞遷移能力，還可促進癌症轉移。本發明亦指出，相較於健康的受試者，肺癌患者血清中的琥珀酸濃度較高，此意味在癌症的發展和進程中，癌細胞會釋放大量的琥珀酸至循環系統中。如本發明所示，血清琥珀酸具有很高的鑑別力，可作為新一類具有預測非小細胞肺癌(NSCLC)潛在價值的循環代謝性致癌物(circulating oncometabolite)；此外，由於在LLC腫瘤模型中，琥珀酸濃度的上升伴隨著皮下腫瘤中TAM的增加與更嚴重的癌症轉移，因此血清中的琥珀酸可能為治療NSCLC的有效治療生物標記。於是，本發明亦提供一種可作為癌症治療劑的抗-琥珀酸抗體。

Description

琥珀酸作為用於癌症診斷和治療之生物標記的用途
本發明係關於一種琥珀酸用於作為診斷或治療癌症的新穎生物標記之用途。較特別地，本發明係關於一種使用琥珀酸的拮抗劑，例如抗琥珀酸之單株抗體或SUCNR1抑制劑，以治療癌症的方法；以及一種透過檢測血清中琥珀酸濃度，以診斷癌症的方法。
免疫系統已進化至可區別正常細胞和惡性細胞，被激活的免疫系統會啟動免疫反應，消除受損的細胞與惡性細胞以保護宿主，根據免疫監控(immunosurveillance)的古典概念，免疫系統應該可預防健康人體內的腫瘤生成與發展。確實，有越來越多的證據顯示，癌症免疫監控的存在不僅可保護宿主免於原發性癌症的侵襲，還可塑造腫瘤的免疫原性(de Visser et al., 2006; Dunn et al., 2004)。然而，一旦腫瘤開始形成，腫瘤細胞便會激活致耐受性訊息傳遞路徑(tolerogenic signaling pathway)，進而損壞免疫系統的自我調節，導致腫瘤具有免疫耐受的能力而不受免疫攻擊。除此之外，免疫細胞、內皮細胞與纖維母細胞會被召集至腫瘤微環境中並被激活成腫瘤相關細胞，從而促進腫瘤的生長與轉移。
在腫瘤微環境中，癌細胞不僅會釋放可溶性分子啟動致癌基因的訊息傳遞，以利於其生長、存活與轉移，還會影響包含免疫細胞在內的周遭細胞以增強腫瘤的發展。然而，宿主的細胞會將腫瘤細胞視為外來細胞，並對其進行免疫監控，因此，腫瘤與免疫細胞之間的動態相互作用，對於調節腫瘤的發生和發展至關重要。巨噬細胞(macrophage)，是腫瘤微環境中的主要細胞族群，在免疫的自我調節與防禦中扮演著重要角色，此外，亦會被微環境中的訊號激活與極化，造成其功能上的不同表現型，例如典型的活化巨噬細胞(M1)與另類活化巨噬細胞(M2)。許多證據都顯示，腫瘤微環境中的巨噬細胞會被腫瘤分泌的細胞激素激活，而變為M2-極化之腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)，進而促進腫瘤的進程並抑制抗腫瘤的免疫反應。癌細胞會產生用於控制其周圍多種非癌細胞之功能性表現型的訊號，以幫助腫瘤的發展。了解腫瘤細胞將細胞招集至其微環境並改變周圍細胞表現型的機制，將有助於提供更有效的治療策略。
細胞的代謝物組成情形被認為是生理或病理狀態的重要指標，例如健康或癌化。除此之外，內源代謝物會參與調控許多細胞生物學上所定義的進程，例如免疫自我調節與腫瘤發展。換句話說，人體需要特定的代謝物以維持正常的生理過程；相反的，某些代謝物在壓力下會誘發有害的反應。舉例來說，腫瘤細胞所釋放的色胺酸代謝物犬尿胺酸(kynurenine)會促進癌細胞的進展，然而，宿主細胞為了抑制腫瘤進程會釋放防禦性的代謝物，像是纖維母細胞不論是在體內或是在體外，皆會透過旁分泌的方式生產與釋放一種新型的色胺酸代謝物：5-甲氧基色胺酸(5-methoxytryptophan)至細胞外環境，以抑制COX-2的過度表現及腫瘤的發生。而值得注意的是，這類代謝物的產生在癌症相關的纖維母細胞中是被抑制的，表示腫瘤細胞可能會透過影響宿主細胞的表現型而消除其抗腫瘤的反應。因此，癌細胞很可能可以產生並釋放內源性因子，藉以透過抑制抗腫瘤的免疫反應，進而促進腫瘤的發展進程。
因此，本發明係提供一種藉由檢測血清中琥珀酸的表現程度做為新的癌症生物標記用以診斷癌症的方法。另外，本發明亦提供一種使用琥珀酸拮抗劑，例如抗琥珀酸之單株抗體或SUCNR1抑制劑，以治療癌症的方法。
基於上述目的，本發明揭示，腫瘤分泌的琥珀酸可活化琥珀酸受器(SUCNR1)之訊息傳遞路徑，使巨噬細胞極化為腫瘤相關巨噬細胞(TAM)以利於腫瘤轉移，從而提高癌症病患體內中的琥珀酸表現程度。
於是，本發明於一方面係提供一種抗-琥珀酸單株抗體，其包含一具有如SEQ ID NO: 2或6所記載之胺基酸序列的重鏈；與一具有如SEQ ID NO: 4或8所記載之胺基酸序列的輕鏈。
於部分實施例中，所述之抗-琥珀酸單株抗體是一種人源化抗-琥珀酸抗體。於一較佳的實施例中，所述之人源化抗-琥珀酸抗體包含重鏈可變結構域VH1-VH5，其分別包含如SEQ ID NO: 9-13所記載之胺基酸序列；與輕鏈可變結構域VL1-VL8，其分別包含如SEQ ID NO: 14-21所記載之胺基酸序列。
於本發明的部分實施例中，所述之單株抗體可中和血清中之琥珀酸。
於另一實施例中，所述之單株抗體可抑制癌症轉移與抑制巨噬細胞轉化成腫瘤相關巨噬細胞。
於另一實施例中，所述之單株抗體可抑制SUCNR1訊息傳遞路徑，並抑制ARG1的表現。
於部分實施例中，所述之單株抗體具有一如SEQ ID NO: 2所記載之胺基酸序列的重鏈，與一如SEQ ID NO: 4所記載之胺基酸序列的輕鏈。
於部分實施例中，所述之單株抗體具有一如SEQ ID NO: 6所記載之胺基酸序列的重鏈，與一如SEQ ID NO: 8所記載之胺基酸序列的輕鏈。
於部分實施例中，所述之人源化抗-琥珀酸抗體包含重鏈可變結構域VH1-VH5，其分別包含如SEQ ID NO: 9、10、11、12、13所記載之胺基酸序列；與輕鏈可變結構域VL1-VL8，其分別包含如SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19、20、21所記載之胺基酸序列。
於其他實施例中，所述之人源化抗-琥珀酸抗體包含重鏈可變結構域VH1-VH5，其分別包含由如SEQ ID NO: 22、23、24、25、26所記載之DNA序列編碼的氨基酸序列；與輕鏈可變結構域VL1-VL8，其分別包含由如SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、32、33、34所記載之DNA序列編碼的氨基酸序列。
另一方面，本發明係關於一種治療癌症的方法，其包含將一琥珀酸拮抗劑給予一有其需要的患者。
於部分實施例中，所述之癌症為非小細胞肺癌、肺癌、前列腺癌、乳癌或大腸癌。
於部分實施例中，所述之琥珀酸拮抗劑為一抗-琥珀酸單株抗體。
於其他實施例中，所述之琥珀酸拮抗劑為一SUCNR1抑制劑。於部分實施例中，所述之SUCNR1抑制劑為一SUCNR1 siRNA。
本發明的另一方面中，係關於一種診斷癌症的方法，包含檢測受試者血清中的琥珀酸含量濃度。
於部分實施例中，所述之癌症為非小細胞肺癌、肺癌、前列腺癌、乳癌或大腸癌。
在以下的實施例中，將進一步舉例說明本發明的其他特徵和優點，以下實施例僅作為範例說明，而非用於限制本發明的範圍。
實施例 1 、癌細胞分泌的琥珀酸可誘導巨噬細胞極化
癌症條件培養基中的可溶性因子可誘導巨噬細胞中的 TAM 標記
先將腹膜巨噬細胞培養於對照組培養基，或是從LLC細胞或A549細胞收集得到的條件培養基(LLC-CM、A549-CM)中24小時，接著分別透過西方墨點法與即時聚合酶連鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)，測量巨噬細胞中的ARG1蛋白質與Arg1 mRNA表現量。將從人類前列腺癌PC3細胞收集的條件培養基(PC3-CM)，分別與腹膜巨噬細胞培養於含10% FBS的RPMI1640培養基中24小時、48小時、72小時，再將經對照組培養基或PC3-CM處理過的巨噬細胞的細胞裂解物，進行ARGI或β-actin抗體的免疫墨點檢測。上述實驗共重複進行3次，其結果皆顯示，相較於對照組培養基，培養於肺癌細胞株(小鼠LLC細胞與人類A549細胞)之條件培養基中的巨噬細胞的ARG1蛋白質與mRNA表現量均上升(圖1A與1B)，且人類前列腺癌細胞(PC3)的條件培養基也可達到類似的效果，提升巨噬細胞中的ARG1蛋白質表現量(圖1C)。另一方面，分別將腹膜巨噬細胞培養於對照組培養基、從MCF-7收集的條件培養基(MCF7-CM)或從HT29收集的條件培養基(HT29-CM)共24小時，並以qPCR進行巨噬細胞中Arg1 mRNA表現量的檢測，其顯示人類乳癌細胞(MCF-7)與大腸癌細胞(HT-29)皆會提升巨噬細胞內的Arg1 與其他TAM標記，如Fizz1 、Mgl1 mRNA表現量(圖1D)。
為鑑定其中的活性分子，將LLC-CM與A549-CM分成具有小分子(＜ 3 kDa)的SCM，與具有蛋白質-胜肽片段(＞ 3 kDa)的PCM，並以qPCR分析經過於SCM或PCM中培養24小時之腹膜巨噬細胞的Arg1 、Fizz1 、Mgl1 mRNA表現量；另外，將腹膜巨噬細胞培養於對照培養基、LLC-CM、LLC-SCM或LLC-PCM共三天。將LLC與A549細胞的條件培養基(LLC-CM、A549-CM)依分子大小(＜ 3 kDa與＞ 3 kDa)進行區分，並檢測其對於巨噬細胞的Arg1 表現量的影響。結果顯示，小分子的片段(＜ 3 kDa)不僅可正調控Arg1 、Fizz1 、Mgl1 的表現量，還可增加VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM所佔比例。然而，蛋白質-胜肽片段(＞ 3 kDa，PCM)並不具有相同的效果(圖1E、1F)(係透過流式細胞儀測量VCAM1+ CD11c+ CD11blow -巨噬細胞所佔比例，並以對照組培養基處理的細胞數進行標準化，所有數據皆表示三次獨立實驗的平均值±SEM，**為P ＜ 0.005；***為P ＜ 0.0005)。
接著，以液相層析質譜儀(LC-MS)，鑑別LLC-SCM與A549-SCM中的可溶性分子，由其主成分分析(principal component analysis, PCA)顯示，LLC-SCM與對照培養基相比，在其成分分布上有明顯的不同(圖2A)，代表這兩組之間的代謝物組成具有差異。為了鑑定由癌症細胞所分泌的代謝物，係使用正交偏最小平方判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)模型所生成的S-plot進行分析，根據S-plot的結果，可見11種LLC細胞所分泌的代謝物具有顯著性的倍數變化與較大的p(corr)[1]、CoeffCS值(大於0.001)(圖2B與表1)，透過檢索內部的代謝物數據庫和純化合物的驗證，三種LLC細胞所分泌的代謝物經確定為琥珀酸、乳酸、檸檬酸，而目前尚不清楚其他八種代謝物的化學特性。此外，透過質譜分析(滯留時間1.8分鐘，m/z 50-400)，可見腫瘤細胞-SCM與對照培養基之間有顯著差異，在LLC-SCM(圖2C)與A549-SCM(圖2D)可見一主要的m/z 117.0的峰值，但在對照培養基中並不見此峰值，且該m/z 117.0峰值的子離子圖譜也與純琥珀酸相同(圖2E)。 表1. 透過由OPLS-DA所生成之S-plot分析LLC-SCM中強度較對照培養基高的代謝物
ID 滯留時間 ( 分 ) 質量 p [1]P p (corr)[1]P CM 離子強度 LLC-CM 離子強度 倍數變化 代謝物名稱
1 1.41 128.0 0.20 0.54 1949.95 3338.91 1.70
2 1.80 117.0 0.35 1.00 357.20 2717.98 7.60 琥珀酸
3 1.26 89.0 0.15 0.37 589.59 1726.79 2.90 乳酸
4 2.66 129.0 0.23 0.89 10.86 1160.43 106.90
5 1.26 191.0 0.16 0.99 21.96 517.07 23.60
6 2.78 129.0 0.16 0.99 42.33 516.42 12.20
7 1.82 257.0 0.13 1.00 2.67 341.19 127.60
8 1.47 191.0 0.11 0.69 0.00 312.12 10000 檸檬酸
9 1.80 73.0 0.11 1.00 29.73 279.26 9.40
10 2.61 573.1 0.11 1.00 58.39 270.38 4.60
11 1.24 231.9 0.10 1.00 17.12 211.08 12.30
為進一步確認癌症細胞的條件培養基中是否含有琥珀酸，係使用琥珀酸比色分析法套組(Succinate Colorimetric Assay Kit)分析條件培養基。其結果顯示，在LLC-CM (0.57 mM)、A549-CM (0.43 mM)、PC3-CM (0.41 mM)、MCF-7-CM (0.28 mM)、HT-29-CM (0.25 mM)中皆能偵測到相當的琥珀酸濃度，而在巨噬細胞條件培養基與新鮮的對照培養基中，則僅偵測到少量的琥珀酸(皆為0.07 mM)。這些結果顯示，琥珀酸是癌症細胞的條件培養基中主要的代謝物，可促進巨噬細胞極化。另外，將C57BL/6J小鼠經皮下注射LLC細胞，於21天後在其身上誘發腫瘤形成，接著將其腫瘤切除並進行分析。其結果顯示，在皮下腫瘤中的琥珀酸濃度為0.65± 0.039 mM (n=11，數據顯示為平均值±SEM，***為P ＜ 0.0005)(圖3B)，表示癌症細胞可釋放琥珀酸至細胞外環境中，此可能為正調控TAM標記與造成TAM極化的原因。
癌細胞分泌的琥珀酸可誘導巨噬細胞極化
以琥珀酸處理小鼠腹膜巨噬細胞，並檢測其TAM標記的表現量，其結果顯示琥珀酸可提升小鼠腹膜巨噬細胞內的ARG1蛋白質表現量，且其呈現濃度依賴性(圖4A)。除此之外，進一步分析腹膜巨噬細胞內的TAM特異性基因的轉錄，結果顯示琥珀酸可提升TAM標記相關基因的表現量，包括Arg1 、Fizz1 、Mgl1 、Mgl2 ，且呈現濃度依賴性(圖4B)；另外，琥珀酸亦可正調控TAM表面標記，包括CD11c與VCAM1(VCAM1+ CD11c+ CD11blow ) (圖4C)，這表示琥珀酸可使巨噬細胞極化為VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM。接著，使用一種LLC的同源小鼠腫瘤模型，評估琥珀酸對於體內的TAM極化的作用。將LLC細胞經皮下注射至C57BL/J6小鼠，後續接受每週兩次的腹膜內注射琥珀酸(20、100 mg/kg)或空白對照(賦形劑)，共3週，且於第21天時採集其原發性皮下腫瘤，並透過流式細胞儀分析從不同組別採集的腫瘤(生理食鹽水組之n= 11；20 mg/kg琥珀酸組之n= 8；100 mg/kg琥珀酸組之n= 10)，評估其中TAM所佔比例(數據為三次實驗的平均值±SEM，其中*為P＜ 0.05、**為P＜ 0.005、***P＜ 0.0005)。結果顯示，從給予琥珀酸處理的小鼠採集的原發性皮下腫瘤，其中所含的VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM數量，明顯高於給予生理食鹽水的小鼠(圖4D)。總體而言，以上結果顯示琥珀酸可促進TAM的功能性極化。
實施例 2 、以血清中之琥珀酸作為診斷癌症的生物標記
人類肺癌中的琥珀酸受器表現量上升
為提供關於SUCNR1的臨床相關性，係使用qPCR檢測213個人類肝癌組織與78個無腫瘤之肝臟組織中的受器mRNA表現量(表2)，結果顯示肝癌組織中的平均受器mRNA表現量明顯高於無腫瘤的肝臟組織(圖5A)，表示腫瘤的SUCNR1表現量上升有助於琥珀酸的促進腫瘤的能力。 表2. 用於分析SUCNR1的患者人口統計
  無腫瘤 (n = 78) 肺癌組織 (n = 213)
 
年齡 ( 歲 )    
中位數 65 66
四分位距 60-71 60-74
性別    
男性 44 131
女性 34 81
未標明 0 1
血清琥珀酸為潛在的肺癌生物標記
C57BL/6J小鼠經注射LLC細胞，並分析其於接種LLC細胞前、後的血清中琥珀酸濃度。在LLC細胞注射前，可偵測到琥珀酸(平均值為0.17±0.037 mM，n= 7)，而在LLC細胞接種後16天則有所上升(平均值為0.36±0.059 mM，小鼠患有177.6 mm3 的腫瘤，其n= 7)(圖5B)。此結果表示，患有腫瘤之小鼠的血清中琥珀酸表現量有上升。另外，檢測21位健康受試者與97位非小細胞肺癌患者，以確認血清中琥珀酸濃度在臨床上的意義(表3)，肺癌患者的平均血清中琥珀酸濃度(0.53±0.038 mM)顯著性的高於健康受試者(圖5C)，表示於非小細胞癌患者的血清中琥珀酸濃度上升可能與腫瘤之進程有關，且有可能為癌症進程的標記。除此之外，透過接受者操作特徵曲線下面積(area under the receiver operating characteristic，AUROC)以確認此組患者的鑑別力(圖5D)，琥珀酸的曲線下面積(AUC)為0.70 (95% 信賴區間: 0.594-0.813，p = 0.0036)，從AUROC曲線中所得的具有最佳診斷效率的琥珀酸之截止值(cutoff level)為0.34 mM (其靈敏度為53.61%與特異性為85.71%)，因此，AUROC分析顯示血清中琥珀酸對非小細胞肺癌患者具有更高的預測值。綜合以上，這些結果顯示血清琥珀酸可作為非小細胞肺癌患者的預測生物標記。 表3. 用於分析血清琥珀酸的患者人口統計
  健康受試者 (n = 21) 肺癌患者 (n = 97)
 
年齡 ( 歲 )    
中位數 58 63
IQR 51-62 58-69
性別    
男性 7 41
女性 14 56
結果以患者數量表現 IQR，四分位距
實施例 3 、抗琥珀酸之單株抗體的開發和治療效果
開發抗琥珀酸之單株抗體作為抗癌的治療性抗體
有鑑於癌細胞會分泌琥珀酸至腫瘤微環境中，以促進TAM極化與癌細胞轉移，且肺癌患者血清中的琥珀酸濃度顯著性的提升，因此，為了進一步檢測透過使用抗琥珀酸抗體中和血清中的琥珀酸，以達到抑制腫瘤發生的可能性，遂製備以接合琥珀酸的載體胜肽作為抗原，來產生對抗琥珀酸的多株抗體，並檢測其對於LLC細胞遷移的影響。使用琥珀酸-牛血清白蛋白共軛物免疫紐西蘭兔，於第三次免疫時，將免疫血清預吸附於蛋白質在體上，並以蛋白質A管柱(GenScript)進行純化，再使用琥珀酸-KLH(賴氨酸-精氨酸-粗胺酸)共軛物進行抗體的間接ELISA試驗(GenScript)，以分析其抗體特異性(圖6A)。此外，為了確認抗琥珀酸抗體中和癌症條件培養基中琥珀酸的能力，亦測量分別經抗-琥珀酸抗體或對照抗體處理過的癌症條件培養基中的琥珀酸濃度。先將LLC-CM或A549-CM與不同濃度之抗琥珀酸抗體共同培養於37℃過夜，再使用琥珀酸比色分析法套組(Succinate Colorimetric Assay Kit)測量LLC-CM或A549CM中的琥珀酸濃度。結果顯示，抗琥珀酸抗體可顯著性的降低癌症條件培養基中的琥珀酸濃度，而對照抗體則無此效果(圖6B)。除此之外，將LLC細胞種於transwell盤的上室中，分別以對照IgG或抗琥珀酸抗體(Succ Ab)處理24小時，並使用PDGF-BB作為趨化因子(chemoattractant)。其結果顯示，抗琥珀酸抗體可抑制LLC細胞的遷移，而對照抗體則無此效果(圖6C)。
因此，進一步製備具潛力的治療性單株琥珀酸抗體。共計生產並挑選出20種小鼠單株抗體用於ELISA測試。於20株單株抗體中，挑選結合親和力最高的前五株進行後續的抗癌能力評估。其結果顯示，由五種細胞株所衍生的這五株單株抗體，可有效的抑制A549細胞的細胞遷移，尤其是由6G10細胞株所產的單株抗體，具有最佳的抗細胞遷移活性。為了確定腫瘤分泌琥珀酸為造成，癌症條件培養基會誘導巨噬細胞表現ARG1的原因，將進一步檢測6G10單株抗體對ARG1表現的影響。將經LLC-CM處理過之PMø與對照IgG或抗琥珀酸抗體共培養24小時，再將其細胞裂解液進行ARG1或β-actin抗體的免疫墨點法，其顯示F5單株抗體可抑制由LLC-CM引起的ARG1正調控，而對照IgG則無此效果(圖7A)；另外，先將PMø以抗琥珀酸抗體或對照IgG預處理1小時，再以琥珀酸(1 mM)刺激3天，並透過流式細胞儀測定其中VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM所佔比例，並以對照組培養基的細胞數進行標準化；將經琥珀酸(1 mM)處理的巨噬細胞，在有或沒有對照組IgG、抗琥珀酸抗體處理24小時後進行transwell檢測，其結果顯示F6單株抗體不僅可抑制因琥珀酸而上升的TAM表面標記，包含CD11c與VCAM1(VCAM1+ CD11c+ CD11blow )(圖7B)，還可抑制琥珀酸所誘導的巨噬細胞遷移，而對照IgG則無此效果(圖7C) 。因此，選擇6G10單株抗體作為第一候選抗體，評估其對LLC的同源小鼠腫瘤模型的治療效果。先將LLC細胞經皮下注射至C57BL/6J小鼠中，使小鼠帶有平均約50 mm3 的皮下腫瘤(LLC腫瘤接種後8天)，再每週給予小鼠兩次腹腔注射6G10F6單株抗體(1、5 mg/kg)或對照抗體IgG(5 mg/kg)，共5週，於LLC注射後第3週以外科手術切除皮下腫瘤，以評估TAM極化，並於腫瘤切除後的2週後採集小鼠的肺臟、肝臟、脾臟和腎上腺，以評估腫瘤轉移。結果顯示，6G10F6單株抗體不但可有效的抑制皮下腫瘤中的TAM族群(圖7D)，還可抑制肺部腫瘤的重複性(圖7E)，而IgG抗體則無此效果。其中值得注意的是，6G10F6單株抗體還可顯著的延長患有LLC腫瘤的小鼠的生存期(圖7F)。這些結果表示，6G10F6單株抗體可作為一具有治療性的抗癌單株抗體。
定序融合瘤 6G10F6 與 6G10G5 的單株抗體
為確定6G10細胞株所產生的抗琥珀酸抗體的序列，遂將兩種融合瘤6G10F6與6G10G5的抗體進行定序。參照TRIzolR試劑的操作說明，從融合瘤細胞中分離出總RNA，再根據PrimeScriptTM 1st Strand cDNA合成套組的操作說明，使用同種型-特異性的反義引子(isotype-specific anti-sense primer)或通用引子(universal primer)，將總RNA反轉錄為cDNA，並以GenScript的cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)的標準操作程序，擴增VH與VL的抗體片段，再分別將完成擴增的抗體片段轉殖到標準選殖載體，之後再以群落PCR，篩選具有正確大小的插入片段的細胞群落，每個片段都將定序至少5個帶有正確大小的片段的群落。經比對不同群落的序列後，這些群落所共有的序列如圖8和圖9所示，編碼 6G10F6抗體之重鏈的DNA序列具有如SEQ ID NO:1所記載之序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:2所記載之序列；編碼 6G10F6抗體之輕鏈的DNA序列具有如SEQ ID NO:3所記載之序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:4所記載之序列；另一方面，編碼 6G10G5抗體之重鏈的DNA序列具有如SEQ ID NO:5所記載之序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:6所記載之序列；編碼 6G10F6抗體之輕鏈的DNA序列具有如SEQ ID NO:7所記載之序列，且其胺基酸序列具有如SEQ ID NO:8所記載之序列。
小鼠 6G10F6 單株抗體的抗體人源化與回復突變設計
透過對6G10F6單株抗體的功能性評估後，可知其具有中和琥珀酸、抑制TAM極化和癌症轉移的功能，因此，將透過使用移植互補決定區(complementarity-determining region，CDR)與回復突變方法，在不犧牲其親代(嵌合)抗體的結合親和力的前提下，進一步將小鼠6G10F6單株抗體人源化。為了降低免疫原性(immunogenicity)，係將小鼠6G10F6單株抗體的恆定區置換為人類IgG4(重鏈)與λ鏈(輕鏈)的恆定區，以生成用於開發人源化抗體的嵌合性小鼠-人類6G10F6抗體(圖10)。為了進行人源化，係使用CDR移植的方式設計人源化抗體，並隨後以經移植抗體上的推測性回復突變點位替換，簡言之，將嵌合性6G10F6抗體的CDR移植至人類受體(免疫球蛋白µ重鏈VH與免疫球蛋白λ鏈可變區VL；圖10)以產生每一嵌合性抗體的人源化輕鏈與人源化重鏈，選擇對結合活性較重要的CDR中的典型殘基、骨架區(framework region)與VH-VL接合處(interface)的殘基，用於取代親代抗體上的相對處(counterpart)。
透過電腦輔助之同源性建模程式模擬嵌合性小鼠-人類6G10F6抗體的結構，以鑑定其回復突變的位置。簡言之，先於PDB抗體資料庫進行小鼠6G10F6抗體序列的BLAST搜尋，以確定Fv片段的最佳模板，尤其是用於建構結構域接口模板，而選定了一具有66%一致性的結構模板2BJM(SPE7的晶體結構：蔥酮(anthrone)錯合物)，小鼠單株抗體與2BJM模板的氨基酸序列比對如圖11所示，基於2BJM的同源性模型，選擇了內核中的所有骨架殘基，為了將這些殘基突變回小鼠單株抗體，相對處(counterpart)保留了內部疏水性相互作用，並降低由回復突變所導致的潛在免疫原性。重鏈中的人源化可變區被命名為VH1、VH2、VH3、VH4、VH5，其分別包含如SEQ ID NOs: 9、10、11、12、13所記載之胺基酸序列；而輕鏈中的人源化可變區被命名為VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8，其分別包含如SEQ ID NOs: 14、15、16、17、18、19、20、21所記載之胺基酸序列；另一方面，重鏈中的人源化可變區VH1、VH2、VH3、VH4、VH5分別包含如SEQ ID NOs: 22、23、24、25、26所記載之DNA序列；而輕鏈中的人源化可變區VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8分別包含如SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、32、33、34所記載之DNA序列。
測定嵌合型 6G10F6 抗體與人源化抗體的結合親和力
為了建構與生產嵌合型6G10F6抗體與人源化抗體，遂合成含有編碼人源化IgG重鏈和輕鏈的DNA序列，並將其插入pCDNA3.4載體中以建構出全長IgG的表達質體(如圖11所示)。於HEK293細胞中表現40種人源化抗體，並離心分離出細胞後，使用ELISA檢測上清液的表現量評估，並使用Biacore 8K進行表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)，確認其結合與測試出親和力的排序。純化嵌合型6G10F6抗體(圖12A)，並以表面電漿共振的生物感測器測定琥珀酸抗體對Ag的親和力，其中一抗分別為山羊抗人之IgG-HRP (GgeScript，Cat. No. A00166)與山羊抗人之λ-HRP (SouthernBiotech，Cat. No. 2070-05)。嵌合型抗體對於BSA-琥珀酸的親和力與動力總結列示於圖12B中，而其sensor-grams則顯示於圖12C中。將表達抗體與親代抗體進行親和力的排序，BSA-琥珀酸對於24種表達各式人源化抗體的HEK293細胞之上清液的親和力係呈現於圖13中，而無法與標定物結合的群落則以灰色標記顯示。
基於親和力排序結果，將按照GenScript的標準操作程序表達與純化排序前三的人源化抗體(VH3+VL3、VH4+VL2、VH4+VL3)。透過SDS-PAGE進行評估，人源化IgG純度約為85%(圖14A)，經純化的IgG產量列於圖14B中。進一步挑選出純度排序前三的純化抗體，進行在不同濃度下的親和力測試。透過Biacore 8K檢測軟體擬合每種抗體的結合數據至1:1相互作用模型，所有數據皆可良好的擬合至模型中(參見圖15A)。如圖15B所示，三種人源化抗體皆保留了與親代嵌合性抗體相當的抗源結合親和力。
經純化之人源化 IgG 的熱穩定性測定
另外，使用ELISA進行四種經純化之抗體(包括嵌合型抗體與人源化抗體VH3+VL3、VH4+VL2、VH4+VL3)，及9種表現各個人源化抗體的HEK293細胞之上清液的穩定性評估，ELISA結果顯示三種人源化抗體經不同溫度處理2個月後仍可與抗原穩固的結合(圖16)。
綜合以上，小鼠單株抗體(mAb)可成功的被人源化，已成功設計、合成出五種重鏈與八種人源化輕鏈，並將其插入pCDNA3.4表達載體進行表達。
實施例 4 、琥珀酸可藉由一特異的膜受器 SUCNR1 誘導癌細胞遷移並增強癌症轉移
SUCNR1 訊息傳遞路徑參與了琥珀酸所介導的 TAM 極化
琥珀酸為已知的SUCNR1配體，因此，進一步檢測琥珀酸是否可藉由SUCNR1促進TAM極化。首先，以對照組IgG與抗SUCNR1抗體預處理腹膜巨噬細胞1小時之後，再以琥珀酸(1 mM)刺激細胞3天，之後使用流式細胞儀定量VCAM1+ CD11c+ CD11blow ，而數據係以相對於對照培養基處理組的倍數呈現，經抗SUCNR1抗體處理的巨噬細胞可消除由琥珀酸所介導的VCAM1+ CD11c+ CD11blow 數量的正調控(圖17A)，此外，腹膜巨噬細胞分別經擾碼對照組siRNA (scrambled control siRNA)、小鼠SUCNR1 siRNA-278、559或758轉染48小時後，再分為經1 mM琥珀酸(Succ)刺激或無處理共16小時或3天，之後分別以qPCR測定Sucnr1 mRNA表現量和使用ARG1或β-actin進行西方墨點法測定SUCNR1蛋白質表現量(數據代表三次實驗的平均值 ± SEM，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.005；***P ＜ 0.005)，結果顯示使用特異性siRNA(si-278、si-559與si-758)而非對照siRNA抑制SUCNR1表現量(圖17B、17C)可抑制琥珀酸所誘導的Arg1 、Fizz1 、Mgl1 、Mgl2 mRNA表現量(圖17D)，且三個不同的SUCNR1 siRNA可消除由琥珀酸所介導的VCAM1+ CD11c+ CD11blow 數量的正調控，而擾碼對照組siRNA則無此效果(圖17E)。這些結果表示，琥珀酸會藉由SUCNR1訊息傳遞路徑而促進TAM極化。
琥珀酸 激活的 SUCNR1 可促進巨噬細胞遷移
為進一步檢測癌症條件培養基與琥珀酸是否會引發巨噬細胞遷移，係將腹膜巨噬細胞接種於transwell盤的上室中，並分別培養於對照培養基(DMEM)或A549細胞之條件培養基(A549-CM)共24小時；另外，將腹膜巨噬細胞接種於transwell盤的上室中，並分別在含有或不含對照IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，培養於對照培養基(DMEM)或A549細胞之條件培養基(A549-CM)共24小時。後續以PDGF-BB為趨化因子以進行細胞遷移測試，並計算遷移的細胞，其結果以基礎對照的倍數形式表示，如圖18A與18B所示，相較於對照培養基，A549-CM與A549-SCM可促進巨噬細胞的遷移，但抗SUCNR1抗體則可抑制該促進效果，而對照IgG則無此功效；除此之外，係以不同濃度的琥珀酸處理巨噬細胞共24小時，其結果顯示抗SUCNR1抗體可抑制琥珀酸所誘導之巨噬細胞遷移，而對照IgG則無此效果(圖18C)，其表示琥珀酸/SUCNR1訊息傳遞路徑對於巨噬細胞之遷移至關重要。
為了確定腫瘤分泌的琥珀酸對巨噬細胞而言，是否為一可溶性的趨化因子，遂於含有或不含對照IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，以琥珀酸(1mM)處理腹膜巨噬細胞共24小時後，再以transwell試驗分析細胞遷移情形，其係於transwell盤的下室添加PDGF與不同濃度的琥珀酸。 相較於對照組，琥珀酸顯著性的增強巨噬細胞的遷移(圖18D)，且琥珀酸所誘導的遷移程度效果類似於PDGF，此結果表示腫瘤細胞可分泌琥珀酸以促進巨噬細胞聚集與遷移，以及後續的TAM極化。
琥珀酸誘導癌細胞遷移與上皮 細胞間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition ， EMT) 並增強癌症轉移
由於琥珀酸可促進巨噬細胞遷移，因此將進一步檢測琥珀酸是否可調節癌細胞遷移，係將LLC細胞接種於常規膜或基質膠包覆的膜上，並以不同濃度的琥珀酸處理24小時後，進行transwell遷移檢測與侵襲能力檢測，係於光學顯微鏡下的3個視野中計算相對的遷移或侵襲能力；同樣的，亦將A549、HT-29、MCF-7、PC3細胞接種於transwell盤的上室，並以不同濃度的琥珀酸處理24小時。於遷移檢測與侵襲能力檢測中，皆以PDGF-BB為趨化因子，並計算遷移的細胞，其結果以基礎對照的倍數形式表示，結果顯示琥珀酸可促進LLC肺癌細胞(圖19A)、A549肺癌細胞、HT-29大腸癌細胞、MCF-7乳癌細胞與PC3前列腺癌細胞(圖19B、19C)的細胞遷移與侵襲能力，且呈現劑量依賴關係。
琥珀酸亦影響癌細胞的EMT，簡言之，係以空白對照或琥珀酸(0.5、1、2.5 mM)處理A549細胞共24小時，後續細胞會再經空白對照或琥珀酸(1 mM)處理一段特定時間，細胞經裂解後，使用E-黏附蛋白(E-cadherin)、N-黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)或β-actin的特異性抗體進行細胞裂解液的免疫墨點法；另一方面，係於含有或不含二甲雙胍 (2 mM)的情況下，使用琥珀酸處理A549細胞共24小時，以評估其抑制EMT效果，並使用transwell試驗測定其細胞遷移能力。結果顯示琥珀酸可抑制E-黏附蛋白，並增加N-黏附蛋白、波形蛋白表現量，且其效果呈現時間與劑量依賴關係(圖19D、19E)，重要的是，EMT抑制劑二甲雙胍可消除琥珀酸誘導的A549細胞遷移(圖19F)，這些結果表示癌細胞所分泌的琥珀酸可以自分泌或旁分泌的方式藉由EMT相關機制促進癌細胞的遷移與侵襲能力。
接著使用同源小鼠LLC腫瘤模型，檢測腫瘤分泌的琥珀酸於腫瘤轉移中的生理相關性。將LLC細胞經皮下注射至C57BL/6J小鼠，接著透過腹膜內注射的方式給予小鼠每週兩次的空白對照或琥珀酸(20、100 mg/kg)，並於3週後手術切除皮下原發性腫瘤，再繼續飼養小鼠兩週後進行犧牲，採集其肺臟、肝臟、脾臟與腎上腺，以評估癌症轉移。結果顯示，經琥珀酸處理之小鼠的肺臟中，癌症轉移結節數量高於經生理食鹽水處理之小鼠，並呈現劑量依賴性關係(圖20A)，而且於經琥珀酸處理之小鼠的肺臟和脾臟中，其癌症轉移結節的數量也同樣的偏高(圖20B)；另外，於經琥珀酸處理之小鼠的腎上腺中，其轉移的發生率也較高，但是並沒有達到統計學上的顯著性差異(p = 0.088)(圖20C)。
因琥珀酸而極化的巨噬細胞會增強癌細胞遷移
由於琥珀酸可藉由巨噬細胞表現型的改變而增強癌細胞的轉移，因此將檢測因琥珀酸而極化的巨噬細胞對於癌細胞遷移的影響。巨噬細胞經琥珀酸處理三天後可得到極化的巨噬細胞，將其與LLC癌細胞共培養於transwell培養盤中，並以transwell試驗來分析癌細胞的遷移。其結果顯示，相較於將LLC細胞獨自培養，極化的巨噬細胞可增強LLC細胞的遷移(圖21A)；另一方面，在共培養的培養盤中可見IL-6的濃度上升，但於獨自培養的培養基中則無此現象(圖21B)。值得注意的是，透過添加抗IL-6中和抗體消除共培養之培養基中的IL-6(圖21D)，可消除與極化巨噬細胞共培養之LLC細胞所具備已增強的遷移能力(圖21C)。這些結果顯示，由極化的巨噬細胞所介導之IL-6分泌在LLC細胞的遷移中至關重要。
將經SUCNR1 siRNA758瞬間轉染的巨噬細胞與LLC細胞共培養，並以琥珀酸處理3天後，相較於僅轉染對照siRNA的巨噬細胞，經SUCNR1 siRNA758轉染的巨噬細胞的細胞遷移能力顯著性下降(圖21E)，此結果表示琥珀酸所誘導的巨噬細胞極化有助於促進癌細胞遷移。
琥珀酸可藉由 SUCNR1 訊息傳遞路徑促進癌症轉移
琥珀酸可與SUCNR1結合以激活多個訊息傳遞路徑標的，特別是絲裂原活化之蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，以及增加細胞內鈣離子和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)。為了確定琥珀酸可活化癌細胞的SUCNR1，將分析A549細胞中會被琥珀酸激活的典型標的。以琥珀酸(1 mM)處理A549/shNC、A549/shSUCNR1細胞一特定時間，取得將細胞裂解後所得之細胞裂解液，以ERK1/2、磷酸化ERK1/2之特異性抗體進行免疫墨點法。顯示於琥珀酸處理後，在兩分鐘的時點可見經對照RNA轉染的A549細胞中的磷酸化ERK1/2迅速增加，但此現象在經SUCNR1 shRNA轉染的A549細胞中則被抑制了(圖22A)。進一步以琥珀酸(1 mM)處理LLC/shNC、LLC/shSUCNR1、A549/shNC、A549/shSUCNR1細胞2小時，並分別以鈣比色法套組(Calcium Colorimetric Assay Kit)與PGE2 ELISA套組，檢測其細胞內的鈣濃度與條件培養基中的PGE2含量。其結果顯示，A549或LLC細胞在經琥珀酸處理2小時後，其細胞內鈣離子濃度上升(圖22B)，然而，經SUCNR1 shRNA轉染的兩種細胞中，其細胞內鈣離子濃度皆未升高(圖22B)；另外，於經對照shRNA轉染的LLC細胞中，可見其釋放至培養基中的PGE2含量上升，然而經SUCNR1 shRNA轉染的LLC細胞則無此現象(圖22C)，這些結果與琥珀酸可激活SUCNR1訊息傳遞之標的的解釋一致。
進一步檢測琥珀酸藉由SUCNR1而誘導癌細胞遷移的能力。於含有或不含對照IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，以琥珀酸(1 mM)處理LLC、A549、PC3與HT-29細胞共24小時，後續以transwell試驗分析其細胞遷移情形。結果顯示，抗SUCNR1抗體可阻斷由琥珀酸所誘導的LLCA549、PC3與HT-29細胞遷移，而對照IgG則無此效果(圖23A)。除此之外，於含有或不含對照IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，以琥珀酸(1 mM)處理LLC與HT-29細胞共24小時，後續以基質膠侵襲試驗檢測其侵襲能力。結果顯示，琥珀酸所誘導之LLC與HT-29細胞的侵襲能力同樣可被SUCNR1抗體抑制，而IgG抗體則無此抑制效果(圖23B)。
接著將分析，於經SUCNR1 shRNA穩定轉染後其SUCNR1表現量降低的A549細胞 (#3與#8，圖24A) 中，由琥珀酸所誘導之細胞遷移與細胞侵襲能力。以琥珀酸(1 mM)處理經對照shRNA(A549/shNC)或SUCNR1 shRNA(A549/shSUCNR1)轉染的A549細胞共24小時，後續以transwell試驗與基質膠侵襲試驗檢測其細胞遷移與侵襲能力。其結果顯示，琥珀酸所誘導的A549細胞遷移與侵襲，可因SUCNR1的基因減弱而被抑制(圖24B)，此外，與對照組相比，經穩定轉染shSUCNR1而Sucnr1 表現量下降的的LLC細胞(LLC/shSUCNR1)，被琥珀酸所誘導的細胞遷移與現象也有所降低(圖24C及24D)。
為了探討SUCNR1於體內對琥珀酸所增強的轉移的影響，係將A549/shNC或A549/shSUCNR1細胞經皮下接種至裸鼠，接著給予小鼠每週\兩次的腹膜內注射琥珀酸(100 mg/kg)，共持續8週，並於第56天安樂死小鼠，並切除其肺臟組織以檢查轉移結節。其結果顯示，於接種A549/shSUCNR1細胞的小鼠中，其肺臟的轉移結節明顯低於接種A549/shNC的小鼠(圖24E)；於接種LLC/shSUCNR1的小鼠身上也有類似的情況，其肺臟的轉移結節也明顯下降(圖24F)。這些結果顯示，琥珀酸會透過SUCNR1而促進癌症轉移。
琥珀酸透過 PI3K/AKT 與 HIF-1α 訊息傳遞路徑而誘導癌症轉移
MAPK-、磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT-TOR與AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)所藉導的缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)正調控，在巨噬細胞的活化與癌症進程中扮演重要的角色。因此，進一步探討這些訊息傳遞因子是否也與琥珀酸的作用相關。以琥珀酸(1 mM)處理A549與LLC細胞一段特定時間後，將細胞裂解以取得細胞裂解液，並以HIF-1α、Akt、磷酸化Akt、AMPK、磷酸化AMPK、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK或β-actin的特異性抗體進行免疫墨點法；另外，也以qPCR檢測經琥珀酸(1 mM)處理一段特定時間後的LLC細胞中的Hif-1α mRNA表現量。結果顯示，於LLC與A549細胞中，琥珀酸可誘導p38 MAPK、AKT與AMPK的磷酸化，且其呈現時間相關性，並可增加HIF-1α的蛋白質(圖25A)與mRNA表現量(圖25B)。使用不同濃度的選擇性激酶抑制劑LY294002或SB202190處理LLC細胞共12小時，並測量其Hif-1 α mRNA表現量；另外一部分，先以LY294002或SB202190預處理LLC細胞共1小時，接著以琥珀酸(1 mM)刺激LLC細胞共12小時，再測量其Hif-1 α mRNA表現量。結果顯示，PI3K/AKT的抑制劑可抑制細胞本身的Hif-1 α 表現量，以及琥珀酸所誘導的Hif-1 α 表現量，而p38 MAPK的抑制劑則無此效果(圖25C與25D)。為了解SUCNR1於驅動細胞表現HIF-1α中所扮演的角色，遂進一步檢測於A549/shSUCNR1細胞中的HIF-1α表現量。以qPCR檢測於經琥珀酸(1 mM)或琥珀酸二甲酯(dimethyl-ester succinate，DMS，20 mM)處理12小時後的A549/shNC與A549/shSUCNR1細胞中HIF-1α之表現量。結果顯示，在經琥珀酸處理的A549/shNC細胞中，出現HIF-1α 的正調控(圖25E)，而經膜穿透性DMS處理的A549/shNC細胞，則出現HIF-1α的表現量上升。然而，於A549/shSUCNR1細胞中，由琥珀酸所誘導的HIF-1α表現被抑制，但並無抑制由DMS所誘導的HIF-1α表現(圖25F)。表示，琥珀酸是以SUCNR1相關性的方式誘導HIF-1α表現，而DMS則不需要SUCNR1介入即可誘導HIF-1α表現。
由於已知HIF-1α路徑可藉由誘導EMT而介導癌症轉移，因此將進一步檢測琥珀酸是否可透過HIF-1α依賴性的訊息傳遞路徑，而促進肺癌細胞遷移與EMT。以不同濃度之HIF-1α特異性抑制劑處理LLC與A549肺癌細胞，再以transwell試驗檢測其細胞遷移能力。結果顯示，藥理上的HIF-1α抑制劑2-MeOE2與Bay 87-2243可抑制LLC與A549細胞因琥珀酸而誘導的細胞遷移，且其呈現劑量依賴關係(圖26A)。脯胺醯基羥化酶(Prolyl hydroxylase，PHD)可藉由將HIF-1α中的兩個保守性脯胺酸殘基羥化並加速其降解，而控制HIF-1α蛋白質的穩定性。為了提供更多證據以支持HIF-1α在琥珀酸所誘導的癌細胞遷移中扮演關鍵角色，遂使用PHD活化劑α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)或抑制劑二甲基草酰甘胺酸(dimethyloxalyl glycine，DMOG)處理細胞，以分析其細胞遷移情形。結果顯示，α-KG可抑制琥珀酸所誘導的癌細胞遷移，而DMOG則會促進琥珀酸所誘導的癌細胞遷移(圖26B、26C)。此外，亦使用qPCR測量A549/shNC或A549/HIF-1α細胞中的HIF-1α 表現量，並以transwell試驗檢測經琥珀酸處理或未經琥珀酸處理之A549/shNC或A549/HIF-1α細胞的細胞遷移能力。結果顯示，HIF-1α的基因削弱(A549/HIF-1α)可抑制A549細胞之由琥珀酸所誘導的細胞遷移能力，但對照組中(A549/shNC)並無此現象(圖26D)。另外，以LY294002或Bay 87-2243預處理A549細胞一小時，再以空白對照或琥珀酸(1 mM)處理24小時，將細胞裂解後，以E-黏附蛋白、N-黏附蛋白、波形蛋白或β-actin的特異性抗體進行其細胞裂解液的免疫墨點檢測，其結果顯示，透過LY294002阻斷PI3K，或透過Bay 87-2243阻斷HIF-1α訊息傳遞路徑，皆可抑制琥珀酸所導致的波形蛋白增強，及E-黏附蛋白減少(圖26E、26F)。
使用異種移植(xenograft)A549/shHIF-1α腫瘤模型確認，於體內由琥珀酸誘導的轉移中，HIF-1α所扮演的角色。將A549/shNC或A549/HIF-1α細胞經由皮下接種至裸鼠，接著給予小鼠每週兩次腹膜內注射琥珀酸(100 mg/kg)，共8週。結果顯示，接種A549/HIF-1α之小鼠的肺臟中，其轉移結節數量明顯低於接種A549/shNC的小鼠(圖27A)，另一方面，進一步利用E-黏附蛋白、波形蛋白或β-actin的特異性抗體，進行從A549/shNC或A549/HIF-1α的原發性皮下腫瘤中萃取的總蛋白質的免疫墨點試驗，其結果顯示，相較於A549/shNC原發性皮下腫瘤，在A549/HIF-1α原發性皮下腫瘤中，因琥珀酸而導致E-黏附蛋白減少及波形蛋白增強的現象被逆轉(圖27B)。綜上所述，這些結果顯示，琥珀酸所活化的SUCNR1可藉由PI3K/AKT訊息傳遞路徑，誘導由HIF-1α所介導的EMT，進而促進癌症轉移。
無
圖1A-1F係顯示，在癌細胞條件培養基中存有一種可溶性因子，其可誘導巨噬細胞表現TAM標記。圖1A顯示培養於控制組培養基、LCC-CM (conditioned medium，條件培養基)或A459-CM中之腹膜巨噬細胞的ARG1蛋白表現量；圖1B顯示培養於控制組培養基、LCC-CM或A459-CM中之腹膜巨噬細胞的Arg1 mRNA表現量；圖1C顯示經控制組培養基或PC3-CM處理之巨噬細胞的ARG1表現量水平；圖1D顯示培養於控制組培養基、從MCF-7收集的條件培養基(MCF7-CM)或從HT29收集的條件培養基(HT29-CM)中24小時之巨噬細胞的Arg1 mRNA表現量；圖1E顯示培養於SCM或PCM中24小時的腹膜巨噬細胞的Arg1 、Fizz1 、Mgl1 mRNA表現量；圖1F顯示培養於控制組培養基、LLC-CM、LLC-SCM或LLC-PCM中三天的巨噬細胞中，VCAM1+ CD11c+ CD11blow –巨噬細胞所佔的比例。
圖2A-2E係顯示從肺癌條件培養基中的小分子片段中所檢測到的琥珀酸。圖2A顯示由控制組培養基與LLC-SCM的液相層析質譜(LC-MS)的結果所得的主成分分析圖(PCA)；圖2B顯示從正交偏最小平方判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)結果所生成的S-plot；圖2C、2D顯示LLC-CM、A549-SCM、控制組培養基DMEM或純琥珀酸的代表性的質譜數據(停留時間 1.8分鐘，m/z 50-400)；圖2E顯示藉由液相層析串聯質譜儀(LC-MSMS，MS2)分析純琥珀酸與LLC-SCM MS1的m/z 117.0之子圖譜。
圖3A-3B係顯示在不同的癌細胞條件培養基與原發性皮下腫瘤中的琥珀酸濃度。圖3A顯示控制組培養基、LLC-CM、A549-CM、PC3-CM、MCF-7-CM、HT-29-CM或腹膜巨噬細胞-CM中的琥珀酸濃度；圖3B顯示從經皮下注射LLC細胞的C57BL/6J小鼠身上切除下來的原發性皮下腫瘤中的琥珀酸濃度。
圖4A-4D係顯示，琥珀酸可促使巨噬細胞極化為TAM。圖4A顯示經不同濃度的琥珀酸處理過後的巨噬細胞，其ARG1的表現量；圖4B顯示培養於琥珀酸(1 mM)中24小時之巨噬細胞內的Arg1 、Fizz1 、Mgl1 與Mgl2 mRNA表現量；圖4C顯示經琥珀酸刺激3天後(1 mM)，巨噬細胞中VCAM1+ CD11c+ CD11blow –TAM所佔的比例；圖4D顯示從經注射LLC與腹腔注射琥珀酸(20與100 mg/kg)的小鼠身上所得的原發性皮下腫瘤中的TAM之百分比。
圖5A-5D係顯示血清中之琥珀酸與腫瘤SUCNR1在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中的臨床相關性。圖5A顯示SUCNR1 mRNA於無腫瘤的肺組織和肺癌組織中的表現量；圖5B顯示小鼠於接種LLC之前與16天後的血清中琥珀酸濃度；圖5C顯示健康受試者與NSCLC患者的血清琥珀酸濃度；圖5D顯示透過AUROC曲線分析NSCLC患者血清中琥珀酸的鑑別力。
圖6A-6C係顯示抗琥珀酸抗體於中和琥珀酸的能力與其特異性。圖6A顯示抗琥珀酸抗體的特異性；圖6B顯示培養於不同濃度的抗琥珀酸抗體的LLC-CM或A549-CM的琥珀酸表現量；圖6C顯示經控制組IgG或抗琥珀酸抗體(Succ Ab)處理24小時的LLC細胞之細胞遷移檢測結果。
圖7A-7F係顯示，單株抗體可有效的抑制TAM極化與癌症轉移，並改善患有腫瘤之小鼠的存活率。圖7A顯示經LLC-CM處理的PMø與對照組IgG或抗琥珀酸抗體培養24小時後的ARG1表現量；圖7B顯示經抗琥珀酸抗體或對照組IgG預處理過的PMø，於琥珀酸(1 mM)處理3天後的PMø中VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM所佔比例；圖7C顯示經琥珀酸(1 mM)處理過的巨噬細胞，在有或沒有對照組IgG、抗琥珀酸抗體處理24小時後的遷移檢測結果；圖7D-7F顯示患有LLC腫瘤的C57BL/6J小鼠經6G10F6單株抗體(1、5 mg/kg)或對照組IgG抗體(5 mg/kg)後，其TAM極化程度、結節數量與存活時間。
圖8係顯示抗體6G10F6的DNA與胺基酸序列。
圖9係顯示抗體6G10G5的DNA與胺基酸序列。
圖10係顯示人源化單株抗體6G10F6的選殖策略。
圖11係顯示小鼠單株抗體Fv片段的同源性模擬。
圖12A-12C係展示6G10F6嵌合式抗體的結合確認。圖12A顯示6G10F6嵌合式抗體的SDS膠體電泳(SDS-PAGE)分析結果，其中lane M1為蛋白質標記(TaKaRa, Cat. No. 3452)、lane 1為還原性條件、lane 2為非還原性條件；與6G10F6嵌合式抗體的西方墨點法分析結果，其中lane 2為蛋白質標記(GenScript, Cat. No. M00521)、lane P為作為陽性對照組的人類IgG1 (Kappa, Sigma, Cat. No. I5154)、lane 1為還原性條件、lane 2為非還原性條件；圖12B-12C顯示該嵌合式抗體的親和力檢測結果。
圖13係顯示使用Biacore進行人源化抗體親和力的排序。
圖14A-14B係顯示所選定回復突變抗體的製備。圖14A顯示在非還原條件和還原條件下選擇的抗體的結果；圖14B顯示純化的IgG的純度和產率。
圖15A-15B係顯示嵌合式抗體與三種人源化抗體的親和力檢測結果。圖15A顯示使用Biacore的1:1相互作用模型的結果；圖15B顯示其對親代嵌合式抗體的抗原結合親和力。
圖16A-16B係顯示所選定可針對抗原的抗體之熱穩定評估結果，所有抗體皆在-80℃、4℃、25℃、40℃下處理一至兩個月。圖16A顯示4種純化抗體的熱穩定結果；圖16B顯示9種未處理IgG樣品的熱穩定結果。
圖17A-17E係指出，琥珀酸所誘導的巨噬細胞極化需要SUCNR1的參與。圖17A顯示經琥珀酸處理的巨噬細胞與對照組IgG或抗SUCNR1抗體培養1小時後，其中VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM所佔比的倍數變化；圖17B與17C顯示經擾碼對照組siRNA、小鼠SUCNR1 siRNA-278、559或758轉染48小時的巨噬細胞中的Sucnr1 mRNA表現量與SUCNR1蛋白質表現量；圖17D顯示經擾碼對照組siRNA、小鼠SUCNR1 siRNA-278、559或758轉染16小時的巨噬細胞中的Arg1 、Fizz1 、Mgl1 、Mgl2 mRNA表現量；圖17E顯示經琥珀酸處理的巨噬細胞經不同siRNA處理過後的VCAM1+ CD11c+ CD11blow -TAM所佔比例。
圖18A-18E係顯示，腫瘤所釋放的琥珀酸會活化SUCNR1，以利於腹膜巨噬細胞遷移。圖18A顯示培養於對照組培養基(DMEM)或A549的條件培養基(A549-CM)中之巨噬細胞的細胞遷移檢測結果；圖18B顯示培養於對照組培養基(DMEM)或A549-CM中之巨噬細胞，在含有或不含有對照組IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，其細胞遷移檢測結果；圖18C顯示經不同濃度的琥珀酸處理過之巨噬細胞的細胞遷移檢測結果；圖18D顯示經琥珀酸(1 mM)處理過的巨噬細胞，在含有或不含有對照組IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，其細胞遷移檢測結果；圖18E顯示經不同濃度的琥珀酸與PDGF處理的巨噬細胞在底室(bottom chamber)的細胞遷移檢測結果。
圖19A-19F係顯示，琥珀酸可促進腫瘤細胞的遷移與侵襲能力。圖19A顯示經不同濃度的琥珀酸處理過之LLC細胞的細胞遷移和侵襲能力檢測結果；圖19B、19C顯示經不同濃度的琥珀酸處理過之A549、HT-29、MCF-7、PC3細胞的細胞遷移和侵襲能力檢測結果；圖19D顯示經琥珀酸(0.5、1、2.5 mM)或空白對照處理24小時之A549細胞中，E-黏附蛋白(E-cadherin)、N-黏附蛋白(N-cadherin)與波形蛋白(vimentin)的表現量；圖19E顯示顯示經琥珀酸(1 mM)或空白對照處理一段指定時間之A549細胞中，E-黏附蛋白(E-cadherin)、N-黏附蛋白(N-cadherin)與波形蛋白(vimentin)的表現量；圖19F顯示在給予或沒有給予metformin (2 mM) 的情況下，經琥珀酸處理之A549細胞的細胞遷移檢測結果。
圖20A-20C係顯示琥珀酸可促進腫瘤轉移。圖20A顯示從患有腫瘤之C57BL/6J小鼠上切除的肺臟，並且計算其中的轉移結節；圖20B、20C顯示從患有腫瘤之C57BL/6J小鼠上切除的肝臟、脾臟、腎上腺中的轉移結節。
圖21A-21E係顯示，由琥珀酸所誘導的極化巨噬細胞會增強癌細胞的遷移。圖21A、21B顯示單株培養的LLC以及與琥珀酸誘導的極化巨噬細胞共培養之LLC的細胞遷移檢測結果與其IL-6表現量；圖21C、21D顯示單株培養的LLC以及有添加抗IL-6中和抗體或對照組IgG (2.5 µg/ml)並與琥珀酸誘導的極化巨噬細胞共培養的LLC的細胞遷移檢測結果與其IL-6表現量；圖21E顯示與經干擾對照組siRNA(sc)或SUCNR1 siRNA-758轉染的巨噬細胞共培養之LLC細胞的IL-6表現量。
圖22A-22C顯示琥珀酸對於細胞內鈣的濃度變化、ERK1/2活化與前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)製造的作用效果。圖22A顯示經琥珀酸(1 mM)處理一段指定時間後的A549/shNC與A549/shSUCNR1細胞中的ERK1/2與磷酸化ERK1/2的表現量；圖22B、22C顯示經琥珀酸(1 mM)處理2小時的LLC/shNC、LLC/shSUCNR1、A549/shNC與A549/shSUCNR1細胞中的細胞內鈣含量與其條件性培養基中PGE2含量。
圖23A-23B係顯示，琥珀酸可透過SUCNR1訊息傳遞路徑而促進腫瘤細胞的遷移與侵襲能力。圖23A顯示在含有或不含對照組IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，經琥珀酸(1 mM)處理之LLC、A549、PC3、HT-29細胞的細胞遷移檢測結果；圖23B顯示在含有或不含對照組IgG或抗SUCNR1抗體的情況下，經琥珀酸(1 mM)處理之LLC、HT-29細胞的侵襲能力檢測結果。
圖24A-24F係顯示，腫瘤分泌的琥珀酸可透過SUCNR1訊息傳遞路徑而促進腫瘤轉移。圖24A顯示穩定表達shSUCNR1或shNC的A549細胞株(A549/shSUCNR1、A549/shNC)中的SUCNR1表現量；圖24B顯示已穩定轉染對照shRNA或SUCNR1 shRNA之A549細胞(A549/shNC、A549/shSUCNR1)，經琥珀酸(1 mM)刺激24小時後的細胞遷移與侵襲能力檢測結果；圖24C顯示穩定表達shSUCNR1之LLC細胞株(LLC/shSUCNR1)的Sucnr1 mRNA表現量；圖24D顯示LLC細胞與LLC/shSUCNR1細胞經琥珀酸(1 mM)刺激24小時後，其細胞遷移檢測結果；圖24E顯示經注射A549/shNC細胞或A549/shSUCNR1細胞的小鼠，接受每週兩次的腹膜內注射琥珀酸(100 mg/kg)共8週後，進行肺臟轉移結節的檢測結果；圖24F顯示經注射LLC細胞或LLC/shSUCNR1細胞的小鼠，接受每週兩次腹膜內注射琥珀酸(100 mg/kg)共8週，再進行肺臟轉移結節的檢測結果。
圖25A-25E係顯示琥珀酸對於A549與LLC細胞內HIF-1α與激酶磷酸化的影響。圖25A顯示A549細胞與LLC細胞經琥珀酸(1 mM)處理一段特定時間後，其HIF-1α、Akt、磷酸化Akt、AMPK、磷酸化AMPK、p38 MAPK與磷酸化p38 MAPK的表現量；圖25B顯示LLC細胞經琥珀酸(1 mM)處理一段特定時間後，其HIF-1α mRNA表現量；圖25C顯示LLC細胞經不同濃度的LY294002或SB202190處理12小時後，其HIF-1α mRNA表現量；圖25D顯示經LY294002或SB202190預處理過的LLC細胞，再經琥珀酸(1 mM)處理12小時後，其HIF-1α mRNA表現量；圖25E顯示A549/shNC、A549/shSUCNR1經琥珀酸(1 mM)或二甲酯琥珀酸(dimethyl-ester succinate，DMS，20 mM)處理12小時後，其HIF-1α mRNA表現量。
圖26A-26F係顯示，PI3K所參與的HIF-1α正調控對於琥珀酸誘導的癌症轉移與EMT至關重要。圖26A顯示在含有或不含各式濃度的HIF-1α抑制劑、2-MeOE2、Bay 87-2243的情況下，LLC細胞與A549細胞經琥珀酸處理24小時後的細胞遷移檢測結果；圖26B、26C顯示在含有或不含a-KG (1 mM)或DMOG (200 µM)的情況下，A549細胞經琥珀酸(1 mM)處理24小時後的細胞遷移檢測結果；圖26D顯示A549/shNC或A549/HIF-1α細胞中的HIF-1α mRNA表現量，以及經琥珀酸(1 mM)處理或未經琥珀酸處理的A549/shNC或A549/HIF-1α細胞的細胞遷移檢測結果；圖26E、26F顯示經LY294002或Bay 87-2243預處理過的A549細胞再以空白對照或琥珀酸(1 mM)處理24小時後，其E黏附蛋白與波形蛋白的表現量。
圖27A-27B係顯示HIF-1α在體內由琥珀酸所誘導的腫瘤轉移中所扮演的角色。圖27A顯示經注射A549/shNC或A549/HIF-1α細胞，接受每週兩次腹膜內注射琥珀酸(100 mg/kg)共8週，再進行肺臟轉移結節的檢測；圖27B顯示從A549/shNC或A549/HIF-1α原發性皮下腫瘤所純化的總蛋白中，其E黏附蛋白與波形蛋白的表現量。
無
<110> 國家衛生研究院
<120> 琥珀酸作為用於癌症診斷和治療之生物標記的用途
<150> US 62/916,376
<151> 2019-10-17
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<220>
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Figure 109135988-A0305-02-0034-164
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體之重鏈
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Figure 109135988-A0305-02-0034-165
Figure 109135988-A0305-02-0035-167
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 109135988-A0305-02-0035-168
Figure 109135988-A0305-02-0036-169
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體之輕鏈
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Figure 109135988-A0305-02-0036-170
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10G5單株抗體之重鏈
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Figure 109135988-A0305-02-0037-173
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<220>
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<220>
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Figure 109135988-A0305-02-0041-2
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<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH2
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Figure 109135988-A0305-02-0043-4
Figure 109135988-A0305-02-0044-5
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Figure 109135988-A0305-02-0046-6
Figure 109135988-A0305-02-0047-7
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<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH4
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<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH5
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Figure 109135988-A0305-02-0050-182
Figure 109135988-A0305-02-0051-11
Figure 109135988-A0305-02-0052-12
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<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL1
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Figure 109135988-A0305-02-0052-183
Figure 109135988-A0305-02-0053-13
Figure 109135988-A0305-02-0054-184
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<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL2
<400> 15
Figure 109135988-A0305-02-0054-185
Figure 109135988-A0305-02-0055-186
<210> 16
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL3
<400> 16
Figure 109135988-A0305-02-0055-187
Figure 109135988-A0305-02-0056-188
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL4
<400> 17
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL6
<400> 19
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Figure 109135988-A0305-02-0061-194
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL7
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 22
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<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH2
<400> 23
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<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH3
<400> 24
Figure 109135988-A0305-02-0066-202
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<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH4
<400> 25
Figure 109135988-A0305-02-0067-205
Figure 109135988-A0305-02-0068-207
<210> 26
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VH5
<400> 26
Figure 109135988-A0305-02-0068-208
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<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL1
<400> 27
Figure 109135988-A0305-02-0069-210
Figure 109135988-A0305-02-0070-211
<210> 28
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL2
<400> 28
Figure 109135988-A0305-02-0070-212
Figure 109135988-A0305-02-0071-213
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL3
<400> 29
Figure 109135988-A0305-02-0071-215
<210> 30
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL4
<400> 30
Figure 109135988-A0305-02-0071-216
Figure 109135988-A0305-02-0072-217
<210> 31
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL5
<400> 31
Figure 109135988-A0305-02-0072-220
Figure 109135988-A0305-02-0073-221
<210> 32
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL6
<400> 32
Figure 109135988-A0305-02-0073-222
<210> 33
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6單株抗體的人源化VL7
<400> 33
Figure 109135988-A0305-02-0073-223
Figure 109135988-A0305-02-0074-224
<210> 34
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗體之VL8
<400> 34
Figure 109135988-A0305-02-0074-225
Figure 109135988-A0305-02-0075-226
<210> 35
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6選殖策略之重鏈
<400> 35
Figure 109135988-A0305-02-0075-227
Figure 109135988-A0305-02-0076-16
Figure 109135988-A0305-02-0077-228
<210> 36
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6選殖策略之重鏈
<400> 36
Figure 109135988-A0305-02-0077-229
Figure 109135988-A0305-02-0078-230
<210> 37
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6選殖策略之輕鏈
<400> 37
Figure 109135988-A0305-02-0079-231
Figure 109135988-A0305-02-0080-232
<210> 38
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 6G10F6選殖策略之輕鏈
<400> 38
Figure 109135988-A0305-02-0080-233
Figure 109135988-A0305-02-0081-18
<210> 39
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2BJM模板
<400> 39
Figure 109135988-A0305-02-0081-234
<210> 40
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠單株抗體
<400> 40
Figure 109135988-A0305-02-0081-235
Figure 109135988-A0305-02-0082-236
<210> 41
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2BJM模板
<400> 41
Figure 109135988-A0305-02-0082-237
<210> 42
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠單株抗體
<400> 42
Figure 109135988-A0305-02-0082-238
Figure 109135988-A0305-02-0083-239
<210> 43
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2BJM模板
<400> 43
Figure 109135988-A0305-02-0083-240
<210> 44
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠單株抗體
<400> 44
Figure 109135988-A0305-02-0083-241
Figure 109135988-A0305-02-0084-242
<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2BJM模板
<400> 45
Figure 109135988-A0305-02-0084-243
<210> 46
<211> 58
<212> PRT
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<220>
<223> 小鼠單株抗體
<400> 46
Figure 109135988-A0305-02-0084-244
Figure 109135988-A0305-02-0085-19

Claims (5)

  1. 一種抗琥珀酸單株抗體用於製造抑制癌症轉移及抑制巨噬細胞轉化為腫瘤相關之巨噬細胞的醫藥品之用途，其中該單株抗體包含一具有如SEQ ID NO：2所記載之胺基酸序列的重鏈；及一具有如SEQ ID NO：4所記載之胺基酸序列的輕鏈；其中，該單株抗體係中和血清中之琥珀酸。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該抗體係抑制琥珀酸受體(SUCNR1)訊息傳遞路徑。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該抗體係抑制精氨酸酶1(ARG1)的表現。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該抗體為一種人源化抗琥珀酸單株抗體。
  5. 如請求項1所述之用途，其中該癌症為非小細胞肺癌、前列腺癌、乳癌或大腸癌。
TW109135988A 2019-10-17 2020-10-16 琥珀酸作為用於癌症診斷和治療之生物標記的用途 TWI756870B (zh)

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