CN113203858A

CN113203858A - 一种肿瘤检测试剂盒

Info

Publication number: CN113203858A
Application number: CN202110487545.XA
Authority: CN
Inventors: 马红妙; 雷洁
Original assignee: Beijing Baotu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Weifang Sanwei bioengineering Group Co., Ltd
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2041-05-06
Also published as: CN113203858B

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种肿瘤检测试剂盒。为弥补现有肿瘤早期诊断试剂的不足，本发明基于新型肿瘤标志物HMGA2，通过杂交瘤技术筛选并获得了新型抗人HMGA2的单克隆抗体，该抗体可与目标抗原高效结合，并能够用于检测固体肿瘤和液体肿瘤，进行定量、定性和定位分析，灵敏度高，准确性好，为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的有力工具。

Description

一种肿瘤检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种肿瘤检测试剂盒。

背景技术

肿瘤(tumour)，又称癌症(cancer)，是指机体在各种致癌因子作用下，局部组织异常增生而导致的疾病，可癌变组织种类非常广泛，包括脑、肝、肺、骨、乳腺、前列腺、皮肤、血液等等，由于基因遗传、环境污染、不健康生活习惯、心理压力过大等多种致癌因素影响，在世界范围内肿瘤的发病率呈现逐年攀升的趋势，据报道全球每年因恶性肿瘤死亡人数已超过9000万人，肿瘤成为仅次于心脑血管疾病的第二大死因。据统计，我国每年新发肿瘤患者近400万，在各类肿瘤中，肺癌发病率居恶性肿瘤发病率首位，其下依次为胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、子宫颈癌、脑癌、胰腺癌等，从发病年龄来看，40岁以下的成年人居多，但是近年来呈现了一定的年轻化趋势，年轻人的发病率也呈现了快速增长态势。

在肿瘤的治疗方面，随着人民生活水平的提高和我国医疗水平的改善，我国肿瘤患者的生存率逐年上升，平均5年生存率约为40％，但是某些肿瘤的生存率现对于欧美发达国家仍有较大差距，造成这种状况的主要原因之一在于我国肿瘤诊断和治疗技术发展滞后，尤其是肿瘤的早期诊断工作需要得到进一步的重视和强化。所谓肿瘤的早期诊断，是指在恶性肿瘤发生发展的初期采用相关诊断技术予以确认，并给予患者积极治疗，据统计恶性肿瘤如果采取早期诊断和治疗后，其治愈率可提高至80％以上，因此早期诊断和早期治疗被认为是最好的肿瘤防治手段。

肿瘤早期诊断技术的实施离不开肿瘤标志物的选择，肿瘤标志物是指肿瘤细胞发生、增值、转移或复发过程中因肿瘤细胞的相关基因表达或集体对肿瘤发生反应而异常变化的一类物质。医学研究人员在19世纪中期就观测到肿瘤患者体内某些蛋白表达异常，但当时并未引起足够重视，直到20世纪60年代才引起了人们的关注，1978年赫贝曼正式提出了肿瘤标志物的概念，肿瘤标志物才开始在临床上广泛应用，并得到迅速发展，截止目前已经出现了mRNA、DNA、细胞代谢物、肿瘤干细胞、蛋白等多种类型的肿瘤标志物，其中蛋白类标志物因其检测方便、成本低廉、准确性高而成为目前临床上应用的最为广泛的一类肿瘤标志物，常见的蛋白类标志物包括癌胚抗原、甲胎蛋白、致癌病毒抗原、免疫球蛋白等等。受限于检测技术的滞后，上述肿瘤标志物在临床应用过程中仍面临假阳性比例高、难以准确反映肿瘤进程等缺陷，且所用检测试剂和检测手段灵敏度不高，特异性差，制备成本高，进一步限制了其应用。因此，研究和筛选新型肿瘤标志物，开发相应的新型检测手段成为肿瘤诊断和治疗领域中的研究热点和难点。

高迁移率族蛋白2(high mobility group A2，HMGA2)是高迁移率族蛋白家族成员之一，该蛋白家族包括三个细分家族，即HMGA(含有AT钩)，HMGB(含有HMG盒)和HMGN(含有核小体结合域)，HMGA家族由HMGA1a、HMGA1b、HMGA1c和HMGA2四种蛋白组成，HMGA1基因编码产生HMGA1a、HMGA1b和HMGA1c三种蛋白，而HMGA2蛋白只由HMGA2编码产生，因此从检测难度上考虑HMGA2相比于HMGA1更适合作为生物标志物。HMGA2基因位于人类染色体12q13-15位点上，全长约140bp，包含5个外显子(I-V)，I/II/III外显子编码3个可以与DNA结合的区域(AT钩)，HMGA2通过AT钩改变染色质的结构，使之发生弯曲、拉伸、卷曲、成环或解链，从而调节靶基因的转录。研究表明HMGA2基因在胚胎发育过程中广泛表达，在成年组织中不表达或低表达，然而目前已经发现HMGA2基因在多种肿瘤组织中呈现高水平表达，如有研究人员发现，HMGA2在结直肠癌中的表达水平，且结直肠癌中HMGA2高表达的患者对放疗更敏感；免疫组织化学检测中发现，肝癌组织中HMGA2蛋白表达水平明显增加；肺腺癌及非小细胞肺癌组织和细胞中也观测到了HMGA2表达上调，且其表达程度与癌细胞的转移有关，上述研究成果表明HMGA2有望成为一种新型广谱肿瘤检测标志物。然而现有技术中关于HMGA2的研究主要集中于实验室阶段，目前国内外也只有WO2012006394A2、CN102375064A等少量专利文献报道了靶向HMGA2蛋白的抗体，还没有相关检测试剂或产品上市应用于临床诊断。

本发明针对现有肿瘤诊断试剂和方法的不足，筛选并获得了靶向HMGA2单克隆抗体，并将其用于固体肿瘤和液体肿瘤的定性和定量分析，为肿瘤的诊断提供了新型检测手段。

发明内容

为了能够有效进行肿瘤诊断和检测，本发明提供了一种靶向HMGA2的单克隆抗体，该抗体具有全新的结构域，所述抗体含有SEQ IDNO.1所示的重链可变区CDRH1；

SEQ IDNO.2所示的重链可变区CDRH2

SEQ IDNO.3所示的重链可变区CDRH3；

SEQ IDNO.4所示的轻链可变区CDRL1；

SEQ IDNO.5所示的轻链可变区CDRL5；

SEQ IDNO.6所示的轻链可变区CDRL6。

进一步的，所述抗体包含有如SEQ IDNO.7所示的重链可变区氨基酸序列。

进一步的，所述抗体包含有如SEQ IDNO.8所示的轻链可变区氨基酸序列。

正常情况下，HMGA2基因主要在胚胎发育过程中广泛表达，被认为是促进机体早期发育的关键基因之一，HMGA2可以促进脂肪形成、干细胞自我更新、骨骼肌发育、调控正常细胞周期，而在发育成熟后的正常组织中基本不表达或有少量表达，但是在多种肿瘤细胞中却呈现了高表达，据研究证实，HMGA2可通过多种途径调节肿瘤细胞的生长过程，如HMGA2参与肿瘤细胞的细胞周期调控，促进肿瘤细胞增殖，加速肿瘤细胞分化，此外HMGA2基因中包括AT钩结构，可与通过与DNA中丰富的特异AT序列结合并改变染色质的构象来调节多种转录因子表达，促进肿瘤细胞侵袭和转移。本发明中所提供的靶向HMGA2的单克隆抗体，能够高效特异性结合目标HMGA2蛋白，从而在多种肿瘤的诊断和检查中发挥作用。

本发明提供了一种肿瘤诊断试剂盒，包括本发明中所提供的靶向HMGA2的单克隆抗体。

进一步的，所述肿瘤包括肝癌，肺癌，结直肠癌，白血病。

进一步的，所述试剂盒中还包括有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。

本发明中基于该靶向HMGA2的单克隆抗体，提供了检测试剂盒，该试剂盒可用于免疫组织化学检测、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、Western-blot检测等多种检测方式，即可用于临床肿瘤检测，又可以和其他检测手段配合，判断肿瘤的发生发展状态，还可以用于实验室研究，揭示肿瘤致病机理和验证治疗手段是否有效。

本发明提供了一种靶向HMGA2单克隆抗体在制备肿瘤检测试剂中的应用。

进一步的，所述肿瘤包括肝癌，肺癌，结直肠癌，白血病。

本发明所提供的新型靶向HMGA2的单克隆抗体，具有全新的抗原结合域，其中重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示，该单克隆抗体与人HMGA2蛋白具有较高亲和力和高度特异性，通过免疫组织化学实验和ELISA实验结果表明，该单克隆抗体既能够在生物组织中原位检测目标抗原的表达情况，也能够在血清、组织液等液体环境定量检测目标抗原的含量，适用于针对固体肿瘤和液体肿瘤等不同类型的肿瘤进行定性、定量和定位分析，为肿瘤的早期诊断提供一种新的检测方案，具有较好的临床应用前景。

附图说明

图1肝癌组织和正常肝脏组织中靶向HMGA2的单克隆抗体的免疫组织化学检测图，图1A为正常肝脏组织，图1B为肝癌组织；

图2肺癌组织和正常肺组织中靶向HMGA2的单克隆抗体的免疫组织化学检测图，图2A为正常肺组织，图2B为肺癌组织；

图3结直肠癌组织和正常肠道组织中靶向HMGA2的单克隆抗体的免疫组织化学检测图，图3A为正常肠道组织，图3B为结直肠癌组织；

图4白血病患者和正常人血液中HMGA2 ELISA检测图。

具体实施方式

如本文所用的抗体，包括“全长抗体”、“抗体片段”或“抗原结合片段”至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，因此保留结合特异性以及至少部分特异性结合能力。抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体片段的包括但不限于Fab、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd′片段以及其他片段。

如本文所用的“单克隆抗体”是指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。单克隆抗体可以通过公知的方法来制备，例如单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞，通过基因重组技术，利用体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备。

如本文所用的“肿瘤”是指恶性肿瘤，包括但不限于肉瘤、淋巴瘤、实体瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、头颈肿瘤、腹膜内器官肿瘤、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、卵巢肿瘤、结直肠肿瘤、皮肤肿瘤、皮肤转移癌、淋巴样肿瘤、胃肠道肿瘤、肺肿瘤、骨肿瘤、黑素瘤、视网膜母细胞瘤或肾肿瘤或其转移性肿瘤。

实施例1靶向HMGA2的单克隆抗体的制备和纯化

1.1抗原的制备

Genebank网站上检索HMGA2基因(基因名为high mobility group AT-hook 2，HMGA2)，基因ID:8091，基因详细信息见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？term＝(hmga2[gene])，获得HMGA2基因序列，采用全合成方式获得该基因序列，并根据序列结构设计引物进行PCR扩增，而后将目标核苷酸序列导入大肠杆菌表达载体中，制备重组人HMGA2蛋白，经纯化后保存于-20℃冰箱中。

1.2免疫小鼠

以上述制备获得的重组人HMGA2蛋白为抗原免疫小鼠。首次免疫，用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌性BALB/c小鼠，腹部皮下多点注射，剂量为60μg/只；每隔2周加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为50μg/只。第三次免疫2周后每只小鼠尾静脉取血，置37℃温箱放置1h，于4℃、4000rpm离心15min，收集上层血清，用间接ELISA测定小鼠血清抗体效价。

1.3细胞准备

复苏小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(本实验室保存)，用含10％胎牛血清的1640完全培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养，当细胞至对数生长时每隔2-3天传代一次，选取生长旺盛，形态良好的细胞供融合使用。

ELISA方法检测小鼠血清效价达到1:2×10⁵时，选取血清效价高的小鼠，对小鼠进行强化免疫一次，3天后处死小鼠，无菌环境中取出脾脏，制备单个脾细胞悬液。将脾细胞溶悬液转入50mL离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，不完全培养基重悬洗涤3次，然后将细胞沉淀悬于不完全培养液中备用。

1.4细胞融合

将收集好的骨髓瘤细胞及脾脏细胞充分混合，加入50％PEG4000诱导融合，缓缓搅动使其分布均匀，37℃下孵育5min，然后加入新鲜无血清培养基终止融合，并用HAT培养液重悬细胞。将细胞加入已铺有滋养细胞的平板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

1.5克隆筛选

细胞融合约10-14天后，显微镜下筛选密度适中、圆润饱满的克隆细胞团，至于含有新鲜培养基的96孔板中，37℃，5％CO₂继续培养3天。而后采用ELISA方法以各个克隆细胞的上清液筛选HMGA2抗体的阳性克隆，阳性克隆细胞转入24孔板中，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基，37℃，5％CO₂继续培养。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入含饲养细胞和HT的12孔板培养。三天后取100μL上清进行第三次ELISA筛选，本轮筛选中共获得10株阳性克隆杂交瘤细胞株，分别命名为ADH-HMGA2 01-10，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

1.6鼠源单抗的制备与纯化

复苏上述保存的杂交瘤细胞，待细胞生长至对数生长期后，用无血清培养基洗涤并重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁵/mL。取健康BALB/c小鼠，腹腔注射高压灭菌的石蜡油预先致敏，0.5mL/只，而后腹腔注射上述杂交瘤细胞ADH-HMGA2 01-10悬液，剂量为10⁶个杂交瘤细胞/只。约7天后，当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水，收集到的腹水于4℃离心4000rpm10min，去除杂质取上清液。腹水上清液采用HiTrap rProtein AFF(GE公司)亲和层析法，按说明书进行纯化。SDS-PAGE胶鉴定纯度，经检测所获得抗体纯度均达到95％以上，命名为Ad-HMGA2 mab 01-10，上述纯化后的抗体保存于-20℃冰箱中，用于后续实验和筛选。

实施例2、单克隆抗体亲和力测定

本发明中采用Fortebio公司的Octet RED384系统，利用生物膜层表面干涉技术检测抗体与抗原的亲和力，即当生物分子结合到传感器表面就形成了一层生物膜，生物膜对透过传感器的光的波形造成干涉现象，检测干涉的相位移动方式，从而可以检测结合到传感器分子数量的变化。具体为，以本发明中所提供的靶向HMGA2单克隆抗体为配体，固化到传感器上(浓度20μg/mL)，以重组人HMGA2蛋白(目标抗原)为分析物，当抗原与生物膜层接触时，传感器表面分子数量发生变化，仪器便可检测抗体与抗原的结合和解离能力。

结果如表1所示，采用解离常数KD值表示单克隆抗体与目标抗原的亲和力，经测定，本发明中所提供的抗体与目标抗原的亲和力水平位于0.271-85.7nM之间，其中Ad-HMGA2 mab 01、Ad-HMGA2 mab 03、Ad-HMGA2 mab 05、Ad-HMGA2 mab 06、Ad-HMGA2 mab 08、Ad-HMGA2 mab 10与目标抗原的亲和力较高，其中Ad-HMGA2 mab 05和Ad-HMGA2 mab 08的亲和力最高，亲和力均在0.1-1nM之间。基于单克隆抗体的亲和力，本发明中选用亲和力较高的Ad-HMGA2 mab 08抗体进行后续实验。

表1靶向HMGA2的单克隆抗体与目标抗原的亲和力

实施例3、靶向HMGA2单克隆抗体序列分析

采用Trizol试剂(Thermo)裂解处理杂交瘤细胞，然后提取杂交瘤细胞RNA，具体方法参见Trizol试剂说明书。使用cDNA合成(逆转录)试剂盒(购自TaKara公司)扩增cDNA第一链，具体方法参看试剂盒说明书。然后通过PCR法分别扩增本发明中Ad-HMGA2 mab 08抗体的重链VH区和轻链的VL区，具体方法可采用本领域中的常规方式，如参考文献(Cloning,expression,and modification of antibody V regions，Sherie L Morrison，CurrProtoc Immunol，2002，PMID:18432877)中公开的方式，将扩增后的核酸产物酶切连接后导入pcDNA3.1载体，测序确定轻链、重链以及各个CDR区序列。其中，重链可变区CDRH1氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链可变区CDRH2氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区CDRH3氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，轻链可变区CDRL1氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，轻链可变区CDRL2氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，轻链可变区CDRL3氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。

实施例4靶向HMGA2的单克隆抗体与肿瘤组织样本的免疫组织化学检测

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是将带有显色剂标记的特异性抗体与组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学反应而显色，可以对于目标细胞或抗原进行定位、定性研究，是肿瘤检测中的重要手段之一，不仅能够直观的观测目标蛋白的表达情况，还能够考察目标蛋白的表达定位，从而为疾病的判断和病理学研究提供实证依据。本发明中为了验证靶向HMGA2的单克隆抗体的有效性，选用来自肝癌、肺癌和结直肠癌患者的组织切片进行免疫组织化学检测，具体方法为：

(1)选取肝癌、肺癌和结直肠癌患者肝癌组织蜡块和相关正常组织蜡块，制备组织石蜡切片。

(2)室温下用二甲苯洗涤脱蜡，后用酒精梯度洗脱除去残存的二甲苯。

(3)用3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育5分钟，然后用TBSB缓冲液冲洗3次。

(4)将靶向HMGA2的单克隆抗体滴加在组织切片上，室温孵育3小时，然后用TBSB缓冲液冲洗3次。

(5)滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37℃孵育30分钟，然后用TBSB缓冲液冲洗3次。

(6)滴加DAB显色剂，混合均匀，室温孵育显色15min，然后用蒸馏水冲洗3次。

(7)晾干，封片，显微镜观测。

如图1所示，图1A为正常肝脏组织中，没有发现HMGA2表达，图1B为肝癌组织中，却发现了HMGA2的高表达；如图2所示，图2A为正常肺组织中，在肺泡结构中没有发现HMGA2表达，图1B为肺癌组织中，却发现了HMGA2在肺泡壁中高表达；如图3所示，图3A为正常肠道组织，没有发现HMGA2表达，图3B为结直肠癌组织，在肠道壁和绒毛结构中均显示有HMGA2表达。上述结果，与以往期刊文献报道一致，说明本发明中所提供的靶向HMGA2的单克隆抗体Ad-HMGA2 mab 08能够有效检测肝癌、肺癌和结直肠癌等固体肿瘤组织中的HMGA2表达情况，可以用于后续的临床诊断和肿瘤研究。

实施例5、靶向HMGA2的单克隆抗体检测血清中目标蛋白表达情况

在实施例4中，验证了采用免疫组化方法检测在肝癌、肺癌和结直肠癌等固体肿瘤中HMGA2蛋白的表达情况，而诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等液体肿瘤中，免疫组化却难以开展，为了进一步验证本发明中所提供的单克隆抗体能否用于检测液体肿瘤，本实施例中选用白血病病人的血液样本与正常志愿者的血液样本，采用ELISA方法进行检测，用于验证本发明中所提供单克隆抗体的有效性，具体方法包括：

(1)选择并获得白血病患者临床血液标本共18例，其中男性9例，女性9例；正常人血液样本20例，其中男性10例，女性10例，静脉采集外周血。

(2)取各样品血液2mL，4000r/min离心10min，收集上清，为血液待测样品，4℃保存。

(3)在酶标板上包被Ad-HMGA2 mab 08抗体，每孔100μL，37℃孵育2h，然后用PBST洗涤3次。

(4)血液待测样品稀释后，每孔加入100μL；同时以重组人HMGA2蛋白为标准品，按梯度稀释法加入标准品孔中。所有样品孔37℃孵育1h，然后用PBST洗涤3次。

(5)加入酶标抗体(二抗)，37℃孵育1h，然后用PBST洗涤3次。

(6)向样品孔中加入100μL/孔的TMB显色液，室温孵育10min进行显色反应。

(7)向样品孔中加入100μL/孔的H₂SO₄，终止反应。

(8)采用酶标仪检测450nm下各个样品孔的吸光度，并根据标准曲线计算血液样品的目标蛋白的浓度。

结果如图4所示，正常人血液中HMGA2处于低水平，而白血病患者血液中HMGA2却呈现明显高水平表达，有报道称，HMGA2基因高表达可以促进白血病细胞的增殖和迁移，而敲除HMGA2基因后则可抑制其增殖，本发明所提供的单克隆抗体可以有效检测血液中的HMGA2蛋白含量，并能够进行定量分析，上述结果表明本发明中所提供的单克隆抗体可以用于液体肿瘤的检测和诊断。

序列表

<110> 北京保图生物技术有限公司

<120> 一种肿瘤检测试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Met Ile Pro Leu Ser Val

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Ala Gly Cys Ser Tyr Thr Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asn Gly Met Thr Thr Tyr Ser Lys Leu Met His Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Glu Asp Pro Thr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Tyr Phe Ser Ser Gly

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Ser Ser Thr Leu Thr Phe Met Gln Ser Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Thr Ser Gly Ala Glu Leu Ala Val Pro Trp Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Gln Ser Gly Tyr Ile Ser Thr Arg Met Ile

20 25 30

Pro Leu Ser Val Trp Val Lys Gln Met Thr Gly Gln His Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Phe Ala Gly Cys Ser Tyr Thr Thr Lys Ala Thr Pro Thr Ala

50 55 60

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Asn Ser Met Glu Leu Arg Ser Asp Gln Gln

65 70 75 80

Trp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asn Cys Ala Tyr Asn Gly Met Thr Thr

85 90 95

Tyr Ser Lys Leu Met His Thr Trp Gly Thr Gly Thr Pro Val Pro Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 8

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Glu Thr Gln Ser Trp Pro Tyr Met Ser Thr Thr Val Leu

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Cys Thr Cys Gln Glu Asp Pro Thr Trp Tyr Gln Gln

20 25 30

Ala Gly Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Tyr Phe Ser

35 40 45

Ser Gly Gly Val Pro Asp Ser Phe Thr Gly Thr Gly Ser Trp Thr Asp

50 55 60

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Thr Leu Thr Phe Leu Ala Asp Tyr

65 70 75 80

Phe Cys Ile Ser Ser Thr Leu Thr Phe Met Gln Ser Pro Phe Gly Ser

85 90 95

Ala Thr Lys Leu Pro Ile Lys

100

Claims

1.一种靶向HMGA2的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区CDRH1；

SEQ ID NO.2所示的重链可变区CDRH2；

SEQ ID NO.3所示的重链可变区CDRH3；

SEQ ID NO.4所示的轻链可变区CDRL1；

SEQ ID NO.5所示的轻链可变区CDRL5；

SEQ ID NO.6所示的轻链可变区CDRL6。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含如SEQ ID NO.7所示的重链可变区氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含如SEQ ID NO.8所示的轻链可变区氨基酸序列。

4.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌，肺癌，结直肠癌，白血病。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。

7.权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体在制备肿瘤检测试剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌，肺癌，结直肠癌，白血病。