CN108473552B - 检测外泌体蛋白eif3a的特异性自身抗体的抗原性组合物和使用其诊断肝癌的方法 - Google Patents

检测外泌体蛋白eif3a的特异性自身抗体的抗原性组合物和使用其诊断肝癌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合作为外泌体蛋白的真核生物翻译起始因子3亚基A(EIF3A)的自身抗体，或包含所述自身抗体的抗原结合位点的片段，产生所述自身抗体的杂交瘤细胞系，具有所述抗原结合位点的氨基酸序列并且特异性结合所述自身抗体的多肽，用于诊断肝癌的组合物，其包括测量包含所述自身抗体或其抗原结合位点的片段的表达水平的试剂，包括所述组合物的肝癌诊断试剂盒，以及使用该组合物提供诊断肝癌信息的方法。此外，本发明涉及通过自身抗体的表达水平筛选肝癌治疗剂的方法。当将本发明的抗EIF3A自身抗体用作肝癌的诊断标记物时，仅使用非侵入性生物样品就可以高度准确性地诊断肝癌。此外，由于通过鉴定的氨基酸序列可以容易地诊断肝癌，本发明预期有利于诊断产品例如肝癌诊断试剂盒的开发。

Description

检测外泌体蛋白EIF3A的特异性自身抗体的抗原性组合物和 使用其诊断肝癌的方法
发明背景
1.发明领域
本发明涉及用于检测外泌体蛋白EIF3A(真核翻译起始因子3亚基A)的特异性自身抗体的抗原组合物和使用该抗原组合物诊断肝癌的方法。更具体而言，本发明涉及特异性结合人体内诱导的外泌体蛋白EIF3A的自身抗体或包含其抗原结合位点(互补位)的片段，产生所述自身抗体的杂交瘤细胞系，具有特异性结合所述自身抗体的抗原决定簇(表位)的氨基酸序列的多肽，用于诊断肝癌的组合物，其包括测量所述自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的表达水平的试剂，包括所述组合物的用于肝癌诊断的试剂盒，使用所述组合物诊断肝癌的方法，以及采用所述自身抗体的表达水平筛选肝癌治疗剂的方法。
2.相关技术的描述
为了诊断癌症，通过分子生物学或生物化学研究，肿瘤标志物的离体诊断目前用于检测血液中的肿瘤生物标志物，结合内窥镜检查，诊断成像，核医学检查等。
用于离体诊断的有效肿瘤标志物应仅通过简单的血液检测来确认癌症的诊断，并应确定其进展。目前临床上使用的大多数肿瘤标志物是CA125，CEA和PSA，它们是在癌细胞中特异性表达并分泌的抗原。他们的血清浓度通过夹心ELISA测量。然而，上述抗原对癌症诊断的敏感性和特异性低，因此它们仅用作癌症诊断的辅助手段。
免疫系统通常诱导针对被识别为非自身的外来抗原的体液免疫应答或细胞免疫应答。但是，即使某物质在体内表达，在表达位点与正常位点不同的情况下，可以作为自身抗原诱导抗体产生，从而被分泌到细胞外，其表现出变形的形状，或者其特征与正常人的不同。据报道，在癌症发展期间，产生针对肿瘤相关抗原(TAA)的自身抗体，伴有异常的癌细胞生长。另外，在肿瘤发生的早期阶段也发现肿瘤相关抗原诱导的自身抗体，因此，它们被认为是适合于早期诊断的生物标志物。
此外，已报道了在许多不同类型的癌症中，在肿瘤发生期间诱导的多种自身抗体。在肝癌发展过程中，作为p53肿瘤抑制基因的负调控因子的MDM2(E3泛素蛋白连接酶)和作为具有多种功能的核蛋白的NPM1(Nucleophosmin1)诱导自身抗体。由于在乳腺癌，结肠癌和肺癌中暴露于细胞表面的糖链缺乏，MUC-1诱导高水平的MUC-1特异性自身抗体。在头颈部鳞状细胞癌中，53％至93％的突变形式的p53蛋白在细胞中过表达并异常积聚以诱导产生针对p53的自身抗体。此外，在43％的小细胞肺癌患者中发现SOX B1，B2自身抗体。在使用EBV自身抗体诊断鼻咽癌的情况下，特异性和敏感性超过90％。
由于通过翻译后修饰的细胞外分泌或通过肿瘤位点的坏死细胞内蛋白质的胞外释放，新表位刺激免疫系统以诱导抗体，这也是一个重要问题。然而，最近证实，癌细胞利用膜囊泡例如外泌体作为细胞材料的细胞外释放系统，并且因此预期通过膜囊泡刺激免疫系统也可以提供能够诱导自身抗体的细胞内蛋白质。
与检测血液蛋白抗原相比，检测自身抗体的优点在于可以构建相对稳定的诊断方法，并且甚至在早期阶段也可以检测。只要目标抗原固定，检测方法就容易构建。因此，已证实当尝试通过多次检测自身抗体诊断癌症时，容易构建多重检测方法并且诊断效果提高。
代表性地，据报道，当通过使用选自表达源自前列腺癌的蛋白质的噬菌体展示文库的22种噬菌体肽自身免疫抗原检测自身抗体时，可以以81.6％敏感性和88.2％特异性检测到前列腺癌，表明诊断效果优于已知的标记PSA。当同时检测ASB-9，SERAC1和RELT抗原反应性自身抗体时，可以以100％特异性和80％灵敏度检测乳腺癌。此外，当使用PIM1，MAPKAPK3和ACVR2B抗原反应性自身抗体时，可以以74％的特异性和83％的敏感性诊断结肠癌。最近有报道称，同时检测7种自身抗体生物标志物的Luminex技术可用于诊断肺癌，准确率为80％或更高。
基于这些结果，通过检测自身抗体的癌症诊断方法被商业化并上市。英国的Oncimmune Ltd.已经构建了一种适用于使用7种自身抗原进行肺癌早期诊断的自身抗体多重检测方法。该产品自2012年以来一直以“EarlyCDT-Lung”的名称推向市场，其应用范围现已拓展至美国市场。因此，已经证实通过癌症来源的自身抗体的多重检测的癌症诊断是有效的，并且因此有人提出鉴定具有高特异性和敏感性的自身抗体是重要的。
获得抗体特异性抗原对于检测血清中的癌症相关自身抗体是至关重要的。作为实现该目的的最基本的方法，从癌细胞获得抗体特异性抗原蛋白质，并通过蛋白质组学分析，然后将相应的抗原制备为重组蛋白质，然后将其用于检测抗体。蛋白质组学方法，如血清蛋白质组分析(SERPA)和多种亲和蛋白质谱分析(MAPPING)可用于鉴定自身抗体特异性抗原。此外，通过将癌细胞裂解物分成几千个部分来制备蛋白质芯片，并且可以检测患者血液在蛋白质芯片中的反应性以鉴定自身抗体。
作为另一种方法，首先获得抗体反应性表位，然后可以鉴定包括该分析的表位蛋白质序列的蛋白质抗原。筛选用于表位分析的cDNA表达噬菌体文库或线性肽文库是通常用于表征抗体的方法。经筛选以鉴定自身抗体抗原的线性肽序列可用于推断抗原蛋白，表达肽的噬菌体可直接用于检测抗体，因此，所述肽可用于制备抗原阵列以供自身抗体检测。
目前，已经进行了许多研究以发现与癌症诊断有关的自身抗体，例如通过测量与各种衍生肽特异性结合的自身抗体的表达水平来诊断肝脏疾病的方法，通过测量与ATIC(5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶/IMP环水解酶)蛋白特异性结合的自身抗体的表达水平来诊断肝癌的方法等。例如，美国专利公开号2010-0261209公开了使用各种衍生肽或与肽特异性结合的自身抗体作为检测肝脏疾病的生物标志物。韩国专利公开号2012-0134547公开了用于诊断肝癌的组合物，其包括测量与ATIC(5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶)特异性结合的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的表达水平的试剂。
由于上述使用自身抗体的诊断方法与抗原检测方法相比，具有配置容易的优点，已经提出了早期诊断的可能性，因此近10年来的相关研究得到关注。然而，在鉴定癌症相关自身抗体和获取抗原的过程中出现的一些问题是获得有用结果的障碍。
第一个问题是获得待分析的自身抗体。为了获得癌症相关的自身抗体，使用患者的血清。然而，由于连续获得患者血清是困难的，因此存在其不足以用于表征的缺点。第二个问题是即使鉴定到抗原蛋白质，也很难获得充分反映抗体特异性表位结构的重组蛋白质。当抗体特异性表位识别序列特征时，可以使用具有不完整高级结构的重组蛋白或来自线性肽文库的抗原进行抗体检测。然而，在识别高级结构的抗体的情况下，获取抗原用于检测存在困难。考虑到针对体内抗原的抗体通常诱导结构识别抗体，迄今为止进行的关于使用自身抗体的研究存在明显限制。
本发明人为鉴定用于诊断肝癌的自身抗体进行了许多努力，结果他们发现与EIF3A蛋白特异性结合的自身抗体可以用作诊断肝癌的自身抗体，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供与EIF3A(真核翻译起始因子3亚基A)蛋白特异性结合的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段。
本发明的又一个目的是提供产生所述自身抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的又一个目的是提供具有特异性结合所述自身抗体的抗原决定簇(表位)的氨基酸序列的多肽。
本发明的又一个目的是提供用于诊断肝癌的组合物，其包括测量自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的表达水平的试剂。
本发明的又一个目的是提供一种包括该组合物的诊断肝癌的试剂盒。
本发明的又一个目的是提供一种使用该组合物诊断肝癌的方法。
本发明的又一个目的是提供一种使用该组合物筛选肝癌治疗剂的方法。
附图的简要说明
图1A是显示通过流式细胞术检测XC90抗体针对各种癌细胞的反应性的结果的图；
图1B是显示通过细胞内染色检测XC90抗体针对各种癌细胞的反应性的结果的显微镜像；
图1C是显示用于检测XC90自身抗体特异性抗原蛋白的Western印迹分析结果的照片；
图2A是蛋白质鉴定结果的照片和曲线图，其中仅包含大量XC90抗体特异性抗原蛋白质的部分被浓缩并在SDS-PAGE上运行，并且提取对应于XC90抗原的条带，接着进行凝胶内消化和质谱检测；
图2B是表示得到的XC90抗体特异性抗原蛋白质的质谱结果的表；
图3A是显示RT-PCR和Western印迹分析结果的照片，其中XC90mAb结合抗原的表达由于siRNA抑制EIF3A表达而降低；
图3B是显示流式细胞术的结果的图，其中XC90mAb结合抗原的表达由于siRNA抑制EIF3A表达而降低；
图3C是显示使用EIF3A抗体通过免疫沉淀从细胞裂解物中分离EIF3A蛋白，并运行SDS-PAGE分离EIF3A蛋白后，通过使用XC90抗体和EIF3A抗体作为第一抗体的EIF3A蛋白的Western印迹分析结果照片；
图3D是显示Western印迹分析结果的照片，其中XC90mAb特异性抗原、EIF3A在部分从细胞释放的外泌体中发现；
图4是通过使用XC90抗体筛选噬菌体展示环状CX7C肽文库来选择XC90抗体特异性抗原表达噬菌体的结果的示意图，图和表；
图4A是显示通过使用XC90抗体筛选噬菌体展示环状CX7C肽文库来选择XC90抗体特异性抗原表达噬菌体的方法的示意图；
图4B是显示四轮选择XC90抗体特异性抗原表达噬菌体的结果的图；
图4C是显示检测XC90抗体特异性抗原对XC90抗体的反应性的ELISA结果的图；
图4D是显示从表达XC90抗体特异性抗原的噬菌体表达的表位序列的表格；
图4E是表示预先使1011pfu或1012pfu的表达XC90抗体特异性抗原的噬菌体与XC90抗体反应后的细胞反应性的结果的图；
图5A是显示“N末端-接头-表位-接头-成熟链霉亲和素-C末端”重组蛋白的结构的示意图，其通过使用成熟的链霉抗生物素蛋白作为载体，将用于蛋白质纯化6X组氨酸标签和环表位置于N末端，并添加接头以最大程度减少结构域之间的影响设计而成；
图5B是显示重组蛋白质以具有4种抗原的形式表达的示意图；
图5C是Western印迹分析照片，显示被设计为具有“N末端-接头-表位-接头-成熟链霉亲和素-C末端”结构的重组蛋白表达的结果；
图6A是显示检测具有XC90p2表位的重组蛋白His-XC90p2-SA对自身抗体检测是否有效的结果图，其中生物素板用不同浓度的纯化的His-XC90p2-SA蛋白质包被，并与不同浓度的XC90mAb反应来检测特异性反应的程度；
图6B是显示检测具有XC90p2表位的重组蛋白His-XC90p2-SA是否适当模拟细胞表达抗原的结果的图，其中检测了XC90抗体的细胞反应的竞争性抑制情况；
图7是显示使用表达XC90p2表位的重组蛋白诊断肝癌的结果的图，其中A是显示对照组(正常)和肝癌患者(HCC)的诊断结果的图，B是显示通过分析诊断结果的诊断特异性的图；
图8是表示分析所得到的XC90抗体的重链可变区(VH)作为XC90自身抗体的互补决定区(CDR)的结果的表；和
图9是表示分析所得到的XC90抗体的轻链可变区(VL)的互补决定区(CDR)作为XC90自身抗体的互补决定区(CDR)的结果的表。
优选实施方式详述
在实现上述目的的一个方面，本发明提供了与EIF3A(真核翻译起始因子3亚基A)蛋白特异性结合的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段。
如本文所用，术语“EIF3A(真核翻译起始因子3亚基A)”是指构成真核翻译起始因子3(eIF-3)复合物的蛋白质，其在开始蛋白质合成的几个步骤中是必需的。编码EIF3A蛋白的基因的特定核苷酸序列和蛋白质信息在NCBI中是已知的(GenBank：登录号NM_003750.2，NP_003741.1等)。
如本文所用，术语“自身抗体”是指与个体自身身体组分特异性反应的抗体，并且也称为自身抗体。一般来说，由于受试者不诱导针对其自身物质的免疫应答，所以它不产生抗体。但是，在特定情况下，受试者也可能产生针对其自身物质的抗体，并且这些抗体被称为自身抗体。当产生自身抗体时，它们可能引起各种疾病，例如自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎。
关于本发明的目的，不同于上述情况，自身抗体可以具体是，但不限于，针对肿瘤相关抗原(TAA)的抗体伴有异常癌细胞生长。
在本发明中，鉴定了与肝癌组织中表达水平增加的EIF3A特异性结合的自身抗体的抗原结合位点，并将相应的抗体设计为XC90抗体(以下称为“抗EIF3A抗体”，“XC90抗体”，“XC90自身抗体”或“自身抗体XC90”)。此外，为了表征自身抗体，本发明人分析了本发明的自身抗体的核苷酸序列。结果发现，本发明的自身抗体是包含SEQ ID NO：22所示的重链可变区和SEQ ID NO：23所示的轻链可变区的自身抗体。
通常，一个抗体分子具有两条重链和两条轻链，每条重链和每条轻链在其N端包含可变区。每个可变区由三个互补决定区(CDR)和四个框架区(FRs)组成。互补决定区决定所述抗体的抗原结合特异性，并且以可变区的框架区维持的较短肽序列存在。
例如，本发明的自身抗体可以包括由SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列表示的重链CDR1，由SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列表示的重链CDR2，和由SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列表示的重链CDR3作为重链可变区的一部分组成的自身抗体，或包含其抗原结合位点的片段。本发明的自身抗体可以是包括CDR1，CDR2和CDR3的全部序列或其片段的自身抗体。此外，本发明的自身抗体可以包括由SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列表示的轻链CDR1，由SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列表示的轻链CDR2，和由SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列表示的轻链CDR3作为轻链可变区的一部分组成的自身抗体，或包含其抗原结合位点的片段。
又如，本发明的自身抗体可以是由SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列作为重链可变区序列组成的自身抗体，或包含其抗原结合位点的片段，并且本发明的自身抗体可以是由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列作为轻链可变区的序列组成的自身抗体，包含其抗原结合位点的片段。此外，所述重链和轻链可以根据目的单独或组合使用，并且本领域技术人员根据目的可以通过常规的遗传工程方法自由组合许多CDR序列和轻链和重链。此外，显然编码所述序列的核苷酸序列也包括在本发明中。
尚未有通过本发明的EIF3A在肝癌中形成自身抗体的报道。尤其是，本发明人首次证明了在患有肝癌的受试者中针对EIF3A的自身抗体显著增加，导致鉴定了由与EIF3A的抗原决定簇(表位)的氨基酸序列相似的氨基酸序列表示的拟肽序列。
本发明的自身抗体包括编码两条全长重链的多核苷酸或具有所述抗体分子免疫活性的片段以实现抗体-抗原结合。此外，本发明的自身抗体包括编码两条全长轻链的多核苷酸或具有所述抗体分子免疫活性的片段以实现抗体-抗原结合。具有所述抗体分子的免疫活性的片段表示保持抗原结合能力的片段，抗体片段的实例包括(i)由轻链可变区(VL)，重链可变区(VH)，轻链恒定区(CL)和重链恒定区1(CH1)组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单克隆抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward E S等，Nature 341：544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域连接形成抗原结合位点的肽接头连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804)，但不限于此。
具体而言，本发明的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段可以是以保藏号KCTC12590BP保藏的杂交瘤细胞系产生的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段。更具体而言，本发明的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段可以是识别SEQ ID NO:1所代表的FPFPSSL(Phe-Pro-Phe-Pro-Ser-Ser-Leu)，SEQ ID NO:2所代表的PVRSGFP(Pro-Val-Arg-Ser-Gly-Phe-Pro)，SEQ ID NO:3所代表的LPWPSSL(Leu-Pro-Trp-Pro-Ser-Ser-Leu)，SEQID NO:4所代表的PSRHSGW(Pro-Ser-Arg-His-Ser-Gly-Trp)，SEQ ID NO:5所代表的PSRHSGY(Pro-Ser-Arg-His-Ser-Gly-Tyr)，SEQ ID NO:6所代表的PARHSGF(Pro-Ala-Arg-His-Ser-Gly-Phe)，SEQ ID NO:7所代表的PARTSWP(Pro-Ala-Arg-Thr-Ser-Trp-Pro)，SEQID NO:8所代表的PPRTGFQ(Pro-Pro-Arg-Thr-Gly-Phe-Gln)，或SEQ ID NO:9所代表的PARSGYP(Pro-Ala-Arg-Ser-Tyr-Pro)氨基酸序列的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段。更具体而言，本发明的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段可以是识别SEQ ID NO:2所代表的氨基酸系列PVRSGFP的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段。在20种必需氨基酸中，F代表苯丙氨酸(Phe)，P代表脯氨酸(Pro)，S代表丝氨酸(Ser)，L代表亮氨酸(Leu)，V代表缬氨酸(Val)，R代表精氨酸(Arg)，G代表甘氨酸(Gly)，W代表色氨酸(Trp)，H代表组氨酸(His)，A代表丙氨酸(Ala)，Y代表酪氨酸(Tyr)，并且Q代表谷氨酰胺(Gln)。
为了鉴定抗原决定簇，即与本发明的自身抗体结合的表位的序列，本发明人利用了由7个氨基酸形成环状结构的噬菌体展示环肽文库系统。具体而言，选择特异性结合抗EIF3A自身抗体的噬菌体。从所选择的噬菌体中，仅纯化对本发明的抗EIF3A自身抗体显示高反应性的噬菌体组，并将其用作包被抗原，然后检测与所述抗原结合的免疫抗体的反应性以分析它们的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了产生所述自身抗体的杂交瘤细胞系。
如本文所用，术语“杂交瘤”是指通过人工融合两种不同类型的细胞而制备的细胞，以及通过使用诱导细胞融合的物质例如聚乙二醇或一种病毒制备的两种或更多种同源细胞或异源细胞的融合细胞。杂交瘤是将不同细胞的不同功能整合到一个细胞中，并以淋巴细胞为代表。特别地，通过融合骨髓瘤细胞和作为负责在脾或淋巴结中的淋巴细胞中产生抗体的前体细胞的B细胞制备的杂交细胞产生单克隆抗体，因此它广泛用于研究或临床试验。另外，产生淋巴因子(生理活性物质)的T细胞和其肿瘤细胞的杂交瘤也被实用化。产生本发明的自身抗体的杂交瘤可适当地通过本领域技术人员对本领域已知的细胞进行修饰来制备。
在本发明的一个实施方案中，将小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0和B细胞融合并培养，然后仅选择产生癌细胞反应性抗体的B细胞杂交瘤，并将其在2014年5月12日以保藏号KCTC12590BP保藏在韩国生命工学研究院生物资源中心。特别地，所述杂交瘤细胞系可以是以保藏号KCTC 12590BP保藏的细胞系。
另一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO:1代表的FPFPSSL，SEQ ID NO:2代表的PVRSGFP，SEQ ID NO:3代表的LPWPSSL，SEQ ID NO:4代表的PSRHSGW，SEQ ID NO:5代表的PSRHSGY，SEQ ID NO:6代表的PARHSGF，SEQ ID NO:7代表的PARTSWP，SEQ ID NO:8代表的PPRTGFQ，或SEQ ID NO:9代表的PARSGYP的氨基酸序列的多肽，它是特异性结合所述自身抗体的表位。
具体而言，由七个氨基酸组成的多肽被制备成在两个末端包含额外的半胱氨酸(Cys；C)的CX7C的形式，因此它们能够形成稳定的环状结构。这些多肽可以用作检测本发明自身抗体的表位模拟多肽。在本发明的具体实施方式中，表达环状肽文库的噬菌体(Ph.D.-C7C噬菌体展示肽文库试剂盒；新英格兰生物实验室-New England Biolabs)，其中7个氨基酸两端都具有半胱氨酸形成环状结构，用于鉴定由SEQ ID NO：2代表的PVRSGFP，其显示出对来自随机序列的XC90mAb自身抗体的高反应性。
另一方面，本发明提供了用于诊断肝癌的组合物，其包含测量自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的表达水平的试剂。
如本文所用，术语“诊断”是指评估病理状态的存在或性质。就本发明的目的而言，诊断不仅包括确定肝癌发病率，还包括预测治疗结果，包括复发，转移扩散和药物反应性和耐药性。具体而言，本发明的与EIF3A特异性结合的自身抗体被用于确定从怀疑患有肝癌的个体分离的样品中EIF3A的表达水平，从而预测个体的预后以及诊断肝癌的发病率。具体而言，所述自身抗体可以是特异性结合SEQ ID NO:1代表的FPFPSSL，SEQ ID NO:2代表的PVRSGFP，SEQ ID NO:3代表的LPWPSSL，SEQ ID NO:4代表的PSRHSGW，SEQ ID NO:5代表的PSRHSGY，SEQ ID NO:6代表的PARHSGF，SEQ ID NO:7代表的PARTSWP，SEQ ID NO:8代表的PPRTGFQ，或SEQ ID NO:9代表的PARSGYP的氨基酸序列的抗体。更具体而言，所述自身抗体可以是特异性结合SEQ ID NO:2代表的PVRSGFP的氨基酸序列的抗体。还有更具体而言，所述自身抗体可以是特异性结合SEQ ID NO:2代表的PVRSGFP的氨基酸序列的抗体，但不限于此。
如本文所用，术语“个体样品”包括显示EIF3A表达水平差异的样品，例如组织，细胞，全血，血清，血浆，唾液，痰，脑脊髓液或尿液，但不限于此。
如本文所用，术语“诊断性标记，用于诊断的标记，诊断用标记或诊断标记”意指能够通过区分癌细胞与正常细胞来诊断癌症的物质。具体而言，本发明的诊断标记可以是与EIF3A特异性结合以便诊断肝癌的自身抗体。
如本文所用，术语“肝癌”是指源自占肝脏大部分的肝细胞的恶性肿瘤，并且包括开始于肝脏内的所有种类的恶性肿瘤(例如肝内胆管癌)和从其他地方扩散到肝脏的转移性肝细胞癌。肝癌的预后取决于肿瘤的数量和大小，血管侵入的程度等。肝癌患者死亡的主要原因不是肝癌本身，而是肝癌发展导致的肝衰竭。因此，本发明人证实了本发明的自身抗体可以用于以高特异性诊断受试者中肝癌的发病率(图7)。
由于释放到血液中的肿瘤特异性蛋白质的半衰期降低，检测癌症中过表达的蛋白质的已知方法不适合诊断癌症。因此，用作癌症的诊断标记物是有问题的。本发明的EIF3A特异性自身抗体具有较长的半衰期以表现出高检测灵敏度，并且也可以通过非侵入性方法从患者中简单地采集样品例如血样。因此，本发明的自身抗体适合用作癌症的诊断标记物。
如本文所用，术语“能够测量与EIF3A蛋白特异性结合的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的表达水平的试剂”是指用作通过测量抗EIF3A自身抗体的表达水平检测标记物的分子，抗EIF3A自身抗体在肝癌患者或怀疑患有肝癌的个体的全血，血清，血浆，淋巴液和组织液中过度表达的标志物。具体而言，它可以是特异性结合所述自身抗体的多肽。所述特异性结合所述自身抗体的多肽可以是具有SEQ ID NO:1代表的FPFPSSL，SEQ ID NO:2代表的PVRSGFP，SEQ ID NO:3代表的LPWPSSL，SEQ ID NO:4代表的PSRHSGW，SEQ ID NO:5代表的PSRHSGY，SEQ ID NO:6代表的PARHSGF，SEQ ID NO:7代表的PARTSWP，SEQ ID NO:8代表的PPRTGFQ，或SEQ ID NO:9代表的PARSGYP的氨基酸序列的多肽。可以通过在两个末端添加半胱氨酸来制备多肽以具有稳定的环状结构，并且还可以以与载体蛋白的融合蛋白的形式制备多肽，以便获得表位的有效表达。
如本文所用，术语“载体蛋白质”意指与期望的蛋白质或多肽结合以有效维持表位表达的蛋白质或其片段。它可以是GFP(绿色荧光蛋白)，HSA(人血清白蛋白)，MBP(麦芽糖结合蛋白)或链霉亲和素，但不限于此，具体而言，其可以为链霉亲和素。在本发明的具体实施例中，使用显示与人血清无非特异性结合的链霉亲和素作为载体蛋白，以制备融合蛋白形式的本发明多肽，以增加诊断试剂盒的灵敏度和特异性。
用于测量表达水平的分析方法包括但不限于Western印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫测定法(otA)、放射免疫扩散法、琼脂免疫扩散法(Ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳法、免疫组织化学染色法、免疫沉淀测定法、补体结合试验、FACS、蛋白质芯片检测等。通过上述检测方法，可以将正常对照组中的抗原-抗体复合物的形成与患有肝癌或怀疑患有肝癌的受试者中的抗原-抗体复合物的形成进行比较，由此诊断疑似肝癌患者中肝癌的发病率。
肝癌的诊断方法可以通过本发明的抗EIF3A自身抗体和与其特异性结合的抗原之间的抗体-抗原反应来实现。如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”是指肝癌标志物，自身抗体和其特异性抗原的结合产物。形成的抗原-抗体复合物的量可以通过测量检测标记的信号强度来定量确定。具体而言，本发明中的抗原-抗体复合物可以是抗EIF3A复合物与其特异性抗体的结合产物。
这种检测标记可以选自下组：酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于此。可用作检测标记的酶的实例包括但不限于β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶(GDPase)、RNA酶(RNase)、葡萄糖氧化酶和萤光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶和β-内酰胺酶。荧光物质的实例包括但不限于荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。配体的实例包括但不限于生物素衍生物。发光物质的实例包括但不限于吖啶酯、萤光素和萤光素酶。微粒的实例包括但不限于胶体金和彩色乳胶。氧化还原分子的实例包括但不限于二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌，Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、和[MO(CN)8]4-。放射性同位素的实例包括但不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、和186Re。
此外，本发明人通过以下实验证明了与抗EIF3A特异性结合的抗体可以用作肝癌的诊断标记。
首先，从肝癌小鼠模型获得脾细胞作为亲本细胞，并与骨髓瘤细胞融合以产生B细胞杂交瘤。从产生的杂交瘤细胞分泌的抗体中，选择与肝癌细胞显示反应性的抗体以分离本发明的源自XC90克隆的XC90mAb自身抗体(图1)。
此后，检测与分离的自身抗体反应的抗原的存在。为了对抗原进行更具体的分析，分离的自身抗体XC90mAb被大量纯化，并进行甘露糖结合蛋白-琼脂糖或蛋白L-琼脂糖纯化以检测抗原(在细胞质中表达)的细胞内定位并鉴定相应的自身抗原蛋白(图2)。检测鉴定的抗原的种类和功能，结果发现相应的抗原是EIF3A(图2和3)。
此外，本发明人使用由7个氨基酸组成的噬菌体展示肽文库来检测特异性表位序列，以鉴定与纯化的自身抗体结合的表位序列(表1)。使用鉴定的噬菌体序列作为包被抗原并将鉴定的自身抗体作为第一抗体进行ELISA，以鉴定显示出高反应性的抗原组。发现显示最高反应性的抗原(由命名为XC90p2的噬菌体文库鉴定)，并命名为XC90p2抗原或XC90p2自身抗原(图5)。
在又一方面，本发明提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，其包含所述组合物。
在本发明中，与抗EIF3A自身抗体特异性结合的抗原包括能够特异性结合所述自身抗体的所有蛋白质，并且不限于特定的蛋白质或多肽。具体而言，所述抗原可以包括其任何片段或其任何变体，只要其可以被抗EIF3A自身抗体识别即可。所述抗原可以由1至2000个氨基酸组成，就本发明的目的而言，所述抗原可以具体由5至16个氨基酸组成，但不限于此。更具体而言，抗原可以是包含本发明的可被自身抗体标志物识别的表位结构的蛋白质。表位不特别限制其大小或类型，只要表位能够形成能被本发明的自身抗体识别的结构，并且例如表位可以是由7个氨基酸组成的多肽。又例如，表位可以是由SEQ ID NOS：1至9的氨基酸序列代表的多肽。例如，本发明人通过使用CX7C-肽展示噬菌体，鉴定了被本发明的自身抗体特异性识别的序列。结果发现本发明的自身抗体对由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的多肽(图4)显示出高反应性。
本发明的肝癌诊断试剂盒不仅可以包括用于测量作为肝癌诊断标志物的EIF3A的表达水平的引物，选择性识别所述标志物的探针或抗体，而且还可以包含一种或多种其他组分的组合物，溶液或适合于分析方法的设备。
此外，用于测量由编码诊断标志物EIF3A的基因表达的蛋白质的表达水平的试剂盒可以包括基质，合适的缓冲溶液，着色酶或用荧光物质标记的第二抗体，着色底物等用于抗体的免疫学检测。至于基质，可以使用硝酸纤维素膜，由聚乙烯树脂制成的96孔板，由聚苯乙烯树脂制成的96孔板和载玻片。至于着色酶，可以使用过氧化物酶和碱性磷酸酶。至于荧光物质，可以使用FITC和RITC，而对于着色底物溶液，可以使用ABTS(2,2'-联氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、OPD(邻苯二胺)、或TMB(四甲基联苯胺)。
用于测量蛋白质水平的分析方法包括但不限于Western印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、放射免疫测定法(otA)、放射免疫扩散法、琼脂免疫扩散法(Ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳法、免疫组织化学染色法、免疫沉淀测定法、补体结合试验、FACS、和蛋白质芯片检测等，具体而言，本发明的试剂盒可以是使用包被有抗EIF3A复合物的ELISA的试剂盒。
蛋白质表达水平可以通过ELISA来测量。ELISA包括各种ELISA方法，例如使用识别固定在固相支持物上的抗原的标记抗体的直接ELISA，使用识别能够识别固定在固相支持物上的抗原的抗体复合物中捕获抗体的间接ELISA，使用另一标记抗体识别固定在固相支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原的直接夹心ELISA和间接夹心ELISA，其中识别固定在固相支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原的另一种标记抗体发生反应，然后标记的二抗识别使用的前一种抗体。例如，通过夹心ELISA检测蛋白质表达水平，其中样品与固定在固相支持物上的抗体反应，并且通过加入抗原特异性的标记抗体检测得到的抗原-抗体复合物，然后进行酶促显色，或者通过加入识别抗原-抗体复合物中抗原的抗体的特异性的标记二抗，然后进行酶促显色。通过测量诊断标志物EIF3A和抗体的结合程度可以诊断肝癌的发病率。
在本发明的一个实施例中，通过使用CX7C-肽展示噬菌体文库鉴定了与本发明的自身抗体反应的表位序列，并且与一抗发生反应，然后与IgGAM-HRP反应，然后检测抗原-抗体复合物形成和其量。结果，正常个体和肝癌个体血清之间的模式存在明显差异。
当以这种方式进行抗EIF3A自身抗体的检测或诊断肝癌时，可以以高特异性和敏感性诊断肝癌。在本发明的优选实施方式中，使用ELISA(酶联免疫吸附测定)进行检测。因此，患有肝癌的个体可以被诊断并且以73.81％的敏感性和76.74％的反应特异性与正常个体区分开来。
此外，可以通过使用针对诊断标志物的一种或多种抗体来进行Western印迹。从样品中分离总蛋白质，电泳以根据大小分离，转移到硝酸纤维素膜上，并与抗体反应。基因表达产生的蛋白质的量通过使用标记抗体测量产生的抗原-抗体复合物的量来确定，由此诊断肝癌的发病率。
另外，可以通过使用针对标志物的一种或多种抗体来进行免疫组化染色。收集来自肝癌患者或怀疑患有肝癌的个体的组织样品并固定，然后根据众所周知的方法制备石蜡包埋块。根据已知方法将块切成几个μm厚的小切片，并且将其附着于载玻片以与包含本发明自身抗体的抗原结合位点的片段反应。随后，洗去未反应的抗体，用选自上述检测标记的一种标记反应的抗体，然后在显微镜下观察。
可以使用蛋白质芯片，其中针对标志物的一种或多种抗体被排列并以高密度固定在基片上的预定位置处。在这方面，在通过使用蛋白质芯片分析样品的方法中，从样品中分离蛋白质并与蛋白质芯片杂交以形成抗原-抗体复合物，然后读取该复合物以检测所述蛋白质的存在或表达水平，从而诊断肝癌的发生。
另一方面，本发明提供了一种诊断肝癌的方法，包括使用该组合物检测自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的步骤。
具体而言，本发明的肝癌诊断方法可以包括以下步骤：(a)测量来自疑似肝癌患者的生物样品中与EIF3A蛋白特异性结合的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段的表达水平；和(b)比较步骤(a)中测得的自身抗体或片段的表达水平与从正常个体分离的生物样品的表达水平。
如本文所用，术语“个体”包括但不限于马，狗，猫，猪，山羊，兔，仓鼠，猴，豚鼠，大鼠，小鼠，蜥蜴，蛇，绵羊，牛，鱼和鸟类、并且意指任何动物(例如人)，并且广泛地包括所述动物的细胞系而没有限制。
在本发明中，对照组是来自显示抗-EIF3A自身抗体的表达水平低于患有肝癌或怀疑患有肝癌的个体的表达水平的个体的样品，并且指的是用作通过使用本发明的抗EIF3A自身抗体的抗原抗体反应来诊断肝癌的标准的样品。
如本文所用，术语“样品”是指选自由全血、血清、血液、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴液、脑脊髓液和组织间液组成的组中，在作为肝癌诊断标志物的抗EIF3A自身抗体的表达水平中显示差异的任何一种或多种样品，但不限于此。
此外，测量蛋白质表达水平的分析方法包括Western印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、放射免疫测定法(otA)、放射免疫扩散法、琼脂免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫组织化学染色法、免疫沉淀测定法、补体结合试验、FACS和蛋白质芯片测定，但测量蛋白质表达水平的方法不限于这些实例。
另一方面，本发明提供了筛选肝癌治疗剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)测量个体中特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体的表达水平；(b)向个体施用候选的肝癌治疗剂；(c)测量施用候选治疗剂的个体中特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体的表达水平；和(d)当在步骤(c)中测量的表达水平低于在步骤(a)中测量的表达水平时，确定所述候选治疗剂为肝癌治疗剂。
在步骤(a)中，测量特异性结合来自除人以外的个体的EIF3A蛋白质的自身抗体的表达水平的步骤可以通过本领域中通常使用的测量表达水平的方法进行而没有限制，其实例包括Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫测定(otA)、放射免疫扩散、琼脂免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀测定法、补体结合试验、FACS和蛋白质芯片测定。
步骤(b)和(c)包括以下步骤：将候选肝癌治疗剂施用于个体，并测量施用候选治疗剂的个体中与EIF3A蛋白特异性结合的自身抗体的表达水平，步骤(d)是当步骤(c)中测量的表达水平低于步骤(a)中测量的表达水平时，包括确定所述候选治疗剂为肝癌治疗剂的步骤的筛选步骤。
如本文所用，术语“肝癌候选治疗剂”是指预期治疗肝癌的物质。任何物质都可以不受限制地使用，只要其预期会直接或间接减轻或改善肝癌。它包括所有候选治疗物质，如化合物、基因或蛋白质。本发明的筛选方法检测施用候选物质之前和之后抗-EIF3A的表达水平。当与施用候选治疗物质之前的表达水平相比，表达水平降低时，可以确定相应的候选治疗物质为肝癌治疗剂。
在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明的构思和效果。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明的范围并不意图受这些实施例的限制。
实施例1：获得来自HBx小鼠的XC90自身抗体
为了获得致癌过程中产生的自身抗体，使用了发生与人类肝癌相似的肝癌的HBx转基因小鼠。从确认了肝癌产生的HBx转基因小鼠获得脾细胞作为B细胞组，并与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合以根据常规B细胞杂交瘤制备方法制备B细胞杂交瘤细胞系。使用HAT培养基(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷培养基)进行融合细胞的初次选择，并且仅分离培养克隆形成细胞。仅选择和维持在克隆形成细胞的培养基中检测到癌细胞反应性抗体的细胞。
在固定和透化后进行细胞内染色，然后通过癌细胞系的流式细胞术分析检测了癌症模型小鼠衍生的自身抗体对癌细胞的反应性。该方法详细描述如下。培养人肝癌细胞系HepG2或小鼠肝癌细胞系Hepa1c1c7，直至培养板中细胞数达到70-80％汇合，然后通过胰蛋白酶处理从培养板上分离，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。向其中加入每2×105个细胞的100μl Cytofix/Cytoperm溶液(BD生物科学-BD Biosciences)，并将细胞在4℃温育20分钟用于固定和透化。温育后，加入1ml Cytowash/Cytoperm溶液并充分混合。然后，通过以1700rpm离心5分钟进行细胞沉淀，并洗涤细胞沉淀。向洗涤过的样品中加入50μl一抗溶液(B细胞杂交瘤细胞培养基或纯化的一抗溶液)，并在4℃下孵育40分钟。温育后，将细胞洗涤三次，并在4℃用抗小鼠抗体-FITC(DaKo)处理40分钟。然后，将细胞进一步洗涤3次，将细胞沉淀重悬于300μl PBS中，然后使用FACSCaliber(BD Biosciences)分析。获得并比较对应于抗体反应的荧光平均值。使用不含一抗的DMEM培养基作为显示无抗体反应的对照组。
结果，获得了许多产生自身抗体的克隆。其中，在本发明中研究了XC90克隆分泌抗体。
产生XC90克隆分泌抗体的杂交瘤细胞系于2014年5月12日保藏于韩国生命工学研究院(KRIBB)的生物资源中心(KCTC)，保藏号为KCTC 12590BP。
实施例2：XC90抗体同种型的确定和纯化
通过使用小鼠抗体同种分型试剂盒进行分析来确定XC90抗体的同种型，结果是IgM型。
为了分析XC90抗体特异性反应，纯化单克隆抗体。将通过培养大量产生XC90抗体的B细胞或产生抗体的细胞获得的细胞培养物注射到小鼠的腹腔中，从而获得腹水。将腹水应用于甘露糖结合蛋白琼脂糖(Pierce)或蛋白L琼脂糖以纯化IgM型抗体。
SDS-PAGE后，通过考马斯亮蓝染色确认纯化的抗体，通过Bradford法进行蛋白质定量。
实施例3：XC90抗体特异性抗原在各种癌细胞中的表达和抗原蛋白的鉴定
为了检测实施例2中纯化的XC90单克隆自身抗体对各种癌细胞系的反应性，以与实施例1中相同的方式进行各种癌细胞系的细胞内染色，然后进行流式细胞术(图1A)。如图1A所示，在包括HepG2、SK-Hep-1、Huh7等的肝癌细胞系和包括HeLa、HT29等在内的其他癌细胞系中观察到XC90抗体反应性抗原的表达，并且特别地，在SK-Hep1肝癌细胞系和LNCap/LN3前列腺癌细胞系中观察到自身抗体的过表达。
此外，为了检测细胞内抗体反应性抗原表达的细胞内定位，使用共聚焦显微镜观察细胞内染色后的细胞，如图1B所示，在细胞质中观察到强染色。
通过Western印迹检测XC90抗体特异性抗原蛋白的表达。详细的方法如下。收集培养的癌细胞系并溶解于NP40细胞裂解缓冲液(含有1.0％(v/v)NP40和蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Roche)的PBS)中并以13,000rpm离心。上清液用作蛋白质分析样品。通过Bradford测定进行蛋白定量。每50μg制备的蛋白质样品在10％还原性SDS-PAGE上运行，并转移到PVDF膜上。此后，将转移了蛋白质的膜在5％(w/v)脱脂牛奶/TBS(Tris缓冲盐水)中封闭，并用一抗进行处理。将纯化的XC90抗体以0.1μg/ml的浓度稀释于封闭溶液中，然后用作一抗。一抗处理后，用TBST(含有0.1％(v/v)吐温-20的TBS)充分洗涤抗体，并用抗小鼠IgGAM-HRP作为二抗处理。随后，通过ECL(增强化学发光)检测抗体反应性蛋白条带。如图1C所示，在HepG2和Hepa1c1c7细胞中发现了XC90抗体特异性抗原，每条带具有150kDa和180kDa的分子量。
实施例4：鉴定XC90抗体特异性蛋白质
为了检测抗XC90抗原的自身抗体的产生是否作为癌症生物标志物有意义，鉴定了XC90抗原蛋白质并检测其功能。详细的方法如下。
如图2A所示，为了分析XC90抗体特异性抗原蛋白，从表达细胞系中部分纯化抗原蛋白。为了提取蛋白质，通过离子交换树脂层析分级显示相应抗原蛋白高表达的HeLa细胞裂解物(使用NP40缓冲液)。使用HiTrap-Q(GE)柱作为离子交换树脂，并在增加NaCl浓度的同时进行分级。基于用XC90抗体对每个级分进行Western印迹的结果，选择含有XC90抗体特异性抗原蛋白的级分，收集所选级分并通过丙酮沉淀浓缩，并在10％SDS-PAGE上分离，然后进行Western印迹和考马斯亮蓝染色进行比较。切出对应于XC90抗原的蛋白质条带，并使用胰蛋白酶对切割的蛋白质条带进行凝胶内消化。如图2B所示，反应后，将提取的肽级分进行质谱分析以获得关于蛋白质序列的信息。证实XC90抗体特异性抗原为EIF3A(或称为EIF3、eIF3a、eIF3p167、eIF3-p170、eIF3p180、eIF3p185、EIF3S10、eIF3-θ、eIF-3-θ、真核翻译起始因子3亚基10、真核翻译起始因子3亚基A、KIAA0139、P167、p180、p185、TIF32)。
为了确认通过质谱法蛋白质鉴定的结果，在使用siRNA抑制EIF3A的表达的细胞中检测到了XC90抗体反应的减少。作为用于抑制EIF3A表达的siRNA(Bioneer)，使用RNAiMAX(英杰公司)并将其注射到HepG2细胞中。siRNA处理48小时后，收集细胞提取总RNA，并使用5μgRNA作为模板合成cDNA。使用合成的cDNA作为模板以使用EIF3A基因特异性引物进行PCR。所得产物在1％琼脂糖凝胶上分析。通过siRNA处理显示EIF3A表达受抑制的细胞用XC90抗体进行Western印迹。结果如图3A所示，XC90抗体反应性抗原蛋白的量显著减少。而且，如图3B所示，用XC90抗体对siRNA处理的细胞进行细胞内染色后的流式细胞术的结果显示抑制EIF3A表达后XC90抗体特异性反应降低。进行免疫沉淀以进一步证实EIF3A是XC90抗体的靶标。将抗EIF3A抗体(细胞信号传导公司-Cell signaling)与50μl蛋白质A/G树脂(SC公司-Santa Cruz)结合，然后向其中加入1mg癌细胞裂解物，并使其在4℃下反应16小时。通过离心分离抗体-抗原复合物-树脂，洗涤6次，并在10％SDS-PAGE上分离，然后用抗EIF3A抗体(细胞信号传导公司)或XC90抗体进行Western印迹。结果如图3C所示，证实两种抗体检测到相同大小的蛋白质。在图3C中，泳道1代表用于免疫沉淀的细胞裂解物，泳道2代表用非EIF3A抗体结合树脂免疫沉淀的组分，泳道3代表用EIF3A抗体结合树脂免疫沉淀的组分。
当诱导自身抗体的抗原是细胞内蛋白质时，应从细胞释放抗原以刺激免疫系统。作为本发明人先前研究的结果，大部分诱导自身抗体的抗原是外泌体蛋白，其被包含在外泌体中然后从细胞释放，因此检测了XC90抗原是否也是外泌体蛋白。收集HepG2细胞培养物后，使用外泌体分离试剂盒(英杰公司)分离外泌体，然后用XC90抗体和抗EIF3抗体(细胞信号传导公司)进行Western印迹。结果如图3D所示，证实两种抗体识别相同的蛋白质。就此而言，样品1代表来自HepG2细胞的外泌体，而样品2代表来自Hepa1c1c7细胞的外泌体。
这些结果证实XC90抗体特异性抗原是EIF3A，其在细胞内表达并以外泌体形式从细胞释放。
实施例5：筛选XC90抗体特异性表位
由于抗原蛋白质结构中的抗体诱导位点是极其受限制的，并且其通常起作用而不管免疫宿主例如人、兔或小鼠，所以预期在癌症小鼠模型中获得的自身抗体也在人类肿瘤发生中被诱导。基于该特征，本发明人预期在癌症小鼠模型中获得的自身抗体也在人类肿瘤发生中被诱导，并且他们通过获得针对来源于癌症小鼠模型的自身抗体特异性的表位，构建了检测人类癌症来源的自身抗体的检测方法。为了获得针对来源于癌症小鼠模型的自身抗体的特异性表位，使用自身抗体仅选择抗体反应性噬菌体来探索表达环肽的噬菌体文库，并且证实其了表位序列。确认了癌细胞表达的抗原的抗体反应的竞争性抑制，并且确认了所述表位序列可以用作抗体特异性抗原模拟物。详细的方法如下。
为了容易地使用反应位点而不是整个抗原蛋白作为XC90抗体特异性抗原，从肽随机表达文库筛选XC90抗体特异性肽抗原，如图4A所示。噬菌体表达环肽文库试剂盒(新英格兰生物实验室)，其中有7个氨基酸随机表达，两个末端两个附加的半胱氨酸残基形成环状结构(-CX7C-)，用作肽表达文库。根据制造商的说明进行如下淘选：将300ng XC90抗体和表达2×1011个不同肽的噬菌体病毒体在200μl TBST溶液中彼此混合，并使其在室温下反应20分钟。将混合物与用封闭溶液(0.1M NaHCO3，pH 8.6，5mg/ml BSA，0.02％(w/v)NaN3)预处理的25μl蛋白质L-琼脂糖珠混合并使其在室温下反应15分钟。对反应性噬菌体进行离心分离，以抗体-噬菌体-蛋白L琼脂糖结合物的形式回收细胞沉淀。将细胞沉淀用TBST洗涤数次，并使用1ml pH 2.2的洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl，pH 2.2,1mg/ml BSA)洗脱。立即向其中加入pH 9.1的1M Tris-HCl溶液进行pH中和。一部分洗脱的噬菌体用于噬菌体滴定，其余用于噬菌体扩增。以与上述相同的方式对扩增的噬菌体进行淘选。在使用XC90抗体的淘选期间，在第四轮淘选后的每一轮中扩增的噬菌体的数目都增加。如图4B所示，结果表明XC90抗体特异性噬菌体的扩增。从第四轮淘选获得的噬菌体中随机选择9个噬菌体，通过DNA测序分析确定肽的表位序列，并且由此确定的9个不同序列总结于表1中。
表1 EIF3A肽表位的氨基酸序列
噬菌体 表位序列
XC90p1 FPFPSSL(SEQ ID NO:1)
XC90p2 PVRSGFP(SEQ ID NO:2)
XC90p3 LPWPSSL(SEQ ID NO:3)
XC90p4 PSRHSGW(SEQ ID NO:4)
XC90p5 PSRHSGY(SEQ ID NO:5)
XC90p6 PARHSGF(SEQ ID NO:6)
XC90p7 PARTSWP(SEQ ID NO:7)
XC90p8 PPRTGFQ(SEQ ID NO:8)
XC90p9 PARSGYP(SEQ ID NO:9)
为了检测所选噬菌体对XC90抗体的结合特异性，进行了ELISA。将所选的9个表位表达噬菌体中的每一个转染到宿主细胞中，扩增，使用PEG/NaCl溶液部分纯化，然后用作ELISA包被抗原。将1010纯化的噬菌体稀释在100μl的包被溶液(0.1M碳酸氢钠缓冲液，pH8.6)中并加入到96孔Maxisorp ELISA板的每个孔中。对于抗原包被，将添加噬菌体的板在4℃下保存16小时或更长时间。噬菌体包被后，加入300μl脱脂乳溶液(5％(w/v)脱脂乳/TBST)，并使其在室温下反应1小时以封闭抗原包被后的剩余位点。封闭后，用TBST洗涤板两次，向其中加入100ng/100μl XC90单克隆抗体，并使其在室温下反应90分钟。之后，用TBST洗涤板6次，并用以1:2500的比例稀释的二抗，抗小鼠IgGAM-HRP(Pierce)处理。二抗也在室温下反应90分钟，用TBST洗涤板六次。HRP酶的显色通过使用TMB溶液(Pierce)进行。在450nm处测量吸光度以定量抗原-抗体反应。结果，如图4C所示，在用作抗原的9个噬菌体中，XC90p2、XC90p4、XC90p6和XC90p8显示出高反应性。通过按照抗体反应性的顺序列出选择的噬菌体抗原，确认了对于抗体反应性重要的序列特征，并且如图4D所示，证实了P-x-R-x-G-x-P(P：脯氨酸，x：非特异性氨基酸，P：脯氨酸，R：精氨酸，G：甘氨酸)的序列特征对于7个氨基酸是重要的。特别地，为了检测表位是否适当地模拟癌细胞表达的抗原结构，在分析自身抗体的细胞反应性期间检测了通过加入表位表达噬菌体来竞争性抑制抗体反应。加入1011或1012pfu的噬菌体抗原并检测到抗体反应的抑制。结果如图4E所示，对XC90抗体的反应完全被抑制，而对无特异性的抗体XC246抗体的反应没有被抑制，并且随着噬菌体数目增加，非特异性反应增加。这些结果表明噬菌体抗原表位足以模拟癌细胞表达的抗原表位。分析其序列特征，结果证实具有高反应性的表位具有重复的结构特征。在以下实施例中，使用XC90p2的序列作为表位来分析对人血清的反应性。
实施例6：XC90p2表位表达体的制备
为了在ELISA中利用所述噬菌体表达的XC90p2抗原用于血清分析，需要连续的噬菌体扩增和纯化。然而，对于大规模的血清分析，获得噬菌体抗原的过程没有重复性，并且一次可以获得的噬菌体数量非常小。为此，为了用能够有效表达所述自身抗体-反应性表位且稳定纯化和获得的表位载体取代M13噬菌体，尝试了许多不同的载体蛋白质。结果，链霉亲和素用作表位载体，并且用于制备每种表达体的引物序列列于表2中。
表2用于制备表位表达体的引物序列
Figure BDA0001594687950000211
具体方法如下：如图5A所示，为了制备表达含有XC90p2抗原表位的链霉亲和素蛋白的基因，进行克隆以获得“N末端-接头-表位-接头-链霉亲和素-C末端”的序列。为了克隆成熟链霉亲和素基因，通过使用链霉菌(Streptomyces avidinii)培养物菌落作为模板，特异性引物(SEQ ID NOS：10和11)和nPfu DNA聚合酶(Solgent)进行菌落PCR。将扩增的链霉亲和素基因克隆到pTOP Blunt V2载体(Enzynomics)中，随后进行测序分析。使用限制酶NotI和XhoI将由此获得的链霉亲和素基因克隆到pET28a(+)载体(Novagen)中。
为了制备XC90p2表位序列，合成了含有接头序列如SEQ ID NOS：12和13的引物。使各引物与T4多核苷酸激酶(Takara)在37℃下反应1小时以磷酸化5'-末端，然后混合。进行PCR以使引物在95℃反应5分钟，然后缓慢冷却以制备XC90p2表位基因。为了制备最终的XC90p2表位表达载体，用NdeI和NotI限制酶消化具有链霉亲和素基因的表达载体，然后以预定比例与XC90p2表位基因混合。将连接酶(Roche)加入到混合物中，并在16℃下连接16小时。将连接混合物转化到DH5α中，并铺在含有卡那霉素的LB成分明确培养基平板上，然后在37℃温育15小时。选择平板上的菌落，并在LB成分明确液体培养基中培养。扩增的重组质粒被分离，然后进行测序分析。如图5A所示，获得了具有“N末端-接头-表位-接头-链霉亲和素-C末端”结构的XC90p2表位表达载体载体。
作为XC90p2表位表达蛋白质的对照组，制备并使用仅表达接头和链霉亲和素而不表达表位的Eph-STA。通过使用链霉亲和素模板载体和引物(SEQ ID NOS：14和15)PCR获得Eph-STA基因，并以克隆XC90p2表位表达载体的相同方式进行克隆，以获得对照蛋白质(Eph-STA)表达载体。
通过表位序列两端的半胱氨酸形成环状肽结构对于维持表位的抗体反应性是必不可少的。与二硫键形成有关的酶表达改善的Rosetta gami TMB(Novagen)菌株用作表达XC90p2表位载体的宿主，并且二硫键氧化还原酶DsbA(基因ID：8114936)额外表达以利于二硫键形成。如图5A所示，DsbA基因的克隆如下进行：制备引物(SEQ ID NOS：16和17)以获得自起始密码子的第414个上游序列，从而包含DsbA的启动子区域。通过使用BL21菌株的gDNA作为模板和nPfu DNA聚合酶(Solgent)进行PCR。用限制性内切酶(XhoI)将得到的DsbA基因和含XC90p2成熟链霉亲和素序列的pET28a(+)载体(Novagen)在37℃下消化4小时，然后将消化的载体和得到的DsbA基因以预定比例混合。向其中加入连接酶(Roche)，并在16℃下连接16小时。将连接混合物转化到DH5α中，铺在含有卡那霉素的LB成分明确的培养基平板上，然后在37℃温育12小时或更长时间。选择平板上的菌落，并在LB成分明确的液体培养基中培养。分离扩增的重组质粒，然后进行测序分析。
实施例7：XC90p2重组蛋白的表达和纯化
His-XC90p2-SA重组蛋白是通过将XC90p2表位表达载体(His-XC90p2-SA/pET28a(+))转化到Rosetta gami TMB(Novagen)菌株中，然后通过加入IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)以1mM终浓度在25℃培养所述菌株20小时。
将培养的细胞悬浮在Sepharose-Q柱结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)中，超声处理，然后离心。通过阴离子交换树脂层析进行部分纯化，在4℃缓慢地将上清液加到Sepharose-Q柱中，并向其中加入洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4，1M NaCl)。将XC90抗体反应性级分以1:1比例与Talon树脂(Clontech)柱缓冲液(pH 7.4的50mM Tris-HCl，150mM NaCl，25％甘油)混合，并在4℃将混合物缓慢加入Talon树脂。此后，用柱缓冲液洗涤柱以除去非特异性蛋白质。作洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，25％甘油，2mM PMSF，10mM咪唑)处理以进行洗脱和纯化。如图5C所示，通过在未加热/未还原的SDS-PAGE上运行，并以考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹来检测每个纯化步骤的蛋白质纯度。结果如图5B所示，分离出具有四聚链霉亲和素或更高分子量的高纯度蛋白质抗原。
实施例8：通过使用XC90p2-表达重组蛋白和对癌细胞反应的竞争性抑制检测XC90自身抗体反应性
为了检测获得的抗原对自身抗体的反应性，进行ELISA。用不同浓度的纯化的His-XC90p2-SA蛋白包被生物素板，并与不同浓度的XC90mAb反应以检测特异性反应的程度。结果如图6A所示，当抗原以0.5μg/孔的浓度包被时，检测到高达0.04ng/100μl的自身抗体XC90mAb。
此外，为了检测表达抗体特异性表位的重组蛋白是否足以模拟癌细胞表达的抗原蛋白的表位，当通过流式细胞术测量XC90抗体和细胞表达的抗原蛋白的反应时，加入XC90抗体特异性重组蛋白以检测反应是否被竞争性抑制。以与实施例1中相同的方式进行流式细胞术。作为一抗，单独处理XC90抗体，或预先将XC90抗体与纯化的His-XC90p2-SA重组蛋白质混合并反应1小时，然后处理。这两个实例相互比较。使用各0.2μg的抗体，并使用0.108ng-2μg的重组蛋白质。作为对照组，使用不表达抗原肽的His-Eph-SA重组蛋白质，并检测HepG2和HeLa细胞中的反应性。结果如图6B所示，证实His-XC90p2-SA重组蛋白以重组蛋白浓度依赖的方式抑制XC90抗体与存在于HepG2或HeLa细胞中的抗原的反应。然而，His-Eph-SA不抑制抗体反应。这些结果表明His-XC90p2-SA重组蛋白充分模拟了XC90抗体特异性抗原蛋白的表位。
实施例9：使用XC90p2表位表达重组蛋白诊断人类肝癌
刺激体内免疫系统诱导抗体反应的蛋白质抗原的表位通常限于在整个蛋白质结构中对应于大小为20个氨基酸或更少的特定区域。此外，已知表位区域的特征即使在不同的个体如人类、小鼠、山羊等中也是相似的。基于这些事实，预期从肝癌模型小鼠获得的自身抗体-反应性表位在人体中显示相同的反应，并且XC90抗体反应特异性已经确认的His-XC90p2-SA重组蛋白用于检测人类自身抗体，结果确认His-XC90p2-SA重组蛋白能够检测人血清中的自身抗体。具体方法如下：
将生物素包被的ELISA平板(Thermo)用每孔300μl封闭缓冲液(不含蛋白质的封闭缓冲液(Thermo)，5％牛血清白蛋白)在4℃封闭16小时，每孔加入用100μl封闭液稀释的200ng重组链霉亲和素蛋白质，在37℃下包被平板1小时。包被后，从平板上除去剩余的重组蛋白，然后用TBST洗涤平板两次。洗涤后，将100μl含有1％明胶的封闭缓冲液加入平板中，然后用100μl封闭缓冲液以1:100稀释的肝癌患者血清或正常人血清处理。在37℃下进行第一次抗体反应2小时，反应后剩余的抗体用TBST洗涤六次。作为二抗，将100μl用不含蛋白质的封闭液以1：2500稀释的抗人IgGAM-HRP(Pierce)处理至平板，并使其在37℃下反应90分钟。反应后，将平板用TBST洗涤6次，并加入100μl TMB溶液与HRP反应，然后测量450nm处的吸光度。重复三次或更多次用重组蛋白对人血清的ELISA以确认重现性。其中，最具代表性的结果如图7A所示。此外，通过受试者工作特性(ROC)曲线分析结果。作为诊断测试的诊断标准的截断值(Cut off value)通常在ROC曲线下的面积最大化的范围内确定。结果如图7B所示，将His-XC90p2-SA的ELISA结果中的AUC面积最大化，正常人的血清与肝癌患者的血清在1.067的截断值下，以灵敏度73.81％和特异性76.74％区分开来。这些结果表明，通过使用作为对应于本发明的XC90抗体的表位模拟物的His-XC90p2-SA重组蛋白对人血清的ELISA可以有用地应用于肝癌的诊断测试。
实施例10：XC90抗体的互补决定区(CDR)的分析和抗体的纯化
在确认XC90抗体特异性识别癌细胞中表达的抗原后，分析XC90抗体的互补决定区(CDR)的序列以获得关于相应抗体的抗体识别特异性的信息。收集106个XC90抗体产生细胞，通过RNA试剂盒(英杰公司)从5μg总RNA合成cDNA，并且1μg合成的cDNA，小鼠重链恒定区引物(SEQ ID NO：18和19)，和小鼠轻链恒定区引物(SEQ ID NO：20和21)用于进行PCR，从而扩增小鼠重链和轻链的含CDR区域(表3)。
表3用于扩增自身抗体重链和轻链的CDR的引物
Figure BDA0001594687950000241
Figure BDA0001594687950000251
通过使用TOPcloner Blunt试剂盒(Enzynomics)将扩增的区域连接至pTOP BluntV2载体。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，从转化的大肠杆菌中提取质粒，然后进行测序分析。从分析的核苷酸序列确定蛋白质序列，并基于Kabat CDR定义进行分析。如图8所示，确定了XC90抗体的重链。如图9所示，确定了XC90抗体的轻链。
通过实施例，确认了各种产生自身抗体的克隆。在这些克隆中，特别是在本发明中表征了源自XC90克隆的抗体，并且证实在癌症患者的血清中检测到该克隆是可能的，由此被认为是肿瘤相关的自身抗体标志物。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，可以在不改变其技术精神或基本特征的情况下以不同的具体形式来实现本发明。因此，应该理解，上述实施例不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本发明的范围由所附权利要求限定，而不是由在其之前的描述限定，因此落入权利要求的边界和范围内的所有变化和修改，或者这种边界和范围的等同物因此旨在被权利要求所包含。
本发明的效果
当将本发明的抗EIF3A自身抗体用作肝癌的诊断标志物时，仅通过使用非侵入性生物样品如血液、血浆、血清和淋巴液而不使用侵入性组织样品，可以76.74％的特异性和73.81％的敏感性诊断出肝癌的发病率。此外，在本发明中鉴定了与标志物反应的肽的序列。因此，不需要设计用于标志物鉴定的复杂反应物质，并且仅使用鉴定的氨基酸序列就可以容易地诊断肝癌，从而导致诊断产品例如肝癌诊断试剂盒的有效开发。
Figure BDA0001594687950000261
<110> 韩国生命工学研究院
普默特株式社
<120> 包含用于检测抗-外泌体EIF3A自身抗体的抗原的组合物及其用于诊断肝癌的应用
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<151> 2015-07-10
<160> 29
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p1 表位
<400> 1
Phe Pro Phe Pro Ser Ser Leu
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p2 表位
<400> 2
Pro Val Arg Ser Gly Phe Pro
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p3 表位
<400> 3
Leu Pro Trp Pro Ser Ser Leu
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p4 表位
<400> 4
Pro Ser Arg His Ser Gly Trp
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p5 表位
<400> 5
Pro Ser Arg His Ser Gly Tyr
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p6 表位
<400> 6
Pro Ala Arg His Ser Gly Phe
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p7 表位
<400> 7
Pro Ala Arg Thr Ser Trp Pro
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p8 表位
<400> 8
Pro Pro Arg Thr Gly Phe Gln
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p9 表位
<400> 9
Pro Ala Arg Ser Gly Tyr Pro
1 5
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 链霉亲和素的F-引物
<400> 10
gcggccgcag gttcgggttc ggccgacccc tccaaggact cg 42
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 链霉亲和素的R-引物
<400> 11
ctcgagtcat cactgctgaa cggcgtcgag 30
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p2表位的F-引物
<400> 12
tatgggtggt gcgtgcccgg ttcgttctgg tttcccgtgc ggtggaggtt cggc 54
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> XC90p2表位的R-引物
<400> 13
ggccgccgaa cctccaccgc acgggaaacc agaacgaacc gggcacgcac caccca 56
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Eph-STA的F-引物
<400> 14
catatgggtg gtgcggccgc aggttcgggt 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Eph-STA的R-引物
<400> 15
ctcgagtcat cactgctgaa cggcgtcgag 30
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DsbA的F-引物
<400> 16
ctcgagcacc accaccacca ccactgatga attattgaag cttatgaaga attt 54
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DsbA的R-引物
<400> 17
ctcgagttat tattttttct cggacagata tt 32
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链恒定区的F-引物
<400> 18
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链恒定区的R-引物
<400> 19
ggaagatctg acatttggga aggactgact ctc 33
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链恒定区的F-引物
<400> 20
gggagctcga yattgtgmts acmcarwctm ca 32
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链恒定区的R-引物
<400> 21
ggtgcatgcg gatacagttg gtgcagcatc 30
<210> 22
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 22
Xaa Val Lys Leu Xaa Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Tyr Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val
115 120 125
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 23
Asp Ile Val Ile Thr Gln Xaa Xaa Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser
115
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 24
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His
1 5 10
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 25
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 26
Gly Ser Tyr Ala Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 27
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 28
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 29
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5

Claims (8)

1.与EIF3A即真核翻译起始因子3亚基A蛋白特异性结合的自身抗体或包含其抗原结合位点的片段；
其中，所述自身抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由SEQ IDNO：24的氨基酸序列所表示的重链CDR1；由SEQ ID NO：25的氨基酸序列所表示的重链CDR2；和由SEQ ID NO：26的氨基酸序列所表示的重链CDR3，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：27的氨基酸序列所表示的轻链CDR1的；由SEQ ID NO：28的氨基酸序列所表示的轻链CDR2；和由SEQ ID NO：29的氨基酸序列所表示的轻链CDR3；
并且，其中所述的包含其抗原结合位点的片段是Fab、Fv、F(ab’)2或scFv。
2.根据权利要求1所述的自身抗体或片段，其中所述自身抗体通过登录号KCTC12590BP保藏的杂交瘤细胞系产生。
3.一种杂交瘤细胞系，其产生权利要求1-2中任一项所述的特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体；
并且所述杂交瘤细胞系以登录号KCTC 12590BP保藏。
4.一种抗原决定簇多肽，其特异性结合至权利要求1-2中任一项所述的特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体，并且由选自SEQ ID NOS：1-9的氨基酸序列所表示。
5.一种用于诊断肝癌的组合物，其包含测量权利要求1-2中任一项所述的特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体或片段的表达水平的试剂；其中所述测量所述自身抗体的表达水平的试剂是特异性结合所述自身抗体的多肽；其中所述多肽包含由选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列所表示的抗原决定簇肽。
6.一种诊断肝癌的试剂盒，其包含权利要求5所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于选自下组的方法：Western印迹、酶联免疫吸附测定、放射免疫测定法、放射免疫扩散法、琼脂免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫组织化学染色法、免疫沉淀测定法、补体结合试验、荧光激活细胞分选、蛋白质芯片检测和其组合。
8.一种筛选肝癌治疗剂的方法，所述方法包括：
（a）测量除人以外的个体中特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体的表达水平；所述的自身抗体为权利要求1所述的与EIF3A即真核翻译起始因子3亚基A蛋白特异性结合的自身抗体；
（b）向所述个体施用候选的肝癌治疗剂；
（c）测量施用候选的治疗剂的个体中特异性结合EIF3A蛋白的自身抗体的表达水平；和
（d）当在步骤（c）中测量的表达水平低于在步骤（a）中测量的表达水平时，确定候选治疗剂为肝癌治疗剂。
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