WO2020204665A1 - Tuba1c 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물 - Google Patents

Tuba1c 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물 Download PDF

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tuba1c
prognosis
diagnosis
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김현구
홍성회
박용
최연호
최병현
박지호
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고려대학교 산학협력단
한국과학기술원
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a marker composition for diagnosing cancer or predicting prognosis, including exosomes overexpressing TUBA1C (Tubulin alpha-1C chain) protein.
  • TUBA1C Tubulin alpha-1C chain
  • a tumor is a product of uncontrolled and disordered cell proliferation that occurs due to an excess of abnormal cells, and if such a tumor has destructive proliferative, infiltrating, and metastatic properties, it is classified as a malignant tumor, that is, cancer. .
  • the means for diagnosing cancer include methods of using X-ray imaging, endoscopy, and biopsy.
  • these methods have the advantage of relatively simple examination process, the diagnosis success rate is not high, or there are problems with hygiene problems and patient pain during the examination. I need this.
  • TUBA1C Tubulin alpha-1C chain protein specifically expressed in exosomes derived from cancer cells
  • the present invention was completed by confirming that it is possible to accurately and quickly diagnose cancer or predict the prognosis when using.
  • an object of the present invention is a marker composition that can be used as a non-invasive method and can improve the accuracy of cancer diagnosis, and a composition comprising TUBA1C (Tubulin alpha-1C chain) protein overexpression exosomes and cancer diagnosis using the same Or, it provides a method of providing information necessary for predicting prognosis.
  • TUBA1C Tubulin alpha-1C chain
  • a marker composition for diagnosing cancer or predicting prognosis including exosomes overexpressing a TUBA1C (Tubulin alpha-1C chain) protein.
  • TUBA1C Tubulin alpha-1C chain
  • the exosome may further include a GRIP and coiled-coil domain-containing protein (GCC2) protein.
  • GCC2 coiled-coil domain-containing protein
  • the cancer may be lung cancer, thymus cancer or esophageal cancer.
  • a primer or probe that specifically binds to the TUBA1C gene in exosomes; And an antibody that specifically binds to TUBA1C protein in exosomes.
  • a composition for diagnosing cancer or predicting prognosis comprising any one or more of them is provided.
  • the composition a primer or probe that specifically binds to the GCC2 gene in the exosome; And an antibody that specifically binds to the GCC2 protein in exosomes. It may further include any one or more of.
  • the cancer may be lung cancer, thymus cancer or esophageal cancer.
  • kits for diagnosing cancer or predicting prognosis including the composition.
  • the kit may be at least one selected from the group consisting of an RT-PCR kit, a microarray chip kit, a DNA kit, and a protein chip kit.
  • a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of cancer comprising measuring the expression level of the TUBA1C gene or protein in an exosome isolated from a biological sample Is provided.
  • the step of measuring the expression level of the GCC2 gene or protein in the exosome may be further included.
  • the biological sample may be one or more selected from the group consisting of whole blood, serum, plasma, saliva, urine, sputum, lymph fluid, and cells.
  • the marker composition of the present invention contains TUBA1C protein that is specifically highly expressed in exosomes of cancer patients, it is possible to diagnose cancer or predict the prognosis with high accuracy and non-invasiveness through measurement of its expression level.
  • the marker composition of the present invention may further improve the sensitivity and accuracy of cancer diagnosis by using TUBA1C and GCC2 overexpressed in exosomes as dual biomarkers.
  • 1 is an ELISA result comparing the expression levels of GCC2 and TUBA1C proteins from blood-derived exosomes of lung cancer patients and normal groups.
  • 2 is an ELISA result comparing the expression level of TUBA1C protein in plasma-derived exosomes of esophageal cancer patients with normal controls.
  • 3 is an ELISA result of comparing the expression level of TUBA1C protein in plasma-derived exosomes of thymic cancer patients with normal controls.
  • 4 is an ELISA result obtained by dividing the expression levels of TUBA1C and GCC2 proteins in blood-derived exosomes of lung cancer patients by radix.
  • 5 is an ROC curve for confirming a change in the sensitivity of diagnosis of lung cancer when two markers are used in combination compared to the case of using TUBA1C and GCC2 alone.
  • a marker composition for diagnosing cancer or predicting prognosis including exosomes overexpressing a TUBA1C (Tubulin alpha-1C chain) protein.
  • the exosome may further include a GRIP and coiled-coil domain-containing protein (GCC2) protein.
  • TUBA1C protein overexpressing exosome and "GCC2 protein overexpressing exosome” refer to exosomes that express GCC2 or TUBA1C protein at a higher level compared to exosomes existing in normal cells.
  • the exosome is a small vesicle of nano size (30 ⁇ 150 nm) secreted from most cells. It is known that the inside of exosomes and the bilateral membrane of phospholipids contain various kinds of proteins, genetic materials (DNA, mRNA, miRNA), and lipids derived from cells. In addition, it has been reported that tissue-derived exosomes reflect the state of the tissue that secreted them, and thus can be used for diagnosis of diseases.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that when using the TUBA1C or GCC2 protein specifically expressed in the exosomes of cancer patients, it is possible to accurately and quickly diagnose cancer or predict the prognosis.
  • cancer includes all cancers, lung cancer, esophageal cancer, thymus cancer, breast cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, skin cancer, prostate cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, bladder cancer, head and neck cancer, bone marrow cancer, biliary tract Cancer and the like may be exemplified, but the present invention is not limited thereto, and preferably lung cancer, esophageal cancer, or thymus cancer.
  • diagnosis means to determine the presence or characteristics of a pathological condition, that is, whether or not cancer has occurred.
  • prognosis refers to determining whether the individual has recurrence, metastasis, drug reactivity, or resistance after cancer treatment. This may include not only the cancer onset of the individual by measuring the expression level of TUBA1C or GCC2 in the exosomes isolated from the sample of the individual, but also the concept of predicting whether the survival prognosis of the individual is good in the future.
  • cancer can be diagnosed or the prognosis can be predicted by measuring the expression level of TUBA1C or GCC2 protein derived from exosomes, primers or probes that specifically bind to their genes, or antibodies that specifically bind to proteins are used. It can be used as a composition for diagnosing cancer or predicting prognosis.
  • the present invention can provide a kit for cancer diagnosis or prognosis in which any one or more of a primer, a probe that specifically binds to the TUBA1C or GCC2 gene, and an antibody that specifically binds to the TUBA1C or GCC2 protein is applied. .
  • the kit may include, but is not limited to, an RT-PCR kit, a microarray chip kit, a DNA kit, and a protein chip kit.
  • the kit can diagnose lung cancer or predict prognosis by checking and detecting the expression level in exosomes of TUBA1C, GCC2 genes or proteins corresponding to the markers.
  • the kit may include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analysis methods.
  • the kit may include a substrate for immunological detection of an antibody, an appropriate buffer solution, a secondary antibody labeled with a color developing enzyme or a fluorescent substance, and a color developing substrate.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, and a slide glass made of glass, and the coloring enzyme is peroxidase, alkaline Phosphatase (alkaline phosphatase), etc.
  • the color developing substrate liquid is ABTS (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-) Sulfonic acid)) or OPD (O-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) may be used, but is not limited thereto.
  • a method of providing information necessary for diagnosis or prognosis of cancer comprising measuring the expression level of the TUBA1C gene or protein in an exosome isolated from a biological sample Is provided.
  • the method of the present invention may further include measuring the expression level of the GCC2 gene or protein in exosomes to improve the sensitivity and accuracy of cancer diagnosis.
  • the biological sample may be one or more selected from the group consisting of whole blood, serum, plasma, saliva, urine, sputum, lymphatic fluid, and cells, preferably whole blood or cells, but is not limited thereto.
  • the gene expression level measurement is a process of determining the presence and expression level of mRNA of TUBA1C and GCC2 genes from a biological sample for diagnosis or prognosis of cancer, and means measuring the amount of mRNA expression.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • assay Northern blotting, DNA chip, etc., but are not limited thereto.
  • the measurement of the protein expression level refers to a process of determining the presence and expression level of TUBA1C and GCC2 proteins from a biological sample for diagnosis or prognosis of cancer.
  • Protein chip analysis immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption) analysis methods for measuring or comparing the expression level of the protein /Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radiation immunity analysis, radioactive immunity diffusion method, octeroni immunity diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation analysis method, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-mass spectrometry (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting, and ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay), but are not limited thereto.
  • MALDI-TOF Microx Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrome
  • the screening of candidate therapeutic substances may be applied.
  • a candidate substance for cancer treatment is treated in a biological sample isolated from a cancer patient, and the expression level of the TUBA1C gene or protein is confirmed in the exosomes therein, the candidate substance effectively functions as a cancer treatment. Can be confirmed.
  • the obtained culture solution was centrifuged at 10,000 g for 30 minutes to remove cell debris, and then passed through a 0.45 ⁇ m and 0.22 ⁇ m filter sequentially to remove relatively bulky substances preferentially. Subsequently, the filtered cell culture solution was concentrated using an Amicon tube 100K (Millipore, USA) leaving only particles of the desired size.
  • the concentrated cell culture solution was separated only from particles having an exosome size (50-100 nm) using a column liquid chromatography method, and concentrated again using an Amicon tube 100K.
  • the concentrated exosomes were obtained using RIPA lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, USA) to obtain proteins, and the results of proteomic analysis were obtained by requesting the Korea Basic Science Institute (KBSI).
  • KBSI Korea Basic Science Institute
  • TUBA1C Tubulin alpha-1C chain
  • GCC2 GRIP and coiled-coil domain-containing protein 2
  • Example 2 Measurement of expression levels of GCC2 and TUBA1C in exosomes of lung cancer patients
  • exosomes containing GCC2 and TUBA1C proteins selected in Example 1 can be used as markers for diagnosis or prognosis of lung cancer
  • Example 3 Measurement of TUBA1C expression level in exosomes of patients with esophageal cancer and thymic cancer
  • exosomes were extracted from plasma samples of 5 normal subjects and 5 esophageal cancer patients, and then the TUBA1C protein concentration in the sample was confirmed using a TUBA1C ELISA KIT (Mybiosource's TUBA1C ELISA KIT (Cat No. MBS9336377)).
  • the average concentration of exosome-derived TUBA1C protein was 939.306 ng/ml in normal subjects, whereas the average concentration of exosome-derived TUBA1C protein was 1236.764 ng/ml in esophageal cancer patients.
  • the concentration of exosome-derived TUBA1C protein in esophageal cancer patients was increased by 1.36 times compared to that of normal subjects, and the p value was 0.021, indicating statistically significant.
  • the TUBA1C protein concentration in the sample was checked using the TUBA1C ELISA KIT (Mybiosource's TUBA1C ELISA KIT (Cat No. MBS9336377)). I did.
  • the average concentration of exosome-derived TUBA1C protein was 909.306ng/ml, whereas in esophageal cancer patients, the average concentration of exosome-derived TUBA1C protein was measured very high as 3503.15ng/ml. Became.
  • the concentration of exosome-derived TUBA1C protein in esophageal cancer patients was increased by 3.85 times compared to that of normal subjects, and the p value was 0.005, indicating statistical significance.
  • Example 4 Evaluation of diagnostic utility of TUBA1C and GCC2 as dual biomarkers
  • the AUC when GCC2 and TUBA1C antibodies were treated at the same time, the AUC was identified as 1 (P 0.0000963), so that when TUBA1C and GCC2 were used as dual biomarkers than when TUBA1C or GCC2 were used alone, a more precise diagnosis was possible. I could confirm.

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따르면, TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물, 키트 및 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome) 내 TUBA1C 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

Description

TUBA1C 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물
본 발명은 TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물에 관한 것이다.
종양(tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고 무질서한 세포증식의 산물이며, 이와 같은 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지면 악성종양(malignant tumor), 즉 암으로 분류하게 된다.
현재 암을 진단하기 위한 검사 수단은 X선 촬영, 내시경 검사, 조직검사 등을 이용하는 방법이 있다. 그러나, 이와 같은 방법들은 검사 과정이 비교적 간단하다는 장점에도 불구하고, 진단 성공률이 높지 않거나 위생상의 문제점 및 검사가 진행되는 과정에서 환자의 고통이 수반되는 문제가 있기 때문에 이를 대체하기 위한 암의 진단 방법이 필요하다.
암을 치료하기 위해서는 치료 이전 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단이 중요하다 할 것이며, 이러한 진단을 통해 초기 단계에서 암이 발견되어야 높은 완치율을 나타낼 수 있다.
따라서, 비침습성이며 고감도 및 고특이성으로 암을 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되는 실정이나, 현재까지 암 진단에 있어서 초기에 특이적으로 병소를 감지하여 발병 여부를 판단하는 분자적 진단 기술은 미미하고, 더욱이 특정 암에 특이적으로 적용되는 방법은 전무한 상황이다.
[선행특허문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허 제10-2080887호
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 엑소좀 유래의 신규한 암 진단 또는 예후 예측용 마커를 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 암세포 유래 엑소좀에서 특이적으로 발현하고 있는 TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질을 이용할 경우 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 비침습적인 방법으로 이용할 수 있으면서도 암 진단의 정확도를 향상시킬 수 있는 마커 조성물로서, TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 엑소좀은 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질을 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 암은 폐암, 흉선암 또는 식도암일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 엑소좀 내 TUBA1C 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 엑소좀 내 TUBA1C 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 중 어느 하나 이상을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은, 엑소좀 내 GCC2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 엑소좀 내 GCC2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 암은 폐암, 흉선암 또는 식도암일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 키트가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome) 내 TUBA1C 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 엑소좀 내 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 마커 조성물은 암 환자의 엑소좀에서 특이적으로 높게 발현되는 TUBA1C 단백질을 포함하므로, 이의 발현 수준 측정을 통해 비침습적이면서도 높은 정확도로 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있다.
또한, 본 발명의 마커 조성물은 엑소좀에서 과발현되는 TUBA1C 및 GCC2을 이중 바이오마커로 이용함으로써 암 진단의 민감도와 정확도를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 폐암 환자와 정상군의 혈액 유래 엑소좀으로부터 GCC2 및 TUBA1C 단백질의 발현 수준을 비교한 ELISA 결과이다.
도 2는 식도암 환자의 혈장 유래 엑소좀 내 TUBA1C단백질의 발현 수준을 정상 대조군과 비교한 ELISA 결과이다.
도 3은 흉선암 환자의 혈장 유래 엑소좀 내 TUBA1C단백질의 발현 수준을 정상 대조군과 비교한 ELISA 결과이다.
도 4는 폐암 환자의 혈액 유래 엑소좀 내 TUBA1C 및 GCC2 단백질의 발현 수준을 기수별로 나누어 측정한 ELISA 결과이다.
도 5는 TUBA1C과 GCC2 단독으로 사용하는 경우 대비, 두 마커를 병용하였을 때 진단 폐암 진단의 민감도 변화를 확인하는 ROC 커브이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물이 제공된다. 또한, 상기 엑소좀은 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "TUBA1C 단백질 과발현 엑소좀" 및 "GCC2 단백질 과발현 엑소좀"은 정상 세포 내에 존재하는 엑소좀에 비해 GCC2나 TUBA1C 단백질을 높은 수준으로 발현하는 엑소좀을 의미한다.
엑소좀(exosome)은 대부분의 세포에서 분비되는 나노 크기(30~150㎚)의 작은 소포체이다. 엑소좀 내부 및 인지질 이중측막에는 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 조직 유래의 엑소좀은 이를 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.
이에 본 발명자들은 암 환자의 엑소좀 내 특이적으로 발현하는 TUBA1C 또는 GCC2 단백질을 이용하는 경우 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
여기서, 암은 모든 암을 포함하는 것으로, 폐암, 식도암, 흉선암, 유방암, 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 전립선암, 난소암, 갑상선암, 방광암, 두경부암, 골수암, 담도암 등을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 폐암, 식도암 또는 흉선암 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징, 즉 암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미한다. 또한, "예후"는 암 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 여부를 판단하는 것을 의미한다. 이는 개체의 시료로부터 분리된 엑소좀 내 TUBA1C 또는 GCC2의 발현 수준을 측정함으로써 해당 개체의 암 발병 여부만이 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋은 지 여부에 대해서 예측하는 개념까지 포함할 수 있다.
이와 같이, 엑소좀에서 유래한 TUBA1C 또는 GCC2 단백질의 발현 수준 측정을 통해 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있으므로, 이의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머나 프로브, 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 암 진단 또는 예후 예측용 조성물로 이용할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 TUBA1C또는 GCC2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 및 TUBA1C 또는 GCC2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 어느 하나 이상을 적용한 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공할 수 있다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 단백질 칩 키트 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 키트는 마커에 해당하는 TUBA1C, GCC2 유전자 또는 단백질의 엑소좀 내 발현 수준을 확인하여 이를 검출함으로써 폐암 진단 또는 예후 예측을 할 수 있다.
상기 키트에는 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 선택적으로 마커를 인지하는 프라이머, 프로브 또는 항체 외에도, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있으며, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome) 내 TUBA1C 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 암 진단의 민감도와 정확도를 향상시키기 위해 엑소좀 내 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 전혈 또는 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유전자 발현 수준 측정은 암의 진단 또는 예후 예측을 위해 생물학적 시료로부터 TUBA1C, GCC2 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 발현량을 측정하는 것을 의미한다.
이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질 발현 수준 측정은 암의 진단 또는 예후 예측을 위해 생물학적 시료로부터 TUBA1C, GCC2 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다.
상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량 분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 TUBA1C, GCC2 유전자 또는 단백질 발현 수준을 측정한 뒤 정상 대조군과 비교하여 그 발현 수준이 정상 대조군보다 높은 경우, 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 암 환자로부터 채취한 생물학적 시료에 암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 내 TUBA1C 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법의 연장선에서, 상기 치료제 후보물질 스크리닝이 적용될 수 있다. 즉, 암 치료제 후보물질을 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 처리한 뒤, 그 내부에 존재하는 엑소좀에서 TUBA1C 유전자 또는 단백질의 발현 수준 감소를 확인하는 경우, 해당 후보물질이 암 치료제로서 효과적으로 기능한다는 것을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 엑소좀 분리 및 단백체 분석 준비
5종의 폐암 세포주(H522, A549, H1650, PC9, H1299), 흉선암 세포주 및 식도암 세포주를 각각 지름 150㎜의 디쉬에서 배양하였다. 이 때, 초고속원심분리기를 이용하여 120,000g로 4시간 동안 원심분리하여 엑소좀을 제거한 FBS(Fetal Bovine Serum)의 상층액을 배양액으로 사용하였다. 상기 배양액을 이용하여 세포가 70-80% confluency 상태가 되도록 2-3일 동안 연속 배양하였다.
얻어진 배양액을 10,000g에서 30분 동안 원심분리하여 cell debris를 제거하고, 0.45㎛, 0.22㎛ 필터에 순차로 통과시켜 상대적으로 부피가 큰 물질들을 우선적으로 제거하였다. 이후 여과된 세포배양액은 Amicon tube 100K(Millipore, USA)를 이용하여 원하는 크기의 입자만 남기고 농축하였다.
다음으로, 농축된 세포배양액을 column liquid chromatography 방법을 이용하여 엑소좀 크기(50-100㎚)의 입자만을 분리하고, Amicon tube 100K를 이용하여 다시 농축하였다.
농축된 엑소좀은 RIPA lysis buffer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 단백질을 얻어내고, 한국기초과학지원연구원(KBSI)에 의뢰하여 단백체 분석 결과를 얻었다.
이를 토대로 암 세포주의 엑소좀에서 과발현되는 TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 및 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein 2)를 최종 선별하였다.
실시예 2: 폐암 환자의 엑소좀 내 GCC2 및 TUBA1C 발현 수준 측정
상기 실시예 1에서 선별한 GCC2 및 TUBA1C 단백질을 포함한 엑소좀이 폐암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성이 있는지 확인하기 위하여, 정상군(n=3)과 폐암 환자군(n=5)의 혈액에서 추출한 엑소좀으로부터 GCC2 및 TUBA1C의 발현 수준을 ELISA(Enzyme linked immunoassay) 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상군(control)에 비해 폐암 환자군에서 GCC2 및 TUBA1C의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 폐암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 특성을 확인하기 위하여, 병원에 내원하는 1 ~ 3기의 폐암 환자 20명으로부터 혈액을 채취하였고, Exoquick(Systembio, USA)를 이용하여 혈장으로부터 엑소좀을 분리하였다. 분리된 혈액 유래 엑소좀에서 유래한 GCC2 및 TUBA1C의 발현 수준은 ELISA 분석을 통해 확인하였다(GCC2: Mybiosource사의 GRIP and coiled-coil domain containing proten 2 ELISA KIT (Cat No. MBS9330667), 2) TUBA1C: Mybiosource사의 TUBA1C ELISA KIT (Cat No. MBS9336377)). 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 정상군에 비해 모든 폐암 기수에서 GCC2 및 TUBA1C의 발현량이 유의하게 증가하고, 폐암 기수가 증가함에 따라 GCC2 및 TUBA1C의 발현량도 함께 증가하는 것이 확인되었다.
실시예 3: 식도암 및 흉선암 환자의 엑소좀 내 TUBA1C 발현 수준 측정
먼저, 정상인 5명, 식도암 환자 5명의 혈장(plasma) 시료로부터 엑소좀을 추출한 후, TUBA1C ELISA KIT(Mybiosource사의 TUBA1C ELISA KIT (Cat No. MBS9336377))를 이용하여 시료 내 TUBA1C 단백질 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상인의 경우 엑소좀 유래 TUBA1C 단백질의 평균 농도가 939.306ng/ml으로 나타난 반면, 식도암 환자에서는 엑소좀 유래 TUBA1C 단백질의 평균 농도가 1236.764ng/ml로 높게 측정되었다. 식도암 환자의 엑소좀 유래 TUBA1C 단백질 농도는 정상인에 비하여 1.36배 증가하였으며, p value는 0.021로 나타나 통계적으로 유의함을 확인할 수 있었다.
다음으로, 정상인 5명, 흉선암 환자 5명의 혈장(plasma) 시료로부터 엑소좀을 추출한 후, TUBA1C ELISA KIT(Mybiosource사의 TUBA1C ELISA KIT (Cat No. MBS9336377))를 이용하여 시료 내 TUBA1C 단백질 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상인의 경우 엑소좀 유래 TUBA1C 단백질의 평균 농도가 909.306ng/ml으로 나타난 반면, 식도암 환자에서는 엑소좀 유래 TUBA1C 단백질의 평균 농도가 3503.15ng/ml로 매우 높게 측정되었다. 식도암 환자의 엑소좀 유래 TUBA1C 단백질 농도는 정상인에 비하여 3.85배 증가하였으며, p value는 0.005로 나타나 통계적으로 유의함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: TUBA1C 및 GCC2의 이중 바이오마커로서의 진단적 유용성 평가
암 진단을 위해 TUBA1C 및 GCC2를 이중 바이오마커로 이용하는 경우의 유용성을 평가하기 위해, TUBA1C과 GCC2 단독으로 사용하는 경우와 두 마커를 병용하는 경우의 진단 민감도 변화를 ROC 커브로 확인하였다. 구체적으로, 정상인 7명, 폐암 환자 21명의 혈장(plasma)에서 엑소좀을 추출한 후 GCC2 ELISA KIT, TUBA1C ELISA KIT을 이용하여 엑소좀 내 GCC2, TUBA1C 단백질의 농도를 구한 후 통계적으로 ROC 커브를 이용하여 AUC 값을 확인하였으며, 이를 도 5에 나타냈다.
도 5를 참고하면, GCC2 항체 단독으로 사용하는 경우 AUC는 0.905 (p = 0.002) 이고, TUBA1C 항체 단독으로 사용하는 경우의 AUC 값은 0.8787 (p = 0.003)였다. 반면에, GCC2 및 TUBA1C 항체를 동시에 처리한 경우, AUC는 1 (P 0.0000963)으로 확인되어, TUBA1C이나 GCC2를 단독으로 사용하였을 때보다 TUBA1C 및 GCC2를 이중 바이오마커로 사용할 경우 더욱 정밀한 진단이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (11)

  1. TUBA1C(Tubulin alpha-1C chain) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질을 더 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 흉선암 또는 식도암인, 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
  4. 엑소좀 내 TUBA1C 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 엑소좀 내 TUBA1C 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 중 어느 하나 이상을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은, 엑소좀 내 GCC2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 엑소좀 내 GCC2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체; 중 어느 하나 이상을 더 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 흉선암 또는 식도암인, 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  7. 제4항 또는 제5항의 조성물을 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  9. 생물학적 시료로부터 분리된 엑소좀(exosome) 내 TUBA1C 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 엑소좀 내 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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