WO2015102208A1 - 줄기세포 배양방법을 이용하여 발굴된 유방암 줄기세포 마커를 이용한 유방암 예후 예측용 조성물 - Google Patents

줄기세포 배양방법을 이용하여 발굴된 유방암 줄기세포 마커를 이용한 유방암 예후 예측용 조성물 Download PDF

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protein
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prognosis
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남정석
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가천대학교 산학협력단
(의료)길의료재단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for predicting breast cancer prognosis using breast cancer stem cell marker, and more particularly, the present invention relates to the mRNA level of the breast cancer stem cell marker gene or the level of protein expressed therefrom. It relates to a composition for predicting breast cancer prognosis comprising an agent to be measured, a kit for predicting breast cancer prognosis comprising the composition, and a diagnostic method for predicting the prognosis of a breast cancer patient using the composition or kit.
  • Prognostic indicators provide many information about the prognosis as well as tumor size, lymph node status and histological grade and include many common factors, such as molecular markers that are likely to respond to a particular therapeutic agent. For example, steroid hormone receptor status measurements of estrogen (ER) and progesterone (PR) are commonly performed to evaluate breast cancer patients. Tumors that are hormone receptor positive must be responsive to hormone therapy, and typically also proliferate less actively, so the prognosis of patients with ER + / PR + tumors is better.
  • ER estrogen
  • PR progesterone
  • HER-2 / neu human epidermal growth factor receptor 2
  • trastuzumab Herceptin; Genentech
  • an anti-Her-2 / neu antibody therapeutic has been developed using Her2 / neu expression levels in breast tumors.
  • tumor suppressor gene p53 which is known to be associated with increased aggressiveness of the disease and poor prognosis.
  • Ki-67 a cell proliferation marker with non-histone nuclear proteins, has been demonstrated to correlate with poor prognosis of breast cancer.
  • Cancer stem cells refer to primitive cells that trigger cancer in cancer cells, and are known to exist separately from cancer cells and have characteristics of normal stem cells. If there are cancer stem cells that cause breast cancer in the patient's body after treatment of breast cancer, the presence of such breast cancer-derived cancer stem cells may occur because the cancer stem cells may have a poor prognosis such as recurrence or metastasis of breast cancer. By detecting, it is expected that the recurrence and prognosis of breast cancer can be evaluated. However, a method for detecting breast cancer-derived cancer stem cells has not been developed yet, and a method using breast cancer-derived cancer stem cells has not been utilized.
  • the inventors of the present invention sought to develop a method for predicting prognosis such as recurrence or metastasis of breast cancer by detecting breast cancer-derived cancer stem cells.
  • the inventors found a gene whose expression level is specifically changed in breast cancer-derived cancer stem cells.
  • the gene is used as a gene marker of breast cancer-derived cancer stem cells, it has been confirmed that the prognosis of breast cancer can be predicted by detecting breast cancer-derived cancer stem cells, thereby completing the present invention.
  • One object of the present invention to provide a composition for predicting breast cancer prognosis comprising an agent for measuring the expression level of marker genes of breast cancer-derived cancer stem cells.
  • Another object of the present invention to provide a kit for predicting breast cancer prognosis comprising the composition.
  • Another object of the present invention to provide a diagnostic method for predicting the prognosis of breast cancer comprising measuring the expression level of the marker gene of breast cancer-derived cancer stem cells using the composition or kit.
  • composition or kit of the present invention When the composition or kit of the present invention is used to treat breast cancer in breast cancer patients, the prognosis such as recurrence or metastasis can be effectively predicted, and thus, it can be widely used for effective treatment of breast cancer.
  • 1 is a heatmap showing a result of analyzing a gene whose expression pattern is changed in a 4T1 mouse breast cancer cell line cultured by a stem cell culture method compared to a cultured cell culture.
  • Figure 2 is a graph showing the results of the analysis of the gene expression changes in 4T1 mouse breast cancer cell line cultured by the stem cell culture method by Ingenuity Pathways Analysis (IPA) compared to normal cell cultured cells.
  • IPA Ingenuity Pathways Analysis
  • the present inventors have been paying attention to the difference between the cultivation method of normal cells and stem cells during various studies to develop a method for evaluating the recurrence and prognosis of breast cancer by detecting cancer stem cells derived from breast cancer.
  • the cells are cultured in the form of cells attached to the bottom of the culture vessel, while the stem cells are cultured in a suspended state without being attached to the bottom of the culture vessel. It forms a form, and when cultured in the form of globules, it is known that normal cells, not stem cells, are killed.
  • the present inventors were able to obtain cancer cells and cancer stem cells, respectively, as a result of culturing the cancer cell lines by the normal cell culture method and the stem cell culture method, respectively, the expression level of the same gene in the obtained cancer cells and cancer stem cells By analyzing, we tried to select genes whose expression level is significantly changed in cancer stem cells.
  • the genes whose expression levels were increased more than two times in cancer stem cells cultured by stem cell culture method compared to cancer cells cultured by general cell culture method were Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr, Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1 and Wisp2 were confirmed, and the genes whose expression levels were reduced more than two times were Birc5, Dab2, Gdf5 and Gdnf.
  • the gene whose expression level is changed can be said to be a gene whose expression level is specifically changed in breast cancer-derived cancer stem cells
  • the gene whose expression level is changed can be utilized as a marker gene of cancer stem cells, and in view of the characteristics of cancer stem cells, breast cancer It has been determined that marker genes can be used to determine whether a patient has a poor prognosis including recurrence, tumor growth, drug resistance, or metastasis after treatment.
  • the present invention comprises an agent for measuring the mRNA level of a gene selected from the group consisting of Cdon, Cebpd, T or a combination thereof or the level of protein expressed therefrom, Provided is a composition for predicting breast cancer prognosis.
  • Cdon gene refers to a gene encoding Cell adhesion molecule-related / down-regulated by oncogenes, which protein is used as a surface receptor of immunoglobulin (Ig) / fibronectin type III. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001243597).
  • Cebpd gene refers to a gene encoding CCAAT / enhancer-binding protein delta, which is used as a bZIP transcription factor that binds to DNA in the form of a homodimer. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_005195).
  • T gene means a gene encoding Brachyury, which is used as a transcription factor in the T-box of a gene. It plays a role in controlling EMT (epithelial-mesenchymal transition) and invasion. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_009309).
  • prognostic prediction refers to a process of predicting a treatment result of a pathological condition by collecting data on the progress of a pathological condition and a treatment procedure.
  • the prognostic prediction may be interpreted as determining the possibility of recurrence, tumor growth, drug resistance or metastasis after treatment of breast cancer.
  • the term "agent for measuring mRNA level of a gene” refers to an agent used in a method for measuring the level of mRNA transcribed from the target gene in order to confirm the expression of a target gene included in a sample.
  • RT-PCR RT-PCR
  • Competitive RT-PCR RT-PCR
  • Real-time RT-PCR RNase protection assay (RPA)
  • Northern blotting It may be a probe or a primer that can specifically bind to a target gene used in a method such as DNA chip analysis, but is not particularly limited thereto.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and is the starting point for template strand copying. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as. Primers can be initiated for DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • the primer may be a primer that can be used for amplification of the Cdon, Cebpd or T gene, and as long as it can be complementarily combined with each of the genes and amplified by PCR, the nucleotide sequence of the primer is It is not limited.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which may correspond to a short base to several hundred bases, which may achieve specific binding with a gene or mRNA, and includes an oligonucleotide probe, It may be prepared in the form of single stranded DNA probe, double stranded DNA probe, RNA probe, or the like, and may be labeled for easier detection.
  • the probe may be a probe capable of complementarily binding to a Cdon, Cebpd or T gene, and the nucleotide sequence of the probe is not limited as long as it can bind complementarily to each of the genes. .
  • the term "agent for measuring the level of protein” refers to an agent used in a method for measuring the level of a target protein included in a sample, preferably Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent). assay, Radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement It may be an antibody used in methods such as the Complement Fixation Assay, FACS, and Protein Chip Assay.
  • the term "antibody” refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule. Such an antibody may be prepared by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. The protein encoded by the marker gene can be obtained and prepared by conventional methods from the obtained protein.
  • the form of the antibody is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof may be included in the antibody of the present invention and may include all immunoglobulin antibodies, as well as humanized antibodies. It may also contain a special antibody of.
  • the antibodies include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function and may be Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the antibody may be an antibody capable of specifically binding to a protein expressed from a Cdon, Cebpd or T gene, and preferably a polyclonal antibody capable of specifically binding to each of the above proteins. , Monoclonal antibodies or parts thereof.
  • a mouse-derived breast cancer cell line is obtained by the respective cell culture method and the stem cell culture method for the stem cells, and comparing the expression level of the genes expressed from each of the cultured stem cells
  • the expression level increased significantly in cells cultured by stem cell culture compared to cells cultured by general cell culture.
  • the genes were Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr, Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1 and Wisp2, and the genes whose expression levels were reduced more than two times were Birc5, Dab2, Gdf5 and Gdnf. I could confirm it.
  • the composition for predicting breast cancer prognosis provided in the present invention in addition to the agent for measuring the mRNA level of the Cdon, Cebpd or T gene or the protein expressed therefrom, Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1 And, may further comprise an agent that measures the mRNA level of a gene selected from the group consisting of, Il6, Birc5, Dab2, Gdnf, Wisp1, Wisp2, Gdf5, and combinations thereof, or the level of protein expressed therefrom.
  • Axin2 gene gene refers to a gene encoding axis inhibition protein 2, which plays a role in regulating the stability of betacatenin in the Wnt signaling pathway. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_004655).
  • End2 gene refers to a gene encoding an ectonucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase family member 2, also called Autotaxin, which is used as an enzyme for producing a lipid signaling molecule lysophosphatidic acid.
  • Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001040092).
  • Igf1 gene refers to a gene encoding Insulin-like growth factor 1, wherein the protein plays a role in promoting growth of the body. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_000618).
  • Angptl4 gene refers to a gene encoding angiopoietin-like 4, which is induced in ischemic conditions and is used as a target for Peroxisome proliferator-activated receptors. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001039667).
  • Nrp1 gene refers to a gene encoding Neuropilin 1, which is used as a co-receptor of a tyrosine kinase receptor. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001024628).
  • Egfr gene refers to a gene encoding a receptor of epidermal growth factor, the protein plays a role in the intracellular transmission of the signal of epidermal growth factor. Specific sequencing and protein information of the gene is known from NCBI (GenBank: NM_005228).
  • Fn1 gene refers to a gene encoding Fibronectin, the protein performs a regulatory function involved in cell adhesion, growth, migration, and differentiation. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_002026).
  • Il6 gene refers to a gene encoding Interleukin 6, which is a type of cytokine and serves to remove foreign substances from the body's immune system. Specific base sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_000600).
  • Wisp1 gene refers to a gene encoding WNT1-inducible-signaling pathway protein 1, which plays a role in regulating mesenchymal cell proliferation and bone differentiation. Specific base sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001204869).
  • WNT1-inducible-signaling pathway protein 2 which is a protein that is a type of CCN family (CCN intercellular signaling protein). Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_003881).
  • Gdf5 gene refers to a gene encoding Growth / differentiation factor 5, which is a type of bone morphogenetic protein belonging to the TGF-beta protein group. Specific sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_000557).
  • Birc5 gene of the present invention means a gene encoding a baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5, also called Survivin, which protein is used as an apoptosis inhibitor. Specific nucleotide sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001012270).
  • Dab2 gene refers to a gene encoding Disabled homolog 2, which is a protein expressed in ovarian epithelial cells. Specific base sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_001244871).
  • Gdnf gene refers to a gene encoding a Glial cell line-derived neurotrophic factor, the protein is a highly conserved glia cell derived neurotrophic factor protein. Specific nucleotide sequence and protein information of the gene is known from the NCBI (GenBank: NM_000514).
  • the present invention provides a breast cancer prognostic kit comprising the composition for predicting breast cancer prognosis.
  • the kit of the present invention can be used to predict the prognosis of breast cancer by measuring the presence of breast cancer-derived cancer stem cells by measuring mRNA levels of Cdon, Cebpd, or T genes or proteins expressed therefrom from samples of breast cancer patients. Include, but are not limited to, primers, probes or antibodies for measuring the mRNA level of the gene or the protein expressed therefrom, as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods. It may be.
  • the kit of the present invention in addition to the agent for measuring the mRNA level of the Cdon, Cebpd or T gene or the protein expressed therefrom, Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, And may further comprise an agent that measures the mRNA level of a gene selected from the group consisting of Fn1, Il6, Birc5, Dab2, Gdnf, Wisp1, Wisp2, Gdf5, and combinations thereof, or the level of protein expressed therefrom.
  • sample of the present invention refers to a direct subject which is isolated from a breast cancer patient and measures the expression level of a Cdon, Cebpd or T gene, and preferably may be a tissue sample of a breast cancer patient.
  • the kit for measuring the mRNA expression level of the Cdon, Cebpd or T gene of the present invention may be a kit containing the necessary elements necessary to perform RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other appropriate container, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, in addition to each primer pair specific for the gene.
  • reaction buffers pH and magnesium concentrations vary
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Taq-polymerases Taq-polymerases
  • reverse transcriptases in addition to each primer pair specific for the gene.
  • Such as enzymes, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water (DEPC-water) may include sterile water and the like. It may also comprise primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • kits of the present invention may include the necessary elements necessary to perform DNA chip assays.
  • the DNA chip analysis kit may include a substrate on which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and a reagent, a preparation, an enzyme, or the like for preparing a fluorescence-labeled probe.
  • the substrate may comprise cDNA corresponding to the quantitative control gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be a protein chip analysis kit for measuring the level of protein expressed from the Cdon, Cebpd or T gene
  • the kit is not particularly limited, but immunological detection of the antibody
  • it may include a secondary antibody labeled with a substrate, a suitable buffer solution, a coloring enzyme or a fluorescent substance, a coloring substrate, and the like.
  • the substrate is not particularly limited thereto, but a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like may be used.
  • peroxidase alkaline phosphatase
  • the fluorescent material is not particularly limited, but may be FITC, RITC, and the like, and the colorant substrate solution is not particularly limited thereto.
  • the present invention provides a diagnostic method for predicting the prognosis of breast cancer patients using the composition or kit for predicting breast cancer prognosis, specifically, (a) Cdon, Cebpd, T from a biological sample of breast cancer patients And measuring the mRNA level of a gene selected from the group consisting of a combination thereof, or the level of a protein expressed therefrom; And (b) comparing the measured mRNA level or the level of protein expressed therefrom with the level measured from cancer cells obtained by normal cell culture of the biological sample.
  • the cancer sample derived from breast cancer when it is determined that breast cancer-derived cancer stem cells are present, the prognostic prediction that there is a high possibility of recurrence, tumor growth, drug resistance, or metastasis to other tissues or organs after treatment of breast cancer, ie You can predict a bad prognosis.
  • the method may further comprise measuring the mRNA level of the Gdnf gene or the protein expressed therefrom.
  • the mRNA level of the added gene or the protein expressed therefrom may reduce the incidence of errors in determining the presence of breast cancer-derived cancer stem cells.
  • the mRNA levels of the Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Wisp1, or Wisp2 genes or the proteins expressed therefrom are significantly compared to the levels measured from cancer cells of the biological sample.
  • the mRNA level of the Birc5, Dab2, Gdf5 or Gdnf gene or the level of protein expressed therefrom is significantly reduced compared to the level measured from cancer cells of the biological sample, the cancer sample derived from breast cancer It can be determined that there is, and thus the prognosis can be predicted that the likelihood of recurrence, tumor growth, drug resistance or metastasis to other tissues or organs is high even after treatment of breast cancer.
  • the method of measuring the mRNA level of the gene or the protein expressed therefrom is the same as described above.
  • DMEM Invitrogen
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin / streptomycin penicillin / streptomycin
  • DMEM medium containing 20ng / ml EGF, 20ng / ml bFGF, 4 ⁇ g / ml heparin, B27 was added to 4T1 mouse breast cancer cell line, and suspended incubated for 7 days at 37 ° C. and 5% CO 2 . Cultures in form were obtained.
  • Example 1 Each culture cultured in Example 1 was applied to the RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) to extract the total RNA from each culture. Each extracted total RNA was applied to a random hexamer and ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific) to synthesize each cDNA. Using the synthesized cDNA, RTQ-PCR (ABI) using Stem cell PCR array (SABioscience (www.sabiosciences.com), cat no: PAMM-405) containing primers of 84 key genes related to stem cells 7300).
  • RNeasy Plus Mini Kit Qiagen Inc, Valencia, CA
  • ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo scientific
  • each extracted RNA is used to generate a Wnt signaling targets PCR array ( SABioscience (www.sabiosciences.com), cat no: PAMM-243Z) was performed (Table 1).
  • the genes in which the expression level is increased more than two times in the cells cultured by the stem cell culture method (Attach) compared to the cells cultured by the general cell culture method (Attach) Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr , Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1 and Wisp2 can be confirmed, and upside down the expression level was more than two times confirmed that the genes Birc5, Dab2, Gdf5 and Gdnf.
  • stem cell culture method when culturing cells in the form of globules using a stem cell culture method, cells that do not exhibit stem cell characteristics are killed during the culturing process. It will be included.
  • stem cell culture method when the stem cell culture method is performed on 4T1 mouse breast cancer cell lines, only cancer stem cells are left in the breast cancer cell lines, and thus, the genes whose expression levels are changed are specifically expressed in breast cancer-derived cancer stem cells. It can be determined that the gene is changed. Therefore, it was analyzed that the gene whose expression level was changed could be utilized as a marker gene of cancer stem cells.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 배양방법을 이용하여 발굴된 유방암 줄기세포 마커 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 유방암 환자의 예후를 예측하기 위한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 또는 키트를 이용하면, 유방암 환자를 대상으로 유방암 치료를 수행할 경우, 재발 또는 전이 등의 치료예후를 효과적으로 예측할 수 있으므로, 유방암의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

줄기세포 배양방법을 이용하여 발굴된 유방암 줄기세포 마커를 이용한 유방암 예후 예측용 조성물
본 발명은 유방암 줄기세포 마커를 이용한 유방암 예후 예측용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 줄기세포 배양방법을 이용하여 발굴된 유방암 줄기세포 마커 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 유방암 환자의 예후를 예측하기 위한 진단 방법에 관한 것이다.
현재 한국의 여성들은 고칼로리 영양식, 저출산, 초산 연령, 모유 수유 기피 등으로 인해 유방암 재발률이 높아지고 있다. 우리나라 유방암 재발률은 40대에 40%로 최고에 달하며, 이후 50대, 30대, 60대, 70대, 20대 순으로 연령에 관계없이 발생한다. 하지만 개선된 검출방법, 집단 스크리닝(mass screening) 및 과거 십 년간에 걸친 치료방법의 발달로 유방암으로 진단된 여성의 생존률이 현저하게 증가하고 있다. 오늘날, 유방암 환자들 중 약 80%는 생존율이 가장 높은 질병의 초기 단계에 진단되고 있으며, 그 결과 유방암 환자의 약 85%는 진단 후 적어도 5년 이상 생존하는 것으로 나타났다.
이러한 진단기술의 발전에도 불구하고, 초기 단계에서 유방암으로 진단된 여성의 약 20%는 10년 후 예후가 나빠, 재발, 전이되거나 또는 이 기간 내에 사망하기도 한다. 그러나, 나머지 80%의 유방암 환자는 10년 후 예후가 우수하여, 추가적인 적극적 보조요법(예, 화학치료)을 요구하지 않는다. 즉, 초기 단계의 임파선-음성(node-negative) 유방암 환자들 중 적어도 일부는 보조적인 화학치료를 받아야 하지만, 환자에 대한 보다 적합한 치료를 위해서는 이들을 위험군별로 분류하여 치료하는 것이 요구된다.
실제로 초기 단계의 암환자 대다수는 수술 및/또는 방사선 치료 이후에 추가적인 치료가 없이도 장기간 생존하므로, 이러한 환자들 모두에게 적극적 보조요법을 추천하는 것은, 암의 화학치료와 관련된 상당한 부작용을 고려할 때 부적절한 것임에 틀림없다. 또한, 초기 단계의 유방암 환자 집단을 초기 진단으로 예후가 양호한 그룹과 양호하지 않은 그룹으로 구분하는 것은 임상학자들이 적합한 치료방법을 선정하는데 유용할 것이다. 따라서, 유방암, 특히 초기 단계의 유방암 환자의 예후를 평가하는 방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
현재까지 상당수 연구는 유방암 예후를 분석하고 치료반응을 예측하기 위한 방법 및 인자의 동정에 집중되어 있다. 예후 표시자(indicator)는 종양 크기, 림프절 상태 및 조직학적 등급뿐만 아니라 예후에 대한 일부 정보를 제공하며 특정 치료제에 반응할 것 같은 분자 마커와 같은, 통상적인 많은 인자를 포함한다. 예컨대, 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR)의 스테로이드 호르몬 수용체 상태 측정법은 유방암 환자를 평가하기 위하여 통상적으로 수행되고 있다. 호르몬 수용체 양성인 종양은 호르몬 요법에 반응할 것임이 틀림없으며, 또한 전형적으로 보다 덜 적극적으로 증식하므로, ER+/PR+ 종양이 있는 환자의 예후는 보다 양호한 편이다.
또한, 인간 상피세포 성장인자 수용체 2(HER-2/neu)의 과다 발현은 양호하지 않은 유방암 예후와 관련성이 있다고 알려져 있다. 현재, 유방 종양에서의 Her2/neu 발현수준을 이용하여 항-Her-2/neu 항체 치료제인 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin; Genentech)에 대한 반응을 예측하는 방법이 개발되어 있다. 또한, 유방암의 약 1/3은 종양 억제유전자 p53에 돌연변이가 있으며, 이러한 돌연변이는 질병의 공격성 증가 및 양호하지 않은 예후와 연관되어 있다고 알려져 있다. 또한, 비-히스톤성 핵 단백질로 세포 증식 마커인 Ki-67의 과다 발현은 유방암의 양호하지 않은 예후와 상관성이 있음이 입증되었다.
상기와 같은 예후 기준 및 분자 마커는 환자의 운명을 예측하고 적절한 치료방법을 선정하는데 일부 지침을 제공하지만, 유방암의 재발 및 예후를 평가하는 특이적이며 민감한 방법으로서는 부족하여 새로운 방법의 개발이 매우 필요한 실정이다. 이러한 방법은 예후가 양호한 유방암 환자와 예후가 양호하지 않은 유방암 환자를 특이적으로 식별할 수 있어야 하며, 고위험도 유방암 환자를 식별할 수 있어야 한다.
한편, 이러한 단점을 극복하는 방안으로서 유방암으로부터 유래된 암줄기세포를 활용하여 유방암의 재발 및 예후를 평가하는 기술을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 암줄기세포란, 암세포 내에 암을 촉발시키는 시원세포를 의미하는데, 암세포와는 별도로 존재하고, 정상 줄기세포의 특성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 유방암의 치료후에도 환자의 체내에 유방암을 유발시킨 원인이 되는 암줄기세포가 존재한다면, 상기 암줄기세포에 의하여 유방암이 재발되거나 전이되는 등의 나쁜 예후를 나타낼 수 있기 때문에, 이러한 유방암 유래 암줄기세포의 존재 여부를 검출함으로써, 유방암의 재발 및 예후를 평가할 수 있을 것으로 예상되고 있다. 그러나, 아직까지는 이러한 유방암 유래 암줄기세포를 검출하는 방법이 개발되어 있지 않아, 유방암 유래 암줄기세포를 이용하는 방법이 활용되지 못하고 있는 실정이다.
본 발명자들은 유방암 유래 암줄기세포를 검출함으로써 유방암의 재발 또는 전이 등의 예후를 예측하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 유방암 유래 암줄기세포에서 특이적으로 발현수준이 변화되는 유전자를 찾아내었는 바, 상기 유전자를 유방암 유래 암줄기세포의 유전자 마커로 활용할 경우, 유방암 유래 암줄기세포를 검출함으로써 유방암의 예후를 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 유방암 유래 암 줄기세포의 마커 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 유방암 유래 암 줄기세포의 마커 유전자의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 유방암 예후 예측을 위한 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물 또는 키트를 이용하면, 유방암 환자를 대상으로 유방암 치료를 수행할 경우, 재발 또는 전이 등의 치료예후를 효과적으로 예측할 수 있으므로, 유방암의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 일반 세포배양된 배양세포에 비하여, 줄기세포 배양방법으로 배양된 4T1 마우스 유방암세포주에서 발현양상이 변화된 유전자를 분석한 결과를 나타내는 Heatmap이다.
도 2는 일반 세포배양된 배양세포에 비하여, 줄기세포 배양방법으로 배양된 4T1 마우스 유방암세포주에서 발현양상이 변화된 유전자를 Ingenuity Pathways Analysis(IPA)로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 유방암 유래 암줄기세포를 검출함으로써 유방암의 재발 및 예후를 평가하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 일반세포와 줄기세포의 배양방법의 차이에 주목하게 되었다. 일반적으로, 암세포를 포함하는 세포를 배양할 경우에는 배양용기의 하단에 세포가 부착된 형태로 배양함에 반하여, 줄기세포는 배양용기의 하단에 부착되지 않고 부유상태로 배양되면서 구상체(sphere)의 형태를 형성하게 되는데, 이같이 구상체의 형태로 배양하면 줄기세포가 아닌 일반세포는 사멸하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 암세포주를 대상으로 일반 세포 배양방법과 줄기세포 배양방법으로 각각 배양한 결과, 각각 암세포와 암줄기세포를 수득할 수 있었고, 이들 수득한 암세포와 암줄기세포에서 동일한 유전자의 발현수준을 분석함으로써, 암줄기세포에서 발현수준이 현저하게 변화되는 유전자를 선별하고자 하였다. 그 결과, 일반 세포배양 방법으로 배양된 암세포에 비해 줄기세포 배양 방법으로 배양된 암줄기세포에서 발현수준이 2배 이상 증가한 유전자는 Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr, Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1 및 Wisp2 임을 확인할 수 있었고, 거꾸로 발현수준이 2배 이상 감소한 유전자는 Birc5, Dab2, Gdf5 및 Gdnf 임을 확인할 수 있었다. 상기 발현수준이 변화된 유전자는 유방암 유래 암줄기세포에서 특이적으로 발현수준이 변화되는 유전자라고 할 수 있으므로, 상기 발현수준이 변화된 유전자는 암 줄기세포의 마커 유전자로서 활용될 수 있으며, 암줄기세포의 특성상 유방암의 치료후 재발가능성, 종양 성장, 약 저항성 또는 전이가능성을 포함하는 나쁜 예후를 가지는 지 여부를 판단하는데 마커 유전자를 이용할 수 있을 것으로 판단되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 Cdon, Cebpd, T 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "Cdon 유전자"란, Cell adhesion molecule-related/down-regulated by oncogenes를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 immunoglobulin (Ig)/fibronectin type III의 표면 수용체로서 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001243597).
본 발명의 용어 "Cebpd 유전자"란, CCAAT/enhancer-binding protein delta를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 DNA에 동형이합체의 형태로 결합하는 bZIP transcription factor로서 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_005195).
본 발명의 용어 "T 유전자"란, Brachyury를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 유전자의 T-box에서 transcription factor로서 사용된다. EMT(epithelial -mesenchymal transition)와 invasion을 조절하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_009309).
본 발명의 용어 "예후 예측"이란, 병리 상태의 진행상황 및 치료과정의 데이터를 취합하여, 병리상태의 치료결과를 예측하는 과정을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 예후 예측은 유방암의 치료후 재발가능성, 종양 성장, 약 저항성 또는 전이가능성을 판단하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 또는 프라이머가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 증폭에 사용될 수 있는 프라이머가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한, 상기 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 마우스유래 유방암세포주를 대상으로 일반 세포 배양방법과 줄기세포 배양방법으로 각각의 배양물을 수득하고, 상기 각 배양물로부터 발현되는 유전자의 발현수준을 비교하여 줄기세포 배양방법에 의하여 배양된 배양물에서 발현수준이 유의하게 증가하거나 또는 감소하는 유전자를 선별한 결과, 일반 세포배양 방법으로 배양된 세포에 비해 줄기세포 배양 방법으로 배양된 세포에서 발현수준이 유의하게 증가한 유전자는 Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr, Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1 및 Wisp2 임을 확인할 수 있었고, 거꾸로 발현수준이 2배 이상 감소한 유전자는 Birc5, Dab2, Gdf5 및 Gdnf 임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr, Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1, Wisp2, Birc5, Dab2, Gdf5 또는 Gdnf 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 이용하면 유방암 유래 암줄기세포의 검출을 통하여 유방암의 치료후 재발가능성, 종양 성장, 약 저항성 또는 전이가능성을 포함하는 유방암의 예후를 효과적으로 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에서 제공하는 유방암 예후 예측용 조성물은 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제에 더하여, Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Birc5, Dab2, Gdnf, Wisp1, Wisp2, Gdf5 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "Axin2 유전자 유전자"란, axis inhibition protein 2를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 Wnt 신호전달 경로에서 베타카테닌의 안정성을 조절하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_004655).
본 발명의 용어 "Enpp2 유전자"란, Autotaxin라고도 하는 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 lipid signaling molecule lysophosphatidic acid를 생성하는 효소로서 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001040092).
본 발명의 용어 "Igf1 유전자"란, Insulin-like growth factor 1를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 신체의 성장을 촉진시키는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000618).
본 발명의 용어 "Angptl4 유전자"란, angiopoietin-like 4를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 허혈성 조건에서 발현이 유도되어 Peroxisome proliferator-activated receptors의 표적으로 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001039667).
본 발명의 용어 "Nrp1 유전자"란, Neuropilin 1를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 티로신 키나제 수용체의 보조수용체로서 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001024628).
본 발명의 용어 "Egfr 유전자"란, 상피세포성장인자의 수용체를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 상피세포성장인자의 신호를 세포내에서 전달하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_005228).
본 발명의 용어 "Fn1 유전자"란, Fibronectin를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 cell adhesion, growth, migration, and differentiation에 관여하는 조절기능을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_002026).
본 발명의 용어 "Il6 유전자"란, Interleukin 6를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 사이토카인의 일종으로서 체내 면역시스템에서 외부물질을 제거하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000600).
본 발명의 용어 "Wisp1 유전자"란, WNT1-inducible-signaling pathway protein 1를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 중간엽 세포증식 및 골분화를 조절하는 역할을 수행한다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001204869).
본 발명의 용어 "Wisp2 유전자"란, WNT1-inducible-signaling pathway protein 2를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 CCN family (CCN intercellular signaling protein)의 일종인 단백질이다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_003881).
본 발명의 용어 "Gdf5 유전자"란, Growth/differentiation factor 5를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 TGF-beta 단백질군에 속하는 골형성 단백질의 일종이다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000557).
본 발명의 용어 "Birc5 유전자"란, Survivin이라고도 하는 baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 세포자멸 억제제로 사용된다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001012270).
본 발명의 용어 "Dab2 유전자"란, Disabled homolog 2를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 난소의 상피세포에서 발현되는 단백질이다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001244871).
본 발명의 용어 "Gdnf 유전자"란, Glial cell line-derived neurotrophic factor를 코딩하는 유전자를 의미하는데, 상기 단백질은 고도로 보존된 글리아세포 유래 신경영양 인자 단백질이다. 상기 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_000514).
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 유방암 예후 예측용 조성물을 포함하는 유방암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 유방암 환자의 시료로부터 Cdon, Cebpd, 또는 T 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 유방암 유래 암줄기세포의 존재여부를 확인함으로써 유방암의 예후를 예측하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 또한, 상술한 조성물과 동일하게, 본 발명의 키트는 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제에 더하여, Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Birc5, Dab2, Gdnf, Wisp1, Wisp2, Gdf5 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "시료"란, 유방암 환자로부터 분리되어 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 바람직하게는 유방암 환자의 조직시료 등이 될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유방암 예후 예측용 조성물 또는 키트를 이용하여 유방암 환자의 예후를 예측하기 위한 진단 방법을 제공하는데, 구체적으로, (a) 유방암 환자의 생물학적 시료로부터 Cdon, Cebpd, T 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 상기 생물학적 시료를 일반 세포 배양하여 수득한 암세포로부터 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 상기 생물학적 시료의 암세포로부터 측정된 수준과 비교하여 유의하게 증가하는 경우에는 상기 생물학적 시료에 유방암 유래 암줄기세포가 존재한다고 판정할 수 있고, 이처럼 유방암 유래 암줄기세포가 존재한다고 판정한 경우에는 유방암의 치료후에도 재발하거나 종양이 성장하거나, 약 저항성을 가지거나 또는 다른 조직 또는 기관으로 전이될 가능성이 높다는 예후 예측, 즉 나쁜 예후를 예측할 수 있다.
또한, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정할 경우, 상술한 유전자 이외에 Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Birc5, Dab2, Wisp1, Wisp2, Gdf5 또는 Gdnf 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 이처럼 추가된 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준은 유방암 유래 암줄기세포의 존재여부를 판정하는데 있어서 오류의 발생을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Wisp1 또는 Wisp2 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 상기 생물학적 시료의 암세포로부터 측정된 수준과 비교하여 유의하게 증가하거나 또는 Birc5, Dab2, Gdf5 또는 Gdnf 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 상기 생물학적 시료의 암세포로부터 측정된 수준과 비교하여 유의하게 감소할 경우에는 상기 생물학적 시료에 유방암 유래 암줄기세포가 존재한다고 판정할 수 있으며, 이에 따라, 유방암의 치료후에도 재발하거나 종양이 성장하거나, 약 저항성을 가지거나 또는 다른 조직 또는 기관으로 전이될 가능성이 높다고 예후를 예측할 수 있다. 한편, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유방암 세포의 배양
유방암 세포를 일반적인 세포배양 방법 및 줄기세포 배양방법으로 각각 배양하여 각각의 배양물을 수득하였다.
실시예 1-1: 일반 세포 배양
4T1 마우스 유방암세포주에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Invitrogen) 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 3일 동안 부착배양하여 배양물을 수득하였다.
실시예 1-2: 줄기세포 배양
4T1 마우스 유방암세포주에 20ng/㎖ EGF, 20ng/㎖ bFGF, 4㎍/㎖ 헤파린, B27이 포함된 DMEM 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 7일 동안 부유배양하여 구상체(sphere) 형태의 배양물을 수득하였다.
실시예 2: 유방암 유래 암줄기세포의 마커 유전자 스크리닝
상기 실시예 1에서 배양한 각각의 배양물을 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen Inc, Valencia, CA)에 적용하여 각 배양물로부터 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 각각의 총 RNA를 random hexamer와 ReverAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 이용하여, 줄기세포와 관련된 84개의 key gene들의 primer가 내재된 Stem cell PCR array(SABioscience (www.sabiosciences.com), cat no: PAMM-405)를 사용하여 RTQ-PCR(ABI 7300)을 수행하였다. 상기 RTQ-PCR을 통해 얻어진 데이터를 DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)에 적용하여 일반 세포배양시에 비하여 줄기세포 배양을 통해 발현수준이 변화된 유전자를 선별하고, 선별된 유전자를 대상으로 Functional Annotation Clustering (Functional Clustering은 여러 가지 데이터 베이스 중에서 중복되는 것들을 찾아 하나로 묶어 주어 Function category를 한번 더 추려주는 기능)을 수행함으로서, 발현양상이 유사한 유전자들은 그룹으로 묶어서 색으로 표시한 Heatmap을 작성하였다(도 1).
또한, 상기 RTQ-PCR을 통해 얻어진 데이터를 Ingenuity system 프로그램(www.ingenuity.com)에 적용하여, Ingenuity Pathways Analysis(IPA)를 수행함으로써, 줄기세포 배양된 4T1 마우스 유방암세포주에서만 특이적으로 증가하는 신호전달 경로를 분석하였다(도 2).
상기 도 1 및 도 2에서 보듯이, Wnt 신호전달에 관여하는 유전자의 발현수준이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
한편, 상기 Wnt 신호전달에 관여하는 유전자 중에서 줄기세포 배양을 수행함에 따라 발현수준이 현저하게 증가하거나 또는 감소된 유전자를 선발하기 위하여, 상기 추출된 각각의 총 RNA를 사용하여 Wnt signaling targets PCR array (SABioscience (www.sabiosciences.com), cat no: PAMM-243Z)를 수행하였다(표 1).
표 1 발현수준이 변화되는 마커 유전자
Symbol Refseq 유전자 명칭 T-TEST(p value) Fold Up- or Down-Regulation(Sphere/Attach)
Angptl4 NM_020581 Angiopoietin-like 4 0.001597 3.1715
Axin2 NM_015732 Axin2 0.189538 2.066
Cdon NM_021339 Cell adhesion molecule-related/down-regulated by oncogenes 0.000504 3.9227
Cebpd NM_007679 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), delta 0.001684 6.8456
Egfr NM_007912 Epidermal growth factor receptor 0.000003 3.6598
Enpp2 NM_015744 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 0.009818 11.276
Fn1 NM_010233 Fibronectin 1 0.000328 3.7606
Igf1 NM_010512 Insulin-like growth factor 1 0.013133 9.3421
Il6 NM_031168 Interleukin 6 0.016757 20.788
Nrp1 NM_008737 Neuropilin 1 0.00014 5.8951
T NM_009309 Brachyury 0.073265 2.2117
Wisp1 NM_018865 WNT1 inducible signaling pathway protein 1 0.011516 2.0241
Wisp2 NM_016873 WNT1 inducible signaling pathway protein 2 0.092482 3.4473
Birc5 NM_009689 Baculoviral IAP repeat-containing 5 0.002291 -4.6071
Dab2 NM_023118 Disabled homolog 2 (Drosophila) 0.006529 -2.2328
Gdf5 NM_008109 Growth differentiation factor 5 0.107274 -2.9751
Gdnf NM_010275 Glial cell line derived neurotrophic factor 0.000468 -3.5763
상기 표 1에서 보듯이, 일반 세포배양 방법으로 배양된 세포(Attach)에 비해 줄기세포 배양 방법으로 배양된 세포(sphere)에서 발현수준이 2배 이상 증가한 유전자는 Angptl4, Axin2, Cdon, Cebpd, Egfr, Enpp2, Fn1, Igf1, Il6, Nrp1, T, Wisp1 및 Wisp2 임을 확인할 수 있고, 거꾸로 발현수준이 2배 이상 감소한 유전자는 Birc5, Dab2, Gdf5 및 Gdnf 임을 확인할 수 있었다.
통상적으로 줄기세포 배양방법을 이용하여 구상체 형태로 세포를 배양하면, 줄기세포의 특성을 나타내지 않는 세포는 배양과정 중에 사멸하게 되므로, 최종적으로 배양된 배양물은 줄기세포의 특성을 갖는 세포들만을 포함하게 된다. 상술한 바와 같이, 4T1 마우스 유방암세포주를 대상으로 줄기세포 배양방법을 수행하면, 상기 유방암세포주 중에서 암줄기세포만이 남겨지게 되므로, 상기 발현수준이 변화된 유전자는 유방암 유래 암줄기세포에서 특이적으로 발현수준이 변화되는 유전자라고 판단할 수 있다. 따라서, 상기 발현수준이 변화된 유전자는 암 줄기세포의 마커 유전자로서 활용될 수 있을 것으로 분석되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. Cdon, Cebpd, T 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    Gdnf, Axin2, Dab2, Birc5, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Wisp1, Wisp2, Gdf5 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 유방암 예후 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
  7. (a) 유방암 환자의 생물학적 시료로부터 Cdon, Cebpd, T 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 상기 생물학적 시료를 일반 세포 배양하여 수득한 암세포로부터 측정된 수준과 비교하는, 유방암환자의 예후를 예측하기 위한 진단 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 단백질의 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    (a) 단계에서 측정된 Cdon, Cebpd 또는 T 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 상기 생물학적 시료를 일반 세포 배양하여 수득한 암세포로부터 측정된 수준과 비교하여 증가하는 경우에는 유방암의 치료후 재발가능성, 종양 성장, 약 저항성 또는 전이가능성을 포함하는 나쁜 예후를 가질 것으로 판정하는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    (a) 단계에서 Gdnf, Axin2, Dab2, Birc5, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Wisp1, Wisp2, Gdf5 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    추가로 측정된 Axin2, Enpp2, Igf1, Angptl4, Nrp1, Egfr, Fn1, Il6, Wisp1 또는 Wisp2 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 상기 생물학적 시료를 일반 세포 배양하여 수득한 암세포로부터 측정된 수준과 비교하여 증가하는 경우에는 유방암의 치료후 재발가능성, 종양 성장, 약 저항성 또는 전이가능성을 포함하는 나쁜 예후를 가질 것으로 판정하는 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    추가로 측정된 Birc5, Dab2, Gdf5 또는 Gdnf 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 상기 생물학적 시료를 일반 세포 배양하여 수득한 암세포로부터 측정된 수준과 비교하여 감소하는 경우에는 유방암의 치료후 재발가능성, 종양 성장, 약 저항성 또는 전이가능성을 포함하는 나쁜 예후를 가질 것으로 판정하는 방법.
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