KR20190071393A - 메탈로티오네인 2a를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물 - Google Patents

메탈로티오네인 2a를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상피-중간엽전환 과정을 조절하는 메탈로티오네인 2A를 유효성분으로 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물, 이를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 키트 및 유방암 환자의 전이 및 예후를 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 상기 메탈로티오네인 2A의 mRNA 또는 단백질 발현 수준은 유방암 전이와 관련된 상피-중간엽전환 지표인 E-cadherin, N-cadherin 및 Vimentin과 상피-중간엽전환 관련 전사인자인 Twist1, Snail, ZEB1 및 Slug의 발현 수준에 영향을 미치며, 유방암 환자에서의 예후를 확인하는 것이 가능하므로, 메탈로티오네인 2A는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메탈로티오네인 2A를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물 {A composition comprising metallothionein 2A for predicting metastasis and prognosis of breast cancer patients}
본 발명은 상피-중간엽전환 과정을 조절하는 메탈로티오네인 2A를 유효성분으로 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
유방암(breast cancer)은 서구화된 식습관과 비만, 출산율 및 수유의 감소, 조기 초경과 폐경기 지연, 스트레스의 증가, 각종 공해 노출 등의 원인으로 인해 발병율이 점차 증가하여 우리나라 여성에게 발병하는 암 1위를 차지하고 있다. 또한, 전이성 유방암에서부터 고형 종양까지 매우 다양한 생물학적 특성을 가지고 있어 다양한 치료적 선택과 예후를 가지며, 유방암 환자의 지속적인 증가에 따라 전이성 유방암 환자도 역시 증가하고 있어 조기 유방암 환자와 함께 이들 환자의 치료방법, 예후, 이에 영향을 미치는 인자에 대한 연구가 지속되고 있으나 아직 미미한 실정이다.
현재까지 대부분의 연구는 유방암 예후를 분석하고 치료반응을 예측하기 위한 방법 및 인자의 동정에 집중되어 있다. 예후 표시자(indicator)는 분자 마커와 같은 통상적인 인자를 포함하며, 종양 크기, 림프절 상태 및 조직학적 등급뿐만 아니라 예후에 대한 일부 정보를 제공한다(Fitzgibbons, P. L. et al., Arch Pathol Lab Med., 124(7), 966-978, 2000). 상기와 같은 분자 마커 및 예후 기준은 환자의 운명을 예측하고 적절한 치료방법을 선정하는데 일부 지침을 제공하나, 유방암의 예후를 특이적이고 민감하게 평가하는 방법으로서는 부족하여 새로운 방법의 개발이 요구된다.
메탈로티오네인(metallothionein)은 단량체의 분자질량이 6,000~8,000인 저분자 금속결합성 단백질로서, 체내에서 다양한 금속(Zn, Cu, Cd, Hg)과 결합하여 금속이온의 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.
메탈로티오네인은 기능을 가지고 있는 10개의 유형(MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1X, MT2A, MT3, MT4)과 기능이 없는 것으로 알려진 6개의 유형(MT1C, MT1D, MT1I, MT1J, MT1K, MT1L)으로 구성되어 있다. 각각의 메탈로티오네인은 독립적으로 조절되며 모든 유형은 유도인자, 조직, 발생과정에서 특이적인 조절을 받는 다고 알려져 있으나 아직까지 이에 대한 연구가 부족하다(Krizkova, S. et al., Drug Metab Rev., 44(4), 287-301, 2012).
상피-중간엽전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT)은 정상적 배아발달 과정에서 발생하는 현상으로, 세포가 상피(epithelial)성 세포 표현형을 상실하고 이동성이 높은 중간엽(mesenchymal)성 세포 표현형으로 전환하여 형태, 부착성 및 이동성을 변화시킨다.
상피-중간엽전환은 태아에서의 다양한 조직 또는 장기 형성과 성체에서의 상처치료, 조직재생 등에서 필수 수행 과정인 것으로 알려져 있다. 생체내에서 나타나는 상피-중간엽전환의 작용은 크게 3가지 과정에서 나타나는 것으로 알려져 있는데, 첫 번째는 정상적인 태아발생 과정에서 수정란의 착상, 배발생 및 장배형성, 신경릉, 심장, 근육·골격 등의 장기 발달에 관여하는 것으로서, 대체로 배아의 발달단계에서 나타난다. 두 번째는 신세뇨관, 수정체의 상피세포, 간세포, 담세포, 심근세포 등에서 조직의 섬유화를 유발시키는 것으로서, 성체의 상처치료과정에서 과다한 손상이 유발된 경우에 나타난다. 세 번째는 암의 전이, 암 줄기세포의 생성, 항암제에 대한 내성유도에 중요한 역할을 수행하는 것으로서, 특히, 암 관련 질환에서 발견되기 때문에 암 발병시 상피-중간엽전환 과정을 억제한다면 암의 발병을 예방 또는 조기 치료할 수 있을 것으로 기대되고 있어, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
상피-중간엽전환에서 가장 초기에 일어나고 가장 중요한 과정은 E-cadherin에서 N-cadherin으로 전환하는 cadherin 전환과정이다.
E-cadherin은 5개의 cadherin 반복체로 구성된 세포외 도메인, 막투과 도메인 및 p120-카테닌(catenin) 및 베타-카테닌과 결합하는 세포내 도메인으로 구성되어 있다. 상피세포에서 E-cadherin-포함 세포-대-세포 접합은 종종 상기 세포골격의 액틴-포함 섬유에 연접해 있다. E-cadherin은 포유동물 발달과정에서 2세포기에서 처음으로 발현되며, 8세포에 인산화되어 압축을 야기한다. 성체 조직에서 E-cadherin은 상피세포에서 발현되는데, 세포 표면에서 5시간의 반감기를 가지고 항상적으로 재생된다.
E-cadherin의 기능 또는 발현의 상실은 암의 진전 및 전이에 관련되어 있다. E-cadherin의 하향조절은 조직내에서 세포 접합의 강도를 떨어뜨리고 세포 이동성을 증진시키므로, 결국 암세포가 기저막을 통과하고 주변 조직으로 침윤할 수 있게 한다. 실제, 많은 암종에서 E-cadherin의 발현이 억제되어 있는 것으로 나타나, E-cadherin은 종양 억제 유전자임이 밝혀졌다.
기존의 유방암 진단 및 치료의 한계에 대한 인식과 함께, 정상세포의 종양형성과정과 상피-중간엽전환 진행 기전과의 관계가 분자생물학적 수준에서 규명됨에 따라, 종래의 예측인자(호르몬 수용체 및 HER2)와는 다른 기전의 새로운 유방암 진단 및 치료기법에 대한 개발이 시도되고 있다.
본 발명에서는 메탈로티오네인 2A의 발현과 상피-중간엽전환의 연관성을 확인하고 유방암 환자에 적용하여, 메탈로티오네인 2A의 발현 수준으로부터 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 마커가 될 수 있음을 규명하였다.
한국등록특허 제10-1421326호, 유방암 예후 예측을 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트, 2014년 07월 14일, 등록. 한국등록특허 제10-1672531호, 조기 유방암 예후 예측 진단용 유전자 마커 및 이의 용도, 2016년 10월 28일, 등록. 한국공개특허 제10-2017-0127774호, 유전자의 결실을 이용한 유방암 환자의 예후 예측 방법, 2017년 11월 22일, 공개.
Fitzgibbons, P. L. et al., Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists Consensus Statement 1999, Arch Pathol Lab Med., 124(7), 966-978, 2000. Krizkova, S. et al., Metallothioneins and zinc in cancer diagnosis and therapy, Drug Metab Rev., 44(4), 287-301, 2012.
본 발명의 목적은 상피-중간엽전환 과정을 조절하는 메탈로티오네인 2A를 유효성분으로 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 상피-중간엽전환(epithelial-mesenchymal transition) 과정을 조절하는 메탈로티오네인 2A(metallothionein 2A)를 유효성분으로 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물, 및, 이를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
상기 "유방암"은 유방에 생긴 암세포로 이루어진 종괴를 의미하며, 일반적으로는 유방의 유관과 소엽에서 발생한 암을 의미한다. 예를 들어, 유방암은 생검(biopsy)에 의해 악성 병리상태로 분류되는 상태로, 유방내암(ductal carcinoma in situ, DCIS), 상피내 소엽성 암종(lobular carcinoma in situ, LCIS), 점액성 유방암(mucinous carcinoma), 침윤성 관상피암(infiltrating ductal carcinoma, IDC), 침윤성 소엽내암(infiltrating lobular carcinoma, ILC) 등을 포함한다.
상기 "예후"는 유방암의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 유방암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다.
상기 "예측"이란 환자가 화학요법 또는 방사선 치료 등의 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암의 재발없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후의 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료방식을 선택하여 적용함으로써 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측방법은 환자가, 예를 들어 소정의 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정의 치료 처방과 같은 치료법에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존 또는 전신 또는 국소 재발이 가능한지를 예측할 수 있다. 또한 이를 통하여 불필요한 보조 항암요법을 최소화하거나 전신 또는 국소 재발이 예측되는 환자에게는 더욱 효과적인 보조 항암요법을 사용할 수 있도록 계획할 수 있다.
상기 "키트"는 메탈로티오네인 2A 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 검출함으로써 유방암 환자의 전이 및 예후를 예측 할 수 있는 것으로, 메탈로티오네인 2A 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 상기 유전자로부터 코딩된 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적으로 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트 및 단백질 칩 키트를 포함한다.
상기 RT-PCR 키트는 메탈로티오네인 2A 유전자에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), DNA/RNA 중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
마이크로어레이는 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함하며, 메탈로티오네인 2A 유전자의 염기서열에 특이적인 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함한다.
마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
상기 메탈로티오네인 2A 유전자로부터 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 일면에 있어서 본 발명은 유방암 환자의 전이 및 예후를 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로,
(a) 유방암 환자로부터 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨 및 객담으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 분리하여 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 메탈로티오네인 2A의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 메탈로티오네인 2A의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 시료는 유방암 환자로부터 분리된 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨 및 객담과 같은 시료 등을 포함하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등을 포함하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter) 및 단백질 칩 등을 포함하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상피-중간엽전환 과정을 조절하는 메탈로티오네인 2A를 유효성분으로 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물, 이를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 키트 및 유방암 환자의 전이 및 예후를 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 상기 메탈로티오네인 2A의 mRNA 또는 단백질 발현 수준은 유방암 전이와 관련된 상피-중간엽전환 지표인 E-cadherin, N-cadherin 및 Vimentin과 상피-중간엽전환 관련 전사인자인 Twist1, Snail, ZEB1 및 Slug의 발현 수준에 영향을 미치며, 유방암 환자에서의 예후를 확인하는 것이 가능하므로, 메탈로티오네인 2A는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일반 유방암 세포주(control)와 메탈로티오네인 2A 발현이 감소된 유방암 세포주(MT-2A KD)에서의 메탈로티오네인 2A 유전자 발현(도 1A) 및 단백질 발현(도 1B) 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 2는 일반 유방암 세포주(control)와 비교하여 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포주(MT-2A KD)에서, 상피-중간엽전환 억제와 관련된 지표인 E-cadherin과 상피-중간엽전환 유도와 관련된 지표인 N-cadherin, Vimentin에 대한 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 3은 일반 유방암 세포주(control)와 비교하여 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포주(MT-2A KD)에서, 상피-중간엽전환 관련 전사인자인 Twist1, Snail, ZEB1 및 Slug에 대한 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 4는 일반 유방암 세포주가 이식된 마우스 모델(MT2A-control)과 비교하여 메탈로티오네인 2A 발현 감소 유방암 세포주가 이식된 마우스 모델(MT2A-shRNA)에서의 유방암 증식 감소 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 일반 유방암 세포주가 이식된 마우스 모델(MT2A-control)과 비교하여 메탈로티오네인 2A 발현 감소 유방암 세포주가 이식된 마우스 모델(MT2A-shRNA)에서의 유방암 전이 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 유방암 환자 552명의 조직 중 메탈로티오네인 2A가 적게 발현한 군(low expression, 171명)과 메탈로티오네인 2A가 과량으로 발현한 군(high expression, 181명)에 대한 생존율 관련 예후 조사를 실시한 결과 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포주의 제조>
일반 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포에 shRNA 발현 시스템(렌티바이러스 시스템을 이용한 메탈로티오네인 2A shRNA 발현 감소 모델 제조)을 이용하여 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포주를 제조하였다. 상기 과정으로부터 구축된 세포주를 확인하기위해, 일반 유방암 세포주(control)와 상기 메탈로티오네인 2A 발현 감소 유방암 세포주(MT-2A KD)에서 메탈로티오네인 2A의 mRNA 발현 및 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하고 이를 도 1A 및 1B에 각각 나타내었다.
도 1A 및 1B를 참고하면, 일반 유방암 세포주에 비해 메탈로티오네인 2A의 발현 감소 유방암 세포주에서는 메탈로티오네인 2A의 mRNA 발현 및 단백질이 현저하게 감소하여, 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포주가 정상적으로 구축되었음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 2. 유방암에서의 메탈로티오네인 2A 발현 조절이 상피- 중간엽전환 과정에 미치는 영향 확인>
상피-중간엽전환에서 가장 초기에 일어나고 가장 중요한 과정은 E-cadherin에서 N-cadherin으로 전환하는 cadherin 전환과정이다. 따라서, 상피-중간엽전환의 진행여부를 확인하는 지표인 cadherin의 발현과 이의 발현을 조절하는 Twist1, Snail, ZEB1 및 Slug의 발현 수준을 확인하여, 유방암에서의 메탈로티오네인 2A 발현이 상피-중간엽전환 과정에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
실시예 2-1. 메탈로티오네인 2A 발현 조절에 따른 상피-중간엽전환 관련 지표 단백질 발현 확인
메탈로티오네인 2A의 발현이 유방암 전이와 관련된 상피-중간엽전환 과정에 미치는 영향을 확인하기 위해, 일반 유방암 세포(control)와 상기 실시예 1에서 제조한 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포(MT-2A KD)에서, 상피-중간엽전환과 관련된 지표인 E-cadherin, N-cadherin 및 Vimentin에 대한 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯 방법으로 확인하고 이를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, 일반 유방암 세포주와 비교하여 메탈로티오네인 2A의 발현 감소 유방암 세포주에서는 상피-중간엽전환 억제와 관련되며 종양 억제 유전자로 알려진 E-cadherin의 발현은 증가하였으나, 상피-중간엽전환 유도와 관련된 지표인 N-cadherin과 Vimentin의 단백질 발현은 감소하여, 메탈로티오네인 2A 단백질의 발현이 유방암 전이와 관련된 상피-중간엽전환 과정에서 중요하게 작용하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 2-2. 메탈로티오네인 2A 발현 조절에 따른 상피-중간엽전환 관련 전사인자 단백질 발현 확인
핵 내에서 상피-중간엽전환 과정과 관련된 전사인자로 Snail계인 Snail1, Snail2(Slug) 및 Snail 3이 있고, Zinc finger E-box Binding(ZEB)계로 ZEB1 및 ZEB2가 있으며, basic Helix-loop-helix(bHLH)계의 Twist가 알려져 있다. 이들은 E-cadherin의 전사 억제와도 관련이 있고, 세포의 생존, 분화 및 전이에 중요한 역할을 한다.
메탈로티오네인 2A의 발현이 상피-중간엽전환 과정과 관련된 전사인자에 미치는 영향을 확인하기 위해, 일반 유방암 세포(control)와 상기 실시예 1에서 제조한 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포(MT-2A KD)에서, 상피-중간엽전환과 관련된 전사인자인 Twist1, Snail, ZEB1 및 Slug에 대한 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯 방법으로 확인하고 이를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면, 일반 유방암 세포주와 비교하여 메탈로티오네인 2A의 발현 감소 유방암 세포주에서는 상피-중간엽전환과 관련된 전사인자인 Twist1, Snail, ZEB1 및 Slug의 단백질 발현이 감소하여, E-cadherin 전사가 유도됨을 알 수 있었다.
따라서, 도 2 및 3의 결과로부터, 유방암에 있어서 메탈로티오네인 2A의 발현 조절은 상피-중간엽전환 과정의 진행여부를 확인하는 지표인 cadherin의 발현과 이의 발현을 조절하는 상피-중간엽전환 관련 전사인자의 발현에도 영향을 미치므로, 메탈로티오네인 2A 단백질의 발현 수준은 유방암의 전이 또는 억제에 중요하게 작용하는 것임을 알 수 있었다.
< 실시예 3. 유방암에서의 메탈로티오네인 2A 발현 조절이 종양 증식 및 전이 활성에 미치는 영향 확인>
메탈로티오네인 2A의 발현이 유방암 세포주가 이식된 동물 모델에 미치는 영향을 확인하기 위해, 면역결핍 마우스인 6주령 BALB/c 누드 마우스에 일반 유방암 세포(MT2A-control)와 상기 실시예 1에서 제조한 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포(MT2A-shRNA)를 각각 이식하여, 7주차까지의 종양 크기를 매주 측정하고 이를 도 4에 나타내었다.
또한, 유방암의 전이를 평가하기 위해, 루시퍼라아제 발현 벡터가 삽입된 일반 유방암 세포(MT2A-control) 및 메탈로티오네인 2A의 발현이 감소된 유방암 세포(MT2A-shRNA)를 각각 면역결핍 마우스인 6주령 BALB/c 누드 마우스에 이식하여 7주차에 광학 이미징 장비로 측정한 다음 이를 도 5에 나타내었다.
도 4 및 5를 참고하면, 메탈로티오네인 2A 발현 감소 유방암 세포주가 이식된 마우스의 경우, 일반 유방암 세포주가 이식된 마우스에 비해 종양의 증식 및 전이가 감소하였으므로, 메탈로티오네인 2A의 발현은 유방암 세포가 이식된 동물모델에서 종양의 증식 및 전이 활성에 영향을 미치는 것임을 알 수 있었다.
<실시예 4. 유방암 환자에서 메탈로티오네인 2A 발현에 따른 예후 확인>
서울아산병원에서 2010년 1월부터 2015년 12월까지 유방암으로 수술을 시행한 552명 환자들을 대상으로, 외과적으로 절제된 유방암 조직의 대표적인 종양 부위를 파라핀 포매(embedding)에 의해 조직 미세배열(tissue microarray, TMA) 블록 절편을 만들어 면역조직화학염색을 실시하였다.
먼저, 유방암 조직에 1차 메탈로티오네인 2A 항체(Abnova, Walnut, CA, USA)를 1:100으로 희석하여 4℃에서 4시간 동안 반응하고, 2차 항체인 anti-rabbit HRP-labelled polymer(EnVision, Dako, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 실온에서 2시간 동안 처리하였다. 발색을 위해 다이아미노벤지딘(Diaminobenzidine, DAB, Dako)으로 상온에서 10분 동안 처리한 다음 병리학자에 의해 판독하여, 면역조직화학염색이 약한군(메탈로티오네인 2A가 적게 발현한 군, low expression)은 171개, 보통군은 200개, 강한군(메탈로티오네인 2A가 과량으로 발현한 군, high expression)은 181개로 분류하였다. 이후, 면역조직화학염색이 약한군과 강한군에 대한 생존율 관련 예후조사(ABLE, 서울아산병원 익명화 프로그램)를 실시하여 도 6에 나타내었다. 대상 환자의 추적은 후향적으로 의무기록과 전화추적을 통해 실시하였으며 음성군과 양성군과의 5년 생존율을 Kaplan-Meier법을 이용하여 비교하였다.
도 6을 참고하면, 552명의 유방암 환자 조직 중 면역조직화학염색이 약하여 메탈로티오네인 2A가 적게 발현한 군의 경우 5년 이내에 생존한 생존율이 60%로 나타났으나, 면역조직화학염색이 강하여 메탈로티오네인 2A가 과량으로 발현한 군의 경우 5년 이내에 생존한 생존율이 40%로 나타나, 메탈로티오네인 2A의 발현 수준은 유방암의 예후 예측시 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (6)

  1. 상피-중간엽전환(epithelial-mesenchymal transition) 과정을 조절하는 메탈로티오네인 2A(metallothionein 2A)를 유효성분으로 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항의 조성물을 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유방암 환자의 전이 및 예후 예측용 키트.
  4. (a) 유방암 환자로부터 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨 및 객담으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 분리하여 생물학적 시료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 시료로부터 메탈로티오네인 2A의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 메탈로티오네인 2A의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;
    를 포함하는 유방암 환자의 전이 및 예후를 위한 정보 제공 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유방암 환자의 전이 및 예후를 위한 정보 제공 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유방암 환자의 전이 및 예후를 위한 정보 제공 방법.
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