WO2017217807A2 - Nckap1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

Nckap1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물 Download PDF

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최은경
정성윤
송시열
이재희
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울산대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing colorectal cancer or predicting colorectal cancer metastasis, comprising NCKAP1 (NCK-Associated Protein 1) as an active ingredient.
  • NCKAP1 NCK-Associated Protein 1
  • colorectal cancer is 27,618 in total, 12.3% of the total.
  • the annual rate of change in age-standardized incidence of colorectal cancer increased by 4.6% in 2013 compared to 1999, which indicates the importance of research on the early diagnosis and treatment of colorectal cancer according to the increased incidence of colorectal cancer. It can be seen that.
  • liver metastasis is the most incidence, classified as the most advanced stage, and one of the largest causes of death in colorectal cancer patients.
  • serum fetal antigen test is relatively simple and used as an important method for follow-up after curative resection of colorectal cancer. Positive reaction can also come out, there is a limit to the diagnostic utilization.
  • Biomarkers have become a major means of advancing customized medicine, and are classified into nucleic acid-based biomarkers based on DNA and RNA, and protein-based biomarkers based on proteins and parts thereof. These biomarkers have recently been applied to early diagnosis, drug response diagnosis, and therapeutic diagnosis for various intractable diseases such as cancer, infectious disease, cardiovascular disease, stroke, and dementia.
  • Rectal examination, stool examination, colonography, colonoscopy, imaging, and blood tests are performed to diagnose colon cancer.
  • Colonoscopy is one of the most useful methods of diagnosing colorectal cancer, but there may be complications such as intestinal perforation or bleeding, and it may not proceed to the upper colon when the tumor blocks the intestine.
  • CT colonography is a method to compensate for the shortcomings of colonoscopy, which is relatively safe and short in examination time, but it may be difficult to distinguish from small polyps or remnants and should be irradiated. .
  • the blood test is a non-invasive method that is very simple and repeatable. Such liquid biopsy is expected to be a useful cancer diagnosis method for diagnosis and evaluation of treatment efficacy and monitoring.
  • the present invention is a biomarker composition for diagnosing colorectal cancer or predicting colon cancer metastasis, comprising NCKAP1 as an active ingredient, or for diagnosing colorectal cancer metastasis or prognostic colon cancer metastasis, comprising an agent capable of measuring the expression level of NCKAP1 as an active ingredient.
  • the composition, a method for diagnosing colorectal cancer and a method for predicting the prognosis of colorectal cancer using the same are provided.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer or a pharmaceutical composition for inhibiting colorectal cancer metastasis, comprising NCKAP1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a method for screening a colorectal cancer therapeutic agent or a colorectal cancer metastasis inhibitor by measuring the expression level of NCKAP1 protein.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing colon cancer comprising NCKAP1 (NCK-Associated Protein 1) or a gene encoding the same as an active ingredient.
  • the present invention also provides a biomarker composition for predicting colon cancer metastasis prognosis comprising NCKAP1 or a gene encoding the same as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for diagnosing colorectal cancer comprising a formulation capable of measuring the expression level of NCKAP1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for predicting the prognosis of colorectal cancer metastasis comprising a formulation capable of measuring the expression level of NCKAP1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a method of providing the information necessary for diagnosing colorectal cancer by measuring the expression level of NCKAP1.
  • the present invention also provides a method of measuring the expression level of NCKAP1 to provide information necessary for predicting the prognosis of colorectal cancer metastasis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer, comprising an NCKAP1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting colorectal cancer metastasis comprising NCKAP1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for screening a colorectal cancer therapeutic agent by measuring the expression level of NCKAP1 protein.
  • the present invention also provides a method for screening a colorectal cancer metastasis inhibitor by measuring the expression level of NCKAP1 protein.
  • the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing colorectal cancer or predicting colorectal metastasis prognosis comprising NCKAP1 (NCK-Associated Protein 1) as an active ingredient, and specifically, a large amount of gene expression analysis in blood of a mouse model of human colon cancer tissue transplantation A new colorectal cancer target candidate was identified, and experimental verification was performed by suppressing the expression of target candidate genes in colorectal cancer cell lines.
  • NCKAP1 was overexpressed in the blood and tissues of colorectal cancer patients, and the migration, infiltration and metastasis of cancer cells by inhibition of NCKAP1 was inhibited, and the possibility of NCKAP1 as a new colorectal cancer target was confirmed. Therefore, colon cancer diagnosis and gene expression inhibitor using the expression level of NCKAP1 can be usefully used as an active ingredient in the pharmaceutical composition for treating cancer or inhibiting cancer metastasis.
  • Example 1 is a result of gene analysis in the colorectal cancer patient transplanted mouse blood according to Example 1 of the present invention.
  • A Confirmation of expression of the existing blood cancer cell marker EPCAM at the level of mouse blood cell-derived RNA from various cancer patient tissue transplants;
  • B Number of genes with 2- or 1.5-fold differences in expression by mass gene analysis,
  • C NCKAP1 as a novel colorectal cancer target Mass Genetic Assay.
  • NCKAP1 discovered by mass gene analysis according to Example 2 of the present invention at the level of blood cell RNA and protein in tissues.
  • A Comparison of NCKAP1 gene expression in mouse-derived blood cells from colorectal cancer patients transplanted.
  • B Analysis of NCKAP1 protein expression in mouse-derived cancerous tissues from colorectal cancer patients.
  • NCKAP1 is a result of verifying the expression of NCKAP1 in the blood and tissue of colorectal cancer patients according to Example 3 of the present invention.
  • A Comparison of NCKAP1 gene expression in blood cells and cancer tissues from colorectal cancer patients
  • B Analysis of gene expression levels of NCKAP1 in blood cells from 10 colorectal cancer patients
  • C Confirmation of NCKAP1 protein expression in tissues from colorectal cancer patients.
  • A Verification of NCKAP1 expression inhibition by RNA interference effect in colorectal cancer cell line
  • B Comparison of wound healing ability by change of expression of NCKAP1
  • C Analysis of change in migration and penetration capacity of colorectal cancer cell line by NCKAP1
  • D Cell by NCKAP1 Morphological changes and epithelial cell specific marker expression analysis.
  • NCKAP1 is a result of establishing a cell line to confirm the in vivo function of NCKAP1 for cancer metastasis, and comparatively verified the wound healing ability and cancer metastasis forming ability related to metastasis.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing colon cancer or a biomarker composition for predicting the prognosis of colon cancer metastasis comprising NCKAP1 (NCK-Associated Protein 1) or a gene encoding the same as an active ingredient.
  • NCKAP1 NCK-Associated Protein 1
  • NCKAP1 NCK-Associated Protein 1
  • NCBI accession no it may be NM_013436.4 or NM_205842.2, but is not limited thereto.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, or as long as a person has a particular disease or condition. Determining the prognosis of the object, or therametrics (eg, monitoring the condition of the object to provide information about treatment efficacy).
  • prognosis refers to the prospect of future symptoms or progress determined by the diagnosis of a disease.
  • the prognosis typically refers to the survival or duration of metastasis within a certain period of time after the onset or surgical procedure of the cancer.
  • the prediction of prognosis is a very important clinical task because it provides clues on the future direction of colorectal cancer treatment, especially whether or not chemotherapy is given to colorectal cancer patients.
  • metastasis refers to a condition in which a tumor is transplanted to, and settled in, a site of another body along various pathways at its primary site. Cancer metastasis is not only determined by the specific characteristics of the cancer, but also the most important clue in determining the cancer's prognosis. Therefore, it is treated as the most important clinical information related to the survival of cancer patients.
  • the present invention provides a composition for diagnosing colorectal cancer or a composition for predicting prognosis of colorectal cancer, comprising a formulation capable of measuring the expression level of NCKAP1 as an active ingredient.
  • the agent capable of measuring the expression level of NCKAP1 may be a primer or probe specifically binding to the NCKAP1 gene, an antibody, peptide, aptamer or compound specifically binding to the NCKAP1 protein, It is not limited to this.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing colorectal cancer or a kit for predicting prognostic colorectal cancer metastasis comprising the composition.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group, which is capable of forming base pairs with complementary templates and acting as a starting point for template strand copying. Refers to the sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. PCR conditions, sense and antisense primer lengths may be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases capable of specifically binding other than mRNA, and is labeled so that the presence or absence of a specific mRNA is expressed. You can check the amount.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single strand DNA probe, a double strand DNA probe, an RNA probe, or the like. Selection of appropriate probes and hybridization conditions may be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • the term “antibody” refers to a specific immunoglobulin directed to an antigenic site as is known in the art.
  • the antibody in the present invention means an antibody that specifically binds to LRP-1 of the present invention, and the antibody can be prepared according to conventional methods in the art. Forms of such antibodies include polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, including all immunoglobulin antibodies.
  • the antibody means a complete form having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • the said antibody also contains special antibodies, such as a humanized antibody.
  • the kit of the present invention includes an antibody that specifically binds to a marker component, a secondary antibody conjugate conjugated with a label that is developed by reaction with a substrate, a color substrate solution to be color-reacted with the label, a wash solution, It may include an enzyme stopping solution and the like, and may be prepared in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components used.
  • the term "peptide” has the advantage of high binding power to the target material, and no degeneration occurs even during thermal / chemical treatment.
  • the small size of the molecule can be used as a fusion protein by attaching to other proteins. Specifically, since it can be used by attaching to a polymer protein chain, it can be used as a diagnostic kit and drug delivery material.
  • aptamer refers to a particular kind of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and which is capable of binding with high affinity and specificity to a target molecule. It means a kind of polynucleotide consisting of). As described above, aptamers are composed of polynucleotides that can bind specifically to antigenic substances like antibodies, but are more stable than proteins, simple in structure, and easy to synthesize. Can be.
  • the present invention comprises the steps of (1) measuring the mRNA expression level or NCKAP1 protein expression level of the NCKAP1 gene from a sample isolated from the patient; (2) comparing the mRNA expression level of the NCKAP1 gene or the expression level of NCKAP1 protein with a control sample; And (3) determining that the NCKAP1 gene mRNA expression level or the NCKAP1 protein expression level is higher than that of the control sample.
  • the present invention comprises the steps of (1) measuring the mRNA expression level of NCKAP1 gene or the expression level of NCKAP1 protein from a sample isolated from a patient with colorectal cancer; (2) comparing the mRNA expression level of the NCKAP1 gene or the expression level of NCKAP1 protein with a control sample; And (3) determining that the risk of metastasis of colorectal cancer is high when the mRNA expression level of the NCKAP1 gene or the expression level of the NCKAP1 protein is higher than that of the control sample. do.
  • the method of measuring the mRNA expression level is RT-PCR, competitive RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay ), Northern blotting and DNA chips are used, but are not limited to these.
  • the method of measuring the protein expression level is Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion method, Rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS and protein chips are used, but are not limited thereto.
  • sample isolated from a patient refers to tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine that differ from the control group in the expression level of the NCKAP1 gene or NCKAP1 protein, which is a biomarker. The same sample is included, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer or a pharmaceutical composition for inhibiting colorectal cancer metastasis, comprising NCKAP1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient.
  • the NCKAP1 protein expression inhibitor may be an antisense nucleotide, small interfering RNA (siRNA) or short hairpin RNA (shRNA) that complementarily binds to the mRNA of the NCKAP1 gene
  • the NCKAP1 Protein activity inhibitors may be, but are not limited to, compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antibodies or natural products that specifically bind to NCKAP1 protein.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include chemicals, nucleotides, antisenses, siRNA oligonucleotides, and natural extracts as active ingredients.
  • the pharmaceutical compositions or complex preparations of the present invention may be prepared using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable auxiliaries in addition to the active ingredients, which may include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coatings, swelling agents, lubricants. Solubilizers such as lubricants and flavoring agents can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be preferably formulated into a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient for administration.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • compositions of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions and sustained release formulations of the active compounds, and the like.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, sternum, transdermal, nasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required to prevent or treat a disease.
  • the type of disease the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health, sex and diet, sex and diet, time of administration, route of administration and composition of the patient. It can be adjusted according to various factors including the rate of secretion, the duration of treatment, and the drug used concurrently.
  • the composition of the present invention is administered once or several times a day, when the compound is 0.1ng / kg to 10g / kg, a polypeptide,
  • 0.1ng / kg ⁇ 10g / kg antisense nucleotides, siRNA, shRNAi, miRNA can be administered at a dose of 0.01ng / kg ⁇ 10g / kg.
  • the present invention (1) contacting the test substance to the colorectal cancer cells; (2) measuring the expression or activity of NCKAP1 protein in colorectal cancer cells in contact with the test substance; And (3) screening a test substance having a reduced expression or activity level of the NCKAP1 protein compared to a control sample, or a method for screening a colorectal cancer therapeutic inhibitor or a method for screening a colorectal cancer metastasis inhibitor.
  • test material refers to an unknown candidate used in screening to examine whether it affects the expression level of a gene or affects the expression or activity of a protein. do.
  • the sample includes, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural extracts.
  • NCKAP1 was confirmed by quantitative PCR (Q-PCR; quantitative PCR) in blood RNA of a total of 4 cases of colorectal cancer transplanted mouse models, including the C87 case used for analysis to verify selected NCKAP1 by mass gene analysis. Results 5, 5.43, 5.61, 6.05 times increased in each case was observed. Significantly increased expression of NCKAP1 in mouse blood transplanted with colorectal cancer patients showed that NCKAP1 could be used as a marker for diagnosing colorectal cancer using patient blood.
  • tissue immunohistochemistry (IHC) was performed on FFPE tissue (forminin-fixed, paraffin-embedded tissue) to confirm NCKAP1 protein expression in patient cancer tissues. Expression of NCKAP1 was confirmed in adenocarcinoma cells of colon cancer patients. The results of confirming the expression of NCKAP1 in the blood and tissues using a mouse model of transplanted tissue cancer patients are shown in FIG.
  • siRNA Small interfering RNA
  • HCT116 colorectal cancer cell line Small interfering RNA
  • Short interfering RNA disrupts the expression of genes by selectively cleaving complementary sequences of RNA to inhibit the production of specific proteins.
  • the siRNAKAP1 siRNA having a complementary arrangement to the NCKAP1 gene was used to inhibit the expression of the gene, thereby observing a change in epithelial-mesenchymal transition (EMT) ability important for cancer metastasis.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • Cancer epithelial cells are transformed into mesenchymal cells and the shape of the cells is fusiform, and the cell's apicalbasal polarity disappears, thereby obtaining cell motility, plasticity, and resistance to cell death. This process is very important for metastasis in which primary cancer cells migrate after invasion and settle and proliferate in other organs.
  • the inhibition of NCKAP1 expression was confirmed at the RNA and protein levels of the siNCKAP1 treated HCT116 colon cancer cell line, and the wound healing, migration, and infiltration capacity of cancer cells were observed to observe the change of epithelial mesenchymal migration ability. Invasion analysis was performed.
  • NCKAP1 was observed by immunostaining by observing a significant decrease in epithelial mesenchymal migration-related functions in the cell line in which NCKAP1 expression was suppressed, the appearance of cells in a cubic shape, and the expression of E-cadherin, an epithelial marker. This epithelial mesenchymal function was found to play a major role.
  • Short hairpin RNA was transfected for in vivo experiments to establish NCKAP1 expression inhibitory cell lines by RNA interference (RNAi) effects.
  • RNAi RNA interference
  • Western blot a protein immunoassay, was performed, and it was confirmed that the expression was suppressed in the cell line into which shNCKAP1 was inserted.
  • the wound healing ability of the cell line performed in Example 4 it was observed that the function was inhibited in the cell line into which the shNCKAP1 was inserted compared to the control group, shScramble, and the epithelial mesenchymal migration ability was observed.

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Abstract

본 발명은 NCKAP1(NCK-Associated Protein 1)을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 인체 대장암 조직 이식 마우스 모델의 혈액에서 대량 유전자 발현 분석을 통해 신규한 대장암 표적 후보를 발굴하였고, 이를 대장암 세포주 내 표적 후보 유전자 발현 억제를 통해 실험적 검증을 하였다. 이를 통해 대장암 환자 혈액 및 조직에서 NCKAP1이 과발현되고, NCKAP1의 억제에 의한 암세포의 이동, 침윤 및 전이가 저해됨을 관찰하고, 신규한 대장암 표적으로서 NCKAP1의 가능성을 확인하였다. 따라서 NCKAP1의 발현 수준을 이용한 대장암 진단과 유전자 발현 억제제를 암의 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

NCKAP1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물
본 발명은 NCKAP1(NCK-Associated Protein 1)을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
2015년에 발표된 중앙암등록본부 자료에 따르면, 2013년에 우리나라에서는 225,343건의 암이 발생했는데, 그 중 대장암은 남녀를 합쳐 27,618건으로 전체의 12.3%로 3위를 차지하고 있다. 대장암의 연령표준화발생률의 연간변화율은 1999년 대비 2013년에 4.6% 증가하였으며 이는 간암, 폐암 등의 발생 감소와 비교하였을 때 대장암의 발생 증가에 따른 대장암 조기진단 및 치료 개발 연구의 중요성을 제시한다고 볼 수 있다.
대장암은 근치적 절제술 후 20~50%에서 재발한다. 재발은 국소 재발과 원격전이가 동반되는 광범위한 재발이 많으며 이는 근치적 절제 치료의 한계성을 나타낸다. 전이성 대장암 중 간 전이는 가장 발병률이 높으며 병기가 가장 진행된 상태로 분류되고 대장암 환자의 가장 큰 사망 원인 중 하나이다. 이러한 대장암의 전이와 재발을 추적하기 위한 방법 중 혈청의 암태아성 항원 검사는 비교적 간편하여 대장암의 근치적 절제술 후 추적검사에 중요한 방법으로 쓰이고 있으나, 대장암과 무관한 양성 질환 및 흡연, 음주에 의해서도 양성 반응이 나올 수 있어 진단 활용에 한계가 있다.
대장암 환자의 약 15~25%는 진단 당시 이미 간 전이가 있으며, 이 중 80~90%의 경우는 진단 초기에 절제 불가능한 간 전이가 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 대장암 및 전이성 대장암의 조기 진단을 가능케할 신규한 바이오 마커의 개발이 시급하다.
바이오 마커는 맞춤형 의료를 앞당길 수 있는 주요 수단이 되고 있으며, DNA, RNA를 기반으로 하는 핵산 기반 바이오 마커와 단백질 및 그 일부분 등을 기반으로 하는 단백질 기반 바이오 마커 등으로 구분된다. 이러한 바이오 마커는 최근 암, 감염성 질환, 심장혈관 질환, 뇌졸중, 치매 등 각종 난치병에 대한 조기진단용, 약물반응진단 및 치료 진단용 등에 적용되고 있다.
대장암을 진단할 수 있는 검사에는 직장 수지 검사, 대변검사 대장조영술, 대장내시경, 영상진단, 혈액검사 등이 시행되고 있으나, 대부분 대장암은 조기 증상이 없어 정기적인 대장 검사가 필요하다. 대장내시경은 대장암 진단의 가장 유용한 방법 중 하나이나 장천공이나 출혈 등의 합병증이 있을 수 있으며 종양이 장관을 막는 경우 상부 대장으로 진행할 수 없는 단점이 있다. CT 대장 조영술은 대장내시경의 단점을 보완할 수 있는 방법으로 비교적 안전하고 검사시간이 짧지만 작은 용종이나 잔변과의 구별이 어려운 경우가 있으며 방사선 조사를 받아야 하고 암 발견 시 다시 대장내시경 검사를 받아야 한다. 이러한 영상진단법은 정확한 검사를 위해 하제를 이용하여 대장을 비우는 것이 필수적이므로 검사 시 불편감이나 통증을 느낄 수 있다. 반면 혈액을 이용한 검사법은 비침습적 방식으로서 매우 간편하고 반복적 검사가 가능하다. 이러한 liquid biopsy는 진단과 치료 효능 평가 및 모니터링에 유용한 암 진단기법으로 전망되고 있다.
본 발명은 NCKAP1을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물, NCKAP1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 또는 대장암 전이 예후 예측용 조성물, 이를 이용한 대장암 진단 방법 및 대장암 전이 예후 예측방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 대장암 전이 억제용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질의 발현 수준 측정을 통한 대장암 치료제 또는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 NCKAP1(NCK-Associated Protein 1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1의 발현 수준을 측정하여 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1의 발현 수준을 측정하여 대장암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질의 발현 수준 측정을 통한 대장암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질의 발현 수준 측정을 통한 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 NCKAP1(NCK-Associated Protein 1)을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 인체 대장암 조직 이식 마우스 모델의 혈액에서 대량 유전자 발현 분석을 통해 신규한 대장암 표적 후보를 발굴하였고, 이를 대장암 세포주 내 표적 후보 유전자 발현 억제를 통해 실험적 검증을 하였다. 이를 통해 대장암 환자 혈액 및 조직에서 NCKAP1이 과발현되고, NCKAP1의 억제에 의한 암세포의 이동, 침윤 및 전이가 저해됨을 관찰하고, 신규한 대장암 표적으로서 NCKAP1의 가능성을 확인하였다. 따라서 NCKAP1의 발현 수준을 이용한 대장암 진단과 유전자 발현 억제제를 암의 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 대장암 환자 조직 이식 마우스 혈액 내 유전자 분석 결과이다. A: 다양한 암 환자 조직 이식 마우스 혈액 세포 유래 RNA 수준에서 기존 혈중 암세포 마커인 EPCAM의 발현 확인, B: 대량 유전자 분석 결과 2배 또는 1.5배 발현 차이 나는 유전자 수, C: 신규한 대장암 표적으로서 NCKAP1의 대량 유전자 분석 결과.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따라 대량 유전자 분석에 의해 발굴된 NCKAP1의 발현을 혈액 세포 RNA 및 조직 내 단백질 수준에서 검증한 결과이다. A: 대장암 환자 조직 이식 마우스 유래 혈액 세포 내 NCKAP1 유전자 발현양 비교, B: 대장암 환자 조직 이식 마우스 유래 암 조직에서 NCKAP1 단백질 발현 분석.
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따라 대장암 환자 혈액 및 조직에서 NCKAP1의 발현을 검증한 결과이다. A: 대장암 환자 유래 혈액 세포 및 암 조직에서 NCKAP1 유전자 발현양 비교, B: 10명의 대장암 환자 혈액 세포 내 NCKAP1의 유전자 발현양 분석, C: 대장암 환자 조직 내 NCKAP1 단백질 발현 확인.
도 4는 대장암 세포주에서 NCKAP1의 기능 검증을 위해 시행한 상피간엽이행 관련 기능 실험 및 마커 분석 결과이다. A: 대장암 세포주에서 RNA 간섭효과에 의한 NCKAP1 발현 억제 검증, B: NCKAP1의 발현 변화에 의한 상처 치유 능력 비교, C: NCKAP1에 의한 대장암 세포주의 이동 및 침투능 변화 분석, D: NCKAP1에 의한 세포 형태 변화와 상피세포 특이적 마커 발현 분석.
도 5는 암 전이에 대한 NCKAP1의 생체 내 기능을 확인하기 위해 세포주를 확립하고, 전이에 관련된 상처 치유능 및 암 전이 형성능을 비교 검증한 결과이다. A: 대장암 세포주에서 RNA 간섭효과에 의한 NCKAP1 발현 억제 확인, B: NCKAP1에 의한 상처 치유 능력 변화 비교, C: NCKAP1 발현 억제에 의한 대장암 세포의 간 전이 종양 형성능 감소 확인.
본 발명은 NCKAP1(NCK-Associated Protein 1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물 또는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 "NCKAP1(NCK-Associated Protein 1)"은 NCBI accession no. NM_013436.4 또는 NM_205842.2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
본 명세서 용어 “예후(prognosis)”는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측은 특히 대장암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 대장암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.
본 명세서에서 용어 “전이(metastasis)”는 어떤 종양이 그 원발 부위에서 여러 경로를 따라 다른 신체의 부위에 이식되어 그곳에 정착 및 증식하는 상태를 말한다. 암의 전이여부는 해당 암의 고유의 특성에 의하여 결정될 뿐만 아니라 암의 예후 결정에 있어서 가장 중요한 단서가 되는 사건이므로, 암 환자의 생존과 관련된 가장 중요한 임상정보로 다루어진다.
또한, 본 발명은 NCKAP1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 조성물 또는 대장암 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 NCKAP1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 NCKAP1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 NCKAP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트 또는 대장암 전이 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 LRP-1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 대장암이라고 판단하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 대장암 환자에서 분리된 시료로부터 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 대장암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 대장암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "환자에서 분리된 시료"란 바이오 마커인 상기 NCKAP1 유전자 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 NCKAP1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 대장암 전이 억제용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 NCKAP1 단백질 발현 억제제는 NCKAP1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 NCKAP1 단백질 활성 억제제는 NCKAP1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 대장암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 대장암세포에서 NCKAP1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 NCKAP1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝 방법 또는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "암" 또는 "암세포"는 대장암이 가장 바람직하지만, NCKAP1 유전자 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 암 또는 암세포라면 적용 가능하다. "암" 또는 "암세포"는 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이거나, 이의 암세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 대장암 환자 조직 이식 마우스 모델을 이용한 혈액 내 대량 유전자 발현 분석
다양한 암 종의 환자 유래 암 조직을 서울아산병원의 Bio Resource Center (BRC)로부터 규정에 의한 경로를 통해 분양받았고, 이를 서울아산병원 임상연구윤리위원회와 아산생명과학연구소 동물실험 윤리위원회의 승인 후 철저한 규정 준수 아래 Balb/c 누드마우스에 이식하여 동물 모델을 구축하였다. 구축된 동물 모델에서 종양의 성장이 확인된 마우스를 마취한 후 심장 채혈을 통해 전혈을 회수하고 이로부터 RNA를 추출하였다. 다양한 암 종의 환자 조직 이식 마우스에서 추출된 RNA에서 기존 혈중 암세포 마커로 사용되는 EPCAM 유전자의 발현 여부를 확인하였고, 그 중 발현이 관찰된 C87 대장암 케이스를 선택하여 RNA의 quality control(QC) 후 Affymetrix GeneChip® human Gene 2.0 ST Array를 사용한 대량 유전자 발현 분석을 수행한 결과, 정상 마우스 혈액 대비 C87 대장암 이식 마우스 모델 유래 혈액에서 1.5배 이상 발현이 차이나는 유전자가 3,917개 존재함을 확인하였다. 이 유전자 (DEG; differential expressed gene) 중 본 발명에 관한 NCKAP1의 발현은 정상 마우스 대비 환자 조직 이식 마우스의 혈액에서 2.66배 증가하였고 상기 내용의 결과를 도 1에 나타내었다.
<실시예 2> 대장암 환자 조직 이식 마우스 모델에서 NCKAP1 발현 검증
대량 유전자 분석을 통해 선택된 NCKAP1을 검증하기 위해 분석에 사용된 C87 케이스를 포함한 총 4 케이스의 대장암 이식 마우스 모델의 혈액 RNA에서 정량적 유전자 분석법(Q-PCR; quantitative PCR)을 통해 NCKAP1의 발현을 확인한 결과 각 케이스별 5, 5.43, 5.61, 6.05배 증가하는 것을 관찰하였다. 대장암 환자 조직이 이식된 마우스 혈액에서 NCKAP1의 발현이 유의적으로 증가함은 NCKAP1이 환자 혈액을 이용한 대장암 진단을 위한 마커로 활용 가능함을 보여주었다. 또한 환자 암 조직에서 NCKAP1의 단백질 발현을 확인하기 위해 파라핀 절편(FFPE tissue; formalin-fixed, paraffin-embedded tissue)에서 조직면역염색(IHC; immunohistochemistry)을 시행하였고, 그 결과 마우스에 이식되었던 총 4 케이스의 대장암 환자 조직의 선암 세포(adenocarcinoma cell)에서 NCKAP1의 발현이 확인되었다. 대장암 환자 조직 이식 마우스 모델을 이용한 혈액 및 조직에서의 NCKAP1의 발현을 확인한 결과는 도 2에 나타내었다.
<실시예 3> 대장암 환자 혈액 및 조직에서 NCKAP1의 검증
조직자원센터(BRC)에서 구입한 동결보존된 10 케이스의 대장암 환자의 암 조직과 정상 조직 및 백혈구 연층(buffy coat)에서 RNA를 추출하여 NCKAP1의 발현양을 상대 비교하였다. 그 결과 정상인 대비 대장암 환자의 혈액에서 NCKAP1의 RNA 수준 발현이 18.89배 증가함을 확인하였고, 정상 조직 대비 암 조직 내에서는 2.61배 증가하였다. 기존 대장암 진단 마커로 사용되고 있는 CEA와 RNA 수준에서의 발현 여부를 비교하였을 때, CEA는 혈액 세포 내 RNA에서 발현이 확인되지 않은 반면 NCKAP1의 경우 10 케이스의 모든 대장암 환자 혈액에서 그 수준이 높게는 64.7배 이상 높아진 것을 관찰하였다. 또한 대장암 환자의 파라핀 조직 절편에서 NCKAP1에 대한 조직면역염색 결과, 정상 조직 대비 암 조직에서의 NCKAP1 단백질 발현이 높은 것을 확인하고 이를 도 3에 나타내었다.
<실시예 4> 대장암 세포주를 이용한 NCKAP1 기능 검증
HCT116 대장암 세포주에서 NCKAP1의 기능을 검증하기 위해 짧은 간섭 RNA(siRNA; small interfering RNA)를 사용하였다. 짧은 간섭 RNA는 상보적인 배열을 하는 RNA를 선택적으로 분해하여 특정 단백질의 생산을 억제함으로써 유전자의 발현을 방해한다. 본 발명에서는 NCKAP1 유전자에 상보적인 배열을 지닌 siRNA인 siNCKAP1을 이용하여 그 유전자의 발현을 억제함으로써 암 전이에 중요한 상피간엽이행(EMT; epithelial-mesenchymal transition) 능력의 변화를 관찰하였다. 암 상피세포는 간엽세포로의 전환을 통해 세포의 모양이 방추형으로 변이되고 세포의 극성(apicalbasal polarity)이 사라지면서 세포의 운동성과 모양 가변성(plasticity) 및 세포 사멸에 대한 저항성이 획득된다. 이러한 과정은 원발암 세포가 혈관 내 침투 후 이동하여 다른 장기에 정착하고 증식하는 원격전이(metastasis)에 매우 중요하다. 도 4에서 siNCKAP1 처리된 HCT116 대장암 세포주의 RNA 및 단백질 수준에서 NCKAP1 발현억제를 확인하였고, 상피간엽이행 능력의 변화를 관찰하기 위해 암 세포의 상처 치유능(wound healing), 이동(migration) 및 침투능(invasion) 분석을 시행하였다. 그 결과 NCKAP1의 발현이 억제된 세포주에서 상피간엽이행 관련 기능이 유의적으로 감소하는 것과 세포의 모양이 입방형으로 변이되고 상피세포 마커인 E-cadherin의 발현이 증가됨을 면역염색법을 통해 관찰함으로써 NCKAP1이 상피간엽이행 기능에 주요하게 작용함을 확인하였다.
<실시예 5> NCKAP1에 의한 생체 내 암 전이능 비교
생체 내(in vivo) 실험을 위해 shRNA(short hairpin RNA)를 유전자 도입(transfection)시켜 RNA 간섭(RNAi; RNA interference) 효과에 의한 NCKAP1 발현 억제 세포주를 확립하였다. NCKAP1 단백질 발현의 감소를 확인하기 위해 단백질 면역 분석법인 western blot을 시행하였고, shNCKAP1이 삽입된 세포주에서 그 발현이 억제된 것을 확인하였다. 실시예 4에서 시행하였던 세포주의 상처치유능을 비교한 결과 대조군인 shScramble 대비 shNCKAP1이 삽입된 세포주에서 그 기능이 억제됨을 관찰하여 상피간엽이행 능력의 감소를 관찰하였다. In vivo 동물 모델에서 암 세포의 전이에 관련된 NCKAP1의 기능을 검증하기 위해 실험적 대장암 전이 모델을 확립하였다. 대장암 세포주를 비장의 비정맥 아래에 이식함으로써 간문맥을 통한 간으로의 직접적인 전이를 유도하고 비장을 제거하여 원발암의 형성을 억제시켜 전이암 형성의 관찰을 용이하게 하였다. 종양 형성 관찰을 위한 생체 이미징 기법을 사용하기 위해 발광 효소인 luciferase 활성을 지닌 HCT116 대장암 세포주를 대조군으로 하여 전이암 형성율을 비교한 결과, NCKAP1의 발현이 억제된 세포주에서 간 전이 암의 형성이 현저히 감소한 것을 확인하였다. 실험 종료 시점에서 암 세포가 이식되지 않은 마우스 대비 간의 무게를 비교하였을 때, 대조군에서는 종양 결절 형성에 의해 간의 무게가 크게 증가한 반면 shNCKAP1이 삽입된 그룹에서는 그 무게가 크게 차이나지 않는 것을 관찰하였고 이를 도 5에 나타내었다.
이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. NCKAP1(NCK-Associated Protein 1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물.
  2. NCKAP1 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  3. NCKAP1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 NCKAP1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 NCKAP1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 NCKAP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  5. NCKAP1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 예후 예측용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 NCKAP1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 NCKAP1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 NCKAP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 대장암 전이 예후 예측용 조성물.
  7. 제3항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
  8. 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는 대장암 전이 예후 예측용 키트.
  9. (1) 환자에서 분리된 시료로부터 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 대장암이라고 판단하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. (1) 대장암 환자에서 분리된 시료로부터 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 NCKAP1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 NCKAP1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 대장암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계를 포함하는 대장암 전이 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. NCKAP1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. NCKAP1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 약학조성물.
  13. (1) 대장암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 대장암세포에서 NCKAP1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 NCKAP1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝 방법.
  14. (1) 대장암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 대장암세포에서 NCKAP1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 NCKAP1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 대장암 전이 억제제 스크리닝 방법.
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