MX2010014280A - Distintivos y determinantes asociados con metástasis y método para utilizarlos. - Google Patents

Abstract

La presente invención ofrece métodos para detectar cáncer utilizando biomarcadores.

Description

DISTINTIVOS Y DETERMINANTES ASOCIADOS CON METÁSTASIS Y MÉTODOS PARA UTILIZARLOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud U.S.S.N. 61/075,933, presentada el 26 de junio de 2008, la cual, en su totalidad, se considera parte de la presente, como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en términos generales, con la identificación de distintivos biológicos asociados con determinantes genéticos y también con estas determinantes genéticas que producen la metástasis de cáncer y con los métodos para usar estos distintivos biológicos y determinantes en el cribado, prevención, diagnóstico, terapia, monitoreo y pronóstico del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La metástasis es una característica clave de la mayoría de los tumores sólidos mortales y representa un complejo proceso biológico de múltiples etapas impulsado por un conjunto de alteraciones genéticas o epigenéticas que confieren a una célula tumoral la capacidad de pasar por alto el control local e invadir la matriz circundante, sobrevivir al tránsito en la vasculatura o el sistema linfático y en última instancia colonizar zonas foráneas y proliferar (Gaorav P. Gupta y Joan Massagué (2006) Cell) . Hay consenso general de que estos eventos genéticos que confieren metástasis se pueden adquirir al azar a medida que el tumor prolifera y se expande; en efecto, la carga tumoral total es un indicador positivo de riesgo metastásico. Por otra parte, la creciente evidencia ha reforzado la tesis de que algunos tumores pueden tener (o no) , desde etapas tempranas, la capacidad de metastazisarse . Que algunos tumores tengan propensión innata {"hard-wired" ) para la metástasis en las etapas tempranas de su existencia, está respaldado por la observación clínica de resultados muy variables entre tumores en sus etapas tempranas equivalentes (es décir, cargas tumorales similares) . En consecuencia, se ha demostrado que el estado transcriptómico de una metástasis más semejante a su coincidente primario antes que a otra metástasis (Perou et al., 2000) . Por otra parte, sé ha demostrado que la mayoría de anormalidades genómicas en un genoma de cáncer se presentan temprano en la transición de la etapa benigna a la maligna (Chin, K. , de Solorzano, C.O., Knowles, D., Jones, A., Chou, W. , Rodríguez, E.G., Kuo, W.L., Ljung, B.M., Chew, K., Myambo, K., et al. (2004) . In situ analysis of genome instability in breast cáncer. Nat . Genet 36, 984-988; Rudolph, K.L., Millard, .', Bosenberg, M.W., y DePinho, R.A. (2001). Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans . Nat Genet 28, 155-159. Otros autores, entre ellos Marcus Bosenberg, sugieren que el complemento particular de los eventos genéticos adquiridos en la etapa temprana de evolución, definirá en última instancia, al menos en parte, el comportamiento biológico del tumor, incluido su potencial metastásico. De este modo, nosotros postulamos que las determinantes genéticas del potencial metastásico de un tumor son preexistentes en tumores primarios malignos en su etapa temprana y que estas, determinantes son funcionalmente activas en los propios procesos responsables de la diseminación metastásica. Por lo tanto, estas determinantes metastásicas no son sólo blancos terapéuticos potenciales sino también determinantes de la agresividad del cáncer y en consecuencia, las determinantes metastásicas también son determinantes de pronóstico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en parte, con el descubrimiento de ciertos marcadores biológicos (denominados aquí "DETERMINANTES"), como proteínas, ácidos nucleicos, polimorfismos, metabolitos y otros analitos, así como ciertas condiciones y estados fisiológicos, que ¡están presentes o alterados en individuos que tienen alto riesgo de desarrollar un tumor metastásico.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un método para evaluar el riesgo de desarrollo de un tumor metastásico en un individuo. El riesgo de desarrollar un tumor metastásico se determina por medición del nivel de una cantidad eficaz de una DETERMINANTE en una muestra proveniente del individuo. El incremento en el riesgo de desarrollar un tumor metastásico en el individuo se determina por medición de una alteración clínicamente significativa del nivel de la DETERMINANTE en la muestra. Como alternativa, el incremento en el riesgo de desarrollar un tumor metastásico en el individuo se determina por comparación del nivel de la cantidad eficaz de DETERMINANTE contra un valor de referencia. En algunos aspectos, el valor de referencia es un índice.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para evaluar la evolución de un tumor en un individuo detectando el nivel de una cantidad eficaz de DETERMINANTES en una primera muestra proveniente , del individuo en un primer periodo de tiempo, detectando el nivel de una cantidad eficaz de DETERMINANTES en una segunda muestra proveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo y comparando el nivel de DETERMINANTES detectadas contra un valor de referencia. En algunos aspectos, la primera muestra se extrae del individuo antes de que el tumor se someta a tratamiento y la segunda muestra se extrae del individuo después de que el tumór se somete a tratamiento.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para monitorear la eficacia del tratamiento o para seleccionar un esquema de tratamiento para un tumor metastásico, mediante la detección del nivel de una cantidad eficaz de DETERMINANTES en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo y opcionalmente, la detección del nivel de una cantidad eficaz de DETERMINANTES en una segunda muestra proveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo. El nivel de la cantidad eficaz de DETERMINANTES detectadas en el primer periodo de tiempo se compara con el nivel detectado en el segundo periodo de tiempo o como alternativa, con un valor de referencia. La eficacia de tratamiento se monitorea por un cambio en el nivel de la cantidad eficaz de DETERMINANTES en el individuo.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que tiene un tumor, identificando al paciente que tiene el tumor, en donde una cantidad eficaz de DETERMINANTES se encuentran alteradas en forma clínicamente significativa, según se mide en una muestra del tumor, y tratando al paciente con un régimen terapéutico que previene o reduce la metástasis del tumor.

En un aspecto, la invención proporciona un método para seleccionar un paciente con tumor que necesita tratamiento complementario, mediante la evaluación del riesgo de metástasis en el paciente al medir una cantidad eficaz de DETERMINANTES en donde una alteración clínicamente significativa de dos o más DETERMINANTES en una muestra de tumor del paciente, indica que el paciente necesita tratamiento complementario.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para informar una decisión de tratamiento para un paciente con tumor, al obtener información sobre una cantidad eficaz de DETERMINANTES en una muestra del tumor de un paciente y seleccionar un régimen de tratamiento que previene o reduce la metástasis del tumor en el paciente si dos o más DETERMINANTES están alteradas de manera clínicamente significativa.

En varias modalidades, la evaluación y/o monitoreo se logra con un nivel predeterminado de previsibilidad. Por nivel predeterminado de previsibilidad, se entiende que el método proporciona un nivel aceptable de exactitud de diagnóstico o exactitud clínica. La exactitud de diagnóstico o clínica se determina por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, con los métodos descritos en la presente.

Una DETERMINANTE incluye, por ejemplo, ; las DETERMINANTES 1 a 360 descritas aquí. Se miden una, dos, tres, cuatro, cinco, diez o más DETERMINANTES. De preferencia, se miden al menos dos DETERMINANTES seleccionadas entre las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271. Como opción, los métodos de la invención también incluyen la medición de al menos un parámetro estándar asociado con un tumor.

El nivel de una DETERMINANTE se mide por métodos electroforáticos o inmuno químicos. Por ejemplo, el nivel de la determinante se detecta por radioinmunoanálisis , inmunofluorescencia o por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.

El individuo tiene un tumor primario, un tumor recurrente o un tumor metastásico. En algunos aspectos, la muestra se extrae de un individuo cuyo tumor ya se ha tratado previamente. Como alternativa, la muestra se extrae de un individuo antes de que el tumor se haya sometido a tratamiento. La muestra es una biopsia tumoral, por ejemplo, una biopsia con aguja gruesa, una biopsia de tejido por escisión o una biopsia de tejido por incisión o una muestra de sangre con células tumorales circulantes .

También está incluido en la invención un perfil de expresión de referencia tumoral metastásica que contiene un patrón de niveles marcadores de una cantidad eficaz de dos o más marcadores seleccionados entre las DETERMINANTES 1 a 360. De preferencia, el perfil contiene un patrón de niveles de marcadores de las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271. También se incluye un medio automático de lectura que contiene uno o más perfiles de expresión de referencia de tumor metastásico y opcionalmente resultados de análisis adicionales e información del individuo. En otro aspecto, la invención proporciona un estuche que comprende una pluralidad de reactivos de detección de DETERMINANTES que detectan las DETERMINANTES correspondientes . El reactivo de detección consiste, por ejemplo, en anticuerpos o fragmentos de los mismos, oligonucleótidos o aptámeros .

En otro aspecto, la invención proporciona un panel de DETERMINANTES que contiene una o más DETERMINANTES indicativas de una ruta fisiológica o bioquímica asociada con metástasis o con la evolución de un tumor. La ruta fisiológica o bioquímica incluye, por ejemplo, En otro aspecto más, la invención proporciona una manera de identificar un biomarcador que es indicativo de enfermedad por la identificación de uno o más genes que se expresan de manera diferencial en la enfermedad en comparación con un control y así producir una lista de genes seleccionados como objetivo; e identificar uno o más genes de la lista seleccionada que estén asociados con un aspecto funcional del avance de la enfermedad. El aspecto funcional es, por ejemplo, migración celular, angiogénesis , degradación de la matriz extracelular o resistencia a anoikis. Como opción, el método incluye identificar üno o más genes en la lista de genes seleccionados como objetivo, que incluyan un cambio evolutivamente conservado para producir una segunda lista de genes seleccionados como objetivo. La enfermedad es, por ejemplo, cáncer, como el cáncer metastásico.

Los compuestos que modulan la actividad o expresión de una DETERMINANTE se identifican al proporcionar una célula que expresa la DETERMINANTE, poner en contacto (por ejemplo, in vivo, ex vivo o in vitro) la célula con una composición que contenga un compuesto candidato; y determinar si el sustrato altera la expresión de actividad de la DETERMINANTE. Si la alteración observada en presencia del compuesto no se observa cuando la célula entra en contacto con una composición carente del compuesto, el compuesto identificado modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE.

En un individuo el cáncer se trata administrándole un compuesto que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE o administrándole un agente que modula la actividad o expresión de un compuesto q e es modulado por una DETERMINANTE. El compuesto puede ser, por ejemplo, (i) un polipéptido DETERMINANTE; (ii) un ácido nucleico que codifica para una DETERMINANTE; (iii) un ácido nucleico que disminuya la expresión o actividad de un ácido nucleico que codifica para una DETERMINANTE, por ejemplo, derivados, fragmentos, análogos y homólogos del mismo; (iv) un polipéptido que disminuya la expresión o actividad de una DETERMINANTE como un anticuerpo específico para la DETERMINANTE. El término "anticuerpo" (Ab - antibody) , en el sentido que se utiliza en la presente, incluye anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) , anticuerpos humanizados o humanos, anticuerpos Fv, diabodies y fragmentos de anticuerpos, siempre que manifiesten la actividad biológica deseada. Por ejemplo, el compuesto es TGF y el agente es inhibidor de TGF . Otro ejemplo es CXCR4 y el agente es un antagonista de CXCR4.

A menos que se defina de otro modo, todos: los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen el mismo significado que para una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica de la presente invención se puedan utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, se describen los métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí, se consideran, en su totalidad, parte de la presente como referencia. En caso de conflicto, la presente solicitud, incluidas las definiciones, fungirá como control. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos descritos aquí sólo son ilustrativos y no tienen fines limitativos.

Otras particularidades y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones, las cuales quedan comprendidas en éstas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra que la expresión de MET específica en melanocitos estimula la formación de melanoma cutáneo. (A) Los melanocitos se recolectaron a partir de los animales indicados y se adaptaron al cultivo. El AR total se extrajo a partir de melanocitos cultivados en presencia o ausencia de doxiciclina (DOX) y la expresión de MET (Tg MET) se evaluó por RT-PCR utilizando cebadores específicos para el transgén. R15, control internó de proteína ribosómica R15; -RT, control PCR de transcriptasa no inversa. (B) Tumores primarios (T1-T6) se recolectaron a partir de animales iMet en doxiciclina y se evaluaron para la expresión de los marcadores melanoc ticos tirosihasa, TRPl y Dct por RT-PCR utilizando cebadores específicos para el gen. XB2, línea celular de queratinocitos de ratón; B16F10, línea celular de melanoma de ratón; R15, control interno de proteína ribosómica R15; -RT, control PCR de transcriptasa no inversa. (C) Tinción inmunohistoquímica de S100 específica para melanocitos en un melanoma primario inducido por MET. Tumor, t; folículo, f; melanocitos foliculares fm; adipocitos, a, (D) Tinción inmunohistoquímica de c-Met total y c-Met fosforilado en un melanoma primario inducido por MET. (E) Se realizó RT qPCR para analizar la expresión de HGF en melanomas primarios inducidos por MET (T1-T6) . Los datos de expresión del tumor están normalizados para expresión en dos línea celulares de melanocitos Ink4a/Arf_/~ .

La Figura 2 muestra que la activación de Met impulsa el desarrollo de melanomas metastásicos y promueve la diseminación pulmonar. (A) Se sembraron cámaras Boyden con 5 x 104 células tumorales iMet (línea BC014) en medio libre de suero. Las cámaras se colocaron en medio quimioatrayente (con 10% de suero) con y sin 50 ng/ml de HGF recombinante y se incubaron durante 24 horas. Las células invasivas se visualizaron por tinción con violeta cristal. (B) Secciones teñidas con H&E de un melanoma primario de célula cutánea fusiforme en la piel dorsal de un ratón transgénico iMet, inducido con doxiciclina y metástasis distal residente en ganglios linfáticos, glándula suprarrenal y pulmón. (C) Se inyectaron 5 x 105 células en la vena de la cola de SCID y los ratones se observaron para detectar la formación de nodulos pulmonares, una correlación de la diseminación metastásica. Panel a la izquierda: Sección teñida con H&E de tejido pulmonar sin nodulos extraído de animales SCID inyectados en la vena de la cola con una línea celular de melanoma HRAS* (ratones 0/4) ; Panel a la derecha: Sección teñida con H&E de tejido pulmonar infiltrado con nodulos extraído de animales SCID inyectados en la vena de la cola con la línea celular BC014 impulsada por MET (iMet) (ratones 3/4) . Tumor, t.

La Figura 3 muestra al análisis genómico multidimensional de especies cruzadas coordinado con un cribado genético funcional de baja complejidad para invasión celular que identifica determinantes , de metástasis. (A) Genes expresados de manera diferencial (grupos de 1597 sondas) por análisis SAM de los perfiles de expresión generados a partir de iHRAS* y se intersectaron melanomas cutáneos iMet por mapeo de ortólogos con genes residentes dentro de regiones de amplificaciones y deleciones en melanoma metastásico humano o con genes expresados de manera diferencial entre melanoma primario humano y melanoma metastásico para definir 360 candidatos. (B) El análisis por el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) de genes expresados diferencialmente entre iHRAS* y melanomas de ratón iMet (grupos de 1597 sondas, parte superior) y la lista de genes integrados de especies cruzadas (lista de 360 genes filtrados, parte inferior) se compararon con 9 conjuntos de genes extraídos al azar de tamaño igual. Parte superior 4, se presentan clasificaciones funcionales significativas. Las líneas quebradas representan la importancia según IPA. (C) Diagrama de flujo que representa el cribado genético de baja complejidad para invasión. 230 clones que representan 199 de los 295 candidatos regulados por aumento y/o amplificados expresados en un sistema lentiviral se transdujeron individualmente en melanocitos primarios humanos (HMEL468) inmortalizados por TERT y se evaluaron respecto a invasión en una placa de invasión Matrigel® de 96 pocilios. El grado de invasión se midió mediante cuantificación por fluorescencia y los valores > se normalizaron según los controles GFP. Las puntuaciones de candidatos equivalentes a más del doble de la desviación estándar respecto al control vectorial en dos cribados independientes (n=45) , se seleccionaron para cribado de validación secundario en HMEL468 o en WM3211 utilizando cámaras de invasión Matrigel de 24 pocilios. (D) Resumen del histograma del cribado genético de baja complejidad respecto a genes de proinvasión. Los melanocitos cebados HMEL468 se transdujeron con virus ADNc candidatos prometástasis individuales y después se depositaron en placas de ensayo de invasión Transwell® de 96 pocilios. El grado de invasión se midió mediante cuantificación por fluorescencia y los valores se normalizaron según el control vectorial vacío. La invasión inducida por ADNc candidato equivalente a 2X la desviación estándar respecto a los controles GFP en dos intentos de cribado independientes, se consideraron aciertos de cribado primario (n=45) . (E) Resumen del histograma del número de incrementos en la actividad invasiva con relación a las 31 determinantes de metástasis validadas de control.

La Figura 4 muestra al análisis cuantitativo automatizado (AQUA® - Automated Quantitative Analysis) de la expresión de proteínas para determinantes representativas (A) Fascinl (FSCN1) y (B) HSF1, realizadas en micromatrices de tejido (TMA - tissue microarrays) de muestras de tumor de melanoma metastásico, primario y nevo, según se describe en [Camp, R.L., Chung, G.G. , & Rimm, D.L., Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat Med 8(11), 1323-1327 (2002)]. Se evaluaron núcleos informativos en cuanto a puntuaciones AQUA® para tinción FSCN1 y HSF1 en compartimientos celulares citoplásmicos y nucleares, respectivamente. Significancia (S; 5%) con base en la prueba de Fisher. Véase la Tabla 2 para el resumen de resultados.

La Figura 5 muestra (A) agregación jerárquica media K y (B) análisis Kaplan-Meier de supervivencias global (arriba) y libre de metástasis (abajo) de dos dé las subclases anteriores en una cohorte de 295 cánceres de mama en la etapa I-II [datos de cáncer de mama de: van de Vijver, M.J. et al., A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cáncer. N Engl J Med 347 (25), 1999-2009 (2002); van't Veer, L.J. et al., Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cáncer. Nature 425 (6871), 530-536 (2002)].

La Figura 6 muestra la metodología de cribado anoikis in vi tro. (A) Estrategia de cribado anoikis in vitro. (B) Células epiteliales intestinales de rata (RIE -Rat intestinal epithelial) reducen su viabilidad cuando se aplican en placas de baja fijación. Las células RIE se depositaron en placas ULC de 96 pocilios o placas adherentes, durante 24 horas. Los niveles de ATP se midieron respecto a su viabilidad celular que se obtuvo como un índice del nivel en el punto de evaluación 24 h/0 h. (C) RIE que expresan V5-mTrkB. Las células RIE se infectaron y a las 48 horas el lisado celular se aisló y se resolvió por SDS-PAGE. El análisis de transferencia Western se hizo con un anticuerpo a-V5.

La Figura 7 muestra varios genes que confieren resistencia anoikis a las células RIE. Las células RIE se infectaron con retrovirus que expresa uno de los genes candidato, se depositaron en placas de baja aglomeración (ultra-low cluster) y se midió la viabilidad de las células a las 24 horas posteriores a la siembra. Los valores se dan con relación a la viabilidad a 0 horas. Todas las lecturas se hicieron por triplicado. Se resaltan las lecturas del vector vacío, el BDNF o mTrkB (controles positivos) .

La Figura 8 muestra los veinte genes candidato que confieren resistencia anoikis a células epiteliales intestinales de rata (RIE) equivalente a más de . dos desviaciones estándar respecto a la mediana. Nueve genes candidato (HNRPR, CDC20, PRIM2A, HRSP12, ENY2 , MGC14141, RECQL, STK3 y MX2) dieron más de 1 desviación estándar respecto a la mediana en dos cribados independientes. Estos genes están localizados en los cromosomas indicados.

Figura 9. Genes que confieren a las células RIE la habilidad de unirse después de mantenerlas en suspensión. Células RIE que expresan un gen candidato se sembraron en placas ULC durante 24 horas. Las células en suspensión se transfirieron a placas adherentes y 24 horas después las células adheridas se tiñeron con violeta cristal. La viabilidad celular se obtuvo en los puntos de evaluación de 24 h/0 h. Todas las lecturas se hicieron por triplicado .

La Figura 10 muestra determinantes de metástasis que estimulan tumorigenicidad . (A) Células H EL468 que expresan de manera estable GFP o las determinantes de metástasis indicadas, se inyectaron por vía subcutánea en ratones SCID (n=6) , los cuales se monitorearon para detectar la formación del tumor mediante exámenes clínicos. Se muestran los tumores (t) primarios teñidos con H&E representativos que manifiestan invasión local en la fibra muscular circundante (m) y adipocitos (a) . (B) Tabla que resume datos obtenidos a partir de ensayos de tumorigénesis inducida por determinantes.

La Figura 11 ilustra que la determinante HOXAl estimula la invasión celular y la capacidad de diseminación pulmonar. (A) Expresión ectópica de HOXAl en HMEL468 que da lugar a un aumento en la activación de FAK (Tyr397; panel a la izquierda) y el aumento correspondiente en invasión a través de Matrigel® en ensayos de invasión Transwell (panel a la derecha; cuantificado en la Figura 11C) . (B) Análisis por transferencia Western para HOXAl-V5 que confirma la expresión de HOXAl en líneas celulares transducidas WM115 y WM3211 (panel a la izquierda) e imágenes representativas de los ensayos de invasión Transwell (panel a la derecha) cuantificados en la Figura 11C. (C) Cuantificación de los datos de la cámara de invasión presentados en las Figuras 11A-B. (D) Células HMEL468 que expresan de manera estable GFP o H0XA1, se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola de ratones SCID (n=6) y se examinaron en necropsia para detectar nodulos pulmonares a las 12 semanas posteriores a la inyección. Se detectaron nodulos pulmonares macroscópicos (y microscópicos) en 50% de la cohorte HOXA1 (n=3) pero en ninguno de los controles. Microfotografías con H&E representativas de nodulos pulmonares (t) y el parénquima pulmonar circundante (1) extirpado de un animal inyectado con HMEL468 -HOXA1. (E) Células de melanoma WM115 que expresan el vector vacío (EV) o HOXA1 se inyectaron por vía subcutánea en ratones lampiños y se evaluaron 46 días después de la inyección. (F) Metástasis representativa del pulmón aislado de un ratón lampiño que tiene células WM115-H0XA1 inyectadas.

La Figura 12 muestra el análisis de transcriptoma inducido por HOXA1 que identifica una red Smad3 definida por Ingenuity Pathway Analysis. Una red molecular generada mediante Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems Inc.) . La red se visualiza gráficamente como nodos (genes) y líneas de conexión (las relaciones biológicas entre los nodos) . Las líneas sólidas representan las interacciones directas y las líneas quebradas representan las interacciones indirectas. Los colores rojo y verde denotan genes que estaban sobreexpresados o subexpresados en el análisis de transcriptoma, respectivamente. Las formas de los objetos representan las familias funcionales a las cuales pertenecen las proteínas. Véase, la Tabla complementaria s3 para familias de genes y descripciones . (B) Las líneas de células transducidas con H0XA1 se evaluaron en cuanto a la expresión de SMAD3 utilizando RT-qPCR. Los valores se calcularon con relación al control interno GAPDH y el control experimental GFP. Las barras de error representan el error estándar.

La Figura 13 muestra que la expresión ectópica de HOXA1 aumenta la invasión celular a través del incremento de la respuesta de señalización TGFP . (A) Células WM115 que expresan ectópicamente HOXA1 se transíectaron con el reportero luciferasa 3TP-Lux inducible por TGFP, y luego se sometieron a tratamiento con o sin TGF . para evaluar el grado de respuesta en comparación con el control ; que expresa GFP. Las barras de error representan el error estándar; prueba t bilateral: -TGFP p=0.003; +TGFP, p<0.0001. (B) Lisados de células completas WM115 que expresan establemente GFP o HOXA1 propagadas en suero al 10% o suero al 1% con o sin TGFp, se analizaron por transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados. (C) . Células M115 que expresan establemente H0XA1 se transdujeron con SMAD3 ARNsh (shSMAD3) o ARNsh no dirigido (sh T) y se aplicaron en cámaras de invasión Transwell Matrigel para evaluar la invasión celular en comparación con la línea celular precursora M115 transducida con virus de control GFP (GFP) . Las imágenes representativas de las cámaras de invasión se presentan en los paneles a la derecha. Prueba t bilateral: GFP vs . shNT, p = 0.0008; shNT vs. shSMAD3, p = 0.0022. (D) Células de melanoma WM115 que expresan el vector vacío (EV) o HOXA1, se inyectaron por vía subcutánea en ratones lampiños . Las secciones tumorales de xenoinjerto resultantes se sometieron a inmunotinción con anti-fosf0-SMAD3 para confirmar la activación de SMAD3 en muestras tumorales HOXA1.

Figura 14. Melanocitos derivados de ratón Ink4a/A'rf-/- se transdujeron con HRAS* (M3HRAS) que sobreexpresan FSCNl o HOXA1 exhiben (A) incremento en la invasión a través de Matrigel en ensayos de invasión Transwell (B) aumento en el crecimiento del tumor subcutáneo en ratones lampiños y (C) incremento en la formación de nodulos pulmonares después de la inyección intravenosa en la vena de la cola en ratones SCID. Cabe señalar que en C, la diferencia en el índice de masa pulmonar/corporal para la cohorte FSCNl no es significativa debido a la relativa buena salud de los animales en el criterio de valoración del ensayo que fue fijado por la cohorte H0XA1 enferma en extremo .

Figura 15. Se utilizó AR extraído de (A) células de melanoma WM115 y (B) melanocitos humanos transformados (HMEL468) que expresan el vector vacío (grupo de control) o H0XA1 (Grupo 1) para el análisis qPCR cuantitativo mediante el uso de matrices RT2 Profiler PCR Arrays (Superarray) para analizar la expresión de un panel de genes asociados con metástasis. Las secciones tumorales de xenoinjerto resultantes se sometieron a inmunotinción con anti-CXCR4 para confirmar la sobreexpresión en muestras tumorales HOXA1 (Figura 13) . Se muestran genes que cumplen con la expresión diferencial límite entre en control y grupos experimentales.

Figura 16. Células de melanoma WM115 y melanocitos humanos transformados (H EL468) que expresan vector vacío (EV) o HOXA1 se inyectaron por vía subcutánea en ratones lampiños. Secciones tumorales de xenoinjerto resultantes se sometieron a inmunotinción con anti-CXCR4 para confirmar la sobreexpresión en muestras tumorales HOXA1.

Figura 17 (A) Análisis QuantiGene de expresión de ARN de la UBE2C en una cohorte de Spitz nevo y muestras FFPE de melanoma. (B) MEF primarias deficientes en Ink4a/Arf se transfectaron con los vectores indicados que expresan HRASV12, MYC y UBE2C. Vec = control vectorial LacZ; las barras indican + D.S. (desviación estándar).

Figura 18 (A) Células de melanoma WM3211 que expresan establemente vector vacío (ev) , Geminin o Nedd9 (control positivo) se evaluaron en cuanto a invasión a través de Matrigel en ensayos de invasión Transwell. (B) Análisis de inmunotransferencia de Usados de células totales extraídos a partir de células WM3211 que expresan establemente vector vacío (ev) , Geminin o Caveolin 1 (control negativo) . Anti-fosfo FAK y anti-fosfo ERK representan especies FAK y ERK activadas, respectivamente. (C) Células M3211 que expresan establemente vector vacío (EV) o Geminin (GEMN) se sometieron a inmunotinción para fosfo-FAK (P-FAK; rojo) y confirmar aumento en la activación FAK observada en la Figura 18B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la identificación determinantes que confieren a los individuos un tumor metastásico o que están en riesgo de desarrollar un tumor metastásico y de características distintivas asociadas con aquellas .

La comparación de especies cruzadas entre conjuntos de datos provenientes de humanos y de ratón aporta un filtro biológico para la identificación de genes causales de cáncer relevantes para la biología del melánoma humano. En el presente estudio, dos modelos de ratón con melanomas, cuyos tumores primarios exhibieron un potencial distinto para metastazisarse, se usaron para identificar genes que se expresaron de manera diferencial en la metástasis. Una comparación del perfil de expresión de tumores primarios que se originan a partir de modelos GEM metastásicos (iMet) y no metastásicos ( iHRAS* ) identificó una lista de 1597 genes expresados de manera diferencial que se priorizaron por filtración biológica mediante análisis de especies cruzadas y se traslaparon con patrones de amplificación y deleción obtenidos por análisis array-CGH. Se formuló la hipótesis de que es más probable qué los cambios evolutivamente conservados (por ejemplo, en ratón y en humanos) sean esenciales; por lo tanto, la triangulación de los datos de expresión provenientes de modelos GEM (con ventajas de antecedentes genéticos definidos y correlación fenotípica evidente) con datos genómicos derivados de tumores metastásicos humanos permitieron la priorización y aportaron relevancia humana a los 1597 candidatos.

Se identificó una lista de 295 genes regulados por aumento y/o amplificados y 65 regulados por disminución y/o eliminados, candidatos a metástasis evolutivamente conservados e impulsados por el fenotipo, por comparación de los transcriptomas de dos modelos de ratón manipulados genéticamente de melanomas cutáneos con potencial metastásico diferencial, seguida por triangulación, con perfiles genómicos y transcriptómicos de melanomas primarios y metastásicos . Estos candidatos se enlistaron en cribados genéticos de baja complejidad para invasión, resistencia anoikis o sobrevivencia en circulación y colonización, que corresponden a las tres etapas principales en la propagación metastásica (es decir, escape del punto tumoral primario, circulación y finalmente colonizar y proliferar en un sitio distal foráneo) . Hasta ahora, el cribado de invasión ha definido treinta y, una (31) determinantes de metástasis validadas capaces de conferir actividad proinvasión a melanocitos humanos inmortalizados con TERT y células de melanoma. Es de esperarse que se definirán subconjuntos independientes de los candidatos a metástasis, como determinantes adicionales a partir de cribados de resistencia a anoikis o colonización que en todo caso, coinciden sólo en forma parcial, con las determinantes provenientes del cribado de invasión. Hasta ahora, el cribado de resistencia a anoikis ha definido nueve (9) determinantes validadas con capacidad para conferir sobrevivencia en suspensión, sin traslaparse con las determinantes de invasión. Estas determinantes juntas o un subconjunto de ellas cubrirán las principales etapas implicadas en la diseminación metastásica.

Se ha reconocido que los tumores primarios son genéticamente heterogéneos. Si las determinantes; de metástasis en una subpoblación dentro de un tumor primario le confieren una ventaja proliferativa y al final impulsan su diseminación a sitios distales, es de esperarse entonces que el derivado metastásico será más homogéneo con relación a su contraparte primaria y por lo tanto manifiesta un patrón de expresión correlacionado con la evolución para tales determinantes de metástasis. A fin de evaluar el patrón de expresión de 25 de estas determinantes aprovechamos el compendio de datos de perfiles de expresión de Oncomine (Rhodes D.R. et al. ONCOMINE: a cáncer microarray datábase and integrated data- ining platform. Neoplasia 6, 1-6. 2004). Sin embargo, aunque la mayoría de estas 25 determinantes de metástasis no hayan estado específicamente involucradas en invasión o metástasis, todas y cada una de ellas presentan un patrón de expresión significativamente correlacionado con el grado de progresión del tumor o el pronóstico en tumores sólidos de melanoma y no melanoma. Por ejemplo, 12 de las 25 determinantes muestran aumento de expresión en metástasis con relación a la enfermedad primaria. En tumores cerebrales (gliomas) , otro tumor mesenquimatoso similar al melanoma, 13 de las determinantes de metástasis presentaron patrón de expresión correlacionado con la progresión, es decir, expresión creciente en gliomas de mayor grado. De estos, seis mostraron correlación positiva con resultados. En adenocarcinoma prostático, diez de las determinantes de metástasis presentaron un aumento significativo en expresión de la etapa primaria a la metástasis. En pulmón, cinco presentaron correlación con grados de tumor crecientes. El traslape más significativo se observó con el adenocarcinoma de mama, en donde 13 de las 25 determinantes de metástasis mostraron correlación con etapas o grados de progresión tumoral; por otra parte, se reportó que 13 de las determinantes están correlacionadas con el pronóstico.

En consecuencia, la invención ofrece métodos para identificar individuos que tienen un tumor metastásico o que se encuentran en riesgo de desarrollar un tumor metastásico, mediante la detección de determinantes asociadas con el tumor metastásico, incluidos aquellos individuos que son asintomáticos respecto al tumor metastásico. Estos distintivos y determinantes son útiles también para monitoreo de individuos sometidos a tratamiento y terapias contra el cáncer y para seleccionar o modificar terapias y tratamientos que serian eficaces en individuos que padecen cáncer, en donde la selección y uso de estos tratamientos y terapias disminuyen la progresión del tumor o retrasan de manera considerable o previenen su aparición o bien reducen o previenen la incidencia de la metástasis del tumor.

Definiciones "Exactitud" se refiere al grado de conformidad de una cantidad medida o calculada (un valor reportado en una prueba) respecto a su valor real (o verdadero) . La exactitud clínica se relaciona con la proporción de resultados verdaderos (positivos verdaderos (TP - true positives) o negativos verdaderos (TN - true negatives) frente a resultados mal clasificados (positivos falsos (FP false positives) o negativos falsos (FN - false negatives) ) y puede establecerse como sensibilidad, especificidad, valores diagnóstico positivos (PPV positive predictive valúes) o valores diagnóstico negativos (NPV - negative predictive valúes) o como probabilidad, razón de momios, entre otras medidas.

En el contexto de la presente invención el término "determinante" abarca, entre otros, proteínas, ácidos nucleicos y metabolitos, junto con sus polimorfismos, mutaciones, variantes, modificaciones, subunidades, fragmentos, complejos proteína- ligando y productos de degradación, complejos proteína- ligando, elementos, metabolitos relacionados y otros analitos o mediciones provenientes de muestras. Las determinantes también pueden incluir proteínas mutadas o ácidos nucleicos mutados . Las determinantes también abarcan factores no sanguíneos o marcadores fisiológicos del estado de salud, distintos de los analitos, por ejemplo, "parámetros clínicos" definidos en la presente, así como "factores de riesgo de laboratorio tradicionales", también definidos en la presente. Las determinantes también incluyen cualquier índice calculado generado matemáticamente o combinaciones de una o más de las mediciones anteriores, que incluyen tendencias temporales y diferencias. Si estuvieran disponibles y a menos que se indique de otro modo, las determinantes que son productos génicos se identifican con base en las abreviaturas alfabéticas oficiales o el símbolo génico asignado por el International Human Genome Organization Naming Committee (HGNC) y enlistado a la fecha de esta presentación en la dirección de Internet del Centro Nacional para Información en Biotecnología de los Estados Unidos (NCBI-National Center for Biotechnology Information) (http : //www. ncbi . nlm. nih. gov/sites/entrez?db=gene) , también conocido como Entrez Gene. ' - El término "DETERMINANTE" o "DETERMINANTES" abarca uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos cuyos niveles se encuentran cambiados en individuos que tienen un tumor metastásico o están propensos a desarrollar un tumor metastásico o en riesgo de tener un tumor metastásico. Las DETERMINANTES individuales se resumen en la Tabla '1 y colectivamente se denominan aquí, entre otras, "proteínas asociadas a tumor metastásico" .

"Polipeptidos DETERMINANTES" o "proteínas DETERMINANTES". Los ácidos nucleicos correspondientes que codifican para polipéptidos se denominan "ácidos nucleicos asociados a tumor metastásico", "genes asociados a tumor metastásico", "ácidos nucleicos DETERMINANTES" o "genes DETERMINANTES". A menos que se indique de otro modo, los términos "DETERMINANTE", "proteínas asociadas a tumor metastásico", "ácidos nucleicos asociados a tumor metastásico", se refieren a cualquiera de las secuencias expuestas en la presente. Los metabolitos correspondientes de las proteínas o ácidos nucleicos DETERMINANTES también se pueden medir, así como cualquiera de los metabolitos marcadores de riesgo tradicionales anteriormente mencionados .

A los marcadores fisiológicos del estado de salud (por ejemplo, edad, historia familiar y otras mediciones de uso común como factores de riesgo tradicionales) se les denomina "fisiología DETERMINANTE". Los índices calculados generados a partir de la combinación matemática de mediciones de uno o más, de preferencia, dos o más de las clases de DETERMINANTES anteriormente mencionadas se denominan "índices DETERMINANTES".

El término "parámetros clínicos" abarca todos los biomarcadores , distintos de la muestra y los analitos, del estado de salud del individuo u otras características, entre otras, por ejemplo, edad (Edad) , etnia (RAZA) , género (Sexo) o historia familiar (FamHX) .

Una "célula endotelial circulante" (CEC circulating endotelial cell) es una célula endotelial de la pared interna de los vasos sanguíneos que, en ciertas circunstancias, incluida la inflamación, se desprende y entra al torrente sanguíneo, y contribuye a la formación de nueva vasculatura asociada con la patogénesis del cáncer. Las CEC pueden ser útiles como marcador de la progresión de un tumor y/o la respuesta a la terapia antiangiogénica.

Una "célula tumoral circulante" ("CTC" circulating tumor cell) es una célula tumoral de origen epitelial que en la metástasis se desprende del tumor primario y entra a la circulación. El número de células tumorales circulantes en la sangre periférica está asociado con la progresión en pacientes con cáncer metastásico. Estas células se pueden separar y cuantificar por métodos inmunológicos que detectan células epiteliales.

"FN" significa negativo falso, que en una prueba del estado de la enfermedad significa clasificar a un individuo enfermo incorrectamente como no enfermo o normal .

"FP" significa positivo falso, que en una prueba del estado de la enfermedad significa clasificar a un individuo normal incorrectamente como enfermo.

Una "fórmula", "algoritmo" o "modelo" es cualquier ecuación matemática, proceso algorítmico, analítico o programado o técnica estadística que toma una o más entradas continuas o categóricas (aquí denominadas "parámetros") y calcula un valor de salida, algunas veces denominado "índice" o "valor índice". Ejemplos no exclusivos de "fórmulas" incluyen sumas, cocientes y operaciones de regresión, como coeficientes y exponentes, transformaciones y normalizaciones del valor biomarcador (incluidos, entre otros, aquellos esquemas de normalización que tienen como base parámetros clínicos, como género, edad o etnia) , reglas y lineamientos , modelos de clasificación estadísticos y sistemas de redes neurales experimentados en poblaciones históricas . Para combinar DETERMINANTES se usan, en particular, ecuaciones lineales y no lineales y análisis de clasificación estadísticos para determinar la relación entre los niveles de DETERMINANTES detectadas en la muestra de un individuo y el riesgo de enfermedad metastásica de éste. En panel y construcción de combinación son de interés particular los algoritmos de clasificación estadística estructural y sináptica y los métodos de generación de índice de riesgo que utilizan particularidades de reconocimiento de patrones, que incluyen técnicas establecidas como relación cruzada, análisis de componentes principales (PCA - Principal Components Analysis) , rotación de factor, regresión logística (LogReg) , análisis discriminante lineal (LDA -Linear Discriminant Analysis) , análisis discriminante lineal eigengene (ELDA - Eigengene Linear Discriminant Analysis) , máquinas vectoriales de soporte (SVM - Support Vector Machines) , bosque aleatorio (RF - Random Forést) , i árbol de particiones recursivas (RPART - Recursive Partitioning Tree) , así como otras técnicas relacionadas de clasificación de árbol de decisiones, Shrunken Centroids (SC) , StepAIC, Kth-Nearest Neighbor, Boosting, árboles de decisiones, redes neurales, redes Bayesianas Networks, máquinas vectoriales de soporte y modelos de Markov ocultos, entre otras. Se pueden emplear otras técnicas en el análisis de riesgo de supervivencia y tiempo para un suceso, que incluyen, los modelos Cox, Weibull, Kaplan-Meier y Greenwood, muy conocidos para los expertos en la técnica. Muchas de estas técnicas son útiles combinadas con una técnica de selección de DETERMINANTE, como la selección en avance, la selección retroactiva o la selección gradual, enumeración completa de todos los paneles potenciales de un tamaño dado, algoritmos genéticos o pueden incluir en su propia técnica metodologías de selección de biomarcadores . Estas pueden asociarse con criterios de información como el criterio de información de Akaike (AIC - Akaike 's Information Criterion) o criterio de información Bayes (BIC - Bayes Information Criterion) a fin de cuantificar el intercambio entre biomarcadores adicionales y la mejora del modelo y contribuir en la disminución del sobre ajuste. Los modelos predictivos resultantes se pueden validar en otros estudios o validarse por cruzamiento en el estudio en el se experimentaron originalmente, mediante el uso de técnicas como Bootstrap, Leave-One-Out (LOO) y validación cruzada 10-Fold (10-Fold CV) . En varias etapas, se pueden estimar índices de descubrimiento falsos por permutación de valor según las técnicas conocidas. La expresión "función de utilidad en economía sanitaria" se refiere a una fórmula que se deriva de la combinación de la probabilidad esperada de un grupo de resultados clínicos en una población de pacientes aplicable idealizada, antes y después de introducir una intervención diagnóstica o terapéutica én el esquema estándar de atención. Comprende, estimar la exactitud, eficacia y características de desempeño de esta intervención y una medición del costo y/o valor (utilidad) asociada con cada resultado, que puede derivarse de los costos de atención reales del sistema de salud (servicios, abastecimientos, dispositivos y medicamentos, etc.) y/o un valor aceptable estimado por año de vida ajustado según la calidad (QALY - quality adjusted Ufe year) que genera cada resultado. La x suma, entre todos los resultados pronosticados, del producto del tamaño de población pronosticado para un resultado multiplicado por la respectiva utilidad esperada para el resultado, es la utilidad en la economía sanitaria total de un estándar de atención dado. La diferencia entre (i) la utilidad total en la economía sanitaria calculada para el estándar de atención con la intervención, frente a (ii) la utilidad total en la economía sanitaria para el estándar de atención sin la intervención da como resultado una medición global del costo en la economía sanitaria o valor de la intervención. Esto puede ser dividido entre el grupo completo de pacientes que se analizan (o sólo entre el grupo de intervención) para llegar a un costo por intervención unitaria y para orientar decisiones tales como posicionamiento en el mercado, precios y presupuestos para aceptación en el sistema sanitario. Estas funciones de utilidad económica son de uso común para comparar la rentabilidad de la intervención pero también se pueden transformar para estimar el valor aceptable por QALY que el sistema sanitario está dispuesto a pagar o las características de desempeño clínico rentable requeridas para una nueva intervención.

Para intervenciones diagnósticas (o pronosticas) de la invención, puesto que cada resultado (que en una prueba diagnóstica de clasificación de la enfermedad puede ser TP, FP, TN o FN) implica un costo diferente, una función de utilidad en economía sanitaria puede favorecer preferencialmente a la sensibilidad con respecto a la especificidad o PPV respecto a NPV con base en la situación clínica y los costos y valores de resultados individuales y ofrecer así otra medida del desempeño y valor económico sanitario que puede ser diferente de las mediciones de desempeño analíticas o clínicas más directas. Estas mediciones diferentes e intercambios relativos convergen, por lo general, sólo en el caso de una prueba perfecta, con índice de error cero (a.k.a., clasificaciones erróne s de resultados para un individuo pronosticado con cero o FP y FN) , que todas las mediciones de desempeño favorecerán sobre la imperfección, pero en diferentes grados.

Los términos "medir" o "medición" o como alternativa "detectar" o "detección" se refieren a evaluar la presencia, ausencia, actividad o cantidad (que puede ser una cantidad eficaz) de una sustancia dada en una muestra clínica o extraída de un individuo, incluida la derivación de los niveles de concentración cualitativos o cuantitativos de esas sustancias o de otro modo, evaluar los valores o la categorización de los parámetros clínicos de un individuo, distintos de los analitos.

El "valor predictivo negativo" o "NPV" se calcula por TN/ (TN + FN) o la fracción negativa verdadera de todos los resultados de prueba negativos. En sí, este valor también es influenciado por la prevalencia de la enfermedad y la probabilidad previa a la prueba de la población destinada a evaluarse.

Véase, por ejemplo, O'Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Valué Of A Diagnostic Test> How To Prevent Misleading Or Confusing Results", Clin. ' Ped. 1993, 32 (8) :485-491, que trata de especificidad, sensibilidad y valores predictivos positivos y negativos de una prueba, por ejemplo, una prueba de diagnóstico clínico. Con frecuencia, en enfoques binarios de clasificación de la enfermedad que usan una medición de la prueba de diagnóstico continua, la sensibilidad y especificidad se resumen mediante las curvas de características de operación receptoras (ROC - Receiver Operating Characteristics) según Pepe et al., "Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic, Prognostic or Screening marker", Am. J. Epidemiol 2004, 159(9): 882-890, y resumidas por el área bajo la curva (AUC - Area Under the Curve) o estadística "c", indicador que permite la representación de la sensibilidad y especificidad de: una prueba, ensayo o método a través del intervalo completo de los valores de corte de la prueba (o ensayo) con apenas un solo valor. Véase también, por ejemplo, Shultz, "Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures " , capítulo 14 de Teitz, Fundamentáis of Clinical Chemistry, Burtis y Ashwood (eds.) , 4th edición 1996, .B. Saunders Company, págs. 192-199; y Zweig et al . , "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronary Artery Disease", Clin. Chem. , 1992, 38(8): 1425-1428. Un enfoque alternativo que utiliza funciones de probabilidad, razones de momios, teoría de información, valores predictivos, calibración (que incluye la prueba de la bondad del ajuste {goodness-of-fit) ) y mediciones de reclasificación se resume según Cook, "Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction" , Circulation 2007, 115: 928-935.

Por último, los cocientes de riesgos instantáneos y cocientes de riesgos absolutos y relativos dentro de cohortes del individuo definidas por una prueba, i constituyen otra medición de exactitud y utilidad clínica. Con frecuencia se usan varios métodos para definir valores anormales o de enfermedad, que incluyen límites de referencia, límites de discriminación y umbrales de riesgo.

El término "exactitud analítica" se refiere a la reproducibilidad y previsibilidad del propio procesó de medición y se puede resumir en mediciones tales como coeficientes de variación y pruebas de concordancia y calibración de las mismas muestras o controles con diferentes tiempos, usuarios, equipo y/o reactivos. Estas y otras consideraciones en la evaluación de nuevos biomarcadores también se resumen en Vasan, 2006.

"Desempeño" es un término que se relaciona con la utilidad general y la calidad de una prueba de diagnóstico o pronóstico, que incluye, entre otros, exactitud clínica y analítica, otras características analíticas y de proceso, como las características de uso (por ejemplo, estabilidad, facilidad de uso) , valor económico sanitario y costos relativos de los componentes de la prueba. Cualquiera de estos factores puede ser el origen de un mejor desempeño y en consecuencia de la utilidad de la prueba y se pueden medir mediante una "métrica de desempeño" apropiada, , como AUC, tiempo para obtener resultado, vida de anaquel, etc., según sea pertinente.

El "valor positivo predictivo" o "PPV" se calcula por TP/ (TP + FP) o la fracción positiva verdadera de todos los resultados de prueba positivos. En sí, este valor también es influenciado por la prevalencia de la enfermedad y la probabilidad previa a la prueba de la población destinada a evaluarse .

En el sentido que se utiliza en la presente el término "riesgo" se relaciona con la probabilidad de que ocurra un evento durante un periodo de tiempo específico, como sucede en la conversión a eventos metastásicos y puede significar un riesgo "absoluto" o un riesgo "relativo" del individuo. El riesgo absoluto se puede medir con relación a la observación real posterior a' la medición de la cohorte de tiempo correspondiente o con relación a los valores índice desarrollados a partir de cohortes históricas estadísticamente válidas que se han observado durante un periodo de tiempo correspondiente. El riesgo relativo se refiere a la relación de riesgos absolutos de un individuo comparados con los riesgos absolutos de cohortes de ¡bajo riesgo o un riesgo poblacional promedio, que puede variar según sean evaluados los factores de riesgo clínico. Las razones de momios, proporción entre eventos positivos y eventos negativos para un resultado de prueba dado, también se usan comúnmente (momios según la fórmula p/ (1-p) en donde p es la probabilidad de evento y (1-p) es la probabilidad de no evento) para cuando no hay conversión.

"Evaluación del riesgo" o "evaluación de riesgo" en el sentido que se utilizan en la presente consiste en elaborar una predicción de la probabilidad, pronóstico o verosimilitud de que pueda suceder un evento o un estado de avance de enfermedad, la tasa de ocurrencia del evento o conversión de un estado de enfermedad a otro, es decir, de un tumor primario a un tumor metastásico o a un punto de riesgo de desarrollar un tumor metastásico o del riesgo de un evento metastásico primario a un evento metastásico secundario. La evaluación de riesgo también puede incluir la predicción de futuros parámetros clínicos, valores de factores de riesgo de laboratorio tradicionales u otros índices de cáncer, en términos absolutos o relativos con relación a una población en la que previamente se hicieron mediciones. Los métodos de la presente invención se pueden emplear para hacer mediciones continuas o categóricas del riesgo de un tumor metastásico, diagnosticando y definiendo así el espectro de riesgo de una categoría de individuos definida como de riesgo para tumor metastásico. En el escenario categórico, la invención se puede usar para discriminar entre cohortes de individuos normales y otros que tienen alto riesgo de desarrollar tumores metastásicos . Este uso diferente puede requerir diferentes combinaciones de DETERMINANTES y paneles individualizados, algoritmos matemáticos y/o valores límite, pero estar sujetos a las mismas mediciones anteriormente mencionadas de exactitud y desempeño para el respectivo uso al que se destinan.

En el sentido que se utiliza en la presente "muestra", es una muestra biológica aislada de un individuo y puede incluir entre otras, por ejemplo, biopsias de tejido, sangre completa, suero, plasma, células sanguíneas, células endoteliales , líquido linfático, ascites, líquido intestinal (conocido también como "líquido extracelular" y abarca los fluidos que se encuentran en los espacios que hay entre las células, incluido, entre otros, el líquido crevicular gingival) , médula espinal, liquido cefalorraquídeo (CSF - cerebrospinal fluid) , saliva, moco, esputo, sudor, orina, células tumorales circulantes, células endoteliales circulantes o cualquier 'otra secreción, excreción u otro de los fluidos corporal.

La "sensibilidad" se calcula por TP/ (TP + FN) o la fracción positiva verdadera de individuos enfermos.

La "especificidad" se calcula por TN/ (TN + FP) o la fracción negativa verdadera de individuos sin la enfermedad o normales .

"Estadísticamente significativo" significa que la alteración es mayor de lo que se podría esperar que ocurriera sólo por casualidad (lo cual sería un "positivo falso"). La significancia estadística se puede determinar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Las medidas de significancia que son de uso común incluyen el valor p, que presenta la probabilidad de obtener un resultado al menos tan extremo como un punto de datos dado, asumiendo que el punto de datos fue el resultado de la casualidad. Un resultado se considera con frecuencia muy significativo a un valor p de 0.05 o menos.

En el sentido que se utiliza en la presente un "individuo" es, de preferencia, un mamífero. El mamífero puede ser una persona, un primate no humano, un ratón, perro, gato, caballo o vaca, aunque no se limita a estos ejemplos. Los mamíferos distintos de los seres humanos se pueden utilizar de manera ventajosa como individuos que representen modelos animales de metástasis tumoraL. El individuo puede ser de sexo masculino o femenino. Un individuo puede ser aquel que se haya diagnosticado previamente o identificado como portador de un tumor o un tumor metastásico y opcionalmente se haya sometido o se esté sometiendo a una intervención terapéutica para el tumor. Como alternativa, el individuo también puede ser alguien que no se haya diagnosticado previamente como portador de un tumor metastásico. Por ejemplo, el individuo puede ser alguien que manifieste uno o más factores de riesgo para un tumor metastásico.

"TN" es negativo verdadero, que para una prueba del estado de la enfermedad significa clasificar correctamente a un individuo sin la enfermedad o normal.

"TP" es positivo verdadero, que para una prueba del estado de la enfermedad significa clasificar correctamente a un individuo con la enfermedad.

Los "factores de riesgo de laboratorio tradicionales" corresponden a biomarcadores aislados o provenientes de muestras del individuo y que actualmente se evalúan en el laboratorio clínico y se usan en algoritmos de evaluación de riesgo global tradicional. Los factores de riesgo de laboratorio tradicionales para metástasis del tumor incluye, por ejemplo, grosor de Breslow, ulceración, índice proliferativo, linfocitos infiltrados en el tumor. Hay otros factores de riesgo de laboratorio tradicionales para la metástasis de un tumor que son conocidos para los expertos en la técnica.

METODOS Y USOS DE LA INVENCION Los métodos descritos en la presente se emplean con individuos que están en riesgo de desarrollar un tumor metastásico, individuos que pueden o no haberse diagnosticado con un tumor metastásico e individuos sometidos a tratamiento y/o terapias para un tumor primario o un tumor metastásico. Los métodos de la presente invención también se pueden emplear para monitorear o seleccionar un régimen de tratamiento para un individuo que tenga un tumor primario o un tumor metastásico y para cribar individuos que no hayan sido diagnosticados previamente como portadores de un tumor metastásico, por ejemplo, individuos que manifiestan factores de riesgo de metástasis. De preferencia, los métodos de la presente invención se usan para identificar y/o diagnosticar individuos que son asintomáticos para un tumor metastásico. "Asintomático" significa que no presenta los síntomas tradicionales.

Los métodos de la presente invención también se pueden usar para identificar y/o diagnosticar a individuos que ya están con alto riesgo de desarrollar un tumor metastásico sólo con base en los factores de riesgo tradicionales.

Un individuo que tiene un tumor metastásico se puede identificar por medición de las cantidades (que incluyen la presencia o ausencia) de un número eficaz (que pueden ser dos o más) de DETERMINANTES en una muestra proveniente del individuo y luego, las cantidades se comparan con un valor de referencia. Se identifican las alteraciones en las cantidades y patrones de expresión de biomarcadores como proteínas, polipéptidos , ácidos nucleicos y polinucleótidos , polimorfismo de proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos y polinucleótidos mutados, o alteraciones en las cantidades moleculares de metabolitos u otros analitos en la muestra del individuo, comparados con el valor de referencia.

Un valor de referencia puede ser relativo a un número o valor derivado de estudios de población, que incluyen, entre otros, individuos que tienen el mismo tipo de cáncer, individuos que tienen igual o similar intervalo de edad, individuos que son del mismo grupo étnico o un grupo similar, individuos que tienen historias familiares de cáncer, o relativo a la muestra inicial de un individuo sometido a tratamiento antineoplásico . Estos valores de referencia se pueden derivar de análisis estadísticos y/o datos de poblaciones de predicción de riesgo obtenidos a partir de algoritmos matemáticos e índices calculados de metástasis de cáncer. También se pueden generar y usar los índices DETERMINANTES de referencia mediante el uso de algoritmos y otros métodos de clasificación estadística y estructural .

En una modalidad de la presente invención', el valor de referencia es la cantidad de DETERMINANTES en una muestra de control proveniente de uno o más individuos que no están en riesgo o están en bajo riesgo de desarrollar un tumor metastásico. En otra modalidad de la presente invención, el valor de referencia es la cantidad de DETERMINANTES en una muestra de control proveniente de uno o más individuos que son asintomáticos y/o carecen de los factores de riesgo tradicionales para un tumor metastásico. En otra modalidad, estos individuos se monitorean ' y/o periódicamente se reevalúan durante un periodo de tiempo pertinente desde el punto de vista del diagnóstico ("estudio longitudinales") y se da seguimiento al análisis para verificar si continúa la ausencia del tumor metastásico (enfermedad o supervivencia sin eventos) . Este periodo de tiempo puede ser de un año, dos años, dos a cinco años, cinco años, cinco a diez años, diez años o diez o más años a partir de la fecha de análisis inicial para la determinación del valor de referencia. Por otra parte, la medición retrospectiva de DETERMINANTES en muestras de individuos con datos históricos adecuadamente ordenados en bancos de datos, se puede usar para establecer estos valores de referencia y reducir así el tiempo requerido para el estudio.

Un valor de referencia también puede estar constituido por las cantidades de DETERMINANTES derivadas de individuos que manifiestan una mejora en los factores de riesgo metastásico como resultado de tratamientos y/o terapias para el cáncer. Un valor de referencia también puede estar constituido por las cantidades de DETERMINANTES derivadas de individuos en los que se ha confirmado la enfermedad mediante las técnicas invasivas o no invasivas conocidas, o en los que tienen alto riesgo de desarrollar tumor metastásico o quienes han padecido un tumor metastásico .

En otra modalidad, el valor de referencia es un valor índice o un valor inicial. Un valor índice o un valor inicial es una muestra compuesta de una cantidad eficaz de DETERMINANTES de uno o más individuos que no tengan tumor metastásico o individuos que son asintomáticos 1 de metástasis. Un valor inicial también puede consistir en las cantidades de DETERMINANTES en una muestra proveniente de un individuo que haya manifestado una mejora en los factores de riesgo tumoral como resultado de tratamiento o terapias antineoplásicos . En esta modalidad, para hacer comparaciones con la muestra proveniente del individuo, las cantidades de DETERMINANTES se calculan de manera similar y se comparan con el valor índice. Como opción, los individuos identificados como portadores de tumor metastásico o que tienen alto riesgo de desarrollar un tumor metastásico se eligen para recibir un régimen terapéutico que disminuya el avance del cáncer o disminuya o prevenga el riesgo de desarrollar un tumor metastásico.

La progresión de un tumor metastásico o la eficacia de un régimen de tratamiento antineoplásico, se puede monitorear detectando una DETERMINANTE en una cantidad eficaz (que pueden ser dos o más) de muestras extraídas de un individuo durante un tiempo y comparando la cantidad de DETERMINANTES detectadas. Por ejemplo, se puede obtener una primera muestra antes de que el individuo reciba el tratamiento y se extraen una o más muestras consecutivas después o durante el tratamiento del individuo. Se considera que el cáncer es progresivo (o que el tratamiento no previene la progresión) si la cantidad de de DETERMINANTES cambia con el tiempo respecto al valor de referencia, mientras que el cáncer no es progresivo si la cantidad de DETERMINANTES permanece constante en el tiempo (con relación a la población de referencia o "constante" según la presente) . El término "constante" en el sentido que se utiliza en la presente, incluye los cambios a través de un tiempo con respecto al valor de referencia.

Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden usar para discriminar la agresividad y/o evaluar la etapa del tumor (por ejemplo, etapa I, II, II o IV) . Esto permitirá que los pacientes se estratifiquen en grupos de alto o bajo riesgo y se traten como corresponde.

Por otra parte, los agentes terapéuticos o profilácticos adecuados para administración a un individuo particular, se pueden identificar al detectar una DETERMINANTE en una cantidad eficaz (que pueden ser dos o más) en una muestra obtenida a partir de un individuo y exponiendo la muestra proveniente del individuo a un compuesto de prueba que determina la cantidad (que pueden ser dos o más) de DETERMINANTES en la muestra proveniente del individuo. En consecuencia, se pueden seleccionar los tratamientos o regímenes terapéuticos para usarse en individuos que tienen cáncer o individuos con riesgo de desarrollar un tumor metastásico, con base en las cantidades de DETERMINANTES en muestras extraídas de los individuos y compararse con un valor de referencia. Dos o más tratamientos o regímenes terapéuticos se pueden evaluar i en paralelo para determinar cuál tratamiento o régimen terapéutico sería el más eficaz para usarse en un individuo y retrasar la aparición o disminuir el avance del cáncer.

La presente invención también ofrece un método de cribado para cambios en la expresión de marcadores asociados con un tumor metastásico, mediante la determinación de la cantidad (que puede ser de dos o más) de DETERMINANTES en una muestra proveniente de un individuo, comparando las cantidades de DETERMINANTES en una muestra de referencia e identificando las alteraciones en cantidades en la muestra del individuo en comparación con la muestra de referencia.

La presente invención también ofrece un método para el tratamiento de un paciente portador de un tumor, mediante la identificación del paciente con el tumor, en donde una cantidad eficaz de DETERMINANTES están alteradas de manera clínicamente significativa según se mide en una muestra proveniente del tumor, y tratando al paciente con un régimen terapéutico que previene o reduce la metástasis del tumor.

Por otra parte, la invención ofrece un método para seleccionar un paciente con tumor que necesita un tratamiento complementario, mediante la evaluación del riesgo de metástasis en el paciente por medición de una cantidad eficaz de DETERMINANTES en donde una alteración clínicamente significativa de dos o más DETERMINANTES en una muestra de tumor proveniente del paciente, indica que el paciente necesita tratamiento complementario.

La información relativa a la decisión de tratamiento para un paciente enfermo de cáncer al obtener información sobre una cantidad eficaz de DETERMINANTES en una muestra del tumor proveniente del paciente y seleccionar un régimen de tratamiento que evite o reduzca la metástasis del tumor en el paciente si dos o más DETERMINANTES se encuentran alteradas en forma clínicamente significativa .

Si la muestra de referencia, por ejemplo, una muestra de control es de un individuo que no tiene cáncer metastásico o si la muestra de referencia refleja un valor relativo a una persona que tiene alta probabilidad de rápida progresión a tumor metastásico, una similitud en la cantidad de la DETERMINANTE en la muestra de prueba y en la muestra de referencia indica que el tratamiento es eficaz. Sin embargo, una diferencia en la cantidad de la DETERMINANTE en la muestra de prueba y la muestra de referencia indica un resultado clínico o un pronóstico menos favorables .

El término "eficacia" significa que el tratamiento produce una disminución en la cantidad o actividad de una DETERMINANTE sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito. La evaluación de los factores de riesgo descritos en la presente se puede hacer por medio de los protocolos clínicos estándar. La eficacia se puede determinar junto con cualquier método conocido para diagnosticar, identificar o tratar una enfermedad metastásic.a .

La presente invención también ofrece paneles de DETERMINANTES que incluyen una o más DETERMINANTES que son indicativas de una ruta fisiológica general asociada con un tumor metastásico, por ejemplo, una o más DETERMINANTES que se puedan usar para excluir o distinguir entre diferentes estados de la enfermedad o secuelas asociadas con la metástasis. Una sola DETERMINANTE puede tener varias de las características anteriormente mencionadas de acuerdo cón la presente invención y como alternativa se puede usar en la sustitución de .una o más DETERMINANTES según corresponda para la aplicación dada de la invención.

La presente invención también comprende un estuche con un reactivo de detección que se une a una o más DETERMINANTES ya sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito. La invención también ofrece un juego de reactivos de detección, . por ejemplo, anticuerpos y/o oligonucleótidos que se pueden unir a dos o más proteínas o ácidos nucleicos DETERMINANTES, respectivamente. En una modalidad, las DETERMINANTES son proteínas y el juego de reactivos contiene anticuerpos que se unen a una cantidad eficaz de 1 a 360 DETERMINANTES suficiente para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE en comparación con un valor de referencia. En otra modalidad, las DETERMINANTES son ácidos nucleicos y el juego de reactivos contiene oligonucleótidos o aptámeros que se unen a una cantidad eficaz de 1 a 360 DETERMINANTES para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE en comparación con un valor de referencia.

En otra modalidad, las DETERMINANTES son proteínas y el juego de reactivos contiene anticuerpos que se unen a una cantidad eficaz de las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271 suficiente para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE en comparación con un valor de referencia. En otra modalidad las DETERMINANTES son ácidos nucleicos y el juego de reactivos contiene oligonucleótidos o aptámeros que se unen a una cantidad eficaz de las DETERMINANTES 1 a 25, 41,, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, ,190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271 suficiente para medir una alteración estadísticamente significativa en la expresión de la DETERMINANTE en comparación con un valor de referencia.

La invención también ofrece un método para tratar a uno o más individuos que están en riesgo de desarrollar un tumor metastásico al detectar cantidades alteradas de una cantidad eficaz de DETERMINANTES presentes en una muestra proveniente de uno o más individuos; y tratando al o los individuos con uno o más medicamentos moduladores del cáncer hasta que las cantidades alteradas o actividad de las DETERMINANTES regresen a un valor inicial determinado en uno o más individuos con bajo riesgo de desarrollar una enfermedad metastásica o como alternativa, en individuos que no manifiestan ninguno de los factores de riesgo tradicionales de enfermedad metastásica.

La presente invención también ofrece un método para tratar a uno o más individuos que tienen tumor metastásico al detectar la presencia de niveles alterados de una cantidad eficaz de DETERMINANTES presentes en una muestra del o los individuos; y tratando al o1 los individuos con uno o más medicamentos moduladores de cáncer hasta que las cantidades alteradas o actividad de las DETERMINANTES regresen a un valor inicial determinado en uno o más individuos con bajo riesgo de desarrollar un tumor metastásico.

La presente invención también ofrece un método para evaluar cambios en cuanto al riesgo de desarrollar un tumor metastásico en un individuo diagnosticado con cáncer, mediante la detección de una cantidad eficaz de DETERMINANTES (que pueden ser dos o más) en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo, la detección de las cantidades de DETERMINANTES en una segunda muestra proveniente del individuo en un segundo periodo de tiempo y comparación de las cantidades de DETERMINANTES detectadas en el primero y en el segundo periodo de tiempo.

Indicaciones de diagnóstico y pronóstico de la invención La invención permite el diagnóstico y el pronóstico de un tumor metastásico. El riesgo de desarrollar un tumor metastásico se puede detectar al medir una cantidad eficaz de DETERMINANTE ya sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito y otros analitos (que pueden ser dos o más) en una muestra de prueba (por ejemplo, una muestra proveniente de un individuo) y comparando las cantidades eficaces con índices o valores de referencia, con frecuencia utilizando fórmulas y algoritmos matemáticos con el fin de combinar información de resultados de varias DETERMINANTES individuales y de parámetros clínicos distintos de los analitos, en un solo índice o medición. Los individuos que se hayan identificado con mayor riesgo de tumor metastásico pueden seleccionarse para recibir regímenes de tratamiento, como , la administración de compuestos profilácticos o terapéuticos para prevenir o retardar la aparición de un tumor metastásico.

La cantidad de DETERMINANTE ya sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analitó, se puede medir en una muestra de prueba y comparar con el "nivel control normal" utilizando técnicas como límites de referencia, límites de discriminación o umbrales de riesgo que definen valores de corte y valores anormales. El "nivel control normal" se refiere al nivel de una o 1 más DETERMINANTES o índices DETERMINANTES combinados que normalmente se encuentran en un individuo que no padece un tumor metastásico. Este nivel control normal y valores de corte pueden variar si una DETERMINANTE se usa sola ó una fórmula de combinación con otras DETERMINANTES en un índice. Como alternativa, el nivel control normal puede ser una base de datos de patrones de DETERMINANTES derivados de individuos previamente evaluados que no desarrollaron un tumor metastásico durante un horizonte de tiempo clínicamente pertinente. ¡ La presente invención se puede usar para hacer mediciones continuas o categóricas del riesgo de conversión a tumor metastásico, diagnosticando y definiendo así el espectro de riesgo de una categoría de individuos definidos como grupo de riesgo para experimentar un evento metastásico. En el escenario categórico, los métodos de la presente invención se pueden usar para distinguir entre cohortes normales e individuos enfermos. En otras modalidades, la presente invención se puede usar para distinguir entre aquellos que están en riesgo de tener un evento metastásico, aquellos que tienen un. avance más rápido (o alternativamente los que tienen un horizonte de tiempo más corto para un evento metastásico) hacia un evento metastásico, los que tienen un avance más lento (o alternativamente los que tienen un horizonte de tiempo más largo para un evento metastásico) o los que tienen un tumor metastásico de los normales. Estos usos diferentes pueden requerir diferentes combinaciones de DETERMINANTES en cuanto a panel individual, algoritmo matemático y/o valores de corte, pero están sujetos a las mismas mediciones anteriormente mencionadas de exactitud y otras mediciones de desempeño importantes para el uso que se pretende.

Identificar al individuo que está en riesgo de desarrollar un evento metastásico permite la selección e iniciación de varias intervenciones terapéuticas o regímenes de tratamiento con el fin de retardar, reducir o prevenir la conversión del individuo a un estado de enfermedad metastásica. Los niveles de la cantidad eficaz de DETERMINANTE ya sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito, también permiten monitorear la evolución del tratamiento de una enfermedad metastásica o evento metastásico. En este método, se puede obtener una muestra biológica proveniente de un individuo sometido a regímenes de tratamiento para el cáncer. Si se desea, las muestras biológicas se obtienen a partir del individuo en varios puntos de evaluación antes, durante o después del tratamiento.

En virtud de determinantes que son funcionalmente activas, por elucidación de su función, los individuos con determinantes elevadas, por ejemplo, se pueden tratar con agente/medicamentos que de manera preferencial se dirigen a esas rutas, por ejemplo, HOXA1 que funciona a través de señalización de TGF , de este modo, los individuos con H0XA1 elevado se pueden tratar con inhibidores de TGFP . O el HOXA1 activa CXCR , un eje de quimiocina que participa en la metástasis y que actúa en una fase anterior al TGFP , de este modo, se pueden usar agentes/medicamentos que antagonizan con el CXCR4.

La presente invención también se puede usar para cribar poblaciones de pacientes o individuos en cualquiera de diversos entornos. Por ejemplo, una organización de mantenimiento sanitario, una entidad de salud pública o un programa de salud escolar pueden someter a cribado un grupo de individuos para identificar aquellos que requieren intervenciones, como se describió en lo anterior o para la recolección de datos epidemiológicos . Las aseguradoras (por ejemplo, salud, vida o incapacidad) pueden someter a cribado a los solicitantes en el proceso para determinar cobertura o costos o los clientes existentes para una posible intervención. Los datos recolectados en estos cribados poblacionales , en particular si están asociados con alguna evolución clínica hacia padecimientos como cáncer o eventos metastásicos , serán valiosos1 en operaciones, como por ejemplo, organizaciones de mantenimiento sanitario, programas de salud pública y aseguradoras. Estos conjuntos o colecciones de datos se pueden almacenar en medios automáticos utilizados en varios de los sistemas de manejo de datos sanitarios con el fin de proporcionar servicios sanitarios mejorados, asistencia sanitaria económica, operación de seguros mejorada, etc. Véase, por ejemplo, la solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2002/0038227; solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2004/0122296; solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2004/0122297 y Patente de los Estados Unidos Núm. 5,018,067. Estos sistemas pueden recuperar los datos directamente a partir de un medio de almacenamiento de datos interno o en forma remota a partir de uno o más sitios de almacenamiento de datos como se verá con detalle más adelante.

Un medio de almacenamiento automático puede comprender un material de almacenamiento de datos codificado con datos o matrices de datos de lectura automática que cuando utilizan una máquina programada con instrucciones para usar tales datos, es capaz de usar para una variedad de propósitos, entre otros, por ejemplo, información de un individuo relativa a factores de riesgo de enfermedad metastásica a través del tiempo o como respuesta a terapias farmacológicas. Las mediciones de cantidades eficaces de biomarcadores de la invención y/o la evaluación de riesgo resultante de esos biomarcadores, se puede implementar un programa de cómputo que se ejecutan en computadoras programables , que comprenden, entre otros, un procesador, un sistema de almacenamiento de datos (que incluye memoria volátil y no volátil y/o elementos de almacenamiento) , al menos un dispositivo de entrada y al menos un dispositivo de salida. Se puede aplicar un código de programa para introducir datos que desempeñen las funciones descritas en lo anterior y generen información de salida. La información de salida se puede aplicar a uno o más dispositivos de salida, según los métodos conocidos en la técnica. La computadora puede ser, por ejemplo, una computadora personal, una microcomputadora o una estación de trabajo de diseño convencional.

Cada programa se puede implementar en lenguaje de programación orientado a objetos o a procedimientos, de alto nivel, para comunicarse con un sistema de cómputo. Sin embargo, si se desea, los programas se pueden implementar en lenguaje compilador o de máquina. El lenguaje puede ser compilado o interpretado. Cada uno de estos programas de cómputo se puede almacenar en un medio o dispositivo de almacenamiento (por ejemplo, ROM o disco magnético u otros que se definen en alguna parte de esta exposición) susceptible de leerse mediante una computadora programable especial o de tipo general, para configurar y operar la computadora cuando el medio o dispositivo de almacenamiento es leído por la computadora para realizar los procedimientos descritos en la presente. También se puede considerar que el sistema de administración de datos sanitarios de la invención se implemente como un medio de almacenamiento susceptible de leerse por computadora y configurarse con un programa de cómputo, en donde el medio de almacenamiento así configurado hace que la computadora funcione de una manera específica y predefinida para realizar las diversas funciones descritas aq í.

Los niveles de una cantidad eficaz de DETERMINANTE ya sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito, se pueden determinar y comparar con un valor de referencia, por ejemplo, una población o individuo control cuyo estado raetastásico sea conocido o con un valor índice o un valor inicial. La muestra de referencia o valor índice o valor inicial se puede tomar o derivar de uno o más individuos que se hayan expuesto al tratamiento o se puede tomar o derivar de uno o más individuos que tengan bajo riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico o se puede tomar o derivar de uno o más individuos que hayan manifestado mejoría como resultado de la exposición al tratamiento. Como alternativa, la muestra de referencia, valor índice o valor inicial se puede tomar o derivar de uno o más individuos que nb se hayan expuesto al tratamiento. Por ejemplo, las muestras se pueden recolectar de individuos que hayan recibido tratamiento inicial para el cáncer o un evento metastásico y tratamiento posterior para el cáncer o un evento metastásico para monitorear el avance del tratamiento. Un valor de referencia también puede consistir en un valor derivado de algoritmos de predicción de riesgo o índices calculados a partir de estudios poblacionales como los que se describen en la presente.

Las DETERMINANTES de la presente invención se puede usar entonces para generar un "perfil de DETERMINANTES de referencia" de aquellos individuos que no tienen cáncer o que no están en riesgo de tener un evento metastásico y de los que no se esperaría que desarrollaran cáncer o un evento metastásico . Las DETERMINANTES expuestas en la presente, también se pueden usar para generar un "perfil de DETERMINANTES de un individuo" proveniente de individuos que tienen cáncer o que están en riesgo de tener un evento metastásico. El perfil de DETERMINANTES individual se puede comparar con un perfil de DETERMINANTES de referencia para diagnosticar o identificar individuos que están en riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico, para monitorear la progresión de la enfermedad, así como la velocidad de progresión de la enfermedad y monitorear la eficacia de las modalidades del tratamiento. Los perfiles de DETERMINANTES de referencia e individual de la presente invención, pueden residir en un medio susceptible de leerse de manera automática, por ejemplo, cintas como las que pueden ser leídas en VCR, CD-ROM, DVD-ROM, USB flash, entre otros. Estos medios susceptibles de leerse de manera automática también pueden contener resultados de análisis adicionales, entre otros, como por ejemplo, mediciones de parámetros clínicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales. Como alternativa o adicionalmente , el medio susceptible de leerse de manera automática también puede incluir información del individuo como la historia clínica y cualquier antecedente familiar importante. El medio susceptible de leerse de manera automática también puede contener información relativa a otros algoritmos de riesgo de enfermedad e índices calculados como los que se describen aquí.

Las diferencias en la estructura genética de los individuos puede dar lugar a diferencias en sus capacidades relativas para metabolizar varios medicamentos, los cuales pueden modular los síntomas o factores de riesgo de cáncer o eventos metastásicos . Los individuos que tienen cáncer o están en riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico pueden variar en cuanto a edad, etnia y otros parámetros. En consecuencia, el uso de las DETERMINANTES expuestas aquí, solas o en combinación con factores genéticos conocidos respecto al metabolismo de medicamentos, permiten que con un nivel predeterminado de previsibilidad se evalúe una presunta terapéutica o profilaxis en un individuo seleccionado, que sea la adecuada para el tratamiento o prevención del cáncer o un evento metastásico en el individuo.

Para identificar la terapéutica o los medicamentos que son adecuados para un individuo específico, una muestra de prueba del individuo se puede exponer también a un agente terapéutico o a un medicamento y se puede determinar el nivel de una o más DETERMINANTES ya sea proteína, ácido nucleico, polimorfismo, metabolito u otro analito. El nivel de una o más DETERMINANTES se puede comparar con una muestra proveniente del individuo antes y después del tratamiento o la exposición a un agente terapéutico o medicamento y se puede comparar con muestras provenientes de uno o más individuos que hayan manifestado mejoras en los factores de riesgo (por ejemplo, parámetros clínicos o factores de riesgo de laboratorio tradicionales) como resultado del tratamiento o la exposición.

Una célula del individuo (es decir, una célula aislada de un individuo) se puede incubar en presencia de un agente candidato y el patrón de la expresión de DETERMINANTES en la muestra de prueba se mide y se compara con un perfil de referencia, por ejemplo, un perfil de expresión de referencia para enfermedad metastásica o un perfil de expresión de referencia sin enfermedad, un valor índice o un valor inicial. El agente de prueba puede ser cualquier compuesto, composición o combinación de los mismos, incluidos los complementos dietéticos. Por ejemplo, los agentes de prueba son agentes de uso frecuente en regímenes de tratamiento del cáncer y se describen aquí.

Los métodos de la invención anteriormente mencionados se pueden usar para evaluar o monitorear la progresión y/o mejora de los individuos a los que se les ha diagnosticado cáncer y quienes se han sometido a intervenciones quirúrgicas .

Medidas de desempeño y exactitud de la invención El desempeño y por lo tanto la utilidad clínica absoluta y relativa de la invención se puede evaluar de varias formas, tal como se señaló en lo anterior. Entre las diversas evaluaciones de desempeño, la invención está destinada a proporcionar exactitud en el diagnóstico y el pronóstico clínico. La exactitud de una prueba, ensayo o método de diagnóstico o pronóstico que se refiere a la capacidad de la prueba, ensayo o método para distinguir entre individuos que tienen cáncer o que están en riesgo de padecer cáncer o un evento metastásico, tiene como base el hecho de que exista o no en los individuos una "alteración significativa" (por ejemplo, clínicamente significativa "significativa desde el punto de vista del diagnóstico") en los niveles de una DETERMINANTE. El término "cantidad eficaz" significa que la medición de un número apropiado de DETERMINANTES (que pueden ser una o más) produce una "alteración significativa" (por ejemplo, nivel de expresión o actividad de una DETERMINANTE) que es diferente del valor de corte predeterminado (o umbral) para esa o esas DETERMINANTES y por lo tanto indica que el individuo tiene cáncer o está en riesgo de experimentar un evento metastásico para el que la DETERMINANTE o DETERMINANTES es clave. La diferencia en el nivel de DETERMINANTES entre normal y anormal es, de preferencia, estadísticamente significativo. Como se señala más adelante y sin limitación alguna de la invención, tener significancia estadística y de este modo la exactitud analítica, diagnóstica y clínica preferida, por lo general, aunque no siempre, requiere que las combinaciones de algunas DETERMINANTES se usen juntas en paneles y se combinen con algoritmos matemáticos para lograr un índice de DETERMINANTES estadísticamente significativo.

En el diagnóstico categórico de un estado de enfermedad, cambiar el valor de corte o valor umbral de una prueba (o ensayo) normalmente cambia la sensibilidad y especificidad pero en una relación cuantitativamente inversa. Por lo tanto, al evaluar la exactitud y utilidad de una prueba médica, ensayo o método propuesto para evaluar el estado de un individuo, siempre se déberá considerar tanto la sensibilidad como la especificidad y darse cuenta de a cuál valor de corte se reporta la sensibilidad y la especificidad porque la sensibilidad y la especificidad pueden variar significativamente en todo el intervalo de valores de corte. El uso de herramientas estadísticas como el AUC, abarcando todos los valores de corte potenciales, se prefiere para la mayoría de las mediciones de riesgo categórico que se utilizan en la invención, mientras que para mediciones de riesgo continuo, se prefiere la estadística de la prueba de la bondad del ajuste {goodness-of-fit) y calibración con los resultados observados u otro criterio de referencia.

Por "nivel predeterminado de previsibilidad" se entiende que el método ofrece un nivel aceptable de exactitud clínica y diagnóstica. Mediante el uso de estas herramientas estadísticas, en el sentido que se utiliza en la presente "grado aceptable de exactitud diagnóstica" se define como una prueba o ensayo (como la prueba de la invención para determinar la presencia clínicamente significativa de DETERMINANTES, las cuales indican la presencia de cáncer y/o el riesgo de tener un evento metastásico) en el que la AUC (área bajo la curva ROC para la prueba o ensayo) es al menos 0.60, convenientemente al menos 0.65, con más conveniencia, al menos 0.70, de preferencia al menos 0.75, con más preferencia al menos 0.80 y con máxima preferencia al menos 0.85.

"Grado muy alto de exactitud diagnóstica" significa que una prueba o ensayo en el que el AUC (área bajo la curva ROC para la prueba o ensayo) al menos 0.75, 0.80, convenientemente al menos 0.85, con más conveniencia, al menos 0.875, de preferencia al menos 0.90, con más preferencia al menos 0.925 y con máxima preferencia al menos 0.95.

Como alternativa, los métodos pronostican la presencia o ausencia de cáncer, cáncer metastásico o la respuesta a la terapia con al menos 75% de exactitud, con más preferencia 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o mayor exactitud .

El valor pronóstico de cualquier prueba depende de la sensibilidad y especificidad de la prueba y de la prevalencia del padecimiento en la población que se evalúa. Esta noción, con base en el teorema de Bayes, permite que a mayor probabilidad de que el padecimiento que se somete a cribado esté presente en un individuo o en la población (probabilidad previa a la prueba) mayor sea la validez de una prueba positiva y mayor sea la probabilidad de que el resultado sea positivo verdadero. De este modo, el problema de usar una prueba en cualquier población en la que haya una baja probabilidad de que el padecimiento esté presente es que el resultado positivo tiene valor limitado (es decir, es más probable que sea positivo falso) . Del mismo modo, en poblaciones con muy alto riesgo, es más probable que un resultado de prueba negativo sea un negativo falso.

Como resultado, los valores ROC y AUC pueden ser engañosos para la utilidad clínica de una prueba en poblaciones evaluadas con baja prevalencia anual de la enfermedad (definidas como aquellas con menos de 1% de eventos (incidencia) o menos de 10% de prevalencia acumulativa con respecto a un horizonte de tiempo especificado) . Como alternativa, las proporciones de riesgo absoluto y riesgo relativo según se definen en alguna parte de esta exposición, se pueden emplear para determinar el grado de utilidad clínica. Las poblaciones de individuos a analizar también se pueden clasificar en cuartiles por valores de medición de la prueba, en donde el cuartil superior (25% de la población) comprende el grupó de individuos con el riesgo relativo más alto para desarrollar cáncer o un evento metastásico y el cuartil inferior comprende el grupo de individuos que tienen el riesgo relativo más bajo para desarrollar cáncer o un evento metastásico. Por lo general, los valores derivados dé las pruebas o ensayos que tienen 2.5 veces el riesgo relativo del cuartil superior al cuartil inferior en una población de baja prevalencia, se consideran con un "alto grado de exactitud diagnóstica" y aquellos con cinco a siete veces el riesgo relativo para cada cuartil, se consideran con "muy alto grado de exactitud diagnóstica" . Sin embargo, los valores derivados de pruebas o ensayos que son sólo 1.2 a 2.5 veces el riesgo relativo para cada cuartil que sigue siendo clínicamente útil, se utilizan mucho como factores de riesgo para una enfermedad; tal es el caso del colesterol total y de muchos biomarcadores inflamatorios con respecto a su pronóstico de futuros eventos metastásicos . Con frecuencia, estas pruebas de exactitud diagnóstico inferior tienen que combinarse con parámetros adicionales a fin de obtener límites clínicos significativos para intervención terapéutica, como se hace con los índices de evaluación de riesgo global anteriormente mencionados.

Una función de utilidad en la economía sanitaria es otro medio más de medición de desempeño y valor clínico de una prueba dada, que consiste en ponderar los resultados potenciales de una prueba categórica con base en mediciones reales del valor clínico y económico para cada uno. El funcionamiento de la economía sanitaria está muy relacionado con la exactitud, ya que la función de utilidad en la economía sanitaria asigna específicamente un valor económico para los beneficios de la correcta clasificación y los costos de una clasificación errónea de los individuos evaluados. Como medida de funcionamiento o desempeño, no es común solicitar una prueba que logre un nivel de desempeño que de lugar a un aumento en el valor económico sanitario por prueba (antes de los costos de la prueba) que sobrepase el precio establecido de la prueba.

En general, en mediciones continuas es común utilizar métodos alternativos para determinar la exactitud diagnóstica, cuando una categoría de enfermedad o categoría de riesgo (por ejemplo, las de riesgo ati para un evento metastásico) no ha sido definida con claridad por las sociedades médicas correspondientes y por la práctica médica, en donde los límites para uso terapéutico no se han establecido aún o en donde no existen estándares de referencia para el diagnóstico del estado previo de enfermedad. En mediciones continuas de riesgo, las medidas de exactitud diagnóstica para un índice calculado normalmente tienen como base el ajuste de la curva >y la calibración entre el valor pronóstico continuo y los valores observados reales (o un valor calculado del índice histórico) y utilizan medidas como R cuadrada, valor p estadístico Hosmer-Lemeshow e intervalos de confianza. No es raro en valores pronósticos que usan esos algoritmos se reporten con un intervalo de confianza (normalmente 90% o 95% IC) con base en pronósticos de cohortes observadas históricas como en la prueba de riesgo de futura recurrencia de cáncer de mama comercializada por Genomic Health, Inc. (Redwood City, California).

En general, al definir el grado de exactitud diagnóstica, es decir, los valores de corte en una curva ROC, definiendo un valor AUC aceptable y determinando intervalos aceptables en la concentración relativa de lo que constituye una cantidad eficaz de DETERMINANTES de la invención que permite que un experto en la técnica use DETERMINANTES para identificar, diagnosticar o pronosticar individuos con un predeterminado nivel de previsibilidad y desempeño.

Marcadores de riesgo de la Invención (DETERMINANTES) Los biomarcadores y métodos de la presente invención permiten al experto en la técnica identificar, diagnosticar o evaluar de otro modo a aquellos individuos que no manifiestan algún síntoma de cáncer o de un evento metastásico, pero que sin embargo pueden estar en riesgo de desarrollar cáncer o un evento metastásico.

Se han identificado mil quinientos noventa y tres biomarcadores cuya presencia o niveles de concentración se encuentran alterados o modificados en individuos que tienen enfermedad metastásica.

La Tabla 1 incluye las trecientas sesenta (360) DETERMINANTES evolutivamente conservadas guiadas por el fenotipo sobreexpresado/amplificado o regulado por disminución/eliminado, de la presente invención. ; Las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271 se han identificado como determinantes pro-invasión.

Tabla 1 El experto en la técnica se dará cuenta que las DETERMIN/ANTES presentadas aquí, abarcan todas las formas y variantes, entre las que se incluyen, polimorfismos, isoformas, imitantes, derivados, precursores incluidos los ácidos nucleicos y los precursores de proteínas (pro-proteins) , productos de escisión, receptores (incluidos los receptores solubles y transmembrana) , ligandos, complejos ligando-proteína y variantes modificadas después de la traducción (como reticulación o glucosilación) , fragmentos y productos de degradación, así como cualquier ácido nucleico multiunitario, proteína y estructuras de glucoproteína constituidas por cualquiera de las DETERMINANTES como subunidades constitutivas de la estructura totalmente ensamblada.

El experto en la técnica podrá notar que la lista de DETERMINANTES proviene de un conjunto diverso de rutas fisiológicas y biológicas, incluidos aquellos que no se consideran relacionados con enfermedad metastásica. Estas agrupaciones de diferentes DETERMINANTES, incluso dentro de aquellos segmentos de alta significancia, pueden indicar señales discrepantes de la etapa o la velocidad de avance de la enfermedad. Estas distintas agrupaciones de DETERMINANTES permitirán una señal biológicamente más detallada y clínicamente útil de las DETERMINANTES así como oportunidades de reconocimiento del patrón dentro de los algoritmos de DETERMINANTES que combinan las múltiples señales de DETERMINANTES.

La presente invención se relaciona, en un aspecto, con un subgrupo de DETERMINANTES ; otras DETERMINANTES e incluso biomarcadores que no están enlistadas en la Tabla 1 anterior, pero que están relacionadas con estas rutas fisiológicas y biológicas, pueden ser útiles dada la señal e información obtenida a partir de estos estudios . En la medida que otros participantes de la ruta de biomarcadores (es decir, otros participantes biomarcadores en rutas comunes con ; los biomarcadores contenidos dentro de la lista de DETERMINANTES de la Tabla 1 anterior) que sean también importantes participantes de la ruta en el cáncer b un evento metastásico, podrán ser equivalentes funcionales de los biomarcadores, como por ejemplo, el CXCR4 expuesto hasta ahora en la Tabla 1. Estos otros participantes de la ruta también se consideran DETERMINANTES en el contexto de la presente invención, siempre que compartan además ciertas características definidas de un buen biomarcador, ! que incluirían tanto la participación en los procesos biológicos descritos aquí como las características analíticas importantes como la biodisponibilidad de! los biomarcadores en una proporción útil entre señal y ruido y en una matriz de muestra útil y accesible como el suero sanguíneo. Estos requisitos, por lo general, limitan la utilidad diagnóstica de muchos miembros de una ruta biológica y con frecuencia sucede sólo en miembros de la ruta que constituyen sustancias secretoras, aquéllas accesibles en la membrana plasmática de las células, así como aquellas que son liberadas en el suero en la muerte celular, debida a la apoptosis o por otras razones como la remodelación endotelial u otra renovación celular o proceso necrótico celular, estén o no relacionados con el avance del cáncer o con un evento metastásico. Sin embargo, los biomarcadores restantes y futuros que cumplan este elevado estándar para las DETERMINANTES es probable que sean muy valiosos. .

Por otra parte, otros biomarcadores no enlistados estarán muy correlacionados con los biomarcadores enlistados como DETERMINANTES en la Tabla 1 (para los fines de esta solicitud, dos variables cualquiera se considerarán "muy correlacionadas" cuando tengan un coeficiente de determinación (R2) de 0.5 o más). La presente invención abarca estos equivalentes funcionales y estadísticos de las DETERMINANTES anteriormente mencionadas. Por otra parte, la utilidad estadística de estas DETERMINANTES adicionales depende, en esencia, de la correlación cruzada entre varios biomarcadores y con frecuencia, se requerirá algún nuevo biomarcador para funcionar dentro de un panel a fin de explicar el sentido de la biología subyacente.

Uno o más, de preferencia, dos o más de las DETERMINANTES enlistadas se pueden detectar en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, se pueden detectar dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), diez (10), quince (15) , veinte (20) , cuarenta (40) , cincuenta (50) , setenta y cinco (75) , cien (100) , ciento veinticinco (125) , ciento cincuenta (150) , ciento setenta y cinco (175) , doscientos (200) , doscientos diez (210) , doscientos veinte (220) , doscientos treinta (230) , doscientos cuarenta (240) , doscientos cincuenta (250), doscientos sesenta (260) o más, doscientos setenta (270) o más, doscientos ochenta (280) o más, doscientos noventa (290) o más, DETERMINANTES.

En algunos aspectos, se pueden detectar las 360 DETERMINANTES enlistadas en la presente. Los intervalos preferidos a partir de los cuales se puede detectar el número de DETERMINANTES incluye los intervalos limitados por cualquier mínimo seleccionado entre uno y 360, en particular, dos, cinco, diez, veinte, cincuenta, setenta y cinco, cien, ciento veinticinco, ciento cincuenta, ciento setenta y cinco, doscientos, doscientos diez, doscientos veinte, doscientos treinta, doscientos cuarenta, doscientos cincuenta, apareado con cualquier máximo hasta el total de DETERMINANTES conocidas, en particular, cinco, diez, veinte, cincuenta y setenta y cinco. Los intervalos preferidos, en particular, incluyen dos a cinco (2-5) , dos a diez (2-10) , dos a cincuenta (2-50) , dos a setenta y cinco (2-75) , dos a cien (2-100) , cinco a diez (5-10) , cinco a veinte (5-20) , cinco a cincuenta (5-50) , cinco a setenta y cinco (5.-75), cinco a cien (5-100), diez a veinte (10-20) , diez a cincuenta (10-50) , diez a setenta y cinco (10-75) , diez a cien (10-100) , veinte a cincuenta (20-50) , veinte a setenta y cinco (20-75) , veinte a cien (20-100) , cincuenta a setenta y cinco (50-75) , cincuenta a cien (50-100) , cien a ciento veinticinco (100-125) , ciento veinticinco a ciento cincuenta (125-150) , ciento cincuenta a ciento setenta y cinco (150-175) , ciento setenta y cinco a doscientos (175-200) , doscientos a doscientos diez (200- 210) , doscientos diez a doscientos veinte (210 -220) , doscientos veinte a doscientos treinta (220 -230) , doscientos treinta a doscientos cuarenta (230 -240) , doscientos cuarenta a doscientos cincuenta (240 -250) , doscientos cincuenta a doscientos sesenta (250-260) .

Construcción de paneles de DETERMINANTES Las agrupaciones de DETERMINANTES se pueden incluir en "paneles". En el sentido que se utiliza e'n la presente, un "panel" se refiere a un grupo de biomarcadores (ya sean DETERMINANTES, parámetros clínicos o factores de riesgo de laboratorio tradicionales) que incluyen más de una DETERMINANTE . Un panel también puede comprender biomarcadores adicionales, por ejemplo, parámetros clínicos, factores de riesgo de laboratorio tradicionales que se sabe están presentes o asociados con cáncer o metástasis de cáncer, en combinación con un grupo seleccionado de DETERMINANTES enlistadas en la Tabla 1.

Como se señaló en lo anterior, muchas de las DETERMINANTES individuales, parámetros clínicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales enlistados, cuando se usan solos y no como miembros de un paneles de varios biomarcadores de DETERMINANTES, tienen poco o ningún uso clínico en distinguir de manera confiable entre individuos normales, individuos en riesgo de tener un evento metastásico e individuos que tienen cáncer, en una población general seleccionada y por lo tanto, solos no se pueden usar, de manera confiable, para clasificar a un individuo en esos tres estados. Incluso en donde haya diferencias estadísticamente significativas en las mediciones medias en cada una de estas poblaciones, como es común que suceda en estudios que son suficientemente potentes, estos biomarcadores pueden seguir limitados en su aplicabilidad a un sujeto individual y contribuyen poco al diagnóstico o pronóstico para este individuo. Una medida común con significancia estadística es el valor p, el cual indica la probabilidad de que una observación haya surgido sólo por casualidad; de preferencia, estos valores p son 0.05 o menores, representando 5% o menos probabilidad de que la observación de interés haya surgido por casualidad. Estos valores p dependen significativamente de la poténcia del estudio realizado.

A pesar de este funcionamiento de la DETERMINANTE individual y el funcionamiento general de fórmulas que combinan sólo los parámetros clínicos tradicionales y pocos factores de riesgo de laboratorio tradicionales, los inventores de la presente han observado que ciertas combinaciones específicas de dos o más DETERMINANTES también se pueden usar como paneles de múltiples biomarcadores que comprenden combinaciones de DETERMINANTES que se sabe están implicadas en uno o más rutas fisiológicas o biológicas y que esta información se puede combinar y hacerla clínicamente útil a través del uso de varias fórmulas que incluyen algoritmos de clasificación estadística y otros, combinando y ..en muchos casos extendiendo las características de desempeño de la combinación más allá de las DETERMINANTES individuales. Estas combinaciones específicas muestran un aceptable nivel de exactitud diagnóstica y cuando hay suficiente información de múltiples DETERMINANTES se combina en una fórmula experimentada, es frecuente que se logre de manera confiable un alto nivel de exactitud diagnóstica transportable de una población a otra.

El concepto general de cómo se combinan dos DETERMINANTES menos específicas o de más bajo desempeño en combinaciones novedosas y más útiles para las indicaciones que se pretenden, es un aspecto de la invención. Con frecuencia, varios biomarcadores tienen mejor funcionamiento que los componentes individuales cuando se usan algoritmos matemáticos y clínicos adecuados; con frecuencia, esto es evidente tanto en sensibilidad como en especificidad, y da como resultado una AUC mayor. Por otra parte, a menudo hay información que pasa desapercibida en los biomarcadores existentes, tal como fue necesario a fin de lograr a través de la nueva fórmula un nivel mejorado de sensibilidad o especificidad. Esta información oculta puede ser verdadera incluso para biomarcadores, que generalmente se consideren, de por sí, con un desempeño clínico por debajo del óptimo. De hecho, el desempeño inferior al óptimo en términos de alta proporción de positivos falsos en un solo biomarcador medido solo, puede ser muy bien un indicador de que alguna información adicional importante está contenida dentro de los resultados del biomarcador, información que no se elucidaría como ausente en la combinación con un segundo biomarcador y una fórmula matemática.

Se pueden usar varios algoritmos estadísticos y de modelos conocidos en la técnica para ayudar en las elecciones de selección de DETERMINANTES y optimizar los algoritmos combinando estas elecciones. Herramientas estadísticas como análisis de factores y correlación/covarianza de biomarcadores cruzados permiten enfoques racionales en la construcción de paneles. La agrupación matemática y el árbol de clasificación que muestran la distancia euclidiana estandarizada entre las DETERMINANTES, se pueden usar de manera ventajosa. También se puede emplear la diseminación informada de rutas de estas técnicas de clasificación estadística, así como enfoques racionales que tengan como base la selección de DETERMINANTES en función de su participación en rutas o funciones fisiológicas particulares.

Por último, fórmulas tales como los algoritmos de clasificación estadística se pueden usar directamente para seleccionar DETERMINANTES y para generar y experimentar la fórmula óptima necesaria para combinar los resultados de las DETERMINANTES múltiples en un solo índice. Con frecuencia, se usan técnicas como la selección en avance (a partir de parámetros explicativos de potencial cero) y en retrospectiva (a partir de parámetros explicativos de potencial disponible) y también se usan criterios de información, como AIC o BIC para cuantificar el intercambio entre el desempeño y la exactitud diagnóstica del panel y el número de DETERMINANTES utilizadas. La posición de la DETERMINANTE individual en un panel seleccionado en avance o en retrospectiva puede estar muy relacionada con su disposición del contenido de información creciente para el algoritmo, así, el grado de contribución es bastante dependiente de la otra DETERMINANTE constitutiva en el panel .

Construcción de algoritmos clínicos Se puede usar cualquier fórmula para combinar resultados de DETERMINANTES en índices útiles en la práctica de la invención. Como se indicó en lo anterior y sin limitaciones, estos índices pueden indicar, entre otras muchas indicaciones, la probabilidad, posibilidad, riesgo absoluto o relativo, tiempo o velocidad de conversión de uno a otro estado de la enfermedad o hacer pronósticos de futuras mediciones de biomarcadores de enfermedad metastásica. Esto puede ser para un periodo u horizonte de tiempo específico o para el riesgo durante el tiempo de vida restante o simplemente proporcionarse como un índice relativo a otra población de referencia.

Aunque aquí se describen varias fórmulas preferidas, los expertos en la técnica conocen otros modelos y tipos de fórmulas además de las que se mencionan en la presente y en las definiciones anteriores. El tipo de modelo real o fórmula utilizada puede seleccionarse a partir del campo de modelos potenciales que tienen como base las características de desempeño y de exactitud diagnóstica de sus resultados en una población experimental. Los aspectos específicos de la fórmula en sí normalmente se pueden derivar de los resultados de la DETERMINANTE en la población experimental correspondiente. Entre otros usos, esta fórmula puede destinarse a mapear el espacio característico derivado de una o más DETERMINANTES introducidas a un grupo de clases de individuos (por ejemplo, útiles para pronosticar la clase de membresía de un individuo como normal, en riesgo de tener un evento metastásico, enfermo de cáncer) , para deducir una estimación de una función de probabilidad de riesgo mediante el uso de un enfoque Bayesiano (por ejemplo, el riesgo de cáncer o de un evento metastásico) o para estimar las probabilidades condicionales de la clase y luego usar la regla de Bayes para producir la función de probabilidad de clase como en el caso "anterior.

Las fórmulas preferidas incluyen la extensa clase de algoritmos de clasificación y en particular, el uso de análisis discriminante. El objetivo del análisis discriminante es pronosticar la membresía (class membership) a partir de un conjunto de particularidades previamente identificadas. En el caso del análisis discriminante linear (LDA linear discriminant analysis) , la combinación lineal de particularidades se identifica la maximizar la separación entre grupos por algunos criterios. Las particularidades para LDA se pueden identificar por medio de un enfoque que tenga como base Eigengene con diferentes valores umbral (ELDA) o un algoritmo escalonado con base en análisis multifactorial de la varianza (MA OVA - multivariate analysis of variance) . Los algoritmos de avance, retrospectivos y escalonados se pueden generar de manera que reduzcan al mínimo la probabilidad de no separación con base en estadística Hotelling-Lawley .

El análisis discriminante lineal con base Eigengene (ELDA - Eigengene-based Linear Discriminant Analysis) es una técnica de selección de particularidades desarrollada por Shen et al. (2006). La fórmula selecciona particularidades (por ejemplo, biomarcadores) en una estructura multifactorial utilizando análisis Eigen modificado para identificar particularidades asociadas con los eigenvectores más importantes. El término "importante" se define como aquellos eigenvectores que explican la máxima varianza en las diferencias entre muestras que se están sometiendo a clasificación con relación a un valor umbral .

Una máquina vectorial de soporte (SVM - support vector machine) es una fórmula de clasificación que intenta encontrar un hiperplano que separe dos clases. Este hiperplano contiene vectores de soporte, puntos de datos que son exactamente la distancia marginal fuera del hiperplano. En el probable evento de que no exista el hiperplano de separación en las dimensiones actuales de los datos, la dimensionalidad sé expande mucho al proyectar los datos a dimensiones más grandes tomando funciones no lineales de las variables originales (Venables y Ripley, 2002) . Aun cuando no se requieren, el filtrado de particularidades para SVM con frecuencia mejora el pronóstico. Las particularidades (por ejemplo, biomarcadores) se pueden identificar para una máquina vectorial de soporte, utilizando una prueba Kruskal-Wallis (KW) no paramétrica para seleccionar las mejores particularidades monofactoriales . También se pueden usar el bosque aleatorio (RF, Breiman, 2001) o el árbol de particiones recursivas (RPART, Breiman et al., 1984), por separado o en combinación para identificar las combinaciones de biomarcadores más importantes. Tanto la KW como el RF requieren que varias particularidades se seleccionen del total. RPART genera un solo árbol de clasificación utilizando un subconjunto de biomarcadores disponibles .

Se puede usar otra fórmula para un procesamiento previo de los resultados de mediciones de DETERMINANTES individuales y obtener formas de información más valiosas, antes de su presentación en la fórmula de pronóstico. Sobre todo, la normalización de resultados de biomarcadores que utiliza transformaciones matemáticas comunes como funciones logísticas o logarítmicas, como la normal u otras posiciones de distribución, con referencia a valores medios de una población, etc., son muy conocidos para los expertos en la técnica. De interés particular son los conjuntos de normalizaciones que tienen como base parámetros clínicos como edad, género, raza o sexo, en los que se usan fórmulas específicas únicamente en individuos de una clase o de manera continua combinando un parámetro clínico como un dato de entrada. En otros casos, los biomarcadores de analitos se pueden combinar en variables calculadas que después se presentan en una fórmula.

Además de los valores de parámetros individuales de un individuo que potencialmente se normaliza, una fórmula pronóstico general para todos los individuos o cualquier clase conocida de individuos, puede en sí calibrarse de nuevo o ajustarse de otro modo con base én el ajuste para la prevalencia esperada en una población y en los valores medios de parámetros de los biomarcadores, según la técnica descrita en D'Agostino et al., (2001) JAMA 286:180-187 u otras técnicas de normalización y recalibración. Estos datos estadísticos de ajuste epidemiológico se pueden capturar, confirmar, mejorar y actualizar de manera continua a través de un registro de datos anteriores presentados al modelo, que pueden, ser susceptibles de leerse en medios automatizados o de otro modo o en ocasiones a través de la consulta retrospectiva de muestras almacenadas o referencia a estudios históricos de estos parámetros y estadística. Otros ejemplos que pueden ser objeto de recalibración de la fórmula o de otros ajustes, incluyen la estadística utilizada en estudios realizados por Pepe, M.S. et al., 2004, sobre las limitaciones de las razones de momios; Cook, N.R., 2007 con relación a las curvas ROC. Por último, el resultado numérico de una fórmula de clasificación, se puede transformar después de procesamiento a través de su referencia a una población clínica real y a resultados de estudio y criterios de valoración observados a fin de calibrar respecto al riesgo absoluto y proporcionar intervalos de confianza para resultados numéricos variables del clasificador o fórmula de riesgo. Un ejemplo de esto es la presentación de riesgo absoluto e intervalos de confianza para ese riesgo, derivados utilizando un estudio clínico real, elegidos con referencia al resultado de la fórmula de puntuación de recurrencia en el producto Oncotype Dx de Genomic Health Inc. (Redwood City, CA) . Otra modificación consiste en hacer ajustes para subpoblaciones más pequeñas del estudio con base en el resultado del clasificador o fórmula de riesgo y definida y seleccionada por sus parámetros clínicos, como edad o sexo.

Combinación con parámetros clínicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales Cualquiera de los parámetros clínicos anteriormente mencionados se pueden usar para llevar a la práctica la invención, como una entrada de datos de DETERMINANTE a una fórmula o como criterio de preseleccion que define una población pertinente que se evaluará mediante un panel y fórmula de DETERMINANTES particular. Como se señala en lo anterior, los parámetros clínicos también pueden ser útiles en la normalización y procesamiento previo de biomarcadores o en la selección de DETERMINANTES, la construcción del panel, la selección del tipo de fórmula y la derivación y el resultado de la fórmula posterior al procesamiento. Se puede adoptar un enfoque similar con los factores de riesgo de laboratorio tradicionales, ya sea como entrada de datos a una fórmula o como criterio de preseleccion.

Medición de DETERMINANTES La medición real de niveles o cantidades de DETERMINANTES se puede determinar en cuanto a proteína o ácido nucleico, por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, a nivel de ácido nucleico, para determinar la expresión génica, se puede usar análisis de hibridación Northern y Southern, así como ensayos de protección de ribonucleasa utilizando sondas que reconozcan específicamente una o más de estas secuencias. Como alternativa, las cantidades de DETERMINANTES se pueden medir mediante ensayos PCR con base en transcripción inversa (RT-PCR - reverse transcription-based PCR) , por ejemplo, utilizando cebadores específicos para secuencias de genes expresadas en diferencial o por amplificación de ARN de cadena ramificada y métodos de detección de Panomics, Inc. Las cantidades de DETERMINANTES también se pueden determinar a nivel de proteína, por ejemplo, por medición de los niveles de péptidos codificados por los productos génicos descritos aquí o la localización subcelular o actividades de los mismos por medio de plataformas tecnológicas, como por ejemplo, AQUA. Estos métodos son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, inmunoensayos con base en anticuerpos contra proteínas codificadas por los genes, aptámeros o impresos moleculares . Se puede usar cualquier material biológico para la detección y/o cuantificación de la proteína p su actividad. Como alternativa, se puede seleccionar un método adecuado para determinar la actividad de proteínas codificadas por los genes marcadores según la actividad de cada proteína analizada.

Las DETERMINANTES sean proteínas, polipéptidos , mutaciones y polimorfismos de los mismos se pueden detectar de cualquier manera que sea adecuada, pero, por lo general, se detectan al poner en contacto una muestra proveniente del individuo con un anticuerpo que se une a la DETERMINANTE ya sea proteína, polipéptido, mutación o polimorfismo y luego detectar la presencia o ausencia de un producto de reacción. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, quimérico o un fragmento de éstos, como se comentó con detalle en lo anterior; la etapa que consiste en detectar el producto de reacción se puede llevar a cabo con cualquier inmunoensayo adecuado. La muestra del individuo es normalmente un fluido biológico tal como se describió en lo anterior y puede ser la misma muestra de fluido biológico utilizada para aplicar el método descrito en lo anterior.

Los inmunoensayos realizados según la presente invención pueden ser ensayos homogéneos o ensayos heterogéneos. En un ensayo homogéneo la reacción inmunológica comprende, por lo general, el anticuerpo específico (por ejemplo, anticuerpo antiproteína DETERMINANTE), un analito marcado y la muestra de interés. La señal que surge de la etiqueta o marca se modifica, directa o indirectamente, durante la unión del anticuerpo con el analito marcado. Tanto la reacción inmunológica como la detección del grado de la misma se pueden llevar a cabo en una solución homogénea. Se pueden emplear etiqúetas inmunoquímicas que incluyen radicales libres, radioisótopos, colorantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos o coenzimas.

En un enfoque de ensayo heterogéneo, los reactivos son, por lo general, la muestra, el anticuerpo y los medios para producir una señal detectable. Se pueden usar muestras como las que se describen en lo anterior. El anticuerpo se puede inmovilizar en un soporte, como un glóbulo (por ejemplo, glóbulos de proteína A y proteína G agarosa) , placa o portaobjetos y ponerlo en contacto con la muestra de la que se sospecha que contiene el antígerio en fase líquida. Luego, el soporte se separa de la fase líquida y la fase de soporte o la fase líquida se examinan con respecto a la presencia de una señal detectable empleando medios para producir esa señal . La señal está relacionada con la presencia del analito en la muestra. Los medios para producir una señal detectable incluyen el uso de etiquetas radioactivas, etiquetas fluorescentes o etiquetas enzimáticas . Por ejemplo, si el antígeno a detectar contiene un segundo sitio de unión, un anticuerpo que se una a ese sitio se puede conjugar a un grupo detectable y añadirse a la solución de reacción en fase líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo detectable en el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de prueba. Ejemplos de inmunoensayos adecuados son oligonucleótidos , inmunotransferencia, métodos de inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, métodos de quimiluminiscencia, electroquimiluminiscencia (ECL - electrochemiluminescen.ee) o inmunoensayos ligados a enzimas.

Los expertos en la técnica estarán familiarizados con varios formatos de inmunoensayos específicos y variaciones de los mismos que pueden ser útiles para llevar a cabo los métodos expuestos en la presente. Véase, en general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Ratón Fia.); véase también la Patente de los Estados Unidos Núra. 4,727,022 de Skold et al. titulada "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application", Patente de los Estados Unidos Núm. 4,659,678 de Forrest et al. titulada "Immunoassay of Antigens", Patente de los Estados Unidos Núm. 4,376,110 de David et al. titulada " Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies" , Patente de los Estados Unidos Núm. 4,275,149 de Litman et al., titulada "Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays", Patente de los Estados Unidos Núm. 4,233,402 de Maggio et al., titulada "Reagents and Method Employing Channeling" y Patente de los Estados Unidos Núm. 4,230,767 de Boguslaski et al., titulada "Heterogenous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as a Label" .

Los anticuerpos se pueden conjugar a un soporte sólido adecuado para una prueba de diagnóstico (por ejemplo, glóbulos como proteína A o proteína G agarosa, microesferas , placas, portaobjetos o pocilios constituidos por materiales como látex por poliestireno) según las técnicas conocidas, por ejemplo, unión pasiva. Los anticuerpos descritos aquí, del mismo modo, se puede conjugar con etiquetas o grupos detectables como radioetiquetas (por ejemplo, 35S, 125I, 131I) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina) y etiquetas fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, Alexa, proteína fluorescente verde, rodamina) según las técnicas conocidas .

Los anticuerpos también pueden ser útiles para detectar modificaciones posteriores a la traducción/ de DETERMINANTES ya sean proteínas, polipéptidos , mutaciones y polimorfismos, como fosforilación de tirosina, fosforilación de treonina, fosforilación de se ina, glucosilación (por ejemplo, O-GlcNAc) . Estos anticuerpos detectan de manera específica los aminoácidos fosforilados en una proteína o proteínas de interés y se pueden usar en los ensayos de inmunotransferencia, inmunofluorescencia y ELISA descritos aquí. Estos anticuerpos son muy conocidos para los expertos en la técnica y se encuentran disponibles a nivel comercial. Las modificaciones posteriores á la traducción también se pueden determinar por medio de iones metaestables en espectrometría de masas de ionización y desorción por láser asistida por matriz reflectora y de tiempo de vuelo (MALDI-TOF - reflector matrix-assisted láser desorption ionization- ime of flight mass spectrometry) (Wirth, U. et al. (2002) Proteomics 2 (10) : 1445-51) .

Para las DETERMINANTES ya sean proteínas, polipéptidos , mutaciones y polimorfismos, que se sabe tienen actividad enzimática, las actividades se pueden determinar in vitro por medio de los análisis enzimáticos conocidos en la técnica. Estos análisis incluyen, entre otros, análisis de fosfatasa, reductasa, entre muchos otros . La modulación de la cinética de las actividades enzimáticas se puede determinar por medición de la constante de velocidad KM por medio de los algoritmos conocidos, como la gráfica de Hill, la ecuación de Michaelis-Menten, gráficas de regresión lineal como el análisis Lineweaver-Burk y la gráfica de Scatchard.

Al utilizar la información de la secuencia proporcionada por las entradas de la base de datos para las secuencias DETERMINANTES, la expresión de las secuencias DETERMINANTES (si estuvieran presentes) se puede detectar y medir utilizando las técnicas conocidas para las personas con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo,, las secuencias dentro de las entradas de la base de datos de secuencias correspondientes a las secuencias DETERMINANTES o dentro de las secuencias descritas aquí, se pueden usar para construir sondas para detectar secuencias de ARN DETERMINANTE, por ejemplo, con análisis de hibridación en transferencia Northern o métodos con secuencias de ácido nucleico específico que se amplifican de manera específica y de preferencia cuantitativamente. Como otro ejemplo, las secuencias se pueden usar para construir cebadores para amplificar de manera específica las secuencias DETERMINANTES en, por ejemplo, métodos de detección con base en amplificación como la reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR - reverse-transcription based polymerase chain reaction) . Cuando las alteraciones en la expresión genética están asociadas con la amplificación, deleción, polimorfismos y mutaciones génicas, las comparaciones de secuencias en poblaciones de prueba y de referencia se pueden hacer comparando cantidades relativas de las secuencias de ADN analizado en las poblaciones de prueba y de referencia.

La expresión de los genes descritos aquí se puede medir a nivel de ARN con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar el análisis de hibridación Northern que utiliza sondas que reconocen de manera específica una o más de estas secuencias, para determinar la expresión génica. Como alternativa, la expresión se puede medir mediante ensayos PCR de transcripción inversa (RT-PCR) , por ejemplo, utilizando cebadores específicos para las secuencias expresadas diferencialmente . El ARN también se puede cuantificar, por ejemplo, por medio de otros métodos de amplificación dirigida (por ejemplo, TMA, SDA, NASBA) o métodos de amplificación de señal (por ejemplo, bADN) , y lo similar.

Como alternativa, se pueden medir los metabolitos de la proteína y ácido nucleico DETERMINANTES. El término "metabolito" incluye cualquier producto químico o bioquímico de un proceso metabolico, por ejemplo, cualquier compuesto producido por el procesamiento, escisión o consumo de una molécula biológica (por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, carbohidrato o lípido) . Los metabolitos se pueden detectar de muchas maneras conocidas para el experto en la técnica, que incluyen espectroscopia de índice de refracción (RI - refractive índex) , espectroscopia ultravioleta (UV) , análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarrojo (IR cercano) , espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR - nuclear magnetic resonance) , análisis de dispersión luminosa (LS - light scattering) , espectrometría de masas, espectrometría de masas con pirólisis, nefelometría, espectroscopia Ráman, cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas, cromatografía de líquidos combinada con espectrometría de masas, espectrometría de masas de ionización y desorción por láser asistida por matriz y de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) , espectroscopia de nebulización iónica combinada con espectrometría de masas, electroforesis capilar, detección por R e IR. (Véase, WO 04/056456 y WO 04/088309) , las cuales, se consideran parte de la presente, como referencia en su totalidad) . Al respecto, otros analitos DETERMINANTES se pueden medir con los métodos de detección mencionados en lo anterior u otros métodos conocidos para el técnico experimentado. Por ejemplo, los iones de calcio circulante (Ca2+) se pueden detectar en una muestra por medio de colorantes fluorescentes como la serie Fluo, Fura-2A, Rhod-2, entre otros. Del mismo modo, se pueden detectar otros metabolitos DETERMINANTES por medio de reactivos que están específicamente diseñados o adaptados para detectar esos metabolitos .

Estuches La invención también incluye un reactivo de detección de DETERMINANTE, por ejemplo, ácidos nucleicos que identifican de manera específica uno o más ácidos nucleicos DETERMINANTES por sus secuencias de ácido nucleico homologas, como secuencias de oligonucleótidos , complementarias a una porción de los ácidos nucleicos DETERMINANTES o anticuerpos para proteínas codificadas por los ácidos nucleicos DETERMINANTES, empacados juntos en forma de un estuche. Los oligonucleótidos pueden ser fragmentos de los genes DETERMINANTES. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden ser de 200, 150, 100, 50, 25, 10 o menos nucleótidos de longitud. El estuche puede contener en recipientes separados un ácido nucleico o anticuerpo (ya sea unido a una matriz sólida o empacado por separado con reactivos para unirse a la matriz) , formulaciones de control (positivo y/o negativo) y/o una etiqueta detectable como fluoresceína, proteína fluorescente verde, rodamina, colorantes de cianina, colorantes Alexa, luciferasa, radioetiquetas, entre otras. El estuche puede incluir instrucciones (por ejemplo, escritas, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo. El ensayo puede estar, por ejemplo, en forma de una hibridación Northern o un ensayo ELISA Sandwich, como es sabido en la técnica.

Por ejemplo, los reactivos de detección de DETERMINANTE se pueden inmovilizar en una matriz sólida, como una tira porosa, para formar al menos un punto o sitio de detección de DETERMINANTE. La región de medición o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de puntos o sitios que contienen un ácido nucleico. Una tira de prueba también puede contener puntos para controles positivos y/o negativos. Como alternativa, los puntos de control pueden estar ubicados en una tira separada de la tira de prueba. Como opción, los diferentes puntos o sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de ácidos nucleicos inmovilizados, por ejemplo, una cantidad más elevada en el primer punto de detección y una cantidad menor en los siguientes puntos. Al adicionar la muestra de prueba, el número de puntos que manifiestan una señal detectable ofrece una indicación cuantitativa de la cantidad de DETERMINANTES presentes en la muestra. Los puntos de detección se pueden configurar de cualquier forma que sea adecuadamente detectable y por lo general, están en forma de barra o de un punto que abarca el ancho total de una tira de prueba.

Como alternativa, el estuche contiene una matriz de sustrato de ácido nucleico que comprende una o más secuencias de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos del conjunto identifican de manera específica una o más secuencias de ácido nucleico representadas por las DETERMINANTES 1-360. El varias modalidades la expresión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 100, ¡125, 150, 175, 200, 250, 275 o más de las secuencias representadas por las DETERMINANTES 1-360, se pueden identificar por la unión a la matriz. La matriz de sustrato puede estar, por ejemplo, en un sustrato sólido, por ejemplo, un " chip" tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,744,305. Como alternativa, la matriz de sustrato puede ser una matriz en solución, por ejemplo, xMAP (Luminex, Austin, TX) , Cyvera (Illumina,, San Diego, CA) , CellCard (Vitra Bioscience, ountain View, CA) y Quantum Dots 1 Mosaic (Invitrogen, Carlsbad, CA) .

Las fuentes de anticuerpos adecuadas para la detección de DETERMINANTES incluyen fuentes comerciales como, por ejemplo, Abazyme, Abnova, Affinity Biologicals, AntibodyShop, Biogénesis, Biosense Laboratories, Calbiochem, Cell Sciences, Chemico International, Chemokine, Clontech, Cytolab, DAKO, Diagnostic BioSystems, eBioscience, Endocrine Technologies, Enzo Biochem, Eurogentec, Fusión Antibodies, Génesis Biotech, GloboZymes, Haematologic Technologies, Immunodetect , Immunodiagnostik, Immunometrics , Immunostar, Immunovision, Biogenex, Invitrogen, Jackson ImmunoResearch Laboratory, KMI Diagnostics, KOma Biotech, LabFrontier, Life Science Institute, Lee Laboratories, Lifescreen, Maine Biotechnology Services, Mediclone, icroPharm Ltd., ModiQuest, Molecular Innovations, Molecular Probes, Neoclone, Neuromics, New England Biolabs, Novocastra, Novus Biologicals, Oncogene Research Products, Orbigen, Oxford Biotechnology, Panvera, PerkinElmer Life Sciences, Pharmingen, Phoenix Pharmaceuticals , Pierce Chemical Company, Polymuri Scientific, Polysciences , Inc., Prómega Corporation, Proteogenix, Protos Immunoresearch, 1 QED Biosciences, Inc., R&D Systems, Repligen, Research Diagnostics, Roboscreen, Santa Cruz Biotechnology, Seikagaku America, Serological Corporation, Serotec, SigmaAldrich, StemCell Technologies, Synaptic Systems GMBH, Technop arm, Terra Nova Biotechnology, TiterMax, Trillium Diagnostics, Upstate Biotechnology, US Biological, Vector Laboratories, Wako Puré Chemical Industries y Zeptometrix. Sin embargo, el técnico experimentado, de rutina, puede preparar anticuerpos, sondas de ácidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos , aptámeros, ARNsi, oligonucleótidos antisentido, contra cualquiera de las DETERMINANTES de la Tabla 1.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : MÉTODOS GENERALES Ratones transgénicos y tumores primarios Se utilizó el transactivador de tetraciclina inverso, el promotor Tet y el transgén activador/promotor de tirosinasa según se describe (Ganss, Montoliu e al. 1994; Chin, Pomerantz et al. 1997; Chin, Tam et al. 1999) .

El ADNc c-Met de ratón (obsequio de George F Vande-Woude, Grand Rapids, MI) se clonó bajo el control de un promotor Tet de modo similar a lo descrito (Chin, Nature 1999) . Se generaron varias líneas fundadoras transgénicas , a la frecuencia esperada. La línea activadora bien definida (Tyr/rtTA, línea 37-Chin, Nature 1999) y tres líneas reporteras independientes (Metl5, Met28 y Met40) , se utilizaron en estos estudios.

Para activar la expresión transgénica in vivo, a los ratones transgénicos MET se les administró doxiciclina en el agua de consumo (2 µg/ml en agua con sacarosa) , en la etapa del destete y se observaron para detectar del desarrollo espontáneo del tumor. Un subgrupo de animales (de 3 semanas) se anestesiaron por vía intraperitoneal con avertina (0.5 g/kg de peso corporal) y se les hizo una herida rectangular de 20 mm en el lomo que luego se suturó. Los animales se observaron cada dos semanas para detectar el desarrollo de tumores o el aspecto de enfermos. Los animales premoribundos o los animales con carga tumoral significativa se sacrificaron y después se les hicieron minuciosas autopsias. Las muestras de tumor se fijaron en formalina al 10% y se introdujeron en parafina para su análisis histológico como se ha descrito previamente (Chin, L. et al. Genes y Derivado, 1997) . En casos en los que había suficientes muestras, los tumores primarios se congelaron de manera instantánea ( flash-frozen) para posterior análisis y se generaron líneas celulares.

Cultivo celular. Se derivaron líneas celulares de melanoma a partir de los tumores de ratones, por digestión con colagenasa + hialuronidasa (2 mg/ml; Sigma) durante 2 horas y después se cultivaron con medio RPMI 1640 (Gibco BRL) que contenía FBS 10% (suero fetal de bovino - fetal bovine serum) y penicilina/estreptomicina 1%. Se generaron cultivos de melanocitos a partir de epidermis de ratones recién nacidos según lo descrito10 y se mantuvieron en RPMI 1640 que contenía FBS 5%, penicilina/estreptomicina 1%, 200 pM de toxina de cólera, 200 nM de 12-O-tetradecanoilforbol-13 -acetato (TPA) . La expresión de c-Met transgénico se indujo en células cultivadas por adición de doxicicliná a 2 g/ml. Melanocitos M3 BRAF, melanocitos cebados con HMEL468, WM3211 y WM115 se mantuvieron en RPMI 1640 que contenía FBS 10%, penicilina/estreptomicina 1%. HMÉL468 identifica un subclon de células PMEL/hTERT/CDK4 (R24C) /p53DD/BRAFv600E según se describe en Garraway et al.11.

Análisis histológico ?_ tinción inmunohistoquímica . Los ratones se sacrificaron según los lineamientos institucionales y los órganos se fijaron en formalina amortiguada al 10% y se incorporaron en parafina. Las secciones de tejido se tiñeron con H&E para proceder a la clasificación de las lesiones y la detección de la metástasis del tumor. Para la detección de proteína c-Met y determinar su estado de activación, las muestras de tumor se inmunotiñeron con anticuerpos totales para c-Met y fosfo c-Met (Tyrl349) a partir de la tecnología de señalización celular. Los tumores se inmunotiñeron con anticuerpo S100 de Sigma.

Expresión génica por RT-PCR y PCR cuantitativa en tiempo real. Para análisis de expresión génica, el ARN total se aisló de melanomas cutáneos primarios o de células cultivadas con Trizol (Gibco BRL) según el protocolo del fabricante. El ARN total se trató con RQ1 DNAsa (Promega) y se usó 1 g de ARN total para la reacción de transcripción inversa con polimerasa Superscript II (Invitrogen) cebada con oligo(dT). Las regiones codificantes se amplificaron por PCR o PCR cuantitativa en tiempo real utilizando SYBR Green (Applied Biosystems) en un sistema PCR Mx3000P en tiempo real (Stratagene) . Se usó proteína ribosómica R15 como control de expresión interno. Las secuencias cebadoras son las siguientes: c-Met: 5'- TCTGTTGCCATCCCAAGACAACATTGATGG (SEQ ID NO. 1), 5'-AAATCTCTGGAGGAGGTTGG (SEQ ID NO. 2); HGF: 5'-CAAGGCCAAGGAGAAGGTTA (SEQ ID NO. 3), 5'- TTTGAAGTTCTCGGGAGTGA (SEQ ID NO. 4); Tyr : 51 CCAGAAGCCAATGCACCTAT (SEQ ID NO. 5), 5'-AGCAATAACAGCTCCCACCA (SEQ ID NO. 6); TRP1 : 5 ATTCTGGCCTCCAGTTACCA (SEQ ID NO. 7), 5 GGCTTCATTCTTGGTGCTTC (SEQ ID NO. 8); DCT; 5*- AACAACCCTTCCACAGATGC (SEQ ID NO. 9), 5'-TCTCCATTAAGGGCGCATAG (SEQ ID NO. 10); R15 : 5'- CTTCCGCAAGTTCACCTACC (SEQ ID NO . 11), TACTTGAGGGGGATGAATCG-inversa (SEQ ID NO. 12) . Los cebadores S AD3 fueron de Superarray .

Perfiles de expresión génica y análisis de datos.

Los ARN de tumor de ratón, inducido por et y HRas, se extrajeron en la forma descrita en lo anterior, se marcaron e hibridaron en Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrays de Dana-Farber Cáncer Institute Microarray Core Facility según el protocolo del fabricante. Los datos de expresión se procesaron con el software R/bioconductor (www. bioconductor . org) . El análisis se hizo conforme a lo descrito12. En resumen, el método de corrección de fondo fue MAS (v4.5), el método de normalización fue constante, el método de ajuste PM fue MAS (v5), el método sumario del valor de expresión fue el median-polish (RMA) . El método cali P/M/A fue ???5. Se seleccionaron juegos de sondas con al menos 2 calis presentes entre 12 muestras de tumor (16,434 juegos de sondas) para otros análisis de expresión diferencial entre seis tumores iMet contra seis tumores iHRas . El análisis de significancia de micromatrices {Significance Analysis of Microarray) (SAM 2.0; http//www. stat . stanford. edu/~tibs/SAM/) se usó en el análisis de expresión diferencial13. Se hicieron dos clases de análisis de muestras no apareadas, seguidos de filtrado para un cambio mínimo equivalente al doble y ajuste del valor delta de manera que la tasa de descubrimientos falsos fuera menor de 0.05. El análisis de transcripción inducida por HOXA1 se hizo por medio de SAM tal como se describe en lo anterior utilizando AR extraído de células (HMEL468, WM115, W 3211) transducidas con GFP o H0XA1 y después llevando a cabo la hibridación de ADNc marcado/ en Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus2.0 de Dana-Fárber Cáncer Institute Microarray Core Facility, según el protocolo del fabricante. El programa Ingenuity Pathway Analysis (http: //www. ingenuity.com/index.html) se utilizó para analizar después las funciones y rutas celulares que estuvieran reguladas de manera significativa en el melanoma metastásico.

Comparación de la expresión génica de ratón y los datos de la matriz (array) CGH humana.

Los juegos de sondas no redundantes, diferencialmente expresadas, obtenidas del análisis de expresión de tumores de ratón (descritos en lo anterior) se mapearon respecto a ortólogos humanos que mostraron anomalías en el número de copias en melanoma metastásico humano identificado por la matriz-CGH (GEO número de acceso GSE7606) . Se utilizó la base de datos de Homologene (NCBI) para identificar genes humanos ortólogos para los diferencialmente expresados en tumores i et frente a iRas . Se seleccionaron los genes regulados por aumento o disminución en los tumores iMet (frente a los tumores iRas) y amplificados o eliminados en la metástasis humana, respectivamente.

Agrupación no supervisada y análisis de supervivencia Kaplan-Meier. Los perfiles de expresión de las determinantes metastásicas se usaron para agrupar 295 tumores de mama 14,15 ; en dos grupos por agrupación media-k con R (http : //www. r-project . org/) . El análisis de supervivencia Kaplan-Meier para los dos grupos se llevó a cabo con el paquete de supervivencia en R y se calcularon los valores p utilizando el paquete de supervivencia en R.

Constructos de ADN y genoteca de baja complejidad. Los productos pRetrosuperSmad3 y p3TPLux fueron de Addgene (#15726 y 11767, respectivamente). Para la genoteca de ADNc de baja complejidad, se obtuvieron 230 ADNc que representan 199 genes a partir de la colección ORFeome (Dana-Farber Cáncer Institute) y se transfirieron en alto volumen a pLenti6/V5 DEST ( Invitrogen) por recombinación Gateway según las sugerencias del fabricante. Los ADNc candidatos calificados en el cribado de invasión se verificaron en cuanto a secuencia y expresión utilizando el epítope V5 y se usaron preparaciones de clones homogéneos en todos los estudios de validación de invasión.

Ensayos de producción viral en 96 pocilios, transducción e invasión Transwell. Aproximadamente 3 x 104 células 293T se sembraron en 100 ul por cada pocilio en placas de fondo plano de 96 pocilios, 24 horas antes de la transfección (-90% de confluencia) en DMEM + FBS 10% (antibiótico) . En cada transfección por pocilio, se diluyeron 150 ng de cadena viral y 110 ng de vectores empacados lentivirales, se diluyeron a 15 ul con Opti-ME (Invitrogen) . La mezcla de vectores resultante se combinó con 15 ul de Opti-MEM que contenía 0.6 ul de Liptofectamina 2000 (Invitrogen) , se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos y se adicionó a los 100 ul de medio de cobertura de las células 293T. El medio se reemplazó con DMEM + FBS 10% + P/S aproximadamente 10 horas después de la transfección y se hicieron 4 recolecciones de sobrenadante viral comenzando a las 36 horas postransfección y se combinaron. 150 ul de sobrenadante viral que contenía 8 ug/ml se adicionaron a las células diana (HMEL468) que se seleccionaron en placas de fondo plano de 96 pocilios antes de la infección (70-80% de confluencia) . Las células se infectaron dos veces y se dejaron recuperar en RPMI + FBS 10% + P/S durante 24 h después de la segunda infección, después de lo cual las células se tripsinizaron y se aplicaron en placas de invasión tumoral de 96 pocilios (BD Bioscience) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Las células invadidas se detectaron con etiquetado in vivo utilizando 4 uM de Calcein AM (BD Biosciences) y se midieron por fluorescencia a 494/517 nm (Abs/Em) . Los candidatos calificados como positivos se identificaron como aquellos que calificaron 2x la desviación estándar respecto al control vectorial.

Ensayos de invasión Transwell. Se utilizaron cámaras de invasión estándar de 24 pocilios ; (BD Biosciences) para evaluar el grado de invasión, de acuerdo a las sugerencias del fabricante. En resumen, las células se tripsinizaron, se enjuagaron dos veces con PBS , se resuspendieron en medio RPMI 1640 libre de suero y se sembraron a 7.5 x 104 células/pocilio para HMEL468, 2.0 x 104 para WM3211 y 5.0 x 104 para WM115. Las cámaras se sembraron por triplicado o cuadruplicado y se colocaron en medio que contenía 10% de suero como quimioatrayente así como en placas de cultivo por duplicado como controles de entradas. Después de 22 horas de incubación, las cámaras se fijaron en formalina 10%, se tiñeron con violeta cristal para conteo manual o por cuantificación de pixeles con Adobe Photoshop (Adobe) . Los datos se normalizaron respecto a las células de entrada para controlar las diferencias en el número de células (control de carga) . Para evaluación del silenciamiento génico {knock-down) de SMAD3 en la invasión mediada por HOXA1, se generó un constructó de ARNsh validado dirigido a SMAD3 (pSUPER-shSMAD3) y virus utilizando los protocolos estándar de producción de retrovirus. Las células de control se transdujeron con ARNsh no dirigido (pSUPER-shNT) en paralelo, para comparación de la invasión.

Estudios de xenoinjerto e inyecciones en la vena de la cola. Células HMEL468 se transdujeron de manera estable con virus de GFP o HOXA1. Para los estudios de xenoinjerto, las células se implantaron en los dos flancos ,de ratones CB-17-scid (C . B- Igh-lb/lcrTa.c-Prkdcscid; Taconic) a 1 x 106 células/sitio por vía subcutánea. Para evaluar la capacidad de diseminación pulmonar, se inyectaron 5.0 x 105 en la vena de la cola de ratones CB- 17-scid. Todos los animales se monitorearon en cuanto al desarrollo del tumor y después se hizo necropsia y análisis histológico.

Ensayo del reportero TGFfi. Las células se sembraron a 2 x 105 células por pocilio por triplicado en placas de 6 pocilios, 24 horas antes de la transfección con reportero p3TPLux (1 ug por pocilio) y reportero control (Renilla, 20 ng por pocilio) . Después de 24 horas de incubación, las células se trataron durante 24 horas con TGFP (20 ng/mL, R&D Systems) y se sometieron al análisis de luciferasa (Promega) , de acuerdo al protocolo del fabricante utilizando un equipo Lumat LB9507 Luminometer para tener acceso a la activación del reportero según indica la proporción firefly/Renilla . Los valores p se calcularon mediante la prueba T bilateral.

Análisis por inmunotransferencía . Las células se trataron según como se indica, con 2 ng/ml de TGFP (R&D Systems) , después se lavaron dos veces en PBS y se lisaron con amortiguador RIPA (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 500 µ? de EDTA, 100 µ? de EGTA, Tritón X-100 1.0% y deoxicolato sódico 1%) que contenía 1 mM de PMSF, lx de Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) y IX de inhibidor de fosfatasa (Calbiochem) . Después de 30 minutos de incubación en amortiguador de lisado a 4°C, los extractos de la célula completa se separaron se depuraron por centrifugación a 10k, 10 minutos a 4°C, luego se determinaron las concentraciones de proteína con DC Protein Assay (BioRad) . La proteínas se visualizaron por separación en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris ( Invitrogen) , se transfirieron a PVDF (Millipore, Billerica, MA) se bloquearon con leche al 5% en PBS + Tween-20 y luego se incubaron con los anticuerpos indicados. Los anticuerpos siguientes se usaron en la inmunotransferencia : pSmad3 y Sraad3 total (Cell Signaling Technology) , alfa-tubulina (Sigma) , V5 (Invitrogen) , fosfo-FAK (pY397) ; Invitrogen) .

Ensayos de expresión con base en ARN por tecnología Panomics. Como alternativa al análisis de expresión de proteínas, también se utilizó la tecnología Quantigene Plex (Panomics) para evaluar la expresión de de PD de ARN. La plataforma QuantiGene tiene como base la tecnología de ADN ramificado, ensayo de hibridación de ácido nucleico sándwich que ofrece un enfoque especial para la detección y cuantificación de ARN por amplificación de la señal del reportero más que la secuencia (Flagella, M. , Bui, S., Zheng, Z., Nguyén, C.T., Zhang, A., Pastor, L., Ma, Y., Yang, W. , Crawford, K.L., McMaster, G.K., et al. (2006) . A multiplex branched ADN assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem 352, 50-60) . Esta tecnología puede medir de manera confiable la expresión cuantitativa de ARN en homogeneizados de tejido frescos, congelados o fijos en formalina e incorporados en parafina (FFPE - formalin-fixed, paraffin-embedded) (Knudsen, B.S., Alien, A.N. , cLerran, D.F., Vessella, R.L., Karademos, J. , Davies, J.E., Maqsodi, B., McMaster, G.K. y Kristal, A.R. (2008) Evaluation of the branched-chain DNA assay for measurement of RNA in formalina-fixed tissues. J Mol Diagn 10, 169-176. Como se muestra en la Figura 17A, una prueba preliminar de viabilidad ha demostrado que podemos medir de manera confiable la expresión de ARN de la UBE2C en 21 nevos "spitz" y 22 muestras de melanoma maligno que estén en bloques FFPE. El análisis de cada gen tuvo excelente reproducibilidad con valores de coeficiente de variación (CV - coefficient of variation) en el intervalo de 8 a 9%, cumpliendo así con los máximos estándares de control de calidad. Esta metodología ofrece así una alternativa ideal para recabar una primera información del patrón de expresión de un candidato de interés sin un anticuerpo disponible. Cabe mencionar que el análisis QuantiGene Plex de la UBE2C corroboró los resultados que indican la actividad oncogénica de la UBE2C. Específicamente, utilizando el ensayo clásico de transformación conjunta demostramos que la UBE2C contribuyó con el HRASV12 activado para aumentar la formación del foco transformado en los fibroblastos embrionarios de ratón primario deficiente en Ink4á/Arf (Figura 17B) .

Análisis cuantitativo automatizado (AQUA®) . Este análisis permite la medición exacta de la concentración de proteína dentro de los compartimientos celulares, como se describe con detalle en alguna parte de la publicación [Camp, R.L., Chung, G.G., & Rimm, D.L., Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue icroarrays . Nat Med 8 (11) , 1323-1327 (2002)] . En resumen, se capturó una serie de imágenes monocromáticas de alta resolución por medio del microscopio PM-2000. Para cada punto histospot, se obtuvieron imágenes en foco y fuera de foco utilizando la señal proveniente de DAPI, citoqueratina y señales específicas para el anticuerpo. El tumor se distinguió de los elementos estrómicos y no estrómicos generando una "máscara" tumoral a partir de citoqueratina y la señal S100. Esto generó una máscara binaria (cada pixel está "on" u "off") con base en un umbral de intensidad establecido por inspección visual de los histospots. La puntuación AQUA® de la proteína de interés en cada compartimiento celular se calculó dividiendo la intensidad de señal (calificada en una escala de 0-255) entre el área del compartimiento específico. Las muestras con menos de 5% de área tumoral por punto no se incluyeron en el análisis cuantitativo automatizado por no ser representativas de la muestra de tumor correspondiente.

EJEMPLO 2 : IDENTIFICACIÓN DE UN DISTINTIVO DE METÁSTASIS EVOLUTIVAMENTE CONSERVADO INDUCIDO POR EL FENOTIPO Modelos de melanoma de ratón manipulado genéticamente (GEM - genetically-engineered mouse) con potenciales metastásicos muy diferentes se usaron como un sistema biológico para disminuir la confusión por las incertidumbres inherentes del análisis de cáncer humano, que incluyen, entre otras, variables relativas a la documentación de micro y macrometástasis y la duración del seguimiento. Los dos modelos de melanoma de ratón utilizados fueron: (i) un modelo GEM inducido por Met, recién desarrollado, constituido por los transgenes rCTA y fcet- et inducidos por tirosinasa en un fondo carente de Ink4a/Arf (Tyr-rtTA; Tet-Met; Ink4a/Arf~/~ , en lo sucesivo "iMet") y (ii) el modelo de melanoma de ratón inducido por HRASV12G (Tyr-rtTA; Tet-HRASV12G; Inkéa/Arf^' , en lo sucesivo "iHRAS*")12 previamente descrito. La caracterización fenotípica ha demostrado que 75% de los ratones iMet desarrollan melanoma en los sitios de la biopsia, con una latencía promedio de 12 semanas. Estos tumores > son positivos al marcador de melanocitos, presentan exprésión del receptor de Met activado por fósforo y de HGF (Figura 5A-E) ; por otra parte, las células derivadas de melanoma iMet muestran robusta actividad invasiva en ensayos de invasión en cámara Transwell como respuesta al HGF recombinante (Figura 2A) . Congruente con la activación de señalización HGF-Met en el melanoma metastásico humano avanzado13, los melanoma iMet en animales transgénicos de novo desarrollan metástasis de manera uniforme en los ganglios linfáticos además de diseminación ocasional a las glándulas suprarrenales y al parénquima pulmonar, sitios comunes de la diseminación metastásica en melanoma humano (Figura 2B) . Este fenotipo metastásico de alta penetración contrasta de manera muy definida con el modelo de melanoma iHRAS* que se caracteriza por melanomas cutáneos primarios no metastásicos12,14. Este potencial metastásico contrastante fue reforzado por la demostración de que las línea celulares iMet, pero no las iHRAS*, derivadas de melanoma primarios tuvieron capacidad para diseminarse al pulmón en ensayos de la vena de la cola (Figura 2C) .

Las bien definidas diferencias entre la propensión metastásica de iHRAS* e iMet permitieron la generación de un distintivo de la metástasis de tumor primario inducida por el fenotipo, con base en comparaciones transcriptómicas de melanomas cutáneos primarios de modelos iHRAS* e iMet. Este distintivo de metástasis en ratón comprende 1597 juegos de sondas, con expresión diferencial > 2 veces a una tasa de descubrimiento falso <0.05 se cotejó después con un gran compendio de genes que (i) residen en las anomalías de número de copias (CNA - copy number aberrations) en melanoma metastásico humano y/o (ii) manifiestan diferente expresión entre melanomas primarios y metastásicos humanos, obteniéndose 295 genes regulados por aumento/amplificados y 65 regulados por disminución/eliminados (Figura 3A; tabla 4) . Para recopilar la primera información de los tipos de actividades biológicas conferidas por estos genes, realizamos un análisis de la ruta con. base en el conocimiento utilizando el programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA) para definir cuáles funciones génicas calificaban de manera significativa con la lista de 360 genes filtrados contra la más grande de 1597 distintivos de metástasis murinos . Para evaluar la significancia de las calis de IPA, generamos listas de extracciones al azar de tamaños idénticos para análisis en paralelo. Como se muestra en la Figura 3B, encontramos que los distintivos de expresión de metástasis murinos mostraron algún exceso de representación, con relación a las listas extraídas al azar, de funciones génicas implicadas en las replicación y recombinación de ADN, cáncer, ciclo celular y muerte celular. Por comparación, la lista filtrada por especies I cruzadas/plataformas cruzadas, mostraron notable enriquecimiento en estas misma funciones además del surgimiento de una nueva red funcional no evidente en el distintivo de expresión murino solo, es decir, "ensamble y organización celular" (Figura 3B) . Esta comparación sugiere que la triangulación de un distintivo de metástasis inducido por el fenotipo y la comparación de especies cruzadas puede servir para enriquecer los sistemas génicos con fuertes enlaces con el proceso de tumorigénesis y metástasis.

EJEMPLO 3: CRIBADO GÉNICO FUNCIONAL PARA DETERMINANTES DE METÁSTASIS En particular, el fuerte enriquecimiento de ensamble y organización celular de los genes, se estimuló dada la importancia del movimiento celular y la invasión que son capacidades obligadas de una célula cancerosa diseminativa . Esta observación nos motivó a implementar un cribado génico de baja complejidad para la identificación de genes que inducen invasión (Figura 3C) ; por otra parte, estos cribados se enfocaron en forma exclusiva en genes regulados por aumento dado su posible potencial terapéutico. Específicamente, se obtuvieron 230 1 ORF disponibles que corresponden a 199 de los 295 candidatos únicos regulados por aumento/amplificados (Tabla 5) a partir del sistema ORFeome humano (http: //horfdb . dfci . harvard.edu/) y se transfirieron a un sistema de expresión lentiviral para transducción en HMEL468, una línea de melanocitos humanos inmortalizados por TERT15. Para el cribado primario, utilizamos el ensayo de invasión transwell de 96 pocilios con lectura fluorométrica para medir la capacidad de los genes determinantes candidatos en cuanto al aumento de migración e invasión de las HMEL468 a través del Matrigel que estimula la matriz extracelular . Como controles positivos y negativos, utilizamos lentivirus GFP y NEDD916, respectivamente. El cribado primario se repitió dos veces y 45 candidatos que calificaron con reproducibilidad dos desviaciones estándar respecto al control GFP se consideraron aciertos de cribado primario (Figura 3C-D) . Se hizo entonces, por triplicado, un cribado de validación secundario en los 45 aciertos primarios utilizando cámaras de invasión transwell de 24 pocilios con Matrigel y se obtuvieron 25 genes capaces de mejorar al menos 1.5 veces la invasión en comparación con el control GFP en melanocitos HMEL468 (Figura 3E y Tabla 3) . Por otra parte, los genes relacionados o genes que forman complejo con uno de estas 25 determinantes también se enlistaron en el ensayo funcional, identificando 6 determinantes adicionales .

EJEMPLO 4 : CORRELACIÓN DE EXPRESIÓN Y PROGRESIÓN EN MELANOMA TMA PRIMARIO Y METASTÁSICO HUMANO Con el fin de correlacionar la expresión de las determinantes de metástasis con la progresión de melanoma maligno, hicimos un análisis IHC de micromatrices de tejido (TMA - tissue microarrays) que contenían muestras de melanoma primario, nevo benigno y metástasis de melanoma, por medio de los anticuerpos comerciales disponibles contra determinantes representativas por medio de AQUA, según se encuentra descrito (Camp, R.L., Dolled-Filhart , M . , King, B.L. y Rimm, D.L. (2003). El análisis cuantitativo de micromatrices de tejido de cáncer de mama mostró que los niveles tanto elevados como normales de la expresión de HER2 están asociados con bajos resultados. Cáncer Res 63, 1445-1448) . Como se resume en la Tabla 2 y según los datos representativos de la Figura 4A a la Figura 4B, con excepción de la BRR 1, las otras determinantes evaluadas (HSF1, MCM7, HOXA1, FSCN1, ACP5 , UBE2C y K TC2) manifiestan expresión significativamente más elevada en primario de metástasis contra nevo benigno.

Tabla 2 Nevo Nevo Primario Determinante vs. Anticuerpo Resumen de expresión vs. Met vs. Met primario HSF1 0.0236* 0.0024* 0.3537 abnova; Mets/En primario más alta H00003297-A01 que nevo H0XA1 ?.000G <0.0001* 0.9017 abnova; Mets/En primario más alta H00003198-B01P que nevo FASCIN 0.2669 0.2621 0.0264* Santa cruz; Mets más alta que en sc21743 primario/nevo ACP5 0.2502 0.0014* 0.0262* Abcam; ab49507 Mets más alta que en primario, en primario tiende a ser más alta que en nevo UBE2C 0.0046* 0.7833 0.0162* Abcam; 12290 Tendencias de interés, Mets la más alta, en primario más alta que nevo KNTC2 0.2248 0.3579 0.0338* Abnova; Mets más alta que en H00010403-M01 primario/nevo MCM7 0.0246* 0.0025* 0.3527 Abnova; Mets/En primario más alta H00004176-M01 que nevo BRRN1 0.0349* 0.0607* 0.8057 Bethyl; A300-603A En nevo más alta que en primario Los valores que indica la prueba de valor p de la comparación de puntuación AQUA® indicada * = Significante por la prueba de Fisher, 5%.

EJEMPLO 5: DETERMINANTES DE METÁSTASIS QUE NO SON ESPECÍFICAS DEL LINAJE Y PRONÓSTICO Está bien establecido que la inestabilidad genómica da lugar a tumorigénesis , generando tumores primarios formados por subpoblaciones heterogéneas de células con perfiles genéticos comunes y distintos. Por lo tanto, es razonable que si una subpoblación que expresa determinantes de metástasis dentro de un tumor primario está dotado de una ventaja proliferativa y en última instancia se disemina, la expresión de determinantes de metástasis aumentaría debido a la representación enriquecida en las lesiones metastásicas derivadas 1 más homogéneas. Para evaluar esta expresión asociada con la progresión, las 25 determinantes se examinaron en el gran compendio de datos de perfiles de expresión en la base de datos Oncomine24. Además de siete determinantes que mostraron un aumento en la expresión en metástasis con relación al melanoma primario, las 25 exhibieron un patrón de expresión correlacionada con la progresión en uno o más tumores sólidos no melanómicos (Tabla 3) , incluso cuando la mayoría de estas 25 determinantes de metástasis no hubieran estado implicadas previamente en la progresión del tumor. Por ejemplo, 9 determinantes mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión en gliomas de alto grado. En adenocarcinoma de próstata, 9 de las determinantes de metástasis exhibieron un aumento significativo en la expresión de primario a metástasis; Del mismo modo, en pulmón, 5 exhibieron correlación con grados de tumor crecientes. El traslape más significativo se observó con adenocarcinoma de mama, en donde 12 de las 25 determinantes de metástasis mostraron correlación con etapas o grados de progresión tumoral .

Dado el significativo traslape en el perfil de adenocarcinoma de mama, utilizamos después en mama5''6 los datos de transcriptoma para resultados registrados para explorar la amplia significancia pronostica potencial de estas determinantes. El conjunto de datos de transcriptoma de cáncer de mama incluyó sondas para 19 de las 20 determinantes de metástasis, que se utilizaron como distintivo para estratificar una cohorte de 295 tumores de mama por medio del algoritmo de clasificación k-media sin supervisar (Figura 5A; Tabla 7) . Se encontró que los subgrupos resultantes tienen diferencias significativas en la supervivencia global (p=2.6~9) y supervivencia libre de metástasis (p=2.1"s) (Figura 5B) . Se obtuvo una separación similar cuando la clasificación se hizo utilizando cúmulos jerárquicos (no se muestran los datos) .

El robusto potencial pronóstico en cáncer de mama en etapa temprana y el amplio patrón de expresión correlacionada con progresión en varios tipos de cáncer no melanómicos, indican que estas 25 determinantes de metástasis no son específicas del linaje y es probable que dirijan procesos centrales que operan en diferentes tipos de tumores, aunque en la literatura la mayoría de ellas no hayan sido relacionadas con la invasión o metástasis. En lugar de esto, muchas están registradas en Gene-Ontólogy como genes del ciclo celular o de proliferación con funciones conocidas en la regulación de puntos de verificación de células fusiformes o condensación de cromosomas. Por ejemplo, se sabe que varias determinantes (por ejemplo, BRRN1, KNTC2 , SPAG5, UBE2C, CENPM y MCM7) regulan procesos de progresión mitótica de ADN, replicación fusiforme mitótica y de ADN. Por otra parte, BRRN1, KNTC2 y UBE2C, están incluidas en un módulo funcional de 20 genes enriquecido en un distintivo de cáncer de mama metastásico asociado con tumores de mama primarios que desarrollan metástasis con relación a los tumores primarios que no lo hacen25. Del mismo modo, la MCM7 se ha identificado como marcador de escaso pronóstico para varios cánceres invasivos, que incluyen el cáncer de próstata26. En su resumen, mientras que aún no es evidente si estas proteínas contribuyen directa o indirectamente en la invasión celular y la metástasis, especulamos que estas proteínas qué son punto de control mitótico, pueden tener doble función en el control de la maquinaria citoesquelética para el movimiento celular.

EJEMPLO 6: IDENTIFICACIÓN DE GENES QUE CONFIEREN RESISTENCIA A ANOIKIS La metástasis en un proceso complejo de varias etapas (Gupta, G.P., y Massague, J. (2006) Cáncer metástasis: building a framework. Cell 127, 679-69). Para que se presente la metástasis total, las células tumorales tienen que tener la capacidad de proliferar en el lugar del tumor primario, introducirse en el sistema circulatorio o linfático, sobrevivir mientras están en circulación, salir del sistema circulatorio y formar un tumor secundario. Para llevar a cabo esto, las células tumorales circulantes tienen que superar la anoikis o apoptosis inducida por la pérdida de fijación a la matriz (Simpson, C.D., Ariyíwe, K. , y Schimmer, A.D. (2008) Anoikis resistance ánd tumor metástasis. Cáncer Lett 272, 177-185). A fin de identificar genes que confieren resistencia a la anoikis a lás células sensibles a la anoikis, omptimizamos un cribado in vitro para la sensibilidad a la anoikis (Figura 6A) . Supusimos que las células sembradas en una placa de baja agüjorneración (ultra-low cluster) recubierta con una capa de hidrogel que evitaba la fijación a la superficie celular simularía parcialmente in vitro la suspensión in vivo de 1as células mientras están en circulación.

En estudios preliminares, sometimos a ¡cribado a una cohorte de líneas celulares de melanoma y ericontramos que todas, sin importar la etapa del melanoma (poif ej emplo, localizado, invasivo) , son resistentes a la anoikis. En cambio, nosotros y otros más encontramos que 1as células epiteliales intestinales de rata (RIE - rat nteséinal epithelial) tienen menos supervivencia al perder: la adherencia (Figura 6B) (Douma, S., Van Láar, T. , Zevenhoven, J., Meuwissen, R. , Van Garderen, E )y Peeper, D.S. (2004) Suppression of anoikis and i Índubtion of metástasis by the neurotrophic receptor TrkB . Nature 430, 1034-1039. Las células RIE son inmortalizadas peVO no son una línea celular transformada. Las células qúe tienen anoikis inician rutas apoptóticas mientras que son viables hasta la pérdida de fijación muestran resis;teric:ia a la anoikis. Por lo tanto, determinamos la generacioh de ATP, indicativo del metabolismo celular, como una medida cuantificable y sensible de la viavilidad celular.

Utilizando el sistema de recombinaciónl Gateway, 199 de los ORF candidatos, identificados a ttravés de nuestro análisis oncogenómico de especies cru adas; se clonaron en el vector retroviral, MSCV/V5. Según ; e analizó por transferencia Western, mTrkB y un muestreo aláa.torizado de clones de ADNc de tamaño compatible se exprIssaron en células RIE, demostrando así la funcionalidad d nuestro sistema de expresión (Figura 6C, no se muestran 1 ?? datos) .

Para el cribado de resistencia a la anoikis , células 293T se depositaron en placas de 6 poci .los y se cotransfectaron con MSCV/V5 que contenía un ORF y el vector de empacado, pCL-Eco (Figura 6A) . Las cétulas se transíectaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogfn) ? el virus se recolectó en diferentes puntos de evailuación. Las células RIE se depositaron en placas de 6 poci los y 24 horas después del sembrado se infectaron en $erie con sobrenadante de 48 h y de 72 h. Las células RIE se recolectaron 24 horas después de la infección final y después de la generación de suspensión monoce ¡luíar, 7000 células/pocilio se depositaron por triplicado en ¿1acas ULC de 96 pocilios (tiempo 0 h) . Para determinar el número de células en condiciones iniciales, las células se lisaron a las 0 h y se determinaron los niveles de ATP (Cell Titer Glo, Promega) . A las 24 horas posteriores a la ¡siembra en ULC de 96 pocilios, las células se lisaron co el : Cell Titer Glo y el lisado se transfirió para su lectura a placas luminométricas de 96 pocilios opacas. En nuestro análisis, los niveles de ATP se compararon a las 24 horas con relación a las 0 horas obteniendo así el grado de cambio en los niveles de ATP (Figura 7) .

Se ha demostrado que el receptor neurotrópico TrkB confiere resistencia a la anoikis in vitro a células sensibles a la anoikis y estimula la formación del tumor y la diseminación pulmonar in vivo (3) . Hemos auirentado la confianza en nuestro cribado ya que el TrkB murino (mTrkB) y el ligando humano del TrkB, BDNF, confirieron a las células RIE resistencia a la anoikis más que el vector solo (Figura 7) . En cribados duplicados idénticos, un promedio de 21% de genes confirieron más de 1 desviación estándar respecto a la mediana de todos los genes candidatos. Veinte genes dieron más de 2 desviaciones estándar respecto a la mediana, en al menos un ciclo del cribado (Figura 8) . Nueve de estos genes confirieron más de 1 desviación estándar respecto a la mediana en los dos cribados, mientras que siete genes de estos nueve dieron más de 2 desviaciones estándar con respecto a la mediana en al menos un cicló del cribado (HNRPR, CDC20, PRI 2A, HRSP12 , ENY2 , MGC14141, RECQL) . De manera interesante, de los nueve geríes, STK3, PRIM2A, CDC20, RECQL, HNRPR, ENY2 y MGC14141 han1 mostrado mayor expresión en muestras de melanoma, ya sea en normal vs . melanoma como en primario vs . metástasis Oncomine , GEO) . Por otra parte, los nueve genes han most :raqo aumento en la expresión en tumores de mama, pulmionares o cerebrales, lo que demuestra que nuestra lista de prioridad tiene validez también en otros tipos de cáncer (Onlcomine) .

A fin de confirmar la mayor viabilidad de células que expresan nuestros nueve genes candidato en condicciones no adherentes, examinamos la retención de las capacidades de fijación después de un periodo de pérdida de fijación. Las células RIE que expresan genes de inter:és se transfirieron a placas ULC y después de 24 horas, todas las células en suspensión se transfirieron a placas adherentes . Las células adherentes se tiñeron con violeta crijstal para cuantificar las células viables. Como se muéstora en la Figura 9, las células RIE hablan reducido la capad, idad , para fijarse a placas adherentes después de estar en uspensión durante 24 horas. Sin embargo, los nueve genes cdnf:irieron mayor capacidad a las RIE para volverse a fijar y permanecer viables después de que las células habían estado en suspensión (Figura 9) . Esta capacidad seria una característica necesaria en las células de tumores circulantes que estuvieran destinadas a coloni:zar en un punto secundario.

EJEMPLO 7 : LAS DETERMINANTES DE METÁSTASIS SON 0NC0GÉN|ICAS Puesto que las determinantes de meitáptasis se adquieren temprano en el proceso de transformac .ón y son preexistentes en tumores primarios, se ha asumido que estos genes de metástasis también podrían ser, de buena fe, genes de cáncer que aportan una ventaja proliferativa a los tumores primarios2,22. Para considerar esto, cuest onamós si estas determinantes de metástasis podrían conferir tumorigenicidad franca a los melanocitos inmortal zados con TERT, HMEL468. Además de HOXAl, también seleccionamos otras tres determinantes para evaluación, ANLN, BRR 1 y KNTC2, ya que están incluidas en un distintivo de 2j54 genes opuestamente correlacionado con sobrevivencia libre de metástasis en melanoma23. En efecto, las HMEL468 transducidas con HOXAl desarrollaron grandes tumoifes (2 cm) con evidencia histopatológica de invasión locajL (Figura 10A) con penetración de 33% (n=2 de 6 sitios trasplantados por vía subcutánea) después de 12 semanas, mi .entras que los controles transducidos con vector no desarrollaron ningún tumor en las 21 semanas posteriores a la inyecci Qn (Figura 10B) . Del mismo modo, las células transducidas |con ANLN, BRRN1 y KNTC2 manifestaron aumento en la tumor genicidad del mismo modo la invasión de células de melanqma humano WM115 y WM3211 (Figura 11B a Figura 11C) . En efecto, como se resume en la Tabla 3 , muchas de las DETERMINANTES sometidas a ensayos de invasión en células de melanoma W 115 y M3211 también mostraron actividad proinvasiva mas allá de la de los melanocitos HMEL468. Otros ehsayos de validación que evalúan el potencial oncogenico y metastásico del HOXA1 que utilizaron la línea celular de melanoma débilmente oncogénica, WM115, indican1 que la sobreexpresión de HOXA1 aumentan notablem1ente el crecimiento del tumor de células xeno )trasplantadas en ratones lampiños (Figura 11E) lo cual es congruent e con los datos que usan otras líneas celulares de ratón y human s . La sobreexpresión del H0XA1 también lleva a un mayor crecimiento tumoral de las células WM115 cluando se implantan por vía intradérmica en los flancos de ratones lampiños y se producen tumores primarios que .fácilmente desarrollan metástasis en los pulmones destoués del desarrollo tumoral (Figura 11F) mientras que e1 control (células de vectores vacíos) no forma tumores primario S'.

Además de estos estudios en líneas celulares humanas, también evaluamos el gen HOXA1 y Fascin 1 (FSCN1) en líneas celulares de ratón. Congruente con los resultados de invasión que usan sistemas celulares humanos ( igura 11A a Figura 11C) , la expresión de los dos candidat OB aumentó notablemente la capacidad de invasión de la matriz (Figura 12A) de los melanocitos derivadosd de ratón I.ik4a/Arf~/~ transducidos con HRAS* (conocidos como células M3|lRAS, Kim, M . , Gans, J.D., Nogueira, C, Wang, A., Paik, J]H., Feng, B., Brennan, C, Hahn, W.C., Cordon-Cardo, C.|, Wagner, S.N., efc al. (2006). Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metástasis gene. Cell 125, 1269-1281) Por otra parte, la sobreexpresión de HOXAI y Fascin 1 aumento de manera significativa la capacidad de las células M3HRAS para proliferar cuando se xenotrasplantaron en los flancos de ratones lampiños (Figura 12B) y para formar nodulos pulmonares macroscópicos después de la inyección en la vena de la cola, un ensayo sustituto para netástasis (Figura 12C) .

EJEMPLO 9 : HOXAl ES UN ONCOGEN QUE PUEDE PROMOVER LA INVA. IÓN POR MODULACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN ???ß Luego,, para explorar la base molecular de la actividad invasiva del HOXAl, determinamos el transcriptoma HOXAl con base en el perfil de expresión del control ¡y de células HMEL468, WM115 y WM3211 transducidas con HOXAl (Figura 11B) . El análisis del ruta con base en el conocimiento de la lista de genes diferencialmente expresados, reveló un sistema génico de señalización TGFp centrado en SMAD3 como nodo principal (Figura 13? y Tabla 6) . Dada su conocida función en la metástasis21, evaluamos si la señalización TGFP estaba modulada po|r HOXA1. Utilizando un constructo reportero sensible a TQFp (p3TP-Lux) , encontramos que la expresión ectópica del HOXA1 no sólo aumentó la actividad reportera basal (11 0 veces, p=0.003) sino que también dio como resultado un áumento de 9.3 veces en la respuesta al ligando TGFp en comparación con el control (p=0.0001; Figura 14A) . En consecüenc:ia, el pSMAD3 activado y el SMAD3 total se elevaron en cond.iciones de cultivo con suero al 10% y al 1% en la estimijlación de TGF (Figura 14B) , lo cual se corroboró por análisis de la expresión de ARN (Figura 13B) . Por otra parte, la invasión mediada por HOXA1 se anuló por silenciamiento fénico de SMAD3 (Figura 14C) , de este modo, la actividad prómotocra de invasión de H0XA1 se conecta funcionalmente con la señalización TGFp-SMAD, una ruta central que rige la metástasis de cáncer21.

Para examinar si la sobreexpresión de HOXA1 influye en el estado de fosforilación de S AD3 en1 tumores , utilizamos muestras de tumores de xenoinjerto derivados de células de melanoma WM115 que expresan vector vacío o HOXA1 (Figura 11E) para análisis inmunohistoquímico qu5 utiliza un anticuerpo fosfo-específico contra SMAD3. Cqnsistente con nuestra observación de que la sobreexpresión del HOXA1 lleva a un aumento en la fosforilación del SMADtJ (Figura 14B) , encontramos un aumento en la fosforilación del SMAD3 en tumores que sobreexpresán HOXAl (Figura 14D) .

EJEMPLO : CXCR.4 Para obtener información de las funciones biológicas del HOXAl, preparamos ADNc a partir de vector vacío y células de melanoma WM115 que sobreexpresán HOXAl melanocitos HMEL468 para utilizarlos en el sistema RT Profiler PCR Arrays (Superarray) y analizar la expresión de un panel de genes asociados con metástasis. El principal gen sobreexpresado compartido entre las dols líneas celulares fue el receptor de quimiocina CXCR4 (Fijgura 15) , un receptor específica para el factor 1 derivado I estrómico quimiocina (SDF-1) , La expresión de CXCR4 po† células tumorales se ha correlacionado con un mal pronostico en muchos tipos de cáncer y desempeña una función crítica en la metástasis celular a través del establecimiento de un gradiente quimiotáctico en órganos que expresan SDF-1 (Fulton AM. Curr Oncol Rep. 2009 Mar; 11 (2) : 125-31) . Para examinar más la relación entre HOXAl y CXCR4 , evaluamos la expresión de CXCR4 en vector vacío y tumores de xenoinjerto que sobreexpresán HOXAl por medio de inmunohistoquímica . Congruente con el análisis RT2 Profiler, encontrados que la expresión de CXCR4 aumento notablemente en los tumores de xenoinjerto M115 -HOXAl y HMEL468 -HOXAl (Figura 16) . Estos datos son congruentes con un modelo en el que el| HOXAl da lugar a un aumento en la expresión de CXCR4 , que a su vez influye en los programas de señalización ?? tastásica iniciados por la sobreexpresion de HOXAl.

En resumen, un enfoque genómico funcional integrador ha permitido la identificación de determinantess de metástasis que son inductores activos de íhvas:ion y oncogenes de j uena fe. Estas determinantes de rtieitástasis descubiertas en el contexto del melanoma, demostiraron ser pronóstico en adenocarcinomas de mama en etapa temprana y mostraron expresión correlacionada con la progresión en diversos tipos de tumores no melanómicos. Estos descubrimientos aportan evidencia experimental dé que las determinantes de metástasis están presentes em algunos tumores primarios de etapa temprana y pueden programar esos tumores para comportarse de manera agresiva y por] lo tanto confieren un escaso resultado clínico. Ya que la njiayoría de estas determinantes no se han relacionado con cáncer o metástasis, podrían proporcionar una base para biomarcadores pronósticos de base funcional y nuevas rutas terapéuticas .

Cribado de Símbolos Gen invasión Ensayo de invasión Correlación Onc >mine del gen ID HMEL468 WM115 WM3211 Melanoma Cerebro Mama Próstata Pulmón ACP5 54 6.5X 2.1x Sin aumento ANLD 54443 2.6X - 2.6X ASF1B 55723 4.7X 2.0X 2.3X + + + + BRRN1 23397 3.5X 2.1X 4.0X + + + BUB1 699 3.1X - - + + CDC2 983 1.6X - - + + + CENP 79019 6.9X - - + + DEPDC1 55635 2.3X - - + + + ELTD1 64123 2.1X 5.0X Sin aumento + EXT1 2131 1.5X - - + + FSCN1 6624 2.4X 2.2X 1.8X + + HCAP-G 64151 1.5X - - + + + HMGB1 3146 3.4X - - + + + + HMGB2 3148 1.5X - - + + + H0XA1 3198 7.8X 6.1X ¦ 5.1X + + + HSF1 3297 2.8X 4.4X - + + + ITGB3BP 23421 4.2X - - + KIF20A 10112 1.5X - - + + + KIF2C 11004 1.6X - - + + + KNTC2 10403 2.4X 2.2X 3.5X + + MCM7 4176 9.4X - - + + + MTHFD2 10797 2.4X 2.5X - + + + NASP 4678 3.7X - - + + PLVAP 83483 1.5X - - + + PTP4A3 11156 1.9X - - + + + + RNF2 6045 2.9X 3.4X 5.7X + SPAG5 10615 3.7X 2.5X 3.1X + TGM2 7052 1.7X - - + + + UBE2C 11065 3.9X - - + + + + + UCHL5 51377 4.1X Sin aumento 1.9X VSIG4 11326 4.8X 2.1X 1.5X + Tabla 6. Descripción completa de los genes en el sistema biológico relac ¡ionado con Smad3 en la Figura 13A Gen Nombre Descripción F¡ imilia ID Akt Grupo Fosfatasa Grupo alcalina 250 ALPP Fosfatasa alcalina, placentaria (isozima Fosfatas Regan) 1052 CEBPD CCAAT/proteína activadora de unión Reguladí >r de (C/EBP), delta transcrip ;ión 1513 CTSK Catepsina K Peptidas 3 1893 ECM1 Proteína de matriz extracelular 1 Transpor tador 2047 EPHB1 Receptor B1 de EPH Cinasa 2065 ERBB3 Oncogen 3 viral de leucemia eritroblástica Cinasa v-erb-b2 Tabla 6 (continuación). Descripción completa de los genes en el siste ma biológico relacionado con Smad3 en la Figura 13A Fgf Grupo 9518 GDF15 Factor 15 de diferenciación de crecimiento Factor de crecimiento 2707 GJB3 Proteína de unión de tramo, beta 3, 31 Transp ?rtador kDa 3039 HBA1 Hemoglobina, alfa 1 Transp orlador 3040 HBA2 Hemoglobina, alfa 2 Transp orlador 8091 HMGA2 Grupo de alta movilidad AJ-hook 2 Otros Integrina Complí ijO 3910 LAMA4 Laminina, alfa 4 Enzimé 1 51 176 LEF1 Factor 1 activador de unión a linfoide Regula dor de transcr pción 4147 MATN2 Matrilina 2 Otros 4162 MCAM Molécula de adhesión a célula de Otros melanoma Mek1/2 Grupo 4286 MITF Factor de transcripción asociado a Regula dor de microftalmia transcr pción 2660 MSTN Miostatina Factor de crecimiento 4751 NEK2 Cinasa 2 relacionada con NIMA (gen a Cinasa nunca en gen mitosis) 56034 PDGFC Factor de crecimiento C derivado de Factor de crecimiento plaquetas 8613 PPAP2b Fosfatasa acida fosfatídica tipo 2B Fosfaté isa Rb Grupo 860 RUNX2 Factor de transcripción relacionado con Regula dor de runt transcr ipción 6285 S100B Proteína B de unión a calcio S100 Otros 4088 SMAD3 Miembro 3 de la familia SMAD Regulé dor de transcr ipción 6662 SOX9 SRY (región Y determinante sexual)-caja Regulé dor de 9 transcr ipción 10253 SPRY2 Homólogo 2 sprouty (Drosophila) Otros 81848 SPRY4 Homólogo 4 sprouty (Drosophila) Otros 6781 STC1 Estañocalcina 1 Cinasa 80328 ULBP2 Pin 2 de unión a UL16 Rece or transm embraná 9839 ZEB2 Caja homeótica 2 que se une a la caja E Regulé dor de de dedo de cinc transcr ipción Tabla 7. Asignación clase k-media de 295 casos publicados de cáncer de mama6 6 Supervivencia global Supervivencia sin metástasis Paciente ID Gr jpo k-media Tiempo Estado Tiempo Estado 4 12.9965777 Vivo 12.99658 sin metástasis 2 6 11.156742 Vivo 11.15674 sin metástasis 2 7 10.1382615 Vivo 10.13826 sin metástasis 2 8 8.80219028 Vivo 8.80219 sin metástasis 1 . 9 10.294319 Vivo 10.29432 sin metástasis 2 11 5.80424367 Vivo 5.804244 sin metástasis 1 12 7.85763176 Vivo 7.857632 sin metástasis 1 13 8.1670089 Vivo 8.167009 sin metástasis 1 14 8.23271732 Vivo 8.232717 sin metástasis 2 17 7.86584531 Vivo 7.865845 sin metástasis 2 26 6.9705681 Vivo 6.970568 sin metástasis 2 27 5.18548939 Vivo 5.185489 sin metástasis 2 28 6.24503765 Vivo 6.245038 sin metástasis 2 29 1 1.3894593 Vivo 1 .38946 sin metástasis 2 36 10.1081451 Vivo 10.10815 sin metástasis 2 38 7.35386721 Vivo 7.353867 sin metástasis 2 39 11.0171 1 16 Vivo 11.01711 sin metástasis 2 45 4.7315 Vivo 1.089665 metástasis 1 48 2.1726 Muerto 1.026694 metástasis 1 51 9.526 Muerto 4.906229 metástasis 2 56 8.4658 Muerto 4.695414 metástasis 2 57 5.1508 Muerto 2.297057 metástasis 1 58 5.3562 Muerto 1.122519 metástasis 1 59 4.9946 Vivo 4.629706 metástasis 1 7.9288 Muerto 4.892539 metástasis 2 4.1178 Vivo 2.680356 metástasis 2 2.7096 Muerto 0.807666 metástasis 1 2.6083 Muerto 1.982204 metástasis 1 5.5041 Muerto 3.028063 metástasis 1 2.6192 Muerto 2.149213 metástasis 2 2.2905 Muerto 2.209446 metástasis 1 3.737 Muerto 2.12731 metástasis 2 5.77960301 Muerto 4.952772 metástasis 1 3.45516769 Muerto 2.543463 metástasis 1 3.225188 Vivo 3.195072 metástasis 1 2.310746 Vivo 2.168378 metástasis 1 3.25256674 Muerto 1.270363 metástasis 3.24161533 Muerto 0.996578 metástasis 2 5.30321698 Vivo 5.303217 sin metástasis 2 5.23203285 Vivo 5.232033 sin metástasis 2 10.0971937 Vivo 10.09719 sin metástasis 2 14.8172485 Vivo 14.81725 sin metástasis 2 14.2614648 Vivo 14.26146 sin metástasis 2 6.64476386 Vivo 6.644764 sin metástasis 2 7.7481 1773 Vivo 7.7481 18 sin metástasis 2 6.4366872 Vivo 6.31896 metástasis 1 5.03764545 Vivo 4.66256 metástasis 1 8.73921971 Vivo 8.73922 sin metástasis 1 7.56741958 Vivo 7.56742 sin metástasis 2 7.29637235 Vivo 7.296372 sin metástasis 1 4.66255989 Muerto 4.66256 sin metástasis 1 132 6.71868583 Vi o 6.718686 sin metástasis 1 133 8.64887064 Vivo 8.648871 sin metástasis 2 134 7.09377139 Muerto 6.995209 metástasis 2 135 9.33059548 Vivo 9.330595 sin metástasis 1 136 3.8220397 Muerto 3.438741 metástasis 1 137 15.3292266 Vivo 15.32923 sin metástasis 2 138 3.84941821 Muerto 3.474333 metástasis 2 139 12.7665982 Vivo 12.7666 sin metástasis 1 140 5.55509925 Vivo 5.555099 sin metástasis 2 141 2.06433949 Muerto 1.40178 metástasis 1 142 15.1348392 Vivo 15.13484 sin metástasis 2 144 14.1273101 Vivo 14.12731 sin metástasis 1 145 5.48665298 Vivo 5.486653 sin metástasis 2 146 9.40725531 Muerto 3.655031 metástasis 2 147 2.70773443 Muerto 1.609856 metástasis 1 148 18.3408624 Vivo 18.34086 sin metástasis 2 149 17.2402464 Vivo 17.24025 sin metástasis 1 150 1.48665298 Muerto 0.960986 metástasis 1 151 17.5742642 Vivo 14.01232 metástasis 2 153 3.03627652 Muerto 1.177276 metástasis 1 154 15.1047228 Vivo 15.10472 sin metástasis 2 155 1.84804928 Muerto 0.930869 metástasis 2 156 17.6591376 Vivo 17.65914 sin metástasis 2 157 7.87405886 Vivo 7.874059 sin metástasis 2 158 3.90691307 Muerto 2.811773 metástasis 1 159 5.41546886 Muerto 4.44627 metástasis 1 160 16.1478439 Vivo 16.14784 sin metástasis 2 161 13.4045175 Muerto 8.128679 metástasis 2 162 15.3127995 Vivo 15.3128 sin metástasis 1 163 15.8193019 Vivo 15.8193 sin metástasis 1 164 5.66461328 Vivo 5.664613 sin metástasis 1 165 1 1.0171116 Muerto 10.44216 metástasis 1 166 3.62217659 Muerto 1.612594 metástasis 1 167 15.3237509 Vivo 15.32375 sin metástasis 2 169 14.8856947 Vivo 14.88569 sin metástasis 1 170 13.3497604 Vivo 13.34976 sin metástasis 2 172 1.63449692 Muerto 1.38809 metástasis 1 : 174 13.7494867 Vivo 13.74949 sin metástasis 1 175 7.67419576 Muerto 7.594798 metástasis 1 8176 12.5722108 Vivo 12.57221 sin metástasis 2 177 9.71 115674 Muerto 8.925394 metástasis 1 178 13.174538 Vivo 13.17454 sin metástasis 2 179 12.7638604 Vivo 12.76386 sin metástasis 1 180 5.28678987 Muerto 2.614648 metástasis 1 181 1 1.8001369 Vivo 11.80014 ' sin metástasis 1 182 1 1.3182752 Vivo 11.31828 sin metástasis 2 183 11.8603696 Vivo 11.86037 sin metástasis 2 184 4.40520192 Muerto 1.21013 metástasis 1 185 7.33470226 Muerto 7.334702 sin metástasis 2 186 11.7399042 Muerto 11.7399 sin metástasis 1 187 12.5037645 Vivo 12.50376 sin metástasis 2 188 1 1.2635181 Vivo 11.26352 sin metástasis 2 189 12.073922 Vivo 12.07392 sin metástasis 1 190 11.9233402 Vivo 11.92334 sin metástasis 2 191 12.7364819 Vivo 12.73.648 sin metástasis 2 192 6.29705681 Muerto 2.696783 metástasis 1 193 1 .832991 1 Vivo 11.83299 sin metástasis 2 194 13.0677618 Vivo 12.46543 metástasis 2 195 11.5455168 Vivo 11.54552 sin metástasis 1 196 11.1950719 Vivo 11.19507 sin metástasis 2 197 11.0472279 Vivo 11.04723 sin metástasis 2 198 11.1430527 Vivo 11.14305 sin metástasis 2 199 10.9075975 Vivo 10.9076 sin metástasis 1 200 10.7679672 Vivo 10.76797 sin metástasis 2 201 11.2005476 Vivo 11.20055 sin metástasis 2 , 202 4.84599589 Muerto 3.378445 metástasis 1 203 11.0362765 Vivo 11.03628 sin metástasis 1 205 10.1382615 Vivo 10.13826 sin metástasis 1 207 9.65366188 Vivo 9.653662 sin metástasis 2 208 10.6748802 Vivo 10.67488 sin metástasis 1 209 , 11.4414784 Vivo 6.565366 metástasis 2 210 11.2032854 Vivo 1 1.20329 sin metástasis 1 212 12.1451061 Muerto 12.1451 1 sin metástasis 1 213 3.24709103 Muerto 1.97399 metástasis 1 214 10.45859 Vivo 7.477071 metástasis 2 215 10.3518138 Vivo 10.35181 sin metástasis 1 217 1.94661 191 Muerto 1.716632 metástasis 1 218 2.94592745 Muerto 2.340862 metástasis 1 : 219 9.83162218 Vivo 9.831622 sin metástasis 2 220 10.3271732 Vivo 10.32717 sin metástasis 2 221 10.3764545 Vivo 10.37645 sin metástasis 2 222 3.30732375 Muerto 2.253251 metástasis 1 224 10.0205339 Vivo 10.02053 sin metástasis 1 226 8.79123888 Vivo 8.791239 sin metástasis 1 227 7.21423682 Muerto 3.356605 metástasis 1 228 1.43463381 Muerto 1.223819 metástasis 1 229 2.85831622 Muerto 1.61807 metástasis 2 230 0.71 184121 Muerto 0.271047 metástasis 1 231 11.156742 Vivo 3.581 109 metástasis 2 233 14.1218344 Vivo 14.12183 sin metástasis 2 235 6.51608487 Vivo 6.516085 sin metástasis 2 236 2.48323066 Vivo 2.483231 sin metástasis 1 ; 237 1.31690623 Muerto 1.152635 metástasis 1 238 2.15195072 Muerto 1.84531 1 metástasis 1 239 8.09308693 Vivo 8.093087 sin metástasis 2 240 6.97330596 Vivo 4.095825 metástasis 1 241 2.13278576 Muerto 2.004107 metástasis 1 243 9.98220397 Vivo 9.982204 sin metástasis 2 245 11.5455168 Vivo 11.54552 sin metástasis 1 246 11.449692 Vivo 1 1.44969 sin metástasis 2 247 5.63723477 Vivo 5.637235 sin metástasis 1 248 4.93360712 Vivo 4.933607 sin metástasis 1 249 5.31690623 Vivo 5.316906 sin metástasis 1 250 11.3648186 Vivo 11.36482 sin metástasis 2 251 9.40725531 Vivo 9.407255 sin metástasis 1 252 9.91649555 Vivo 9.122519 metástasis 1 254 4.66803559 Muerto 4.588638 metástasis 1 256 9.50581793 Vivo 8.988364 metástasis 2 257 2.58726899 Muerto 2.297057 metástasis 2 258 5.35249829 Muerto 5.117043 metástasis 1 259 8.96372348 Vivo 5.516769 metástasis 2 260 8.81314168 Vivo 8.303901 metástasis 2 261 8.59411362 Vivo 8.594114 sin metástasis 2 , 263 4.5284052 Muerto 2.223135 metástasis 1 264 7.25256674 Vivo 7.252567 sin metástasis 2 265 6.78986995 Vivo 6.78987 sin metástasis 1 266 7.01 163587 Vivo 7.01 1636 sin metástasis 1 267 6.92950034 Vivo 6.9295 sin metástasis 1 268 7.08829569 Vivo 7.088296 sin metástasis 1 269 1.35249829 Muerto 0.936328 metástasis 1 270 2.96235455 Muerto 2.962355 sin metástasis 1 271 7.02258727 Vivo 7.022587 sin metástasis 2 272 7.25256674 Vivo 7.252567 sin metástasis 2 273 6.99794661 Vivo 6.997947 sin metástasis 1 274 5.9247091 Vivo 5.924709 sin metástasis 2 275 0.05475702 Vivo 0.054757 sin metástasis 2 276 1.07323751 Muerto 0.648871 metástasis 1 ¦ 277 5.11430527 Vivo 5.114305 sin metástasis 2 278 5.31143053 Vivo 5.311431 sin metástasis 2 280 5.29226557 Vivo 5.292266 sin metástasis 2 281 7.34017796 Vivo 7.340178 sin metástasis 2 282 5.74401095 Vivo 5.744011 sin metástasis 2 283 5.32511978 Vivo 5.32512 sin metástasis 1 284 5.32238193 Muerto 3.915127 metástasis 1 1 285 5.77138946 Vivo 5.771389 sin metástasis 2 286 4.94455852 Vivo 4.944559 sin metástasis 1 287 6.06707734 Vivo 6.067079 sin metástasis 2 288 1.86721424 Muerto 0.353183 metástasis 1 290 4.97193703 Vivo 4.971937 sin metástasis 2 291 1 1.652293 Vivo 11.65229 sin metástasis 1 292 8.36687201 Vivo 8.366872 sin metástasis 2 293 6.31348392 Vivo 6.313484 sin metástasis 1 294 6.14373717 Vivo 6.143737 sin metástasis 1 295 5.55509925 Vivo 5.555099 sin metástasis 2 296 5.08692676 Vivo 5.086927 sin metástasis 1 297 9.59616701 Vivo 9.596167 sin metástasis 2 298 9.45653662 Vivo 9.456537 sin metástasis 2 300 3.78370979 Muerto 2.852841 metástasis 1 301 9.33059548 Vivo 9.330595 sin metástasis 2 302 1.78234086 Vivo 1.782341 sin metástasis 1 303 9.19370294 Vivo 9.193703 sin metástasis 2 304 9.67008898 Vivo 6.710472 metástasis 2 305 9.54962355 Vivo 9.549624 sin metástasis 2 306 10.201232 Vi o 10.20123 sin metástasis 2 307 2.80629706 Muerto 1.965777 metástasis 1 308 9.32238193 Vivo 9.322382 sin metástasis 1 309 9.31416838 Vivo 8.561259 metástasis 2 310 9.09787817 Vivo 9.097878 sin metástasis 1 311 4.54757016 Muerto 4.219028 metástasis 1 312 9.10335387 Vivo 9.103354 sin metástasis 2 313 9.03216975 Vivo 6.056126 metástasis 2 314 5.05954826 Muerto 3.219713 metástasis 1 315 8.24093087 Vivo 8.240931 sin metástasis 2 317 5.60438056 Muerto 2.138261 metástasis 2 318 2.43394935 Vivo 2.335387 metástasis 2 319 6.4996577-7 Muerto 6.370979 metástasis 1 320 . 9.89459275 Vivo 9.894593 sin metástasis 1 321 1.78507871 Vivo 1.500342 metástasis 2 322 6.70499658 Vivo 6.704997 sin metástasis 1 323 8.80219028 Vivo 8.80219 sin metástasis 2 324 8.85968515 Vivo 8.859685 sin metástasis 1 325 8.85420945 Vivo 8.854209 sin metástasis 2 326 8.29842574 Vivo 8.298426 sin metástasis 1 327 6.09445585 Vivo 4.621492 metástasis 1 328 5.57700205 Vivo 5.577002 sin metástasis 2 329 5.80424367 Vivo 5.804244 sin metástasis 1 330 5.19917865 Vivo 5.199179 sin metástasis 1 331 2.50787132 Muerto 2.157426 metástasis 1 332 7.99178645 Vivo 7.991786 sin metástasis 1 333 8.49555099 Vivo 8.495551 sin metástasis 1 334 7.69336071 Vivo 7.693361 sin metástasis 2 335 7.4770705 Vivo 7.477071 sin metástasis 1 336 7.40862423 Vivo 7.408624 sin metástasis 2 337 6.81998631 Vivo 6.819986 sin metástasis 1 338 6.34360027 Vivo 6.3436 sin metástasis 1 339 16.5913758 Vivo 16.59138 sin metástasis 1 340 5.85900068 Muerto 3.12115 metástasis 1 341 2.36276523 Muerto 1.73306 metástasis 1 342 15.3511294 Vivo 15.35113 sin metástasis 2 343 6.6091718 Vivo 6.609172 sin metástasis 2 ! 344 6.87474333 Vivo 6.874743 sin metástasis 1 345 6.99520876 Vivo 6.995209 sin metástasis 2 346 7.121 1499 Vivo 7.121 15 sin metástasis 2 347 4.72005476 Vivo 4.720055 sin metástasis 2 348 6.17111567 Vivo 6.171116 sin metástasis 2 349 6.46406571 Vivo 6.464066 sin metástasis 1 ; 350 3.28542095 Vivo 3.285421 sin metástasis 1 i I 351 6.52703628 Vivo 6.527036 sin metástasis 1 352 5.80971937 Vivo 5.809719 sin metástasis 2 353 6.55167693 Vivo 6.551677 sin metástasis 1 354 6.16016427 Vivo 6.160164 sin metástasis 2 355 6.04517454 Vivo 6.045175 sin metástasis 2 356 6.21492129 Vivo 6.214921 sin metástasis 2 357 5.82340862 Vivo 5.823409 sin metástasis 2 358 6.23956194 Vivo 6.239562 sin metástasis 2 359 6.01779603 Vivo 6.017796 sin metástasis 2 360 5.54962355 Vivo 5.549624 sin metástasis 2 361 5.34702259 Vivo 5.347023 sin metástasis 2 362 5.25941 136 Vivo 5.259411 sin metástasis 1 : 363 6.00958248 Vivo 4.971937 metástasis 1 364 18.0807666 Vivo 18.08077 sin metástasis 1 365 17.486653 Vivo 17.48665 sin metástasis 2 366 17.1526352 Vivo 17.15264 sin metástasis 2 367 0.97467488 Muerto 0.572211 metástasis 1 I 368 16.8706366 Vivo 9.568789 metástasis 2 369 6.57084189 Muerto 3.258042 metástasis 2 ; 370 14.3600274 Muerto 9.998631 metástasis 2 371 2.40657084 Muerto 1.968515 metástasis 2 373 7.77275839 Vivo 7.772758 sin metástasis 2 374 5.75496236 Muerto 2.680356 metástasis 1 375 17.4209446 Vivo 17.42094 sin metástasis 1 377 9.53045859 Muerto 8.528405 metástasis 1 378 13.9192334 Vivo 13.91923 sin metástasis 1 379 13.8644764 Vivo 13.86448 sin metástasis 1 380 12.7392197 Vivo 12.73922 sin metástasis 2 381 12.2600958 Vivo 12.2601 sin metástasis 2 383 11.08282 Vivo 11.08282 sin metástasis 2 385 2.88843258 Muerto 1.946612 metástasis 1 387 8.21355236 Vivo 8.213552 sin metástasis 2 388 7.22518823 Vivo 7.225188 sin metástasis 2 389 4.94729637 Muerto 3.419576 metástasis 1 390 6.80355921 Vivo 6.803559 sin metástasis 2 391 6.02053388 Vivo 6.020534 sin metástasis 2 392 6.17111567 Vivo 6.171116 sin metástasis 1 393 5.5742642 Vivo 5.574264 sin metástasis 1 394 5.70841889 Vivo 5.708419 sin metástasis 2 395 15.0773443 Vivo 11.21 15 metástasis 2 396 10.2313484 Vivo 10.23135 sin metástasis 1 397 8.77207392 Muerto 4.766598 metástasis 2 398 8.42436687 Vivo 8.424367 sin metástasis 1 401 10.0314853 Vivo 1.527721 metástasis 1 402 7.37850787 Vivo 7.378508 sin metástasis 1 403 6.75427789 Vivo 6.754278 sin metástasis 2 404 7.57015743 Vivo 7.570157 sin metástasis 2 REFERENCIAS 1. 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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método con un nivel predeterninadó de previsibilidad para evaluar el riesgo de desarrollar un tumor metastásico en un individuo, que consiste en: a. medir el nivel de dos o más DETERMINANTES seleccionadas ' a partir del grupo formado | por las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271, en una muestra proveniente del individulo, y b. medir una alteración ciánicamente significativa en el nivel de dos o más DETERMINANTES n la muestra, en donde la alteración indica un aumeijito en el riesgo de desarrollar un tumor metastásico en el individuo. El método según la reivindicación 1, que además consiste en medir una cantidad eficaz de una o mas DETERMINANTES seleccionadas a partir del grupo formado por las DETERMINANTES 26-40, 42-60, 64, 65, 67-73, "/5-95, 97, 98, 100-102, 104-125, 127-134, 136, 139-176, 178-|l89, 191-209, 211, 213-216, 219-226, 228-238, 240-260, 262-J-270, 272-360. 3. El método según las reivindicacionjes 1 ó 2, que además consiste en medir al menos un parámetro estándar asociado con el tumor. 4. El método según la reivindicacibn 1, en donde el nivel de una DETERMINANTE se mide por DETERMINANTES con un valor de referencia. 11. El método según la reivindicación 10, en donde el valor de referencia es un valor índice. 12. Un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para evaluar la progresión de un túmor en un individuo, que consiste en: a. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES seleccionadas a partir del grupo formado por las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96,| 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271, en una primera muestra proveniente del individuo en un primer periodo de tiempo,- b. detectar el nivel de las do o más DETERMINANTES en una segunda muestra del individuo en un segundo periodo de tiempo; c. comparar el nivel de las dofe o más DETERMINANTES detectadas en el paso (a) con la cantidad detectada en la etapa (b) con un valor de referencia. 13. El método según la reivindicacic Qn 12, en donde la primera muestra se extrae del individúe antes de recibir tratamiento para el tumor. 14. El método según la reivindicací|ón 2 , en donde la segunda muestra se extrae del individuo después de recibir tratamiento para el tumor. 15. Un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para monitorear la eficacia del tratamiento de un tumor metastásico, que consiste en: a. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES seleccionadas a partir del grupo formado por las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271, en una primera muestra extraída del individuo en un primer periodo de tiempo; b. detectar el nivel de dos o más DETERMINANTES en una segunda muestra extraída del individuo en ?. segundo periodo de tiempo; c. comparar el nivel de las dos o mas DETERMINANTES detectadas en el paso (a) con la cantidad detectada en el paso (b) o con un valor de refereneia, en donde la eficacia del tratamiento se monitore . por un cambio en el nivel de dos o más DETERMINANTES del individuo. 16. El método según la reivindicaci .óñ en donde el individuo previamente ha recibido tratamzuent el tumor metastásico. 17. El método según la reivindicaci -óíi 15 , en donde la primera muestra se extrae del individuo antes de recibir tratamiento para el tumor metastásico. 18. El método según la reivindicaci .on 15; en donde la segunda muestra se extrae del individuo después de recibir tratamiento para el tumor metastásico 19. Un método con un nivel predeterminado de previsibilidad para seleccionar un régimen de tratamiento para un individuo a quien se ha diagnosticado un tumor, que consiste en a. detectar el nivel de una cantidad eficaz de dos o más DETERMINANTES seleccionadas a partir del grupo formado por las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271, en una primeria muestra extraída del individuo en un primer periodo de tiempo; b. opcionalmente, detectar el nivel de una cantidad eficaz de dos o más DETERMINANTES en una segunda muestra extraída del individuo en un segundo periodo de tiempo; c. comparar el nivel de las do o más DETERMINANTES detectadas en el paso (a) con un| valor de referencia u opcionalmente con la cantidad detectada en el paso (b) . 20. El método según la reivindicación 19, en donde el individuo previamente ha recibido tratamiento para el tumor. 21. El método según la reivindicación 19, en donde la primera muestra se extrae del individuj» antes de recibir tratamiento para el tumor 22. El método según la reivindicación 19, en donde la segunda muestra se extrae del individuo después de recibir tratamiento para el tumor. 23. Un perfil de expresión de referencia para tumor metastásico, que comprende un patrón de niveles de marcadores de una cantidad eficaz de dos o más marcadores seleccionados a partir del grupo formado por las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271. 24. Un estuche que comprende una pluralidad de reactivos de detección de DETERMINANTES que detectan las correspondientes DETERMINANTES seleccionados a partir del grupo formado por las DETERMINANTES 1 a 25, 41, 61, 62, 63, 66, 74, 96, 99, 103, 126, 135, 137, 138, 177, 190, 210, 212, 217, 218, 227, 239, 261 y 271, suficiente para generar el perfil según la reivindicación 20. 25. El estuche según la reivindicación 24, en donde el reactivo de detección comprende uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos. 26. El estuche según la reivindicación 24, en donde el reactivo de detección comprende uno o más oligonucleótidos . 27. El estuche según la reivindicación 24, en donde el reactivo de detección comprende uno o más aptámeros . 28. Un medio susceptible de leerse en medios automáticos, que contiene uno o más perfiles de expresión de referencia para tumor metastásico, según la reivindicación 23, y opcionalmente , resultados de prueba adicionales e información del individuo. 29. Un panel de DETERMINANTES que comprende una o más DETERMINANTES que son indicativas de una ruta fisiológica o bioquímica asociada con metástasis. 30. El panel según la reivindicación 29, en donde la ruta fisiológica o bioquímica comprende migración celular, angiogénesis , degradación de la matriz extracelular o anoikis. 31. Un panel de DETERMINANTES que comprende una o más DETERMINANTES que son indicativas de la progresión de un tumor . 32. Un método para identificar un biomarcador que es pronóstico para una enfermedad, que consiste en: a) identificar uno o más genes que se expresan diferencialmente en la enfermedad en comparación con un control, para producir una lista de genes objetivo; y b) identificar uno o más genes en la lista objetivo que estén asociados con un aspecto funcional de la progresión de la enfermedad; y así identificar un biomarcador que sea pronóstico de la enfermedad. 33. El método según la reivindicación 32, que también comprende el paso que consiste en: identificar uno o más genes en la lista de genes objetivo, que comprende un cambio evolutivamente conservado para producir una segunda lista de genes objetivo. 34. El método según la reivindicación 32, en donde la enfermedad es cáncer. 35. El método según la reivindicación 34, en donde el cáncer es cáncer metastásico. 36. El método según la reivindicación 32, en donde el aspecto funcional es la migración celular, angiogénesis , degradación de la matriz extracelular o anoikis . 37. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE, que consiste en: (a) proporcionar una célula que exprese la DETERMINANTE ; (b) poner en contacto la célula con una composición que comprende un compuesto candidato; y (c) determinar si la sustancia altera la expresión o actividad de la DETERMINANTE; en donde, si la alteración observada en presencia del compuesto no se observa cuando la célula entra en contacto con una composición que carece del compuesto, el compuesto identificado modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE. 38. El método según la reivindicación 37, en donde la célula entra en contacto i vivo, ex vivo o in vitro. 39. Un método para tratar un cáncer en un individuo, que consiste en administrarle al individuo un compuesto que modula la actividad o expresión de una DETERMINANTE. 40. Un método para tratar un cáncer en un individuo, que consiste en administrarle al individuo un agente que modula la actividad o expresión de un compuesto que es modulado por una DETERMINANTE. 41. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto es TGF o CXCR4. 42. El método según la reivindicación 41, en dond el agente es un inhibidor de TGF O un inhibidor de CXCR4. 43. Un método para tratar un paciente con un tumor, que consiste en: identificar un paciente con un tumor, en donde dos o más de las DETERMINANTES 1-360 están alteradas de una forma clínicamente significativa según se mide en una muestra del tumor, y tratar al paciente con un régimen terapéutico que previene o reduce la metástasis del tumor. 44. Un método para seleccionar un paciente con tumor que necesita de un tratamiento complementario, que consiste en: evaluar el riesgo de metástasis en el paciente por la medición de dos o más de las DETERMINANTES 1-360, en donde la alteración clínicamente significativa de las dos o más DETERMINANTES en una muestra de tumor proveniente del paciente indica que el paciente necesita el tratamiento complementario. 45. Un método de información para decisión de tratamiento en un paciente portador de un tumor, que consiste en: obtener información sobre dos o más de las DETERMINANTES 1-360 en una muestra de tumor proveniente del paciente, y seleccionar un régimen de tratamiento que prevenga o reduzca la metástasis del tumor en el paciente si las dos o más DETERMINANTES están alteradas de manera clínicamente significativa.