KR101890391B1 - Ｎｋｘ３―２를 포함하는 난소암의 진단을 위한 마커 및 조성물 - Google Patents

Ｎｋｘ３―２를 포함하는 난소암의 진단을 위한 마커 및 조성물 Download PDF

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Abstract

난소암의 예후 또는 난소암의 재발의 위험성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법 및 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 조성물 및 이를 위한 물질을 스크리닝 하는 방법에 의하면 난소암의 예후 또는 재발을 효율적으로 진단하고, 이를 난소암을 치료 또는 난소암 재발을 예방할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있다.

Description

ＮＫＸ３―２를 포함하는 난소암의 진단을 위한 마커 및 조성물{A composition, and marker for diagnosing ovarian cancer comprising NKX3-2}
난소암의 예후 또는 난소암의 재발의 위험성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법 및 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 조성물 및 이를 위한 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
난소 암종(ovarian carcinoma)는 여성 암 중 가장 높은 치사율을 나타내는 암이다. 이러한 높은 치사율은 난소 암종의 화학 내성(chemoresistance) 및 빈번한 재발로 인한 것이다. 난소 암종을 예방 또는 치료하기 위한 여러 제제가 개발되어 왔으나, 난소 암종은 여전히 높은 재발율 및 치사율을 가지고 있다.
최근들어 종양 내 적은 수로 존재하지만 높은 암 유발 능력을 지닌 암 줄기 세포(cancer ctem cell:CSC)에 대한 관심도가 높아지고 있다. CSC는 회전 타원체 형성 분석으로 난소 혈청 암종(ovarian serous carcinoma: OSC)으로부터 최초로 분리되었으며, 이들이 암의 재발 및 화학 내성에 대한 주요 원인 중 하나일 것으로 추측되고 있다. 그러나 아직까지 난소 CSC를 줄이고, 난소암의 높은 재발율 및 치사율을 줄이기 위한 효과적인 전략은 개발되지 않고 있다.
일 양상은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위한 방법을 제공한다.
다른 양상은 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 다른 양상은 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 및 PDK4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.
구세코이드 호메오박스(goosecoid homeobox: GSC) 유전자는 NCBI Accession No: NM_173849.2의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. VAV3 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(vav 3 guanine nucleotide exchange factor: VAV3) 유전자는 NCBI Accession No: NM_006113.4 또는 NM_001079874.1의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 포크머리 상자 A2(forkhead box A2: FOXA2) 유전자는 NCBI Accession No: NM_021784.4 또는 NM_153675.2의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 림프성 인핸서-결합 인자1(lymphoid enhancer-binding factor 1: LEF1) 유전자는 NCBI Accession No: NM_016269.4, NM_001166119.1, NM_001130714.2 또는 NM_001130713.2의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 연골 올리고머 기질 단백질(cartilage oligomeric matrix protein: COMP) 유전자는 NCBI Accession No: NM_000095.2의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 아주로시딘1(azurocidin 1: AZU1) 유전자는 NCBI Accession No: NM_001700.4의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 글루타메이트 수용체, 이온성 수용기, N-메틸-D-아스파테이트 2A(glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2A: GRIN2A) 유전자는 NCBI Accession No: NM_001134408.2, NM_000833.4 또는 NM_001134407.2의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 인터류킨 17F(interleukin 17F: IL17F) 유전자는 NCBI Accession No: NM_052872.3의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. CD86 분자(CD86 molecule: CD86) 유전자는 NCBI Accession No: NM_001206925.1, NM_001206924.1, NM_176892.1, NM_175862.4 또는 NM_006889.4의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 펩티드 YY(peptide YY: PYY) 유전자는 NCBI Accession No: NM_004160.4의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. c-fos-유도 성장 인자(혈관 내피 성장 인자 D)(c-fos induced growth factor(vascular endothelial growth factor D): FIGF) 유전자는 NCBI Accession No: NM_004469.4의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. NK3 호메오박스 2(NK3 homeobox 2: NKX3-2) 유전자는 NCBI Accession No: NM_001189.3의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 무날개형 MMRV 통합 부위 패밀리, 멤버 3A(wingless-type MMTV integration site family member 3A: WNT3A) 유전자는 NCBI Accession No: NM_033131.3의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다. 피루베이트 데히드로제나제 키나제, 이소자임4(pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4: PDK4) 유전자는 NCBI Accession No: NM_002612.3의 mRNA 서열을 갖는 것일 수 있다.
GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 발현의 증가 또는 감소는 난소암의 예후 또는 난소암 재발과 연관성이 있는 것으로 본 발명자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서, GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 발현 수준은 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 있어서, GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질은 천연적으로 존재하는 야생형 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 및 그의 기능적 변이체를 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 본 명세서에 있어서, GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자는 천연적으로 존재하는 야생형 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 코딩하는 유전자 및 그의 기능적 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로 해석된다.
상기 발현 수준은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 상기 발현 수준은 mRNA 또는 단백질 단계에서의 발현 수준인 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 mRNA의 양, 단백질의 양, 또는 그 조합을 측정하기 위한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제제는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 물질인 것일 수 있다. 상기 제제는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4의 유전자의 mRNA 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열; 또는 그 조합일 수 있다. 상기 제제는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 이들의 안티센스 서열; 또는 그 조합일 수 있다.
상기 프라이머는 중합효소에 의한 중합 반응에서 중합 개시점을 제공하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 사용되는 것일 수 있다. 용어 "증폭(amplification)"은 표적 서열 또는 그의 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것을 나타낸다. 상기 핵산 증폭 반응은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 핵산의 증폭은, 증폭 동안 복수의 사이클을 필요로 하는 방법 또는 단일 온도에서 수행되는 방법을 포함한다. 순환 방법(cycling techniques)의 예는 열 순환을 필요로 하는 방법을 포함한다. 열 순환을 필요로 하는 방법은 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 포함한다. PCR은 당업계에 알려져 있다. PCR은 보통 열변성에 의하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA으로 변성시키는 단계, 프라이머를 상기 단일가닥 DNA에 어닐링하는 단계; 및 상기 프라이머로부터 상보적 가닥을 합성하는 단계를 포함한다. 등온 증폭 방법은 단일 온도 또는 증폭 과정의 주요 양상이 단일 온도에서 수행되는 방법이다. 이중가닥을 분리하기 위하여 반응 산물을 가열하여 추가적 프라이머가 결합할 수 있도록 하는 PCR과는 대조적으로, 등온 방법은 이중가닥을 분리하고 주형을 재카피하기 위하여 가닥 치환 폴리머라제(strand displacing polymerase)에 의존한다. 등온 방법은 반복 주형 카피(reiterative template copying)를 개시하기 위하여 프라이머의 치환에 의존하는 방법과 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법으로 구분할 수 있다. 프라이머의 치환에 의존하는 방법은 헬리카제 의존적 증폭(helicase dependant amplification: HDA), 엑소뉴클레아제 의존적 증폭(exonuclease dependant amplification), 리콤비나제 중합효소증폭(recombinase polymerase amplification: RPA) 및 루프 매개된 증폭(loop mediated amplification: LAMP)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 단일 프라이머 분자의 연속된 재사용 또는 신규 합성에 의존하는 방법은 가닥치환증폭 (strand displacement amplification: SDA) 및 핵산 기반 증폭(nucleic acid based amplification : NASBA 및 TMA)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함한다. 상기 프라이머는 선택되는 증폭 방법에 따라 하나, 또는 2이상의 세트로 포함될 수 있다. 상기 프라이머는 PCR용 프라이머일 수 있다.
mRNA 발현 수준 측정은 난소암의 예후 또는 난소암 재발 위험을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 개체의 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 및 PDK4 유전자의 mRNA의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서 mRNA 양의 측정일 수 있다. 이는 mRNA를 직접 분리하거나, 상기 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하는 것으로 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이 또는 그 조합을 이용하는 것을 포함할 수 있다. RT-PCR은 RNA를 분석하는 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하는 방법이다. 상기 RT-PCR 중 증폭 단계에서 상기 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 상기 유전자의 mRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 대조군과 비교함으로써, 개체의 난소암의 예후 또는 재발의 위험성을 간편하게 판단할 수 있다. 상기 대조군은 난소암에 걸리지 않거나 또는 완치된 개체의 시료로부터 얻은 정상 대조군 또는 음성 대조군일 수 있다. 상기 대조군은 또한 난소암에 걸려 있거나, 난소암이 재발한 개체의 시료로부터 얻은 양성 대조군일 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "프라이머(primer)"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들면 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 확인할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "프로브(probe)"란 표적 핵산 예를 들면, mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링(labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 mRNA와 상보적인 핵산 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 확인할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.
상기 제제는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 단백질인 것일 수 있다. 상기 펩티드 또는 단백질은 항체, 리간드, 수용체, 작용제(agonist), 길항체(antagonist), 또는 이들의 단편; 또는 그 조합일 수 있다.
단백질 발현수준 측정은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정일 수 있다. 이는 예를 들면 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 직접 분리하거나, GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 확인하는 것일 수 있다. 이를 위한 분석방법은 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 또는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA를 포함할 수 있다. 또한 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있고, 상기 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 확인할 수 있다.
또한, 예를 들면 상기 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 이용할 수 있다. 상기 웨스턴 블롯 분석은 샘플에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동을 하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 그 후 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 상기 단백질의 양을 확인하여, 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 확인할 수 있다.
상기 검출 방법은 난소암에 걸리지 않았거나 또는 완치되고, 다른 조작을 가하지 않은 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현량과 생물학적 샘플에서의 상기 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어질 수 있고, mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4의 단백질 단편은 예를 들면 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단편은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프 (epitope)를 가지고 있는 단백질 단편을 의미한다. GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자를 발현벡터에 클로닝하고 그 유전자에 의해 코딩되는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 수득하고, 수득된 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다.
상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 재조합 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 아주반트(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.
단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 약 10 ㎍의 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다. 또한 단일클론 항체는 상업적으로 판매되는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질에 대한 항체를 입수하여 사용할 수 있다.
이러한 항체들을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역 측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯팅 또는 면역 블롯팅 등의 방법에 의해 생물학적 샘플 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인할 수 있다.
용어 "단편"은 예를 들면 온전한 항체, 펩티드 또는 단백질의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위 또는 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 단편은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv일 수 있다. 상기 결합 단편은 최소한 7개 이상의 아미노산, 예를 들면 9 개 이상의 아미노산, 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 발현 수준은 개체로부터 분리된 시료 중의 발현 수준일 수 있다. 상기 시료는 난소로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 개체는 인간, 영장류, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 토끼, 쥐 등을 포함하는 포유 동물을 포함할 수 있다.
다른 양상은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 및 PDK4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 예를 들면 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현량을 측정할 수 있는, 마이크로어레이일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 키트가 예를 들면 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한 상기 키트는 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 버퍼, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 또는 유리 슬라이드글라스가 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, 또는 RITC가 사용될 수 있다. 발색 기질은 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), 또는 TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체로부터 분리된 시료와 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA로부터 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 물질을 접촉시켜 이들의 복합체를 형성시키는 단계; 상기 복합체의 수준을 측정하여 상기 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 발현 수준이 대조군의 발현 수준과 비교하여 변화한 경우, 개체의 난소암의 예후가 불량한 것 또는 난소암 재발의 위험이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 시료를 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질과 접촉시켜 이들의 복합체를 형성시키는 단계를 포함한다.
상기 발현 수준은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 단백질 단계에서의 발현 수준일 수 있다. 따라서, 상기 측정은 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 mRNA의 양, 단백질의 양 또는 그 조합을 측정하는 것으로 수행할 수 있다.
상기 방법은 또한 상기 복합체의 수준을 측정하여 시료 중의 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 복합체를 다시 분리하여 상기 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 것, 또는 상기 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 그 수준을 측정하는 것일 수 있다. 상기 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다.
상기 방법은 상기 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 동일한 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 또한 상기 결정하는 단계는 측정된 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에서 측정된 동일한 유전자의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 개체는 난소암의 예후가 불량한 것 또는 난소암 재발의 위험이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 결정하는 단계는 상기 측정된 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에서 측정된 동일한 유전자의 발현 수준보다 같거나 낮은 경우, 상기 개체는 난소암의 예후가 불량하지 않은 것 또는 난소암 재발의 위험이 낮은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 또한 상기 개체의 GSC, VAV3, FOXA2, LEF1, COMP, AZU1, GRIN2A, IL17F, CD86, PYY, FIGF, NKX3-2, WNT3A 또는 PDK4 유전자의 발현 수준이 대조군의 발현 수준에 비교하여 변화한 경우 개체를 난소암의 예후가 불량한 것 또는 난소암의 재발의 위험성이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 이상 증가하거나, 양성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법은 또한 암세포의 화학 내성, 림프절 전이, 원격 전이 또는 환자의 생존율을 포함하는 환자의 임상 병리학적 파라미터를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
상기 진단하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 VAV3 유전자의 발현 수준을 저해시키기 위한 제제를 포함하는 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 제제는 암세포의 회전 타원체 형성능 저해, 암세포 콜로니 형성 저해, 암세포의 증식 또는 성장 저해 또는 다른 항암제에 대한 약물 민감성을 향상시키는 효과를 제공하여 난소암을 직간접적으로 치료 또는 난소암의 재발을 예방할 수 있다. 상기 암세포는 CSC일 수 있다.
상기 제제는 VAV3 유전자의 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA 서열에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 제제는 VAV3 유전자의 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA 서열에 결합하여 VAV3 유전자의 발현을 저해할 수 있다.
상기 제제는 VAV3 유전자의 서열에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nt의 길이를 가질 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 VAV3 유전자의 서열과 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열일 수 있으나, VAV3 유전자 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 모든 서열을 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 siRNA일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 제제는 VAV3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 진단용 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 진단용 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 후보 물질을 개체에 투여하는 단계; 상기 개체로부터 분리된 시료를 VAV3 단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질과 접촉시켜 이들의 복합체를 형성시키는 단계; 상기 복합체의 수준을 측정하여 시료 중의 VAV3 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 발현 수준을 대조군에서 측정된 VAV3 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 발현 수준이 대조군의 발현 수준에 비교하여 변화하는 경우, 상기 후보 물질을 난소암의 치료 또는 난소암의 재발 예방에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 난소암의 치료 또는 난소암의 재발 예방 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 후보 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 후보 물질은 난소암의 치료 또는 난소암의 재발 예방에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 물질일 수 있다. 후보 물질을 투여하는 경로는 선택되는 물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여 경로는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의한 경로일 수 있다. 상기 물질은 전신적으로 또는 국부적, 예를 들면 난소에 투여될 수 있다.
상기 방법은 상기 개체의 VAV3 유전자의 발현 수준이 대조군의 발현 수준에 비교하여 변화한 경우, 상기 후보 물질을 난소암의 치료 또는 난소암의 재발 예방에 효과적인 것으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함한다.
상기 스크리닝하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 조성물은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위해 효율적으로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 키트는 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위해 효율적으로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 방법은 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 진단하기 위해 효율적으로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 조성물은 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위해 효율적으로 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방하기 위한 물질을 스크리닝하는 방법에 의하면 난소암을 치료 또는 난소암의 재발을 예방할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있다.
도 1은 17개의 OSC로부터 배양된 1차 세포들로부터 회전 타원체 형성 분석으로 분리한 CSC 세포를 나타낸다. 도 1A는 OSC 세포의 1차 배양물의 위상 차 이미지이고, (a)는 로우 뷰, (b)는 하이 뷰 및 (c)는 파워 뷰의 회전 타원체 형태를 나타낸다. 도 1B는 1차 암 세포의 회전 타원체 형성능이 1세대 및 2세대 사이에서 2.17%-2.37%로 일정한 것을 나타내고, 이는 회전 타원체 형성 세포들이 자기 복제(self-renewing) 특성을 가진 것을 나타낸다. 도 1C는 줄기 세포 마커의 혈저한 발현이 SFC 세포에서 검출된 것을 나타낸다(*P<0.05). 당업계에 알려진 줄기 세포의 마커들을 사용하였고, CD117을 제외한 모든 마커들이 SFC에서 유의하게 과발현됨을 나타낸다. 이는 SFC가 배양된 1차 세포에 비교하여 CSC에 풍부하게 있음을 나타낸다.
도 2는 OSC SFC 및 이에 상응하는 1차 암세포의 cDNA 마이크로어레이 분석을 나타낸다. 도 2A는 SFC 및 1차 암세포 사이에서 15배 이상 발현 수준의 차이가 있는 유전자들의 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)을 나타낸다. X축에 시료 및 Y축에 유전자가 각각 나열되어 각각의 클러스터링된 발현 데이터가 열지도 상에 나타나 있다. SFC 시료의 이에 상응하는 1차 암세포에 비교한 상대적인 유전자 발현 수준이 밝은색(하락)부터 어두운색(상승)까지 그레이스케일로 표시되어 있다. 28개 유전자가 모든 4개 SFC 시료에서 대조군 세포에 비해 높게 발현되었고, 34개 유전자가 모든 4개 SFC 시료에서 대조군 세포에 비해 낮게 발현되었다. 도 2B의 원형 차트는 SFC에서 2배 이상 발현이 변화한 유전자 온톨로지를 나타낸다(P<0.05). 세포자살(apoptosis) 및 증식과 관련된 유전자가 13%, 세포 주기와 관련된 유전자가 10%, 신호 전달 및 CSC와 관련된 유전자가 8%, 약물 반응에 관련된 유전자가 5%를 차지한다. 도 2C는 cDNA 마이크로어레이에서 현저하게 발현이 증가한 유전자의 qRT-PCR에 의한 확인을 나타낸다. qRT-PCR은 SFC 및 이의 부계 암세포 17쌍에 대해 수행되었고, GSC(4.26배), VAV3(7.05배), FOXA2(12.06배), LEF1(17.26배), COMP(21.33배), GRIN2A(9.36배), CD86(23.14배), PYY(4.18배), NKX3-2(10.35배), 및 PDK4(74.26배)가 SFC에서 그의 부계 암세포에 비해 현저하게 증가하였음을 나타낸다.(*P<0.05).
도 3A는 qRT-PCR로 선별된 유전자들의 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 13개 유전자의 mRNA 발현 수준이 SFC에서 1차 암세포에 비해 유의하게 증가하였음을 나타낸다. 11개 유전자는 OSC에서 대조군 나팔관에 비해 유의하게 과발현 되었다(*P<0.05). 도 3B는 LEF1, PYY, NKX3-2 및 WNT3A 유전자가 화학 내성 암세포에서 화학 감수성 암세포에 비해 상대적 mRNA 수준이 현저하게 증가하였음을 나타낸다. 도 3C는 임상 병리학적 파라미터들과 qRT-PCR로 확인한 mRNA 발현 수준 사이의 연관성을 나타낸다. (a)는 PYY의 발현 수준 증가(2배 이상)가 림프절 전이와 유의한 연관성이 있음을 나타낸다(*P<0.05). (b)는 VAV3의 발현 수준 증가(2배 이상)가 원격 전이와 연관성이 있음을 나타낸다(*P<0.05). (c)는 PYY(2배 이상), FOXA2(6배 이상), 및 NKX3-2(10배 이상)의 발현 수준 증가가 OSC의 화학 내성 증가와 각각 연관성이 있음을 나타낸다(*P<0.05).
도 4A는 OSC 및 대조군 조직의 면역 조직 화학 염색을 나타낸다. (a,b)는 FOXA2에 대한 OSC 내 염색에서 핵에서는 양성을 나타내나, 나팔관 내에서는 음성인 것을 나타낸다. (c,d) LEF1은 OSC 내 염색에서 핵에서는 양성을 나타내나, 나팔관 내에서는 음성인 것을 나타낸다. (e,f) VAV3에 대한 OSC 내 핵 및 세포질 반응성에서 양성을 나타내나, 나팔관 내에서는 음성인 것을 나타낸다. (g,h) OSC 내 핵에서 NKX3-2 염색이 관찰되었으나, 나팔관 내에서는 관찰되지 않은 것을 나타낸다. (i,j) OSC 내에서 Wnt3A에 대한 막 염색이 관찰되었으나, 나팔관 내에서는 오직 내강 염색만이 관찰된 것을 나타낸다. (k,l) OSC 내 PYY-양성 염색이 관찰된 반면, 나팔관 내에서는 음성임을 나타낸다. 도 4B는 VAV3 및 FOXA2 면역 조직 화학 반응성에 따른 생존 곡선을 나타낸다. 고 수준의 VAV3(a) 또는 FOXA2(b) 발현을 갖는 환자들이 저 수준의 VAV3 또는 FOXA2 발현을 갖는 환자보다 낮은 생존률을 갖는 것을 나타낸다(P<0.05).
도 5는 PTX-내성 난소 암세포에 대한 VAV3 녹다운의 효과를 나타낸다. 도 5A는 회전 타원체 형성 분석 결과를 나타낸다. VAV3 siRNA 첨가 후 회전 타원체 형성 수가 음성 siRNA 대조군에 비교하여 30% 감소하였다. 회전 타원체의 크기 또한 VAV3 siRNA 첨가된 SKpac 세포에서 음성 siRNA 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다. 그래프는 평균±표준 오차를 나타낸다.(*P<0.001). 도 5B는 콜로니 형성 분석을 나타낸다. VAV3 녹다운 세포를 웰당 300 세포씩 분주하고 14일간 배양하였다. VAV3 siRNA가 가해진 SKpac 세포의 콜로니 수는 음성 siRNA가 가해진 대조군 세포에 비해 41% 감소하였다. 그래프는 3회 반복 실험의 평균±표준 오차를 나타낸다.(*P<0.001). 도 5C는 MTT 분석을 나타낸다. 세포 생존능을 VAV3 siRNA 첨가 후 평가하였다. 세포 생존능은 음성 siRNA 대조군에 비교하여 24시간 및 48시간 후 각각 25% 및 18% 감소하였다(*P<0.05). VAV3 siRNA와 40 nM PTX 첨가 후, SKpac 세포의 수는 PTX 및 음성 siRNA 첨가 대조군에 비교하여 24시간 및 48시간에서 각각 27% 및 16% 감소하였다(*P<0.05). 그래프는 3회 반복 실험의 평균±표준 오차를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 난소암의 불량한 예후를 나타내는 마커들의 선별
1. 재료 및 실험 방법
(1) 환자 및 조직 시료
CSC의 분리 및 평가를 위해서 17명의 고도의 OSC 난소암 환자의 종양 세포를 난소 절제술 수술시 획득하여 배양하였다. 이들 배양된 1차(primary) 암세포를 이용하여 회전타원체 형성 분석을 수행하였다.
고도의 OSC 환자들로부터 36개의 신선한 조직 샘플을 얻었고, 이를 이용하여 cDNA 마이크로어레이에서 서로 다르게 발현하는 mRNA 발현 확인을 위한 qRT-PCR을 수행하였다. 하기 표 1은 상기 환자들의 임상병리학적 특성을 나타낸다.
양성 자궁 근종으로 인해 난관 절제술과 함께 자궁 적출술을 받은 환자로부터의 나팔관을 건강 대조군으로서 사용하였다.
면역 조직 화학 분석에서는 분당 차 메디컬 센터에서 치료받는 74명의 고도의 OSC 환자로부터의 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 이용하였다. 상기 환자들의 임상병리학적 특성은 하기 표 1에 나타나 있다.
조직학적 진단 및 임상적 단계는 세계 보건 기구(WHO) 분류에 따랐다. 조직학적 단계는 2단계 등급 체계에 따르고, 종양 단계는 종양-림프절-전이(TNM) 단계법에 따랐다.
시료는 수술 후 1차 화학 치료 요법(택솔/플래티넘-기반 조합 치료)에 대한 반응성에 따라서, 화학 감수성(chemosensitive) 및 화학 내성(chemoresistant) 그룹으로 나누었다.
본 연구는 분당 차병원의 윤리 의원회의 승인을 받았으며, 모든 환자들의 사전 동의서를 받고 진행하였다.
[표 1] 정량적 실시간 PCR 분석 및 면역 화학 조직 염색에서 사용된 환자들의 임상 병리학적 특성
Figure 112018052314659-pat00001
IHC: 면역 화학 조직; qRT-PCR: 정량적 실시간 PCR
(2) 1차 세포 배양 및 회전타원체-형성 세포의 분리
1차 종양 세포는 17명의 고도 OSC 환자들로부터 난소 절제술 수술시 획득하였다. 종양 덩어리를 작은 조각들로 절단하고 단일-세포 현탁액으로 효소적 소화시켰다. 이후 50 U/mL 콜라게나제 A(Roche, Pleasanton, CA)를 포함하는 무 Ca2+/Mg2+ 포스페이트 완충 식염수 내에서 배양하였다. 상피 세포를 선별하기 위해 세포를 Ber-EP4-코팅 자성 Dynabead(Life Technologies, Grand Island, NY)와 함께 배양하고, 그 후 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 20 ng/mL 표피 성장 인자(Life Technologies)를 포함하는 RPMI 배지(Gibcoo/Life Technologies, Grand Island, NY)에서 배양하였다.
회전 타원체 형성 분석을 위해서, 단일 세포들을 20 ng/mL 표피 성장 인자(Life Technologies), 10 ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 0.4% 소 태아 알부민(Sigma-Aldrich) 및 5 μg/mL 인슐린(Sigma-Aldrich)으로 보충된 무혈청 Dulbecco's modified Eagles's 배지/F12 배지(Life Technologies) 내 1x103 세포/cm2의 밀도로 초저-부착성 6-웰 배양 플레이트(Corning, Acton, MA) 상에 분주하였다. 50-100 세포들의 회전 타원체 형성을 분주 후 7일차에 평가하였다. 회전 타원체 형성 효율은 콜로니/웰 당 분주된 세포로 정의된다.
(3) cDNA 마이크로어레이 분석
cDNA 마이크로어레이는 4개의 회전 타원체 형성 세포(spheroid-forming cell: SFC) 시료 및 이에 상응하는 1차 암세포에 대해 수행하였다.
CSC는 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Reymond, WA)를 이용하여 얻었다. 표적 cDNA 프로브의 합성 및 혼성화는 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification 키트(Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 이용하여 수행하였다. 증폭하고 라벨링한 cRNA는 cRNA Cleanup Module(Agilent Technology) 상에서 정제하였다. 단편화된 cRNA는 직접 조립 인간 올리고 마이크로어레이(assembled Human Oligo Microarrays)(60K)(Aligent Technology) 상에 피펫팅 하였다.
혼성화 이미지는 DNA 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 스캔하였고 Feature Extraction Software(Agilent Technology)로 정량화하였다. 데이터 정규화(normalization) 및 유의미하게 변화한 유전자의 선별은 GeneSpring GX 7.3(Agilent Technology)으로 수행하였다. 정규화된 비(ratio)의 평균은 평균 정규화 신호 채널 강도를 평균 정규화 대조군 채널 강도로 나누어 계산하였다. 유전자의 기능적 주석(functional annotation)은 GeneSpring GX 7.3에 의한 Gene Ontology Consortium(www.geneontology.org/index.shtml)에 따라 수행하였다. 유전자 분류는 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 및 Medline 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 기초로 수행하였다.
(4) 정량적 실시간 PCR
총 RNA를 조직 또는 1차 세포로부터 TRIzol 시약(Life Technologies)를 이용하여 분리하였다. 제1 가닥(first-strand) cDNA 합성은 Superscript Ⅲ 키트(Life Technologies)를 이용하여 수행하였다. 실시간 PCR은 CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 3회 수행되었다. 20 μL의 최종 반응물은 0.5 μL cDNA 주형, 10 μL TaqMAn Master Mix(Applied Biosystems, Paisley, United Kindom), 및 1 μL의 프라미어 및 프로브 혼합물을 포함하였다. 전사 수준은 글리세랄데히드 3-포스페이트 데히드로제나제(GAPDH) 발현에 대하여 정규화되었다. 유전자 발현은 식 2-ΔΔCt를 이용하여 계산하였다.
(5) 조직 마이크로 어레이 및 IHC 염색
IHC 분석을 위해, 74개의 OSC 시료를 조직 마이크로어레이를 구성하는데 이용하였다. 각각의 시료에서, 각 조직 덩어리로부터 3 mm 지름의 조직 중심부 2개씩을 뚫어 내고 이들을 수동 마이크로어레이 장치(UNITMA; Quick-RAYTM UNITech Science, Seoul, Korea)를 이용하여 파라핀 블록에 정렬시켰다. 조직 마이크로어레이 파라핀 구획은 크실렌 내에서 탈파라핀화 시켰다. 내인성 페록시다제 활성은 0.3% 히드로젠 페록시드로 블로킹하였다. 항원 회수를 위하여, 상기 구획들은 0.1 M 시트레이트 버퍼(pH 6.0) 내에서 15분간 전자레인지로 가열하였다.
슬라이드는 하기의 1차 항체 및 희석도로 4℃에서 밤새 배양하였다: FOXA2 (1:200; Abcam, Cambridge, United Kingdom), LEF1 (1:250; Abcam), PYY (1:50; Abcam), VAV3 (1:50; Novus Biologicals, Littleton, CO), NKX3-2 (1:75; Novus Biologicals), 및 Wnt3A (1:750; Novus Biologicals). 슬라이드는 이후 HRP 폴리머 Ultravision LP Detection System(Thermo Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 2차 항체와 함께 상온에서 15-30분간 배양하였다. 상기 구획들은 이후 디아미노벤지딘으로 발색시키고 헤마톡실린으로 대조염색 하였다. IHC 염색은 두명의 독립적인 병리학자에 의해 해석되었다.
단백질 발현은 면역반응성 점수로 결정하였다. 양성 세포의 비율은 0(음성), 1(10% 미만의 양성 세포), 2(10-50% 양성 세포), 3(51-75% 양성 세포), 또는 4(75% 초과의 양성 세포)로 점수를 매겼다. 염색 강도는 0(음성), 1(약함), 2(중간), 또는 3(강함)으로 나누었다. 최종 면역반응성 점수는 상기 두 종류의 점수를 곱하여 계산하였다.
(6) VAV3에 대한 기능적 분석
VAV3 siRNA의 형질주입
VAV3 기능적 분석에서, SKOV3(ATCC, Manassas, VA)을 단계적으로 증가하는 농도의 파클리탁셀(paclitaxel: PTX)에 8개월 이상 지속적으로 노출시켜 발생하는 PTX-내성 SKpac 세포를 사용하였다. VAV3 siRNA와 음성 siRNA(정상 대조군)를 합성하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA). 형질주입 전날, 1x105 세포를 6-웰 플레이트 각각에 분주하였다. 그 다음 날, 상기 세포들을 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 어닐링한 siRNA 올리고뉴클레오티드로 형질주입하였다. 형질주입 24시간 및 48시간 후에, 세포들을 수확하고 siRNA 형질주입 후 VAV3 녹다운(knockdown)의 효율을 qRT-PCR로 확인하였다. 확인된 세포들은 이후의 MTT, 콜로니 형성, 및 회전 타원체-형성 분석에서 이용된다.
(7) 세포 생존능에 대한 MTT 분석
세포(1x104)들을 96-웰 배양 플레이트 내에 분주하고 이후 10 pmol VAV3 siRNA를 배양 배지 내에 24시간 및 48시간 첨가하였다. 대조군 세포들에 대해서는 10 pmol의 음성 siRNA를 배양 배지 내에 첨가하였다. 24시간 및 48시간 후, 상기 세포들을 MTT 시약(0.5 mg/mL)과 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 결과물인 포르마잔(formazan) 결정은 100 μL의 DMSO를 각각의 웰에 첨가하여 용해시켰다.
(8) 콜로니 형성 분석
세포들을 6웰 플레이트 각각의 웰 당 1x105 세포 수의 밀도로 분주하였다. 그 다음날, 세포들을 siRNA로 형질주입한 후 48시간 동안 배양하였다. 형질주입된 세포들은 이후 웰 당 300 세포의 밀도로 겔라틴-코팅 6웰 배양 디시 내에 다시 배치하였다. 14일 후, 콜로니들을 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정한 후 헤마톡실린을 이용하여 염색하였다. 50 세포를 초과하는 군을 콜로니로 계수하였다.
(9) 통계 분석
통계 분석은 SPSS 통계 소프트웨어 패키지(IBM SPSS Statistics Data Editor 20)로 수행하였다. 각각의 종양 그룹에서 mRNA 및 단백질 발현 수준 사이의 관계 및 임상 병리학적 요인을 χ2 분석, Fisher's 정확 검정, 또는 Mann-Whitney 검정으로 평가하였다. 생존 분석을 위해서 Kaplan-Meier 방법 및 Cox 비례 위험 모델을 사용하였다. 각각의 기능적 분석의 결과는 평균±표준 오차로 표현하였다. Student's t-검정을 수행하였고 P<0.05를 유효한 것으로 간주하였다.
2. 난소암의 병리학적 상태를 평가하기 위한 SFC 특이적 바이오 마커의 선별
(1) 인간 난소 암종의 1차 세포 배양물로부터 분리된 SFC 내 다량의 암 줄기 세포의 존재 확인
회전 타원체-형성 분석에서 50-100세포의 비부착성 회전 타원체 다발이 분주 1주일 후 관찰되었다(도 1A). 상기 SFC를 수집한 후, 회전 타원체 형성 능력을 평가하였다. 접종된 세포들의 회전 타원체 형성의 효율은 1차 세대에서 2.37%±0.4%였다. 상기의 부유 구체들을 효소적으로 분해시키고 단일 세포들을 수확하고 동일한 배양 조건에서 2차 회전 타원체를 형성하기 위해 사용하였다. 2차 세대의 회전 타원체 형성 능력(2.17%±0.3%)은 1차 세대와 유사하였다(도 1B 및 표 2).
[표 2] OCS의 1차 및 2차 세대의 회전 타원체 형성능
Figure 112018052314659-pat00002
SCN: 혈청 암종; SD: 표준 편차
CSC가 SFC 내에 풍부한지 여부를 확인하기 위해, 잘 알려진 줄기 세포 마커의 SFC 내 mRNA 발현을 qRT-PCR로 분석하였고 부계의 1차 암세포와 비교하였다. 평가된 줄기 세포 마커는 ALDH1, CD24, CD44, CD133, NOTCH3, SOX2, 및 CD117였다. CD117을 제외하고, 모든 줄기 세포 마커가 1차 암세포보다 SFC 내에서 높게 발현되었다(P<0.05). 따라서 CSC는 SFC 내에 풍부함을 확인하였고(도 1C), 이러한 SFC들을 CSC-유사 세포로 부를 수 있다.
(2) cDNA 마이크로어레이에 의한 CSC-유사 세포의 유전자 발현 프로필 확인
회전 타원체 형성 CSC-유사 세포의 유전자 발현 프로필을 평가하기 위해 cDNA 마이크로어레이를 수행하였다. 4 종의 CSC-유사 세포 시료와 이들의 상응하는 부계 1차 암세포 사이에서 유전자 발현을 비교하였다. 그 결과, CSC-유사 세포 내에서 619개 유전자의 발현이 대조군 암세포에 비하여 적어도 5배 이상 유의하게 증가 또는 감소하였다(P<0.05). 이들 중 381개 유전자는 증가하였고, 238개 유전자는 감소하였다. 특히 15배 이상 변화한 62개 유전자의 계층적 클러스터링이 도 2A에 나타나 있다. 본 마이크로어레이 데이터는 마이크로어레이 실험에 대한 최소 정보(minimum information about a microarray experiment: MIAME)의 권고에 따라 제공되었고, Gene Expression Omnibus(GEO) 시리즈 등록 번호 GSE60765를 통해 열람할 수 있다(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
CSC-유사 세포 내에서 적어도 2배 이상 증가 또는 감소한 유전자들(P<0.05)을 생물학적 프로세스 유전자 온톨로지(biological process gene ontology)에 따라 분류하였다. 도 2B는 각각의 프로세스를 나타내는 유전자의 비율을 나타내는 원형 도표이다. 가장 큰 수의 유전자는 세포사멸 및 증식과 연관되어 있고(각각 13%); 세포 주기(10%); CSC(8%) 및 신호 전달(8%); 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)(6%); 미토겐-활성 단백질 키나제(MAPK)(6%); 티로신 키나제(6%) 및 Notch 신호(6%); 약물 반응성(5%); 및 Wnt 신호 전달(5%); 헷지호그(hedgehog) 신호(4%); 상피-간엽 변이(3%) 및 Toll-유사 신호(3%); 및 인슐린 수용체 경로(2%)의 유전자가 해당되었다.
CSC 마커 중에서도 CD24(13.85배), ALDH1A1(6.80배) 및 SOX2(5.36배)가 회전 타원체를 형성하는 CSC-유사 세포에서 현저하게 상향 조절되었다. CSC-유사 세포에서 대조군과 비교하여 5배 이상 발현이 증가하는 암유발 연관 유전자들이 그들의 관련 기능과 함께 표 3에 요약되어 있다.
[표 3] 종양 발생과 관련된 것으로 알려지고, 1차 암세포에 비교하여 CSC에서 5배 이상 상승 조절된 유전자
Figure 112018052314659-pat00003
APO: 세포자살; CSC: 암 줄기 세포 마커; CYC: 세포 주기; DRU: 약물 반응; EMT: 상피-간엽 변환(epithelial mesenchymal transformation); HED: 헷지호그 경로; INS: 인슐린 수용체; NOT: Notch 신호 경로; PRO: 증식; SCT: 줄기 세포 전사; SIG: 신호 전달; TGF: 변형 성장 인자-β 경로; TOL: Toll-유사 수용체 신호 경로; TYR: 티로신 키나제 신호; WNT: Wnt 경로.
(3) 바이오 마커 후보군으로서 14개의 유전자 선별 및 qRT-PCR에 의한 확인
불량한 예후 및 화학 내성을 예측하기 위한 바이오 마커 후보군을 확인하기 위해, 14개의 유전자를 cDNA 마이크로어레이 및 유전자 온톨로지에 기반하여 선별하였다. 구체적으로, cDNA 마이크로어레이로 CSC-유사 세포 내에서 5배 이상 유전자 발현이 상향된 유전자들을 확인하고, 이들 중 가장 높게 발현이 되는 발암 관련 유전자들을 선별하였다. 상기 14개 유전자의 상대적인 발현 수준은 하기와 같다: GSC (8.39배), VAV3 (11.75배), FOXA2 (15.11배), LEF1 (28.76배), COMP (15.34배), AZU1 (13.36배), GRIN2A(7.34배), IL17F (17.36배), CD86 (8.67배), PYY (11.98배), FIGF (14.01배), NKX3-2 (9.43배), WNT3A (6.19배), 및 PDK4 (11.83배).
또한 상기 14개 유전자의 SFC 및 이들의 부계 암세포 내 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하였다. 그 결과, GSC (4.26배; P < 0.001), VAV3 (7.05배; P < 0.001), FOXA2 (12.06배; P < 0.05), LEF1 (17.26배; P < 0.05), COMP (21.33배; P < 0.001), GRIN2A (9.36배; P < 0.001), CD86 (23.14배; P < 0.001), PYY (4.18배; P < 0.001), NKX3-2 (10.35배; P < 0.001), 및 PDK4 (74.26배; P < 0.001)가 SFC 내에서 부계 암세포에 비해 현저하게 발현 수준이 상승하였음을 확인하였다(도 2C).
(4) 화학 내성 암세포 내에서 LEF1, PYY, NKX3-2 및 WNT3A 의 발현 수준 상승의 확인
상기 후보군 유전자들의 mRNA 발현을 측정하기 위해 36개의 신선한 인간 OSC 조직에 대하여 qRT-PCR을 수행하였다. OSC 조직 내 mRNA 발현 수준은 정상 나팔관 대조군 조직과 비교하였다.
그 결과, 인간 OSC에서, 하기의 11개 유전자가 유의미하게 과발현되었다: VAV3 (7.92배), FOXA2 (7.32배), LEF1 (9.64배), COMP (25.01배), GRIN2A (12.51배), IL17F(2.50배), CD86 (6.35배), PYY (13.50배), NKX3-2(10.79배), WNT3A (15.67배), 및 PDK4 (10.19배) (모든 P < 0.05).
도 3A는 대조군에 비교한 13개 후보군 유전자의 OSC 내 상대적인 발현량을 나타낸다. LEF1, PYY, NKX3-2, 및 WNT3A의 발현 수준에 유의한 차이가 있었다(P < 0.05). 구체적으로, 화학 내성 암세포인 OSC에서 화학 감수성 대조군 세포에 비해 LEF1은 2.85배; PYY는 20.03배; NKX3-2는 3.02배; 및 WNT3A는 3.91배 발현 수준이 증가하였다(도 3B).
추가적으로 mRNA 발현 수준과 임상 병리학적 파라미터들의 관계를 분석하였다. VAV3의 발현양 상승(정상 대조군에 비해 2배)은 원격 전이(distant metastasis)와 관련성이 있었다(P<0.05). PYY의 발현양 상승(2배 이상)은 림프절 전이(P<0.05) 및 화학 내성(P<0.05)과 관련성이 있었다. FoxA2의 발현양 상승(6배 이상) 및 NKX3-2의 발현양 상승(10배 이상)은 화학 내성과 관련성이 있었다(P<0.05)(도 3C).
(5) OSC 내 VAV3, NKX3-2 및 LEF1 의 과발현과 불량한 예후와의 연관성 확인
74개의 OSC 조직 시료 마이크로어레이에 대하여 후보군 유전자들의 단백질 발현 및 이와 임상 병기, 림프절 및 원격 전이, 화학 내성 및 생존 등의 임상 병리학적 파라미터와의 관계를 확인하기 위한 IHC 연구를 수행하였다. 상기 연구의 대상으로 LEF1, PYY, NKX3-2, WNT3A6, VAV3 및 FOXA2 6종의 단백질을 선별하였다. LEF1, NKX3-2, PYY 및 Wnt3A는 면역반응성 점수가 4 이상인 경우; FOXA2는 면역 반응성 점수가 2 이상인 경우; 및 VAV3는 면역 반응성 점수가 6 이상인 경우 과발현된 것으로 간주하였다.
그 결과, OSC 조직의 세포질 또는 핵 내에서 국소적 또는 확산적인 염색이 관찰되었다(도 4A). 구체적으로, FOXA2, LEF1 및 NKX3-2가 핵에서 양성, PYY가 세포질에서 양성, 및 VAV3가 핵 및 세포질 모두에서 양성을 나타내었다.
양성 장액성 낭선종(benign serous cystadenoma) 및 정상 나팔관으로부터의 상피 및 기질(stromal) 세포는 FOXA2, LEF1, NKX3-2 및 VAV3에 대해 음성 또는 약한 양성(5% 미만의 양성 세포)을 나타냈다.
정상 나팔관 및 양성 장액성 낭선종의 상피 세포에서 Wnt3A에 대한 말단 부근 염색이 발견되었다. 반면 OSC 조직에서는 막 염색이 관찰되었다.
대부분의 OSC들은 상기 단백질들을 과발현하였다. FOXA2는 66.2%(49/74)의 사례, 및 LEF1는 59.5%(44/74)의 사례에서, 및 PYY, NKX3-2 및 Wnt3A는 각각 58.1%(43/74), 58.1%(43/74), 및 63.5%(47/74)의 사례에서 과발현되었다. IHC 염색 및 임상 병리학적 파라미터 사이의 관계는 하기 표 4에 나타나 있다. 원격 전이는 LEF1, VAV3 및 NKX3-2의 발현과 유의하게 관련되어 있었다(P<0.05). 화학 내성은 NKX3-2의 과발현과 유의하게 관련되어 있었다(P<0.05).
[표 4] OSC의 면역 조직 화학 발현 양상 및 임상 병리학적 파라미터 사이의 관계(N=74)
Figure 112018052314659-pat00004
a: p<0.05. 면역 반응성 점수가 FOXA2는 2 이상, LEF1, PYY, NKX3-2 및 Wnt3A는 4 이상, 및 VAV3는 6 이상일 때 과발현으로 간주.
실시예 2. VAV3 siRNA를 이용한 VAV3 녹다운의 CSC에 대한 효과 확인
(1) 높은 VAV3 면역 반응성(immunoreactivity)과 OSC의 불량한 예후의 연관성 확인
74명의 OSC 환자에 대하여 이들의 단백질 발현에 따른 생존 분석을 수행하였다. 실험 재료 및 방법은 상기 실시예 1에서 설명된 재료 및 방법과 동일하다. 단백질 발현은 면역 조직 화학으로 분석하였다. 평균 추적 관찰 기간은 31개월이었다(1-112개월). 상기 관찰 기간 동안, 21명의 환자(28.4%)가 질병에 의해 사망하였다. Kaplan-Meier 분석으로 VAV3의 과발현(면역 반응성 점수 6 이상) 및 FOXA2의 과발현(면역 반응성 점수 2 이상)이 짧은 생존 기간(overall survival: OS)과 유의한 관계가 있음을 밝혀내었다(VAV3, OS: 과발현군 64.2% vs. 대조군 94.4%, P < 0.05; FOXA2, OS: 과발현군 63.3% vs. 대조군 88%, P < 0.05). 다른 단백질들의 발현은 환자의 생존과 유의한 연관성이 없었다.
임상 병리학적 파라미터 및 VAV3 및 FOXA2 면역 반응성에 대해 다변량 콕스 회기 분석(multivariate Cox regression analysis)을 수행하였다. VAV3 과발현은 OSC환자의 불량한 예후에 대한 독립적인 마커임을 확인하였다(표 5; 위험률 15.27, P<0.05). 그러나 FOXA2 과발현은 본 분석에서 OS와 유의한 연관성이 없었다. 화학 내성 또한 낮은 생존율과 연관성이 있었다(위험률=17.74, P<0.001)
[표 5] 임상 병리학적 파라미터 및 VAV3 및 FOXA2의 면역 조직 화학적 발현양에 대한 다변량 콕스 회기 분석
Figure 112018052314659-pat00005
a: P<0.05.
(2) VAV3 녹다운의 회전 타원체 형성을 저해 및 암세포의 생존 및 증식 감소 효과 확인
1) 회전 타원체 형성 분석
암세포에 VAV3 siRNA(서열번호 1 또는 2)를 첨가한 경우, VAV3 siRNA의 CSC 활성에 대한 효과를 확인하기 위해, VAV3 녹다운 세포들의 회전 타원체의 수 및 크기를 정상 대조군과 비교하였다.
그 결과, VAV3 siRNA 처리에 의해 CSC의 회전 타원체 형성 수가 현저하게 줄어들었고(음성 siRNA 대조군에 비교하여 30% 감소)(P<0.001), 회전 타원체의 크기 또한 현저하게 줄어들었다(도 5A). 즉 VAV3 녹다운이 CSC 활성을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
2) 콜로니 형성 분석
콜로니 형성 분석으로 SKpac 세포의 클론성 증식이 VAV3 siRNA에 의해 현저하게 저해됨을 확인하였다. 구체적으로, SKpac 세포의 콜로니 수는 VAV3 siRNA에 의해 음성 siRNA가 첨가된 대조군에 비해 41%만큼 감소하였다(P<0.001)(도 5B).
3) PTX 약물 민감성 분석
VAV3 저해로 인한 PTX-내성 SKpac 세포의 PTX에 대한 민감성에 대한 효과를 평가하였다. 구체적으로, 세포 생존능을 MTT 분석을 이용하여 실험하였다.
그 결과, VAV3 siRNA+PTX 첨가한 경우, 첨가 24시간 및 48시간 후에 PTX+음성 siRNA 첨가 대조군에 비교하여 SKpac 세포의 수를 각각 27% 및 16% 감소시켰다(P<0.05)(도 5C).
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> A composition, and marker for diagnosing ovarian cancer comprising NKX3-2 <130> PN122415 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VAV3 siRNA <400> 1 caggaccaaa gagucaggag aauau 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VAV3 siRNA <400> 2 auauucuccu gacucuuugg uccug 25

Claims (1)

  1. NKX3-2, FOXA2, PDK4, 및 FIGF 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 난소암의 예후 또는 난소암 재발의 위험성을 예측하기 위한 조성물.
KR1020180060683A 2018-05-28 2018-05-28 Ｎｋｘ３―２를 포함하는 난소암의 진단을 위한 마커 및 조성물 KR101890391B1 (ko)

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PLoS ONE, Vol. 6, Iss. 3, p.e17149 (2011.03.)

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