WO2023158093A1 - 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물 - Google Patents

암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물 Download PDF

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WO2023158093A1
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immune checkpoint
checkpoint inhibitor
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김경미
강소영
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • It relates to a composition for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients.
  • PD-L1 immunohistochemistry is widely used to predict treatment response to immune checkpoint blockade (ICB). These tests measure PD-L1 protein levels, but are dependent on the antibody clone, staining platform, and interpretation method. For example, assessment of PD-L1 expression in advanced gastric or gastroesophageal junction adenocarcinoma is performed using the PD-L1 IHC 22C3 pharmDx assay and combined positive score (CPS), but metastatic non-small cell lung cancer (NSCLC: Non-small cell lung cancer) sample testing uses the tumor proportion score (TPS) instead of the CPS.
  • CPS tumor proportion score
  • the Ventana SP142 assay is used in patients with urothelial carcinoma and is used to enumerate immune cells (IC) within the tumor microenvironment.
  • IC immune cells
  • This variability in scoring methods has confounded results across clinical trials and clinical practice, leading to uncertainty about the universal value of PD-L1 expression levels as a biomarker across tumor types.
  • FFPE formalin fixed paraffin embedded
  • the use of archival tumor tissue in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) prepared using non-standard fixation and storage methods may not provide predictable and intended results for appropriate PD-L1 antigen retrieval, which is It can potentially increase IHC heterogeneity, intensity and topography of staining. All these factors complicate the use of IHC-evaluated PD-L1 levels to predict clinical response to ICB.
  • RNA-based assays for FFPE tissue are currently used in clinical settings to classify or predict the risk of recurrence in patients affected by various tumor types.
  • RNA-based gene expression analysis includes microarray, real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)-based analysis, and RNA sequencing.
  • RT-qPCR real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • the RT-qPCR assay is one of the most widely used gene quantification methods because of its wide dynamic range, high sensitivity, high specificity, little or no post-amplification processing, and the ability to increase sample throughput.
  • the use of highly specific primers targeting stably expressed genes provides a high level of specificity and sensitivity, enabling simultaneous measurement of multiple targets, including genes, for sample quality control purposes.
  • RT-qPCR Gene expression profiling by RT-qPCR has minimal input requirements and can be much more cost-effective than IHC methods.
  • IHC the strong concordance between RT-qPCR and IHC demonstrated the analytical validity of RT-qPCR even for challenging FFPE tumor samples. Therefore, implementing gene-specific reverse transcription can significantly increase the validation success rate of molecular classifiers in the FFPE sample cohort.
  • the present inventors aimed to develop RT-qPCR to measure the CD274 mRNA expression level correlated with PD-L1 IHC, reducing the test time and archiving tumor tissue necessary to perform other IHC analyzes in the same patient. wanted to help save money.
  • three RT-qPCR primers were designed to compare the results with PD-L1 IHC, and the results were clinically verified in gastric cancer (GC) and urothelial carcinoma patients treated with ICI. .
  • One aspect is to provide a composition for predicting reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients, including an agent capable of measuring the expression level of the CD274 gene in a sample isolated from cancer patients.
  • Another aspect is to provide a kit for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients comprising the composition.
  • Another aspect includes amplifying the CD274 gene in a sample isolated from a cancer patient.
  • Another aspect is to provide a use of an agent capable of measuring the expression level of the CD274 gene in a sample isolated from a cancer patient for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for a cancer patient.
  • One aspect provides a composition for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for a cancer patient, including an agent capable of measuring the expression level of the CD274 gene in a sample isolated from the cancer patient.
  • cancer patient may be an individual capable of having cancer as a disease, and specifically, the “individual” may be a mammal, for example, a mouse, rat, cat, guinea pig, hamster, dog, monkey, or chimpanzee. , a human, etc., and may be specifically a human.
  • the sample is from the group consisting of blood, plasma, serum, tissue, cells, lymph, bone marrow, saliva, eye fluid, semen, brain extract, spinal fluid, joint fluid, thymus fluid, ascites fluid, amniotic fluid, cell tissue fluid and cell culture fluid. It may be one or more selected, and specifically may be one or more of blood, plasma, serum, tissue, cells, lymph, bone marrow, cell tissue fluid, and cell culture fluid, and more specifically, tissue, cell, cell tissue fluid, and cell culture fluid. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • gene can refer to any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in protein coding or transcription, or in regulating the expression of other genes.
  • a gene can consist of all of the nucleic acid encoding a functional protein or only a portion of a nucleic acid encoding or expressing a protein.
  • Nucleic acid sequences may include genetic abnormalities within exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or unique sequences adjacent to the gene.
  • measuring the expression level of the CD274 gene may be measuring the amount of PD-L1 protein (a protein encoded by the CD274 gene) or mRNA, and specifically, measuring the amount of CD274 mRNA.
  • the "measuring the amount of protein” is a process of confirming the presence and expression level of the protein encoded by the gene in the sample of the subject. it means.
  • the amount of the protein is measured by Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA: Radioimmunoassay), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion method, rocket At least one selected from the group consisting of immunoelectrophoresis, tissue, immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), and protein chip. It may be performed by a technique.
  • the "measurement of the amount of mRNA” refers to a process of confirming the presence or absence of mRNA of the gene and the expression level of the gene in a sample of a subject.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Real time RT-PCR real time reverse transcriptase polymerase reaction
  • qPCR quantitative polymerase chain reaction
  • qPCR competitive reverse transcription polymerase chain reaction
  • RPA RNaseprotection assay
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • RT-qPCR competitive reverse transcription polymerase chain reaction
  • RT-qPCR Inverse PCR and Long and Accurate PCR
  • RNaseprotection assay RNaseprotection assay
  • Northern blotting it may be performed by one or more techniques selected from the group consisting of a DNA chip, specifically, reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcriptase polymerase It may be a reaction (real time RT-PCR), real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), or more specifically, RT-qPCR.
  • the agent is at least one selected from the group consisting of primers, probes, aptamers, antibodies, and peptides that can specifically bind to a nucleotide sequence containing the CD274 gene or a protein encoded by the nucleotide sequence.
  • it may be a primer or probe capable of specifically binding to a nucleotide sequence including the CD274 gene, and more specifically, a primer capable of specifically binding to a nucleotide sequence including the CD274 gene.
  • the agent increases the expression level of one or more sites selected from the group consisting of the junction of exon 1 and exon 2, the junction of exon 3 and exon 4, and the junction of exon 5 and exon 6 of the CD274 gene. may be measuring
  • the preparation contains CD274 TaqMan probe for the junction of exon 1 and exon 2 (assay ID; Hs01125296_m1), CD274 TaqMan probe for the junction of exon 3 and exon 4 (assay ID; Hs00204257_m1), and exon 5 and exon 6 It may be one or more probes selected from the group consisting of CD274 TaqMan probes for junctions (assay ID; Hs01125301_m1).
  • primer refers to a nucleic acid sequence capable of forming complementary base pairs with the template strand and serving as a starting point for copying the template strand, and may be, for example, 5 to 50 nucleic acid sequences. there is.
  • the primers are usually synthetic, but may be used with naturally occurring nucleic acids.
  • the sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but is sufficiently complementary to allow hybridization with the template.
  • probe refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and means a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding.
  • Aptamer refers to a small single-stranded nucleic acid (DNA or RNA) piece that has the characteristics of being able to bind to various types of substances from small molecule compounds to proteins with high affinity and specificity, for example, It may be a single-stranded nucleic acid fragment consisting of 10 to 60 nucleotides.
  • antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction, and may be a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, a synthetic antibody, and/or an affinity matured antibody. .
  • peptide refers to a polymer composed of two or more amino acids linked by amide bonds (or peptide bonds).
  • the primers, aptamers or probes can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods.
  • Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of one or more homologues of the native nucleotide, and internucleotide modifications, e.g., uncharged uncharged compounds such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, and the like.
  • There is a transformation into a linker or a charged linker such as phosphorothioate, phosphorodithioate, and the like.
  • the antibody or peptide may be derived from nature, or may be synthetically produced in whole or in part, and may include a synthesized sequence.
  • the cancer is lung cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, colon cancer, breast cancer, uterine sarcoma, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, and cervical carcinoma.
  • vaginal carcinoma vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, esophageal cancer, laryngeal cancer, small intestine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, sarcoma of the soft tissue, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, multiple myeloma, chronic or acute leukemia, solid tumor of childhood, lymphoma, bladder cancer, kidney It may be at least one selected from the group consisting of cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, axial contraction tumor, brainstem glioma, and urothelial cell carcinoma, and specifically at least one selected from the group consisting of gastric cancer and urothelial cell carcinoma.
  • cancer refers to a class of diseases characterized by the development of abnormal cells that proliferate uncontrollably and have the ability to invade and destroy normal body tissues.
  • immune checkpoint inhibitor refers to a compound, such as a drug (antibody), that inhibits or blocks proteins expressed by cells of the immune system, such as T cells and some types of cancer cells. including).
  • the protein can suppress the "immune” response and block T cells from killing “cancer” cells, and when the protein is blocked, the "suppression of the immune system is overcome, and the T cells can kill” cancer cells.
  • the immune checkpoint inhibitor may target one or more immune checkpoints selected from the group consisting of PD-1, CTLA4, KIR, 4-1BB/TNFRS9, TIM3 and LAG3.
  • the checkpoint inhibitor may target one or more immune checkpoints selected from the group consisting of PD-1, CTLA4, and LAG3, and more specifically, target PD-1, that is, PD-1/PD-L1. .
  • the immune checkpoint inhibitor may be at least one selected from the group consisting of nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, ipilimumab, atezolizumab, trimelimumab, avelumab, and durvalumab, Specifically, it may be one or more selected from the group consisting of pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, and durvalumab.
  • responsive refers to a clinical or therapeutic benefit given to a patient with a disease or disorder, eg, at risk of developing or having cancer, which benefits include one or more of: prolonged survival (including overall survival and progression-free survival); eliciting an objective “response” (including complete remission or partial remission); or improvement of signs or symptoms of cancer.
  • the “objective "response” refers to a measurable “response”, such as complete “response” (CR) or partial response (PR).
  • the “partial remission” refers to a decrease in the size of one or more "tumours” or lesions or the extent of the body's cancer in response to treatment.
  • prediction may refer to pre-determination of a specific result, for example, treatment responsiveness, through identification of characteristics such as the expression level of a specific gene.
  • PD-1 in cancer cells of gastric cancer or urothelial carcinoma patients treated with anti-PD-1/PD-L1 agents pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab or durvalumab as an immune checkpoint inhibitor.
  • IHC L1 immunohistochemistry
  • RT-qPCR RT-qPCR result for CD274 mRNA
  • the RT-qPCR result for CD274 mRNA in cancer cells of gastric cancer or urinary tract cancer patients showed sensitivity, specificity, and positive predictive value (PPV) compared to PD-L1 immunohistochemistry (IHC) results. , it was confirmed that the negative predictive value (NPV) and accuracy were excellent (see Example 4).
  • the composition for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients is more suitable for cancer patients (in particular, gastric cancer or urothelial cell carcinoma patients) than immunohistochemistry for PD-L1. It was confirmed that the reactivity predictive power of the immune checkpoint inhibitor was excellent.
  • Another aspect provides a kit for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients comprising the composition.
  • the "cancer patient”, “sample”, “formulation”, “cancer”, “immune checkpoint inhibitor” and the like may be within the above-described range.
  • the kit includes a primer, a probe, or an antibody recognizing a selective marker for measuring the expression level of the gene whose expression is increased or decreased depending on the therapeutic response to the immune checkpoint inhibitor, as well as one or more other suitable analysis methods.
  • Component compositions, solutions or devices may be included.
  • a kit for measuring the mRNA expression level of the gene may be a kit containing essential elements to perform RT-PCR.
  • the RT-PCR kit contains, in addition to each primer specific for the above gene, a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Another aspect includes amplifying the CD274 gene in a sample isolated from a cancer patient.
  • a method for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients comprising measuring the expression level of the CD274 gene.
  • cancer patient may be within the aforementioned range.
  • the CD274 gene may be CD274 mRNA.
  • the CD274 gene may include one or more sites selected from the group consisting of the junction of exon 1 and exon 2, the junction of exon 3 and exon 4, and the junction of exon 5 and exon 6 of the CD274 gene. there is.
  • CD274 TaqMan probe for the junction of exon 1 and exon 2 (assay ID; Hs01125296_m1)
  • CD274 TaqMan probe for the junction of exon 3 and exon 4 (assay ID; Hs00204257_m1) and exon 5
  • the expression level of the CD274 gene may be measured using one or more probes selected from the group consisting of CD274 TaqMan probe for the junction of exon 6 (assay ID; Hs01125301_m1).
  • the amplification is reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), real time reverse transcriptase polymerase reaction (Real time RT-PCR), quantitative polymerase chain reaction (qPCR), competitive reverse transcription polymerase chain reaction (Competitive RT -PCR), real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), inverse polymerase chain reaction (Inverse PCR) and long and accurate polymerase chain reaction (Long and Accurate PCR) using one amplification method selected from the group consisting of It may be, specifically, it may be to use one amplification method selected from the group consisting of RT-PCR, RT-qPCR and real time PCR, and more specifically, it may be to use RT-qPCR.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Real time RT-PCR real time reverse transcriptase polymerase reaction
  • qPCR quantitative polymerase chain reaction
  • Competitive RT -PCR competitive reverse transcription polymerase chain reaction
  • RT-qPCR real-time quantitative polymerase chain reaction
  • the time required for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor can be shortened, and cancer (in particular, gastric cancer or urothelial cell carcinoma) can be diagnosed at an early stage. .
  • Another aspect is to provide a use of an agent capable of measuring the expression level of the CD274 gene in a sample isolated from a cancer patient for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for a cancer patient.
  • cancer patient may be within the aforementioned range.
  • RT-qPCR results for CD274 mRNA in cancer cells of cancer patients administered with immune checkpoint inhibitors have a significant correlation with PD-L1 immunohistochemistry (IHC) results, and PD-L1 immunohistochemistry It was confirmed that the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, and accuracy were excellent compared to the (IHC) results.
  • the composition for predicting the reactivity of an immune checkpoint inhibitor for cancer patients according to one aspect has better predictive power for the reactivity of checkpoint inhibitors for cancer patients (in particular, gastric cancer or urothelial cell carcinoma patients) than immunohistochemistry for PD-L1. It is excellent, and the composition has the advantage of being able to shorten the time required to predict the reactivity of the immune checkpoint inhibitor and to diagnose cancer at an early stage by measuring the expression level of CD274 mRNA using RT-qPCR.
  • Figure 1 is a schematic representation of CD274 and TaqMan probes spanning exon 1-2, exon 3-4 and exon 5-6 boundaries.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of PD-L1 immunohistochemical staining in gastric cancer and the SP142 assay in urothelial cell carcinoma.
  • 3a to 3c are diagrams showing the correlation between PD-L1 scores and CD274 mRNA expression levels in gastric cancer and urothelial cell carcinoma.
  • 4a to 4c are diagrams showing the cutoff of the PD-L1 binding positive score in gastric cancer and the cutoff of PD-L1 immune cells in urothelial cell carcinoma.
  • FIG. 5 is a diagram showing the response results to anti-PD-1/PD-L1 inhibitors in gastric cancer and urothelial cell carcinoma.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of PD-L1 expression and mRNA expression of CD274 in gastric cancer patients and urothelial cell carcinoma patients.
  • FIG. 7 is a diagram showing the survival results of RT-qPCR and PD-1/PD-L1 treatment in patients with urinary tract carcinoma.
  • GC gastric cancer
  • PD-1 urothelial carcinoma
  • PD-L1 immunotherapy additional anti-programmed death 1
  • the mean age was 61.0 years (range 33-81 years), and 30 patients (61.2%) were male.
  • the treatment response of 49 patients treated with immunotherapy was evaluated every 6-12 weeks according to the Immune Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (iRECIST). Patients with a follow-up period of at least 6 weeks were included.
  • the primary clinical endpoint of the present invention is the objective response rate (ORR), which is defined as complete response (CR) or partial response (PR).
  • Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed using a high-capacity cDNA reverse transcription kit (Thermo Fisher Scientific, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Each target gene was analyzed using gene expression analysis including forward and reverse primers and FAM-labeled MGB TaqMan probes from Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) according to previous studies.
  • the CD274 TaqMan probe (assay ID; Hs01125296_m1) spanning the exon 1-2 boundary, and the exon 3-4 boundary
  • RT-qPCR Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • PCR Polymerase chain reaction
  • Gastric FFPE tissue blocks were cut at 4 ⁇ m and stained on an Autostainer Link 48 system (Agilent Technologies) using the Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx kit (Agilent Technologies).
  • a rabbit anti-human PD-L1 monoclonal antibody (clone SP142; Ventana Medical Systems, Arlington, AZ, USA) was used as previously described.
  • the combined positive score (CPS) of PD-L1 expression in gastric cancer was calculated by dividing the number of PD-L1-stained tumor and immune cells by the total number of viable tumor cells multiplied by 100.
  • RT-qPCR RT-qPCR
  • IHC gastric cancer
  • CPS ⁇ 1 and CPS ⁇ 10 for gastric cancer and IC ⁇ 5 for urothelial cell carcinoma were used.
  • sensitivity specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV) and accuracy
  • a positive result of IHC is CPS ⁇ 1 or CPS ⁇ 10 for gastric cancer and urinary tract
  • IC ⁇ 5 was considered.
  • logistic regression was performed to evaluate response prediction based on tumor type, IHC results and RT-qPCR results.
  • PD-L1 positivity with CPS ⁇ 1 was found in 32 cases (54.2%), and CPS ⁇ 10 was found in 13 of 59 gastric cancer cases (22%).
  • PD-L1 CPS ranged from 0 to 95, with an average CPS of 9.24.
  • PD-L1 positivity with IC ⁇ 5 was confirmed in 12 of 41 urothelial carcinomas (29.3%).
  • PD-L1 IC in urothelial carcinoma ranged from 0 to 95, with an average IC of 10.46.
  • PD-L1 IHC in gastric cancer using 22C3 pharmDx and urothelial cell carcinoma using Ventana SP142 assay were shown (FIG. 2).
  • CD274 mRNA expression levels (relative quantification) in spanning exons 1-2, exons 3-4, and exons 5-6 were 0-2.4897 with an average relative quantification (RQ) of 0.1004 and 0-2.4897 with an average relative quantification of 0.2371, respectively. 7.5214 and 0-3.7064 with an average relative quantification of 0.0928.
  • AUC area under the curve
  • ORR objective response rate
  • P 0.010
  • P ⁇ 0.001 high mRNA expression of CD274
  • FIG. 5A The predictive performance of PD-L1 IHC and the receiver operating characteristic (ROC) for mRNA expression of CD274 exons 1-2 showed high discriminant ability.
  • OS overall survival
  • mRNA expression of the CD274 exon 1-2 junction did not significantly correlate with patients' progression-free survival and overall survival (FIG. 7).

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Abstract

일 양상은 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물 및 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, 면역관문억제제가 투여된 암 환자들의 암 세포 내 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과가 PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과와 유의한 상관성이 존재하고, PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과에 비해 민감도, 특이도, 양성 예측도, 음성 예측도 및 정확도가 우수하다는 것을 확인하였다. 이에, 일 양상에 따른 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물은 PD-L1에 대한 면역조직화학 보다 암 환자(특히, 위암 또는 요로상피세포암 환자)에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측력이 우수하며, 상기 조성물은 RT-qPCR을 이용하여 CD274 mRNA의 발현량을 측정함으로써 면역관문억제제의 반응성 예측에 소요되는 시간이 단축될 수 있고, 조기에 암을 진단할 수 있는 장점이 있다.

Description

암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물
암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물에 관한 것이다.
PD-L1(Programmed Death-ligand 1) 면역조직화학(IHC: immunohistochemistry)은 ICB(immune checkpoint blockade)에 대한 치료 반응을 예측하는데 널리 사용된다. 이러한 검사는 PD-L1 단백질 수준을 측정하지만 항체 클론, 염색 플랫폼 및 해석 방법에 따라 다르다. 예를 들어, 진행성 위 또는 위식도 접합부 선암종에서 PD-L1 발현의 평가는 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 분석 및 복합양성점수(CPS: combined positive score)를 사용하여 수행되지만, 전이성 비소세포폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer) 샘플 검사는 CPS 대신 종양비율점수(TPS: tumor proportion score)를 사용한다. Ventana SP142 분석은 요로상피세포암 환자에서 사용되며, 종양 미세 환경 내에서 면역 세포(IC: immune cell)를 계산하는데 사용된다. scoring method의 이러한 가변성은 임상 시험 및 임상 실습 전반에 걸쳐 결과를 혼동시켰으며, 이는 종양 유형 전반에 걸친 바이오마커로써 PD-L1 발현 수준의 보편적 가치에 대한 불확실성으로 이어진다. 또한, 비표준화된 고정 및 보관 방법을 사용하여 제조한 FFPE(formalin fixed paraffin embedded)의 보관 종양 조직의 사용은 적절한 PD-L1 항원 검색에 대한 예측 가능하고 의도된 결과를 제공하지 않을 수 있으며, 이는 잠재적으로 IHC 이질성, 강도 및 topography of staining을 증가시킬 수 있다. 이러한 모든 요인은 ICB에 대한 임상 반응을 예측하기 위해 IHC에서 평가한 PD-L1 수준의 사용을 복잡하게 만든다.
FFPE 조직에 대한 RNA 기반 분석은 현재 다양한 종양 유형에 의해 영향을 받는 환자의 재발 위험을 분류하거나 예측하기 위해 임상 환경에서 사용된다. RNA 기반 유전자 발현 분석에는 마이크로어레이(microarray), 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR: real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) 기반 분석 및 RNA 시퀀싱(RNA sequencing)이 포함된다. RT-qPCR 분석은 넓은 동적 범위, 높은 감도, 높은 특이도, 증폭 후 처리가 거의 또는 전혀 없고, 시료 처리량을 증가시킬 수 있기 때문에 가장 널리 사용되는 유전자 정량 방법 중 하나이다. 또한, 안정적으로 발현된 유전자를 표적으로 하는 고도로 특이적인 프라이머를 사용하면 높은 수준의 특이성과 감도를 제공하여, 시료 품질 관리 목적으로 유전자를 비롯한 여러 표적을 동시에 측정할 수 있다. RT-qPCR에 의한 유전자 발현 프로파일링은 최소한의 입력 요구 사항을 가지며 IHC 방법보다 훨씬 더 비용 효율적일 수 있다. 또한, RT-qPCR과 IHC 사이의 강력한 일치성은 까다로운 FFPE 종양 샘플에 대해서도 RT-qPCR의 분석적 타당성을 입증했다. 따라서 유전자 특이적 역전사를 구현하면 FFPE 샘플 코호트에서 분자 분류기의 검증 성공률이 상당히 증가할 수 있다.
이에, 본 발명자는 PD-L1 IHC와 상관 관계가 있는 CD274 mRNA 발현량을 측정하기 위해 RT-qPCR을 개발하는 것을 목표로 하였으며, 검사 시간을 줄이고 동일한 환자에서 다른 IHC 분석을 수행하는데 필요한 보관 종양 조직을 절약하는데 도움을 주고자 하였다. 이를 위해 3개의 RT-qPCR 프라이머를 설계하여 PD-L1 IHC와 결과를 비교하였고, ICI로 치료한 위암(GC: gastric cancer) 및 요로상피세포암(urothelial carcinoma) 환자에서 결과를 임상적으로 검증하였다.
일 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자를 증폭시키는 단계; 및
상기 CD274 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제의 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 용어 "암 환자"는 질환으로서 암을 보유할 수 있는 개체일 수 있고, 구체적으로 상기 "개체"는 포유류일 수 있고, 예를 들면 마우스, 쥐, 고양이, 기니피그, 햄스터, 개, 원숭이, 침팬지, 인간 등일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있다.
상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 세포 조직액 및 세포 배양액 하나 이 상 일 수 있으며, 보다 구체적으로는 조직, 세포, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 용어　"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 CD274 유전자의 발현량 측정은 PD-L1 단백질(CD274 유전자가 코딩하는 단백질) 또는 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있고, 구체적으로, CD274 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 CD274 유전자의 발현량 측정이 PD-L1 단백질의 양을 측정하는 것일 경우, 상기 "단백질의 양 측정"은 대상의 시료에서 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 구체적으로, 상기 단백질의 양 측정은 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked　immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사　면역　확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony)　면역확산법, 로케트 (rocket)　면역전기영동, 조직　면역　염색,　면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 CD274 유전자의 발현량 측정이 CD274 mRNA의 양을 측정하는 것일 경우, 상기 "mRNA의 양 측정"은 대상의 시료에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 상기 mRNA의 양 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real time RT-PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR), 역 중합효소 연쇄반응(Inverse PCR) 및 길고 정확한 중합효소 연쇄반응(Long and Accurate PCR), RNase 보호 분석법(RNaseprotection assay; RPA), 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real time RT-PCR), 실시간 정량중합효소 연쇄반응RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)일 수 있고, 보다 구체적으로는 RT-qPCR일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 제제는 상기 CD274 유전자를 포함하는 염기 서열 또는 상기 염기 서열이 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 및 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 상기 CD274 유전자를 포함하는 염기 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 CD274 유전자를 포함하는 염기 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 제제는 상기 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2의 접합부, 엑손 3 및 엑손 4의 접합부 및 엑손 5 및 엑손 6의 접합부로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 부위의 발현량을 측정하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 제제는 엑손 1 및 엑손 2의 접합부에 대한 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs01125296_m1), 엑손 3 및 엑손 4의 접합부에 대한 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs00204257_m1) 및 엑손 5 및 엑손 6의 접합부에 대한 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs01125301_m1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로브일 수 있다.
상기 용어 "프라이머(primer)"는 주형 가닥에 상보적인 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 핵산서열을 의미하며, 예를 들어, 5개 내지 50개의 핵산 서열일 수 있다. 상기 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 상기 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다.
상기 용어 "프로브(probe)"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다.
상기 용어 "앱타머(Aptamer)"란 저분자 화합물로부터 단백질까지 다양한 종류의 물질에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 작은 단일가닥핵산(DNA 혹은 RNA) 조각을 의미하며, 예를 들어, 10 내지 60 뉴클레오타이드로 이루어진 단일가닥 핵산 조각일 수 있다.
상기 용어 "항체(antibody)"란 항체는 항원과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 의미하며, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 합성 항체 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
상기 용어 "펩티드(peptide)"는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
상기 프라이머, 앱타머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등과 같은 하전되지 않은 연결체 또는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등과 같은 하전된 연결체로의 변형이 있다.
상기 항체 또는 펩티드는 천연으로부터 유래되거나, 전체 또는 일부가　합성적으로 생산될 수 있고, 합성된 서열을 포함할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 다발성 골수종, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상종양, 림프종, 방광암, 신장암, 신장세포 암종, 신장 골반 암종, 축수축 종양, 뇌간 신경교종 및 요로상피세포암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 위암 및 요로상피세포암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 용어 "암(cancer)"은 제어 불가능하게 증식하며 정상적인 신체 조직을 침투하고 파괴하는 능력을 갖는 비정상적인 세포의 발생을 특징으로 하는 질병의 부류를 지칭한다.
상기 용어 "면역관문억제제(immune　checkpoint　inhibitor)"는 면역계의 세포, 예를 들어, T 세포 및 일부 유형의　암　세포에 의해 발현되는 단백질을　억제시키거나, 차단하는 화합물, 예를 들어, 약물 (항체 포함)을 지칭한다. 상기 단백질은　면역　반응을　억제시키고, T 세포가　암　세포를 사멸시키지 못하게 차단할 수 있으며, 상기 단백질이 차단되었을 때,　면역계의　억제는 극복되고, T 세포는　암　세포를 사멸시킬 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 면역관문억제제는 PD-1, CTLA4, KIR, 4-1BB/TNFRS9, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 면역관문을 표적하는 것일 수 있고, 구체적으로는, 상기 면역관문억제제는 PD-1, CTLA4 및 LAG3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 면역관문을 표적하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 PD-1, 즉, PD-1/PD-L1을 표적하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 면역관문억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 이필리무맙, 아테졸리주맙, 트리멜리무맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로, 펨브롤리주맙, 니보루맙, 아테졸리주맙 및 더발루맙으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 용어 "반응성"은 질환 또는 장애 예를 들어,　암　발병 위험이 있거나 또는　암을 보유한 환자에게 주어진 임상적 또는 치료적 이점을 지칭하며, 상기 이점에는 하기 중 하나 이상이 포함된다: 연장된 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함); 객관적　반응의 유발 (완전 관해　또는 부분 관해　포함); 또는　암의 징후 또는 증상의 개선.
상기 "객관적　반응(objective　response)"은 측정 가능한　반응, 예를 들면 완전　관해(CR) 또는 부분 관해(PR)를 가리킨다.
상기 "완전　관해"란 치료　반응에서　암의 모든 조짐의 사라짐 (예를 들어, 모든 표적 병변의 사라짐)이 의도된다.
상기 "부분　관해"는 치료에　반응하여 하나 또는 하나 이상의　종양　또는 병변의 크기 또는 신체　암의 정도에 있어서의 감소를 지칭한다.
상기 용어 "예측"은 특정 유전자의 발현량과 같은 특징의 확인을 통해 특정 결과 예를 들어, 치료　반응성을 미리 판단하는 것을 의미할 수 있다.
일 실시예에서는 위암 또는 요로상피세포암 환자의 암 세포 내 PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과와 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과를 비교 분석한 결과, PD-L1 면역조직화학 결과와 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과가 유의한 상관성을 가짐을 확인하였다(실시예 1 참조).
또한, 일 실시예에서는 면역관문억제제로서 항 PD-1/PD-L1 제제인 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙 또는 더발루맙으로 치료된 위암 또는 요로상피세포암 환자의 암 세포 내 PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과와 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과를 비교 분석한 결과, PD-L1 면역조직화학 결과와 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과가 유의한 상관성을 가짐을 확인하였다(실시예 2 참조).
또한, 일 실시예에서는 위암 또는 요로상피세포암 환자의 생존과 위암 또는 요로상피세포암 환자의 암 세포 내 PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과 또는 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과가 유의한 상관성을 가짐을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한, 일 실시예에서는 위암 또는 요로상피세포암 환자의 암 세포 내 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과가 PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과에 비해, 민감도, 특이도, 양성 예측도(PPV), 음성 예측도(NPV) 및 정확도가 우수함을 확인하였다(실시예 4 참조).
상기 실시예 1 내지 4로 살펴 보아, 일 양상에 따른 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물은 PD-L1에 대한 면역조직화학 보다 암 환자(특히, 위암 또는 요로상피세포암 환자)에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측력이 우수함을 확인할 수 있었다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 키트를 제공한다.
상기 "암 환자", "시료", "제제", "암", "면역관문억제제" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 키트는 면역관문억제제에 대한 치료 반응성에 따라 발현이 증가 또는 감소되는 상기 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필수적 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오디트(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자를 증폭시키는 단계; 및
상기 CD274 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성을 예측하는 방법을 제공한다.
상기 "암 환자", "시료", "암", "면역관문억제제" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 CD274 유전자는 CD274 mRNA일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 CD274 유전자는 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2의 접합부, 엑손 3 및 엑손 4의 접합부 및 엑손 5 및 엑손 6의 접합부로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 부위를 포함할 수 있다.
상기 CD274 유전자의 발현량을 측정하는 것은 엑손 1 및 엑손 2의 접합부에 대한 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs01125296_m1), 엑손 3 및 엑손 4의 접합부에 대한 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs00204257_m1) 및 엑손 5 및 엑손 6의 접합부에 대한 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs01125301_m1)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 이용하여 상기 CD274 유전자 발현량을 측정하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 증폭은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real time RT-PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR), 역 중합효소 연쇄반응(Inverse PCR) 및 길고 정확한 중합효소 연쇄반응(Long and Accurate PCR)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 증폭 방법을 이용하는 것일 수 있고, 구체적으로는, RT-PCR, RT-qPCR 및 Real time PCR으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 증폭 방법을 이용하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는, RT-qPCR을 이용하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 방법에 의하면, CD274 mRNA의 발현량을 측정함으로써 면역관문억제제의 반응성 예측에 소요되는 시간이 단축될 수 있고, 암(특히, 위암 또는 요로상피세포암)을 조기에 진단할 수 있다.
또 다른 양상은 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제의 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측 용도를 제공하는 것이다.
상기 "암 환자", "시료", "암", "면역관문억제제" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따르면, 면역관문억제제가 투여된 암 환자들의 암 세포 내 CD274 mRNA에 대한 RT-qPCR 결과가 PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과와 유의한 상관성이 존재하고, PD-L1 면역조직화학(IHC) 결과에 비해 민감도, 특이도, 양성 예측도, 음성 예측도 및 정확도가 우수하다는 것을 확인하였다. 이에, 일 양상에 따른 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물은 PD-L1에 대한 면역조직화학 보다 암 환자(특히, 위암 또는 요로상피세포암 환자)에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측력이 우수하며, 상기 조성물은 RT-qPCR을 이용하여 CD274 mRNA의 발현량을 측정함으로써 면역관문억제제의 반응성 예측에 소요되는 시간이 단축될 수 있고, 조기에 암을 진단할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 엑손 1-2, 엑손 3-4 및 엑손 5-6 경계에 걸쳐 있는 CD274 및 TaqMan 프로브의 개략도를 나타내는 도이다.
도 2는 위암에서 PD-L1 면역조직화학염색 결과 및 요로상피세포암에서 SP142 분석을 사용한 결과를 나타내는 도이다.
도 3a 내지 3c는 위암 및 요로상피세포암에서 PD-L1 점수와 CD274 mRNA 발현 수준의 상관 관계를 나타내는 도이다.
도 4a 내지 4c는 위암에서 PD-L1 결합 양성 점수의 컷오프 및 요로상피세포암에서 PD-L1 면역세포의 컷오프를 나타내는 도이다.
도 5는 위암 및 요로상피세포암에서 항-PD-1/PD-L1 억제제에 대한 반응 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 위암 환자 및 요로상피세포암 환자에서 CD274의 PD-L1 발현 및 mRNA 발현 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 요로상피세포암 환자에서 RT-qPCR 및 PD-1/PD-L1 치료에 대한 환자의 생존 결과를 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예
참조예 1. 환자 및 데이터 수집
2016년 12월부터 2020년 1월까지 삼성서울병원에서 중증 위암(GC: Gastric cancer) (n = 59) 또는 요로상피세포암 (urothelial carcinoma) (n= 41)을 갖고 고식적 화학요법 (n=100) 및 추가의 항-프로그래밍된 사멸 1 (PD-1)/PD-L1 면역요법 (n= 49)으로 치료된 100명의 환자의 데이터를 소급하여 수집하였다. 평균 연령은 61.0세 (33-81세)이었고, 30명의 환자 (61.2%)는 남성이었다. 면역요법으로 치료된 49명의 환자에 대한 치료 반응은 고형 종양에서 면역 반응 평가 기준 (iRECIST: Immune Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)에 따라 6-12주마다 평가하였다. 6주 이상의 추적 기간을 갖는 환자를 포함시켰다. 본 발명의 주요 임상 종점은 완전관해 (CR: complete response) 또는 부분관해 (PR: partial response)으로 정의되는 객관적 반응률 (ORR: objective response rate)이다. 진행성 질환 (PD: progressive disease) 또는 안정한 질환 (SD: stable disease)을 갖는 환자는 무반응자(non-responders)로 분류하였다. 임상병리학적 데이터는 전자 의료 기록으로부터 소급적으로 추출하였다. 연구는 데이터 분석 및 연구 치료를 위한 구성적 기관심의 위원회 지침(IRB No. 2018-09-041-001)에 따라 수행되었고, 환자의 동의도 얻었다.
참조예 2. RNA 추출 및 RT-qPCR 수행
Total RNA는 ReliaPrep쪠 FFPE Total RNA Miniprep System (Promega, WI, USA)을 사용하여, FFPE(formalin fixed paraffin embedded) 종양 조직으로부터 분리하였다. 제조자의 지시에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였다. 각각의 표적 유전자는 이전 연구에 따라 Applied Biosystems(Thermo Fisher Scientific)의 정방향 및 역방향 프라이머와 FAM-labeled MGB TaqMan 프로브를 포함하는 유전자 발현 분석을 사용하여 분석하였다. PD-L1(Programmed death-ligand 1) IHC(immunohistochemistry)와 NanoString nCounter assay의 높은 상관 관계를 발견함으로써, 엑손 1-2 경계에 걸쳐 있는 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs01125296_m1), 엑손 3-4 경계에 걸쳐있는 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs00204257_m1) 및 엑손 5-6 경계에 걸쳐있는 CD274 TaqMan 프로브 (assay ID; Hs01125301_m1)를 선택하여 RT-qPCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하였다 (도 1). PCR(polymerase chain reaction) 증폭은 QuantStudio 6 (Thermo Fisher Scientific)에 대한 다음 조건을 사용하여 3회 반복으로 수행하였다: 50℃에서 2분 및 94℃에서 10분, 이어서 15초 동안 95℃ 및 60초 동안 60℃의 40회 사이클. 각 유전자의 mRNA 발현 수준을 2-ΔCt (ΔCt = ΔCttarget gene- ΔCtGUSB2) 방법을 사용하여 측정하였다.
참조예 3. PD-L1 IHC (면역조직화학; immunohistochemistry)
위 FFPE 조직 블록을 4 μm으로 절단하고, Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 키트(Agilent Technologies)를 사용하여 Autostainer Link 48 시스템(Agilent Technologies) 상에서 염색하였다. 요로상피세포암에 대해, 토끼 항-인간 PD-L1 모노클로날 항체 (clone SP142; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)를 이전에 설명한 것과 동일하게 사용하였다. 위암에서 PD-L1 발현의 복합양성점수(CPS: combined positive score)는 PD-L1-염색된 종양 및 면역 세포의 수를 생존 가능한 종양 세포의 총 수로 나눈 것에 100을 곱하여 계산하였다. 위암에 대해 1 및 10의 복합양성점수(CPS) 컷오프를 사용하여 RT-qPCR과 IHC 사이의 일치율을 평가하였다. 요로상피세포암에서, 5개 이상의 종양 영역을 커버하는 종양-침윤 면역 세포(IC: immune cell)는 PD-L1-양성으로 정의하였다.
참조예 4. 면역조직화학 (IHC: immunohistochemistry)과 RT-qPCR의 통계학적 분석
IHC과 RT-qPCR을 비교하기 위해, 위암의 경우 CPS ≥ 1 및 CPS ≥ 10, 요로상피세포암의 경우 IC ≥ 5를 사용하였다. 민감도, 특이도, 양성 예측도(PPV: positive predictive value), 음성 예측도(NPV: negative predictive value) 및 정확도를 계산하기 위해, IHC의 양성 결과는 위암의 경우 CPS ≥ 1 또는 CPS ≥ 10, 요로상피세포암의 경우 IC ≥ 5로 간주하였다. 또한, 로지스틱 회귀를 수행하여 종양 유형, IHC 결과 및 RT-qPCR 결과를 기반으로 반응 예측을 평가하였다.
객관적 반응률 (ORR; CR/PR) 및 질병 통제 비율 (DCR; CR/PR/SD)을 two-tailed unpaired Student's t-tests를 사용하여, CD274 mRNA RT-qPCR 결과와 비교하였다. 수신기 작동 특성(ROC: receiver operating characteristic) 곡선들이 생성되었고, 상이한 패널들의 진단 값은 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 아래의 면적(AUC: area under the ROC curve)을 계산하여 평가하였다. 무진행 생존 (PFS: progression-free survival) 및 전체 생존 (OS: overall survival)의 Kaplan-Meier 추정치를 log-rank test를 사용하여 비교하였다. 모든 그래프는 GraphPad Prism 버전 9.0(GraphPad Software Inc., San Diego, USA)을 사용하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었다. 모든 통계적 분석은 SPSS 소프트웨어 버전 27.0 (IBM Corp., Armonk, New York, USA)을 사용하여 수행하였다.
실시예
실시예 1. PD-L1 면역조직화학 (IHC: immunohistochemistry) 및 CD274 RT-qPCR 결과의 분석적 비교
22C3 pharmDx assay를 사용하여 CPS ≥ 1를 갖는 PD-L1 양성은 32건 (54.2%) 발견되었고, CPS ≥ 10은 59건의 위암 중 13건 (22%)에서 확인되었다. PD-L1 CPS의 범위는 0 내지 95이며, 평균 CPS는 9.24이다. Ventana SP142 assay를 사용하여, IC ≥ 5를 갖는 PD-L1 양성이 41개의 요로상피세포암 중 12개 (29.3%)에서 확인되었다. 요로상피세포암에서의 PD-L1 IC의 범위는 0 내지 95이며, 평균 IC는 10.46이다. 22C3 pharmDx를 사용하는 위암에서의 PD-L1 IHC 및 Ventana SP142 assay을 사용하는 요로상피세포암을 나타내었다(도 2).
스패닝 엑손 1-2, 엑손 3-4 및 엑손 5-6의 CD274 mRNA 발현 수준 (상대적 정량화)은 각각 평균 상대정량 (RQ: relative quantification)이 0.1004인 0-2.4897, 평균 상대정량이 0.2371인 0-7.5214 및 평균 상대정량 이 0.0928인 0-3.7064이다. 이들 3개의 엑손-엑손 접합부 내의 CD274 mRNA 발현 수준은 높은 상관 관계를 나타내었다 (엑손 1-2 및 엑손 3-4에 대한 스피어만 상관분석 r2=0.92; 엑손 1-2 및 엑손 5-6의 경우 r2=0.89; 엑손 3-4 및 엑손 5-6의 경우 r2=0.99) (도 3a). 평가된 모든 100개의 샘플에서, PD-L1 점수는 엑손 1-2 (r2 = 0.81), 엑손 3-4 (r2 = 0.65) 및 엑손 5-6 (r2 = 0.59)에 걸쳐 CD274 mRNA 발현 수준과 높은 상관 관계가 있었다(도 3a). 위암에서 22C3 pharmDx를 갖는 PD-L1 CPS 점수는 CD274의 엑손 1-2 (r2 = 0.81), 엑손 3-4 (r2 = 0.67) 및 엑손 5-6 (r2 = 0.62) 접합과 유의하게 상관되었다 (도 3b). 요로상피세포암에서 Ventana SP142 PD-L1 IC 점수는 CD274의 엑손 1-2 (r2 = 0.93), 엑손 3-4 (r2 = 0.82) 및 엑손 5-6 (r2 = 0.76) 접합과 유의하게 연관되었다 (도 3c).
엑손 1-2, 엑손 3-4 및 엑손 5-6 접합부에서의 CD274 mRNA 발현의 상대정량 컷오프는 위암에 대해 1 및 10의 PD-L1 CPS 컷오프 및 요로상피세포암에 대해 5의 PD-L1 IC 컷오프에 기초한 곡선 아래의 면적(AUC) 분석에 의해 평가되었다 (표 1 및 도 4a 내지 4c). 위암에서 CPS 컷오프 10에서, 최고 곡선 아래의 면적(AUC) 값은 0.0722의 컷오프를 갖는 엑손 1-2 접합부에서 CD274 mRNA 발현으로부터 얻은 0.783이었다 (P < 0.0001). 요로상피세포암에서, IC 5의 PD-L1 IC 컷오프를 기반으로 한 곡선 아래의 면적(AUC) 분석은 0.0480 (P < 0.0001)의 컷오프 값을 갖는 엑손 1-2 접합부에서 CD274 mRNA 발현으로부터 얻은 0.781의 최고 곡선 아래의 면적(AUC) 값을 나타냈다.
Test Result Test Gastric Urothelial
Immunohistochemistry 22C3 pharmDx SP142
≥1 CPS IHC 32 (54.2%)
<1 CPS IHC 27 (45.8%)
≥10 CPS IHC 13 (22.0%)
<10 CPS IHC 46 (78.0%)
≥5 IC IHC 12 (29.3%)
<5 IC IHC 29 (70.7%)
Cutoff Values of RT-qPCR
≥0.0276 RQ exon 1- exon 2 CPS ≥1 22 (37.3%)
<0.0276 RQ exon 1- exon 2 37 (62.7%)
≥0.0563 RQ exon 3- exon 4 34 (57.6%)
<0.0563 RQ exon 3- exon 4 25 (42.4%)
0.0511≥ RQ exon 5- exon 6 14 (23.7%)
<0.0511 RQ exon 5- exon 6 　 45 (76.3%) 　
≥0.0722 RQ exon 1- exon 2 CPS ≥ 10 13 (22.0%)
<0.0722 RQ exon 1- exon 2 46 (78.0%)
≥0.1966 RQ exon 3- exon 4 9 (15.3%)
<0.1966 RQ exon 3- exon 4 50 (84.7%)
≥0.0528 RQ exon 5- exon 6 13 (22.0%)
<0.0528 RQ exon 5- exon 6 　 46 (78.0%) 　
≥0.048 RQ exon 1- exon 2 IC ≥ 5 12 (29.3%)
<0.048 RQ exon 1- exon 2 29 (70.7%)
≥0.1966 RQ exon 3- exon 4 7 (17.1%)
<0.1966 RQ exon 3- exon 4 34 (82.9%)
≥0.0528 RQ exon 5- exon 6 13 (31.7%)
<0.0528 RQ exon 5- exon 6 　 　 28 (68.3%)
　 Total 59 41
RT-qPCR, quantitative real-time polymerase chain reaction; IHC, immunohistochemistry; CPS, combined positive score
실시예 2. 항-PD-1/PD-L1 억제제에 대한 환자의 반응 예측
2018년 5월부터 2020년 10월까지, 49명의 환자를 항 PD-1/PD-L1 제제로 치료하고, 치료 반응을 6주 초과의 추적 기간으로 평가하였다 (펨브롤리주맙 [n = 16], 니볼루맙[n = 16), 아테졸리주맙 [n = 13] 및 더발루맙 (n = 4)) (표 2). PD-1/PD-L1 제제에 대한 주기의 중앙값은 2021년 5월 20일 기준 8.9 (범위, 1-37)이고, 중간 추적 기간 중앙값은 11.3개월이였다. 또한, 항-PD-1/PD-L1 요법으로 치료된 환자의 임상병리학적 특성을 요약하였다(표 3).
항-PD-1/PD-L1 반응자 (CR/PR, n = 16) 및 무반응자(non-responders) (PD/SD, n= 33)는 객관적 반응률(ORR)의 iRECIST 카테고리를 사용하여 확인하였다. 그 결과, PD-L1 발현 (P = 0.010) 및 CD274 높은 mRNA 발현 (P < 0.001)은 면역요법에 대한 반응과 유의하게 연관됨을 확인하였다 (도 5A). PD-L1 IHC의 예측 성능 및 CD274 엑손 1-2의 mRNA 발현에 대한 수신기 작동 특성(ROC)는 높은 판별 능력을 나타내었다. 곡선 아래의 면적(AUC) 및 이들의 95% 신뢰 구간 (CIs: confidence intervals)은 PD-L1의 경우 0.76 (0.61 - 0.91), CD274 엑손 1-2의 mRNA 발현의 경우 0.75 (0.59 - 0.91)이었다 (도 5B). iRECIST 카테고리의 질병 통제 비율 (CR/PR/SD, n = 30 및 PD, n = 19)을 사용한 유사한 연관성은 PD-L1 발현(P = 0.015) 및 CD274 높은 mRNA 발현(P = 0.038)에 대해 관찰되어, 예측 곡선 아래의 면적(AUC)은 각각 0.70(0.55 - 0.86) 및 0.68(0.53 - 0.83)인 면역 요법에 대한 반응이다(도 5C 및 5D).
Patient
No. 		Tumor
Type 		Immune checkpoint inhibitor Objective Response CPS IC PD-L1 IHC antibody clone CD274 RQ exon 1-2,
0.0722 cut-off 		CD274 RQ exon1-2, 0.0480 cut-off PD-L1 IHC CPS 1% cut-off PD-L1 IHC CPS 10% cut-off PD-L1 IHC IC 5% cut-off
1 GC Pembrolizumab CR 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
2 GC Pembrolizumab CR 80 　 22C3 ≥0.0722 　 <1% ≥10% 　
3 GC Nivolumab PR 2 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
4 GC Pembrolizumab PR 1 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
5 GC Pembrolizumab PR 80 　 22C3 ≥0.0722 　 <1% ≥10% 　
6 GC Pembrolizumab PR 90 　 22C3 ≥0.0722 　 <1% ≥10% 　
7 GC Pembrolizumab PR 95 　 22C3 ≥0.0722 　 <1% ≥10% 　
8 GC Pembrolizumab PR 2 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
9 GC Nivolumab PR 5 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
10 GC Pembrolizumab PR 11 　 22C3 ≥0.0722 　 <1% ≥10% 　
11 GC Durvalumab SD 1 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
12 GC Pembrolizumab SD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
13 GC Pembrolizumab SD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
14 GC Pembrolizumab SD 3 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
15 GC Pembrolizumab SD 5 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
16 GC Durvalumab PD 3 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
17 GC Durvalumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
18 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
19 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
20 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
21 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
22 GC Nivolumab PD 12 　 22C3 <0.0722 　 <1% ≥10% 　
23 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
24 GC Nivolumab PD 3 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
25 GC Pembrolizumab PD 25 　 22C3 <0.0722 　 <1% ≥10% 　
26 GC Pembrolizumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
27 GC Pembrolizumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
28 GC Pembrolizumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
29 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
30 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
31 GC Nivolumab PD 0 　 22C3 <0.0722 　 <1% <10% 　
32 GC Nivolumab PD 12 　 22C3 <0.0722 　 <1% ≥10% 　
33 GC Durvalumab PD 2 　 22C3 <0.0722 　 ≥1% <10% 　
34 Urothelial Nivolumab CR 　 0 SP142 0.01153 <0.0480 　 　 <5%
35 Urothelial Atezolizumab CR 　 50 SP142 0.17342 ≥0.0480 　 　 ≥5%
36 Urothelial Atezolizumab CR 　 50 SP142 0.51228 ≥0.0480 　 　 ≥5%
37 Urothelial Nivolumab PR 　 1 SP142 0.05241 ≥0.0480 　 　 <5%
38 Urothelial Nivolumab PR 　 2 SP142 0.02822 <0.0480 　 　 <5%
39 Urothelial Atezolizumab PR 　 95 SP142 0.83284 ≥0.0480 　 　 ≥5%
40 Urothelial Atezolizumab SD 　 0 SP142 0.00000 <0.0480 　 　 <5%
41 Urothelial Atezolizumab SD 　 0 SP142 0.01535 <0.0480 　 　 <5%
42 Urothelial Atezolizumab SD 　 1 SP142 0.02038 <0.0480 　 　 <5%
43 Urothelial Atezolizumab SD 　 1 SP142 0.04487 <0.0480 　 　 <5%
44 Urothelial Atezolizumab SD 　 1 SP142 0.05112 ≥0.0480 　 　 <5%
45 Urothelial Atezolizumab SD 　 2 SP142 0.00000 <0.0480 　 　 <5%
46 Urothelial Atezolizumab SD 　 2 SP142 0.01245 <0.0480 　 　 <5%
47 Urothelial Atezolizumab SD 　 15 SP142 0.00000 <0.0480 　 　 ≥5%
48 Urothelial Atezolizumab SD 　 15 SP142 0.01742 <0.0480 　 　 ≥5%
49 Urothelial Atezolizumab PD 　 5 SP142 0.00000 <0.0480 　 　 <5%
RQ, relative quantification; IHC, immunohistochemistry; GC, gastric cancer; CR, complete response; PR, partial response; SD, stable disease; PD, progressive disease; CPS, combined positive score; IC, immune cell
　 Anti-PD-1/PD-L1 patients, No (%) Overall response rate (CR/PR), (%) P-value Disease control rate (CR/PR/SD), (%) P-value
Overall 49 16 (32.7%) 30 (61.2%)
Age 0.261 0.043
<65 30 (61.2%) 8 (26.7%) 15 (50%)
≥ 65 19 (38.8%) 8 (42.1%) 15 (78.9%)
Sex 0.045 0.001
Male 30 (61.2%) 13 (43.3%) 24 (80%)
Female 19 (38.8%) 3 (15.8%) 6 (31.6%)
Gastric cancer 33 10 (30.3%) 15 (45.5%)
PD-L1 CPS cutoff 1 18 9 (50%) 0.007 12 (66.7%) 0.007
RT-qPCR cutoff 0.0276 15 6 (40%) 0.269 10 (66.7%) 0.025
PD-L1 CPS cutoff 10 8 5 (62.5%) 0.023 5 (62.5%) 0.266
RT-qPCR cutoff 0.0722 5 5 (100%) <0.001 5 (100%) 0.008
Urothelial carcinoma 16 6 (37.5%) 15 (93.8%)
PD-L1 IC cutoff 5 6 3 (50%) 0.424 5 (83.3%) 0.182
RT-qPCR cutoff 0.0480 5 4 (80%) 0.018 5 (100%) 0.486
RT-qPCR, quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction; CR, complete response; PR, partial response; SD, stable disease; PD, progressive disease; CPS, combined positive score
실시예 3. PD-L1 IHC (면역조직화학; immunohistochemistry) 및 CD274 RT-qPCR 결과에 의한 환자 생존의 상관성
위암 환자에서, 무진행 생존 (PFS)은 엑손 1-2 접합부 (P = 0.010)에 걸친 CD274의 PD-L1 발현 (P = 0.018) 및 높은 mRNA 발현과 강하게 연관되었다 (도 6A). 유사한 연관성이 전체 생존 (OS) 및 PD-L1 발현 (P = 0.047) 사이에서 관찰되었지만, 전체 생존은 mRNA 발현 (P = 0.134)과 유의하게 연관되지 않았다 (도 6B). 요로상피세포암 환자의 경우, PD-L1 발현은 무진행 생존 (P = 0.016) 및 전체 생존 (P = 0.009) 둘 모두와 유의하게 연관되었다. 그러나, CD274 엑손 1-2 접합부의 mRNA 발현은 환자의 무진행 생존 및 전체 생존과 유의한 상관 관계가 없었다(도 7).
실시예 4. PD-L1 IHC (면역조직화학; immunohistochemistry)와 CD274 RT-qPCR 결과의 임상적 유용성
민감도, 특이도, 양성 예측도(PPV), 음성 예측도(NPV) 및 정확도의 표준 매개변수를 사용하여, PD-L1 평가의 임상 유용성을 IHC 및 RT-qPCR과 비교하였다 (표 4). 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위한 최상의 성능을 얻기 위해, 위암 샘플에서 2가지 값 (CPS ≥ 1% 및 10%; RQ ≥ 0.0276 및 ≥ 0.0772)을 사용하였다. PD-L1 CPS ≥ 1%가 최고 민감도 (90%)를 나타내었고, 평균 상대정량이 0.0722인 컷오프를 갖는 RT-qPCR은 위암에서 최고 특이도 (100%)를 나타내었다. 양성 예측도가 매우 낮음(50%)에도 불구하고, 위암 샘플(90%)에서 1% 이상의 복합양성점수로 최고 민감도가 달성되었다. 요로상피세포암에서, PD-L1 IHC에 비해 더 높은 곡선 아래의 면적(AUC) 값을 갖는 RT-qPCR로 더 높은 민감도 (66.7%) 및 특이도 (90%)를 관찰하였다.
Prediction Method Sensitivity Specificity PPV NPV AUC on ROC
(95% CI)
Gastric cancer IHC ≥ 1% 90.0% 60.9% 50.0% 93.3% 0.75 (0.58-0.93)
Gastric cancer RQ ≥ 0.0276 60.0% 60.9% 40.0% 77.8% 0.60 (0.39-0.82)
Gastric cancer IHC ≥ 10% 50.0% 87.0% 62.5% 80.0% 0.69 (0.47-0.90)
Gastric cancer RQ ≥ 0.0772 50.0% 100.0% 100.0% 82.1% 0.75 (0.54-0.96)
Urothelial carcinoma IHC ≥ 5% 50.0% 70.0% 50.0% 70.0% 0.60 (0.30-0.90)
Urothelial carcinoma RQ ≥ 0.0480 66.7% 90.0% 80.0% 81.8% 0.78 (0.52-1.00)
RQ, relative quantification; IHC, immunohistochemistry; RT-qPCR, quantitative real-time polymerase chain reaction; AUC, area under curve; ROC, receiver operating characteristic

Claims (14)

  1. 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 CD274 유전자의 발현량 측정은 CD274 mRNA의 양을 측정하는 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 CD274 유전자를 포함하는 염기 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2의 접합부, 엑손 3 및 엑손 4의 접합부 및 엑손 5 및 엑손 6의 접합부로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 부위의 발현량을 측정하는 것인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 다발성 골수종, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상종양, 림프종, 방광암, 신장암, 신장세포 암종, 신장 골반 암종, 축수축 종양, 뇌간 신경교종 및 요로상피세포암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 면역관문억제제는 PD-1, CTLA4, KIR, 4-1BB/TNFRS9, TIM3 및 LAG3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 면역관문을 표적하는 것인, 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 면역관문억제제는 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 아테졸리주맙(atezolizumab) 및 더발루맙(durvalumab)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
  9. 청구항 1의 조성물을 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 키트.
  10. 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자를 증폭시키는 단계; 및
    상기 CD274 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성을 예측하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 CD274 유전자는 CD274 mRNA인, 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 CD274 유전자는 CD274 유전자의 엑손 1 및 엑손 2의 접합부, 엑손 3 및 엑손 4의 접합부 및 엑손 5 및 엑손 6의 접합부로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 부위를 포함하는 것인, 방법.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 증폭은 RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)을 이용하는 것인, 방법.
  14. 암 환자로부터 분리된 시료 내 CD274 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 제제의 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측 용도.
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