KR101849699B1 - 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법 및 암 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀은 발현양 측정의 민감도가 높아 암 진단시 진단의 정확도가 높고, 다양한 암종의 진단에 적용이 가능하므로 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 정보 제공 방법 및 암 치료물질의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물{Composition for diagnosing or prognosising cancer comprising fibronectin protein positive exosome}

본 발명은 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법 및 암 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100㎚인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데 이것을 엑소좀이라고 부른다. 엑소좀이 어떤 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나 정상 상태 및 병적 상태 모두에서 다수의 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다. 현재까지 파이브로넥틴 양성 엑소좀을 이용한 암의 진단 또는 예후 예측에 대한 연구에 대하여 알려진 바는 없다.

파이브로넥틴 단백질(fibronectin protein)은 모든 척추동물에서 발견되며 서로 유사한 두 개의 폴리펩티드로 구성된 분자량이 250 KDa 정도인 고분자량 부착성 당단백질(adhesive glycoprotein)이다. 이의 주된 역할은 세포가 세포외 매트릭스에 부착하는 것을 용이하게 하는 것이다. 배양한 비-형질전환 세포의 표면에는 파이브로넥틴 단백질이 존재하고 형 질전환된 세포의 표면에는 존재하지 않는다는 사실은 파이브로넥틴이 중요한 부착 단백질임을 시사한다. 또한 파이브로넥틴 단백질은 헤파린, 콜라겐 및 히알루론산을 포함한 다수의 세포외 단백질에 결합하는 능력을 갖는다. 이러한 능력은 세포 표면 상에서 세포외 매트릭스의 상이한 성분 및 막-결합 피브로넥틴 수용체(인테그린)로의 결합에 의한 것이며 세포-세포 상호작용 및 세포외 매트릭스와의 세포 상호작용을 주도하게 한다. 파이브로넥틴의 다른 주요 기능은 발생, 조직 복구 및 상처 치유 동안 세포 이동, 세포 증식의 조절, 및 분화에서의 그의 관련이다(Alitalo& Vaheri, 1982, Adv. Cancer Res. 37 111; Yamada, 1983, Annu. Rev. Biochem. 62 761; Hynes, 1985, Annu. Rev. Cell Biol. 167). 파이브로넥틴의 정확한 조성은 조직형 및/또는 세포 상태에 의존적이다. 인간에서 잠재적으로 20개의 상이한 파이브로넥틴 형태가 존재하며 대부분 타입 3 모듈의 대안적인 스플라이싱으로부터 나타난다(Potts and Campbell, 1994, Curr. Opin. Cell Biol. 6 648). 파이브로넥틴 스플라이싱 변이체의 발현은 발생적으로 조절되고 조직특이적인 것으로 보인다.

한편, 종양(Tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고 무질서한 세포증식의 산물로서 이러한 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor)으로 분류하게 된다. 특히, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 유전적 질환이라고 할 수 있다.

우리나라에서 암으로 인한 사망자의 수는 2002년 국내 총 사망자 246,515명 (조사망률 인구 10만명 당 512명)가운데 25.5% (남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만명 당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협한다. 대부분의 암은 초기에는 증상이 없으며, 증상이 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람이 이를 간과하기 쉽고, 이는 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.

현재, 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있다. 또한 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써 X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사(생검)를 시행하여 그 진단율을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 검사과정이 비교적 간단하다는 장점에도 불구하고 진단 성공률이 높지 않은 문제, 위생상의 문제 및 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 문제가 있어, 이를 대체할 만한 암의 진단 방법이 필요하다.

암을 치료하기 위해서는 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기에 발견될 수 있는 것이어야 한다. 조기 진단된 암의 경우 매우 높은 완치율을 나타내기 때문이다. 따라서 비침습성이며, 고감도 및 고특이성으로 암을 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 나아가 구체적 암에 대한 예후를 예측한 맞춤형 진단 및 치료가 필요하다. 하지만 현재까지 암 진단에 있어서 초기에 특이적으로 병소를 감지하여 발병 여부를 판단하는 분자적 진단 기술은 미미한 실정이고 특정 암에 대해서는 아직까지 그 방법이 전무한 상태라고 해도 과언이 아니다.

이에 효과적인 암 진단 또는 예후 예측을 위한 진단 방법 또는 이를 진단할 수 있는 마커의 발견에 대한 필요성이 절실하다.

본 발명자는 신규한 암의 진단 또는 예후 예측용 마커를 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 이용할 경우 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 암 진단 또는 예후 예측을 대체할 수 있는 새로운 방법 또는 마커를 제공하는 것으로서, 파이브로넥틴 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트, 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법, 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파이브로넥틴 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 파이브로넥틴 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및

b) 상기 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는, 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 암 세포 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;

b) 암세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계;

c) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

d) 상기 a) 단계의 파이브로넥틴 단백질 발현과 상기 c) 단계의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀은 발현양 측정의 민감도가 높아 암 진단시 진단의 정확도가 높고, 다양한 암종의 진단에 적용이 가능하므로 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트, 정보 제공 방법 및 암 치료물질의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포의 침윤 활성을 분석한 측정 값을 나타낸 도이다.
도 3은 MDA-MB-231 세포를 속도차 원심분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 5는 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 펠렛을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 펠렛을 유세포 분석하여 그 개수 및 크기 분포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 펠렛을 투과전자현미경으로 관찰하여 직경 구조를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 불연속 밀도 구배 원심분리하여 유방암 세포의 침윤에 엑소좀이 주요 역할을 함을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 정상 MDA-MB-231 세포, shRab27a MDA-MB-231세포 및 비히클(vehicle) MDA-MB-231세포의 shRab27a 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 11은 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 12는 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 베지클 사이즈 분석기로 분석한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 13은 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 전자투과현미경으로 관찰한 것을 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 14는 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 분석을 실시한 측정값을 나타낸 도이다.
도 15는 MDA-MB-231 세포의 엑소좀에 열을 가한 후 침윤 활성을 분석한 결과값을 나타낸 도이다.
도 16은 유방암, 위암, 대장암, 폐암 환자, 일반 감염환자 및 정상인의 혈중 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 발현을 ELISA로 확인한 도이다(C : 정상인(control), T : 갑상선염(thyroiditis), G : 위염(gastritis), HB : B형 간염(hepatitis B), RA : 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), BC : 유방암(breast cancer), LC : 폐암(lung cancer), CC : 대장암(colon cancer), SC : 위암(stomach cancer)).
도 17은 혈중 파이브로넥틴 단백질을 검출하는 경우와 엑소좀 표면 파이브로넥틴 단백질을 검출하는 경우의 검출 민감도를 비교한 도이다.
도 18은 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 유방암 조기진단 및 예후 예측 진단 효과를 확인한 도이다(C : 정상인, B : 양성종양, S0-S4 : 단계별 유방암 환자, AS : 수술 후의 환자).
도 19는 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 폐암 조기진단 및 예후 예측 진단 효과를 확인한 도이다(C : 정상인, S1-S4 : 단계별 폐암 환자, B : 양성 결절).
도 20는 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 대장암 조기진단 및 예후 예측 진단 효과를 확인한 도이다(C : 정상인, S1-S4 : 단계별 대장암 환자, Un : 병기 불명).

본 발명은 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀"은 파이브로넥틴 단백질을 포함하는 엑소좀을 의미하는 것이며, 바람직하게는 파이브로넥틴 단백질이 혈중 엑소좀의 표면에 있는 경우를 의미한다.

본 발명의 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀은 정상인과 비교하였을 때 다양한 종류의 암 환자의 혈액에서 높게 발현되므로, 다양한 종류의 암 진단에 활용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 암의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 암 발명 여부 뿐만 아니라 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋을지 여부에 대해서까지 예측이 가능한 것을 의미한다.

본 발명의 파이브로넥인 단백질(fibronectin protein)은 분자량이 250 KDa 정도인 고분자량 부착성 당단백질(adhesive glycoprotein)이다.

상기 파이브로넥틴 단백질은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단백질로, 상기 단백질의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변이체는 파이브로넥틴 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

상기 파이브로넥틴 단백질은 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열로 코딩될 수 있으며, 상기 유전자 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 암은 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성 종양을 제한 없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 식도암, 치종암, 후두암, 방광암, 구강암, 자궁암 및 뇌종양을 포함하고, 더욱 바람직하게는 유방암, 위암, 대장암 및 폐암을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 키트는 RT PCR 키트, 마이크로어레이 칩(micro array chip) 키트, DNA 키트, 또는 단백질 칩 키트를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 키트는 마커 단백질에 해당하는 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀의 발현 수준을 확인하여 이를 검출함으로써 암의 진단 또는 예후 예측을 할 수 있다. 본 발명의 키트에는 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

단백질의 발현 수준 측정은 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋을지 여부에 대해서까지 예측할 수 있다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계; 를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 개체에서 분리된 시료를 의미하나, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴 블랏(Western blot), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 웨스턴 블랏은 하기와 같은 방법으로 수행될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 단백질의 양을 확인하여, 암의 진단 및 예후를 예측할 수 있다. 상기 검출 방법은 정상 대조군에서의 파이브로넥틴 단백질의 발현양과 암 의심개체에서의 파이브로넥틴 단백질의 발현양을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기 파이브로넥틴 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다.

상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA 및 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA를 포함하는 다양한 ELISA 방법을 의미한다. 더욱 구체적으로, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 다만, 이러한 검출 방법에 제한되지 않는다.

상기 단백질 칩을 이용하여 파이브로넥틴 단백질의 발현수준을 확인하는 단계는 시료에서 단백질을 분리, 상기 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성, 이를 판독하여 파이브로넥틴 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 하지만, 이러한 방법에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 a) 암 세포 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; b) 암세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; c) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 d) 상기 a) 단계의 파이브로넥틴 단백질 발현과 상기 c) 단계의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 암 치료 후보 물질의 존재 및 부존재하에서 파이브로넥틴 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 암의 치료제로서 선택할 수 있다.

즉, 암의 치료 후보 물질의 부존재시 및 존재시의 암 세포에서 엑소좀의 파이브로넥틴 단백질 발현 수준을 비교한 후, 암 진단의 마커인 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 발현 수준을 감소시키는 물질을 암의 치료제로 예측할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 암 세포의 침윤과 관련된 인자 분리 및 확인

1.1 암 세포의 침윤 분석

유방암 세포의 배양액에서 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자가 존재하는지를 확인하고, 이를 분리하기 위하여, 침윤성을 가지는 인간 유방암 세포 MDA-MB-231 및 약한 침윤성을 가지는 인간 유방암 세포 MCF-7을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 포함하는 DMEM 고농도 글루코오스(Eagle's minimal essential medium-high glucose) 배지에 각 상기 세포를 넣고 37℃에서 배양하였다. 상기 배양된 세포가 90% 이상이 되면, 1% 우태아혈청을 포함하는 배지로 교환한 후 다시 48시간 동안 배양하여 배양액을 수득하였다.

유방암 세포의 침윤 활성 분석을 수행하기 위하여, 공극 지름(pore diameter)이 8 ㎛인 웰(well)을 24 웰에 삽입하고 25%의 마트리겔(Matrigel)로 2시간동안 코팅하였다. 상기 코팅된 챔버에 10,000개의 MCF-7 세포를 넣어 챔버 상부에 깔고, 여기에 MDA-MB-231 세포 배양액 500 ㎕를 희석하여 첨가하였으며, 하부 웰에는 1% 우태아혈청을 포함하는 배지를 넣어 배양하였다. 48시간 뒤 코팅된 챔버를 통과한 MCF-7 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 현미경으로 관찰한 후 상기 통과된 MCF-7 세포를 계수하여 침윤정도를 분석하였다. 상기와 동일한 방법으로 코팅 챔버에 10,000개의 MDA-MB-231 세포를 넣어 챔버 상부에 깔고, MCF-7 배양액을 첨가하여 침윤정도를 분석하였다. 상기 침윤분석 방법에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다. 또한, 상기 침윤분석 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포 배양액과는 다르게 MDA-MB-231 세포 배양액이 MCF-7 세포의 침윤을 2-3배 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, MDA-MB-231 세포의 침윤 능력은 MDA-MB-231 배양액에 의해서 향상되었지만 MCF-7 배양액에서는 변화하지 않았음을 확인하였다. 따라서, MCF-7 배양액에 유방암 세포의 침윤에 관여하는 인자가 있음을 확인하였다.

1.2 암 세포의 침윤과 관련된 인자 분리 및 확인

상기 실시예 1.1의 결과에 따라 MDA-MB-231 세포 배양액 내에서 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자를 분리하기 위하여, 유방암 세포 배양액으로 속도차 원심분리 또는 불연속 밀도구배 원심분리를 수행하였다.

보다 구체적으로, 속도차 원심분리를 수행하기 위하여, MDA-MB-231 세포가 페트리 디쉬에 80-90%로 가득찼을 때 1% 우태아혈청을 포함하는 배지로 교환한 후 다시 48시간 동안 배양하여 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 순차적으로 300 x g에서 3 분, 1500 x g에서 15 분 및 2500 x g에서 15분 조건으로 원심분리하여 세포, 세포 파괴물 및 세포 소기관 등을 제거하였다. 상기 원심분리된 시료의 상층액을 0.2 ㎛의 필터를 이용하여 걸러내고, 100,000 x g 에서 한시간 동안 다시 원심분리하여 엑소좀 펠렛을 수득하고 이를 PBS에 녹였다. 상기 분획 과정을 도 3에 나타내었다. 상기 실시예 1.1의 침윤 활성 분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에는 MDA-MB-231 또는 MCF-7 유방암 세포를 깔았다. 여기에 대조군, MDA-MB-231 유방암 세포 배양액, 상기 수득한 엑소좀을 포함한 분획 펠렛; 또는 엑소좀이 제거된 MDA-MB-231 세포 배양액(상층액 3 + 펠렛 2, 도 3 참고) 등 총 4종류를 각각 첨가하여 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 엑소좀을 포함한 분획 펠렛(펠렛 3, 도4의 Exosomes)에서 현저하게 유방암 세포 침윤 활성이 나타났고, 엑소좀이 제거된 MDA-MB-231 세포 배양액(상층액 3 + 펠렛 2, 도 4의 w/o Exosomes) 에서는 유방암 세포 침윤 활성이 나타나지 않음을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 암 세포의 침윤에 엑소좀이 관련된다는 사실을 확인하였다.

또한, 상기 과정을 통해 수득한 엑소좀이 포함된 분획 펠렛(펠렛 3)이 엑소좀의 고유한 특성을 지니고 있는지 확인하기 위하여, CD63 및 CD9 엑소좀 마커를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였고, 유세포분석기(Flow Cytometry, FACS)를 이용하여 개수 및 크기 분포를 확인하였다. 또한, 상기 펠렛을 그리드(grid)에 부착하고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색한 후 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)(Hitachi H-7000)을 이용하여 직경 구조를 관찰하였다. 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 배양액에서 수득한 분획 펠렛 모두 CD63 및 CD9의 엑소좀 마커를 발현함을 확인하였다.

또한, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 배양액에서 수득한 분획 펠렛 내의 엑소좀이 전형적인 엑소좀의 크기를 가지고 있으며, 약 100 nm의 직경 구조를 가지고 있음을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통해 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 배양액에서 수득한 분획 펠렛은 엑소좀의 고유한 특성을 가지고 있음을 확인하였다.

상기 실험 결과를 재 검증하기 위하여, 상기 과정을 통해 수득한 엑소좀이 포함된 분획 펠렛(펠렛 3)을 불연속 밀도 구배 원심분리 하였다. 보다 구체적으로, 각 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 및 5% 농도의 OptiPrep 용액을(1.25-0.941 g/cm^-3) 튜브에 로딩한 후 상기 수득한 펠렛을 최상층에 로딩하여 210,000 ×g 에서 16시간 동안 초원심분리(ultracentrifuge)한 후, 각각의 분획을 다시 200,000 ×g에서 1시간 동안 초원심분리하여 분획물을 수득하였다. 이후, 상기 실시예 1.1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부웰에는 MCF-7 유방암 세포를 깔고, 여기에 상기 불연속 밀도 구배 원심분리를통해 수득한 각각의 분획물을 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포의 침윤 활성을 나타내는 주요 분획은 엑소좀이 포함되어 있을 것으로 예상되는 1.14-1.19 ㎎/㎖의 밀도 분획임을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통해, 유방암 세포의 침윤에 엑소좀이 주요 역할을 함을 확인하였다.

1.3 암 세포의 침윤과 엑소좀의 관련성 확인

유방암 세포의 침윤이 엑소좀과 관련성이 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에는 정상 MDA-MB-231 세포, shRNA 플라스미드를 이용한 Rab27a의 발현 저해를 통해 엑소좀의 분비를 감소시킨 MDA-MB-231 세포(shRab27a), 및 대조군으로 공벡터를 삽입한 MDA-MB-231 세포(vehicle)를 이용하였다. 상기 Rab27a는 엑소좀 방출 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 3 종류의 세포에서 Rab27a 단백질의 발현량을 확인하였으며, 107 개의 각 세포로부터 수득한 세포 배양액을 모아 원심분리하여 엑소좀 펠렛을 수득하고, 이의 단백질을 정량하였다. 또한, 상기 실시예 1.1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에는 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 대조군, 정상 MDA-MB-231 세포 배양액, 비히클(vehicle) MDA-MB-231 세포 배양액 또는 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액을 각각 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에서 엑소좀 분비는 종래에 보고된 바와 같이 대조군에 비해 40-50% 줄어들었으며, shRNA에 의해 정상적으로 Rab27a의 발현이 저해된 것을 확인하였다.

또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에 의한 MCF-7 세포의 침윤 능력은, MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 능력에 비해 50% 가량 감소됨을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통해, 유방암 세포의 침윤 능력은 엑소좀의 분비 수준과 관련이 있음을 확인하였다.

1.4 암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 침윤 특성 분석

유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

혈액 샘플은 경북대학교 병원에서 제공받았으며, 1 내지 4기의 유방암 환자의 혈액 채취는 경북대학교병원의 임상시험감사위원회의 규정에 따라 진행하였다. 서로 다른 임상단계의 유방암 환자 100명의 혈장에서 Exoquick (Systembio) 또는 플라즈마 순환 엑소좀을 분리하는 초원심분리법(UC)을 이용하여 엑소좀을 분리하였다. 상기 두 가지 방법으로 분리된 엑소좀의 특성을 웨스턴 블랏, 베지클 사이즈 분석기(Model ELS-Z (Otsuka Electronics Co.)) 및 전자투과현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 유방암 환자의 혈장에서 Exoquick 분리법(EQ) 또는 초원심분리법(UC)을 이용하여 분리한 엑소좀은 모두 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9를 발현함을 확인하였다.

또한, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 유방암 환자의 혈장에서 초원심분리법(UC)을 이용하여 분리한 엑소좀의 평균 크기는 91.1nm이고, Exoquick 분리법(EQ)을 이용하여 분리한 엑소좀의 평균 크기는 101.8nm로, 두 가지 방법으로 분리된 엑소좀 간에 유의한 크기 차이가 없음을 확인하였다.

상기 실험을 통하여, 엑소좀 분리 방법에 따른 순도 차이가 없음을 확인하였으므로, 이후 실험에서는 Exoquick 분리법을 이용하였다. 먼저, 정상인 또는 유방암 환자(0기 내지 4기), 및 유방암 제거 수술 후 환자에서 채취한 혈액을 17000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 혈장을 얻었다. 상기 원심분리한 혈장 시료에 Exoquick-Exosome Precipitation Solution (System biosciences)을 혈장 부피의 1/4만큼 넣어준 후, 2시간 동안 4℃에서 휴지시키고, 1500 ×g에서 30분간 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 엑소좀 펠렛을 PBS에 녹여 이후 실험에 이용하였다.

상기 실시예 1.1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 0기를 의미하는 상피내암(Ductal Carcinoma in Situ, DCIS) 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀(S0), 1 내지 4기 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀(S1-S4), 유방암 제거 수술 후 환자(AS)의 혈장에서 분리한 엑소좀, 또는 정상인(C)의 혈장에서 분리한 엑소좀을 각각 첨가하여 유방암 세포의 침윤 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 1 내지 4 기의 유방암 환자의 혈장 엑소좀을 처리한 군에서 정상인의 엑소좀을 처리한 군에 비해 MCF-7 세포의 침윤이 3-4 배 증가함을 확인하였다. 또한, 다른 장기나 림프 노드(lymph node)로의 전이가 일어나지 않은 0 기인 상피내암(DCIS) 상태의 환자의 혈중 엑소좀을 처리한 군 역시 높은 유방암 진행 단계 환자의 혈중 엑소좀을 처리한 군과 비슷한 수준으로 MCF-7 세포의 침윤을 유도함을 확인하였으며, 이를 통해 기관 수준에서 미세 전이가 관찰되지 않은 초기 단계의 유방암 세포에서도 이미 침윤 능력을 지닌 엑소좀이 분비될 수 있음을 확인하였다. 또한, 수술로 암 조직을 제거한 경우, 정상인과 비슷한 수준으로 혈중 엑소좀의 유방암 세포 침윤 유도 능력이 줄어듦을 확인하였다.

실시예 2 - 암 세포의 침윤 활성과 관련된 엑소좀의 특성 확인

2.1 엑소좀의 구성 요소 중 침윤을 유도하는 인자 확인

엑소좀의 단백질, RNA 및 지질 중 어느 인자가 유방암 세포의 침윤을 유도하는지 확인하기 위하여, 엑소좀을 고온으로 변성시킨 후, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1.1의 침윤 분석 방법과 동일한 방법으로, 코팅된 챔버의 상부 웰에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 대조군, MDA-MB-231 엑소좀, 90℃에서 5분간 열을 가한 MDA-MB-231 엑소좀 또는 65℃에서 5분간 열을 가한 MDA-MB-231 엑소좀을 각각 넣은 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 90℃ 또는 65℃로 열을 가한 엑소좀을 처리한 군은 열을 가하지 않은 엑소좀을 처리한 군에 비해 유방암 세포의 침윤 활성이 떨어짐을 확인하였다. 상기 실험 결과를 통하여, 열에 의해 파괴되는 것으로 보이는 엑소좀의 단백질이 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자임을 확인하였다.

2.2 엑소좀에서 파이브로넥틴 단백질의 확인

엑소좀 단백질 중 어떤 단백질이 유방암 세포의 침윤을 유도하는지 확인하기 위하여, 질량 분석기를 이용한 비 표지 정량법을 이용해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포로부터 엑소좀을 수득한 후, 각 시료에 효과적인 펩타이드화를 위하여 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 처리하고 60℃에서 20분간 환원시킨 후, 이어서 50 mM의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 처리하여 알킬화(alkylation)를 통해 엑소좀 단백질의 변성을 유도하였다. 반응이 끝난 후 엑소좀 단백질 시료에 아크릴아미드(acrylamide), 과산화황산암모늄(ammonium persulfate) 및 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine, TEMED)을 넣고 겔 상태로 만들어 굳혔다. 상기 굳은 겔을 작은 조각으로 자른 후 100 mM TEAB(triethylammonium bicarbonate) 용액 및 아세토니트릴(acetonitrile) 용액으로 세척하고 완전히 감압 건조하였다. 상기 건조된 겔 조각에 트립신(trypsin)을 처리하고 37℃에서 15시간 동안 반응시켜 펩타이드화하였다. 펩타이드를 겔에서 추출하여 염을 제거하고 nano-UPLC와 Q-Tof Premier (waters) 기기의 질량 분석법(Mass spectrometry)을 이용하여 프로테옴을 분석하였다. MASCOT 프로그램을 통해 단백질을 동정하고, IDEAL-Q 프로그램으로 정량 정보를 분석하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

번호	설명	단백질 스코어	펩티드 수	MB231/ MCF7 비율	SD
IPI00022418	FN1 (Fibronectin의 아형 1)	464	19	2,505	4,863

표 1에 나타낸 바와 같이, MCF-7 엑소좀과 비교하여 MDA-MB-231 엑소좀에서 높은 발현을 보이는 단백질을 확인하였다. 특히, MDA-MB-231 엑소좀에서 높은 발현을 보이는 단백질 중에서, 부착성 당단백질로 알려진 파이브로넥틴 단백질(fibronectin protein)을 확인하였다.

실시예 3 - 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀의 암 진단용 마커로서의 이용 가능성 확인

파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀이 암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성이 있는지 확인하기 위하여 유방암, 위암, 대장암 및 폐암 환자, 일반 염증환자와 정상인의 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀의 발현양의 차이를 비교하였다. 96 웰 플레이트에 CD63 다클론성항체(poly clonal antibody)를 밤새 방치하여 코팅한 후 각 웰을 차단(blocking) 용액으로 처리하였다. 상기 처리를 한 웰에 암 환자, 일반 염증환자 및 정상인의 혈액을 1㎕ 넣어 2시간 반응시켰다. 웰을 충분히 세척한 후 검출 항체(detection antibody)로 파이브로넥틴 단일클론항체(mono clonal antibody)를 처리하였다. ELISA 방법으로 검출한 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이 엑소좀 마커인 CD63은 모든 실험군에서 비슷한 수준으로 관찰되었고, 유방암, 폐암, 대장암, 위암 환자 혈중의 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀의 검출양이 정상인과 일반 염증환자의 검출양에 비해 크게 증가함을 확인하였다. 따라서, 혈중 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 이용하여 암을 진단할 수 있음을 확인하였다.

비교예 - 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질을 검출하는 경우 민감도의 확인

혈중 파이브로넥틴 단백질 검출과 비교할 때 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질을 검출시 검출 민감도가 우수함을 확인하기 위하여, 혈중 파이브로넥틴 단백질과 혈중 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질의 검출의 민감도를 MedCalc (MedCalc Software) 프로그램을 이용하여 비교하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다. 엑소좀 표면의 파이브로넥틴을 검출하기 위해서는 상기 실시예 3의 방법을 사용하였다.

도 17에 나타낸 바와 같이 혈중 파이브로넥틴 단백질 검출시의 AUC(Area Under the Curve)는 0.764인 반면, 혈중 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질 검출시의 AUC는 0.939이므로 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질을 검출하는 경우의 민감도가 더 좋다는 사실이 확인되었다.

따라서 암 진단시에 혈중 파이브로넥틴 단백질이 아닌 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 단백질을 이용한다면, 시료의 양이 적은 경우나 초기 암인 경우에도 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4 - 파이브로넥틴 양성 엑소좀의 조기 암 진단 및 암 치료 후 예후 예측 진단에 대한 효과

파이브로넥틴 양성 엑소좀이 조기 암 진단 및 암 치료 후 예후 예측 진단을 하는 데 효과적임을 확인하기 위하여 하기의 방법을 수행하였다. 상기 실시예 3의 방법으로 정상인 (C), 양성 종양 (B) 과 단계별 유방암 환자 (S0-S4), 수술 후의 환자 (AS) 의 혈액을 이용하여 엑소좀 표면의 파이브로넥틴을 검출하였으며 그 결과를 도 18에 나타내었다.

또한 상기 실시예 3의 방법으로 정상인 (C), 단계별 폐암 환자 (S1-S4), 양성 결절 (B)의 혈액을 이용하여 엑소좀 표면의 파이브로넥틴을 검출하였으며 그 결과를 도 19에 나타내었다.

또한 상기 실시예 3의 방법으로 정상인 (C), 단계별 대장암 환자 (S1-S4), 병기 불명 (Un)의 혈액을 이용하여 엑소좀 표면의 파이브로넥틴을 검출하였으며 그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 18 내지 20에 나타낸 바와 같이 정상인과 양성 종양의 경우에는 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 수준이 낮았고, 암의 초기 단계별로 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 양에는 큰 차이가 없었다. 이로부터 파이브로넥틴 양성 엑소좀을 이용하여 조기 암의 상태에서부터 진단이 가능함을 확인하였다. 또한 수술 후 환자의 경우에는 엑소좀 표면의 파이브로넥틴 수치가 암 환자에 비해 현저히 낮아진 것을 확인하였으며, 이를 통해 암의 치료 후 예후 예측의 진단에 이용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing or prognosising cancer comprising fibronectin protein positive exosome <130> 1_260P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2386 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys 1 5 10 15 Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys Arg Gln 20 25 30 Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val Ala Val Ser Gln Ser 35 40 45 Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr Gln Ile Asn Gln Gln 50 55 60 Trp Glu Arg Thr Tyr Leu Gly Asn Ala Leu Val Cys Thr Cys Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr 85 90 95 Cys Phe Asp Lys Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Arg Val Gly Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met Ile Trp Asp Cys Thr Cys Ile Gly Ala 115 120 125 Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala Asn Arg Cys His Glu Gly 130 135 140 Gly Gln Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Thr Trp Arg Arg Pro His Glu Thr 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu 165 170 175 Trp Thr Cys Lys Pro Ile Ala Glu Lys Cys Phe Asp His Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Trp 195 200 205 Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg Ile Thr 210 215 220 Cys Thr Ser Arg Asn Arg Cys Asn Asp Gln Asp Thr Arg Thr Ser Tyr 225 230 235 240 Arg Ile Gly Asp Thr Trp Ser Lys Lys Asp Asn Arg Gly Asn Leu Leu 245 250 255 Gln Cys Ile Cys Thr Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Lys Cys Glu Arg 260 265 270 His Thr Ser Val Gln Thr Thr Ser Ser Gly Ser Gly Pro Phe Thr Asp 275 280 285 Val Arg Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro 290 295 300 Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met 305 310 315 320 Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu 325 330 335 Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly 340 345 350 Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly 355 360 365 Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu 370 375 380 Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe 385 390 395 400 Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn 405 410 415 Gly Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr 420 425 430 Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr 435 440 445 Thr Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala 450 455 460 Ala His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile 465 470 475 480 Gly Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys 485 490 495 Thr Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser 500 505 510 Gln Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn 515 520 525 Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr 530 535 540 Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln 545 550 555 560 Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp 565 570 575 Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg 580 585 590 Gly Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser 595 600 605 Ser Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn 610 615 620 Ser His Pro Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys 625 630 635 640 Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu 645 650 655 Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys 660 665 670 Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly 675 680 685 His Gln Glu Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr 690 695 700 Pro Val Thr Ser Asn Thr Val Thr Gly Glu Thr Thr Pro Phe Ser Pro 705 710 715 720 Leu Val Ala Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Ile Thr Ala Ser Ser Phe 725 730 735 Val Val Ser Trp Val Ser Ala Ser Asp Thr Val Ser Gly Phe Arg Val 740 745 750 Glu Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Gly Asp Glu Pro Gln Tyr Leu Asp Leu 755 760 765 Pro Ser Thr Ala Thr Ser Val Asn Ile Pro Asp Leu Leu Pro Gly Arg 770 775 780 Lys Tyr Ile Val Asn Val Tyr Gln Ile Ser Glu Asp Gly Glu Gln Ser 785 790 795 800 Leu Ile Leu Ser Thr Ser Gln Thr Thr Ala Pro Asp Ala Pro Pro Asp 805 810 815 Thr Thr Val Asp Gln Val Asp Asp Thr Ser Ile Val Val Arg Trp Ser 820 825 830 Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Val Tyr Ser Pro Ser 835 840 845 Val Glu Gly Ser Ser Thr Glu Leu Asn Leu Pro Glu Thr Ala Asn Ser 850 855 860 Val Thr Leu Ser Asp Leu Gln Pro Gly Val Gln Tyr Asn Ile Thr Ile 865 870 875 880 Tyr Ala Val Glu Glu Asn Gln Glu Ser Thr Pro Val Val Ile Gln Gln 885 890 895 Glu Thr Thr Gly Thr Pro Arg Ser Asp Thr Val Pro Ser Pro Arg Asp 900 905 910 Leu Gln Phe Val Glu Val Thr Asp Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr 915 920 925 Pro Pro Glu Ser Ala Val Thr Gly Tyr Arg Val Asp Val Ile Pro Val 930 935 940 Asn Leu Pro Gly Glu His Gly Gln Arg Leu Pro Ile Ser Arg Asn Thr 945 950 955 960 Phe Ala Glu Val Thr Gly Leu Ser Pro Gly Val Thr Tyr Tyr Phe Lys 965 970 975 Val Phe Ala Val Ser His Gly Arg Glu Ser Lys Pro Leu Thr Ala Gln 980 985 990 Gln Thr Thr Lys Leu Asp Ala Pro Thr Asn Leu Gln Phe Val Asn Glu 995 1000 1005 Thr Asp Ser Thr Val Leu Val Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ala Gln Ile 1010 1015 1020 Thr Gly Tyr Arg Leu Thr Val Gly Leu Thr Arg Arg Gly Gln Pro Arg 1025 1030 1035 1040 Gln Tyr Asn Val Gly Pro Ser Val Ser Lys Tyr Pro Leu Arg Asn Leu 1045 1050 1055 Gln Pro Ala Ser Glu Tyr Thr Val Ser Leu Val Ala Ile Lys Gly Asn 1060 1065 1070 Gln Glu Ser Pro Lys Ala Thr Gly Val Phe Thr Thr Leu Gln Pro Gly 1075 1080 1085 Ser Ser Ile Pro Pro Tyr Asn Thr Glu Val Thr Glu Thr Thr Ile Val 1090 1095 1100 Ile Thr Trp Thr Pro Ala Pro Arg Ile Gly Phe Lys Leu Gly Val Arg 1105 1110 1115 1120 Pro Ser Gln Gly Gly Glu Ala Pro Arg Glu Val Thr Ser Asp Ser Gly 1125 1130 1135 Ser Ile Val Val Ser Gly Leu Thr Pro Gly Val Glu Tyr Val Tyr Thr 1140 1145 1150 Ile Gln Val Leu Arg Asp Gly Gln Glu Arg Asp Ala Pro Ile Val Asn 1155 1160 1165 Lys Val Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Asn Pro Asp Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr Thr 1185 1190 1195 1200 Pro Asp Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly Gln 1205 1210 1215 Gln Gly Asn Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser Cys 1220 1225 1230 Thr Phe Asp Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val Tyr 1235 1240 1245 Thr Val Lys Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile Ile 1250 1255 1260 Pro Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro 1265 1270 1275 1280 Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr 1285 1290 1295 Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu 1315 1320 1325 Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 1330 1335 1340 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser 1345 1350 1355 1360 Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val 1365 1370 1375 His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg 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Gly Pro Asp Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu 1585 1590 1595 1600 Gly Leu Gln Pro Thr Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn 1605 1610 1615 Pro Ser Gly Glu Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile 1620 1625 1630 Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile 1635 1640 1645 Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val 1650 1655 1660 Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro 1665 1670 1675 1680 Asp Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser 1685 1690 1695 Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln 1700 1705 1710 Pro Leu Ile Gly Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu 1715 1720 1725 Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro 1730 1735 1740 Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu 1745 1750 1755 1760 Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser 1765 1770 1775 Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val 1780 1785 1790 Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val 1795 1800 1805 Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp 1810 1815 1820 Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 1825 1830 1835 1840 Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro 1845 1850 1855 Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly 1860 1865 1870 Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp 1875 1880 1885 Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp 1890 1895 1900 Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu 1905 1910 1915 1920 Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys 1925 1930 1935 Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg 1940 1945 1950 Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu 1955 1960 1965 Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro 1970 1975 1980 Leu Ile Gly Arg Lys Lys 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<211> 8905 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cggggcgggg acagcccggc gggtctctcc tcccccgcgc cccgggcctc cagaggggcg 60 ggaggggacc gtcccatata agccccggct cccggcgctc ggacgcccgc gccggctgtg 120 ctgcacaggg ggaggagagg gaaccccagg cgcgagcggg aagaggggac ctgcagccac 180 aacttctctg gtcctctgca tcccttctgt ccctccaccc gtccccttcc ccaccctctg 240 gcccccacct tcttggaggc gacaaccccc gggaggcatt agaagggatt tttcccgcag 300 gttgcgaagg gaagcaaact tggtggcaac ttgcctcccg gtgcgggcgt ctctccccca 360 ccgtctcaac atgcttaggg gtccggggcc cgggctgctg ctgctggccg tccagtgcct 420 ggggacagcg gtgccctcca cgggagcctc gaagagcaag aggcaggctc agcaaatggt 480 tcagccccag tccccggtgg ctgtcagtca aagcaagccc ggttgttatg acaatggaaa 540 acactatcag ataaatcaac agtgggagcg gacctaccta ggcaatgcgt tggtttgtac 600 ttgttatgga ggaagccgag gttttaactg cgagagtaaa cctgaagctg aagagacttg 660 ctttgacaag tacactggga acacttaccg agtgggtgac acttatgagc gtcctaaaga 720 ctccatgatc tgggactgta cctgcatcgg ggctgggcga gggagaataa gctgtaccat 780 cgcaaaccgc tgccatgaag ggggtcagtc ctacaagatt ggtgacacct ggaggagacc 840 acatgagact ggtggttaca tgttagagtg tgtgtgtctt ggtaatggaa aaggagaatg 900 gacctgcaag cccatagctg agaagtgttt tgatcatgct gctgggactt cctatgtggt 960 cggagaaacg tgggagaagc cctaccaagg ctggatgatg gtagattgta cttgcctggg 1020 agaaggcagc ggacgcatca cttgcacttc tagaaataga tgcaacgatc aggacacaag 1080 gacatcctat agaattggag acacctggag caagaaggat aatcgaggaa acctgctcca 1140 gtgcatctgc acaggcaacg gccgaggaga gtggaagtgt gagaggcaca cctctgtgca 1200 gaccacatcg agcggatctg gccccttcac cgatgttcgt gcagctgttt accaaccgca 1260 gcctcacccc cagcctcctc cctatggcca ctgtgtcaca gacagtggtg tggtctactc 1320 tgtggggatg cagtggctga agacacaagg aaataagcaa atgctttgca cgtgcctggg 1380 caacggagtc agctgccaag agacagctgt aacccagact tacggtggca actcaaatgg 1440 agagccatgt gtcttaccat tcacctacaa tggcaggacg ttctactcct gcaccacaga 1500 agggcgacag gacggacatc tttggtgcag cacaacttcg aattatgagc aggaccagaa 1560 atactctttc tgcacagacc acactgtttt ggttcagact cgaggaggaa attccaatgg 1620 tgccttgtgc cacttcccct tcctatacaa caaccacaat tacactgatt gcacttctga 1680 gggcagaaga gacaacatga agtggtgtgg gaccacacag aactatgatg ccgaccagaa 1740 gtttgggttc tgccccatgg ctgcccacga ggaaatctgc acaaccaatg aaggggtcat 1800 gtaccgcatt ggagatcagt gggataagca gcatgacatg ggtcacatga tgaggtgcac 1860 gtgtgttggg aatggtcgtg gggaatggac atgcattgcc tactcgcagc ttcgagatca 1920 gtgcattgtt gatgacatca cttacaatgt gaacgacaca ttccacaagc gtcatgaaga 1980 ggggcacatg ctgaactgta catgcttcgg tcagggtcgg ggcaggtgga agtgtgatcc 2040 cgtcgaccaa tgccaggatt cagagactgg gacgttttat caaattggag attcatggga 2100 gaagtatgtg catggtgtca gataccagtg ctactgctat ggccgtggca ttggggagtg 2160 gcattgccaa cctttacaga cctatccaag ctcaagtggt cctgtcgaag tatttatcac 2220 tgagactccg agtcagccca actcccaccc catccagtgg aatgcaccac agccatctca 2280 catttccaag tacattctca ggtggagacc taaaaattct gtaggccgtt ggaaggaagc 2340 taccatacca ggccacttaa actcctacac catcaaaggc ctgaagcctg gtgtggtata 2400 cgagggccag ctcatcagca tccagcagta cggccaccaa gaagtgactc gctttgactt 2460 caccaccacc agcaccagca cacctgtgac cagcaacacc gtgacaggag agacgactcc 2520 cttttctcct cttgtggcca cttctgaatc tgtgaccgaa atcacagcca gtagctttgt 2580 ggtctcctgg gtctcagctt ccgacaccgt gtcgggattc cgggtggaat atgagctgag 2640 tgaggaggga gatgagccac agtacctgga tcttccaagc acagccactt ctgtgaacat 2700 ccctgacctg cttcctggcc gaaaatacat tgtaaatgtc tatcagatat ctgaggatgg 2760 ggagcagagt ttgatcctgt ctacttcaca aacaacagcg cctgatgccc ctcctgacac 2820 gactgtggac caagttgatg acacctcaat tgttgttcgc tggagcagac cccaggctcc 2880 catcacaggg tacagaatag tctattcgcc atcagtagaa ggtagcagca cagaactcaa 2940 ccttcctgaa actgcaaact ccgtcaccct cagtgacttg caacctggtg ttcagtataa 3000 catcactatc tatgctgtgg aagaaaatca agaaagtaca cctgttgtca ttcaacaaga 3060 aaccactggc accccacgct cagatacagt gccctctccc agggacctgc agtttgtgga 3120 agtgacagac gtgaaggtca ccatcatgtg gacaccgcct gagagtgcag tgaccggcta 3180 ccgtgtggat gtgatccccg tcaacctgcc tggcgagcac gggcagaggc tgcccatcag 3240 caggaacacc tttgcagaag tcaccgggct gtcccctggg gtcacctatt acttcaaagt 3300 ctttgcagtg agccatggga gggagagcaa gcctctgact gctcaacaga caaccaaact 3360 ggatgctccc actaacctcc agtttgtcaa tgaaactgat tctactgtcc tggtgagatg 3420 gactccacct cgggcccaga taacaggata ccgactgacc gtgggcctta cccgaagagg 3480 acagcccagg cagtacaatg tgggtccctc tgtctccaag tacccactga ggaatctgca 3540 gcctgcatct gagtacaccg tatccctcgt ggccataaag ggcaaccaag agagccccaa 3600 agccactgga gtctttacca cactgcagcc tgggagctct attccacctt acaacaccga 3660 ggtgactgag accaccattg tgatcacatg gacgcctgct ccaagaattg gttttaagct 3720 gggtgtacga ccaagccagg gaggagaggc accacgagaa gtgacttcag actcaggaag 3780 catcgttgtg tccggcttga ctccaggagt agaatacgtc tacaccatcc aagtcctgag 3840 agatggacag gaaagagatg cgccaattgt aaacaaagtg gtgacaccat tgtctccacc 3900 aacaaacttg catctggagg caaaccctga cactggagtg ctcacagtct cctgggagag 3960 gagcaccacc ccagacatta ctggttatag aattaccaca acccctacaa acggccagca 4020 gggaaattct ttggaagaag tggtccatgc tgatcagagc tcctgcactt ttgataacct 4080 gagtcccggc ctggagtaca atgtcagtgt ttacactgtc aaggatgaca aggaaagtgt 4140 ccctatctct gataccatca tcccagaggt gccccaactc actgacctaa gctttgttga 4200 tataaccgat tcaagcatcg gcctgaggtg gaccccgcta aactcttcca ccattattgg 4260 gtaccgcatc acagtagttg cggcaggaga aggtatccct atttttgaag attttgtgga 4320 ctcctcagta ggatactaca cagtcacagg gctggagccg ggcattgact atgatatcag 4380 cgttatcact ctcattaatg gcggcgagag tgcccctact acactgacac aacaaacggc 4440 tgttcctcct cccactgacc tgcgattcac caacattggt ccagacacca tgcgtgtcac 4500 ctgggctcca cccccatcca ttgatttaac caacttcctg gtgcgttact cacctgtgaa 4560 aaatgaggaa gatgttgcag agttgtcaat ttctccttca gacaatgcag tggtcttaac 4620 aaatctcctg cctggtacag aatatgtagt gagtgtctcc agtgtctacg aacaacatga 4680 gagcacacct cttagaggaa gacagaaaac aggtcttgat tccccaactg gcattgactt 4740 ttctgatatt actgccaact cttttactgt gcactggatt gctcctcgag ccaccatcac 4800 tggctacagg atccgccatc atcccgagca cttcagtggg agacctcgag aagatcgggt 4860 gccccactct cggaattcca tcaccctcac caacctcact ccaggcacag agtatgtggt 4920 cagcatcgtt gctcttaatg gcagagagga aagtccctta ttgattggcc aacaatcaac 4980 agtttctgat gttccgaggg acctggaagt tgttgctgcg acccccacca gcctactgat 5040 cagctgggat gctcctgctg tcacagtgag atattacagg atcacttacg gagagacagg 5100 aggaaatagc cctgtccagg agttcactgt gcctgggagc aagtctacag ctaccatcag 5160 cggccttaaa cctggagttg attataccat cactgtgtat gctgtcactg gccgtggaga 5220 cagccccgca agcagcaagc caatttccat taattaccga acagaaattg acaaaccatc 5280 ccagatgcaa gtgaccgatg ttcaggacaa cagcattagt gtcaagtggc tgccttcaag 5340 ttcccctgtt actggttaca gagtaaccac cactcccaaa aatggaccag gaccaacaaa 5400 aactaaaact gcaggtccag atcaaacaga aatgactatt gaaggcttgc agcccacagt 5460 ggagtatgtg gttagtgtct atgctcagaa tccaagcgga gagagtcagc ctctggttca 5520 gactgcagta accaacattg atcgccctaa aggactggca ttcactgatg tggatgtcga 5580 ttccatcaaa attgcttggg aaagcccaca ggggcaagtt tccaggtaca gggtgaccta 5640 ctcgagccct gaggatggaa tccatgagct attccctgca cctgatggtg aagaagacac 5700 tgcagagctg caaggcctca gaccgggttc tgagtacaca gtcagtgtgg ttgccttgca 5760 cgatgatatg gagagccagc ccctgattgg aacccagtcc acagctattc ctgcaccaac 5820 tgacctgaag ttcactcagg tcacacccac aagcctgagc gcccagtgga caccacccaa 5880 tgttcagctc actggatatc gagtgcgggt gacccccaag gagaagaccg gaccaatgaa 5940 agaaatcaac cttgctcctg acagctcatc cgtggttgta tcaggactta tggtggccac 6000 caaatatgaa gtgagtgtct atgctcttaa ggacactttg acaagcagac cagctcaggg 6060 agttgtcacc actctggaga atgtcagccc accaagaagg gctcgtgtga cagatgctac 6120 tgagaccacc atcaccatta gctggagaac caagactgag acgatcactg gcttccaagt 6180 tgatgccgtt ccagccaatg gccagactcc aatccagaga accatcaagc cagatgtcag 6240 aagctacacc atcacaggtt tacaaccagg cactgactac aagatctacc tgtacacctt 6300 gaatgacaat gctcggagct cccctgtggt catcgacgcc tccactgcca ttgatgcacc 6360 atccaacctg cgtttcctgg ccaccacacc caattccttg ctggtatcat ggcagccgcc 6420 acgtgccagg attaccggct acatcatcaa gtatgagaag cctgggtctc ctcccagaga 6480 agtggtccct cggccccgcc ctggtgtcac agaggctact attactggcc tggaaccggg 6540 aaccgaatat acaatttatg tcattgccct gaagaataat cagaagagcg agcccctgat 6600 tggaaggaaa aagacagacg agcttcccca actggtaacc cttccacacc ccaatcttca 6660 tggaccagag atcttggatg ttccttccac agttcaaaag acccctttcg tcacccaccc 6720 tgggtatgac actggaaatg gtattcagct tcctggcact tctggtcagc aacccagtgt 6780 tgggcaacaa atgatctttg aggaacatgg ttttaggcgg accacaccgc ccacaacggc 6840 cacccccata aggcataggc caagaccata cccgccgaat gtaggtgagg aaatccaaat 6900 tggtcacatc cccagggaag atgtagacta tcacctgtac ccacacggtc cgggactcaa 6960 tccaaatgcc tctacaggac aagaagctct ctctcagaca accatctcat gggccccatt 7020 ccaggacact tctgagtaca tcatttcatg tcatcctgtt ggcactgatg aagaaccctt 7080 acagttcagg gttcctggaa cttctaccag tgccactctg acaggcctca ccagaggtgc 7140 cacctacaac gtcatagtgg aggcactgaa agaccagcag aggcataagg ttcgggaaga 7200 ggttgttacc gtgggcaact ctgtcaacga aggcttgaac caacctacgg atgactcgtg 7260 ctttgacccc tacacagttt cccattatgc cgttggagat gagtgggaac gaatgtctga 7320 atcaggcttt aaactgttgt gccagtgctt aggctttgga agtggtcatt tcagatgtga 7380 ttcatctaga tggtgccatg acaatggtgt gaactacaag attggagaga agtgggaccg 7440 tcagggagaa aatggccaga tgatgagctg cacatgtctt gggaacggaa aaggagaatt 7500 caagtgtgac cctcatgagg caacgtgtta tgatgatggg aagacatacc acgtaggaga 7560 acagtggcag aaggaatatc tcggtgccat ttgctcctgc acatgctttg gaggccagcg 7620 gggctggcgc tgtgacaact gccgcagacc tgggggtgaa cccagtcccg aaggcactac 7680 tggccagtcc tacaaccagt attctcagag ataccatcag agaacaaaca ctaatgttaa 7740 ttgcccaatt gagtgcttca tgcctttaga tgtacaggct gacagagaag attcccgaga 7800 gtaaatcatc tttccaatcc agaggaacaa gcatgtctct ctgccaagat ccatctaaac 7860 tggagtgatg ttagcagacc cagcttagag ttcttctttc tttcttaagc cctttgctct 7920 ggaggaagtt ctccagcttc agctcaactc acagcttctc caagcatcac cctgggagtt 7980 tcctgagggt tttctcataa atgagggctg cacattgcct gttctgcttc gaagtattca 8040 ataccgctca gtattttaaa tgaagtgatt ctaagatttg gtttgggatc aataggaaag 8100 catatgcagc caaccaagat gcaaatgttt tgaaatgata tgaccaaaat tttaagtagg 8160 aaagtcaccc aaacacttct gctttcactt aagtgtctgg cccgcaatac tgtaggaaca 8220 agcatgatct tgttactgtg atattttaaa tatccacagt actcactttt tccaaatgat 8280 cctagtaatt gcctagaaat atctttctct tacctgttat ttatcaattt ttcccagtat 8340 ttttatacgg aaaaaattgt attgaaaaca cttagtatgc agttgataag aggaatttgg 8400 tataattatg gtgggtgatt attttttata ctgtatgtgc caaagcttta ctactgtgga 8460 aagacaactg ttttaataaa agatttacat tccacaactt gaagttcatc tatttgatat 8520 aagacacctt cgggggaaat aattcctgtg aatattcttt ttcaattcag caaacatttg 8580 aaaatctatg atgtgcaagt ctaattgttg atttcagtac aagattttct aaatcagttg 8640 ctacaaaaac tgattggttt ttgtcacttc atctcttcac taatggagat agctttacac 8700 tttctgcttt aatagattta agtggacccc aatatttatt aaaattgcta gtttaccgtt 8760 cagaagtata atagaaataa tctttagttg ctcttttcta accattgtaa ttcttccctt 8820 cttccctcca cctttccttc attgaataaa cctctgttca aagagattgc ctgcaaggga 8880 aataaaaatg actaagatat taaaa 8905

Claims (6)

1. 엑소좀의 표면에 존재하는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드로 이루어진 파이브로넥틴 단백질 양성 엑소좀을 포함하는, 대장암 또는 폐암의 조기진단 및 예후 예측용 조성물.
   
2. 제1항의 조성물을 포함하는 대장암 또는 폐암의 조기진단 및 예후 예측용 키트.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암 또는 폐암의 조기진단 및 예후 예측용 키트.
   
4. a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
   b) 상기 엑소좀의 표면에 존재하는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드로 이루어진 파이브로넥틴 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는, 대장암 또는 폐암의 조기진단 및 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 a)단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암 또는 폐암의 조기진단 및 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 b)단계의 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴 블롯(western blot), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사선확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암 또는 폐암의 조기진단 및 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
   

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