WO2020256529A1 - 신장이식 후 bk 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측을 위한 소변 엑소좀 바이오마커 - Google Patents

신장이식 후 bk 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측을 위한 소변 엑소좀 바이오마커 Download PDF

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울산대학교 산학협력단
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker related to BK virus-associated nephropathy after kidney transplantation, a composition for diagnosing BK virus infectious nephropathy or predicting the prognosis of a patient after a kidney transplant, a kit, and a BK virus infectious kidney using the same It relates to a method of providing information for diagnosing a condition or predicting a patient's prognosis after kidney transplantation.
  • BK virus is a virus belonging to papovavirus, and is morphologically similar to SV40, a papovavirus of monkeys, and the genetic composition of the genome is the same as that of SV40.
  • BK virus is mainly isolated from patients with immunological disorders, but its association with the disease is not clear. However, according to serum epidemiological investigations, the BK virus is widely infiltrated around the world. In particular, in kidney transplant patients, it is a major cause of nephropathy and hemorrhagic cystitis, and BK viral nephropathy (BKVN) causes weakened function of the transplanted kidney and failed transplantation (Pakfetrat M.
  • Urinary exosomal viral microRNA as a marker of BK virus nephropathy in kidney transplant recipients.
  • FLoS One. 2017 is known for the diagnosis of BK virus nephropathy.
  • biomarkers that can differentiate and diagnose BK virus nephropathy and transplant rejection which are complications after kidney transplantation, and use them for selection of treatment directions and determination of treatment progress after kidney transplantation. Therefore, it is urgent to find an appropriate marker that can increase the predictive power of rejection reactions and post-transplant complications after kidney transplantation.
  • the present inventors have made diligent efforts to discover non-invasive and accurate BK virus infectious nephropathy diagnostic markers or markers for predicting the prognosis of patients after kidney transplantation. Thus, the present invention was completed by identifying a new biomarker that can be diagnosed.
  • the purpose of this study is to contribute to the diagnosis of kidney transplant rejection, BK virus nephropathy, or prognostic markers to determine the course of treatment after kidney transplantation and to select an appropriate treatment method.
  • the present invention comprises any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L or a gene encoding the same, diagnosis of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or prognosis of patients after kidney transplantation It provides a biomarker composition for prediction.
  • the present invention comprises a substance for measuring the expression level of mRNA of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L or a gene encoding the protein. It provides a composition for diagnosing a condition or predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation.
  • the substance measuring the expression level of the mRNA may be a primer or probe that specifically binds to the gene.
  • the substance for measuring the expression level of the protein is an antibody, an interacting protein, a ligand, an oligopeptide, a peptide nucleic acid, which specifically binds to the protein or fragment thereof.
  • PNA PNA
  • nanoparticles or aptamers PNA
  • the present invention provides a kit for diagnosing BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation, comprising the above-described composition.
  • the present invention comprises the step of measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, Provides a method of providing information necessary for diagnosing BK virus infectious nephropathy after transplantation or predicting a patient's prognosis after kidney transplantation.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the method compares the measured protein or mRNA expression level with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a sample of a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant. If the result corresponds to any one or more selected from the group consisting of the following a) to d), it may further include the step of determining as BK virus infectious nephropathy:
  • the present invention comprises the step of measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, It provides a method of providing information necessary for determining treatment for BK virus infectious nephropathy after transplantation.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the method compares the measured protein or mRNA expression level with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a sample of a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant. If the result corresponds to any one or more selected from the group consisting of the following a) to d), it is determined as BK virus infectious nephropathy, and further comprising the step of determining to apply a treatment for BK virus infectious nephropathy.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L or a gene encoding the same in a sample isolated from an individual; b) comparing the expression level measured in step a) with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant; c) As a result of the comparison of step b), the expression level in the sample isolated from the subject in step a) was in a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant.
  • step a) If it is higher than the expression level of, determining as BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation; And d) applying a treatment for BK virus infectious nephropathy to the individual in step a). It provides a method for diagnosing and treating BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the present invention comprises any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L or a gene encoding the same, diagnosis of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or prognosis of patients after kidney transplantation It provides a biomarker composition for prediction.
  • the present invention comprises a substance for measuring the expression level of mRNA of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L or a gene encoding the protein. It provides a composition for diagnosing a condition or predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation.
  • the substance measuring the expression level of the mRNA may be a primer or probe that specifically binds to the gene.
  • the substance for measuring the expression level of the protein is an antibody, an interacting protein, a ligand, an oligopeptide, a peptide nucleic acid, which specifically binds to the protein or fragment thereof.
  • PNA PNA
  • nanoparticles or aptamers PNA
  • the present invention provides a kit for diagnosing BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation, comprising the above-described composition.
  • the present invention comprises the step of measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, Provides a method of providing information necessary for diagnosing BK virus infectious nephropathy after transplantation or predicting a patient's prognosis after kidney transplantation.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the method compares the measured protein or mRNA expression level with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a sample of a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant. If the result corresponds to any one or more selected from the group consisting of the following a) to d), it may further include the step of determining as BK virus infectious nephropathy:
  • the present invention comprises the step of measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, It provides a method of providing information necessary for determining treatment for BK virus infectious nephropathy after transplantation.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the method compares the measured protein or mRNA expression level with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a sample of a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant. If the result corresponds to any one or more selected from the group consisting of the following a) to d), it is determined as BK virus infectious nephropathy, and further comprising the step of determining to apply a treatment for BK virus infectious nephropathy.
  • the present invention comprises the steps of: a) measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L or a gene encoding the same in a sample isolated from an individual; b) comparing the expression level measured in step a) with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant; c) As a result of the comparison of step b), the expression level in the sample isolated from the subject in step a) was in a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant.
  • step a) If it is higher than the expression level of, determining as BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation; And d) applying a treatment for BK virus infectious nephropathy to the individual in step a). It provides a method for diagnosing and treating BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the treatment of BK virus infectious nephropathy in step d) is selected from the group consisting of reduction or cessation of immunosuppressants, leflunomide and cidofovir. It can be any one or more.
  • the present invention provides a method comprising: a) treating a candidate material for treating BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation in a sample isolated from an individual showing BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation; And b) measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L or a gene encoding the same; comprising, screening for a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation Provides a way.
  • the sample may be urine or urine-derived exosomes.
  • the screening method is c) the expression of mRNA of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L measured in step b) or a gene encoding the same.
  • the step of determining the candidate substance in step a) as a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation may be further included.
  • the biomarker provided in the present invention has a marked increase in expression in patients with BK virus infectious nephropathy
  • the diagnostic composition, kit, or detection method of the present invention comprising a substance for measuring the expression level of the biomarker of the present invention
  • biomarker of the present invention is differentially expressed in patients with BK virus infectious nephropathy, which is one of the common complications after transplantation or transplant rejection, BK virus infectious nephropathy is distinguished from kidney transplant rejection and diagnosed accurately and quickly. You can do it, and you can provide the information you need to decide on a treatment plan.
  • 1 is a diagram showing the selection process of biomarkers representing ABMR, TCMR and BKVN groups.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of selecting a total of 14 proteins present at the intersection site as a result of the t-test and the volcano plot as candidate biomarkers for BKVN.
  • ABMR antibody-mediated rejection group
  • TCMR T-cell mediated rejection group
  • DONOR donor group
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of final selection of four proteins whose expression patterns are significantly different from those of the ABMR group and the TCMR group among BKVN biomarker candidate substances.
  • FIG. 5 is a result of performing ROC curve analysis by analyzing the expression levels of four types of BK virus infectious nephropathy markers selected in the examples of the present invention.
  • candidate proteins were selected based on proteomic analysis.
  • proteomic analysis In the urine exosome protein quantitative analysis, a total of 1820 proteins were detected, of which 14 proteins having a remarkably different expression profile between "NOMOA group and DONOR group” and "BKVN group” were selected. Finally, four proteins showing significantly different expression patterns between the "ABMR group or TCMR group” and the BKVN group among the 14 proteins were identified.
  • HNRNPA1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No.P09651
  • MAT2B Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta, UNIPROT Accession No.Q9NZL9
  • RPS10 40S ribosomal protein S10, UNIPROT Accession No.P09651
  • CSE1L Exportin-2, UNIPROT Accession No.Q9NZL9.
  • biomarkers involved in poor prognosis after kidney transplantation namely, Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRNPA1), Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta (MAT2B), RPS10 (40S ribosomal protein S10) and CSE1L (Exportin-2 )
  • HNRNPA1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1
  • MAT2B Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta
  • RPS10 40S ribosomal protein S10
  • CSE1L Exportin-2
  • BK virus-associated nephropathy refers to kidney disease caused by BK virus, and is referred to as BK virus nephropathy or nephropathy.
  • Nephropathy refers to a condition in which a lesion has occurred in the kidney, and it refers to all cases in which the unit of the disease is not established or the lesion is unclassifiable. Mainly, it occurs as a complication of the administration of immunosuppressants in kidney transplant patients, and the BK virus invades epithelial cells of the graft gland, causing inflammation, and eventually causing a decline in the function of the transplanted kidney.
  • the BK virus infectious nephropathy may be named interchangeably with'BKVN'.
  • the term "renal allograft rejection” refers to a series of immune reactions that occur when the recipient's immune system, who has received the donor's kidney, recognizes the transplanted kidney as an external antigen. Depending on the findings, it can be classified into antibody-mediated rejection (ABMR), T cell mediated rejection (TCMR), and mixed rejection in which all of them appear in combination. have.
  • ABMR antibody-mediated rejection
  • TCMR T cell mediated rejection
  • mixed rejection in which all of them appear in combination. have.
  • the rejection reaction of the kidney transplant may include both antibody-mediated rejection, T cell-mediated rejection, and mixed rejection, and preferably acute T cell mediated rejection (TCMR). ), acute antibody-mediated rejection, chronic active antibody-mediated rejection, and mixed rejection.
  • TCMR acute T cell mediated rejection
  • biomarker discovered in the present invention is a protein that is specifically highly expressed only in BK virus infectious nephropathy, it is useful in diagnosing BK virus infectious nephropathy by distinguishing from kidney transplant rejection.
  • biomarker of the present invention refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively associated with the presence of a biological phenomenon, and the biomarker of the present invention is a protein that can confirm whether there is BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or a gene encoding the same Or, it refers to a protein that is a criterion for predicting a patient with a good or poor prognosis, or a gene encoding it.
  • Biomarkers can be derived from genomic nucleotide sequences or from expressed nucleotide sequences (eg, from RNA, nRNA, mRNA, cDNA, etc.), or from encoded polypeptides.
  • the term includes nucleic acid sequences that are complementary to or flanked by a marker sequence, such as nucleic acids used as probes or primer pairs capable of amplifying the marker sequence.
  • the biologic in the urine of a patient exhibiting BK virus infectious nephropathy (BKVN) compared to a no major abnormality (NOMOA) among kidney transplant patients.
  • BKVN BK virus infectious nephropathy
  • NOMOA no major abnormality
  • the'expression' means that a protein or nucleic acid is produced in a cell.
  • 'Protein' is used interchangeably with'polypeptide' or'peptide', for example, refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in nature.
  • 'Polynucleotide' or'nucleic acid' refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in the form of single- or double-stranded. Unless otherwise limited, also include known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to those of naturally occurring nucleotides.
  • 'mRNA' refers to RNA that transfers genetic information (gene-specific nucleotide sequence) to ribosomes that specify amino acid sequences from specific genes during protein synthesis.
  • diagnosis in the present invention is to determine the presence or occurrence of pathology of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation by measuring the level of any one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L.
  • predicting prognosis means preliminarily counting and guessing the medical outcome, and for the purposes of the present invention, the course of the disease of a patient receiving a kidney transplant (pathology, improvement, transplant rejection, drug resistance) It means to guess in advance.
  • the prognosis includes a positive prognosis (positive prognosis) or a negative prognosis (negative or poor prognosis), and in the present invention, the positive prognosis is rejection after kidney transplantation and BK virus infectious nephropathy or symptoms or diseases related thereto. It means that it does not occur, and a negative prognosis means that BK virus infectious nephropathy or related symptoms have occurred after kidney transplantation.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predicting the prognosis of a patient after kidney transplant, comprising a substance for measuring the expression level of the mRNA or protein thereof of the four biomarkers of the present invention do.
  • the composition for diagnosing or predicting prognosis of the present invention is for measuring the expression level of mRNA
  • the substance measuring the mRNA expression level is a gene encoding any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L, or It may be a set of probes or primers that specifically bind to its mRNA.
  • primer is a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group, which can form a complementary template and a base pair, and serves as a starting point for copying the template. It refers to a short functional nucleic acid sequence.
  • PCR amplification is performed using the sense and antisense primers of the genes encoding the four biomarker proteins described above to diagnose BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or patient after kidney transplantation through whether the desired product is generated. Can predict the prognosis of The PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short number of bases to several hundred bases capable of specific binding to mRNA, and is labeled You can check the presence or absence of a specific mRNA.
  • the probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
  • hybridization is performed using a probe complementary to the mRNA of the gene encoding the biomarker protein of the present invention to diagnose BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predict the prognosis of patients after kidney transplantation through hybridization. I can. Selection of suitable probes and conditions for hybridization can be modified based on those known in the art.
  • the primer or probe of the present invention can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method or other well known method.
  • Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro Amidates, carbamates, etc.) or to charged linkers (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • uncharged linkers e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro Amidates, carbamates, etc.
  • charged linkers eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • the substance measuring the expression level of the biomarker protein may be an antibody that specifically binds to any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L.
  • an antibody is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the biomarker protein of the present invention, and such an antibody is encoded by the biomarker gene by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method.
  • Proteins can be obtained and produced from the obtained proteins by conventional methods. This includes partial peptides that can be made from the protein, and the partial peptides of the present invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and any polyclonal antibody, monoclonal antibody, or any one having antigen-binding properties is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibody of the present invention also includes special antibodies such as humanized antibodies.
  • the antibody against the protein encoded by the biomarker gene of the present invention may be any antibody that can be prepared by a method known in the art.
  • the antibody used for diagnosis of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation of the present invention or detection of markers for predicting prognosis of patients after kidney transplantation is a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and may be Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, etc., but is not particularly limited thereto.
  • the present invention is the diagnosis of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation, comprising the composition for diagnosis of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation. Kits are provided.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a competitive RT-PCR kit, a real-time RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit.
  • a composition comprising an antibody that recognizes the four biomarker proteins or a primer, a probe that recognizes the mRNA of a gene encoding the biomarker protein, as well as one or more other components suitable for an analysis method Or a device may be included.
  • the kit may be a diagnostic kit, characterized in that it contains essential elements necessary to perform a reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes each primer pair specific for the gene encoding the biomarker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each gene, and is about 7 bp to 50 bp in length, more preferably about 10 bp to 30 bp in length.
  • a primer specific to the nucleic acid sequence of the control gene may be included.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (various pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitors DEPC. - May include DEPC-water, sterilized water, etc.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently labeled probe.
  • the substrate may include a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or a fragment thereof.
  • the kit for measuring the expression level of a protein in the present invention may include a substrate, an appropriate buffer solution, a secondary antibody labeled with a color developing enzyme or a fluorescent substance, and a color developing substrate for immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with polystyrene resin, and a slide glass made of glass, and the coloring enzyme is peroxidase, alkaline force. Fatase (alkaline phosphatase) can be used, FITC, RITC, etc.
  • ABTS 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • OPD o-phenylenediamine
  • TMB tetramethyl benzidine
  • the present invention comprises measuring the expression level of the mRNA of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, Provides a method of providing information necessary for diagnosing BK virus infectious nephropathy after transplantation or predicting a patient's prognosis after kidney transplantation.
  • the "individual” is an individual who has undergone a kidney transplant, and is likely to develop BK virus infectious nephropathy or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant, humans, primates including chimpanzees, dogs, cats, etc. , Livestock animals such as cattle, horses, sheep, goats, mammals such as rodents such as mice and rats, and farmed fishes may be included without limitation.
  • the "sample” used for analysis refers to BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation that can be distinguished from normal conditions such as blood, plasma, serum, saliva, nasal fluid, sputum, ascites, vaginal secretions, urine, and feces. It includes a biological sample capable of identifying a specific protein. Preferably, it may be a biological liquid sample, for example blood, serum, plasma or urine, most preferably urine or urine-derived exosomes. The sample may be prepared to increase the detection sensitivity of the protein marker.
  • the sample obtained from the patient is anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, continuous It can be pretreated using methods such as sequential extraction or gel electrophoresis.
  • the "measurement of protein expression level” refers to the presence and expression of a biomarker protein expressed in a biological sample in order to diagnose BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predict the prognosis of a patient who has undergone a kidney transplant.
  • the presence or absence of the protein may be detected or the amount of the protein may be measured using an antibody that specifically binds to the protein.
  • Antibodies specific for protein are as described in the composition for diagnosis or prognosis of the present invention.
  • the method of measuring the expression level of a protein can be used without limitation, methods known in the art, such as western blotting, dot blotting, enzyme-linked immunosorbent assay.
  • the "measurement of expression level of mRNA” refers to the presence or absence of mRNA of a gene encoding a biomarker protein in a biological sample in order to diagnose BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or to predict the prognosis of a patient who has undergone a kidney transplant. This is a process of confirming the level of expression, which can be determined by measuring the amount of mRNA. Analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RTPCR (RT-PCR), RNase protection method, northern blotting, or DNA. There is a chip (DNA chip technology) and the like, but is not limited thereto.
  • the method of providing information necessary for diagnosing BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation or predicting the prognosis of patients after kidney transplantation of the present invention is to reject the measured protein or mRNA expression level as a normal control group that did not receive a kidney transplant or after a kidney transplant. If the result of comparison with the sample of the patient group that did not show the reaction or BK virus infectious nephropathy corresponds to any one or more selected from the group consisting of the following a) to d), the step of determining as BK virus infectious nephropathy may be further included.
  • the normal control group refers to a normal person who has not received a kidney transplant, and can be interpreted as including a kidney donor (donor).
  • the patient group who did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation received a kidney transplant but exhibited stable kidney function and showed antibody-mediated rejection, T cell-mediated rejection, mixed rejection, or BK virus infectious nephropathy. It refers to patients who have not had a kidney transplant.
  • the method of providing information necessary for the diagnosis of BK virus infectious nephropathy or predicting the prognosis of a patient after kidney transplant of the present invention is
  • BK virus infectious nephropathy can be specifically diagnosed by distinguishing from antibody-mediated rejection and T cell-mediated rejection. Samples collected from patients who showed rejection after kidney transplantation and BK virus infectious kidneys after kidney transplantation BK virus infectious nephropathy can be specifically and clearly identified by obtaining and comparing the expression level or expression pattern of a protein or a gene encoding the protein in a sample taken from a patient who wants to know the presence or prognosis of the disease.
  • the present invention it is possible to accurately diagnose BK virus infectious nephropathy by distinguishing from rejection after kidney transplantation, or to predict the prognosis of patients after kidney transplantation, and to make an appropriate treatment plan according to the diagnosis or predicted prognosis. Can be obtained.
  • the present invention further comprises the step of measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, kidney transplantation Provides a method of providing information necessary for the patient's treatment decision afterwards.
  • the method of providing the information necessary for determining the treatment of a patient after kidney transplantation of the present invention is to determine the measured protein or mRNA expression level in a normal control group who did not receive a kidney transplant, or a patient group who did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation. If the result of comparison with the sample corresponds to any one or more selected from the group consisting of the following a) to d), it is determined as BK virus infectious nephropathy, and the step of determining to apply a treatment for BK virus infectious nephropathy. May additionally include:
  • the present invention provides a method for diagnosing and treating BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation.
  • the method for diagnosis and treatment of BK virus infectious nephropathy includes the following steps:
  • step b) comparing the expression level measured in step a) with a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant;
  • step c) As a result of the comparison of step b), the expression level in the sample isolated from the subject in step a) was in a sample of a normal control group that did not receive a kidney transplant or a patient group that did not show rejection or BK virus infectious nephropathy after a kidney transplant. If it is higher than the expression level of, determining as BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation; And
  • step a applying the BK virus infectious nephropathy therapy to the individual in step a).
  • the treatment of BK virus infectious nephropathy in step d) is reduced or stopped of immunosuppressants, leflunomide and cidofovir It may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto, and as described above, an appropriate treatment may be selected under the judgment of a person skilled in the art or a clinician.
  • the present invention provides a method comprising: a) treating a candidate material for treating BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation in a sample isolated from an individual showing BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation; And b) measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L or a gene encoding the same; comprising, screening for a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation Provides a way.
  • the screening method of the therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation of the present invention comprises: c) any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L measured in step b), or mRNA of a gene encoding the same.
  • the step of determining the candidate substance in step a) as a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation may be further included.
  • it is a method of comparing the increase or decrease of the mRNA or protein expression of a marker in the presence and absence of a candidate for treatment of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation.It is useful for screening a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation. Can be used.
  • biomarker proteins of the present invention or genes encoding the same in a biological sample isolated from a patient who showed BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation in the absence of therapeutic candidates for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation. And the expression level of the four biomarker proteins of the present invention or the gene encoding the same in the presence of a therapeutic candidate, and comparing both, the expression level in the presence of the therapeutic candidate Substances that reduce the level of expression in the absence can be selected as a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation.
  • the method of providing information necessary for the diagnosis of BK virus infectious nephropathy after kidney transplantation of the present invention or for predicting the prognosis of a patient after kidney transplantation, a method of providing information necessary for determining the treatment of patients after kidney transplantation, and BK virus infectivity after kidney transplantation Any screening method for a therapeutic agent for nephropathy may include an in vitro method performed on a sample isolated from an individual.
  • the screening method for a therapeutic agent for BK virus infectious nephropathy is performed in vivo, it is intended for mammals other than humans, and not for humans or human bodies.
  • urine samples were centrifuged at 4,000 rpm and 4° C. for 15 minutes, and exo Stored at -80°C until extracting moth was used in the experiment.
  • the frozen urine samples were thawed by 15 mL each, vortexed for 1 minute, and then centrifuged at 17,000xg for 15 minutes at room temperature, and the supernatant (SN1) was collected.
  • SN1 was ultracentrifuged at 200,000xg for 70 min at room temperature using a Beckman Coulter Optima L-80xp ultracentrifuge, rotor SW40Ti (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). The supernatant was discarded and the pellet was washed by dissolving in 11 mL of DPBS, followed by ultracentrifugation again at 200,000xg for 70 minutes at room temperature. The supernatant was discarded and the exosome pellet was used for protein separation or exosome particle quantification.
  • Sample preparation for proteomic analysis was subjected to freeze drying, protein solubilization and digestion.
  • the resulting peptide mixture was desalted, dried using C18 reverse phase chromatography, and then analyzed by high resolution mass spectrometry combined with nano-flow liquid chromatography.
  • LFQ label free quantitation
  • a protein as a biomarker candidate is summarized in [Fig. 1].
  • a t-test was used to select proteins with significantly different mean abundances compared to the NOMOA and DONOR groups.
  • a volcano plot was used to select proteins showing a difference of at least 2 times compared to the NOMOA group.
  • the overlapping proteins were selected from the two analyzes and compared again with the other two pathological groups to compare the significant difference in mean abundance. All analyzes were performed with a cut off of p ⁇ 0.05.
  • the final candidate proteins were selected based on the T test analysis in order to discover specific exosome proteins in each of the ABMR, BKVN and BKVN groups.
  • proteins that are specifically expressed only in the BKVN group compared to the NOMOA group or the DONOR group among urine exosome proteins only the proteins whose expression profile differs by more than 2 times compared to the NOMOA group are selected as shown in Table 1 above. Fourteen proteins were first selected.
  • HNRNPA1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No.P09651
  • MAT2B Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta, UNIPROT Accession No.Q9NZL9
  • RPS10 40S ribosomal protein S10, UNIPROT Accession No.P09651
  • CSE1L Exportin-2, UNIPROT Accession No.Q9NZL9.
  • ROC curve analysis was performed to evaluate the potential of biomarkers that can distinguish between NOMOA, ABMR, TCMR and BKVN groups, and are shown in FIG. 5 . As a result, it was confirmed that the area under the curve was 0.5 or more in all biomarkers, and showed very high levels of sensitivity and specificity.

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Abstract

본 발명은 비침습적인 BK 바이러스 감염성 신병증 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 키트, 상기 마커 조성물을 이용하여 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법, 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료 방법, 그리고 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측을 위한 소변 엑소좀 바이오마커
본 발명은 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 (BK virus-associated nephropathy)과 관련된 바이오마커, BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물, 키트 및 이를 이용하여 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
장기이식 분야는 서서히 정밀 의료의 일부가 되고 있다. 현재의 표준 면역 억제 치료를 사용할 때 여전히 신장 이식을 받은 환자의 15 ~ 20%에서 급성 거부 반응이 발생하며, 현재까지는 혈청 크레아틴의 농도 증가 또는 새로운 단백뇨의 발현 등이 생길 경우 조직 생검을 통해 진단된다. 혈청 크레아틴 농도 증가 또는 새로운 단백뇨 발현이 있는 시점에서의 신장 상태는 이미 염증이 꽤 진행된 상태이기 때문에, 무증상의 거부반응(subclinical acute rejection)을 조기 발견할 수 있는 바이오마커의 필요성이 대두된다. 선천적/후천적 면역 반응은 조직학적 수준에서 나타나기 전에 분자 수준에서 먼저 나타난다고 알려져 있다. 따라서 신장이식 후에 임상적 상태를 미리 진단하고 모니터링하기 위한 비침습적 바이오마커의 개발은 정밀 의료에 필수적인 단계이다.
BK 바이러스(BKV)는 파포바바이러스(papovavirus)에 속하는 바이러스로서, 원숭이의 파포바바이러스인 SV40과 형태적으로 유사하며, 유전체의 유전자구성은 SV40과 동일하다. BK 바이러스는 면역이상이 있는 환자에서 주로 분리되는데, 질환과의 관련성은 분명하지 않다. 그러나, 혈청역학적조사에 따르면 BK 바이러스는 세계각국에서 광범위하게 침음하고 있다고 한다. 특히, 신장이식환자에서는 신병증(nephropathy) 및 출혈성 방광염(hemorrhagic cystitis)을 야기하는 주요 원인인데, BK 바이러스성 신병증(BKVN)은 이식된 신장의 기능 약화 및 이식 실패를 야기한다(Pakfetrat M. et al., Int J Organ Transplant Med 2015; 6: 77-84). 신장이식환자에서 BK 바이러스의 감염 비율은 1 내지 10% 사이이며, 이식 결손 빈도는 10 내지 80%로 알려져 있다. 이에, 초기 치료를 위한 BKV 감염의 적절하고 정확한 진단이 매우 중요한 실정이다.
BK 바이러스 신병증의 진단과 관련하여 소변 엑소좀 miRNA 마커가 알려져 있다(KIM et al., Urinary exosomal viral microRNA as a marker of BK virus nephropathy in kidney transplant recipients. FLoS One.2017). 그러나, 신장이식 후 합병증인 BK 바이러스 신병증과 이식거부반응을 구별하여 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하고 이를 신장이식 후 치료 방향의 선택 및 치료 경과 판단에 활용하고자 하는 연구는 전무하다. 이에, 신장이식 후 거부반응과 이식 후 합병증 진단의 예측력을 높일 수 있는 적절한 마커를 발굴하는 것이 절실한 실정이다.
본 발명자들은 비-침습적이고 정확한 BK 바이러스 감염성 신병증 진단 마커 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측을 위한 마커를 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 프로테오믹스 접근법을 통해 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 감염성 신병증을 구별하여 진단할 수 있는 새로운 바이오마커를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서는 신장 이식 후 주요 이상이 없는 군(NOMOA), 항체 매개성 거부반응군(ABMR), T세포 매개성 거부반응군(TCMR) 및 BK 바이러스 감염성 신병증군(BKVN)의 소변 엑소좀 내에서 신장이식 거부반응 진단, BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측 표지자를 발굴함으로써 신장이식 후 치료 경과를 판단하고 적절한 치료 방법을 선택하는데 기여하고자 한다.
일 양태로, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) HNRNPA1의 상향 조절; b) MAT2B의 상향 조절; c) RPS10의 상향 조절; 및d) CSE1L의 상향 조절.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하고, BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법을 적용하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) HNRNPA1의 상향 조절; b) MAT2B의 상향 조절; c) RPS10의 상향 조절; 및d) CSE1L의 상향 조절.
또 다른 양태로서, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료와 비교하는 단계; c) 상기 b) 단계의 비교 결과, a) 단계의 개체로부터 분리한 시료에서의 발현 수준이 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료에서의 발현 수준보다 높은 경우, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계; 및 d) 상기 a) 단계의 개체에게 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법을 적용하는 단계;를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
일 양태로, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) HNRNPA1의 상향 조절; b) MAT2B의 상향 조절; c) RPS10의 상향 조절; 및d) CSE1L의 상향 조절.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하고, BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법을 적용하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) HNRNPA1의 상향 조절; b) MAT2B의 상향 조절; c) RPS10의 상향 조절; 및d) CSE1L의 상향 조절.
또 다른 양태로서, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료와 비교하는 단계; c) 상기 b) 단계의 비교 결과, a) 단계의 개체로부터 분리한 시료에서의 발현 수준이 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료에서의 발현 수준보다 높은 경우, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계; 및 d) 상기 a) 단계의 개체에게 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법을 적용하는 단계;를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계의 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법은 면역억제제의 감량 또는 중단, 레플루노미드 (leflunomide) 및 시도포비어 (cidofovir)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 a) 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타낸 개체로부터 분리한 시료에 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 c) 상기 b) 단계에서 측정된 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 후보물질을 처리하기 전보다 하향 조절되는 경우, 상기 a) 단계의 후보물질을 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 바이오마커는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내는 환자에서 현저하게 발현이 증가하므로, 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 본 발명의 진단용 조성물, 키트 또는 검출 방법을 통해 BK 바이러스 감염성 신병증 발병여부 또는 신장이식 후 환자의 예후를 정확하고 신속하게 진단 또는 예측 할 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커는 이식거부반응 또는 이식 후 흔히 나타나는 합병증 중 하나인 BK 바이러스 감염성 신병증 환자에서 차별적으로 발현되므로, BK 바이러스 감염성 신병증을 신장이식 거부반응과 구별하여 정확하고 신속하게 진단할 수 있으며, 이후 치료방침을 결정하는 데 필요한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 ABMR, TCMR 및 BKVN 군을 대표하는 바이오마커의 선발 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 t-테스트 결과와 볼케이노 플롯 결과 교차 부위에 존재하는 총 14개 단백질을 BKVN의 바이오마커 후보 물질로 선발한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 t-테스트를 사용하여 주요 이상이 없는 군(NOMOA) 및 공여자군(DONOR)과 비교하여 항체 매개성 거부반응군(ABMR), T세포 매개성 거부반응군(TCMR) 및 BK 바이러스 감염성 신병증군(BKVN)에서 각각 63개, 108개 및 53개의 소변 엑소좀 단백질이 다른 군과 유의적으로 상이하게 발현되는 것을 확인한 결과를 벤다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 4는 BKVN 바이오마커 후보 물질 중 ABMR군 및 TCMR군 단백질과 비교하여 현저하게 발현 양상이 차이가 나는 단백질 4종을 최종 선정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 선정한 BK 바이러스 감염성 신병증 마커 4종의 발현량을 분석하여 ROC 곡선 분석을 수행한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 신장이식 환자 및 기증자의 소변 샘플에서 특정 엑소좀 단백질의 발견을 위해, 프로테오믹스 분석을 기반으로 후보 단백질을 선택했다. 소변 엑소좀 단백질 정량 분석에서 총 1820개의 단백질이 검출되었고, 이중 "NOMOA군 및 DONOR군"과 "BKVN군" 간에 발현 프로파일이 현저하게 차이가 나는 단백질 14종을 선택했다. 마지막으로, 14종 단백질 중 "ABMR군 또는 TCMR군"과 BKVN군 사이에 유의적으로 서로 다른 발현 양상을 나타내는 4개의 단백질을 확인하였다. 확인된 단백질은 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이 HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No.P09651), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta, UNIPROT Accession No.Q9NZL9), RPS10(40S ribosomal protein S10, UNIPROT Accession No.P46783) 및 CSE1L(Exportin-2, UNIPROT Accession No.Q9NZL9)였다.
이에, 본 발명에서는 신장이식 후 불량한 예후에 관여하는 선별된 바이오마커, 즉, HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10(40S ribosomal protein S10) 및 CSE1L(Exportin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다. 이를 이용하여 신장이식 후 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤형 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 신장이식 환자의 사망률을 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 용어 "BK 바이러스 감염성 신병증"(BK virus-associated nephropathy; BKVN)은 BK 바이러스에 의해 야기되는 신장병을 의미하며, BK 바이러스 신장병 또는 신장병증 등으로 불린다. 신병증은 신장에 병변이 생긴 상태를 의미하는데, 질환의 단위가 확립되지 않거나 병변이 분류불능인 경우를 모두 총칭한다. 주로, 신장이식 환자에서 면역억제제 투여에 의한 합병증으로 발병되며, BK 바이러스는 이식선의 상피 세포를 침범하여 염증을 일으키고, 결국 이식된 신장의 기능 저하를 야기한다. 본 명세서에서, 상기 BK 바이러스 감염성 신병증은 'BKVN'과 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명에서 용어 "신장이식의 거부반응(renal allograft rejection)"은 공여자의 신장을 이식 받은 수여자의 면역 체계가 이식신장을 외부 항원으로 인식하여 일어나는 일련의 면역 반응을 의미하며, 발생기전과 신생검 소견에 따라 항체-매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR), T 세포 매개성 거부반응(T cell mediated rejection, TCMR), 및 이들 모두가 복합적으로 나타나는 혼합 거부반응(mixed rejection)으로 분류될 수 있다.
본 발명에서 상기 신장이식의 거부반응은 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응 및 혼합 거부반응을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 급성 T 세포 매개 거부 반응(Acute T cell mediated rejection, TCMR), 급성 항체-매개 거부반응(acute antibody mediated rejection), 만성 활성형 항체-매개 거부반응(chronic active antibody mediated rejection) 및 혼합 거부반응(mixed rejection)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서는 발굴된 바이오마커는 BK 바이러스 감염성 신병증에만 특이적으로 높게 발현되는 단백질이므로, 신장이식 거부반응과 구별하여 BK 바이러스 감염성 신병증을 진단하는데 유용하다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증이 있는지 확인할 수 있는 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 혹은 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 바이오마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 신장이식 환자들 중에서 조직검사 상 주요한 이상소견이 없는 정상 대조군(no major abnormality, NOMOA)과 비교하여 BK 바이러스 감염성 신병증(BKVN)을 나타내는 환자의 소변에서 상기 바이오마커들이 특이적으로 발현하였음을 확인함으로써 상기 바이오마커들이 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단마커로서 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 상기 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA를 의미한다.
본 발명에 있어서, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하여 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 병리 존재 또는 발생 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에 있어서, "예후 예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 신장을 이식받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 이식거부반응, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다. 또한, 상기 예후는 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 또는 불량한 예후)를 포함하며, 본 발명에서 양성적 예후는 신장이식 후 거부반응 및 BK 바이러스 감염성 신병증 또는 이와 관련된 증상이나 질환이 발생하지 않는 것을 의미하고, 음성적 예후는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 또는 관련 증상이 발생한 것을 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 4종의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단 또는 예후 예측용 조성물이 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 mRNA 발현 수준을 측정하는 물질은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 전술한 4종의 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 진단하거나 신장이식 후 환자의 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 진단하거나 신장이식 후 환자의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
한편, 본 발명에서 상기 바이오마커 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
상기 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 상술한 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
본 발명의 키트에는 상기 4종의 바이오마커 단백질을 인식하는 항체 또는 상기 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA를 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분을 포함하는 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 양태로서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로, 본 발명에서 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, "개체"는 신장이식을 받은 개체로서, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증이 나타날 가능성이 있거나 또는 BK 바이러스 감염성 신병증이 나타난 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축 동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물, 소변, 대변 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증에 특이적 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있으며, 가장 바람직하게는 소변 또는 소변 유래 엑소좀일 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "단백질의 발현수준 측정"은 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 진단하거나 신장이식을 받은 환자의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 발현된 바이오마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 존재 여부를 검출하거나 단백질의 양을 측정할 수 있다. 단백질에 특이적인 항체는 본 발명의 진단 또는 예후 예측용 조성물에 서술한 바와 같다. 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 "mRNA의 발현수준 측정"은 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 진단하거나 신장이식을 받은 환자의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) HNRNPA1의 상향 조절;
b) MAT2B의 상향 조절;
c) RPS10의 상향 조절; 및
d) CSE1L의 상향 조절.
상기 정상 대조군이란 신장이식을 받지 않은 정상인을 의미하며, 신장 기증자 (공여자)를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군은 신장이식을 받았지만 안정적인 신장 기능이 발휘되며 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응, 혼합 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증이 나타나지 않은 상태의 신장이식 환자 등을 의미한다. 이들 정상 대조군 및 환자로부터 채취한 시료와 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 존재 또는 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
나아가, 본 발명의 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법은
항체 매개성 거부반응 및 T세포 매개성 거부반응과 구별하여 BK 바이러스 감염성 신병증을 특이적으로 진단할 수 있는바, 신장이식 후 거부반응을 나타낸 환자군으로부터 채취한 시료와 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 존재 또는 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 BK 바이러스 감염성 신병증을 특이적으로 명확하게 규명할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의하면 신장이식 후 거부반응과 구별하여 BK 바이러스 감염성 신병증을 정확하게 진단하거나, 신장이식 후 환자의 예후를 예측할 수 있고, 진단 또는 예측된 예후에 따라 적절한 치료 계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다.
이에, 본 발명은 또한, 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하고, BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법을 적용하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다:
a) HNRNPA1의 상향 조절;
b) MAT2B의 상향 조절;
c) RPS10의 상향 조절; 및
d) CSE1L의 상향 조절.
본 발명의 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법에 있어서, BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법을 적용하는 것으로 결정된 이후에는, BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법으로 공지된 다양한 치료법을 단독 또는 조합하여 환자에게 적절하게 적용할 수 있다.
예를 들어, 면역억제제의 감량 또는 중단, 레플루노미드 (leflunomide) 및 시도포비어 (cidofovir) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당해 기술분야의 통상의 기술자 또는 임상의 판단 하에 적절한 치료법을 선택할 수 있다.
이에 따라, 추가의 측면에서 본 발명은 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료와 비교하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 비교 결과, a) 단계의 개체로부터 분리한 시료에서의 발현 수준이 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료에서의 발현 수준보다 높은 경우, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계; 및
d) 상기 a) 단계의 개체에게 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법을 적용하는 단계.
본 발명의 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법에 있어서, 상기 d) 단계의 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법은 면역억제제의 감량 또는 중단, 레플루노미드 (leflunomide) 및 시도포비어 (cidofovir)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전술한 바와 같이 당해 기술분야의 통상의 기술자 또는 임상의 판단 하에 적절한 치료법을 선택할 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 a) 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타낸 개체로부터 분리한 시료에 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법은 c) 상기 b) 단계에서 측정된 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 후보물질을 처리하기 전보다 하향 조절되는 경우, 상기 a) 단계의 후보물질을 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료 후보물질의 존재 및 부존재 하에서 마커의 mRNA 또는 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료제를 스크리닝 하는데 유용하게 사용할 수 있다.
즉, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료 후보물질의 부존재 하에 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내었던 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 본 발명의 4종의 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 또한 치료 후보물질의 존재 하에서 본 발명의 4종의 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 치료 후보물질이 존재할 때의 발현 수준을 부재 하에서의 발현 수준보다 감소시키는 물질을 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제로 선택할 수 있다.
본 발명의 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법, 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 치료제의 스크리닝 방법은 모두 개체로부터 분리된 시료에서 수행되는 생체 외 (in vitro) 방법을 포함할 수 있다.
다만, 생체 내 (in vivo)에서 BK 바이러스 감염성 신병증의 치료제 스크리닝 방법이 수행되는 경우, 인간을 제외한 포유동물을 대상으로 하며, 인간 (human) 또는 인체 (human body)를 대상으로 하지 않는다.
본 발명에 따른 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법 및/또는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법에 대한 다른 구체적인 내용은 전술한 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
환자의 선발 및 소변 시료의 준비
BK 바이러스 감염성 신병증을 진단하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위하여, 신장이식 후 5년 이내 징후 생검 (indication biopsy)을 시행받은 환자 및 기증자를 포함하여 전체 60명을 대상으로 생검 2~3 시간 전에 소변 시료를 수집하였다. 또한 생체 신장 기증자로부터 신장 기증수술 직전에 소변 시료를 수집하였다. 환자들은 생검의 병리학적인 진단에 따라 5 군으로 분류되었다; BK 바이러스 감염성 신병증 (BKVN) 군 12개, T 세포 매개성 거부반응 (TCMR) 군 8개, BK 바이러스 감염성 신병증 (BKVN) 군 5개, 주요 이상이 없는 (NOMOA) 군 11개, 및 기증자 (DONOR) 군 24개. 혼합된 동종 이병성 병변을 가진 환자의 소변은 제외하였다. 이 연구는 아산 병원 의료기관 평가위원회의 승인을 받아 진행하였으며, 모든 환자에게서 서면 동의를 받았다.
[실시예 2]
소변 시료의 가공 및 엑소좀의 분리
준비된 소변 시료로부터 이전에 보고된 Pisitkun et al. (2004) 및 Alvarez et al. (2012)의 방법을 약간 수정하여 계단식 초 원심 분리(step-wise ultracentrifugation) 방법으로 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, 각 실험 참가자로부터 30 mL 이상의 소변 시료를 수집하였으며, 각각의 소변 시료에 400 μl 프로테아제 저해제 혼합물 [50 μM 4-(2-animoethyl) benzensulfonyl fluoride hydrolchloride(AEBSF-HCl, 시그마 알드리치), 2 μM Leupeptin-hemisulfate(시그마 알드리치), 및 3.3 mM Sodium azide(시그마 알드리치)]를 첨가하였다. 전 세포(whole cell), 거대 막 입자(large membrane particles), 및 다른 잔해를 포함하는 요침전물(urinary sediments)을 제거하기 위하여, 소변 시료를 4,000 rpm, 4℃에서 15분 간 원심분리하였고, 엑소좀을 추출할 때까지 -80℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
그 후, 냉동된 소변 샘플을 각각 15 mL 만큼 해동시키고 1분 동안 볼텍싱 한 다음 상온에서 15분 동안 17,000xg에서 원심 분리하고 상층액 (SN1)을 수집하였다. SN1은 Beckman Coulter Optima L-80xp 초 원심 분리기, 로터 SW40Ti (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 실온에서 70 분 동안 200,000xg에서 초 원심 분리시켰다. 상청액을 버리고 펠렛을 11 mL의 DPBS에 용해시켜 세척한 다음 실온에서 70분 동안 200,000xg에서 다시 초 원심 분리시켰다. 상청액을 버리고 엑소좀 펠릿을 단백질 분리 또는 엑소좀 입자 정량화에 사용하였다.
[실시예 3]
LC-MS 분석 및 단백질 확인
프로테오믹스 분석을 위한 샘플 준비는 동결 건조, 단백질 가용화 및 소화를 거쳤다. 생성된 펩타이드 혼합물을 탈염시키고 C18 역상 크로마토그래피를 사용하여 건조시킨 다음 나노-유동 액체 크로마토그래피(nano-flow liquid chromatography)와 결합된 고분해능 질량 분석(high resolution mass spectrometry)으로 분석하였다.
Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 서열 데이터베이스 분석 및 라벨 프리 정량(label free quantitation, LFQ) 분석을 적용하여 신장이식 BK 바이러스 감염성 신병증 진단 또는 예측을 위한 바이오마커 후보 물질을 검색하였다. 이로부터, 1820 개의 소변의 엑소좀 단백질을 확인했다. DAVID 생물정보 데이터베이스를 사용하여 유전자 온톨로지 할당(Gene ontology assignments), 분자 기능 및 Kegg 경로 분석을 수행하였다.
[실시예 4]
바이오마커 후보 선발
바이오마커 후보 물질로 단백질을 선택하는 과정을 [도 1]에 요약하였다. 각각의 병리학적 그룹을 대표하는 특정 바이오마커를 선택하기 위해, t-테스트를 사용하여 NOMOA 및 DONOR 그룹과 비교하여 유의하게 다른 평균 존재비 (abundance)를 갖는 단백질을 선택했다. 또한 볼케이노 플롯(volcano plot)을 사용하여 NOMOA 군과 비교할 때 2 배 이상의 차이를 보이는 단백질을 선택했다. 두 가지 분석에서 중복된 단백질을 선택하고 나머지 두 병리학적 군과 다시 비교하여 평균 존재비의 유의한 차이를 비교 하였다. 모든 분석은 p <0.05의 컷 오프(cut off)로 수행되었다.
4-1. BKVN 환자의 단백질 바이오마커 확인 및 1차 선별
4193개의 소변 단백질로부터 각각의 병리학적 그룹을 대표하는 특정 바이오마커를 선택하고자 하였으며, Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 서열 데이터베이스 분석 및 라벨 프리 정량(label free quantitation, LFQ) 분석을 적용하여 1820개의 소변 엑소좀 단백질을 확인하였다.
1820개의 소변 엑소좀 단백질 중에서 BKVN 군을 구별할 수 있는 마커를 선발하기 위하여, 먼저 T 테스트를 사용하여 NOMOA 및 Donor 그룹과 비교하여 BKVN 그룹에서 유의하게 다른 평균 존재비(abundance)를 갖는 단백질을 1차적으로 선발한 결과 53개의 단백질이 BKVN 군에서만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다(p<0.05).
다음으로, NOMOA 그룹과 BKVN 그룹 만을 비교하여 2배 이상의 발현량 차이를 보이는 단백질을 확인한 결과 785개 단백질이 선별되었다(p<0.05).
상기 1차 선발된 53종의 단백질과 2배 이상의 발현량 차이를 보이는 785개 단백질 중에서 중복되는 단백질 14종을 BKVN 마커 후보로 최종 선발하고, ABMR 군 및 TCMR과 존재비의 유의한 차이를 다시 비교한 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
NOMOA, DONOR 군과 BKVN 군에서 차이를 보이는 단백질 목록(14종)
등록번호 Protein FDR Confidence: Combined Abundance Ratio: (BKVN)/(NOMOA) Abundance Ratio Adj. P-Value: (BKVN)/(NOMOA) T test NOMOA vs BKVN T test BKVN vs TCMR T test ABMR vs BKVN T test BKVN vs donor 설명 유전자 이름
P09651 High 6.849 0.00146 0.014 0.013 0.015 0.012 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 HNRNPA1
Q9UBC9 High 0.384 0.098373 0.016 0.277 0.198 0.003 Small proline-rich protein 3 SPRR3
P51809 High 0.355 0.064925 0.024 0.198 0.145 0.270 Vesicle-associated membrane protein 7 VAMP7
Q9BV40 High 0.242 0.065796 0.026 0.183 0.093 0.000 Vesicle-associated membrane protein 8 VAMP8
Q9NZL9 High 3.185 0.201235 0.027 0.039 0.024 0.026 Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta MAT2B
O15400 High 0.417 0.151364 0.028 0.014 0.026 0.000 Syntaxin-7 STX7
P46783 High 3.683 0.179117 0.029 0.042 0.026 0.031 40S ribosomal protein S10 RPS10
Q9Y2Q5 High 0.353 0.122038 0.030 0.059 0.040 0.005 Ragulator complex protein LAMTOR2 LAMTOR2
O14727 High 0.417 0.158031 0.031 0.270 0.344 0.000 Apoptotic protease-activating factor 1 APAF1
Q9NS93 High 0.392 0.114131 0.032 0.020 0.125 0.000 Transmembrane 7 superfamily member 3 TM7SF3
P07686 High 0.41 0.14935 0.036 0.410 0.226 0.300 Beta-hexosaminidase subunit beta HEXB
Q14517 High 0.38 0.109148 0.036 0.219 0.002 0.010 Protocadherin Fat 1 FAT1
Q9UHA4 High 0.49 0.198844 0.039 0.041 0.159 0.022 Ragulator complex protein LAMTOR3 LAMOTOR3
P55060 High 4.341 0.111267 0.044 0.049 0.043 0.045 Exportin-2 CSE1L
4-2. BKVN 특이적 바이오마커의 최종 선발
ABMR, BKVN 및 BKVN 군에서 각각 특이적인 엑소좀 단백질을 발견하기 위하여 T 테스트 분석을 기반으로 최종 후보 단백질을 선택했다. 소변 엑소좀 단백질 중에서 NOMOA 군 또는 DONOR 군과 비교하여 BKVN 군에서만 특이적으로 발현되는 단백질 중에서 NOMOA 군과 비교하여 발현 프로파일이 2배 이상 차이가 나는 단백질만 선별하는 과정을 통해 상기 [표 1]의 14종 단백질을 1차 선별하였다.
상기 [표 1]의 1차 선별된 14종 단백질 중에서, ABMR 군과 비교하여 BKVN 군에서만 유의하게 다른 평균 존재비(abundance)를 갖는 단백질을 후보 바이오마커로 선택하고, TCMR 군과 비교하여 BKVN 군에서만 유의하게 다른 평균 존재비(abundance)를 갖는 단백질을 후보 바이오마커로 선택하였고, 마지막으로 상기 각 후보 바이오마커 단백질 중 중복되는 4가지 단백질을 ABMR, TCMR과 BKVN 군에서 차이가 예상되는 최종 BKVN 바이오마커 단백질로 선정하였다. 확인된 단백질은 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이 HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No.P09651), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta, UNIPROT Accession No.Q9NZL9), RPS10(40S ribosomal protein S10, UNIPROT Accession No.P46783) 및 CSE1L(Exportin-2, UNIPROT Accession No.Q9NZL9)였다.
4-3. 선발된 BKVN 특이적 바이오마커의 특성 확인
최종 선발된 바이오마커의 특성을 확인하기 위하여, DAVID 생물정보 데이터베이스를 사용하여 유전자 온톨로지 할당(Gene ontology assignments), 분자 기능 및 Kegg 경로 분석을 수행하였으며, 그 결과를 [표 2]에 나타내었다.
선발된 BKVN 특이적 마커의 기능적 특성
등록번호 설명 BP direct MF direct
P09651 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 :Positive regulation of telomere maintenance via telomerase :protein binding
Q9NZL9 :one-carbon metabolic process :protein biding
P46783 40S ribosomal protein S10 :translational initiation :protein binding
P55060 Exportin-2 :Ran GTPase binding:protein binding
상기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 선발된 BKVN 특이적 마커는 대부분 번역 개시(translational initiation) 및 단백질 결합(protein binding)에 관여하는 것으로 확인되었다.
4-4. BKVN 특이적 바이오마커의 정확도 검증
표 2의 선발된 4종의 바이오마커에 대한 검증을 위해, ROC 곡선 분석을 수행하여 NOMOA, ABMR, TCMR군과 BKVN군을 구별할 수 있는 바이오마커의 잠재력을 평가하여 [도 5]에 나타내었다. 그 결과, 곡선 아래 면적은 모든 바이오 마커에서 0.5 이상이며, 민감도와 특이도에 있어서 매우 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다.
본 발명을 지원한 국가연구개발사업은 하기와 같다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1711046930/2016M3A9E8941330
[부처명] 과학기술정보통신부
[연구관리 전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 바이오·의료기술개발사업
[연구과제명] 신장 이식 후 섬유화에 대한 바이오마커로서의 urinary transglutaminase 2 진단 키트 개발
[주관기관] 서울아산병원
[연구기간] 2020. 02. 01 - 2020. 07. 31

Claims (17)

  1. HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10(40S ribosomal protein S10) 및 CSE1L(Exportin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 (BK virus-associated nephropathy, BKVN)의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  2. HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10(40S ribosomal protein S10) 및 CSE1L(Exportin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 조성물.
  5. 제2항의 조성물을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측용 키트.
  6. 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10(40S ribosomal protein S10) 및 CSE1L(Exportin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀인 것인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 진단 또는 신장이식 후 환자의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    a) HNRNPA1의 상향 조절;
    b) MAT2B의 상향 조절;
    c) RPS10의 상향 조절; 및
    d) CSE1L의 상향 조절.
  9. 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀인 것인, 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군 시료와 비교한 결과가 하기 a) 내지 d)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 해당하는 경우 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하고, BK 바이러스 감염성 신병증에 대한 치료법을 적용하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 신장이식 후 환자의 치료법 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    a) HNRNPA1의 상향 조절;
    b) MAT2B의 상향 조절;
    c) RPS10의 상향 조절; 및
    d) CSE1L의 상향 조절.
  12. a) 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료와 비교하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 비교 결과, a) 단계의 개체로부터 분리한 시료에서의 발현 수준이 신장이식을 받지 않은 정상 대조군 또는 신장이식 후 거부반응 또는 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타내지 않은 환자군의 시료에서의 발현 수준보다 높은 경우, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증으로 판정하는 단계; 및
    d) 상기 a) 단계의 개체에게 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법을 적용하는 단계;를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀인 것인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 d) 단계의 BK 바이러스 감염성 신병증 치료법은 면역억제제의 감량 또는 중단, 레플루노미드 (leflunomide) 및 시도포비어 (cidofovir) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증의 진단 및 치료방법.
  15. a) 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증을 나타낸 개체로부터 분리한 시료에 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
    b) HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀인 것인, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법.
  17. 제15항에 있어서, c) 상기 b) 단계에서 측정된 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 후보물질을 처리하기 전보다 하향 조절되는 경우, 상기 a) 단계의 후보물질을 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 감염성 신병증 치료제의 스크리닝 방법.
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