WO2022075775A1 - 췌장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 - Google Patents

췌장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 Download PDF

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윤승배
송미영
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for predicting anticancer drug reactivity, and more specifically, a marker composition for predicting anticancer drug reactivity comprising a specific gene or a protein encoding the same in a pancreatic cancer patient, a composition for predicting anticancer drug treatment reactivity, predicting anticancer drug reactivity It relates to a kit for use, and a method for providing information for predicting anticancer drug treatment responsiveness.
  • Pancreatic cancer is a malignant tumor originating from the pancreas, and it is known that the 5-year survival rate is less than 10% because most patients are found to have advanced cancer. Although the incidence of pancreatic cancer in Korea ranks eighth, cancer-related deaths account for just after lung cancer, liver cancer, stomach cancer, and colorectal cancer. Symptoms of pancreatic cancer include symptoms found in various pancreatic diseases, and abdominal pain, anorexia, weight loss, and jaundice are the most common symptoms. Jaundice occurs in most cases.
  • anticancer agents for the treatment of pancreatic cancer are known as gemcitabine and 5-fluorouracil (5-FU). Treatment with these anticancer drugs is performed by observing the therapeutic response, and if the drug reactivity is good, it is continued, and if there is no drug reactivity, the anticancer agent is changed.
  • responses to chemotherapy vary among patients with similar clinical characteristics, and even in patients with the same stage, there is a significant difference in patient survival.
  • the therapeutic response to anticancer drugs varies from individual to individual, and the concept of personalized treatment using an anticancer drug selected and used according to a patient's genetic status is emerging.
  • Korean Patent No. 2100557 discloses a method for predicting the therapeutic reactivity of oxaliplatin by detecting the expression level of SLC22A18 in colorectal cancer patients
  • Korean Patent No. 1601940 discloses KDM1B (Lysine-Specific Demethylase 1B) Disclosed is a composition for predicting the responsiveness of an ovarian cancer patient to an anticancer drug by detecting the expression level of the.
  • the present inventors collected plasma from normal persons and pancreatic cancer patients in order to discover genetic markers that can predict the reactivity of anticancer drugs in pancreatic cancer patients, and separated exosomes therefrom to produce exosome proteins. As a result of the analysis, it was confirmed that there is a correlation between the expression level of a specific gene and the anticancer drug reactivity, and based on this, the present invention was completed.
  • the present invention provides a gene comprising KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2) It provides a marker composition for predicting the anticancer drug response of a pancreatic cancer patient, comprising the mRNA or protein encoded by the gene.
  • the present invention includes KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2). It provides a composition for predicting an anticancer drug response of a pancreatic cancer patient, and a kit for predicting an anticancer drug response of a pancreatic cancer patient comprising the composition, comprising an agent for measuring the level of mRNA or protein encoded by the gene.
  • the present invention provides KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277) in specimen-derived biological samples. 2) It provides an information providing method for predicting the anticancer drug response of pancreatic cancer, comprising the step of measuring the level of the gene mRNA or the protein encoded from the gene.
  • the present invention provides KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2) provides a marker composition for predicting an anticancer drug response in a pancreatic cancer patient, comprising the mRNA of the gene or the protein encoded by the gene.
  • the marker composition is MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.
  • LYZ Lysozyme C; NM_000239.3
  • GP2 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3
  • LAMP2 Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1
  • CTSD Cathepsin D; NM_001909.5
  • CD81 CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2
  • LAMB1 Longminin subunit beta-1; NM_002291.3
  • PSMB2 Proteasome subunit
  • AZGP1 Zainc-alpha-2-glycoprotein
  • the anticancer agent may be gemcitabine (Gemcitabine) and lead paclitaxel (Nab-paclitaxel).
  • the present invention includes KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2). It provides a composition for predicting an anticancer drug response of a pancreatic cancer patient, including an agent for measuring the level of mRNA or protein encoded by the gene, and a kit for predicting an anticancer drug response of a pancreatic cancer patient comprising the same.
  • the composition for predicting the anticancer drug response of the pancreatic cancer patient is MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP2) -2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4
  • the anticancer agent may be gemcitabine (Gemcitabine) and lead paclitaxel (Nab-paclitaxel).
  • the present invention provides KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277) in a subject-derived biological sample. .2) provides an information providing method for predicting the anticancer drug response of pancreatic cancer, comprising the step of measuring the level of mRNA or protein encoded from the gene.
  • the method comprises MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome) -associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (La
  • the anticancer agent may be gemcitabine (Gemcitabine) and lead paclitaxel (Nab-paclitaxel).
  • the biological sample may be exosomes derived from blood or plasma.
  • the mRNA level is determined by next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction ( Real-time PCR), RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting (northern blotting) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of.
  • NGS next generation sequencing
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • microarray and northern blotting (northern blotting) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of.
  • the protein level is determined by western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation. , flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and at least one method selected from the group consisting of a protein chip can be measured through
  • the present inventors found that the sensitivity to the therapeutic effect of the anticancer agent, specifically, the combination of gemcitabine and nappaclitaxel, was significantly high depending on the expression level of a specific gene. This is expected to be useful for predicting the effectiveness of the therapeutic effect of anticancer drugs in pancreatic cancer patients.
  • 1 to 13 are analyzes of proteins in exosomes isolated from the plasma of pancreatic cancer patients administered with anticancer agents, the bars shown in the figure represent the quantitative protein amount of each sample, among which the blue bar represents the average value of each group sample and The standard deviation is shown (the x-axis of all graphs is Quan Channels, the left is Progression, the right is Regression, and the y-axis is Abundance [a.u.], which is 10 per division).
  • KRT73 Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3
  • Figure 2 shows the result of confirming the expression level of GSDMA (Gasdermin-A; NCBI accession number: NM_178171.5) according to drug reactivity by analyzing the protein in the exosome isolated from the plasma of a pancreatic cancer patient administered with an anticancer agent. will be.
  • LACRT Extracellular glycoprotein lacritin; NCBI accession number: NM_033277.2
  • MMP9 Microx metalloproteinase-9; NCBI accession number: NM_004994.3
  • MME (Neprilysin; NCBI accession number: NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287 .4, NM_001354642.2, NM_001354643.1) shows the results of checking the expression level.
  • GP2 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NCBI accession) number: NM_001007240.3, NM_001502.4 , NM_001007241.3, NM_001007242.3 shows the results of checking the expression level.
  • LAMP2 is an analysis of the protein in the exosomes isolated from the plasma of a pancreatic cancer patient administered with an anticancer agent, according to drug reactivity, LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NCBI accession number: NM_001122606.1 ) shows the results of checking the expression level.
  • CTSD Cathepsin D; NCBI accession number: NM_001909.5
  • CD81 CD81 antigen; NCBI accession number: NM_004356.4, NM_001297649.2) expression level was confirmed. the results are shown.
  • LAMB1 Laminin subunit beta-1; NCBI accession number: NM_002291.3
  • LAMB1 Laminin subunit beta-1; NCBI accession number: NM_002291.3
  • PSMB2 Protein subunit beta type-2; NCBI accession number: NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2 shows the results of checking the expression level.
  • AZGP1 Zinc-alpha-2-glycoprotein; NCBI accession number: NM_001185.4 expression level according to drug reactivity The confirmed results are shown.
  • the present inventors collected plasma from normal persons and pancreatic cancer patients to discover gene markers that can predict chemotherapy reactivity in pancreatic cancer patients, separated exosomes from them, and analyzed exosome proteins. As a result, expression of specific genes It was confirmed that there is a correlation between the level and the anticancer drug reactivity, and based on this, the present invention was completed.
  • the present invention includes KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2). It provides a marker composition for predicting the anticancer drug response of a pancreatic cancer patient, comprising the mRNA of the gene or the protein encoded by the gene.
  • the marker composition is MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 ; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin sub
  • pancreatic cancer refers to an aggressive characteristic in which pancreatic cells divide and grow ignoring normal growth limits, an invasive characteristic that penetrates into surrounding tissues, and a metastatic (metastatic) characteristic that spreads to other parts of the body.
  • Metastatic refers to diseases caused by cells with characteristics.
  • the term “marker for predicting anticancer drug response” is a substance used to predict whether anticancer drug administration can be useful for the treatment of cancer before administration, and is used to predict reactivity to anticancer drug by measuring its expression level do.
  • markers may include organic biomolecules such as nucleic acids, polypeptides, proteins, lipids or sugars, and the like.
  • a marker for predicting anticancer drug reactivity is a nucleic acid or polypeptide marker that can predict anticancer drug treatment reactivity in pancreatic cancer patients.
  • the anticancer agent may be gemcitabine (Gemcitabine) and lead paclitaxel (Nab-paclitaxel), but is not limited thereto.
  • the present inventors identified the use of a specific gene according to the present invention as a novel marker for predicting the prognosis of anticancer drug responsiveness in pancreatic cancer through specific examples.
  • genes KRT73, GSDMA, LACRT, MMP9, MME, LYZ, GP2, LAMP2, CTSD, CD81, LAMB1, PSMB2, and AZGP1
  • genes KRT73, GSDMA, LACRT, MMP9, MME, LYZ, GP2, LAMP2, CTSD, CD81, LAMB1, PSMB2, and AZGP1
  • the present invention provides KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277. 2) It provides a kit for predicting an anticancer drug response of a pancreatic cancer patient, including a composition for predicting an anticancer drug response of a pancreatic cancer patient, and a composition for predicting an anticancer drug response in a pancreatic cancer patient, comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of the gene comprising the gene .
  • the composition for predicting the anticancer drug response of the pancreatic cancer patient is MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2) , NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM
  • the kit for prediction of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the kit of the present invention contains genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of a DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising
  • the PCR buffer solution may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 .
  • components necessary for performing electrophoresis that can confirm whether or not the PCR product is amplified may be additionally included in the kit of the present invention.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase
  • DNase DNase
  • RNase inhibitors DEPC -Water
  • sterile water etc.
  • a primer pair specific for a gene used as a quantitative control may be included.
  • the kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA corresponding to a gene or fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include cDNA corresponding to a quantitative structural gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the kit of the present invention may be a kit characterized in that it includes essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit includes an antibody specific for a marker protein, and an agent for measuring the protein level.
  • the ELISA kit may include a reagent capable of detecting an antibody that has formed an "antigen-antibody complex", for example, a labeled secondary antibody, chromopores, an enzyme, and a substrate thereof.
  • an antibody specific for the quantitative control protein may be included.
  • the present invention provides KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) and LACRT in a subject-derived biological sample.
  • KRT73 Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI accession number: NM_175068.3
  • GSDMA Gasdermin-A; NM_178171.5
  • LACRT Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2
  • the method is MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta
  • the term “information providing method for predicting anticancer drug response in pancreatic cancer” used in the present invention is a preliminary step for predicting whether anticancer drug administration can be useful for cancer treatment prior to administration. of clinical judgment or findings are excluded.
  • the subject-derived biological sample may include tissues, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid and urine, preferably blood or plasma, and more preferably plasma-derived exosomes.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the mRNA level is determined by next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase protection assay; RPA), microarray (microarray), and may be measured through one or more methods selected from the group consisting of northern blotting (northern blotting), but is not limited thereto.
  • NGS next generation sequencing
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RPA RNase protection assay
  • microarray microarray
  • the protein level was determined by western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, flow cytometry, and immunity. It may be measured by at least one method selected from the group consisting of immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and protein chip, but is limited thereto it's not going to be
  • Plasma samples from normal and pancreatic cancer patients are collected in BD Vacutainer Plastic K2EDTA Tube (BD, Cat.no 367525), and plasma is separated by centrifugation within 2 hours at 2,500 rpm and 4°C for 20 minutes. The supernatant plasma was aliquoted into Protein LoBind Tubes (Eppendorf, Cat.no 0030108116) by 500 ⁇ l and stored at -80°C.
  • Plasma samples were centrifuged at 3,000 g and 4 °C for 15 minutes to remove cells and cell debris in the plasma. Then, 250 ⁇ l of Exo2D TM for Protein assay (EXOSOMEplus) was added to 500 ⁇ l of plasma sample at a 2:1 ratio to separate exosomes based on the Aqueous Two-Phase System, and then, HaltTM Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-Free ( The exosome samples were prepared by resuspending the exosomes in 200 ⁇ l of PBS with the addition of Thermo scientific). Samples were stored at -80 °C until analysis.
  • EXOSOMEplus Exo2D TM for Protein assay
  • exosomal protein was mixed with SDS loading buffer and electrophoresed using 10% Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Eletrophoresis (SDS-PAGE) technique to separate proteins according to molecular weight size. After immersing the electrophoresed gel in InstantBlueTM (Coomassie blue stanning) reagent and staining at room temperature for 15 minutes, protein detection and distribution were first checked.
  • InstantBlueTM Concentrassie blue stanning
  • 80 ⁇ l of 50 mM TEAB buffer was added and centrifuged at 1,000 g for 60 seconds.
  • 80 ⁇ l of 0.2% FA was added and centrifuged at 1,000 g for 60 seconds.
  • 80 ⁇ l of elution buffer (50% ACN, 0.2% FA) was added, centrifuged at 4,000 g for 60 seconds, and the eluted sample was freeze-dried.
  • Protein peptide samples prepared through the digestion process were analyzed for proteomic bodies using Q Exactive Plus LC-MS/MS System mass spectrometer (Thermo Scientific). Each sample was measured in duplicate, and the data generated by the instrument was analyzed using Proteome Discoverer TM 2.2 (Thermo Scientific) software for database search, comprehensive protein and peptide identification, characterization and quantitative analysis and statistical analysis. was carried out.

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Abstract

본 발명은 항암제 치료 반응성 예측용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 췌장암 환자에서 특정 유전자 또는 이를 코딩하는 단백질을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물, 항암제 치료 반응성 예측용 키트, 및 항암제 치료 반응성 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석한 결과, 특정 유전자의 발현 수준에 따라 항암제, 구체적으로는 젬시타빈 및 납파클리탁셀 병용제제의 치료효과에 대한 감수성이 유의하게 높음을 규명하였는바, 췌장암 환자에서 항암제에 대한 치료 효과의 유효성을 예측하는 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

췌장암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커
본 발명은 항암제 치료 반응성 예측용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 췌장암 환자에서 특정 유전자 또는 이를 코딩하는 단백질을 포함하는 항암제 치료 반응성 예측용 마커 조성물, 항암제 치료 반응성 예측용 조성물, 항암제 치료 반응성 예측용 키트, 및 항암제 치료 반응성 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
췌장암은 췌장에서 기원한 악성 종양으로, 대부분의 환자가 암이 진행된 상태로 발견되기 때문에 5년 생존율이 10%도 되지 않는 암으로 알려져있다. 췌장암의 국내 발생률은 8위에 이르지만, 암에 의한 사망에는 폐암, 간암, 위암, 대장암 바로 다음을 차지하고 있다. 췌장암의 증상으로는 여러 가지 췌장 질환에서 볼 수 있는 증상이 나타날 수 있으며, 복통, 식욕부진, 체중감소, 황달 등이 가장 흔한 증상으로 췌장암 환자의 대부분에서 복통과 체중감소가 나타나고, 췌두부암 환자의 대부분에서 황달이 나타난다.
현재, 췌장암 치료에 잘 알려진 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine), 5-플루오르우라실(5-FU) 등으로 알려져있다. 이러한 항암제를 통한 치료법은 치료반응을 관찰하여, 약물 반응성이 좋을 경우 지속하고, 약물 반응성이 없으면 항암제를 변경하게 되는데, 이 과정 중 암이 더욱 진행되는 경우가 많다. 또한, 비슷한 임상적 특징을 가지는 환자들 중에서도 항암화학요법에 대한 반응이 다양하게 나타나고, 같은 병기의 환자라 할지라도 환자의 생존에 상당한 차이를 보인다. 더욱이, 항암제에 대한 치료 반응은 개인 별로 달라, 환자의 유전 상태에 따라 항암제를 선택하여 사용하는 개인 맞춤형 치료의 개념이 부상되고 있다.
대한민국 등록특허 제2100557호는 대장암환자에서 SLC22A18 발현량을 검출하여 옥사리플라틴(oxaliplatin)의 치료 반응성을 예측하는 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제1601940호는 KDM1B (Lysine-Specific Demethylase 1B) 의 발현 수준을 검출함으로써, 난소암 환자의 항암제 치료 반응성을 예측하기 위한 조성물을 개시하고 있다.
그러나, 췌장암 환자에서 항암 치료의 반응성을 예측할 수 있는 마커의 개발은 아직 미흡한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 췌장암 환자에서 항암제 치료 반응성을 예측할 수 있는 유전자 마커를 발굴하고자 정상인 및 췌장암 환자에서 혈장을 채취하고 이로부터 엑소좀(exosome)을 분리하여 엑소좀 단백질을 분석한 결과, 특정 유전자의 발현 수준과 항암제 반응성간의 상관관계가 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체 유래 생물학적 시료에서 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 항암제 반응 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 마커 조성물은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)일 수 있다.
또한, 본 발명은 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물 및 이를 포함하는 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)일 수 있다.
또한, 본 발명은 피검체 유래 생물학적 시료에서 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 항암제 반응 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 방법은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명자들은 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석한 결과, 특정 유전자의 발현 수준에 따라 항암제, 구체적으로는 젬시타빈 및 납파클리탁셀 병용제제의 치료효과에 대한 감수성이 유의하게 높음을 규명하였는바, 췌장암 환자에서 항암제에 대한 치료 효과의 유효성을 예측하는 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 내지 13은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석한 것으로, 도면에 나타난 막대는 각 샘플의 정량적 단백질 양을 나타내며, 그 중 파란색 막대는 각 그룹 샘플의 평균값과 표준편차를 나타낸 것이다(모든 그래프의 x축은 Quan Channels로서 좌측은 Progression, 우측은 Regression을 나타내며, y축은 Abundance [a.u.]로서 눈금당 10을 나타낸다).
도 1은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 GSDMA (Gasdermin-A; NCBI 접근(accession)번호 : NM_178171.5) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NCBI 접근(accession)번호 : NM_033277.2) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NCBI 접근(accession)번호 : NM_004994.3) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 MME (Neprilysin; NCBI 접근(accession)번호 : NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 LYZ (Lysozyme C; NCBI 접근(accession)번호 : NM_000239.3) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NCBI 접근(accession)번호 : NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NCBI 접근(accession)번호 : NM_001122606.1) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 CTSD (Cathepsin D; NCBI 접근(accession)번호 : NM_001909.5) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 CD81 (CD81 antigen; NCBI 접근(accession)번호 : NM_004356.4, NM_001297649.2) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NCBI 접근(accession)번호 : NM_002291.3) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NCBI 접근(accession)번호 : NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 항암제를 투여한 췌장암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀 내 단백질을 분석하여, 약물 반응성에 따라 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NCBI 접근(accession)번호 : NM_001185.4) 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 췌장암 환자에서 항암제 치료 반응성을 예측할 수 있는 유전자 마커를 발굴하기 위해 정상인 및 췌장암 환자에서 혈장을 채취하고 이로부터 엑소좀(exosome)을 분리하여 엑소좀 단백질을 분석한 결과, 특정 유전자의 발현 수준과 항암제 반응성간의 상관관계가 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 조성물은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “췌장암”은 췌장 세포가 정상적인 성장한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.
본 발명에서 용어 “항암제 반응 예측용 마커”는 항암제 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 예측하는데 사용하기 위한 물질로서, 이의 발현량을 측정하여 항암제에 대한 반응성을 예측하는데 사용된다. 이러한 마커에는 핵산, 폴리펩타이드, 단백질, 지질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 목적상, 항암제 치료 반응성 예측용 마커는 췌장암 환자에서 항암제 치료 반응성을 예측할 수 있는 핵산 또는 폴리펩타이드 마커이다.
본 발명에서, 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 췌장암의 항암제 반응성 예후예측을 위한 신규 마커로써 본 발명에 따른 특정 유전자의 용도를 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 항암제 구체적으로는 젬시타빈 및 납파클리탁셀을 병용 투여한 췌장암 환자의 검체에서 특정 유전자(KRT73, GSDMA, LACRT, MMP9, MME, LYZ, GP2, LAMP2, CTSD, CD81, LAMB1, PSMB2 및 AZGP1)의 발현이 유의하게 증가되는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
상기 결과를 통해 특정 유전자(KRT73, GSDMA, LACRT, MMP9, MME, LYZ, GP2, LAMP2, CTSD, CD81, LAMB1, PSMB2 및 AZGP1) 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이 췌장암 환자에서 항암제 반응성을 예측하기 위한 마커로 이용될 수 있음을 유추할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래 생물학적 시료에서 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 항암제 반응 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “췌장암의 항암제 반응 예측을 위한 정보제공방법”은 항암제 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 예측하기 위한 예비적 단계로써 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 혈액 또는 혈장일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈장 유래 엑소좀일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 혈장 내 엑소좀의 특이 단백질 분석
1-1. 엑소좀 샘플 준비
정상인 및 췌장암 환자의 혈액을 BD Vacutainer Plastic K2EDTA Tube (BD, Cat.no 367525)에 채취한 후 2시간 이내 2,500 rpm, 4 ℃ 조건에서 20분간 원심 분리하여 혈장을 분리한다. 상층 혈장을 Protein LoBind Tube (Eppendorf, Cat.no 0030108116)에 500 ㎕씩 분주하고 -80 ℃에 보관하였다.
혈장 시료를 3,000 g, 4 ℃ 조건에서 15분간 원심 분리하여 혈장 내 세포 및 세포 찌꺼기 (cell debris)을 제거하였다. 다음 혈장 시료 500 ㎕에 Exo2DTM for Protein assay (EXOSOMEplus) 250 ㎕, 2:1 비율로 첨가하여 Aqueous Two-Phase System을 기반으로 엑소좀을 분리 후, Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-Free(Thermo scientific)을 첨가한 200 ㎕ 용량의 PBS에 엑소좀을 재부유(Resuspending)시켜 엑소좀 샘플을 준비하였다. 시료 분석 전까지 -80 ℃에 보관하였다.
1-2. 엑소좀 단백질 정량분석
상기 실시예 1-1에서 제조된 혈장 엑소좀 샘플 30 ㎕에 프로테아제 및 포스페타아제(1X)를 포함하는 RIPA 버퍼 30 ㎕를 첨가하고 충분히 혼합시킨 후 원심분리 하였다. 추출된 엑소좀 단백질은 Bovine Serum Albumin (BSA) Standard Set (BIO-RAD)와 PierceTM BCA Protein Assay (Thermo scientific)을 이용하여 농도 측정 및 정량분석을 진행하였다.
다음 엑소좀 단백질 20 ㎍을 SDS loading buffer와 섞은 후 10% Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Eletrophoresis (SDS-PAGE) 기법으로 전기영동 하여 단백질들을 분자량 크기에 따라 분리시켰다. 전기영동된 젤을 InstantBlue™ (Coomassie blue stanning) 시약에 담가 상온에서 15분간 염색한 후 1차적으로 단백질 검출 및 분포 상황을 확인하였다.
1-3. S-Trap™ Mini Spin Column (ProtiFi)을 이용한 단백질 digestion
(1) 시료에 5% SDS, 50 mM TAEB (pH7.55), 1x PPIC을 추가하여 용해하였다. 인산을 이용하여 pH 값을 맞춰주었다.
(2) BCA assay을 이용하여 정량한 단백질 시료 300 ㎍을 취하였다. Digestion할 단백질에 최종농도가 20 mM이 되게 DTT를 추가하여 95 ℃에서 10분 동안 알킬화시켰다.
(3) 실온에서 식혀준 후 최종농도가 40 mM 되게 IAA을 추가하여 어두운 곳에서 30분간 reduction 시켰다. 다음 12% 인산을 1.2% 인산으로 되게끔 섞어주었다.
(4) S-Trap binding buffer (90% methanol 100 mM TEAB (pH 7.1)) 350 ㎕ 추가한 후 모두 S-Trap spin column으로 옮겼다. 다음 원심 분리기를 이용하여 4,000 g에서 30초간 원심 분리하였다.
(5) S-Trap buffer 400 ㎕을 S-Trap spin column에 추가한 후 원심 분리기를 이용하여 4,000 g에서 30초간 원심 분리하였다. 이를 3회 반복하였다.
(6) S-Trap spin column을 새로운 2 ml sample tube로 옮긴 후, 단백질과1:25 비율의 trypsin을 50 mM TEAB buffer 125 ㎕에 녹여 S-Trap spin column에 추가하여 37 ℃에서 16시간 동안 incubation 하였다.
(7) 50 mM TEAB buffer를 80 ㎕ 추가하여 1,000 g에서 60초간 원심 분리하였다. 다음 0.2% FA를 80 ㎕ 추가하여 1,000 g에서 60초간 원심 분리하였다. 마지막으로 elution buffer (50% ACN, 0.2% FA)를 80 ㎕ 추가하여 4,000 g에서 60초간 원심 분리하고 용리한 시료를 동결 건조하였다.
1-4. 프로테오믹스 분석
Digestion 과정을 거쳐 준비된 단백질 펩티드 시료를 Q Exactive Plus LC-MS/MS System 질량분석기 (Thermo Scientific)을 이용하여 단백질체 분석을 하였다. 각 시료마다 두 번 반복(duplicate)하여 측정하였고, 기기에서 생성된 데이터는 Proteome DiscovererTM 2.2 (Thermo Scientific) 소프트웨어를 이용하여 데이터베이스 검색, 종합적인 단백질 및 펩티드의 식별, 특성 분석과 정량 분석 및 통계분석을 진행하였다.
실시예 2. 췌장암 환자에서 항암제 반응성에 따른 특정 유전자 발현 확인
젬시타빈 및 납파클리탁셀을 병용투여한 췌장암 환자 4명(반응성이 좋은 환자 2명 및 반응성이 좋지 않은 환자 2명)의 혈장을 수득하고, 실시예 1의 방법을 통해 혈장 엑소좀 단백질을 추출한 후 항암제의 반응성에 따라 발현의 차이를 나타내는 유전자를 분석하였다.
그 결과, 도 1 내지 13에 나타낸 바와 같이 KRT73, GSDMA, LACRT, MMP9, MME, LYZ, GP2, LAMP2, CTSD, CD81, LAMB1, PSMB2 및 AZGP1 유전자의 발현이 항암제 반응성이 좋게 나타나는 환자군의 검체에서만 유의적으로 증가되어 있는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마커 조성물은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NCBI 접근(accession)번호 : NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  4. KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2)를 포함하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NCBI 접근(accession)번호 : NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제4항의 조성물을 포함하는, 췌장암 환자의 항암제 반응 예측용 키트.
  8. 피검체 유래 생물학적 시료에서 KRT73 (Keratin, type II cytoskeletal 73; NCBI 접근(accession)번호 : NM_175068.3), GSDMA (Gasdermin-A; NM_178171.5) 및 LACRT (Extracellular glycoprotein lacritin; NM_033277.2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 항암제 반응 예측을 위한 정보제공방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 방법은 MMP9 (Matrix metalloproteinase-9; NCBI 접근(accession)번호 : NM_004994.3), MME (Neprilysin; NM_000902.5, NM_007288.3, NM_007289.4, NM_007287.4, NM_001354642.2, NM_001354643.1), LYZ (Lysozyme C; NM_000239.3), GP2 (Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2; NM_001007240.3, NM_001502.4, NM_001007241.3, NM_001007242.3), LAMP2 (Isoform LAMP-2C of Lysosome-associated membrane glycoprotein 2; NM_001122606.1), CTSD (Cathepsin D; NM_001909.5), CD81 (CD81 antigen; NM_004356.4, NM_001297649.2), LAMB1 (Laminin subunit beta-1; NM_002291.3), PSMB2 (Proteasome subunit beta type-2; NM_002794.5, NM_001199779.2, NM_001199780.2) 및 AZGP1 (Zinc-alpha-2-glycoprotein; NM_001185.4)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 항암제는 젬시타빈(Gemcitabine) 및 납파클리탁셀(Nab-paclitaxel)인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 mRNA 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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