WO2018155948A1 - 폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커 - Google Patents

폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커 Download PDF

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seq
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lung cancer
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박웅양
김진호
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Definitions

  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Tolerance to anticancer drugs can be attributed to long-term use of anticancer drugs, in which cells exposed to the drug reduce the intracellular accumulation of the drug (Shen et al., 1986; Shen et al., 2000; Gottesman et al., 2002), This can occur through several mechanisms, such as activating excretion (Schuetz et al., 1996; Goto et al., 2002), or modifying the target protein (Urasaki et al., 2001). This process is not only the biggest obstacle to cancer treatment, but also deeply related to the failure of treatment. Among the various mechanisms involved in drug resistance, multidrug resistance (MDR) plays an important role (Brooks et al., 2003).
  • MDR multidrug resistance
  • Multidrug resistance refers to a phenomenon in which not only the anticancer drug in use is used but also various anticancer drugs having completely different structures or functions (Biedler et al., 1975; Gottesman, 2002).
  • chemotherapy in actual cancer patients, when some anti-cancer drugs are ineffective, they frequently become resistant to other anti-cancer drugs, and complex chemotherapy with different types of anti-cancer drugs with different mechanisms of action at the time of initial treatment Despite attempts at therapy, it is often observed that there is no therapeutic effect. Because of this, the very limited range of available anticancer drugs is pointed out as an important problem in chemotherapy of cancer. Thus, screening with suitable therapeutic responsive markers can lead to significant advances in anticancer drug treatment. Accordingly, studies on the therapeutic reactivity of individual anticancer agents according to the SNP genotype have been actively developed in recent years.
  • One aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (H), or guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • a composition for predicting survival prognosis according to anticancer chemotherapy in a lung cancer patient comprising an agent capable of specifically detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence substituted with this cytosine (C).
  • Another aspect provides a kit for predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients comprising the composition.
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced by histidine (H), or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, in a biological sample isolated from an individual.
  • a method for detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 is substituted with cytosine (C) is provided.
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (H), or guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • a composition comprising an agent capable of specifically detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence substituted with cytosine (C).
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced by histidine (H), or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, in a biological sample isolated from an individual.
  • an information providing method for predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients comprising detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence substituted with cytosine (C) at guanine (G) at position 553.
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced by histidine (H), or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, in a biological sample isolated from an individual.
  • One aspect provides a protein or a polynucleotide encoding the amino acid sequence wherein aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H).
  • the EZH2 protein variant may be an isolated EZH2 protein variant.
  • the polynucleotide encoding the EZH2 protein variant may be a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C).
  • the EZH2 protein variant was encoded by a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was replaced with cytosine (C), and thus at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: Aspartate (D) may be an EZH2 protein variant consisting of an amino acid sequence substituted with histidine (H).
  • EZH2 protein variant means that a mutation has occurred in a part of the amino acid sequence of the EZH2 protein represented by SEQ ID NO: 1.
  • guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 may be a protein encoded by an EZH2 gene variant substituted with cytosine (C), and 185 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Aspartate (D) at the position may be a protein variant consisting of an amino acid sequence substituted with histidine (H).
  • Amino acid substitutions mean that the amino acid sequence is altered by one or more nucleotides being changed to another nucleotide.
  • Amino acid mutations include missense mutations, silent mutations, nonsense mutations, neutral mutations, intron mutations, and frame shift mutations. Shifts), and the like.
  • a missense variation refers to an alteration in which another amino acid is encoded by altering a nucleotide to another nucleotide.
  • the EZH2 protein variant consists of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H), and may have a missense mutation.
  • Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) protein is a histone-lysine N-methyltransferase encoded by the EZH2 gene.
  • the EZH2 may be a protein belonging to EC 2.1.1.43. EZH2 is involved in DNA methylation and functions to inhibit transcription.
  • EZH2 in humans, is a polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the nucleic acid sequence of (GRCh38 / hg38) chr7: 148,807,383-148,884,321, the nucleic acid sequence of NCBI Accession numberNM_004456, or the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2, or of SEQ ID NO: 1 It may be a polypeptide having an amino acid sequence.
  • the polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C) may be an EZH2 gene variant.
  • EZH2 gene variant means that a mutation has occurred in a portion of the nucleotide sequence of the EZH2 gene represented by SEQ ID NO: 2. Specifically, guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 may be an EZH2 gene variant substituted with cytosine (C).
  • the EZH2 gene variant may include a SNP in a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the EZH2 gene variant may include an SNP in which guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C).
  • Single nucleotide polymorphism is used in the sense commonly known in the art. SNPs may be representative of single nucleotide polymorphisms present in the genome within a population. The SNP may have a frequency of at least 7% of the minor alleles of the SNP in the population.
  • EZH2 protein variant consisting of an amino acid sequence wherein aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H), or guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the EZH2 gene variant consisting of a nucleotide sequence substituted with cytosine (C) may be a marker for predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients.
  • the term "marker” refers to a label capable of predicting survival prognosis following chemotherapy.
  • the survival prognosis may be responsiveness according to chemotherapy and thus survival prognosis.
  • Patient means a patient with lung cancer.
  • the lung cancer refers to a malignant tumor originating in the lung, and may include squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, large cell cancer, and small cell cancer.
  • the marker may be a marker for predicting survival prognosis according to chemotherapy in patients with squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, large cell carcinoma, or small cell carcinoma.
  • prognosis refers to the course and cure of a disease, such as the onset, recurrence, metastatic spread of a disease such as lung cancer, and the likelihood of lung cancer-causing death or progression, including drug resistance or susceptibility.
  • the prognosis may refer to survival prognosis according to chemotherapy in lung cancer patients, and may refer to responsiveness to chemotherapy and thus survival prognosis in lung cancer patients.
  • Chemotherapy may mean a treatment regimen using an anticancer agent.
  • the prognosis may refer to, for example, lung cancer patients receiving an anticancer agent containing a taxane-based compound, responsiveness to the anticancer agent and thus survival prognosis, and in lung cancer patients receiving an anticancer agent including docetaxel. It may mean responsiveness to the anticancer agent and thus survival prognosis.
  • the anticancer chemotherapy may be first treatment, second treatment, or third treatment.
  • prediction means to determine in advance the likelihood that a patient will survive by preferentially or unfavorably responding to a therapy such as chemotherapy. Predicting survival prognosis is related to the survival and / or likelihood of treatment of the patient, for example, surgical removal of certain anticancer agents and / or primary tumors, and / or treatment with chemotherapy for a certain period of time without cancer recurrence. do. Using these markers can help patients with lung cancer choose the most appropriate treatment, determine whether they respond favorably to specific chemotherapy, or predict long-term survival after chemotherapy. .
  • Significant marker may mean a marker having high validity due to accurate prediction results and a high reliability so as to show a consistent result even in repeated measurements.
  • Polynucleotides consisting of nucleotide sequences substituted with cytosine (C) are highly reliable markers that can accurately predict survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients.
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (H), or guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • a composition for predicting survival prognosis according to anticancer chemotherapy in a lung cancer patient comprising an agent capable of specifically detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence substituted with this cytosine (C).
  • agent capable of specifically detecting a protein means a substance that can be used to specifically identify or detect the protein in a subject's sample.
  • the agent capable of specifically detecting the protein may be an agent capable of specifically detecting a p.D185H mutation site.
  • agent capable of specifically detecting a p.D185H variant site of a protein means a substance that can be used to specifically identify or detect a p.D185H variant site of the protein in a subject's sample. .
  • Agents capable of specifically detecting the protein may be EZH2 protein variants, e.g., specific compounds or synthetic materials that target the p.D185H variant site of the EZH2 variant, and are antibodies specific for the EZH2 protein variant.
  • aspartate (D) at position 185 of the protein of SEQ ID NO: 1 may be an antibody specific for an EZH2 protein variant consisting of an amino acid sequence substituted with histidine (H).
  • antibody refers to a specific polypeptide molecule that is directed to an antigenic site as it is known in the art.
  • the antibody specific for the EZH2 protein variant is obtained by cloning a gene encoding the EZH2 protein variant into an expression vector according to a conventional method to obtain an EZH2 protein variant encoded by the gene, and from the obtained EZH2 protein variant. It can be produced by the method. It may also include partial peptides that can be made from the EZH2 protein variant.
  • Antibodies capable of detecting the EZH2 protein variant may include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • agent capable of specifically detecting a polynucleotide refers to a substance that can be used to specifically identify or detect the polynucleotide in a sample of an individual.
  • the agent capable of specifically detecting the polynucleotide may be an agent capable of specifically detecting a c.553G> C mutation region.
  • agent capable of specifically detecting c.553G> C variant sites of a polynucleotide is used to specifically identify or detect c.553G> C variant sites of a polynucleotide in a sample of an individual. Means a substance that can be.
  • An agent capable of specifically detecting a c.553G> C variant region of the polynucleotide includes a SNP position of the polynucleotide in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary polynucleotide thereof, and A polynucleotide comprising 10 or more contiguous nucleotides selected from polynucleotides, wherein the SNP site may be a nucleotide at position 553 in SEQ ID NO: 2.
  • Agents capable of specifically detecting the polynucleotide include a substance that specifically binds to an EZH2 gene variant, a substance that specifically binds to a c.553G> C variant region of the EZH2 gene variant, or c. It may be a primer, probe or antisense nucleic acid that specifically binds to the 553G> C mutation site.
  • the primer, probe or antisense nucleic acid specifically binds to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G), located at position 553 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with cytosine (C), is added to a nucleotide sequence of another nucleic acid material. There may be no specific binding.
  • the primer, probe or antisense nucleic acid may be prepared by one of ordinary skill in the art. Design can be based on the nucleotide sequence of the gene variant.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming complementary templates and base pairs and serving as a starting point for template strand copying. Means 7 to 50nt of the nucleic acid sequence.
  • the sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but only if it is sufficiently complementary to hybridize with the template.
  • Primers will initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • PCR conditions, sense and antisense primer lengths can be modified based on what is known in the art, therefore, PCR using the sense and antisense primers of the nucleotide sequence region of the EZH2 gene variant. Amplification can be performed to predict survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients.
  • probe refers to a nucleic acid fragment, such as RNA or DNA, that is short to several bases to hundreds of bases capable of specific binding with mRNA, and labeled to identify the presence of a specific mRNA.
  • Probes may be made in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art. Therefore, hybridization may be performed using a probe complementary to the nucleotide sequence of the EZH2 gene variant, thereby predicting survival prognosis according to chemotherapy in lung cancer patients through hybridization.
  • antisense nucleic acid refers to a nucleic acid based molecule that has a complementary sequence to a targeted EZH2 gene variant and can form a dimer with the EZH2 gene variant, and can be used to detect EZH2 gene variants.
  • the antisense nucleic acid may be complementary to the polynucleotide or fragment thereof, or these.
  • the fragment may have a nucleotide of 5 nt or more, 10 nt or more, 10 to 1000 nt, 10 to 500 nt, 15 to 500 nt, 15 to 300 nt, 15 to 200 nt, or 15 to 150 nt, but may have an appropriate length to increase detection specificity. You can choose.
  • Another aspect provides a kit for predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients comprising the composition.
  • the kit comprises a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H), or guanine at position 553 in nucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • aspartate (D) at position 185 in amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H), or guanine at position 553 in nucleotide sequence of SEQ ID NO:
  • the kit includes an antibody that specifically recognizes a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H), or 553 in nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • Primers, probes or antisense nucleic acids capable of specifically detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence wherein the guanine (G) at position is replaced with cytosine (C) and may further comprise one or more other suitable for analysis Component compositions, solutions or devices may be included.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a microarray chip kit or a protein chip kit.
  • the RT-PCR kit is required to perform RT-PCR to specifically detect a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C). May contain required elements.
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence where guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C)
  • Test tubes or other suitable containers reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the kit may also include instructions for use.
  • the instruction manual may be used in the anticancer agent of a lung cancer patient in a sample used for amplification, for example, when the target sequence is amplified in the amplification reaction using the specific primer and the target sequence is not amplified in the amplification reaction using the non-specific primer.
  • the microarray chip may include a DNA or RNA polynucleotide probe.
  • Microarray means that the probe is immobilized at a high density in a separate region of the substrate surface.
  • the microarray includes a probe specific for a c.553G> C variant region of a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C) And conventional microarray configurations.
  • the detection involves labeling a nucleic acid sample with a labeling substance capable of generating a detectable signal comprising a fluorescent substance, such as a substance such as Cy3 and Cy5, and then hybridizing onto a microarray and generating a signal from the labeling substance.
  • the hybridization result can be detected by detecting.
  • the kit may also include instructions for use.
  • the instructions for use may refer to reactivity of an anticancer agent in a lung cancer patient in a sample, for example, when a target sequence is detected in a hybridization reaction using the fully complementary probe and a target sequence is not detected in a hybridization reaction using the mismatch probe. This may include a description of outcome determination, including a description of the presence of a sequence associated with a low and therefore poor survival prognosis, and from the results for predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients. have.
  • the protein chip kit may measure the expression level of a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H).
  • the protein chip kit may comprise a substrate, a suitable buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like, for immunological detection of the antibody.
  • Peroxidase, alkaline phosphatase, and the like may be used as the color developing enzyme.
  • FITC FITC
  • RITC RITC
  • OPD o-phenyl
  • Rendiamine TMB (tetramethyl benzidine) and the like can be used.
  • the kit may also include instructions for use.
  • the instructions may include a description of outcome determination, including a description of predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients based on antigen-antibody response results, color development or fluorescence levels.
  • aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is converted to histidine (H) in a biological sample isolated from an individual to predict survival prognosis according to chemotherapy in lung cancer patients.
  • H histidine
  • the term “individual” refers to a lung cancer patient who wants to predict survival prognosis following chemotherapy.
  • the subject may be a vertebrate, may be a mammal, an amphibian, a reptile, a bird, and the like, may be a mammal, for example, a human ( Homo sapiens ), a Korean.
  • the lung cancer patient may be a lung cancer patient with pathological stage IV.
  • biological sample may include tissues isolated from an individual, tumor tissue, lung tumor tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, samples such as cerebrospinal fluid or urine, and the like.
  • the method for detecting the protein may be to detect using an agent that can specifically detect the protein.
  • the protein is detected by using an agent capable of specifically detecting a p.D185H mutation site in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H). May be to detect.
  • the agent capable of specifically detecting the protein may be an antibody, but is not limited thereto.
  • Methods for detecting the protein include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and Ouchterlony. Immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), protein chips, etc. Can be.
  • the method for detecting the polynucleotide may be by using an agent capable of specifically detecting the polynucleotide.
  • the method for detecting the polynucleotide may be to detect the nucleotide of the SNP position in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide may be detected by using an agent capable of specifically detecting a c.553G> C mutation site where guanine (G) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with cytosine (C). May be to detect.
  • Agents capable of specifically detecting c.553G> C mutation sites of the polynucleotides may be primers, probes or antisense nucleic acids.
  • Methods for detecting the polynucleotide include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real-time reverse transcriptase (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RNase protection) assay: RPA), northern blotting, DNA chips, and the like.
  • RT-PCR reverse transcriptase
  • RT competitive reverse transcriptase
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcriptase
  • RNase protection assay RPA
  • northern blotting DNA chips, and the like.
  • the nucleotide at the SNP position can be directly determined by a known nucleotide sequencing method.
  • the nucleotide sequencing method may be a Sanger (or dideoxy) method or a Maksam-Gilbert (chemical cleavage) method.
  • the method may include the step of determining the subject as a risk group with poor prognosis of survival following chemotherapy if the risk allele is present as a result of determining the nucleotide of the SNP site.
  • the amino acid at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was histidine (H)
  • the nucleotide at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 was cytosine (C )
  • risk allele refers to the reference allele as the minor allele a, where a is a risk allele if the frequency of a in lung cancer patients is significantly greater than the frequency of a in other lung cancer patients. can do.
  • the frequency of cytosine (C) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in lung cancer patients is significantly higher than the expression frequency of cytosine (C) at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in other lung cancer patients
  • cytosine (C) may be used as a risk allele. The more C a subject has, the poorer the prognosis of survival from chemotherapy is.
  • Determining the survival prognosis following chemotherapy may be to predict the relative degree of survival prognosis according to chemotherapy. For example, it may be to predict whether the survival prognosis according to chemotherapy is worse than that of the group having the reference genome sequence.
  • the poor survival prognosis according to chemotherapy may be low responsiveness to the anticancer agent and thus poor survival prognosis. Poor survival prognosis can mean low survival, short survival, or short progression free survival.
  • the low reactivity to the anticancer agent may mean that the drug is resistant to the anticancer agent, or the sensitivity to the anticancer agent is low. For example, when a lung cancer patient has a genotype of CC or GC, it may be to predict whether the reactivity to an anticancer agent is low and the survival prognosis is poor as compared with the genotype of GG.
  • the anticancer agent may be a taxane-based compound.
  • the anticancer agent may be docetaxel (Docetaxel, taxotere) or paclitaxel (Paclitaxel, Taxol).
  • Docetaxel interferes with the production of microtubules that transport chromosomes to the anode during cell division, thereby killing cancer cells that divide more frequently than normal cells.
  • paclitaxel can interfere with cell division and kill cancer cells.
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H), or guanine at position 553 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the present invention provides a use for predicting survival prognosis following chemotherapy in lung cancer patients of a composition comprising an agent capable of specifically detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence substituted with cytosine (C).
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (H), or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, in a biological sample isolated from an individual
  • an information providing method for predicting survival prognosis according to chemotherapy in lung cancer patients comprising detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence of guanine (G) at position 553 substituted with cytosine (C). .
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (H), or SEQ ID NO: 2
  • H histidine
  • SEQ ID NO: 2 If a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which guanine (G) at position 553 is replaced with cytosine (C) in the nucleotide sequence of is detected, it may be determined that lung cancer survival prognosis is poor.
  • Another aspect is a protein consisting of an amino acid sequence in which aspartate (D) at position 185 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (H), or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, in a biological sample isolated from an individual Detecting a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence wherein guanine (G) at position 553 is substituted with cytosine (C); And analyzing the detected results to determine whether to administer a therapeutic agent to a patient in need of treatment for lung cancer, thereby providing a method of predicting and treating survival prognosis according to chemotherapy in lung cancer patients.
  • the method of treatment comprises detecting the protein, or detecting the polynucleotide. Details of the detection of the protein or polynucleotide are as described above.
  • the method of treatment includes analyzing the detected results to determine whether to administer a therapeutic agent to a patient in need of treatment for lung cancer. Specifically, when a risk allele is present as a result of assaying the nucleotide at the SNP position in the nucleotide sequence, the individual may be determined as a risk group having a poor prognosis for survival by chemotherapy. For example, when a lung cancer patient has a genotype of CC or GC, it can be predicted that the risk group has a lower responsiveness to an anticancer agent and a poor prognosis compared to the case of having a genotype of GG.
  • the lung cancer treatment agent is, for example, Carboplatin (paraplatin) (Cisplatin), Cisplatin (Cisplatin), cyclophosphamide (Cyclophosphamide), Ifosfamide (Nidran), Nitrogen mustar (Mechlorethamine HCL), Bleomycin, Doxorubicin, Mitomycin C, Cytarabine, Flurouracil, Gemsi Gemcitabine, Trimetrexate, Methotrexate, Etoposide, Vinblastine, Vinorelbine, Alimta, Altretamine Altretamine, Procarbazine, Taxol, Taxotere, Topotecan, Irinotecan, Bevacizumab, Gefitinib, Erlotinib , Picibanil Vial, Aclarubicin, Tegafur, It
  • Preferred dosages for the treatment of lung cancer depend on the patient's condition, weight, extent of disease, drug form, route of administration and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, it may be administered at 0.0001 to 2,000 mg / kg, preferably at 0.001 to 2,000 mg / kg. Administration may be once a day or may be divided several times. However, the scope of the present invention is not limited by the above dosage.
  • the therapeutic agent may be administered to various mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like. All modes of administration may be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the SNP can be applied as a biomarker that can predict the response and survival rate of chemotherapy. By analyzing the SNP, it is useful to select a patient group having an effect on chemotherapy and to suggest a treatment direction of lung cancer patients.
  • FIG. 1A shows Kaplan-Meier survival curves in a group of patients receiving docetaxel and having a p.D185H mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a patient group having no p.D185H mutation.
  • FIG. 1B shows Kaplan Meier survival curves in patients who did not receive docetaxel, in patients with p.D185H mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and in patients without p.D185H mutation.
  • "p-value” is the p-value (p-value) that is the result of the test whether the distribution of the genotype of the SNP is significantly different between the docetaxel group and the docetaxel group Means.
  • Figure 2 confirms whether the protein complex formation of the EZH2 protein having a p.D185H mutation.
  • Figure 3 confirms the reactivity of chemotherapy in EZH2 protein with p.D185H mutation and EZH2 protein without p.D185H mutation.
  • a total of 378 lung tumor tissues diagnosed with lung cancer were obtained. Subsequently, genomic DNA was obtained from the 378 lung tumor tissues using the QiAmp DNA kit (Qiagen, Germany). Covaris S220 (Covaris, MA, USA) was used to shear genomic DNA (approximately 250 ng) obtained from each tumor tissue, followed by end-repair, and A binding (A-tailing). ), A specific adapter (adaptor) at both ends (ligation) and amplified it to prepare a library for sequencing. Sequencing was performed on libraries made using the Miseq Genome Analyzer (Illumina, USA).
  • UCSC assembly hg19 (GRCh37) was used as a reference genome (http://genome.ucsc.edu). Sequencing reads data obtained from a genomic analyzer were aligned to the UCSC assembly hg19 (GRCh37) reference genome using the Burrows-Wheeler Aligner (BWA) algorithm (http://genome.ucsc.edu ). PCR duplications were removed using Picard-tools-1.8 (http://picard.sourceforge.net/) and single nucleotide variations (SNV) and indel deletions using the GATK-2.2.9 algorithm. Indel) was detected.
  • BWA Burrows-Wheeler Aligner
  • the diagnostic and treatment records of the 378 lung cancer patients were obtained. All patients diagnosed with lung cancer did not receive radiation therapy prior to chemotherapy.
  • the classification according to lung cancer staging system for 57 patients treated with chemotherapy with docetaxel was as follows: stage I 6 cases; One case of stage II; One case of stage III; Stage IV 46 cases.
  • a group of patients receiving docetaxel by chemotherapy was mixed intravenously with 60 to 75 mg / m 2 of docetaxel with distilled water containing 5% dextrose and injected intravenously over one hour at three week intervals. Patients who did not receive docetaxel received cisplatin or pemetrexed. Chemotherapy was discontinued in consideration of disease progression, toxicity, or decision of the patient or physician.
  • a total of 378 genomic data of patients diagnosed with lung cancer and clinical evaluation, diagnosis and treatment records of the patients were integrated.
  • the integrated data was used as raw data, and after analyzing the association between anticancer agent and overall survival from the raw data, significant variations were explored.
  • survival time was recorded as the time between diagnosis date and death date or last medical treatment date.
  • FIG. 1A shows Kaplan-Meier survival curves in a group of patients receiving docetaxel and having a p.D185H mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a patient group having no p.D185H mutation.
  • the HR risk was about 2.9 times higher than in the case of GG.
  • the average survival time is about 2.9 times shorter than that of GG.
  • SNP, rs2302427 of EZH2 has a high correlation with survival rate. That is, when the C allele is compared to the G allele, it can be seen that the responsiveness to chemotherapy and the HR risk thereof are about 2.9 times higher. Patients with the GC or CC genotype are considered to have anticancer drug resistance to docetaxel.
  • FIG. 1B shows Kaplan Meier survival curves in patients who did not receive docetaxel, in patients with p.D185H mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and in patients without p.D185H mutation.
  • the genotype of position 553 in the nucleotide sequence of EZH2 is GC or CC, there was no significant difference in HR risk compared to the case of GG.
  • the SNP marker As shown in Figure 1, the SNP marker, it was confirmed that there is a significant difference in reactivity and survival prognosis when docetaxel is administered to the lung cancer patient group having the SNP, the reactivity to docetaxel and thus the survival prognosis It was confirmed that it acts as a marker for predicting.
  • EZH2rs2302427 Docetaxel group Docetaxel not administered Polymorphic genotype Occurrence Average survival (days) (95% CI) Log rank p HR (95% CI) P Occurrence Average survival (days) (95% CI) Log rank p HR (95% CI) P GG 47 1773 (1376, NA) 0.020 1.00 0.026 262 2681 (2069, NA) 0.12 1.00 0.12 GC / CC 10 602 (597, NA) 2.933 (1.134, 7.584) 59 2110 (1596, NA) 1.53 (0.90, 2.61)
  • Table 2 is a table showing the number of patients with GG or GC / CC genotype at the SNP position, average survival time, etc. for 378 lung cancer patients.
  • the SNPs shown in Table 2 have rs number rs2302427 and have mutations of p.D185H and c.553G> C.
  • rs number is the number of SNP registered in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information) GENEBANK, and the sequence shown in the sequence number Some of these sequences, including SNPs, are shown.
  • NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information
  • sequence represented by SEQ ID NO is a sequence comprising an SNP site as part of the sequence represented by the NCBI GenBank Accession No. (rs number).
  • p-value is a p-value that is the result of a test of whether the distribution of the genotype of the SNP is significantly different between the group administered with docetaxel and the group not receiving docetaxel. Means.
  • the identified SNPs can be applied as biomarkers with histological specificity to predict the response and survival rate of chemotherapy.
  • the SNP may be used as a biomarker for predicting chemotherapy response and survival in lung cancer patients treated with docetaxel chemotherapy.
  • the analysis of the SNP will be useful for the selection of small groups that are effective for docetaxel chemotherapy, and may also help in determining the treatment regimen for terminal lung cancer patients.
  • EZH2 is an enzyme with the SET domain of most histone methylation enzymes. It complexes with Suz12, EED, RbAp48 / 46, etc. to methylate the 27th lysine (K) residue of histone H3, and induces histone covalent modification. Inhibits gene expression by inducing DNA methylation by binding to DNA methylation enzyme DNMT. Therefore, immunoprecipitation was performed to determine whether SNP of EZH2 affects protein complex formation, that is, binding ability with Suz12, EED, and RbAp48 / 46.
  • EZH2 mutants particularly D185H (GAC-> CAC)
  • GAC-> CAC QuikChangeSite-Directed Mutagenesiskit
  • Lung adenocarcinoma cell lines NCI-H23 and 293T cell lines, were maintained at 37 ° C., 5% CO 2 in RPMI-1640 and DMEM containing 10% FBS, 100 U / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin, respectively. Then, to overexpress EZH2, plasmids expressing GFP-labeled wild type EZH2 and EZH2 mutants (D185H) were used with Nucleofector solution (Amaxa) or Lipofectamine 3000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. By transduction into cells.
  • 293T cells were lysed in lysis buffer for 20 minutes at 48 hours and then centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes.
  • Cell lysates were mixed with 2 ⁇ g of protein G magnetic beads (Thermo Fisher Scientific) and GFP antibody (Abcam) and incubated at 4 ° C. for 2 hours.
  • Immune complexes were collected using magnetic and washed twice with wash buffer. Beads associated with whole cell lysates and protein complexes were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with appropriate antibodies.
  • Protein blotting was performed using GFP, EED, EZH2 (Abcam), and SUZ12 (Cell signaling). Primary antibodies were detected using Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated secondary antibody (Bio-Rad), and immunostained proteins were visualized with an ECL detection system (Thermo Fisher Scientific).
  • HRP Horseradish peroxidase
  • NCI-H23 cells transduced with EZH2 with p.D185H mutation and NCI-H23 cells transduced with EZH2 without p.D185H mutation Were seeded in 96-well plates at a density of 5x10 3 cell / well. Cells were then treated with GSK126 (10 ⁇ M), GSK343 (10 ⁇ M), docetaxel (5 ⁇ M), and paclitaxel (10 ⁇ M) for 48 hours. Cell growth was analyzed according to manufacturer's instructions using Cell Counting Kit-8 (Dojindo). The same procedure was performed three times.
  • the cells transduced with EZH2 having the p.D185H mutation were more active in all anticancer agents than the cells transduced with the EZH2 without the p.D185H mutation.
  • the SNP of EZH2 is resistant to anticancer drugs, and thus can be used as a biomarker for predicting anticancer chemotherapy response and survival in lung cancer patients treated with chemotherapy.

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Abstract

폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 마커, 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다. 상기 마커를 이용한 진단은 폐암에 대한 유전자 검사를 통하여 화학 요법의 치료 방향을 제시하며, 치료 효과를 예측 및 극대화할 수 있다.

Description

폐암 환자의 생존 예후 예측용 마커
본 출원은 2017년 2월 24일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2017-0025043호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하는 위한 방법에 관한 것이다.
개인의 다양한 유전체적 차이는 대부분 단일 뉴클레오티드 다형성 (single nucleotidepolymorphism: SNP, 이하 SNP라고 함)으로 구성되는데 일부의 유전자형에서는 해당 단백질과 그 대사에서 기능적인 차이를 보이며 이는 약리 유전체적 대인적 감수성에 민감하게 작용하는 것으로 알려져 있다 (Huang and Ratain, CA Cancer J Clin 2009;59:42-55). 한편, 많은 항암제들이 효과적인 치료제로 사용되고 있지만 새롭게 대두되고 있는 문제점은 항암제에 대한 암세포의 내성 (resistance)이다 (Tsuruo et al., 1984). 항암제에 대한 내성은 장기적인 항암제 사용으로 약물에 노출된 세포들이 약물의 세포 내 축적을 감소시키거나 (Shen et al., 1986; Shen et al., 2000; Gottesman et al.,2002), 해독 작용 또는 배출을 활성화하거나 (Schuetz et al., 1996; Goto et al., 2002), 표적이 되는 단백질을 변형 (Urasaki et al., 2001) 시키는 등의 여러 가지 기전을 통하여 일어나게 된다. 이러한 과정은 암치료에 가장 큰 장애 요소일 뿐만 아니라 치료의 실패와도 깊은 관련이 있다. 약물에 대한 내성에 관여하는 다양한 기전 중에서도 다약물 내성 (MDR; Multi-DrugResistance)이 중요한 부분을 차지하고 있다 (Brooks et al., 2003). 다약물 내성은 사용 중인 항암제뿐만 아니라 구조나 기능이 전혀 다른 다양한 항암제에도 내성을 보이는 현상을 말한다 (Biedler et al., 1975;Gottesman, 2002). 실제 암 환자에 화학 요법을 시도할 때 어떤 항암제가 효력을 발휘하지 못하는 경우에 이후 다른 항암제에 대해서도 내성을 보이는 사례가 빈번하며, 초기 치료 시 작용기전이 다른 여러 종류의 항암제를 동시에 투여하는 복합 화학 요법을 시도했음에도 불구하고 치료 효과가 없는 현상을 자주 관찰할 수 있다. 이로 인하여 사용 가능한 항암제의 범위가 매우 제한되는 것은 암의 화학 요법에 있어서 중요한 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 적합한 치료 반응성 표식자를 이용한 선별은 항암제 치료의 획기적인 진보를 초래할 수 있다. 이에, SNP 유전자형에 따른 개별 항암제의 치료 반응성에 관한 연구가 최근 지속적으로 활발하게 전개되고 있다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물의 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 용도를 제공한다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하는 단계; 및 검출된 결과를 분석하여 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료제의 투여 여부를 결정하는 단계를 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하여 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 EZH2 단백질 변이체는 분리된 EZH2 단백질 변이체일 수 있다.
상기 EZH2 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다. 따라서, EZH2 단백질 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되어 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 EZH2 단백질 변이체인 것일 수 있다.
용어, "EZH2 단백질 변이체"란 서열번호 1로 표시되는 EZH2 단백질의 아미노산 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 EZH2 유전자 변이체에 의해 코딩되는 단백질인 것일 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 변이체인 것일 수 있다.
아미노산 치환은 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 변경되는 것에 의하여 아미노산 서열이 변경된 것을 의미한다. 아미노산 변이는, 미스센스 변이 (missense mutation,과오 변이), 잠재성 변이 (silent mutation),넌센스 변이 (nonsense mutation),중립 변이 (neutralmutation),인트론에서 일어나는 변이, 격자이동 변이 (Frame shift mutation,프레임 쉬프트) 등을 야기할 수 있다. 미스센스 변이는 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 변경되는 것에 의하여 다른 아미노산이 코딩되는 변경을 의미한다. 상기 EZH2 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 미스센스 변이를 갖는 것일 수 있다.
EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) 단백질은 EZH2 유전자에 의해 코딩되는 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 (histone-lysine N-methyltransferase)이다. 상기 EZH2는 EC 2.1.1.43에 속하는 단백질인 것일 수 있다. EZH2는 DNA 메틸화에 관여하여 전사를 억제하는 기능을 한다. EZH2는 인간의 경우, (GRCh38/hg38) chr7:148,807,383-148,884,321의 핵산 서열, NCBI Accession numberNM_004456의 핵산 서열, 또는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다.
상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 EZH2 유전자 변이체인 것일 수 있다.
용어, "EZH2 유전자 변이체"란 서열번호 2로 표시되는 EZH2 유전자의 뉴클레오티드 서열 일부에 변이가 일어난 것을 의미한다. 구체적으로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 EZH2 유전자 변이체인 것일 수 있다.
상기 EZH2 유전자 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서 SNP를 포함하는 것일 수 있다. 상기 EZH2 유전자 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 SNP를 포함하는 것일 수 있다.
단일 염기 다형성 (single nucleotidepolymorphism : SNP)는, 당업계에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. SNP는 집단 내의 게놈에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성을 나타내는 것일 수 있다. 상기 SNP는 집단 내의 SNP의 소수 대립인자의 빈도가 7% 이상인 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 EZH2 단백질 변이체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 EZH2 유전자 변이체는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 마커인 것일 수 있다.
용어 "마커"는 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측할 수 있는 표지를 의미한다. 상기 생존 예후는 항암 화학 요법에 따른 반응성 및 이에 따른 생존 예후인 것일 수 있다.
환자는 폐암이 발병한 환자를 의미한다. 상기 폐암은 폐에서 기원한 악성 종양을 의미하며, 편평상피암, 선암, 대세포암, 및 소세포암을 포함하는 것일 수 있다. 상기 마커는 편평상피암, 선암, 대세포암, 또는 소세포암 환자에 있어서, 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 마커인 것일 수 있다.
용어, "예후"는 폐암과 같은 질환의 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성 또는 감수성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다.
예후는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있고, 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 대한 반응성 및 이에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있다. 항암 화학 요법은 항암제를 이용하는 치료 요법을 의미하는 것일 수 있다. 예후는 예를 들면, 탁센 (taxane)계 화합물을 포함하는 항암제를 투여한 폐암 환자에서, 항암제에 대한 반응성 및 이에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있고, 도세탁셀을 포함하는 항암제를 투여한 폐암 환자에서 항암제에 대한 반응성 및 이에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있다. 상기 항암 화학 요법은 1차로 치료, 2차로 치료, 또는 3차로 치료된 것일 수 있다. 일반적으로 폐암이 진행성인 경우에는 항암 화학 요법으로 치료를 시행하고 있고, 도세탁셀, 파클리탁셀과 같은 탁센계 화합물을 투여하여 치료를 시행하고 있지만, 비슷한 임상적 특징 또는 비슷한 병기를 가지는 환자들 중에서도 항암 화학 요법에 대한 반응이 다양하고 생존 예후에 상당한 차이를 보인다. 상기 마커를 이용하는 경우 항암 화학 요법에 대한 반응성을 정확하게 예측할 수 있으며, 이에 따른 생존 예후를 용이하게 판단할 수 있어, 추가 필요한 치료 방법의 진행 방향을 손쉽게 결정할 수 있다. 이로써 폐암 발병 후의 생존율을 현저히 높일 수 있다.
용어, "예측"이란 환자가 항암 화학 요법 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 생존할 가능성을 미리 판단하는 것을 의미한다. 생존 예후를 예측하는 것은 환자의 치료, 예를 들면 특정 항암제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 항암 화학 요법으로 치료된 후 생존 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 상기 마커를 이용하는 경우 폐암 환자에게 가장 적절한 치료 방법을 선택하도록 도움을 줄 수 있고, 특정 항암 화학 요법에 선호적으로 반응하는지 확인하거나, 항암 화학 요법을 투여한 후 환자의 장기 생존 여부를 예측할 수 있다.
유의성 있는 마커의 선택과 적용은 예측의 신뢰도를 결정할 수 있다. 유의성 있는 마커란 예측 결과가 정확하여 타당도 (validity)가 높고, 반복 측정 시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도 (reliability)가 높은 마커를 의미할 수 있다. 상기 마커로서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는, 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 정확하게 예측할 수 있는 신뢰도가 높은 마커이다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공한다.
용어, "단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질을 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p.D185H 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것일 수 있다.
용어, "단백질의 p.D185H 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 단백질의 p.D185H 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다.
상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 EZH2 단백질 변이체, 예를 들어 EZH2 변이체의 p.D185H 변이 부위를 타겟 (target)으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있고, EZH2 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있고, 서열번호 1의 단백질의 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 EZH2 단백질 변이체에 특이적인 항체일 수 있다.
용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 폴리펩티드 분자를 의미한다. 상기 EZH2 단백질 변이체에 특이적인 항체는, EZH2 단백질 변이체를 코딩하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝 (cloning)하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 EZH2 단백질 변이체를 얻고, 얻어진 EZH2 단백질 변이체로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 EZH2 단백질 변이체에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함하는 것일 수 있다. 상기 EZH2 단백질 변이체를 검출할 수 있는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 (light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄 (heavy chain)을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
용어, "폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것일 수 있다.
용어, "폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제"란 개체의 시료 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 확인하거나 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치를 포함하고 상기 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 SNP 부위는 서열번호 2에서 553번 위치의 뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 EZH2 유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 물질, EZH2 유전자 변이체의 c.553G>C 변이 부위에 특이적으로 결합하는 물질, 또는 EZH2 유전자 변이체의 c.553G>C 변이 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 553번 위치인 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고 다른 핵산 물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것일 수 있다.
상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 통상의 기술자가 EZH2 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 디자인할 수 있다.
용어, "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7 내지 50nt의 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소 (reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산 (nucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, EZH2 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열 부위의 센스 (sense) 및 안티센스 (antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측할 수 있다.
용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 (labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, EZH2 유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측할 수 있다.
용어, "안티센스 핵산"은 타겟으로 하는 EZH2 유전자 변이체에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 EZH2 유전자 변이체와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, EZH2 유전자 변이체를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것일 수 있다. 상기 단편은 5nt 이상, 10nt 이상, 10 내지 1000nt, 10 내지 500nt, 15 내지 500nt, 15 내지 300nt, 15 내지 200nt, 또는 15 내지 150nt의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 개체에서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출함으로써, 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측할 수 있다.
상기 키트에는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 특이적으로 인지하는 항체, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산이 포함될 수 있고, 이에 추가로 분석에 적합한 1종 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적으로, 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
상기 RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되고, 상기 비특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되지 않는 경우, 증폭에 사용된 시료 중에서 폐암 환자의 항암제에 대한 반응성이 낮고, 이에 따른 생존 예후가 나쁜 것과 관련된 서열이 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 마이크로어레이는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 의미한다. 상기 마이크로어레이는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다.
또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 완전 상보적인 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되고, 상기 미스매치 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되지 않는 경우, 시료 중에서 폐암 환자의 항암제에 대한 반응성이 낮고, 이에 따른 생존 예후가 나쁜 것과 관련된 서열이 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현수준을 측정할 수 있다. 단백질 칩 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 발색 효소로는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광 물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질로는 ABTS (2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 항원-항체 반응 결과, 발색 또는 형광 수준에 기초하여 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.
다른 양상은, 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위하여, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공한다.
용어, "개체"는 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하고자 하는 폐암 환자를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있고, 포유동물일 수 있으며, 예를 들면 인간 (Homo sapiens), 한국인일 수 있다. 상기 폐암 환자는 병리학적 병기가 Ⅳ인 폐암 환자일 수 있다.
용어, "생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 조직, 종양 조직, 폐 종양 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.
상기 단백질을 검출하는 방법은 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 단백질을 검출하는 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된, p.D185H 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질을 검출하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 효소면역흡착법 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역분석법 (radioimmunoassay: RIA), 방사선 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석 (Immunoprecipitation Assay), 보체고정분석 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter: FACS), 단백질 칩 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법은 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 뉴클레오티드를 검출하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법은 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등일 수 있다. 또는, 알려진 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법 (sequencing method)에 의하여 SNP 위치의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법은 생거 (또는 디데옥시) 방법 또는 막삼-길버트 (화학 절단) 방법일 수 있다.
상기 방법은 상기 SNP 부위의 뉴클레오티드를 결정한 결과 위험 대립인자가 존재하는 경우, 상기 개체를 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단백질을 검출한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아미노산이 히스티딘(H)이거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드을 검출한 결과, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 뉴클레오티드가 시토신(C)인 경우, 상기 개체를 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "위험 대립인자 (risk allele)"란 기준 대립인자를 소수 대립인자 a로 하여 폐암 환자에서의 a의 빈도가 다른 폐암 환자에서의 a의 발현 빈도보다 유의하게 큰 경우에는 a를 위험 대립인자로 할 수 있다. 개체가 위험 대립인자를 많이 가질수록 항암제에 대한 반응성이 낮고, 이에 대한 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 폐암 환자에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 시토신(C)의 빈도가, 다른 폐암 환자에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 시토신(C)의 발현 빈도보다 유의하게 큰 경우에는 시토신(C)를 위험 대립인자로 할 수 있다. 개체가 C를 많이 가질수록 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정할 수 있다.
항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정하는 것은, 항암 화학 요법에 따른 생존 예후의 상대적인 정도를 예측하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군에 비하여 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜지를 예측하기 위한 것일 수 있다. 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁘다는 것은 항암제에 대한 반응성이 낮고, 이에 따른 생존 예후가 나쁜 것일 수 있다. 생존 예후가 나쁜 것은 생존율이 낮은 것, 생존 기간이 짧은 것, 또는 무진행 생존 기간이 짧은 것을 의미하는 것일 수 있다. 항암제에 대한 반응성이 낮은 것은 항암제에 대한 내성을 갖는 것, 또는 항암제에 대한 감수성이 낮은 것을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들면, 폐암 환자가 CC 또는 GC의 유전자형을 갖는 경우, GG의 유전자형을 갖는 경우에 비하여, 항암제에 대한 반응성이 낮고, 생존 예후가 나쁜지를 예측하기 위한 것일 수 있다.
상기 항암제는 탁센 (taxane)계 화합물일 수 있다. 상기 항암제는 도세탁셀 (Docetaxel, taxotere) 또는 파클리탁셀 (Paclitaxel, Taxol) 일 수 있다. 도세탁셀은 세포 분열시 염색체를 양극으로 운반하게 하는 미세소관의 생성을 방해하여 정상 세포보다 분열이 잦은 암세포를 사멸시킬 수 있다. 마찬가지로, 파클리탁셀은 세포 분열을 방해하여 암세포를 사멸시킬 수 있다.
다른 양상은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물의 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 용도를 제공한다.
다른 양상은, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 정보제공 방법에서, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 검출되면, 폐암 생존 예후가 나쁜 것으로 판단할 수 있다.
다른 양상은, 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및 검출된 결과를 분석하여 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료제의 투여 여부를 결정하는 단계를 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하여 치료하는 방법을 제공한다.
상기 치료하는 방법은 상기 단백질을 검출하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 검출에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 치료하는 방법은 검출된 결과를 분석하여 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료제의 투여 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 상기 뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 뉴클레오티드를 검정한 결과 위험 대립인자가 존재하는 경우, 상기 개체를 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 폐암 환자가 CC 또는 GC의 유전자형을 갖는 경우, GG의 유전자형을 갖는 경우에 비하여, 항암제에 대한 반응성이 낮고, 생존 예후가 나쁜 위험군인 것으로 예측할 수 있다. 이후, 상기 위험군으로 결정된 개체에 대하여 상기 개체에 적용되는 약물, 즉 폐암 치료제의 사용 및 투여 여부를 결정할 수 있다. 상기 폐암 치료제는, 예를 들어, 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 니드란(Nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(Bleomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 미토마이신 C(Mitomycin C), 시타라빈(Cytarabine), 플루로우라실(Flurouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 트리메트렉세이트(Trimetrexate), 메토크렉세이트(Methotrexate), 에토포시드(Etoposide), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(Alimta), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 베바시주맙(Bevacizumab), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 피시바닐 바이알(Picibanil Vial), 아크라루비신(Aclarubicin), 테가푸르(Tegafur), 에피루비신(Epirubicin), 베로테칸(Belotecan), 안트라싸이클린(anthracycline), 이다루비신(idarubicin), 닥티노마이신(dactinomycin)일 수 있으며, 도세탁셀, 파클리탁셀과 같은 탁센계 화합물을 포함할 수 있다.
상기 폐암 치료제의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 치료제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
상기 SNP는 항암 화학 요법의 반응과 생존율을 예측할 수 있는 바이오 마커로 적용이 가능하다. 상기 SNP를 분석함으로써 항암 화학 요법에 효과가 있는 환자군을 선별하고, 폐암 환자의 치료 방향을 제시하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1a은 도세탁셀을 투여한 환자군 내에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.D185H 변이를 갖는 환자군 및 p.D185H 변이를 갖지 않는 환자군에서의 카플란 메이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸다. 도 1b는 도세탁셀을 투여하지 않은 환자군 내에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.D185H 변이를 갖는 환자군 및 p.D185H 변이를 갖지 않는 환자군에서의 카플란 메이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 1에 있어서, "p-값"은 상기 SNP의 유전형의 분포가 도세탁셀을 투여한 군과 도세탁셀을 투여하지 않은 군에서 유의하게 차이가 나는지에 대한 검증의 결과인 p-값 (p-value)을 의미한다.
도 2는 p.D185H 변이를 갖는 EZH2 단백질의 단백질 복합체 형성 여부를 확인한 것이다.
도 3은 p.D185H 변이를 갖는 EZH2 단백질 및 p.D185H 변이를 갖지 않는 EZH2 단백질에서 항암 화학 요법의 반응성을 확인한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. D185H 변이를 갖는 폐암 환자에서 항암제 투여에 따른 생존율 확인
1. 폐암 환자의 통합 데이터 구축
삼성 서울 병원에서 폐암으로 진단 받은 환자 총 378명, 항암 화학 요법으로 도세탁셀을 투여한 환자군 57명과 도세탁셀을 투여하지 않은 환자군 321명을 대상으로 유전체 데이터 및 상기 환자들의 임상평가, 진단 및 치료 기록을 통합하여, 통합 데이터를 구축하였다.
상기 폐암으로 진단받은 환자 총 378명의 폐 종양 조직을 수득하였다. 이어서, QiAmp DNA 키트 (Qiagen, Germany)를 이용하여, 상기 378명의 폐 종양 조직으로부터 유전체 DNA을 수득하였다. Covaris S220 (Covaris, MA, USA)를 사용하여 각 종양 조직으로부터 확보한 유전체 DNA (약 250ng)를 전단 (shearing)한 후, 말단을 평활화 시키고 (end-repair), A를 결합시키고 (A-tailing), 양 말단에 특이적인 어댑터 (adaptor)를 결합 (ligation)시키고, 이를 증폭하여 시퀀싱을 위한 라이브러리를 제작하였다. Miseq 게놈 분석기 (Illumina, USA)를 사용하여 제작된 라이브러리를 대상으로 시퀀싱을 수행하였다. 이 때, UCSC assembly hg19 (GRCh37)를 참조 게놈 (http://genome.ucsc.edu)으로 사용하였다. 게놈 분석기에서 획득한 시퀀싱 리드 (reads) 데이터를 버로우-휠러-정렬 (Burrows-Wheeler Aligner : BWA) 알고리즘을 사용하여 UCSC assembly hg19 (GRCh37) 참조 게놈에 정렬하였다 (http://genome.ucsc.edu). PCR duplication은 Picard-tools-1.8 (http://picard.sourceforge.net/)를 사용하여 제거하였으며, GATK-2.2.9 알고리즘을 사용하여 단일 뉴클레오티드 변이 (Single NucleotideVariation : SNV) 및 삽입-결실 변이 (Indel)를 검출하였다.
상기 378명의 폐암 환자의 진단 및 치료 기록을 수득하였다. 상기 폐암으로 진단받은 환자 모두는 항암 화학 요법 전에 방사선 요법을 받지 않았다. 항암 화학 요법으로 도세탁셀을 투여한 환자군 57명에 대한 폐암 병기 시스템에 따른 분류는 다음과 같다: 단계 I 6례; 단계 II 1례; 단계 III 1례; 단계 IV 46례. 항암 화학 요법으로 도세탁셀을 투여한 환자군은, 60 내지 75㎎/㎡의 도세탁셀을 5%의 덱스트로스 (dextrose)를 함유하는 증류수와 혼합하여, 3주 간격으로 1시간에 걸쳐 정맥 주사하였다. 도세탁셀을 투여하지 않은 환자군은, 시스플라틴 (cisplatin) 또는 페메트렉시드 (pemetrexed)를 투여받았다. 질병 진행, 독성 여부, 또는 환자 또는 의사의 결정을 고려하여, 항암 화학 요법을 중단하였다.
상기 폐암으로 진단 받은 환자 총 378명의 유전체 데이터 및 상기 환자들의 임상평가, 진단 및 치료 기록을 통합하였다. 통합된 데이터를 원 (raw data)로 사용하고, 상기 원 데이터로부터 항암제와 전반적인 생존에 대한 연관성을 분석한 후, 유의한 변이를 탐색하였다.
2. 통계 분석
유전자형과 생존율 사이의 연관성은 HR 위험도 (Hazard ratios :HR) 및 95% 신뢰도 (CIs)를 사용하여 측정하였다. 유전자형에 따른 생존율의 차이는 로그 순위 (log-rank) 검정을 이용하여 비교하였다. 유전자형에 따른 생존율을 카플란 메이어 (Kaplan-Meier) 방법을 이용하여 계산하였다. 모든 분석은 R 통계분석 시스템을 이용하였다.
3. 폐암 환자의 SNP가 항암 화학 요법의 반응성 및 생존율에 미치는 영향 확인
도세탁셀을 투여받은 폐암 환자의 성별, 나이, 병리학적 특성을 하기 표 1에 나타내었다.
임상변수 카테고리 EZH2 D185H (+) EZH2 D185H (-)
환자수 % 환자수 %
성별 남성 7 70 26 55.3
여성 3 30 21 44.7
나이 < 60 7 70 19 40.4
60 3 30 28 59.6
병리학적 병기 Ⅳ 9 90 37 78.7
Ⅲ 0 0 1 2.1
Ⅱ 0 0 1 2.1
Ⅰ 1 10 5 10.6
NA 0 0 3 6.4
생존율과 SNP의 연관성을 분석하였다. 이 때, 생존기간은 진단일과 사망일 또는 최종 진료일 사이의 시간으로 기록하였다.
도 1a은 도세탁셀을 투여한 환자군 내에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.D185H 변이를 갖는 환자군 및 p.D185H 변이를 갖지 않는 환자군에서의 카플란 메이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸다. 도 1a을 참조하면, 도세탁셀을 투여한 폐암 환자군에서, EZH2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 유전자형이 GC 또는 CC인 경우, GG인 경우에 비하여, HR 위험도가 약 2.9 배 높았다. 또한, EZH2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 유전자형이 GC 또는 CC인 경우, GG인 경우에 비하여, 평균 생존기간이 약 2.9배 이상 짧았다.
이로부터, EZH2의 SNP, rs2302427는 생존율과 연관성이 높은 것을 알 수 있다. 즉 G 대립인자에 비하여 C 대립인자를 가질 때, 항암 화학 요법에 대한 반응성 및 이에 따른 HR 위험도가 약 2.9배 높은 것을 알 수 있다. GC 또는 CC 유전자형을 가지는 환자의 경우, 도세탁셀에 대한 항암제 내성을 가지는 것으로 판단된다.
도 1b는 도세탁셀을 투여하지 않은 환자군 내에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 p.D185H 변이를 갖는 환자군 및 p.D185H 변이를 갖지 않는 환자군에서의 카플란 메이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 1b를 참조하면, 도세탁셀을 투여하지 않은 폐암 환자군에서, EZH2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 유전자형이 GC 또는 CC인 경우, GG인 경우에 비하여, HR 위험도에 유의한 차이를 보이지 않았다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 SNP는 마커는, 상기 SNP를 갖는 폐암 환자군에 도세탁셀을 투여한 경우 그 대한 반응성 및 생존 예후에 유의한 차이가 있음이 확인되어, 도세탁셀에 대한 반응성 및 이에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 마커로 작용함을 확인하였다.
EZH2rs2302427 도세탁셀을 투여한 군 도세탁셀을 투여하지 않은 군
다형성유전자형 발생수 평균 생존기간(일)(95%CI) 로그 순위 p HR(95%CI) P 발생수 평균 생존기간(일)(95%CI) 로그 순위 p HR(95%CI) P
GG 47 1773 (1376, NA) 0.020 1.00 0.026 262 2681 (2069, NA) 0.12 1.00 0.12
GC/CC 10 602 (597, NA) 2.933 (1.134, 7.584) 59 2110 (1596,NA) 1.53 (0.90, 2.61)
표 2는 폐암 환자 378명에 대하여, SNP 위치에서 GG 또는 GC/CC 유전형을 가지는 환자수, 평균 생존 기간 등을 나타내는 표이다. 표 2에 나타낸 SNP는 rs 번호 rs2302427를 갖고, p.D185H 및 c.553G>C의 변이를 갖는다. 표 2에 있어서, rs 번호는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information) 진뱅크 (GENEBANK)에 등록된 SNP의 번호로서, 상기 서열번호에 나타낸 서열은 SNP를 포함하는 이들 서열의 일부를 나타낸 것이다. 당업자라면, rs 번호를 참조하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 서열번호로 표시되는 서열은 NCBI 진뱅크 등록번호 (rs 번호)에 의하여 나타내어지는 서열의 일부로서 SNP 부위를 포함하는 서열이다. 표 2에 있어서, "p-값"은 상기 SNP의 유전형의 분포가 도세탁셀을 투여한 군과 도세탁셀을 투여하지 않은 군에서 유의하게 차이가 나는지에 대한 검증의 결과인 p-값 (p-value)을 의미한다.
이러한 결과는 확인된 SNP가 항암 화학 요법의 반응과 생존율을 예측할 수 있는 조직학적 특이성을 가진 바이오 마커로 적용이 가능하다는 것을 보여준다. 특히, 상기 SNP는 도세탁셀 항암 화학 요법으로 치료한 폐암 환자에 있어서, 항암 화학 요법 반응과 생존을 예측하는 생체 지표로 사용될 수 있다. 따라서, 상기 SNP의 분석은 도세탁셀 항암 화학 요법에 효과가 있는 소그룹의 선별에 유용할 것이며, 말기 폐암 환자의 치료 요법을 결정하는 데에도 도움이 될 수 있다.
4. 폐암 환자의 SNP가 단백질 복합체 형성에 미치는 영향 확인
EZH2는 대부분의 히스톤 메틸화 효소가 가지고 있는 SET domain을 가진 효소로, Suz12,EED, RbAp48/46 등과 함께 복합체를 이루어 히스톤 H3의 27번째 라이신(K) 잔기를 메틸화 시키며, 히스톤 공유변형을 유발할 뿐만 아니라, DNA 메틸화 효소인 DNMT와 결합으로 인한 DNA 메틸화를 유도하여 유전자 발현을 억제한다. 따라서, EZH2의 SNP가 단백질 복합체 형성, 즉 Suz12, EED, RbAp48/46 등과의 결합력 여부에 영향을 미치는지 확인하기 위해 면역침강법을 수행하였다.
4-1. EZH2 클로닝
전장 인간 EZH2를 코딩하는 cDNA 클론을 Origene社로부터 구매하여 준비하였다. EZH2 돌연변이체(mutants), 특히 D185H(GAC-->CAC)는 QuikChangeSite-Directed Mutagenesiskit(Stratagene)를 사용하여 생성하였으며, 돌연변이 여부를 시퀀싱을 통해 확인하였다.
4-2. 세포배양 및 형질도입( transfection )
폐선암종 세포주인 NCI-H23와 293T 세포주를 각각 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 RPMI-1640 및 DMEM에 37℃, 5% CO2로 유지시켰다. 이후, EZH2를 과발현 시키기 위해, GFP-표지된 wild type EZH2 및 EZH2 돌연변이체(D185H)를 발현하는 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 Nucleofector 용액(Amaxa) 또는 리포펙타민(Liopofectamine) 3000(Invitrogen)를 사용하여 세포 내로 형질도입 시켰다.
4-3. 상호면역침전(Co- immunoprecipitation )
형질도입 후, 48시간에 293T 세포를 용해 완충액에서 20분 동안 용해시킨 후, 4℃에서 10분 동안 원심분리 하였다. 세포 용해물을 단백질 G 마그네틱 비드(magnetic beads)(Thermo Fisher Scientific) 및 GFP 항체(Abcam) 2㎍과 혼합하여 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 마그네틱을 이용하여 면역 복합체를 수집하고 세척 완충제로 2회 세척하였다. 전체 세포 용해물 및 단백질 복합체와 관련된 비드를 SDS-PAGE로 분리하고 적절한 항체를 이용하여 면역 블로팅하였다.
4-4. 면역블롯 방법( Immunoblotting assay)
GFP, EED, EZH2 (Abcam), 및 SUZ12 (Cell signaling)을 사용하여 단백질 블롯팅을 수행하였다. Horseradish peroxidase (HRP)-컨쥬게이트 2차 항체(Bio-Rad)를 사용하여 1차 항체를 검출하고, 면역염색된(Immunostained) 단백질은 ECL 검출 시스템 (Thermo Fisher Scientific)으로 시각화 하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 단백질 복합체의 구성 요소인 Suz12 및 EED의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있다. 즉, EZH2의 SNP, rs2302427는 단백질 복합체의 형성력을 감소시킬 수 있다.
5. 폐암 환자의 SNP가 항암 화학 요법의 저항성에 미치는 영향 확인
EZH2의 SNP, rs2302427가 항암제에 대하여 저항성을 갖는지 여부를 확인하기 위하여, p.D185H 변이를 갖는 EZH2가 형질도입된 NCI-H23 세포 및 p.D185H 변이를 갖지 않는 EZH2가 형질도입된 NCI-H23 세포를 96-well plate에 5x103 cell/well의 밀도로 3중 분주(seeding)하였다. 이후, 세포에 GSK126(10μM), GSK343(10μM), 도세탁셀(5μM), 및 파클리탁셀(10μM)을 48시간 동안 처리하였다. 세포 성장을 Cell Counting Kit-8 (Dojindo)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 분석하였다. 동일 과정을 3번 반복 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, p.D185H 변이를 갖는 EZH2가 형질도입된 세포는 p.D185H 변이를 갖지 않는 EZH2가 형질도입된 세포에 비하여 모든 항암제에서 세포 증식이 더 활발한 것을 확인할 수 있었다. 즉, EZH2의 SNP는 항암제에 대하여 내성을 가지는 바, 항암 화학 요법으로 치료한 폐암 환자에 있어서, 항암 화학 요법 반응과 생존을 예측하는 생체 지표로 사용될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (23)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
    폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p.D185H 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 10개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항암 화학 요법은 탁센 (taxane)계 화합물을 투여하는 것인 조성물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 키트.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
  11. 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위하여,
    개체로부터 분리된 생물학적 시료에서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 단백질을 검출한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아미노산이 히스티딘, 또는
    상기 폴리뉴클레오티드을 검출한 결과, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 뉴클레오티드가 시토신인 경우,
    상개 개체를 항암 화학 요법에 따른 생존 예후가 나쁜 위험군으로 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 p.D185H 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제인 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 항체인 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 단백질을 검출하는 방법은 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선 면역분석법, 방사선 면역확산법, 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 또는 단백질 칩인 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 사용하여 검출하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 c.553G>C 변이 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블랏팅 또는 DNA 칩인 것인 방법.
  20. 청구항 11에 있어서, 상기 항암 화학 요법은 탁센 (taxane)계 화합물을 투여하는 것인 방법.
  21. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물의 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 용도.
  22. 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하기 위한 정보제공 방법.
  23. 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 185번 위치의 아스파르테이트(D)가 히스티딘(H)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
    서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 553번 위치의 구아닌(G)이 시토신(C)으로 치환된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및
    검출된 결과를 분석하여 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료제의 투여 여부를 결정하는 단계를 포함하는 폐암 환자에서 항암 화학 요법에 따른 생존 예후를 예측하여 치료하는 방법.
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