CN101692088A - 一种肺癌血清学早期诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种肺癌血清学早期诊断试剂盒，从而对肺癌进行早期诊断。试剂盒包括：人体血浆中eIF3a标准品蛋白、生物素标记抗体、亲和素—过氧化物酶复合物、eIF3a抗体包被的96孔板、样品稀释液、抗体稀释液、亲和素—过氧化物酶复合物稀释液、TMB显色液、TMB反应终止液。该试剂盒具有可操作性强、可靠、稳定、特异性和灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本方法涉及到一种ELISA试剂盒，该试剂盒能够准确、稳定、特异和灵敏的检测人体血清中eIF3a的表达水平，从而对肺癌早期诊断提供实验室检查依据。
背景技术
肺癌是我国和全世界范围危害人类生命健康的常见肿瘤。在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。同时，由于缺乏有效的早期发现手段，中晚期病例治疗花费大而且收效小，5年生存率仅约10％，使得肺癌防治成为癌症防治的重中之重、难中之难。
我国肺癌的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势。20世纪90年代与70年代相比，我国肺癌的死亡率上升了111.85％。目前我国肺癌发病率已超过万分之三，达到十万分之三十五，成为发病率最高的恶性肿瘤。同时肺癌的死亡率已由20世纪70年代位居癌症死因的第4位攀升为第1位。由于已暴露的人群数目甚大，上升趋势至少要延续20～30年。
卫生部2006年5月29日发布《2006年中国“吸烟与健康”报告》。调查表明，我国肺癌的发病及死亡年龄有年轻化的趋向。报告显示，我国肺癌的发病及死亡年龄自40岁以后迅速上升，70岁达到高峰，75岁以后略有下降。女性和男性年龄发病率和死亡率的变化趋势基本一致。但在肺癌死亡率迅速上升的城市，不同时期的肺癌死亡率年龄曲线显示，肺癌死亡率高峰出现前移。
肺癌早期少有症状，因症状就诊者多属中晚期，疗效不佳。因而早期发现，早诊早治是提高肺癌治愈率、降低死亡率的关键。但是，目前全世界尚没有成熟的肺癌筛查方案。
eIF3a是一种新确定的肿瘤相关蛋白，它在肿瘤发生机制，维持恶性生物性状中具有重要作用，eIF3a的高度表达与细胞的分化增殖密切相关。现有研究表明eIF3a可能作为肺癌等常见恶性肿瘤的生物标志，对于肺癌早期诊断和分类，乃至预后具有临床意义。因此，检测eIF3a的表达水平可以用于早期诊断肺癌。
发明内容
本方法要解决的技术问题是，针对现有检测方法的缺乏，提出一种能够对人体血浆中eIF3a的表达水平进行定量检测的试剂盒，从而实现对肺癌进行早期诊断。该试剂盒具有可操作性强、可靠、稳定、特异性和灵敏度高等特点。
本发明肺癌血清学早期诊断试剂盒包括：人体eIF3a标准品蛋白、抗体包被的96孔板、样品稀释液、抗体稀释液、生物素标记抗体、亲和素-过氧化物酶复合物、亲和素-过氧化物酶复合物稀释液、TMB显色液、TMB反应终止液，抗体包被的96孔板中所述的抗体是免疫新西兰白兔产生的。
所述的人体eIF3a标准品蛋白是将eIF3acDNA PCR扩增后，构建pGEX-2T载体，转化大肠杆菌，原核表达后提取并纯化得到的蛋白，纯度大于85％。
抗体包被的96孔板中所述的抗体的制备过程如下：将纯化的150μg人体eIF3a蛋白分两次免疫雌性新西兰白兔，中间间隔30天，两次均为皮下注射；在每次注射后的7天开始收集兔血清2-4次，每次采血间隔两个星期，第一次100μl，第二次10-20ml，第三和四次为40ml，纯化抗体蛋白，抗体的效价为1∶5000。
所述的eIF3a抗体包被的96孔板，每孔包被4μg。
所述的样品稀释液为50mmol/L的碳酸盐缓冲液。
所述的抗体稀释液与亲和素-过氧化物酶复合物稀释液均为pH＝7.4PBST，配制如下：NaCl 2.0克、KH2PO4 0.2克、Na2HPO4·12H2O 2.9克、KCl 0.2克、NaN30.2克、加H2O至1000ml，再加入Tween20 0.5ml。
TMB反应终止液为0.5M H2SO4。
本发明是以免疫学反应为基础，将eIF3a和其多克隆抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测方法。本反应主要在聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
经过大量实验证明该多克隆抗体特异性和灵敏性均很高。其Western Blot检测结果如图1所示。A549，H1299，HepG2和Hela细胞株有eIF3a的表达，使用该抗体可以敏感的检测出eIF3a在上述细胞株中的表达，说明该抗体灵敏度较好。而NIH3T3无内源性eIF3a表达，该抗体没有检测出eIF3a，说明该抗体特异度较好。其具体检测方法如下：
将上述细胞均匀种于6孔板，每孔使用250μl RIPA强效细胞裂解液裂解细胞，10000转离心5分钟，收集上清并检测蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混合并变性5分钟。配制10％SDS-PAGE胶，每个孔上样30μg蛋白，电泳2小时。使用半干转膜仪转膜3小时，将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上。室温下将膜于10％封闭液中振荡封闭2小时。使用AbD按照1∶1000稀释，4℃孵育膜过夜。然后将膜与近红外标记的二抗于常温下孵育1小时。最后，将孵育好的膜于扫描仪上扫描，检测出eIF3a的蛋白表达量。
基于该抗体开发的试剂盒已经初步用于检测血浆中的eIF3a表达水平，并且有较好的灵敏度，检测40例肺癌患者和对照健康人的结果如表1所示：
表1 eIF3a在肺癌患者和健康人血浆中的表达水平
实验结果表明该试剂盒可以灵敏而准确的检测出患者血浆中的eIF3a的表达水平。
由以上初步实验可知，本发明为一种能够对人体血浆中eIF3a的表达水平进行定量检测的试剂盒，从而对肺癌进行早期诊断。该试剂盒具有可操作性强、可靠、稳定、特异性和灵敏度高等特点。
附图说明
图1为使用AbD检测A549，H1299，HepG2，Hela和NIH3T3细胞株中eIF3a的蛋白表达水平结果的电泳图；
图2为试剂盒检测标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明那个，而不是限制本发明。
实施例1：
本发明试剂盒组成如下：
1、人体eIF3a标准品蛋白(PCR扩增eIF3a cDNA后，构建pGEX-2T载体，转化大肠杆菌，原核表达后提取并纯化得到蛋白(纯度需大于85％)。
2、eIF3a抗体包被的96孔板(每孔包被4靏)，抗体的效价为1∶5000；
3、样品稀释液(50mmol/L碳酸盐缓冲液)
28.6g Na2CO3和16.9g NaHCO3溶于1L水中(10×)
4、抗体稀释液(pH＝7.4PBST)
5、生物素标记抗体
武汉博士德生物工程有限公司购买，产品型号：AR1107
6、亲和素-过氧化物酶复合物
武汉博士德生物工程有限公司购买，产品型号：SA2002
7、亲和素-过氧化物酶复合物稀释液(pH＝7.4 PBST)
| NaCl | 2.0克 |
| KH2PO4 | 0.2克 |
| Na2HPO4·12H2O | 2.9克 |
| KCl | 0.2克 |
| NaN3 | 0.2克 |
| H2O | 至1000ml |
| 吐温(Tween)20 | 0.5ml |
8、TMB显色液
购自北京康为世纪生物科技有限公司。产品型号：CW0050
9、TMB反应终止液(0.5M H2SO4)
本发明首先使用一种eIF3a的特异性抗体AbD，该抗体为免疫新西兰白兔所产生，其具体生产过程如下：将纯化的150ug eIF3a蛋白(具体步骤见标准品蛋白生产过程)分两次免疫雌性新西兰白兔，中间间隔30天，两次均为皮下注射。在每次注射后的7天开始收集兔血清2-4次，每次采血间隔两个星期，第一次100ul，第二次10-20ml，第三和四次为40ml。使用免疫前的血清做为对照，最后使用Pierce公司ImmunoPure immobilization试剂盒纯化蛋白，抗体的效价为1∶5000。
实施例2：
本发明具体检测方法如下：
加入100ul的标准蛋白，空白对照和待检测样品于96孔板中，37℃孵育2个小时；
去除孔中的液体；
加100ul的生物素标记抗体，37℃孵育1个小时；
去除孔中的液体并冲洗每个孔三遍；
加100ul亲和素-过氧化物酶复合物，37℃孵育1个小时；
去除孔中的液体并冲洗每个孔五遍；
加90ul TMB显色液，避光37℃孵育30分钟；
加50ul TMB反应终止液；
酶标仪450nm检测结果。
Claims (7)
1.一种肺癌血清学早期诊断试剂盒，其特征在于，包括：人体eIF3a标准品蛋白、抗体包被的96孔板、样品稀释液、抗体稀释液、生物素标记抗体、亲和素-过氧化物酶复合物、亲和素-过氧化物酶复合物稀释液、TMB显色液、TMB反应终止液，抗体包被的96孔板中所述的抗体是免疫新西兰白兔产生的。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的人体eIF3a标准品蛋白是将eIF3a cDNA PCR扩增后，构建pGEX-2T载体，转化大肠杆菌，原核表达后提取并纯化得到的蛋白，纯度大于85％。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，抗体包被的96孔板中所述的抗体的制备过程如下：将纯化的150μg人体eIF3a蛋白分两次免疫雌性新西兰白兔，中间间隔30天，两次均为皮下注射；在每次注射后的7天开始收集兔血清2-4次，每次采血间隔两个星期，第一次100μl，第二次10-20ml，第三和四次为40ml，纯化抗体蛋白，抗体的效价为1∶5000。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的eIF3a抗体包被的96孔板，每孔包被4μg。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液为50mmol/L的碳酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体稀释液与亲和素-过氧化物酶复合物稀释液均为pH＝7.4PBST，配制如下：NaCl 2.0克、KH2PO40.2克、Na2HPO4·12H2O 2.9克、KCl 0.2克、NaN30.2克、加H2O至1000ml，再加入Tween20 0.5ml。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，TMB反应终止液为0.5M H2SO4。
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|---|---|---|---|---|
| CN105779575A (zh) * | 2014-12-25 | 2016-07-20 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人eif3a基因的用途及其相关药物 |
| CN108473552A (zh) * | 2015-07-10 | 2018-08-31 | 韩国生命工学研究院 | 检测外泌体蛋白eif3a的特异性自身抗体的抗原性组合物和使用其诊断肝癌的方法 |
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2009
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| CN108473552B (zh) * | 2015-07-10 | 2021-11-02 | 韩国生命工学研究院 | 检测外泌体蛋白eif3a的特异性自身抗体的抗原性组合物和使用其诊断肝癌的方法 |
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