CN105849278A

CN105849278A - 基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片及其应用

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Publication number: CN105849278A
Application number: CN201480058936.8A
Authority: CN
Inventors: 李铮; 秦棪楠; 钟耀刚; 陈琳; 吴昊翔
Original assignee: 李铮
Current assignee: Shenzhen gedao sugar Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2016-08-10
Also published as: JP2017502307A; WO2015103743A1

Abstract

本发明提供一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，其中凝集素芯片至少包括Jacalin、GSL‑II、PTL‑I、SJA、GSL‑I、LCA、Con‑A、PTL‑II、DSA、VVA、GNA、PHA‑E+L、MAL‑II、AAL、PSA、WGA以及UEA‑I凝集素探针的组合，用该凝集素芯片制备检测唾液中糖蛋白糖链变化的试剂盒，以及利用该凝集素芯片检测唾液中糖蛋白糖链的变化的应用。

Description

基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病

的凝集素芯片及其应用技术领域本发明涉及一种鉴别疾病的凝集素芯片，具体涉及一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片。背景技术

国际癌症研究机构的最新资料表明，肝癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一， 2008年全球肝癌患者 74. 9万，死于肝癌的患者 69. 5 万，其中中国肝癌患者 40. 2 万，死于肝癌的患者 37. 2 万 (http：〃 globocan. iarc. fr/)。据中国卫生部《2012中国卫生统计年鉴》显示， 2011 年恶性肿瘤高居我国主要疾病死亡率的首位，而其中肝癌位居恶性肿瘤死亡率的第二位（http：〃 www. moh. gov. cn)。肝癌死亡率高的原因之一是当前肝癌的确诊通常是在晚期，因而错过了最佳的治疗时期，而且临床诊断后患者平均生存时间不到 12个月。甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP )是目前肝癌诊断的特异性指标，但 AFP测定存在假阳性和假阴性的问题。约 20%的晚期肝癌患者，直至病故前， AFP测定仍为阴性。病理组织学检查仍是目前诊断的金标准，但鉴于组织学检查固有的缺陷如损伤性检查、不能动态检测、存在取样差异等。因此寻求非损伤性检查，进行肝癌早期诊断，是防控肝癌的关键。

随着社会的进步，科学技术的发展，人们对医学检查的要求也越来越高，要求无创、简便、快速的疾病检查诊断方法。与血清标本相比，唾液采集安全方便、无创伤和无血源性疾病传播的危险。而且近年来，唾液作为临床样本已被广泛应用于多种疾病诸如艾滋病、自身免疫性疾病、酒精性肝硬变、囊性纤维病、糖尿病、心血管病、龋病等的药物水平监测、病情监控和疗效评价当中。文献和我们以往的研究工作表明唾液中含有丰富的 ^连接糖蛋白和连接糖蛋白，而唾液蛋白糖基化的改变与疾病的发生发展具有较高的关联性。从变化的唾液糖蛋白糖链中可以找到与疾病相关的生物标志物，而基于唾液检测的新技术和新方法也会逐渐成为今后非侵袭性临床诊断发展的一个方向。糖类物质同核酸一样是重要的生物信息分子，而且是基因信息的延续。随着分子生物学及细胞生物学的发展，糖类物质的其它诸多生物功能不断被认识，糖类物质不仅可以以多糖或游离寡糖的形式直接参与生命过程，而且可以作为糖复合物，如糖蛋白、蛋白多糖及糖脂等参与许多重要的生命活动。此外，糖复合物还与许多疾病，如癌症、细菌和病毒感染等疾病有着密切的关系。

我国 90%以上的肝癌为肝细胞癌（Hepatocel lular carcinoma, HCC )， 75%〜80%的 HCC发病与肝脏慢性病毒性感染有关，世界范围内 80%〜90%的 HCC患者伴随有肝纤维化。目前研究表明：在肝病的炎症、纤维化、癌变的过程中患者肝组织和血清中发生了糖蛋白糖链结构和功能的改变。糖链因其结构复杂和功能多样，包含了巨大的信息量，一旦在翻译后的修饰过程中发生糖链修饰紊乱，就会产生严重的后果。如在病理状态下，由于糖代谢酶类活力的改变或缺陷，可使糖蛋白上的糖链表达水平发生异常，导致细胞功能失常，甚至出现恶性发展。

国内外研究现状及分析：

( 1 ) 肝炎、肝纤维化 /肝硬化与肝癌发生发展过程中患者血清 / 肝组织中糖蛋白糖链发生变化，表明血清和组织中糖蛋白糖链变化与肝癌发生发展具有关联性。

我国是慢性肝炎特别是乙型肝炎的高流行区，约有 1. 2亿人长期携带乙肝病毒，慢性肝炎患者大约有 3000万。约有 30万慢性肝炎患者发展为肝硬化和肝癌患者。研究发现， 80%-90%的肝癌患者经历 "慢性肝炎一肝硬化一肝癌" 的过程。已有研究表明，在肝炎到肝纤维化 / 肝硬化过程中患者血清中糖蛋白糖链发生变化 ^[5]。如在乙肝病毒 (HBV)感染后肝纤维化患者血清中 Gal化双天线型 _糖链水平明显高于健康志愿者，同时血清中双天线型和三天线型 ^糖链水平伴随肝纤维化程度的加重而降低。另有研究表明随着肝纤维化的发展，血清中平分型核心 α (1，6^11(化双天线型 -糖链水平升高，而三天线型糖链降低，表明血清中特定 ^糖链水平的变化可以用来监测纤维化的发展。 Kam等利用 MALDI-T0F质谱技术定量分析了慢性 HBV感染和不同程度的肝纤维化患者血清中的 ^连接糖链谱的变化，发现了 17个糖链质谱峰可以作为肝纤维化 /肝硬化检测的潜在生物标志物，而 1341. 5、 1829. 7、 1933. 3和 2130. 3 m/z四个糖链质谱峰能鉴别诊断肝纤维化和肝硬化，准确率达 85%。 Qu等运用 DNA测序仪的荧光糖链电泳技术 (DSA-FACE) 评估了慢性 HBV患者血清中的 ^糖链谱的变化，发现糖链谱中峰 1， 2， 8和 10在一定程度上可以区分肝纤维化的不同阶段。研究也发现血清中透明质酸（HA)浓度变化与肝纤维化不同阶段的之间具有相关性。

在肝纤维化 /肝硬化与肝癌发生发展过程中患者血清和肝组织中糖蛋白糖链发生变化，如 Liu等运用 DSA-FACE检测肝纤维化、肝硬化和肝癌患者血清中的 9种糖链结构，发现 α -1， 3Fuc化三天线糖链结构在肝癌患者血清中的丰度最高，而平分型 α -1， 6核心 Fuc化双天线糖链结构在肝硬化患者血清中的丰度较高，证明这两种糖链在血清中的丰度变化与肿瘤发展阶段密切相关。 ^乙酰葡糖胺基转移酶 III (GnT- 111)、乙酰葡糖胺基转移酶 V (GnT- V ) 和 α 1， 6-岩藻糖基转移酶 ( a 1-6FT) 在肝癌患者血清及癌变组织中高表达，是肝癌相关的三种重要异常表达酶，能引起肝癌患者体内糖蛋白糖链结构的改变。研究也发现 Sia α -2， 6糖链结构在肝癌组织中高表达，但在肝硬化组织中并无明显变化，可作为区分肝硬化与肝癌的依据之一。

目前，在肝癌诊断标志物的研究中，一些新技术用于了肝癌患者血清中糖蛋白糖链结构的研究，发现了一些在肝癌发生发展过程中患者血清中特有的糖蛋白糖链。如，运用离子淌度质谱（ion mobil ity mass spectrometry, IM- MS) 技术分析了健康人、肝硬化和肝癌患者血清中糖蛋白糖链结构，发现肝硬化和肝癌中存在差异的糖链。 Liu 等运用凝集素芯片（含有 16种凝集素）技术分析 HCC和肝硬化患者血清中糖蛋白糖链结构的差异，发现 HCC患者血清中 Fuc化的糖蛋白丰度较高。应用 MALDI-TOF- MS定量比较了 77名随机选取的健康志愿者、 52名慢性肝病患者和 73名肝癌患者血清糖蛋白上的 83个 ^ 糖链，发现肝癌患者血清糖蛋白上 57个 ^糖链的丰度发生了显著变化，其中六种糖链可分别用于肝癌诊断，检测敏感性从 36%到 91%。三种 ^糖链的联用能从慢性肝病患者中诊断出肝癌患者，敏感性为 90%, 特异性为 89%。在肝癌（肿瘤直径小于 3厘米）早期诊断标志物的研究中，我国科学家发现血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3 (Glypican-3, GPC3)可作为检出早期肝癌的分子标志物。 GPC3 不仅有助于早期发现肝癌，而且具有很强的肝癌特异性，如作为 AFP的补充，有助于提高 HCC的确诊率。

上述的研究表明：在肝炎、肝纤维化 /肝硬化与肝癌发生发展过程中患者血清 /肝组织中糖蛋白糖链发生变化，表明血清和组织中糖蛋白糖链变化与肝癌发生发展具有关联性，通过血清区别检测肝炎、肝硬化与肝癌是可行的。但是鉴于血检固有的缺陷，如损伤和存在血源性疾病传播的危险，因此有必要进一步研究和寻求非损伤性鉴别诊断肝炎、肝硬化与肝癌的新技术和新方法。

(2) 唾液是一种理想的非损伤性疾病诊断介质，但唾液中糖蛋白糖链的变化与肝癌发生发展的关联性有待研究。

人体唾液由腮腺、下颌下腺、舌下腺和其他一些小腺体分泌，包含核酸、蛋白质、脂类、矿物质和其他小分子物质。唾液能起到维持口腔内环境稳定、润滑口腔壁、方便咀嚼、说话和吞咽食物的作用。另外，唾液中还存在抑制和消灭细菌和病毒的物质。唾液含量和组成上的变化，不管是由口腔局部病变还是机体整体状况引起的，都可能会造成唾液功能缺陷。研究发现，唾液中除了含有一些唾液基本组成性蛋白质（在不同性别和不同年龄段都几乎无差别表达的蛋白质或糖蛋白）外，还含有一些可以反应人体身体健康和生理状况的一些蛋白质，这些蛋白质往往在不同年龄、性别、病理和生理状况的人群中出现差异性表达。分析唾液中这些差异表达的蛋白质是进行人体健康状况评估和疾病相关生物标记物研究的基础。血液中的部分蛋白质成分同样存在于唾液中，唾液能反映出血液中部分蛋白质水平的变化。因此，就有可能通过唾液的检测来进行疾病的诊断。

肿瘤和内分泌器官一样，可以分泌激素、淋巴因子和细胞因子，通过血液运输到达远端器官，对全身产生影响。一旦这些因子到达唾液腺，或随唾液分泌进入口腔或导致唾液中的基因转录谱发生改变，引起某些蛋白质的丰度或种类改变，从而成为唾液中的肿瘤生物标志物。目前研究发现，人唾液中有 1939种蛋白质，人血桨中有 3 020种蛋白质， 27%的唾液蛋白质组与血桨蛋白质组重合。这表明许多血液循环中的生物标志物可能在唾液中得到鉴定，也进一步说明唾液可被用于诊断疾病。血桨蛋白质组学发现的 177个与心血管疾病相关的潜在生物标志物的蛋白质中， 40%的蛋白质同样出现在唾液蛋白质组中；在已列出的 1058个潜在癌症相关生物标志物的蛋白质中， 34%的蛋白质同样出现在唾液蛋白质组中。唾液和血桨的蛋白质组比较结果显示，有些蛋白质只在唾液蛋白质组中出现，而没有出现在血桨蛋白质组中，表明两者蛋白质种类并不完全一样。通过对唾液、血桨和人类全蛋白质组的 GO ( geneontology ) 注释比较，发现唾液和血桨蛋白质组中细胞外基质组分较多，而细胞内液组分较少，提示唾液和血桨蛋白质组具有分泌蛋白质组的特征；在生物学过程和分子功能方面的分析结果提示，唾液蛋白质组和血桨蛋白质组具有相似的生物学功能。因此，从唾液中筛选肿瘤标志物具有科学性和可行性，并具有非损伤性检测的优势。

随着凝集素亲和纯化、化学修饰方法捕获糖蛋白及串联质谱分析技术的发展，近 5年唾液糖蛋白质组的研究得到了较快的发展，推动了肿瘤相关唾液糖蛋白的筛选和鉴定。 2006年 Ramachandran等运用酰肼化学方法从唾液中鉴定到 45个 _糖蛋白， 2年后该研究组又通过分别鉴定唾液、腮腺、下颌下腺和舌下腺的糖蛋白，将鉴定的 -糖蛋白数目提高到 77个。最新研究显示，运用基于 6肽库的动态范围压缩技术、酰肼化学和串联质谱的方法，从唾液中共鉴定到 193 个 -糖蛋白。目前，在唾液中寻找年龄和性别相关的标志性糖蛋白也成为一个新的研究热点。如免疫球蛋白 A, 糖蛋白 340和粘蛋白 5B 等在唾液中的丰度随着年龄的增加而增加，而粘蛋白 7的丰度却随着年龄的增加而减少。其中粘蛋白 5B上的糖链谱随着血型的不同而有所不同。

凝集素芯片技术：可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化。

凝集素由于其可特异性识别不同糖链结构并可以多价形式与糖链高亲和性结合的特性被广泛用于糖组学的研究。凝集素芯片通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一，其有助于发展新的诊断和监测疾病的方法。

申请号为 201110021447. 3发明专利，是我们在前期用芯片点样仪将凝集素点制于环氧衍生化的玻片载体上，经固定化处理，制备出高覆盖率凝集素芯片。用凝集素芯片技术对临床样本中糖蛋白糖链与凝集素进行特异性结合的研究，分析各种样本中的糖蛋白糖链谱及其识别的凝集素。并借鉴基因芯片数据分析方法对糖蛋白糖链的表达谱进行数据统计分析，确定临床样本和正常对照组中糖蛋白糖链的差异结构。首先我们用标准糖蛋白 RNase B 和 Fetuin, 验证了凝集素芯片在检测糖蛋白糖链方面的可行性和可靠性，并应用凝集素芯片对 Chang' s liver 正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白进行了初步分析，发现糖蛋白上有多价 Sia 或 GlcNAc、末端 α -1， 3 man, GalNAc和 Gal β l-4GlcNAc 糖链结构。然后应用高覆盖率凝集素芯片研究转录生长因子活化的肝星状细胞（LX-2 ) 中糖蛋白糖链谱的变化，发现： AAL, PHA-E (菜豆凝集素 -E) 和 ECA识别的 Fuc、 N_GlcNAc和 Gal糖链结构在活化态细胞的胞膜上表达明显增强。应用芯片技术研究 CC1₄诱导小鼠肝纤维化模型中糖基因表达与肝细胞表面糖链谱之间的关联性。发现纤维化肝脏中有 10个糖基转移酶基因转录水平发生改变。首次揭示在肝纤维化发生过程中 ^Glycan的合成通路" Tn antigen → T antigen (core-1) → sialyl-T antigen"被激活。从糖组学角度揭示了肝纤维化形成过程中蛋白糖基化发生变化的分子机理。综上所述，本发明拟从 "乙肝一乙肝后肝硬化一肝癌"进展的三个阶段，利用已建立的糖组学技术和方法，寻找乙肝、乙肝后肝硬化和肝癌患者唾液中共有的和特有的糖蛋白糖链；将为非损伤性鉴别肝炎、肝硬化与肝癌提供新方法。发明内容

本发明的目的在于提供一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片及其应用，其能非损伤，快速鉴别唾液中糖蛋白糖链的变化，为非损伤性鉴别肝炎、肝硬化与肝癌提供新方法。本发明的技术解决方案是：一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组和对照探针，其特殊之处在于：所述测试凝集素探针组至少包括 Jacalin、 GSL_II、 PTL_I、 SJA、 GSL_I、 LCA、 Con_A、 PTL_II、 DSA、 WA、 GNA、 PHA_E+L、 MAL_II、 AAL、 PSA、 WGA以及 UEA-I凝集素探针的组合。

一种上述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白及糖链的变化。上述测试凝集素探针组还包括 WFA、 LTL、 LEL、 EEL以及 PWM凝集素探针的组合。一种上述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白及糖链的变化。

上述测试凝集素探针组还包括 PHA-E、 PNA、 MPL、 DBA, NPA、 BS_I 以及 SNA凝集素探针的组合。一种利用上述凝集素芯片制备检测唾液中糖蛋白及糖链的变化的试剂盒。

一种上述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白及糖链的变化。

一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组和对照探针，其特殊之处在于：所述测试凝集素探针组包括 I、 II及 III组，所述 I、 II及 III组分别是 Jacal in、GSL-II、PTL-I、 SJA、 GSL-I , IXA、 Con_A、 PTL-II , DSA、 WA、 GNA、 PHA - E+ MAL-II , AAL、 PSA、 WGA以及 UEA-I凝集素探针的组合， W 、 LTL、 LEU EEL 以及 PWM凝集素探针的组合以及 PHA-E、 PNA、 MPL、 DBA, NPA、 BS-I 以及 SNA凝集素探针的组合。一种利用上述凝集素芯片制备检测唾液中糖蛋白及糖链的变化的试剂盒。

本发明的有益效果是：能非损伤，高通量，快速鉴别唾液中糖蛋白及糖链的变化，为非损伤性鉴别肝炎、肝硬化与肝癌提供新方法。附图说明图 1为凝集素芯片上凝集素探针布局图；

图 2为健康人，乙肝，肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链荧光检测结果。

图 3为唾液芯片验证结果。 A为唾液芯片布局图， N1-N7为健康人唾液， HB1-HB6 为乙肝患者唾液， HC1-HC7 为肝硬化患者唾液， HCC1-HCC7为肝癌患者唾液。 B为凝集素 LTL与唾液芯片结合的荧光检测结果图。 C为 LTL对应健康人、乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液结合强度比较。

具体实施方式

1、实验部分 1. 1 试剂与材料

甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，吐温 -20和蛋白酶抑制剂均购自美国 Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白 (BSA)购自德国 Merck公司。 Cy3荧光均购自美国 Amerhsma公司。 T-PER动物组织蛋白提取试剂购自美国 PIERCE公司。其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进一步纯化。所有实验用水都为经 Milli-Q50纯水系统（美国 Millipore 公司）处理的超纯水。 Sephadex G-25 柱脱盐购自美国 GE Healthcare公司。芯片杂交盒购自美国 Bio-Rad伯乐公司。 PVDF 膜购自美国 Millipore公司。其它常见玻璃器皿均为国产。 37种凝集素（具体名称见表 1 ) 分别购自 Vector实验室，美国 Sigma-Aldrich 公司和德国 Calbiochem公司。表 1 凝集素具体名称表

縮略语英文全称中文全称

Jacalin Artocapus integrifolia 木菠萝凝集素

ECA Erythrina cristagalli Letin 鸡冠刺桐凝集素

HHL Hippeastrum Hybrid Lectin 孤挺花凝集素

WFA Wisteria Floribunda Agglutinin 紫藤花凝集素

GSL- II Griffonia Simplicifolia Lectin II 加纳子凝集素—Π

MAL- II Maackia Amurensis Lectin II 马鞍树凝集素- II

PHA-E Phaseolus vulgaris Agglutinin(E) 菜豆凝集素 -E

PTL- I Psophocarpus Tetragonolobus Lectin I 四棱豆凝集素- I

SJA Sophora Japonica Agglutinin 槐凝集素

PNA Peanut Agglutinin 花生凝集素

EEL Euonymus Europaeus Lectin 欧洲卫矛凝集素

AAL Aleuria Aurantia Lectin 橙黄网胞盘菌凝集素

LTL Lotus Tetragonolobus Lectin 四棱莲凝集素

MPL Madura Pomifera Leetin 橙桑凝集素

LEL Lycopersicon 番凝集素

Eseulentum(Tomato)Lectin

GSL- I Griffonia SimPlicifolia Lectin I 加纳子凝集素 I

DBA Dolchos Biflorus Agglutinin 双花扁豆凝集素

LCA Lens Culinaris Agglutinin 扁豆凝集素

RCA 120 Ricinus Communis Agglutinin I 蓖麻凝集素

STL Solanum Tuberosum(Potato)Lectin 马铃薯凝集素

BS- I Bandeiraea simplicifolia Lectin I 西非单叶豆凝集素 - I

ConA Canavalia ensiformis Agglutinin 伴刀豆凝集素

PTL- II Psophocarpus Tetragonolobus Lectin II 四棱豆凝集素 - II

DSA Datura stramonium Agglutinin 曼陀罗凝集素 SBA Soybean Agglutinin 大豆凝集素

VVA Vicia Villosa Agglutinin 蚕豆凝集素

NPL Narcissus Pseudonarcissus Lectin 水仙花凝集素

PSA Pisum Sativum Agglutinin 豌豆凝集素

ACA Amaranthus caudatus Agglutinin 尾穗觅凝集素

WGA Triticum vulgaris Agglutinin 麦胚凝集素

UEA- I Ulex Europaeus Agglutinin I 荆豆凝集素- 1

PWM Phytolacca americana Agglutinin 美洲商陆凝集素

MAL- I Maackia Amurensis Lectin I 马鞍树凝集素- 1

GNA Galanthus nivalis Agglutinin 雪莲花凝集素

BPL Bauhinia Purpurea Lectin 羊蹄甲凝集素

PHA-E+L Phaseolus vulgaris Agglutinin(E+L) 菜豆凝集素 -E+L

SNA Sambucus Nigra Agglutinin 西洋接骨木凝集素

1.2 实验仪器

电热鼓风干燥箱：天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本 TOMY公司；超速冷冻离心机 5804R: 德国 Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国 Implen公司；生物芯片扫描仪 4000B: 美国 Axon公司；芯片点样仪：博奥晶芯 SmartArrayer48点样仪；芯片杂交箱 HL-2000: 美国 UVP公司。

1.3 研究人群和全唾液采集

志愿者无其它疾病，一周之内没有服用任何药物。已确诊的乙肝患者 36例，乙肝后肝硬化患者 27例和乙肝致肝癌患者 27例。由于肝病患者平均年龄为 57-65岁， 20例健康志愿者平均年龄为 62岁。每组中 A, B, AB和 0型血型的个体比例一致，以保证唾液糖蛋白糖链不受血型的影响。饭后两小时，约 9点到 10点之间，生理盐水漱口三次后迅速采集自然分泌的全唾液。唾液采集至少 1 ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂（每毫升唾液加入 ΙμΙ^) 防止蛋白降解。

表 2 乙肝患者，乙肝后肝硬化患者和肝癌患者情况表

附注表 1 : ALT, 丙氨酸转氨酶； AST, 天冬氨酸转氨酶。

1.4 唾液蛋白处理和荧光标记收集到的全唾液经 12 000 rpm 4 °C离心 10 min后吸取上清弃去不溶沉淀物。上清再经 0.22 μπι孔径的滤膜过滤掉细菌和其他微生物。为了减小个体差异并归一化个体样本，按照不同分组每例样本各取 100 μΐ混合， BCA法蛋白定量。混合样本经 Cy3荧光染料标记后用 Sephadex G-25除盐柱去掉游离荧光。标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育。个例样本用于唾液芯片的点制。

1.5 凝集素芯片和数据分析

凝集素芯片的制备， Cy3 荧光标记的样本蛋白与凝集素芯片的孵育步骤及凝集素芯片数据获取与归一化分析与之前专利申请号 201110021447.3发明专利描述一致。

1.6唾液芯片的制备和数据分析

参见图 3，唾液芯片由个例唾液样本点制而成，样本根据健康人、乙肝、肝硬化和肝癌患者分成四组，分别 7例， 6例， 7例和 7例。

Cy3 标记的凝集素用以检测这些唾液样本中凝集素特异识别的糖链结构表达水平。唾液蛋白溶于点样缓冲液（0.5 mg/mL BSA溶于 l xPBS, pH 7.4 )中至终浓度 l mg/mL，并用芯片点样仪点制于环氧化修饰的玻片上。唾液芯片的布局图显示在图 3中 A部分。每个样本区内重复三次，每张片基三个重复区。点好的片基在 50%湿度中孵育过夜，然后 37 °C真空干燥 3 h固定，固定好的芯片可 4 °C避光密封保存备用。芯片首先在封闭缓冲液中常温封闭 lh， l xPBST和 l xPBS 各清洗两次，每次 5min，离心甩干。后加入配好的含 Cy3标记凝集素的孵育缓冲液，在芯片杂交箱内 4 rpm缓慢旋转 3h， l xPBST和 l xPBS各清洗两次，每次 10min，离心甩干。通过芯片扫描仪设置光电倍增管 70%和激光强度 100%, 在 532 nm波长处扫描芯片图像。图像经 Genepix 3.0软件分析获取原始数据。原始数据中小于两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本九个重复点的有效值再取平均值（A_s)，每组平均值表示为组内每个样本平均值（A_s) 的均值 (A_G) ±标准偏差（SDCJ)。任意两组或多组间借助 SPSS statistics 19 软件进行 t检验或单方面方差分析（one-way ANOVA)寻找显著差异，参见图 3中 B和 C部分。

2、结果部分

2.1 乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链谱的变化

利用凝集素芯片分别对健康志愿者、乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将三组肝病结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度（NFI) 在乙肝（HB)、肝硬化（HC) 和肝癌组（HCC) 分别比健康组（H) 得到 Fold-change值。我们认为 Fold-change > 2 和 Fold-change < 0.5为肝病患者相较于健康人在唾液中上调和下调表达的糖链。

结果发现，分别有 23种， 20种和 24种凝集素识别糖链在 HB、 HC和 HCC患者唾液中差异表达（表 3和图 2)。其中 Jacalin和 VVA 识别的 T/Tn抗原，唾液酸化 Τ/Τη抗原; PTL-L PTL-IL SJA和 GSL-I 等识别的 aGalNAc和 aGal (特别是末端）糖链结构； LCA、 Con-A 和 GNA识别的高甘露糖， α-D-Man, Manal-3Man结构；以及 GSL-Π 和 DSA识别的 β-D-GlcNA, (GlcNAcpi-4)_n等在三种肝病患者唾液中高表达。而 AAL、 PSA 和 UEA-1 识别的核心岩藻糖， Fuca-N-acetylchitobiose-Man 和 Fucal-2Gaipi-4Glc(NAc)等结构； MAL-II识别的 Siaa2-3Gaipi-4Glc(NAc)/Glc; WGA识别的多价唾液酸和 (GlcNAc)_n结构等则在三种肝病患者唾液中低表达。

除此之外， SNA识别的 Sia2-6Gal/GalNAc只在乙肝中高表达； PHA-E 识别的平分型 GlcNAc 和双天线 N-糖链， MPL 识别的 Gai 1 -3 GalNAc只在乙肝中低表达。 EEL识别的 Gala 1 -3 (Fuca 1 -2)Gal， PWM识别的分支型（LacNAc)_n只在肝癌中高表达； WFA识别的末端 GalNAca/pi-3/6Gal， LTL识别的 Fucal-3(Gaipi-4)GlcNAc只在肝癌中低表达。

2.2 乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链谱之间的比较

通过对乙肝、肝硬化和肝癌唾液的凝集素芯片结果比较，发现 PNA识别的 T抗原， MPL识别的 Gaipi-3GalNAc， NPA识别的高甘露糖和 Manal-6Man在肝硬化患者唾液中的表达水平显著高于乙肝患者，而 DSA和 WGA识别的多价唾液酸，（GlcNAc ^PfGlcNAcpi-^n 在肝硬化患者唾液中的表达水平显著低于乙肝患者。 PHA-E 识别的平分型 GlcNAc和双天线 N-糖链， LEL识别的 (GlcNAc)_n， WGA识别的多价唾液酸，（GlcNAc ^PfGlcNAcpi-^在肝癌患者唾液中的表达水平显著高于肝硬化患者，而 WFA 识别的末端 GalNAca/ i-3/6Gal, PNA识别的 T抗原， NPA识别的高甘露糖和 Manal-6Man, PSA识别的 Fuca-N-acetylchitobiose-Man在肝癌患者唾液中的表达水平显著低于肝硬化患者。

表 3 : 乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链谱的表达

HB/N HC/N HCC/N HC/HB HCC/HC

T/Tn antigen, sialyl-T(ST),

Jacalin 4.6 3.9 2.9 ― ― sialyl-Tn (STn)

WFA terminating in GalNAca/pi-3/6Gal ― ― 0.4 ― 0.3

GlcNAc and agalactosylated

GSL-II 2.0 2.3 2.7 ― ― tri/tetra antennary glycans

Siaa2-3Gaipi-4Glc(NAc)/Glc,

MAL-II Siaa2-3Gal, Siaa2-3, 0.4 0.4 0.5 ― ―

Siaa2-3GalNAc

Bisecting GlcNAc, biantennary

PHA-E complex-type N-glycan with outer 0.5 ― ― ― 2.1

Gal

GalNAc, GalNAca-l,3Gal,

PTL-I 4.5 4.2 4.2 ― ―

GalNAca- 1 ,3ϋα1β- 1 ,3/4Glc

Terminal in GalNAc and Gal,

SJA anti-A and anti-B human blood 2.2 2.5 2.6 ― ― group

PNA Gaip 1 -3GalNAca-Ser/Thr(T) 0.1 ― 0.3 23.9 0.2

Gala 1 -3 (Fuca 1 -2)Gal (blood group

EEL ― ― 2.4 ― ―

B antigen)

Fuc l -6GlcNAc(core fucose),

AAL 0.4 0.2 0.3 0.5 ―

Fucal-3(Gaipi-4)GlcNAc

LTL Fucal-3(Gaipi-4)GlcNAc ― ― 0.5 ― ―

MPL Gaipi-3GalNAc 0.2 ― ― 4.8

LEL (GlcNAc)n 0.2 0.5 ― ― 2.6

GSL-I aGalNAc, aGal, anti-A and B 2.3 2.2 2.6 ― ―

DBA aGalNAc, Tn antigen ― 2.6 2.7 ― ― α-D-Man, Fuca-l,6GlcNAc,

LCA 3.1 5.1 5.0 ― ― a-D-Glc

a-Gal, α-GalNAc, Gala-l,3Gal,

BS-I 100 ― ― 0.2 ―

Gala-l,6Glc

High-Mannose,

Con-A Mana 1 -6(Mana 1 -3)Man, terminal 2.4 3.1 3.6 ― ―

GlcNAc

PTL-II Gal, blood group H， T-antigen 2.0 2.5 2.1 ― ― β-D-GlcNA, (GlcNAcpi-4)n,

DSA 5.5 2.7 3.4 0.5 ―

Gaipi-4GlcNAc terminal GalNAc,

VVA GalNAca-Ser/Thr(Tn), 8.5 7.5 4.8

GalNAcal-3Gal

NPA High-Mannose, Manal-6Man ― 8.14 2.83 7.2 0.4

PSA Fuca-N-acetylchitobiose-Man 0 0.2 0.1 100 0.2

WGA Multivalent Sia and (GlcNAc)_n 0.1 0.02 0.3 0.2 15.8

UEA-I Fuca 1 -2Gaip 1 -4Glc(NAc) 0.4 0.2 0.4

PWM Branched (LacNAc)_n ― ― 2.0

GNA High-Mannose, Manal-3Man 3.9 3.9 3.3

Bisecting GlcNAc, bi-antennary

PHA-E+L N-glycans, tri- and tetra-antennary 100 100 100

complex-type N-glycan

SNA Sia2-6Gal/GalNAc 2.3 ― ―

附注：表中数据表示该组的凝集素芯片结果中每个凝集素对应 NFI 相对于对照组 NFI的 Fold-change值。 HB, 乙肝； HC,肝硬化； HCC, 肝癌； -，无显著差异； 100， Fold-change值的分母为零。

本发明凝集素探针筛选的结果，参见表 4，

表 4:

Ml (确定患有肝病） HB HC HCC

Jacalin † † †

GSL-II † † †

PTL-I † † †

SJA † † †

GSL-I † † †

LCA † † †

Con-A † † †

PTL-II † † † DSA † † †

VVA † † †

GNA † † †

PHA-E+L † † †

MAL-II Ϊ Ϊ Ϊ

AAL Ϊ Ϊ Ϊ

PSA Ϊ Ϊ Ϊ

WGA Ϊ Ϊ Ϊ

UEA-I Ϊ Ϊ Ϊ

M3(M1后确定 HB和 HC) HB HC

PHA-E Ϊ ―

PNA Ϊ ―

MPL Ϊ ―

DBA ― † NPA ― †

BS-I † ―

SNA † ―

2.3 凝集素芯片结果验证

为进一步验证凝集素芯片的结果，验证凝集素探针与健康人、乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液样本中识别糖链的结合。以凝集素 LTL 为例，将 Cy3荧光标记的 LTL与点制好的唾液芯片孵育，经芯片扫描仪扫描（见图 3B) 和 Genepix 3.0软件分析，根据 1.6所述方法对原始数据深入分析。结果显示， LTL与 7例肝癌唾液样本中识别糖链的结合强度明显低于其与其它样本的结合（见图 3C),经 student t-test 发现 P值小于 0.05。其余凝集素探针验证方法参照此方法，结果均显示与凝集素芯片结果一致。证明这些凝集素可以作为探针通过对唾液中的糖蛋白糖链的检测鉴别肝系列病。

Claims

权利要求书

1、一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，其特征在于：所述测试凝集素探针组至少包括

Jacal in, GSL- II、 PTL- I、 SJA、 GSL- I、 LCA、 Con- A、 PTL- II、 DSA、 WA、 GNA、 PHA-E+ MAL_II、 AA PSA、 WGA以及 UEA-I凝集素探针的组合。
2、根据权利要求 1所述基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，其特征在于：所述测试凝集素探针组还包括 WFA、 LTL、 LEL、 EEL以及 PWM凝集素探针的组合。

3、根据权利要求 1所述基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，其特征在于：所述测试凝集素探针组还包括 PHA-E、 PNA、 MPL、 DBA, NPA、 BS-I以及 SNA凝集素探针的组合。
4、一种基于唾液糖蛋白糖链鉴别肝系列病的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组和对照探针，其特征在于：所述测试凝集素探针组包括

I、 II及 III组，所述 I、 II及 III组分别是 Jacal in、 GSL- II、 PTL- 1、 SJA、 GSL-I , IXA、 Con_A、 ΡΊ1 - II、 DSA、 WA、 GNA、 PHA - E+ MAL-II , AAL、 PSA、 WGA以及 UEA-I凝集素探针的组合， W 、 LTL、 LEU EEL 以及 PWM凝集素探针的组合以及 PHA-E、 PNA、 MPL、 DBA, NPA、 BS-I 以及 SNA凝集素探针的组合。
5、一种权利要求 1所述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白糖链的变化。
6、一种权利要求 2所述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白糖链的变化。
7、一种权利要求 3所述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白糖链的变化。
8、一种权利要求 4所述凝集素芯片的应用，其特征在于：用于检测唾液中糖蛋白糖链的变化。
9、一种利用权利要求 2所述凝集素芯片制备检测唾液中糖蛋白糖链的变化的试剂盒。
10、一种利用权利要求 4所述凝集素芯片制备检测唾液中糖蛋白糖链的变化的试剂盒。