CN102507920A - 一种凝集素芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凝集素芯片及其应用，该凝集素芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上呈阵列分布的凝集素探针，所述的凝集素探针包括I型凝集素探针、II型凝集素探针和对照探针。利用这两类探针制作成凝集素芯片，通过检测荧光标记的血清样本当中凝集素探针所识别的糖蛋白含量的变化，依据荧光标记的糖蛋白定性或定量的判断，进行大骨节病的分子发病机制研究及大骨节病治疗后的预后监测。

Description

一种凝集素芯片及其应用

技术领域

本发明属于大骨节病的防治技术领域，涉及一种凝集素芯片及其应用。

背景技术

大骨节病(Kashin-Beck Disease)是一种地方性骨关节病，是我国重点防治的地方病之一。依据2010年10月卫生部发布的大骨节病防治情况显示，我国大骨节病主要流行于从东北到川藏高原狭长地带上的14个省(市)、自治区的366个县，现有I度及以上大骨节病患者69.45万例，其中13岁以下患者18435例，10583.8万人口受到威胁。大骨节病不但给患者造成了巨大的身心痛苦，而且给病区当地带来了沉重的医疗和财政负担，严重阻碍了当地的经济发展，是造成“因病致穷、因病返贫”的重要公共卫生问题之一。

大骨节病是一种患病率和致残率较高的畸形性骨关节病，疾病的发生往往从幼儿开始，多数患者首先出现骨关节疼痛的症状，病情严重的患者出现骨关节变形，造成行动不便，最终部分或完全丧失劳动能力和生活自理能力。由于大骨节病的病因与发病机制迄今不明，我国目前采取的综合防治措施缺乏病因针对性，难以完全阻断新发病例的出现，随着自然环境和防治策略的不断变化，未来我国的大骨节病病情仍有反复的可能。基于目前国际上疾病发病机制研究方法的最新进展，有专家提出利用现代分子生物学技术研究大骨节的发病机理及寻找诊疗标志物。

目前，影响我国大骨节病防治工作的主要技术问题包括：大骨节病的临床诊断主要建立在出现临床症状、体征基础上，如采用右手X线正位片显现干骺端和骨端病变后诊断为早期大骨节病，明显滞后于大骨节病软骨细胞坏死和生物化学损害之后，更滞后病区人群长期居住在环境有害因素暴露下分子水平的损害，因此，建立在临床症状、体征水平上研究不明原因的大骨节病病因，难于发现致病因素，突破病因学研究，进而难以建立起早期干预措施和治疗技术与措施。如我国大骨节病的病因发病机制与防治研究。其次，虽然大骨节病的病情有所消退，但不少专家认为由于病因不明，不但要警惕再度发生暴发流行，更要居安思危。政府和人民群众迫切要求控制和消灭大骨节病。

凝集素是一类具有糖链专一性、可促使细胞凝集的蛋白质，它具有与糖链专一性、非共价、可逆结合的能力。凝集素芯片是将各种不同来源的凝集素固定于醛基化、环氧化或经其它方式修饰后的玻璃片基上，再与标记后的糖蛋白、菌体、细胞等待检测样品反应，经后续处理后，以检测待检测样品的糖链结构。凝集素芯片能简便、快速、高通量的检测分析蛋白质的糖基化修饰，在短时间内给出待检测样品的糖结构指纹图谱。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种凝集素芯片及其应用，利用凝集素芯片检测血清当中与大骨节病相关的若干糖蛋白的情况，为大骨节病的分子发病机制研究和治疗后进行预后监测提供科学依据。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种凝集素芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上呈阵列分布的凝集素探针，所述的凝集素探针包括I型凝集素探针、II型凝集素探针和对照探针；

所述的I型凝集素探针为DBA、DSA、BPL、GSL-II、STL、VVA凝集素探针当中的一种或几种；

所述的II型凝集素探针为WGA、PHA-E+L、GNA、RCA120、PSA凝集素探针当中的一种或几种。

所述的凝集素探针包括至少两种I型凝集素探针、至少两种II型凝集素探针，I型凝集素探针和II型凝集素探针总共不少于五种。

所述的凝集素芯片应用于定性或定量的检测血清当中凝集素探针所识别的糖蛋白。

所述的糖蛋白还用荧光素进行标记。

所述的在进行凝集素探针检测之前，还要对待测血清的蛋白含量进行定量检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过检测健康人血清样本、未治疗大骨节病人血清样本和透明质酸注射治疗后大骨节病人血清样本，分析大骨节病发病后血清当中糖蛋白的糖链谱的变化，筛选到了两类凝集素探针：I型凝集素探针和II型凝集素探针，从而利用这两类探针制作成凝集素芯片，通过检测荧光标记的血清样本当中凝集素探针所识别的糖蛋白含量的变化，依据荧光标记糖蛋白定性或定量的检测结果，可以进行大骨节病的分子发病机制及预后监测研究。

当前大骨节病发病机制研究及预后监测主要基于患者症状、体征和X片影像学检查，由于大骨节病早期缺乏明显的症状、体征和异常X片改变，基于症状、体征和X片检查大骨节病准确性和灵敏度较低，目前仍缺乏灵敏度和特异度较高的大骨节病检测技术。本发明可以简便、快速、准确检测出大骨节病患者外周血糖链谱的特征性改变，从而为大骨节病发病机制研究和预后监测提供科学依据。

研制我国大骨节病检测芯片，进而建立大骨节病早期预警系统，不但有助于分子水平上阐明大骨节病的分子发病机理，而且也是国家环境与健康可持续研究发展的需要。

附图说明

图1为大骨节病血清BCA法蛋白定量标准曲线图；

图2为凝集素芯片点样图；

图3为凝集素芯片检测未治疗大骨节病患者与治疗后大骨节病患者血清糖蛋白糖链Ratio比值分析结果图；

图4为凝集素芯片检测健康人血清荧光图像结果图；

图5为凝集素芯片检测大骨节病患者血清荧光图像结果图；

图6为凝集素芯片检测大骨节病患者治疗后血清荧光图像结果图。

具体实施方式

为了便于大骨节病的分子发病机制研究及治疗后进行预后监测，通过检测健康人血清样本、未治疗大骨节病人血清样本和透明质酸注射治疗后大骨节病人血清样本，分析大骨节病发病后血清当中糖蛋白的糖链谱的变化，寻找可以作为大骨节病检测指标的糖蛋白。下面结合具体的凝集素芯片的检测对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、血清样本的处理：

1.1血清样本的采集

共采集25份采自大骨节病病区健康人血清样本、16份大骨节病人血清样本、20份透明质酸注射治疗后病人血清样本。

抽取一定量的血液，室温或4℃静置半小时，3000rpm离心5分钟，分离血清。血清分离后分装，于-80℃保存。血清使用前12000g，4℃离心15min，吸取中间层用于检测。

由于需要进行糖蛋白含量的比对分析，因此还需要对血清样本进行荧光标记：

经血清样本各自混匀后再用1×PBS稀释30倍，各取100μL稀释后的混合血清分别与100μLNa₂CO₃混匀，吸取混合液用Cy3或Cy5荧光染料标记，并用G-25柱分离纯化。将标记好的样本分装冻存于-20℃以下的环境中。

1.2血清蛋白的定量

将BCA试剂盒中试剂A和试剂B按照50∶1的比例混合，配制成标准工作试剂(SWR)。将BSA配制成0mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL之间的标准品。健康人血清和大骨节病人血清用1×PBS稀释30倍后各10μL分别与200μL BCA标准工作试剂混合。37℃孵育30min后冷却至室温。在562nm处测定光密度值。以BSA为横坐标，A562nm为纵坐标绘制标准曲线，并求出线性公式：样本562nm处光密度值＝1.1999×样本蛋白浓度+0.2814。根据标准品曲线计算样品浓度。

分别取10mM PBS稀释30倍后的大骨节对照人血清、和大骨节病病人血清和治疗后病人血清样品进行光密度值测定。经测定，三个样本的光密度值分别为2.6277、2.608、2.5618带入上述的线性公式：样本562nm处光密度值＝1.1999×样本蛋白浓度+0.2814，依据公式绘制的标准曲线如图1所示，得三种血清蛋白浓度分别为1.9554mg/ml、1.9389mg/ml、1.9005mg/ml。

血清蛋白浓度检测是凝聚素芯片质量控制的一个步骤。对血清蛋白浓度的准确测定保证了后续血清蛋白荧光标记上样量的一致性，提高了凝集素芯片检测的准确性。

1.3Cy3荧光标记血清蛋白的定量

以10mM PBS为空白，分别测定Cy3标记后的三种血清蛋白在OD260和OD280的吸收值，带入公式C蛋白浓度＝1.45×OD280-0.75×OD260分别计算蛋白浓度。检测结果如表1所示：

表1Cy3荧光标记血清蛋白的浓度测定结果

血清分类	OD280	OD260	蛋白浓度
				对照人血清	0.44183	0.2958	0.421762
大骨节病人血清	0.21639	0.16088	0.194714
				治疗后病人血清	0.42991	0.29957	0.401688

对3种血清样本蛋白含量的测量也是为了控制凝聚素芯片的质量，它保证了凝集素芯片上样量的一致性，提高凝集素芯片检测的准确性。

2、凝集素芯片的制备

为了更好的分析血清中的差异糖蛋白，将37中识别不同糖链节结构凝集素连同阴性质控BSA、Marker Cy3标记的BSA作为探针，一起点制成4×10的矩阵，具体排列如图2所示。

凝集素芯片的制备具体为：

a)取环氧化片基备用；

b)将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；

c)将配制的点样液加到384孔板内；再用点样仪器在环氧化片基上点样；

d)将点制好的芯片在湿度为55％-65％的环境中孵育2.5-3.5小时；

e)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；

f)将固定好的凝集素芯片放置在干燥器中以备用。

3、凝集素芯片检测血清当中的糖蛋白

a)将1-2％牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液(10mM PBS)中配制成封闭液，

b)将制备好的凝集素芯片置于封闭液中1小时；

c)将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20(0.05％Tween-20的10mM PBS)和磷酸盐缓冲液

d)分别清洗各2次，每次3分钟，再经甩干后备用；

e)对甩干后的凝集素芯片加入3-5μg荧光素标记好的血清样本和750-800μL的孵育缓冲液(含1％BSA、0.05％Tween-20的10mM PBS)，并在室温孵育3小时；

f)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再甩干；

g)对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，光电倍增管(PMT)设为100％，先进行预扫描，然后选定点样区域，进行精确扫描，调节明亮度和对比度，达到最佳视觉效果；得到凝集素与标记后糖蛋白糖链结合的荧光图像；

h)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构反复核对。

用GenePix3.0软件从扫描结果图中获取各个凝集素与标记后3种血清糖蛋白结合的荧光信号，血清糖蛋白糖链Ratio比值分析结果如图3所示，从中可以明显的看出大骨节患者血清中与RCA120、PSA、WGA、GNA、PHA-E+L凝集素结合的糖蛋白糖链显著增多，而与DBA、DSA、GSL-II、BPL、STL、VVA凝集素结合的糖蛋白糖链显著减少，具体如表2所示。

表2大骨节病人血清糖蛋白糖链谱的变化

通过比较分析凝集素识别糖蛋白糖链的不同，可以看出：(1)比较DBA、VVA两种识别O型糖链结构的异同，发现大骨节病发生后血清糖蛋白中O型糖链Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T)或GalNAcα-Ser/Thr(T)含量降低。(2)在大骨节病人血清中，与DSA、STL、GLS-II结合的糖蛋白减少，说明血清糖蛋白上的GlcNAc结构有可能减少。(3)通过比较AAL、PSA、LCA识别糖链结构的异同，发现大骨节病发病后糖蛋白上岩藻糖含量增加，可能主要以Fucoseα-1，6GlcNAc(core fucose)的形式存在。(4)在大骨节病人血清中，与GNA结合的糖蛋白增加，说明血清糖蛋白上的Mannose结构有可能增加，可能以末端分支α-1，3甘露糖的形式存在。(5)与WGA结合的糖蛋白增加，说明血清糖蛋白上的Sia结构增加。(6)与PHA-E+L结合的糖蛋白增加，说明大骨节病人血清糖蛋白的N型糖链分支数增加。(7)RCA120主要识别β-gal结构，大骨节病人血清糖蛋白与其结合增强，说明大骨节病人血清糖蛋白上的β-gal结构可能增多。

鉴于以上两种大骨节病人血清糖蛋白的变化，将能够识别这些变化的凝集素分为两类：

I型凝集素：DBA、DSA、BPL、GSL-II、STL、VVA凝集素，所识别的糖蛋白在大骨节病患者血清当中减少；

II型凝集素：WGA、PHA-E+L、GNA、RCA120、PSA凝集素，所识别的糖蛋白在大骨节病患者血清当中增加；

将上述两种类型的凝集素制成凝集素芯片，检测被荧光素标记的血清当中的糖蛋白，以健康人的检测结果作为对照，结合表2当中各凝集素探针的识别，判定待测血清样本中大骨节病特征糖蛋白的变化情况，进行大骨节病的分子发病机制研究和预后监测。

具体的凝集素芯片的制备方法及血清样本的处理及荧光素标记同上。

图4、图5、图6分别为凝集素芯片检测健康人血清样本、大骨节病人血清样本和透明质酸注射治疗后病人血清样本的I型、II型凝集素所识别糖蛋白的荧光图像，其中红色框内为I型凝集素所检测到的荧光图像，白色框内为II型凝集素所检测到的荧光图像。

可以根据荧光亮度所反应的糖蛋白的含量，相对于健康人的对照，定性的看到六种I型凝集素的确特异性的检测到了大骨节病人血清当中所识别的糖蛋白含量的减少，五种II型凝集素的确特异性的检测到了大骨节病人血清当中所识别的糖蛋白含量的增加(图4与图5的对比)；而在治疗康复之后，I型凝集素所识别的糖蛋白含量回升，II型凝集素所识别的糖蛋白含量回落；这表明凝集素芯片所检测到的信息与病情发展、变化相一致。更进一步，还能够通过检测荧光的强度，定量的检测到糖蛋白含量的变化，以更精确的对糖蛋白含量进行跟踪监测。

这说明通过所制备的凝集素芯片检测血清样本当中糖蛋白的含量，进而与正常参照，或者标准对照，其所识别的糖蛋白含量的变化，可以作为大骨节病分子发病机制研究和预后监测的科学依据。

Claims (5)

1.一种凝集素芯片，其特征在于，包括固相载体和固定在该固相载体上呈阵列分布的凝集素探针，所述的凝集素探针包括I型凝集素探针、II型凝集素探针和对照探针；

所述的I型凝集素探针为DBA、DSA、BPL、GSL-II、STL、VVA凝集素探针当中的一种或几种；

所述的II型凝集素探针为WGA、PHA-E+L、GNA、RCA120、PSA凝集素探针当中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的凝集素芯片，其特征在于，所述的凝集素探针包括至少两种I型凝集素探针、至少两种II型凝集素探针，I型凝集素探针和II型凝集素探针总共不少于五种。

3.如权利要求1所述的凝集素芯片应用于定性或定量检测血清当中凝集素探针所识别的糖蛋白。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白还用荧光素进行标记。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在进行凝集素探针检测之前，还要对待测血清的蛋白含量进行定量检测。

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