CN105092856A - 缺血性脑卒中多种生物标志物临床检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及SHIP-1，IGF-1，SDPR，MBL，ICAM-1，Hs-CRP，LP(a)，MMP-9芯片临床诊断试剂，除Hs-CRP生化试剂外的其余项目的任意组合或单味的任意方法学的临床诊断试剂和方法学包含在权利要求书1-6项，以及8种血清蛋白标志物的鉴定和选择及其生物标志物任意组合的鉴定和选择，8种生物标志物的抗原和其对应抗体的制备方法和质量标准。所述8种血清蛋白标志物在血液中差异表达并可用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及判断预后和治疗效果平价的临床检测。
Description
1、技术领域：
本发明涉及在缺血性脑卒中血清差异表达的多个和单个生物标志物的鉴定和选择与在缺血性脑卒中血清中差异表达的生物标志物任意组合或单个标志物的鉴定和选择，以及选择所述生物标志物组合的方法。本发明还涉及生物标志物以用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及判断预后和治疗效果平价的临床检测用途及其试剂盒。本发明还涉及监测干预方案效果。该发明专利属于临床医学、急诊医学、临床诊断学、实验诊断学和生物技术领域交叉学科的创新技术研究，
2、背景技术：
脑卒中是我国最常见的慢性病之一。2000年我国脑卒中死亡率在城市地区为127.96/10万，农村地区为115.2/10万。每年用于卒中的治疗费用400亿，如果按各类危险因素人群(糖尿病患者1.36亿，血脂异常2亿，高血压患者2.66亿，吸烟人群3.5亿，房颤患者800万人，肥胖者7000万人)计10.3亿人次已处于脑卒中危险地带。目前脑卒中已成为我国第一大致残和第二大致死疾病，位于世界脑卒中发病地图中处于“高死亡带”。
随着中国迈向老龄化社会的脚步不断加快，全国≥60岁老人2亿，每年因脑卒中死亡270万，是欧美4-5倍，每年还有250万的新发病例正以8.7％速度增长，超过GDP的增长速度，幸存病例750万。脑卒中的死亡率还在不断攀升。据统计目前每12秒钟就有1名脑卒中新发病者，每21秒钟就有1人死于脑卒中[1，2]。
脑卒中病程进展慢，但发病率、病死率和致残率都很高，给患者、家庭、社会带来了巨大的精神负担和经济负担。因此，对于脑卒中患者来说早期预警和诊断、评价并迅速实施干预治疗是非常重要的。目前，对于急性缺血性脑卒中(AIS)的诊断主要依赖于患者的临床表现和神经影像学资料，如CT或MRI。然而CT对于缺血性脑卒中尤其是程度较轻的病例作用不大；而脑部的MRI价格昂贵、耗费时间长，且很多急诊医疗部门无能力配置，同时由于一些患者自身的原因限制了MRI的广泛使用。因此建立蛋白质微阵列芯片近红外荧光标记技术联合检测急性缺血性脑卒中血清8种血清标志物水平与急性缺血性脑卒中临床评价非常重要。解决目前还尚无MRI、CT的医疗机构对急性缺血性脑卒中病人的诊疗问题和影像学诊断时间窗的问题。用于脑卒中危险因素人群的筛查，以便早期干预治疗，节约医疗资源。
本发明的8种血清蛋白标志物应用蛋白质微阵列芯片近红外荧光标记技术、酶免技术、发光技术等与其配对抗原/抗体结合的原理，在固相基质中结合此8种标志物的单克隆抗体，捕捉被检测血清中特异蛋白，并经特异的化学反应产生光信号，根据光强度的强弱对蛋白标志物进行定量分析；拟研发的蛋白质微阵列芯片试剂盒将解决目前缺血性脑卒中诊断方法主要依赖MRI、CT、成本高、时间窗长等局限性问题，为这一重大疾病的预警和早期诊断提供技术支撑。该试剂盒的问世给缺血性脑卒中的早期预警、早期临床诊断和早期干预治疗提供帮助，对于降低医疗费用，提高诊疗率和生存质量具有明显的社会经济意义。为解决目前还没有MRI和CT检查设备的中小医院、社区卫生院提供更好的诊断工具，缩短缺血性脑卒中的诊断时间，为其救治争取更多的机会，从而加强对脑卒中的三级预防防控措施产生深远影响。该试剂盒的问世也填补了国内尚无用于缺血性脑卒中(AIS)特异性的临床实验室诊断工具。
3、发明内容
本发明涉及SHIP-1，IGF-1，SDPR，MBL，ICAM-1，Hs-CRP，LP(a)，MMP-9芯片临床诊断试剂，除Hs-CRP生化试剂外的其余项目的任意组合或单味的任意方法学的临床诊断试剂和方法学包含在权利要求书1-6项，以及8种血清蛋白标志物的鉴定和选择及其生物标志物任意组合的鉴定和选择，所述8种血清蛋白标志物在血液中差异表达并可用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及判断预后和治疗效果平价的临床检测。本发明生物标志物和生物标志物组合的测定结果被用于缺血性脑卒中的预警、诊断及判断预后。为了测定本发明生物标志物的血清表达量，所述的8种生物标志物的任意组合和所述方法学研发的临床应用试剂盒及其用途均在本发明范围内。本发明还包括所述8种生物标志物的抗原和其对应抗体的制备方法和质量标准。本发明还提供使用本发明的生物标志物的鉴定方法。
(1)利用基因扩增技术构建工程菌以获得8种蛋白的纯化抗原和抗原质量标准
(2)利用杂交瘤技术生产8种蛋白的特异性单克隆抗体(含二抗的单抗和多抗，人源的和合成的)质量标准
(3)将8种血清蛋白标志物的配对抗体，应用蛋白质微阵列芯片技术和抗原抗体结合的原理，在固相基质中结合此8种标志物的配对单克隆抗体，捕捉被检测血清中特异蛋白，并经特异的化学反应产生光信号，根据光强度的强弱对蛋白标志物进行定量分析。
(4)试制蛋白质微阵列芯片临床诊断试剂盒，分析病例组和条件匹配的对照组，确定检测结果与急性缺血性脑卒中诊断的符合程度，确定该试剂对于疾病早期预警和早期诊断的时间敏感性和特异性
4、原材料质量控制
A、进行反应模块的研究及蛋白芯片最佳反应模块；
B、对抗体稀释缓冲液、芯片封闭液体系进行研究及最佳配制方案；
C、进行抗体点样量的研究及抗体点样时稀释方案设计原则；
D、对蛋白芯片点样生产工艺及蛋白芯片点样生产工艺流程；
E、对蛋白芯片装配工艺及蛋白芯片装配工艺流程及质量控制标准。
5、反应液体系生产
1)浓缩洗涤液的生产：
2)反应体系的确定：
3)产品质量标准的确定：
4)产品性能评估
A、分析灵敏度：达到pg/ml水平；
B、检测信号线性范围：106数量级；
C、检测浓度线性范围：104数量级；
D、检测准确性：90％～110％；
E、检测精密性：小于15％；
F、荧光检测分辨力小于50um；
G、探测灵敏度：0.2荧光分子/um2；
H、准确度：90％～110％；
I、分析灵敏度：小于各指标1/10cutoff值浓度；
J、检测浓度线性范围：0.5cutoff～50cutoff值浓度；
K、检测精密性：小于15％；
L、临床灵敏度：大于80％；
M、临床特异度：大于90％。
6、具体实施方式：
本发明涉及从血液中鉴定和选择在缺血性脑卒中患者与正常人之间差异表达和可单独和联合用于诊断的试剂。如此，本发明涉及能用于检测和监测生物标志物和生物标志物组合的差异蛋白表达以用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及判断预后和治疗效果平价的临床检测。本发明还涉及鉴定特别有用的生物标志物各组合的方法。
1)定义除非另外指明，本发明的实施将利用细胞生物学、分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术，它们在本领域技术人员能力范围内。这些技术在文献中已被解释。
2)本发明所述的缺血性脑卒中患者血清8种生物标志物的任意组合和方法学技术均经引用并入本文。
3)本文设计的“扩增”为分子生物学范围
4)本文涉及的“微阵列”包括固定到固相支持物上的一组特异性蛋白，或一组对应的特异性抗体以获得缺血性脑卒中诊断的相同结果。
5)术语“抗体”还包括抗体的抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”或“片段”)表示保留特异性结合多肽能力的全长抗体的一个或多个片段
6)本文所用术语“生物标志物”表示在缺血性脑卒中患者个体和正常个体(无缺血性脑卒中个体)之间受差异调节的蛋白。
7)本文所用术语“差异表达”表示与对照样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较
8)适用于本发明的可检测标记物包括可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记物包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。检测这些标记物的手段对本领域技术人员是公知的。
9)在一个优选实施方案中，用于比较的一种或多种样品用产生可区分检测信号的不同的荧光染料标记，不同标记的靶样品同时杂交到同一微阵列上。在一个优选实施方案中，蛋白样品将包括一种或多种对照分子，它们与微阵列上的特异性抗原或抗体结合以标准化微阵列产生的信号。优选的是，标记的标准化蛋白样品是与上述点到微阵列上的特异性抗原或抗体完全对应。标准化对照位于阵列的角落或边缘以及中间。经过特定仪器扫描获依据所标记物的信号强弱计算蛋白含量。
Claims (6)
1.近红外荧光物质标记的抗原或抗体(含单克隆抗体和多克隆抗体)的3，4，5-三磷酸-磷脂酰肌醇-5-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate5-phosphatase1，SHIP-1)，胰岛素样生长因子-1(Isoform1ofInsulin-likegrowthfactorI，IGF-1)，血清剥夺相关蛋白(Serumdeprivation-responseprotein，SDRP)，甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin)又称甘露糖结合凝集素(mannose-binding-lectin)，MBL)，细胞间粘附分子(Intercellularadhesionmolecule1，ICAM-1)，超敏C-反应蛋白(Hs-reactiveprotein，Hs-CRP)，脂蛋白(a)(Lipoprotein(a)，LP(a))，基质金属蛋白酶(Macrophagemannosereceptor1，MMP-9)多种生物标记物联合或单个标记物的用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及疗效评价的临床检测的生物芯片技术、金标技术、双抗体夹心或渗滤技术、酶联免疫技术、化学发光法、免疫化学发光法、生物素法、临床化学法的临床诊断试剂盒，还包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记物包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠等相关的临床检测试剂盒。
2.不同荧光物质标记的抗原或抗体(含单克隆抗体和多克隆抗体)的3，4，5-三磷酸-磷脂酰肌醇-5-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate5-phosphatase1，SHIP-1)，胰岛素样生长因子-1(Isoform1ofInsulin-likegrowthfactorI，IGF-1)，血清剥夺相关蛋白(Serumdeprivation-responseprotein，SDRP)，甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin)又称甘露糖结合凝集素(mannose-binding-lectin)，MBL)，细胞间粘附分子(Intercellularadhesionmolecule1，ICAM-1)，超敏C-反应蛋白(Hs-reactiveprotein，Hs-CRP)，脂蛋白(a)(Lipoprotein(a)，LP(a))，基质金属蛋白酶(Macrophagemannosereceptor1，MMP-9)多种生物标记物联合或单个标记物的用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及疗效评价的临床检测的生物芯片技术、金标技术、双抗体夹心或渗滤技术、酶联免疫技术、化学发光法、免疫化学发光法、生物素法、临床化学法的临床诊断试剂盒，还包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记物包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠等相关的临床检测试剂盒。
3.不同酶类标记的抗原或抗体(含单克隆抗体和多克隆抗体)的3，4，5-三磷酸-磷脂酰肌醇-5-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate5-phosphatase1，SHIP-1)，胰岛素样生长因子-1(Isoform1ofInsulin-likegrowthfactorI，IGF-1)，血清剥夺相关蛋白(Serumdeprivation-responseprotein，SDRP)，甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin)又称甘露糖结合凝集素(mannose-binding-lectin)，MBL)，细胞间粘附分子(Intercellularadhesionmolecule1，ICAM-1)，超敏C-反应蛋白(Hs-reactiveprotein，Hs-CRP)，脂蛋白(a)(Lipoprotein(a)，LP(a))，基质金属蛋白酶(Macrophagemannosereceptor1，MMP-9)多种生物标记物联合或单个标记物的用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及疗效评价的临床检测的生物芯片技术、金标技术、双抗体夹心或渗滤技术、酶联免疫技术、化学发光法、免疫化学发光法、生物素法、临床化学法的临床诊断试剂盒，还包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记物包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠等相关的临床检测试剂盒。
4.不同化学物质标记的抗原或抗体(含单克隆抗体和多克隆抗体)的3，4，5-三磷酸-磷脂酰肌醇-5-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate5-phosphatase1，SHIP-1)，胰岛素样生长因子-1(Isoform1ofInsulin-likegrowthfactorI，IGF-1)，血清剥夺相关蛋白(Serumdeprivation-responseprotein，SDRP)，甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin)又称甘露糖结合凝集素(mannose-binding-lectin)，MBL)，细胞间粘附分子(Intercellularadhesionmolecule1，ICAM-1)，超敏C-反应蛋白(Hs-reactiveprotein，Hs-CRP)，脂蛋白(a)(Lipoprotein(a)，LP(a))，基质金属蛋白酶(Macrophagemannosereceptor1，MMP-9)多种生物标记物联合或单个标记物的用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及疗效评价的临床检测的生物芯片技术、金标技术、双抗体夹心或渗滤技术、酶联免疫技术、化学发光法、免疫化学发光法、生物素法、临床化学法的临床诊断试剂盒，还包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记物包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠等相关的临床检测试剂盒。
5.不同底物法的涉及1、2、3、4的内容的用于多种生物标记物联合或单个标记物的用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及疗效评价的临床检测的生物芯片技术、金标技术、双抗体夹心或渗滤技术、酶联免疫技术、化学发光法、免疫化学发光法、生物素法、临床化学法的临床诊断试剂盒，还包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的任何组分。可用于本发明的标记物包括用标记的链亲合素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠等相关的临床检测试剂盒。
6.不同化学反应法或不同波长检测法涉及1、2、3、4、5的内容的用于缺血性脑卒中疾病的预警、诊断、监测、健康状态评价和预测以及疗效评价的临床检测试剂盒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Liu Xiaoye Document name: Notification of Publication of the Application for Invention |
|
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151125 |