CN101861522B - 预后方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学预后领域。具体地说，本发明涉及一种预测受试者前列腺癌级数和总生存率的方法，包括检测人体试验样本如血清中的巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)的增加。

Description

预后方法
技术领域
本发明涉及医学预后领域。具体地说，本发明涉及一种预测受试者前列腺癌级数和总生存率的方法，包括检测人体试验样本如血清中的巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)的增加。
优先权文本
本申请以澳大利亚临时专利，申请号为：2007905761，发明名称为″预后方法″，申请日为2007年10月22日的在先申请要求优先权。该申请的所有内容在此作为参考。
背景技术
MIC-1是TGF-β总科的分支，TGF-β总科最初是在mRNA过量表达和巨噬细胞激活的基础上克隆的1。尽管MIC-1在休眠巨噬细胞中不表达，一些生物介体包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-I)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激巨噬细胞以诱导MIC-1的表达。由于许多促炎症细胞因子的诱导，脂多糖和干扰素γ(IFN-γ)的直接诱导的失败，有人作出假设：MIC-1可能是一种巨噬细胞激活的自分泌的下游调节因子1。
MIC-1在许多组织中都能表达3-6。人类组织的Northern杂交表明在肾脏、胰腺和前列腺中有少量MIC-1mRNA存在，在胎盘有大量MIC-1mRNA存在3-5。在正常、表面健康受试者，血清中MIC-1的水平随着年龄的增长而上升8。MIC-1的过量表达与癌症，尤其是与前列腺癌相关7，且MIC-1的高血清浓度与转移性疾病的存在相关7-8。MIC-1通过乳房、结肠和前列腺癌的活组织切片检查的免疫组织化学也被检测到6。然而，MIC-1在这些器官的正常上皮细胞中没有被检测到6。这个结果，与p53诱导的MIC表达，以及MIC-1可以诱导一些上皮肿瘤细胞系的细胞凋亡的资料9-11一起表明了MIC-1在上皮肿瘤中的作用。
当前列腺癌局限在前列腺时，前列腺癌通常通过血清中前列腺特异性抗原(PSA)的浓度增加而被诊断出，尽管现在很关注这种测试的准确性。另外，对最近被诊断为局部化前列腺癌的男性的治疗处理还存在一个主要的临床挑战，例如，尽管前列腺癌通常为非致命的，没有症状，大部分没有得到治疗的局部化前列腺癌的受试者有很好的预后，同时，积极治疗与生活方式(例如，丧失泌尿功能和阳痿)和患病率的重大影响是相关的12。
目前，安全区分发展良性和预后差(彻底治疗法是有效的)的前列腺癌的方法是不够的。″格里森得分(Gleason sum)″(计算出10)是目前用于前列腺癌严重度的一个指标：低格里森总分的肿瘤组织学接近于正常的组织，成为恶性的可能性小；同时，高格里森总分的肿瘤更可能成为恶性肿瘤。然而，这种技术要求进行前列腺的活体检视和组织学分析，因此，这是一种具有扩散性危害、且昂贵的技术，需要时间让专家来分析。
利用国际抗癌联盟(UICC)开发和维护的肿瘤淋巴结转移(TNM)分类系统来分类恶性肿瘤，以达到对癌症扩散程度分类的全球公认标准，34TNM分期(I-IV)是用于理解前列腺癌的严重度的一个重要的因素。TNM系统评估肿瘤的大小(T评分)、淋巴结参与的程度(N评分)和任何转移(M评分)，以及使用细胞形态来分级，格里森总分来源于细胞形态。简单地说，T评分从0(没有肿瘤)到4分级；N评分从0(没有淋巴结扩散)到3分级；M评分从0(没有远转移)到1(远转移)分级。″X″级为不参与评分的任何参数。TNM分期I前列腺癌的评分为：T1、N0、M0，格里森总分为4或以下，是在样本的小部分区域不经意地发现的癌症，通常是因为前列腺组织由于其他原因被去除；细胞接近于正常细胞，检测指检出腺体是正常的。TNM分期II前列腺癌的评分为：T1-T2、N0、M0，格里森总分为5或以上，涉及到更多的前列腺，腺体内感觉到肿块。TNM分期III前列腺癌的评分为：T3、N0、M0，格里森总分为任意数，肿瘤扩散到前列腺包膜，腺体表面能感觉到肿块。TNM分期IV前列腺癌的评分为：T4、N和M为任意数，格里森总分为任意值，或者T为任意数，格里森得分为任意数，N和/或M为1，肿瘤侵入到邻近组织，或扩散到淋巴结或其他器官。
前列腺癌患者可能会经历癌症的密切观察，或可能通过外科手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗、或这些治疗法的结合来治疗。经过密切观察的局部化疾病患者有高的无进展生存率13-14；然而，非常多的选择密切观察的男性最终发展为前列腺癌的严重期，其中治疗可能有效。目前，临床医生缺少精确预测疾病结果的工具，因此，许多前列腺癌患者会经历不必要的攻击性的局部治疗，发病率显著，对生存率没有任何益处15。通过积极监测、以及基于早期PSA变化的选择性延迟干预的治疗被认为是一种减少无痛疾病患者过度治疗的策略。然而，尽管PSA测定的底线和PSA变化的速率都是重要的预后因素，它们在区分发展成致命的前列腺癌和疾病级数低风险或无风险的前列腺癌的作用很小。
本发明研究了MIC-1是否是区分恶性肿瘤和良性肿瘤的生物标志。为评估MIC-1对前列腺癌级数的预测价值，测定了大量外来的不同疾病期的前列腺癌患者的MIC-1血清浓度。令人惊讶的是，MIC-1的血清或血浆浓度可以为前列腺癌提供诊断和/或预后信息，同样地，MIC-1很有潜力成为预测前列腺癌级数的有价值的生物标志，而且更进一步地，升高的MIC-1浓度可能对决定前列腺癌的合适的治疗方法有用。另外，本发明比较了前列腺癌期间MIC-1血清浓度和健康对照人群的MIC-1血清浓度，惊奇的是，本发明发现MIC-1血清浓度升高除了与年龄有关之外，还与表面健康受试者的总生存率呈反比例相关。
因此，本发明发现MIC-1血清浓度可能是预测前列腺癌患者和表面健康人群死亡率的有效工具。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种预测表面健康受试者的总生存率的方法，该方法包括：检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值与所述受试者死亡率增加的可能性呈相关性。
第二方面，本发明提供了一种男性受试者前列腺癌的预测方法，该方法包括，检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值与前列腺癌恶化的可能性的增加呈相关性。
第三方面，本发明提供了一种筛选受试者的方法，所述受试者被诊断为前列腺癌，所述受试者受益于前列腺癌的积极治疗，该方法包括，检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值表明所述受试者受益于前列腺癌的积极治疗。
第四方面，本发明提供了一种筛选前列腺癌后期辅助治疗的受试者的方法，该方法包括，检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值表明所述受试者受益于辅助治疗。
附图说明
图1展示了自然对照人群按年龄MIC-1血清浓度(pg/mL)的盒形图；
图2为前列腺癌病例中不同疾病临床分期MIC-1血清浓度的示意图；
图3为所有受试者(A、B和C)或局部化疾病受试者(D、E和F)的MIC-1血清浓度和前列腺癌特异性生存率之间的关系示意图；
A、D：通过MIC-1血清浓度的四分位数分层Kaplan-Meier生存率评估；
B、E：曲线图下的动态区表明直至抽血后六年致命性前列腺癌的试验中MIC-1血清浓度，PSA和格里森总分的结合，以及MIC-1血清浓度、PSA和格里森总分的结合的准确度，曲线下区域VS抽血时间的评估线图是以变系数乘法风险模型为基础的；
C、F：MIC-1，PSA和格里森总分的结合，MIC-1、PSA和格里森总分的结合的预测模型的全球发病率情况。基于协变量和生存率观察的重新取样的引导非参数用于确定全球发病率情况的置信区间；
图4展示了从随访时期死亡的所有男性对照人群中分层的表面健康受试者血清MIC-1水平的Kaplan-Meier图；
A：当受试者通过血清MIC-1中值分层时(MIC-1水平在中值以上，存活率为82％；MIC-1水平在中值以下，存活率为94％；p＜0.0001)；
B：当受试者通过血清MIC-1四分位数分层时；
图5展示了血清MIC-1水平四分位数预测双胞胎未来死亡率风险的Kaplan-Meier图；
图6展示了A：同卵双胞胎(MZ；r＝0.419；p＜0.0001)和B：异卵双胞胎(DZ；r＝0.342；p＝0.0046)中血清MIC-1水平与存活时间显著相关，与遗传背景无关，这些相关性没有显著差异(相对风险比＝1.27；95％CI＝0.63-2.53)；
图7展示了1442个前列腺癌患者中通过MIC-1血清浓度的四分位数分层的前列腺癌死亡率的累积发生率。
具体实施方式
本发明发现血清MIC-1是表面健康受试者所有原因的死亡率的有力的预测因子，其可以识别死亡率风险增加的病人，使调查和干扰成为可能，以提高生活质量、且降低医疗费用。
因此，第一方面，本发明提供了一种预测表面健康受试者的总生存率的方法，该方法包括：检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值与所述受试者死亡率增加的可能性呈相关性。
在这里，术语″总生存率″为表面健康受试者的存活率；更具体地，受试者不是死于除事故或不幸(如受试者不是死于如威胁生命的疾病的医疗事故、或癌症，尤其是如前列腺癌的上皮癌、心血管疾病和事故)以外的其他原因，或者，换一句话说，受试者不是死于所有死亡原因。术语″表面健康受试者″为没有明显症状或威胁生命的疾病或状况(如以上提及的状况)的不良影响的受试者。优选地，当从受试者中抽取人体试验样本时，受试者为表面健康的。
根据本发明的第一方面，人体试验样本中的MIC-1的增加值可以理解为预示死于除事故或不幸外的其他原因的可能性的增加(即MIC-1的增加值提供了一种预测表面健康受试者可能的死亡的方法)。也可以理解为在人体试验样本中没有MIC-1增加的地方(如检测的MIC-1量在一个范围或以下，被认为是正常的)，第一方面所述的方法预示了受试者总生存率的可能性增加。
在一些实施例中，人体试验样本的MIC-1的增加值预示死于癌症或心血管疾病或其他威胁生命的医学事故的可能性的增加。
在一些实施例中，MIC-1的增加值预示在抽取受试者人体试验样本10年内，或者5年内死亡的可能性的增加。在一些实施例中，MIC-1的增加值预示了在抽取受试者人体试验样本3年内或1年内死亡的可能性的增加。
MIC-1的值，在本发明第一方面的方法中被认为是MIC-1的“增加值”，可能随着使用的特定人体试验样本类型和受试者的年龄而变化。
用于第一方面的方法的人体样本优选为血清样本；然而，羊水、胎盘提取物、全血、血浆、白细胞层、尿、脑脊髓液、精液、关节滑液、或者组织活检的样本也适用。本领域技术人员知道人体试验样本中的MIC-1的量被确定为所述人体试验样本中的MIC-1浓度或水平。而且，本领域技术人员知道血清样本中的MIC-1浓度实质上等同于血浆样本中的MIC-1浓度，因为，血浆的主要成分为血清，区别仅在于还包括纤维蛋白原和其它凝血因子。此外，本领域技术人员知道血清或血浆中的MIC-1浓度约对应于全血样本中的MIC-1浓度的两倍，因为，全血大约由一半血清或血浆组成。
因此，对血清样本来说，＞1ng/mL的值很可能表示MIC-1的增加值，预示着受试者死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加；同时，＞1.3ng/mL的MIC-1值很可能表示MIC-1的增加值，强烈地预示着受试者死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加。更进一步，血清样本中＞1.6ng/mL的MIC-1值很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着受试者死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加。
之前证实血清MIC-1水平的正常范围为约0.2-1.150ng/ml29；然而，本发明表明随着年龄的增加MIC-1趋向于增加。
因此，在一些实施例中，血清样本中MIC-1的值是测定的与年龄相近的表面健康受试者MIC-1水平的最高haptile，该血清样本中MIC-1的值可能表示MIC-1水平增长，预示着个体死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加。因此，45-54岁的血清样本中的MIC-1的值＞0.543ng/ml，其可能表示MIC-1水平增长，预示着个体死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加，55到59岁＞0.626ng/ml，60到64岁＞0.831ng/ml，65到69岁＞0.926ng/ml，70到74岁＞1.025ng/ml，75到79岁＞1.260ng/ml。
然而，在一些实施例中，血清样本中的MIC-1的值是测定的与年龄相近的表面健康受试者MIC-1水平的最高四分位数，该血清样本中的MIC-1的值很可能表示MIC-1的水平增长，预示着个体死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加。因此，因此，45-54岁血清样本中的MIC-1的值可能＞0.679ng/ml，其血清样本中的MIC-1的值很可能表示MIC-1水平增长，预示着个体死于除意外或不幸外的其他原因的可能性的增加，55到59岁＞0.914ng/ml，60到64岁＞1.087ng/ml，65到69岁＞1.199ng/ml，70到74岁＞1.430ng/ml，75到79岁＞1.765ng/ml。
人体试验样本中的MIC-1的值可以由免疫分析如酶联免疫法(ELISA)或使用抗MIC-1抗体或其片段的免疫组织化学(如与组织活检的分段样本一起)迅速测定。抗MIC-1抗体或其片段可以由本领域技术人员熟知的任何方法制备而得。
在本发明第一方面的实施例中，人体试验样本中的MIC-1的增加值通过以下步骤检测：
(i)测定所述人体试验样本中的MIC-1的值；
(ii)将所述MIC-1的值与正常受试者的对照人体样本中的一个MIC-1值或一个范围进行比较。
在这里，术语″正常受试者″是指抽取对照人体样本10年内没有死于除事故或不幸以外的其他原因的受试者。
在一些实施例中，正常受试者是年龄相近的，其中正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差10岁以内。更优选地，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差5岁以内。可以理解为，人体样本中检测的MIC-1增加值，与正常受试者相比，增加值相差越大，越强烈地预示着受试者死于除事故或不幸以外的其他原因的可能性的增加。因此，在一些实施例中，人体血清试验样本中检测的MIC-1值与正常受试者中的MIC-1值相差＞0.3ng/mL，很可能表示MIC-1增加值，预示着个体死于除事故或不幸以外的其它原因的可能性的增加，而相差＞0.6ng/mL，很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着个体死于除事故或不幸以外的其它原因的可能性的增加。
在本发明第一方面的一些实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是利用多次测量(nb MIC-1值的降低利用序列测定来检测的，这种方法预示着受试者总生存率率增长的可能性)来测定的受试者MIC-1值的增加。因此，同一个体人体试验样本中MIC-1的值可能在不同时间点来测定。例如，人体试验样本中的MIC-1的值可在一定时间间隔检测。时间间隔可以根据受试者的需要逐个确定，例如，时间间隔可以为三个月、一年、五年或十年，但可以理解为时间间隔可以根据实施者任何相关的健康或医疗因素来调整。于是，人体试验样本的MIC-1增加值可以通过比较特定时间点人体试验样本的MIC-1的值与较早时间点相同人体样本的MIC-1值来检测。这样，MIC-1的增加值可以通过测定随时间的增加，特定受试者人体试验样本中的MIC-1值的增加来检测。
因此，在本发明第一方面的一些实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是利用多次测量来检测受试者MIC-1值的增加，多次测量包括：
(i)测定所述人体试验样本中的MIC-1值；
(ii)将该MIC-1值与较早时间点从相同受试者体内抽取的对照人体样本中的MIC-1的值或范围进行比较。
在该实施例中，受试者的MIC-1的增加值可以调整，以弥补通常与受试者年龄增加相关的MIC-1的增加。
可以理解为：通过多次测量测定的受试者MIC-1值的较大增加，与较小增加相比，更强烈地预示着受试者死于意外或不幸的其他原因的可能性的增加。在一些实施例中，利用多次测量测定的人体内血清样本MIC-1值的增加＞0.3ng/mL，很可能表示MIC-1增加值，预示着个体死于事故或不幸之外的其他原因的可能性的增加，同时，利用多次测量测定的人体内MIC-1值的增加＞0.6ng/mL，很可能表示MIC-1增加值，更强烈地预示着个体死于事故或不幸之外的其他原因的可能性的增加。
在本发明第一方面的一些实施例中，受试者为男性。在另一些实施例中，受试者为女性。而且，在一些实施例中，受试者大于35岁，或更优选地，大于45岁。然而，在另一些实施例中，受试者可能大于55岁，或大于65岁，或甚至大于75岁。
第二方面，本发明提供了一种男性受试者前列腺癌的预测方法，该方法包括，检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值与前列腺癌级数的可能性的增加呈相关性。
在一些实施例中，MIC-1的增加值与发展成为恶性前列腺癌的可能性增加有关。在这里，术语″恶性前列腺癌″可以理解为很可能发展成为更威胁生命的前列腺癌，也就是说，发展成为更严重且有害的阶段，和/或转移。这在一些恶性癌症中，发生的几率更大，例如，恶性癌症经历一年或几年后，可能发展成更严重或有害的阶段；在恶性癌症的另一些例子里，这可能发生得更迅速，例如，经历一到三个月发展成更严重或有害的阶段。
根据本发明的第二方面，MIC-1的增加值与前列腺癌发展的可能性增加有关，从而，与受试者死于前列腺癌的可能性增加有关。在一些实施例中，MIC-1的增加值预示着受试者在抽取样本10年内、甚至5年内死于前列腺癌的可能性的增加。在一些实施例中，MIC-1的增加值预示着受试者在抽取样本3年内、甚至1年内死于前列腺癌的可能性的增加。
MIC-1的值，在本发明第二方面的方法中被认为是MIC-1的“增加值”，可能随着使用的特定人体试验样本类型和受试者的年龄而变化。用于第二方面的方法的优选的人体试验样本是血清样本；然而，其他的样本如第一方面方法提及的样本也是适合的。
对血清样本来说，＞1ng/mL的值很可能表示MIC-1的增加值，预示着前列腺癌级数，从而预示着受试者死于前列腺癌的可能性的增加。更进一步地，血清样本中的MIC-1值＞1.3ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着前列腺癌级数，及受试者死于前列腺癌的可能性的增加。作为选择，血清样本中的MIC-1值＞1.466ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着前列腺癌级数，及受试者死于前列腺癌的可能性的增加。还进一步地，血清样本中的MIC-1值＞1.6ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着前列腺癌级数，及受试者死于前列腺癌的可能性的增加。
本发明第二方面的实施例中，人体试验样本的MIC-1的增加值是通过以下方法测定的：
(i)测定所述人体试验样本中的MIC-1值；
(ii)将所述MIC-1的值与正常受试者的对照人体样本中的一个MIC-1值或一个范围进行比较。
在一些实施例中，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差10岁以内。更优选地，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差5岁以内。
可以理解为，人体试验样本中检测的MIC-1增加值的地方，其值与正常受试者的值的差别越大，越强烈地预示着前列腺癌受试者死于前列腺癌的可能性的增加。因此，在一些实施例中，血清样本中检测的MIC-1的值与正常受试者的MIC-1的值相差＞0.3ng/mL，很可能表示MIC-1增加值，预示着前列腺癌受试者死于前列腺癌的可能性的增加，而相差＞0.6ng/mL，很可能表示MIC-1增加值，更强烈地预示着前列腺癌受试者死于前列腺癌的可能性的增加。
在本发明第二方面的一些实施例中，人体样本中MIC-1增加值是通过多次测量来检测受试者内MIC-1值的增加。因此，同一受试者人体试验样本中MIC-1的值可能是在不同时间点测定的。例如，受试者人体试验样本中MIC-1的值可能在诊断为前列腺癌前，或随即诊断为前列腺癌，且在诊断后一定的时间间隔内测定的。这个时间间隔可以根据受试者的需要逐个确定。例如，这个时间间隔可以为三个月或一年或两年，但可以理解为：时间间隔可以随着受试者的疾病分期或其他相关的健康医疗因素而调整。于是，利用多次测量测定的人体试验样本的MIC-1增加值可以通过比较在特定时间点人体试验样本的MIC-1的值与相同人体样本在较早时间点的MIC-1值来检测。这样，MIC-1的增加值可以通过测定随时间的增加，特定受试者人体试验样本中的MIC-1值的增加来检测。
因此，在本发明第二方面的实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是受试者MIC-1值的增加，其是多次测量确定的：
(i)测定所述受试者人体试验样本的MIC-1值；
(ii)将该MIC-1值与在较早时间点取自相同受试者的对照人体样本中的MIC-1值或范围进行比较。
在该实施例中，受试者的MIC-1的增加值可以调整，以弥补通常与受试者年龄增加相关的MIC-1的增加。
可以理解为，与根据多次测量测定的MIC-1值的较大增加，与较小增加相比，MIC-1值的增加越大，越强烈地预示着前列腺癌级数，从而预示着受试者死于前列腺癌的可能性的增加。在一些实施例中，根据多次测量测定的血清样本中MIC-1值的增加＞0.3ng/mL，很可能表示是MIC-1的增加值，强烈地预示着前列腺癌级数，以及受试者死于前列腺癌的可能性的增加。而根据多次测量测定的血清样本中MIC-1值的增加＞0.6ng/mL，很可能表示是MIC-1的增加值，更强烈地预示着前列腺癌级数，以及受试者死于前列腺癌的可能性的增加。
在本发明第二方面的一些实施例中，受试者大于35岁，或更优选地，大于45岁。然而，在另一些实施例中，受试者可能大于55岁，或大于65岁，或甚至大于75岁。
本发明第二方面的方法的结果可以是一种或几种其他的预测指标结合来使用(如格里森得分，PSA，TMN分期)。此外，利用该方法的结果，结合前列腺癌组织核心的基质染色(在Bauskin et al.(2005)Cancer Res 65(6)2330-233630中有描述，所有内容在此作为参考)，可以增加致命性局部前列腺癌和非致命性前列腺癌(如局限于器官的前列腺癌)间的预后能力。前列腺癌组织核心的基质染色可以利用本领域技术人员熟知的任何合适方式进行，例如包括利用抗MIC-1抗体的免疫组织化学。因此，所述方法还包括检测与一种或几种预测因子结合的MIC-1的增加值，所述预测因子选自格里森得分、前列腺特异抗原量、MIC-1的基质染色和肿瘤淋巴结转移期。
前列腺癌患者可能会经历癌症的密切观察，或可能通过外科手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗、基因治疗、接种疫苗、细胞因子或细胞因子调整疗法(如抗体疗法)或这些治疗法的结合来治疗。
因此，第三方面，本发明提供了一种筛选受试者的方法，所述受试者被诊断为前列腺癌，所述受试者受益于前列腺癌的积极治疗，该方法包括，检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值表明所述受试者受益于前列腺癌的积极治疗。
在一些实施例中，MIC-1的增加值预示着受试者可能受益于前列腺癌的积极治疗。在另一些实施例中，MIC-1的增加值强烈地预示着受试者受益于前列腺癌的积极治疗。
在这里，术语″前列腺癌的积极治疗″可以理解为前列腺癌的治疗，可以去除和/或控制疾病，例如去除整个前列腺。这些积极治疗可能与一些不良副作用相关，但可以阻止前列腺癌发展成为更威胁生命的前列腺癌，即发展成为更严重或危险的阶段，和/或转移。积极治疗可能包括外科手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗、基因治疗、接种疫苗、细胞因子或细胞因子调整疗法(如抗体疗法)或这些治疗法的结合。
在一些实施例中，受试者可能最近被诊断出前列腺癌。
在第三方面的方法里用于使用的人体样本优选为血清样本，然而，第一方面方法提及的其他的人体样本也是适合的。
如第一方面或第二方面所述，MIC-1的值，在本发明第三方面的方法中被认为是MIC-1的“增加值”，可能随着使用的特定人体试验样本类型和受试者的年龄而变化。
对于被诊断为前列腺癌的受试者的血清样本来说，MIC-1的值＞1ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，预示着受试者可能受益于前列腺癌的积极治疗。更进一步地，MIC-1的值＞1.3ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，强烈地预示着受试者可能受益于前列腺癌的积极治疗。MIC-1的值＞1.6ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着受试者可能受益于前列腺癌的积极治疗。
人体试验样本中的MIC-1值可以如本发明第一方面和第二方面描述的迅速测定。
在本发明第三方面的实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是通过以下步骤测定的：
(i)测定所述受试者的MIC-1值；
(ii)将该MIC-1值与取自正常受试者的对照人体样本中的MIC-1值或范围进行比较。
在一些实施例中，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差10岁以内。更优选地，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差5岁以内。
在本发明第三方面的一些实施例中，人体试验样本中的MIC-1的增加值是利用多次测量测定的受试者的MIC-1的值的增加。因此，同一受试者人体试验样本中MIC-1的值可能是在不同时间点测定的。例如，受试者人体试验样本中MIC-1的值可能在诊断为前列腺癌前，或随即诊断为前列腺癌，且在诊断后一定的时间间隔内测定的。这个时间间隔可以根据受试者的需要逐个确定。例如，这个时间间隔可以为三个月或一年或两年，但可以理解为：时间间隔可以随着受试者的疾病分期或其他相关的健康医疗因素而调整。于是，人体试验样本的MIC-1增加值可以通过比较在特定时间点人体试验样本的MIC-1的值与相同人体样本在较早时间点的MIC-1值来检测。这样，MIC-1的增加值可以通过测定随时间的增加，特定受试者人体试验样本中的MIC-1值的增加来检测。
因此，在本发明第三方面的实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是受试者内MIC-1的值的增加，是通过多次测量测定的，包括：
(i)测定所述个体内的MIC-1值；
(ii)将该MIC-1值与较早时间点从相同受试者体内抽取的对照人体样本中的MIC-1的值或范围进行比较。
在该实施例中，受试者的MIC-1的增加值可以调整，以弥补通常与受试者年龄增加相关的MIC-1的增加。
可以理解为，与根据多次测量测定的MIC-1值的增加越大，越强烈地预示着受试者受益于积极治疗。在一些实施例中，根据多次测量测定的血清样本中MIC-1值的增加＞0.3ng/mL，很可能表示是MIC-1的增加值，强烈地预示着受试者受益于积极治疗。同时，根据多次测量测定的血清样本中MIC-1值的增加＞0.6ng/mL，很可能表示是MIC-1的增加值，更强烈地预示着受试者受益于积极治疗。
在本发明第三方面的一些实施例中，受试者大于35岁，或更优选地，大于45岁。然而，在另一些实施例中，受试者可能大于55岁，或大于65岁，或甚至大于75岁。
本发明第三方面的方法的结果可以是一种或几种其他的预测指标结合来使用(如格里森得分和PSA)。此外，利用该方法的结果，结合MIC-1基质染色评估，可以增加选择治疗策略的能力。因此，所述方法还包括检测与一种或几种预测因子结合的MIC-1的增加值，所述预测因子选自格里森得分、前列腺特异抗原量、MIC-1基质染色和肿瘤淋巴结转移期。
本发明还发现前列腺癌患者的MIC-1血清水平在如外科手术或放射治疗的积极治疗后，可能仍然是增加的(即MIC-1水平的增加可能是由于残余的，未检测到的癌症)。在这些案例中，治疗后MIC-I水平增加的测量结果表明这些受试者可能受益于辅助治疗。
因此，第四方面，本发明提供了一种筛选前列腺癌后期辅助治疗的受试者的方法，该方法包括，检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的增加值，所述MIC-1的增加值表明所述受试者受益于辅助治疗。
在这里，术语″辅助治疗″可以理解为可以去除和/或控制疾病的前列腺癌的额外治疗，如去除整个前列腺。这些辅助治疗可能与一些不良副作用相关，但可以阻止前列腺癌发展成为更威胁生命的前列腺癌，即发展成为更严重或危险的阶段，和/或转移。辅助治疗包括外科手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗、基因治疗、接种疫苗、细胞因子或细胞因子调整疗法(如抗体疗法)或这些治疗法的结合。
在第四方面的方法里使用的人体样本优选为血清样本，然而，第一方面方法提及的其他的人体样本也是适合的。
MIC-1的值，在本发明第四方面的方法中被认为是MIC-1的“增加值”，可能随着使用的特定人体试验样本类型和受试者的年龄而变化。
对于被诊断为前列腺癌的受试者的血清样本来说，MIC-1的值＞1ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，预示着受试者可能受益于前列腺癌的辅助治疗。更进一步地，MIC-1的值＞1.3ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，强烈地预示着受试者可能受益于前列腺癌的辅助治疗。MIC-1的值＞1.6ng/mL很可能表示MIC-1的增加值，更强烈地预示着受试者可能受益于前列腺癌的辅助治疗。
人体试验样本中的MIC-1的值可能如本发明第一方面和第二方面描述的迅速测定。
在本发明第四方面的实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是通过以下步骤测定的：
(i)测定所述人体试验样本中的MIC-1值；
(ii)将该MIC-1值与取自正常受试者的对照人体样本中的MIC-1值或范围进行比较。
在一些实施例中，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差10岁以内。更优选地，正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相差5岁以内。
在本发明第四方面的一些实施例中，人体试验样本中的MIC-1的增加值是利用多次测量测定的受试者的MIC-1的值的增加。因此，同一受试者人体试验样本中MIC-1的值可能是在不同时间点测定的。例如，受试者人体试验样本中MIC-1的值可能在诊断为前列腺癌前，或随即诊断为前列腺癌，且在诊断后一定的时间间隔内测定的。这个时间间隔可以根据受试者的需要逐个确定。例如，这个时间间隔可以为三个月或一年或两年，但可以理解为：时间间隔可以随着受试者的疾病分期或其他相关的健康医疗因素而调整。于是，人体试验样本的MIC-1增加值可以通过比较在特定时间点人体试验样本的MIC-1的值与相同人体样本在较早时间点的MIC-1值来检测。这样，MIC-1的增加值可以通过测定随时间的增加，特定受试者人体试验样本中的MIC-1值的增加来检测。
因此，在本发明第四方面的实施例中，人体试验样本中的MIC-1增加值是受试者内MIC-1的值的增加，是通过多次测量测定的，包括：
(i)测定所述人体试验样本中的MIC-1值；
(ii)将该MIC-1值与较早时间点从相同受试者体内抽取的对照人体样本中的MIC-1的值或范围进行比较。
在该实施例中，受试者的MIC-1的增加值可以调整，以弥补通常与受试者年龄增加相关的MIC-1的增加。
可以理解为，根据多次测量测定的MIC-1值的增加越大，越强烈地预示着受试者受益于辅助治疗。在一些实施例中，根据多次测量测定方法测定的血清样本中MIC-1值的增加＞0.3ng/mL，很可能表示是MIC-1的增加值，强烈地预示着受试者受益于辅助治疗。同时，根据多次测量测定方法测定的血清样本中MIC-1值的增加＞0.6ng/mL，很可能表示是MIC-1的增加值，更强烈地预示着受试者受益于辅助治疗。
在本发明第四方面的一些实施例中，受试者大于35岁，或更优选地，大于45岁。然而，在另一些实施例中，受试者可能大于55岁，或大于65岁，或甚至大于75岁。
因此，本发明第四方面的方法的结果可以是一种或几种其他的预测指标结合来使用(如格里森得分和PSA)。此外，利用该方法的结果，结合MIC-1基质染色评估，可以增加选择治疗策略的能力。例如，之前表明MIC-1基质染色水平是与放射性前列腺切除术后的前列腺癌结果相关联的，下降的基质染色水平是疾病再度恶化的独立的预测因子30。因此，本发明第四方面所述方法还包括检测与一种或几种预测因子结合的MIC-1的增加值，所述预测因子选自格里森得分、前列腺特异抗原量、MIC-1基质染色和肿瘤淋巴结转移期。
以下将结合附图和非限制的实施例来详细说明本发明。
实施例1  健康对照人群与前列腺癌患者中MIC-1的血清浓度
材料与方法
前列腺癌研究人群
前列腺癌人群是前列腺癌病因学的基于群体病例对照研究中心(被称为瑞典前列腺癌研究中心，研究分两个阶段进行，在2001年1月和2003年10月间注册)的一部分。简单的说，受试者都为病理学确诊为前列腺癌的35岁到79岁男性(ICD-10：C61)。取得1380前列腺癌病例的血清样本用于MIC-1血清分析。临床信息如肿瘤淋巴结转移(TNM)分期，格里森得分，诊断性前列腺特异抗原(PSA)浓度和主要治疗手段通过国家前列腺癌登记处(表1)的链接而得到。从诊断日期后平均为4.9个月(从0.7到23.7个月)，前列腺癌患者捐献的血液被储存在-70℃直到分析。表面健康对照人群为876个男性，自然的，表面健康的，对照人口受试者随机选自瑞典人口登记处，频率与之前描述的前列腺癌病例的预期分布相等，其是按照年龄(相差5岁以内一类)和地理住所分布的。病例全为35到79岁的男性。取876个对照人口受试者的血清样本用于MIC-1血清分析。
表1  研究组的描述性特征*
Figure GPA00001115127400151
*正负值以平均值±SD来表示；
Figure GPA00001115127400152
临床分期根据国际抗癌联盟恶性肿瘤TNM分期来分组12。
随访评估
利用每个研究参与者唯一的国际登记号，通过与瑞典死亡原因登记处链接的记录，前列腺癌特异性死亡率的随访，直到2007年3月1日完成。由有经验的肿瘤专家检查死亡证明书，建立2004年12月31号后死亡的受试者的死亡原因，其中前列腺癌特异性死亡定义为前列腺癌被归类为死亡的根本原因。平均随访时间为4.6年(从0.6到6.5年)。共325(23％)名前列腺癌患者在随访期间死亡，其中有218(15％)名患者，前列腺癌被归类为其死亡的根本原因。在自然对照人群中，82名(9％)死于随访期间。
测定MIC-1血清水平
利用MIC-1夹心ELISA来测定MIC-1血清水平。夹心ELISA使用鼠单克隆抗体(MAb)26G6H62，3用于抗原捕捉，羊多克隆抗体(PAb)233B3-P用于检测2。确定两种抗体的最佳浓度，然后用于后续的所有研究。96孔ELISA酶标板用以1∶5(最终浓度约为20ng/mL)的比例稀释于包被缓冲液中(溶于蒸馏水的0.1mol/L碳酸盐，pH 9.4-9.8)中的MAb 26G6H6上清液包被，置于4℃ 24小时。然后每孔加入300μL于37℃下溶于磷酸盐缓冲液(PSB)2小时的1％(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)溶液洗涤ELISA板三次。然后按100μL/孔的量将重组人类MIC-1(rhMIC-1)标准品、组织培养上清液或患者血清加入到板里，37℃孵育1h。冲洗板三次，然后每孔加入100μL以1∶5000稀释于抗体稀释液(Ab稀释液；PBS中含有1％(wt/v)BSA和0.05％(v/v)吐温-20)中的羊PAb 233B3-P，37℃孵育1h。然后洗涤ELISA平板三次，每孔加入100μL以1∶5000比例稀释于Ab稀释液中的生物素标记的驴的抗羊IgG，37℃孵育1h。然后洗涤板四次，接下来每孔加入100μL溶于含0.014％H2O2，pH5.0的0.05mol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中(Sigma)的过氧化物酶底物(1mg/mL o-苯二胺盐酸盐(Sigma))。显色5-15min，每孔加入100μL 4N H2SO4终止反应。利用酶标仪在490nm波长处测定吸光率。样本中人类MIC-1(hMIC-1)的浓度通过与rhMIC-1标准曲线比较而测定。利用酶标仪(Pasteur Diagnostics)提供的标准曲线拟合软件来制作标准曲线。标准曲线中rhMIC-1的浓度是基于高纯度重组MIC-1的主标准与该标准作比较而测定的。主标准蛋白质浓度是通过总氨基酸组合物的八次测定而确定的。所有的样本至少进行两次三个重复分析。结果以平均数+/-SD的形式表示。血清样本无目的地贴上标签用于血清浓度的测定。
统计分析
按年龄段，通过ANOVA分析，比较MIC-1血清水平和log-转换的MIC-1浓度水平。评估从诊断日期到死亡日期或到数据归并日期(1 March 2007)的生存率。存活时间设定为患者死于非前列腺癌的死亡时间。通过MIC-1血清水平，使用Cox回归模型评估前列腺癌死亡率的风险比(HR)。
结果
自然对照人群的MIC-1血清浓度和年龄之间的相关性
如表2和图1所示，自然的、表面健康对照人群受试者的MIC-1血清浓度与年龄是非常相关的。例如，45-54岁的MIC-1血清浓度平均数±SD为543±352pg/ml，而75-79岁为1260±1033pg/ml。
表2  对照人群中MIC-1血清浓度的描述性统计表
Figure GPA00001115127400171
1ANOVA
自然对照人群的MIC-1血清浓度和总生存率之间的相关性
如图3所示，令人惊奇的是，对照人群的MIC-1血清浓度与总生存率是呈负相关的。例如，当对照人群根据血清MIC-1水平划分为四分位数时，只有3％、MIC-1血清浓度＜673pg/ml的对照人群死于其他原因，而22％、MIC-1血清浓度＞1299pg/ml的对照人群死于其他原因。
表3  根据死于其他原因的876例对照人群MIC-1血清浓度的风险比死亡率
1来自Cox模型的风险比
2来自按年龄段调整后的Cox模型的风险比
前列腺癌患者及其随访
在PSA试验中，通过PSA浓度升高总计发现414(30％)名前列腺癌病例；897(65％)名患者被诊断为局部化疾病，其中癌症局限于前列腺包膜，没有区域或远处传播的证据(表1)。大多数患者接受了最初治疗；48％的研究人群主要使用治疗疗法，35％使用保守疗法。在随访期间，1380个男人中有316(23％)死亡，218(15％)患有前列腺癌，归类为其根本死亡原因。随访时间为4.7年(从0.1到5.9年)。
MIC-1血清浓度和前列腺癌疾病的临床分期
MIC-1血清浓度根据前列腺癌不同的临床分期差异显著(P＜0.001)。与疾病的局部化分期I-II的患者中MIC-1血清浓度(平均值＝1101pg/ml)相比，在前列腺癌局部晚期III和转移期IV的患者中，可以观察到MIC-1血清浓度显著升高(分别为：平均值＝1394pg/ml，p＜0.001；平均值＝2084pg/ml，p＜0.001)。
MIC-1血清浓度和前列腺癌死亡
前列腺癌患者根据血清MIC-1水平分层为四分位数。与存活的前列腺癌患者相比，最终死于前列腺癌的患者中MIC-1血清浓度的偏向于最高四分位数(图2)。单变量Cox回归分析显示了MIC-1浓度的增加与死亡率升高是非常相关的，log转化的MIC-1浓度每增加100％，死亡率就增加四倍(趋势P＜0.001)。而只有6％的MIC-1血清浓度＜722pg/mL的患者死于随访期间，30％的MIC-1血清浓度＞1466pg/mL的患者死亡了，产生6倍斜率(风险比＝6.1，95％置信区间(CI)＝3.8-9.8，表4)。
格里森得分、TNM分期、和PSA浓度的调整减弱了MIC-1血清浓度和前列腺癌生存率之间的相关性。然而，高MIC-1浓度仍然是一个单独的预后预测因子，与最低类别相比，最高类别具有高于3倍的死亡率(风险比＝3.4，95％CI＝2.0-5.8；表4)。
与全部研究人群相比，局部化疾病的患者MIC-1血清浓度和前列腺癌存活率之间具有更强的相关性。最高血清MIC-1浓度的患者比最低种类的患者死亡率高11倍(风险比＝11.4，95％CI＝3.4-38.3)。在调整分析中，MIC-1仍然是一个单独的预后因素，最高种类比最低种类死亡率几乎高6倍(风险比＝5.8，95％CI＝1.7-20.2)。
MIC-1血清浓度预测前列腺癌结果的准确性
随访早期，在区分致命性和非致命性前列腺癌方面，MIC-1血清浓度显示了良好的预测准确性；然而，这种区分能力随着时间而逐渐减弱，在随访最后减到约0.68，造成0.70的全球同病率记录(95％CI＝0.65-0.72；图3)。从包含PSA和格里森得分的预测模型的0.82到还包含MIC-1的预测模型的0.84，全球同病率增加显著(p＜0.001)。在诊断为局部化疾病的患者中，当预测模型除包含PSA和格里森得分外，还包括MIC-1时，全球同病率从0.82显著增加到0.86(p＜0.001)。
表4  根据死于前列腺癌的1380名前列腺癌患者的MIC-1血清水平的风险比
Figure GPA00001115127400191
1单变量Cox模型的风险比
2多变量Cox模型的风险比，MIC-1、格里森得分、TNM分期、诊断术后PSA和区域或远处转移作为协变量
讨论
该实施例从大量前列腺癌患者的研究证实了MIC-1血清浓度和疾病分期之间的相关性，表明了血清MIC-1浓度的预后价值。在多变量分析中，调整重要的预后因素后(包括格里森得分、临床分期和诊断性PSA浓度)，MIC-1仍然是疾病结果的一个单独的预后指标。
重要的是，在局限于器官的疾病中，血清MIC-1浓度的升高是最终致命性前列腺癌的有力的、单独的预测因子。当疾病的传统标记(格里森得分和PSA)也用于区分致命性和非致命性前列腺癌时，血清MIC-1浓度的预测价值进一步加强。在最初局部化前列腺癌中，血清MIC-1、格里森得分和PSA的预后价值尤其显著。这些结果强烈地表明血清MIC-1浓度是用于预测前列腺癌级数的一个重要的生物标记。
该研究也表明了，结合血清MIC-1浓度、PSA浓度和格里森得分显著地增加了预测疾病发生的准确性，尤其是在局部化疾病患者中。具体地，这种增加在早期预测中最显著，随着随访时间逐渐减弱，因此，高诊断性MIC-1浓度可用于识别除受益于局部治疗外，还受益于最初的系统辅助治疗的患者。
尽管MIC-1和癌症之间有强的相关性，MIC-1在肿瘤形成中的作用不好理解6。大多数研究报道MIC-1在调节肿瘤生长中通过p53依赖性和p53非依赖性途径诱导凋亡，以及通过抗肿瘤形成活性19，而起抗肿瘤形成的作用9，17 18；然而，也有报道肿瘤形成活性的加强20。在本研究中，观察到MIC-1血清浓度和前列腺癌特异性生存率之间有显著的相关性。血清MIC-1浓度和前列腺癌死亡率之间相关性的一致性提示MIC-1在前列腺癌级别中具有功能性作用。
综上所述，MIC-1血清浓度在前列腺癌晚期和转移患者中显著地升高。此外，血清MIC-1浓度是前列腺癌，尤其是在局限于前列腺的患者死亡率的有力的预测因子，其独立于已知的预后因素。而且，血清MIC-1浓度与年龄呈强相关性，而且与对照人群的总生存率呈相关性。
实施例2  表面健康男性对照人群中血清MIC-1与生存率关系的进一步考察
材料与方法
男性对照人群受试者的随访评估
利用每个研究参与者唯一的国际登记号，使用与瑞典死亡原因登记处链接的记录，对上述所说的876例表面健康男性进行前列腺癌特异性死亡率的随访，直到2007年3月1日完成。检查死亡证明书，建立2004年12月31号后死亡个体的死亡原因。平均随访时间为5.2年(从0.1到5.9年)。共102(12％)名前列腺癌患者在随访期间死亡，其死亡原因可从死亡证明书得知，且根据国际疾病分类(ICD)标准编码。除了要考虑总体的死亡率，也考察了根本死亡原因为癌症(ICD9 140-239，ICD10 C00-D48)和心血管疾病(CVD)(ICD9401-459或ICD10 110-199)的死亡率。
统计分析
结果采用中值(±)范围的方式，除非另有说明，p＜0.05表明具有显著性。分别利用连续变量的不成对t试验和分类变量的卡方分析对人群进行比较。由于许多数值不是正态分布，通过Spearman的rank检验来计算标记物之间的相关性。比较不同MIC-1水平的患者累积生存率之间的差异。计算从抽血日到死亡日的暴露时间，并首先检查时间间隔的长短。使用Cox比例危险度模型评估未作调整的和已作调整的死亡相对危险度(RRs)和95％CI。以之前分析确定的变量作为独立的风险因子，第一个拟合模型后评估已作调整的RRs。通过Kaplan-Meier方法计算生存曲线，利用log-rank检验统计，比较风险分层组间的生存曲线。当比较系数的相关性时，通过相关性z试验确定相关性r值，利用Fisherr到z转换比较相关性r值。按之前描述的方法比较相对危险度25。用StatView 5.0软件(SAS Inc.，CampusDrive，Cary，NC，United States of America)来分析。
结果和讨论
男性对照人群的特征
在876个受试者中，102人在随访期间死亡。其中，30人死于癌症，46人患有心血管疾病，其中13人患有缺血性心肌梗塞。剩下的26个患者死于其他的原因或按其死亡证明书没有明确地分类(表5)。血清MIC-1水平的中值是934pg/ml(范围为156-9638pg/ml；四分位数间距为628pg/ml)。
表5  876名表面健康男性对照人群的描述性数据
变量                特异性                数据
抽血年龄(岁)                              68±12
随访时间(年)                              5.3±0.5
抽烟情况n(％)
                    从未                  330(38％)
                    现在或过去            513(58％)
                    未知                  33(4％)
MIC-1水平(pg/ml)                          935±627
BMI(kg/m2)                                25.9±3.9
死亡率n(％)
                    存活                  774(88％)
                    死亡                  102(12％)
死亡原因n(％)
                    心血管                43(42％)
                    随访时间              3.3±2.9
                    癌症                  33(33％)
                    随访时间              2.7±2.2
                    其他                  26(25％)
                    随访时间              3.1±1.7
1数据用中值±四分位数间距或绝对值表示(％)
在正常男性人群中血清MIC-1水平是死亡的预测因子
在所有男性人群中，血清MIC-1水平与年龄和预测的死亡率显著相关，调整年龄后的死亡相对危险度为3.38(95％CI＝1.38-8.26)。876个男性对照受试者在中值(935+627pg/ml)以上的血清MIC-1水平与死亡率有相关性(p＜0.0001)。根据受试者血清MIC-1中值(935pg/ml)分层的Kaplan Meier图表明，与MIC-1水平低于中值的受试者的生存率相比，MIC-1水平高于中值的受试者生存率明显低(分别为94％和82％；p＜0.0001；图4A)。而且，在研究期间最终死亡的受试者中，血清MIC-1水平明显较高(存活受试者中值＝885pg/ml，死亡受试者中值＝1432pg/ml；p＜0.0001)。然而，死亡的受试者明显比存活的受试者年龄老(存活者的抽血年龄中值＝67岁，死亡者的抽血年龄中值＝75岁；p＜0.0001)。而且，血清MIC-1水平与年龄有相关性(p＝0.458；p＜0.0001)。根据血清MIC-1水平将人群划分为四分位数，如图4B所示重新检测。大部分在随访期间死亡的受试者的血清MIC-1水平在最高四分位数(＞1299pg/ml)。而且，血清MIC-1水平在最高四分位数与死亡率显著相关(p＜0.0001)，在这个四分位数里，只有74％的受试者存活，在较低的三个四分位数，受试者的存活率大于90％。最终死于非心血管或非癌症、心血管疾病或癌症的男性的血清MIC-1水平更可能位于最高四分位数(分别为p＝0.0034，p＝0.0001，p＝0.0429)。如表6所示，利用Cox比例风险模型，最高四分位数的血清MIC-1水平造成死亡风险增加7倍(RR 7.05；95％CI3.49-14.25)。当调整死亡的其他风险、吸烟史、BMI和年龄时，最高四分位数的血清MIC-1仍然与未来死亡率风险显著相关(RR 3.38；95％CI 1.38-8.26；表6)。
表6  男性对照人群中所有死亡原因的多变量Cox比例风险分析
Figure GPA00001115127400231
Figure GPA00001115127400232
原始的
Figure GPA00001115127400233
调整年龄、BMI和吸烟史后
因此，血清MIC-1水平为正常男性人群的未来所有死亡原因提供了一个单独的、有力的预测因子。
实施例3  在双胞胎人群中血清MIC-1的相关性
为了确认，考察了双胞胎人群中血清MIC-1和生存率之间的相关性。
材料和方法
双胞胎组
双胞胎组包括308对受试者(包括154对同性双胞胎)，登记于目前世界最大的双胞胎登记处——瑞典双胞胎登记处，其登记了自1886出生的超过85,000对双胞胎。用于目前分析的双胞胎子集参与了生物老化的研究22-23。之前通过询问双胞胎是否″像一个豆荚里的豌豆那样相似″或″通常不会比同胞更相似″来测定结合性；所有双胞胎通过限制性片段长度多态性(RPLP)或血清测试和微卫星标记来确定其结合性。
双胞胎人群的随访评估
对于双胞胎人群中的308对受试者，通过总人口登记处直至2003年底得到死亡日期；利用每对双胞胎个人登记号(PRN)，通过与瑞典死亡原因登记处的链接而得到死亡原因。死亡原因登记处，建立于1961年，对死于1961年后的所有瑞典人口的完整性为99％。死亡原因更新至2001年底。特异性原因的死亡从死亡证明书获得，且根据国际疾病分类学(ICD)标准编码。除了考察总体死亡率，还评估了癌症(ICD9 140-239，ICD10 C00-D48)和CVD(ICD9 401-459或ICD10 110-199)是其根本死亡原因的死亡率。年龄和性别信息来源于瑞典双胞胎登记处。每对双胞胎的观测时间从加入组群日——定义为抽血日期(1992-1996)开始，直到观测期末(2003年3月31日)发生死亡或终检(存活)。
测定端粒长度
用于端粒分析的全血对154对双胞胎是有效的24。通过末端限制性片段(TRF)分析来评估端粒的长度，其是依赖于至少105个细胞的限制性酶消化和Southern杂交来测定端粒的平均长度。尽管对短端粒的检测存有偏见，这是最初的，也是使用最广泛的技术之一，产生了可靠的结果。测定了18批研究参与者的端粒长度。为了计算端粒测量中可能的批次特异性差异，每批端粒长度分别统一标准以适合正态分布，然后每批统一了标准的端粒长度用于端粒长度连续变量分析。当把端粒长度作为分类变量来研究时，分别按长度来获取每个批次的四分位数，然后把所有批次的对应的每个四分位数(Q1，Q2，Q3和Q4)分组汇集。标准化和四分位数方法是控制批次间测量变量的测量方法。为了检验批次间变量的控制情况，限于对端粒长度标准化的33对双胞胎进行分析，其中也测定了同批中双胞胎之间的协作。
血清MIC-1水平的测定
利用敏感性的夹心ELISA2来测定MIC-1血清浓度(pg/ml)，敏感性的夹心ELISA如前所述，使用鼠单克隆抗体(MAb)26G6H6用于抗原捕捉，羊多克隆抗体(PAb)233B3-P用于检测。所有样本三次重复试验，样本之间的变量系数少于12％。
统计分析
如实施例2进行统计分析。
结果和讨论
双胞胎组的特征
如表7所示，在抽血时，双胞胎组受试者明显比男性对照人群受试者老(双胞胎组中值＝78岁；男性对照人群组＝68岁；p＜0.0001)。双胞胎组比男性对照人群组具有较高的血清MIC-1水平(中值＝1393pg/ml；范围为428-8064pg/ml；四分位数值间距为1056pg/ml；p＜0.0001)，血清MIC-1水平与年龄显著相关(p＝0.614；p＜0.0001)。此外，双胞胎人群(中值＝23.84kg/m2)比男性对照人群组(中值＝25.92kg/m2；p＜0.0001)的BMI明显较低。
表7  308对双胞胎受试者的描述性数据
死亡的199个受试者，29人死于癌症，95人死于心血管事故，其中41人为心肌梗塞。双胞胎组中最终死亡的受试者在血液取样时比男性对照人群组死亡的受试者老(双胞胎组中值＝83岁；男性对照人群组中值＝71岁；p＜0.0001)。与男性对照人群组相反，双胞胎组67％以上为女性，尽管血清MIC-1水平在性别之间没有显著差异(双胞胎组男性MIC-1水平中值＝1407pg/ml；双胞胎组女性MIC-1水平中值＝1383pg/ml；p＝0.5149)。然而，在血液取样时，双胞胎组中的女性明显比男性老(双胞胎组中女性年龄中值＝82岁；男性年龄中值＝74岁；p＜0.0001)。男性和女性在死亡率上没有差异(p＝0.6268)。有趣的是，血清MIC-1与端粒长度负相关(ρ＝-0.181；p＝0.0011)。双胞胎组中117对受试者的血清IL-6水平是有用的，双胞胎组中109对受试者的血清CRP水平是有用的。血清MIC-1水平与血清IL-6有相关性(ρ＝0.233；p＝0.0121)；然而，血清MIC-1与CRP血清水平没有相关性(ρ＝0.054；p＝0.5765)。由于血清IL-6、CRP、年龄、端粒长度和BMI是被确定的死亡标志，将它们预测死亡率的能力与血清MIC-1水平预测死亡率的能力进行了比较。
MIC-1是确定的未来死亡率的单独的标志
双胞胎组中受试者的血清MIC-1水平分层为四分位数。血清MIC-1预测死亡率，血清MIC-1水平增加与死亡率风险的增加具有相关性(p＜0.0001；表8；图5)。在这组中，只有6％的血清MIC-1水平在最高四分位数的受试者在随访期间存活了，相比而言，69％的血清MIC-1水平在最低四分位数的患者在随访期间存活了。最终死于癌症、心血管疾病或其他情况的受试者更可能具有最高四分位数的血清MIC-1水平(分别为p＝0.0345，p＜0.0001，p＝0.0263)。最高四分位数的血清MIC-1水平的受试者死亡风险增加(RR＝8.64；95％CI＝5.41-13.78)，证实了所有男性对照人群组中的观察结果。然而，在双胞胎组里，最低四分位数以上的MIC-1血清水平的任何增加都表明死亡风险的增加(表8)。当与死亡率相关的其他因素(如之前或现在的吸烟史，BMI、性别、端粒长度和年龄)调整时，最高两个四分位数的血清MIC-1水平仍然独立地与未来死亡率风险的增加具有相关性(最高四分位数：RR＝2.87，95％CI＝1.68-4.91；第二最高四分位数：RR＝1.99，95％CI＝1.20-3.29；表8)。
当进一步调整端粒长度、IL-6和CRP时，双胞胎组也证实了血清MIC-1是死亡率的一个单独的预测因子这一发现。双胞胎组中只有108对受试者的数据对血清IL-6和CRP水平都有用。由于血清MIC-1的最高两个四分位数有力地预测死亡率，调整以后，血清MIC-1根据中值(1392pg/ml)而分层。除了调整以前或现在的吸烟史、BMI、性别、端粒长度和年龄，血清IL-6和CRP水平的风险比也被调整了。当调整以前或现在的吸烟史、BMI、性别、端粒长度和年龄、血清IL-6和CRP水平后，高于中值的血清MIC-1水平是死亡率的一个单独的预测因子(RR＝2.26；95％CI＝1.19-4.29；表8)。
在所有男性对照人群组和双胞胎组里，血清MIC-1与BMI不是非常相关的(数据没有显示出来)。这很可能是因为在这些组里相比起疾病特异性人群(除了心血管疾病人群)血清MIC-1水平相对较低。这些结果表明影响BMI的血清MIC-1水平在患病人群中明显较高27。先前显示在心力衰竭患者中，影响BMI的血清MIC-1水平很可能大于3700pg/ml28。然而，相比较老的双胞胎组，所有较年轻的男性人群对照组中BMI明显较高，血清MIC-1水平较低，如前所述，这标志着血清MIC-1与BMI呈负相关27。加之，当结合男性对照人群和双胞胎组的大于3800pg/ml的血清MIC-1水平的患者时，血清MIC-1与BMI趋于负相关(ρ＝-0.351；p＝0.0547)。前列腺癌患者只有当MIC-1水平大于6000pg/ml时与BMI有显著的相关性，在慢性肾脏疾病中也有类似的相关性(Breit et al.submitted to The Lancet)。
因此，血清MIC-1水平被证实为一种单独的、有力的双胞胎人群未来所有原因死亡率的预测因子，双胞胎人群主要为女性，双胞胎组中血清MIC-1与死亡时间有相关性。正如之前公开的，血清MIC-1水平与年龄、及死亡率和老龄化的其他标志，特别是IL-6和CRP有相关性26。血清MIC-1水平与端粒长度呈现弱却显著的相关性，这可能通过一些环境变量而受到影响。氧化应激显著地缩短了端粒长度，且诱导DNA损伤，可能导致重复序列(Breit et al.submitted to The Lancet)，重复序列是生物老化的标志。
表8  双胞胎组所有死亡原因的多变量Cox比例风险分析
Figure GPA00001115127400271
Figure GPA00001115127400281
原始的。
Figure GPA00001115127400282
调整了年龄、性别BMI、吸烟史和端粒长度。
*调整了年龄、性别BMI、吸烟史、端粒长度、IL-6和CRP。
血清MIC-1水平预测与遗传背景无关的死亡率
尽管与生物老化的可能标志相关，结果中的一些重要的数字预测死亡率26，结果表明：由于血清MIC-1水平与生存时间直接相关，不受双胞胎结合性影响，因而血清MIC-1水平独立地预测死亡率，不受遗传背景大的影响。在双胞胎两个都死亡的情况下，血清MIC-1与生存时间显著地反相关(r＝0.344；p＜0.0001)。如图6A和6B所示，同卵(MZ)和异卵(DZ)双胞胎之间的相关性的强度没有显著的差异(MZ：r＝0.419，p＜0.0001；DZ：r＝0.342，p＝0.0046；差异z＝-0.51；p＝0.2946，一个尾部，p＝0.5892两个尾部；Fisher r到z转换)。
加之，利用Cox比例风险模型，血清MIC-1水平大于开始研究时的中值的MZ和DZ双胞胎之间的死亡风险没有显著的差异(MZ：RR＝1.71，95％CI＝1.06-2.77；OZ：RR＝2.17，95％CI＝1.32-3.56)，这些相关性没有显著的不同(相对危险度＝1.27；95％CI＝0.63-2.53)。因此，血清MIC-1在同卵双胞胎和异卵双胞胎具有相似的预测死亡率的能力，表明血清MIC-1的改变与活跃的疾病发展而不是遗传背景相关。
因此，血清MIC-1水平是一种重要的用于预测所有原因死亡率的风险增加的生物标志。
实施例4  前列腺癌患者的MIC-1血清浓度
为了证实如实施例1的前列腺癌患者的血清MIC-1水平，在该实施例中，除了组更大，随访多10个月外，与实施例1描述的研究相同，以考察被诊断为前列腺癌的男性组。
材料与方法
研究组
本研究利用来自1440前列腺癌受试者(来自瑞典前列腺癌(CAPS))的血清样本，用于MIC-1水平的测定。基于自我报告的治疗史，样本归类为治疗前(n＝431)或治疗后(n＝1011)。
随访评估
利用每个受试者唯一的国际登记号，通过链接于瑞典人口登记处的记录，评估了从抽血日期到2008年1月15日的活体状况，前列腺癌特异性生存率通过链接于至2005年12月31的死亡原因登记处而获得。由有经验的肿瘤专家检查死亡证明书，建立2005年12月31号后死亡个体的死亡原因。
MIC-1血清水平的测定
MIC-1血清浓度(pg/ml)如实施例1描述的进行测定。所有样本进行三次试验，样本之间的变量系数低于12％。
统计分析
用Kruskal-Wallis试验，来检验临床特征之间MIC-1血清水平的差异。利用死于前列腺癌作为结果进行时间-事故分析。在死于非前列腺癌的受试者死亡时考察存活时间。利用Cox回归分析评估MIC-1血清水平和前列腺癌死亡率之间的相关性，以所有患者MIC-1水平分布的四分位数为基础，血清浓度归类为四组，最低组(即较低四分位数)用作参考组。以预测风险组分层的分析中，进行log-转换的MIC-1水平的Cox回归分析。为评估MIC-1血清水平对前列腺癌死亡率的区分能力，评估了基于Cox回归模型的参数评估的同病率概率31。同病率评估在0.5-1.0范围内，1.0代表预后性变量和存活时间的理想的同病率。
竞争风险的存在因使用R程序语言32的cmprsk包而为公众所知，cmprsk包用于评估前列腺癌死亡率的累积发病率。使用Gray′s试验33来评估根据MIC-1水平分布的四分位数分组的患者之间的累积发病率差异。报道的所有P值基于两方面假设。
结果
MIC-1血清水平
表9显示了根据患者的临床特征的MIC-1血清水平。MIC-1血清水平随T分期(P＜0.0001)、M分期(P＜0.0001)、格里森得分(P＜0.0001)和诊断性PSA水平(P＜0.0001)的水平升高而显著升高。淋巴结阴性和淋巴结阳性患者之间MIC-1血清水平没有观察到显著的差异。
表9  较大前列腺癌组的MIC-1血清水平
Figure GPA00001115127400301
1Kruskal-Wallis检验
MIC-1血清水平和前列腺癌死亡率
总的来说，1442男性中有380人(26％)在随访时期死亡，265(18％)人前列腺癌归为其根本死亡原因。平均随访时间为4.9年(从0.1到6.8年)。根据MIC-1血清水平将人群分层为四分位数。最后死于前列腺癌的患者的MIC-1血清水平的分布与存活患者相比，趋向于最高四分位数。如图7和表10所示，6年随访之后，MIC-1血清浓度在710pg/ml以下(即底部四分位数，图7中第一四分位数)的受试者的前列腺癌累积死亡率为7％，MIC-1血清浓度在1456pg/ml以上(即最高四分位数，图7中第四四分位数)的受试者的前列腺癌累积死亡率为34％(P＜0.0001)，相当于6倍相对风险度(风险比[HR]，6.33；95％置信区间[CI]，4.11-9.74；表10)。在调整已知的预后因素格里森得分、TNM分期和诊断性PSA水平的多变量分析中，高MIC-1水平仍然与前列腺癌死亡率呈相关性(调整后HR，3.58；95％ CI，2.28-5.63；表10)。
表10  1442例前列腺癌患者死于前列腺癌的风险
*来自多重Cox模型的风险比，多重Cox模型包括血清MIC-1水平、临床T分期、活组织切片检查格里森得分、诊断性血清PSA水平和转移情况作为变量
对治疗前(n＝431)和治疗后(n＝1,011)抽血的男性的MIC-1血清水平分别进行评估。与总研究组比较，治疗前MIC-1血清水平和前列腺癌生存率之间具有更强的相关性(表10)。在最高四分位数的受试者(即血清MIC-1水平＞1456pg/ml)比在最低四分位数的受试者(即血清MIC-1水平＜710pg/ml)的死亡率高于12倍多(HR，12.08；95％ CI，2.82-51.70)。在调整后的分析中，治疗前MIC-1水平仍然是一种单独的预后因素，在最高四分位数的死亡率比最低四分位数的死亡率差不多高十倍(HR，9.61；95％ CI，2.22-41.57)。受试者在治疗后最高四分位数的MIC-1血清水平也与前列腺癌死亡率风险增加呈相关性，比最低四分位数的MIC-1血清水平的受试者的死亡率高六倍(HR，5.95；95％ CI，3.78-9.37；表10)。对格里森得分、TNM分期和诊断性PSA水平的调整减弱了治疗后MIC-1血清水平和前列腺癌死亡率之间的相关性；然而，治疗后血清MIC-1水平最高四分位数(即＞1456pg/ml)仍然是一种单独的预后学的预测因素，最高组比最低组的癌症死亡率要高3倍(HR，3.09；95％ CI，1.91-5.00；表10)。
临床局部疾病的受试者的MIC-1血清水平
然后限于对临床局部疾病的受试者(即T得分为T1/T2，N得分为N0/Nx，M得分为M0/Mx的受试者)进行分析，因为对这些受试者进行单独预测和处理是一种特殊的挑战。为探究更相似子群MIC-1血清水平的预测值，将受试者进一步划分为传统的低风险组(PSA＜10且格里森得分＜7)、中风险组(PSA为10-20或格里森总数为7)和高风险组(PSA＞20且格里森得分＞7)。然而，由于在低风险组随访期间只有一个受试者死于前列腺癌，因此将低风险组和中风险组归为一个风险组。log-转换的MIC-1血清水平的Cox回归分析表明：在低/中风险组的男性间其与前列腺癌死亡率显著相关，在高风险组也是一样(分别为P＝0.0001和P＝0.001；表11)。通过评估Cox模型的预测强度，低/中风险组的男性间的同病率概率为0.74(SE，0.04)，而高风险组的男性间的同病率概率为0.66(SE，0.04)。
限于治疗前或治疗后抽血的样本分析表明，低/中风险组(治疗前，P＝0.009；治疗后，P＝0.006)和高风险组(治疗前，P＝0.02；治疗后，P＝0.01)的男性间的前列腺癌死亡率和log-转换的MIC-1血清水平之间有显著的相关性。治疗前和治疗后抽血的男性间，低/中风险组均比高风险组的男性间同病率概率高(分别为0.72vs.0.69；0.70vs.0.65；表3)。
表11  857例局部化疾病的受试者死于前列腺癌的风险
Figure GPA00001115127400321
在每个预测风险组类别检验了MIC-1血清水平的预测作用。Log-转换的MIC-1血清水平模拟为连续变量。
本实施例证实了MIC-1血清浓度和疾病分期的相关性，还第一次证明了血清MIC-1水平作为用于区分致命性和非致命性前列腺癌的标志的预测价值。
在多变量分析中，对公知预测因素格里森得分、临床分期和诊断性PSA水平的调整没有实质地影响MIC-1单独的预测价值。重要的是，在局限于器官的疾病中，升高的血清MIC-1水平是致命性前列腺癌的单独的预测因子。因此这个结果表明血清MIC-1水平可以预测前列腺癌死亡率和疾病发展。
由于筛选含有PSA的前列腺癌的影响，前列腺癌逐渐在局部化分期被诊断出来。由于用密切观察法治疗处理的局部化疾病的受试者无进展生存率很高13-14，且疾病结果不能准确预测，因此，有低风险疾病的受试者的过度治疗很普遍。基于早期PSA变化的主动监测和选择性延迟干扰，被认为是减少无痛疾病受试者过度治疗的一种策略。然而，尽管PSA测量基线和PSA改变率是重要的预后因素，但它们在从疾病发展低风险的患者中辨别将发展成为致命性前列腺癌的患者的作用不大16。本实施例得到的结果显示：治疗前和治疗后血清MIC-1水平都可以用于预测器官局限疾病的受试者的疾病结果。因此，诊断的高MIC-1浓度可以识别受益于除局部治疗外的早期系统性辅助治疗的受试者。
总的来说，利用独立于传统的疾病预测标志的血清MIC-1浓度，前列腺癌受试者被划分为几组，其前列腺癌死亡率有很大不同。有临床局部化高风险疾病的、很难评估预后的受试者中，治疗前和治疗后血清MIC-1水平和临床结果都有相关性。此外，血清MIC-1水平识别最终恶化的低到中风险疾病的受试者。而且，除血清MIC-1水平测定外的MIC-1基质染色评估，可以带来额外的识别致命性和非致命性局部化前列腺癌的能力。
尽管在以上说明书中详细地描述了本发明方法的优选实施例，但本发明不限于公开的实施例，可以对本发明进行没有脱离本发明范围的多种重排、修饰和替代。
在说明书中，词语″包含″意思是为整体的包含物，而不是排除在整体以外。
在该说明书里所有公开内容都以参考文献作为参考。本说明书中关于文件、法规、原料、装置、文章等等的讨论仅用来提供本发明的背景条件。在本申请权利要求的优先权日之前，与本发明相关的现有技术或本领域普通技术即已经在澳大利亚或其他地方存在，因此，不在本发明的保护范围内。
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Claims (14)

1.抗MIC-1抗体或其片段在制备诊断试剂中的应用，所述诊断试剂用于预测表面健康受试者的总生存率，其特征在于，所述应用包括通过免疫分析检测来自所述受试者的人体试验样本中MIC-1的值，其中，所述MIC-1的值的增加与所述受试者的增加的死亡可能性呈相关性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人体试验样本中的MIC-1的增加值预测了由于除意外或不幸外的其他原因导致的增加的死亡可能性。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，MIC-1的增加值预测了所述受试者在提取人体试验样本10年内增加的死亡可能性。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，MIC-1的增加值预测了所述受试者在提取人体试验样本5年内增加的死亡可能性。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述人体试验样本为血清样本。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，该方法包括：检测MIC-1的增加值＞1ng/mL。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，检测MIC-1的增加值＞1.3ng/mL。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，人体试验样本中所述MIC-1的增加值是通过以下步骤检测的：(i)测定所述人体试验样本中MIC-1值；(ii)比较该MIC-1值与正常受试者的对照试验样本中的MIC-1值。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相近，相差在10岁以内。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述正常受试者的年龄与被抽取相关人体试验样本的受试者的年龄相近，相差在5岁以内。
11.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，人体试验样本中所述MIC-1的增加值是受试者内MIC-1的量的增加，其是利用多次测量检测出来的，包括：(i)测定所述人体试验样本的MIC-1值；(ii)将该MIC-1值与较早时间点取自相同受试者的对照试验样本的MIC-1值进行比较。
12.根据权利要求8任一项所述的应用，其特征在于，该方法包括：检测MIC-1的增加值＞0.3ng/mL。
13.根据权利要求8任一项所述的应用，其特征在于，该方法包括：检测MIC-1的增加值＞0.6ng/mL。
14.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述受试者年龄在35岁以上。
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