CN1239510A - 用髓先祖抑制因子－1、单核细胞集落抑制因子和巨噬细胞抑制因子－4治疗疾病的组合物和方法 - Google Patents

用髓先祖抑制因子－1、单核细胞集落抑制因子和巨噬细胞抑制因子－4治疗疾病的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了使用分离的编码人髓先祖抑制因子－1(MPIF－1)多肽(以前称为MIP－3和趋化因子β8(CKβ8或ckb－8))、人单核细胞－集落抑制因子(M－CIF)多肽(以前称为MIPI－γ和趋化因子β1(CKβ1或ckb－1))和巨噬细胞抑制蛋白－4(MIP－4)的核酸分子、以及MPIF－1、M－CIF和/或MIP－4多肽本身的治疗组合物和方法，同样公开了产生上述物的载体、宿主细胞和重组方法。

Description

用髓先祖抑制因子-1、单核细胞集落抑制因子和 巨噬细胞抑制因子-4治疗疾病的组合物和方法
发明背景
发明领域
本发明涉及新型趋化因子多肽和编码核苷酸。更具体而言，使用分离的编码人髓先祖抑制因子-1(MPIF-1)多肽(以前称为MIP-3和趋化因子β8(CKβ8或ckb-8))、人单核细胞-集落抑制因子(M-CIF)多肽(以前称为MIP1-γ和趋化因子β1(CKβ1或ckb-1))和巨噬细胞抑制蛋白-4(MIP-4)的核酸分子、以及MPIF-1、M-CIF和/或MIP-4多肽本身提供治疗组合物和方法，同样提供用于产生上述物的载体、宿主细胞和重组方法。
相关技术
趋化因子，也称作胞间分泌(intercrine)细胞因子，是结构和功能相关的细胞因子的一个亚家族。这些分子大小是8-14kd。通常趋化因子在氨基酸水平上显示20％-75％的同源性，其特征在于有形成两个二硫键的四个保守的半胱氨酸残基。根据前两个半胱氨酸残基的排列，将趋化因子分类为两个亚家族：α和β。α亚家族中，前两个半胱氨酸被一个氨基酸分开，因此被称作“C-X-C”亚家族。β亚家族中，两个半胱氨酸在相邻的位置，因此称作-C-C-亚家族。迄今为止，在人类中已鉴定了此家族的至少8个不同成员。
胞间分泌细胞因子显示广泛的多种功能。标志特征是它们引起独特细胞型趋化迁移的能力，包括单核细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和成纤维细胞。许多趋化因子具有促炎活性，参与炎症反应期间的多个步骤。这些活性包括组胺释放、溶酶体酶和白三烯释放的刺激、增强的靶免疫细胞对内皮细胞的粘附、增强的补体蛋白质的结合、诱导的粒细胞粘附分子和补体受体的表达和呼吸爆发。除参与炎症外，某些趋化因子显示具有其它活性。例如，巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)能抑制造血干细胞的增殖，血小板因子-4(PF-4)是内皮细胞生长的有力抑制剂，白细胞介素-8(IL-8)促进角质细胞的增殖，GRO是黑素瘤细胞的自分泌生长因子。
由于多种生物活性，趋化因子与许多生理和疾病状况有关就不令人吃惊了，其包括淋巴细胞运输、创伤愈合、造血调节和免疫紊乱如变态反应、哮喘和关节炎。造血谱系调节剂的一个实例是MIP-1。最初将MIP-1鉴定为巨噬细胞产生的内毒素-诱导的促炎细胞因子。随后的研究显示MIP-1由两种不同的但相关的蛋白质MIP-1α和MIP-1β组成。MIP-1α和MIP-1β都是巨噬细胞、单核细胞和T淋巴细胞的化学引诱物。有趣的是，多能干细胞抑制剂(SCI)的生化纯化和随后的序列分析揭示SCI与MIP-1β相同。此外，显示MIP-1β能中和MIP-1α抑制造血干细胞增殖的能力。这一发现导致了以下假说：MIP-1的主要生理作用是调节骨髓中的血细胞生成，先前假设的炎症功能是次要的。MIP-1α作为干细胞抑制剂的作用模式与其在G2S分裂间期阻断细胞周期的能力有关。此外，MIP-1α的抑制作用似乎限于未成熟先祖细胞，实际上是在粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)存在下刺激晚期先祖细胞。
鼠MIP-1是从脂多糖刺激的RAW264.7中分泌的主要蛋白质，RAW264.7是一种鼠巨噬细胞肿瘤细胞系。鼠MIP-1已被纯化并发现它是由两种相关蛋白质MIP-1α和MIP-1β组成的。
已克隆了几组可能是MIP-1α和MIP-1β的人同系物。所有情况中，从对激活的T细胞RNA制备的文库中分离cDNAs。
在早期创伤炎症细胞中能检测到MIP-1蛋白质，显示它诱导从创伤成纤维细胞中的产生IL-1和IL-6。另外，当向鼠足垫皮下注射或向兔脑脊液脑池内注射时，纯化的天然MIP-1(包括MIP-1、MIP-1α和MIP-1β多肽)引起急性炎症(Wolpe和Cerami，FASEB J.3：2565-73(1989))。除MIP-1的这些直接或间接的促炎特性之外，在使用无菌创伤容器的实验小鼠模型中，在创伤愈合的早期炎症期回收MIP-1(Fahey等人，细胞因子(Cytokine)，2：92(1990))。例如，Chiron公司申请的PCT申请U.S.92/05198，公开了可有效用作在酵母中产生哺乳动物巨噬细胞炎症蛋白质(MIP)的模板的DNA分子。
鼠MIP-1α和MIP-1β是不同但紧密相关的细胞因子。部分纯化的两种蛋白质的混合物影响嗜中性粒细胞的功能，引起局部炎症和发热。已在酵母细胞中表达MIP-1α并纯化为同质物。结构分析证实MIP-1α与血小板因子4(PF-4)和白细胞介素8(IL-8)具有很相似的二级和三级结构，与它们共有一定的序列同源性。也已证明MIP-1α在体内有效保护小鼠干细胞免于随后在体外被氚化的胸腺嘧啶核苷杀死。也显示MIP-1α增强由粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子引起的更多定向先祖粒细胞巨噬细胞集落-形成细胞的增殖(Clemens,J.M.等人，细胞因子4：76-82(1992))。
本发明的多肽，最初在原始专利申请中被称为MIP-1γ和Ckβ-1的M-CIP，根据氨基酸序列同源性它是β趋化因子家族的新成员。MPIF-1多肽，最初在原始申请中被称为MIP-3和Ckβ-8，根据氨基酸序列同源性也是β趋化因子家族的新成员。
发明概述
依照本发明的一个方面，提供新型的全长或成熟MPIF-1、MIP-4和/或M-CIF多肽，以及有生物活性的、可用于诊断或治疗上的片段、其类似物和衍生物。本发明的MPIF-1、MIP-4和M-CIF优选地是动物来源的，更优选的是来源于人的。
依照本发明的另一个方面，提供编码这些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)和编码这些多肽的经分离的核酸分子(包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA)以及有生物活性的和可用于诊断或治疗上的片段、其类似物和衍生物。
MPIF-1多核苷酸本发明也提供包含编码MPIF-1多肽的多核苷酸的经分离的核酸分子，MPIF-1多肽含图1所示的氨基酸序列(SEQ IDNO：4)，或由1994年2月9日保藏的ATCC保藏号75676细菌宿主中的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。通过对保藏的MPIF-1克隆测序测定核苷酸序列，显示于图1中(SEQ ID NO：3)，其包含一个编码120个氨基酸残基的多肽的开放阅读框和大约21个氨基酸残基的前导序列，非糖基化形式的成熟蛋白质的预计分子量大约11kDa，糖基化形式的分子量大约11-14kDa，这依赖于糖基化的程度。成熟MPIF-1蛋白质的氨基酸序列显示于图1中(SEQ ID NO：4)。
因而，本发明的一个方面提供了包含具有下列核苷酸序列的多核苷酸的经分离的核酸分子，核苷酸序列选自：(1)(a)编码含图1中完整氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的MPIF-1多肽的核苷酸序列；(1)(b)编码含图1(SEQ ID NO：4)中完整氨基酸序列但除去N-端甲硫氨酸残基的MPIF-1多肽的核苷酸序列；(1)(c)编码含图1(SEQID NO：4)中位点22-120的氨基酸序列的成熟MPIF-1多肽的核苷酸序列；(1)(d)编码MPIF-1多肽的核苷酸序列，MPIF-1多肽含ATCC保藏号75676中包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列；(1)(e)编码成熟MPIF-1多肽的核苷酸序列，该多肽含ATCC保藏号75676中包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列；以及(1)(f)与以上(1)-(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。
M-CIF多核苷酸一方面，本发明提供包含编码M-CIF多肽的多核苷酸的经分离的核酸分子，M-CIF多肽含图2所示的氨基酸序列(SEQID NO：2)、或于1993年10月13日保藏的ATCC保藏号75572在细菌宿主中的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。通过对保藏的M-CIF克隆测序测定核苷酸序列，显示于图2中(SEQ ID NO：1)，其包含一个编码93个氨基酸残基的多肽的开放阅读框和大约19个氨基酸残基的前导序列，非糖基化形式的预计分子量大约9kDa，糖基化形式约9-14kDa，这依赖于糖基化的程度。成熟M-CIF蛋白质的氨基酸序列显示于图2中(SEQ ID NO：2)。
因而，本发明的一个方面提供了包含具有下列核苷酸序列的多核苷酸的经分离的核酸分子，核苷酸序列选自：(2)(a)编码含图2(SEQID NO：2)中完整氨基酸序列的M-CIF多肽的核苷酸序列；(2)(b)编码含图2(SEQ ID NO：2)中完整氨基酸序列但除去N-端甲硫氨酸残基的M-CIF多肽的核苷酸序列；(2)(c)编码含图2(SEQ IDNO：2)中位点20-93的氨基酸序列的成熟M-CIF多肽的核苷酸序列；(2)(d)编码M-CIF多肽的核苷酸序列，M-CIF多肽含ATCC保藏号75572中包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列；(2)(e)编码成熟M-CIF多肽的核苷酸序列，该多肽含ATCC保藏号75572中包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列；以及(2)(f)与以上(2)-(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。
MIP-4多核苷酸本发明进一步提供包含编码MIP-4多肽的多核苷酸的经分离的核酸分子，MIP-4多肽含图3所示的氨基酸序列(SEQ IDNO：6)，或由1994年2月9日保藏的ATCC保藏号75675在细菌宿主中的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。通过对保藏的MIP-4克隆测序测定核苷酸序列，显示于图3中(SEQ ID NO：5)，其包含一个编码89个氨基酸残基的多肽的开放阅读框和大约20个氨基酸残基的前导序列，非糖基化形式的预计分子量大约8kDa，糖基化形式约8-14kDa，这依赖于糖基化的程度。成熟MIP-4蛋白质的氨基酸序列显示于图2中(SEQ ID NO：6)。
本发明的另一个方面提供包含具有下列核苷酸序列的多核苷酸的经分离的核酸分子，核苷酸序列选自：(3)(a)编码含图3(SEQ IDNO：6)中完整氨基酸序列的MIP-4多肽的核苷酸序列；(3)(b)编码含图3(SEQ ID NO：6)中完整氨基酸序列但除去N-端甲硫氨酸残基的MIP-4多肽的核苷酸序列；(3)(c)编码成熟MIP-4多肽的核苷酸序列，该多肽含图3(SEQ ID NO：6)中位点21-89的氨基酸序列；(3)(d)编码MIP-4多肽的核苷酸序列，该多肽含ATCC保藏号75675中包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列；(3)(e)编码成熟MIP-4多肽的核苷酸序列，该多肽含ATCC保藏号75675中包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列；以及(3)(f)与以上(3)-(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。
MPIF-1、M-CIF和MIP-4多核苷酸变异体本发明进一步涉及上述多核苷酸的变异体，它们编码含图1、2和3(SEQ ID NOS：2、4和6)的推断的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA编码的多肽之片段、同系物和衍生物。多核苷酸的变异体可是自然发生的多核苷酸等位基因变异体或非自然发生的多核苷酸变异体。
同系的MPIF-1、M-CIF和MIP-4多核苷酸本发明进一步的实施方案包括包含一种多核苷酸的经分离的核酸分子，此多核苷酸含与以上(1)-、(2)-或(3)中的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的任何核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列，或在严格杂交条件下能与以上(1)-、(2)-或(3)中的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多核苷酸杂交的多核苷酸。这些杂交的多核苷酸在严格杂交条件下不与包含仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
核酸探针依照本发明的又一方面，也提供包含足够长度的核酸分子的核酸探针，以特异性杂交MPIF-1、M-CIF和/或MIP-4核酸序列。
重组载体、宿主细胞和表达本发明也涉及包含本发明的经分离的核酸分子的重组载体、包含重组载体的宿主细胞、以及制备这些载体和宿主细胞并通过重组技术使用它们产生MPIF-1、M-CIF和MIP-4多肽或肽的方法。
MPIF-1多肽本发明进一步提供分离的MPIF-1多肽，它所含的氨基酸序列选自：(I)(a)MPIF-1多肽的氨基酸序列，其含完整的120氨基酸序列，包括图1(SEQ ID NO：4)所示的前导序列；(I)(b)MPIF-1多肽的氨基酸序列，其含完整的120氨基酸序列，包括图1(SEQ ID NO：4)中显示的前导序列但除去N-端甲硫氨酸残基；(I)(c)成熟MPIF-1多肽(没有前导区)的氨基酸序列，其含图1(SEQ ID NO：4)中位点22-120的氨基酸序列；(I)(d)含完整氨基酸序列包括前导序列的MPIF-1多肽之氨基酸序列，其由ATCC保藏号75676中包含的cDNA克隆所编码；(I)(e)成熟MPIF-1多肽的氨基酸序列，其含ATCC保藏号75676中包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。
M-CIF多肽本发明进一步提供分离的M-CIF多肽，它所含的氨基酸序列选自：(II)(a)M-CIF多肽的氨基酸序列，其含完整的93氨基酸序列，包括图2(SEQ ID NO：2)所示的前导序列；(II)(b)M-CIF多肽的氨基酸序列，其含完整的93氨基酸序列，包括图2(SEQID NO：2)所示的前导序列但除去N-端甲硫氨酸残基；(II)(c)成熟M-CIF多肽(没有前导区)的氨基酸序列，其含图2(SEQ ID NO：2)中位点20-93的氨基酸序列；(II)(d)含完整氨基酸序列包括前导序列的M-CIF多肽之氨基酸序列，其由ATCC保藏号75572中包含的cDNA克隆所编码；(Ⅱ)(e)成熟M-CIF多肽的氨基酸序列，其含ATCC保藏号75572中包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。
MIP-4多肽本发明进一步提供分离的MIP-4多肽，它所含的氨基酸序列选自：(III)(a)MIP-4多肽的氨基酸序列，其含完整的89氨基酸序列，包括图3(SEQ ID NO：6)所示的前导序列；(III)(b)MIP-4多肽的氨基酸序列，其含完整的89氨基酸序列，包括图3(SEQID NO：6)所示的前导序列但除去N-端甲硫氨酸残基；(III)(c)成熟MIP-4多肽(没有前导区)的氨基酸序列，其含图3(SEQ ID NO：6)中位点21-89的氨基酸序列；(III)(d)含完整氨基酸序列包括前导序列的MIP-4多肽的氨基酸序列，其由ATCC保藏号75675中包含的cDNA克隆所编码；(III)(e)成熟MIP-4多肽的氨基酸序列，其含ATCC保藏号75675中包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。
同系的MPIF-1、M-CIF和MIP-4多肽本发明的多肽也包括含与以上(I)-、(II)-和(III)中的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所述至少95％相同的氨基酸序列之同系多肽，以及含与以上至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽。
携带MPIF-1、M-CIF和MIP-4表位的多肽和编码多核苷酸本发明这方面的一个附加实施方案涉及肽或多肽，它们含MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的携带表位部分之氨基酸序列，其含有以上(I)-、(II)-和(III)中的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的氨基酸序列。含本发明的携带表位部分的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽之氨基酸序列的肽或多肽，包括这些多肽的这种部分，其含至少6或7个氨基酸，优选的至少9个，更优选的至少约30个氨基酸到约50个氨基酸，尽管本发明也包括任何长度的携带表位的多肽，它们的长度可达以及包含上述本发明的多肽的完整氨基酸序列。
本发明的另一核酸实施方案涉及经分离的核酸分子，核酸分子包含编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽携带表位部分的氨基酸序列之多核苷酸，多肽含以上(I)-、(II)-或(III)中的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的氨基酸序列。
MPIF-1、M-CIF和MIP-4抗体依照本发明的更进一步方面，提供针对这些多肽的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗体，其特异性结合含以上(I)-、(II)-和/或(III)中的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述氨基酸序列的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽。
本发明进一步提供分离这些抗体的方法，这些抗体特异地结合含此处所述氨基酸序列的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽。如下所述这些抗体可用于诊断或治疗。
MPIF-1、M-CIF和MIP-4拮抗物和方法依照本发明的又一方面，提供这些多肽的拮抗物或抑制剂，它们能用来抑制这些多肽的作用，例如，在动脉粥样硬化、自身免疫疾病和慢性炎症和传染病、组胺-介导的变应性反应、嗜曙红细胞过多综合征、矽肺、肉样瘤病、肺的炎症疾病、IL-1和TNF的抑制、再生障碍性贫血和脊髓发育不良综合征的治疗中。另外，这些多肽能用来抑制IL-1和TNF-α的产生以治疗再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征、哮喘和关节炎。
诊断测定依照本发明的又一方面，提供检测与多肽的表达不足和过量表达相关的疾病和检测编码这些多肽的核苷酸序列中的突变的诊断测定。
依照本发明的又一方面，提供使用这些多肽、或编码这些多肽的多核苷酸作为研究试剂的方法，其用于涉及科学研究、DNA合成和DNA载体制造的体外目的，用于发展治疗人类疾病的治疗和诊断的目的。
本发明也提供一种筛选方法，用于鉴定能增强或抑制MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽诱导的细胞应答的化合物，其包括用候选化合物接触表达MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的细胞，测定细胞应答，和将细胞应答与标准细胞应答比较，在不存在候选化合物下进行接触时测定标准；由此，超过标准的细胞应答增强表明化合物是激动剂，超过标准的细胞应答降低表明化合物是拮抗物。
对于许多疾病，人们相信在取自患这些疾病的个体的某些组织或体液(例如血清、血浆、尿、关节液或脊髓液)中可检测到MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平显著升高或降低，这是相对于“标准的”MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平，即取自没有患病的个体的组织或体液中MPIF-1、M-CIF或MIP-4的表达水平。因而，本发明提供疾病诊断中有用的诊断方法，包括：(a)测定个体的细胞或体液中MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平；(b)将MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平与标准MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平相比较，由此，测定中MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平相对于标准表达水平而言的升高或降低则提示疾病。这些疾病包括白血病、慢性炎症、自身免疫病、实体瘤。
药物组合物另一方面，本发明也提供药物组合物，其包含至少一种MPIF-1、M-CIF或MIP-4的：多核苷酸、探针、载体、宿主细胞、多肽、片段、变休、衍生物、携带表位部分、抗体、拮抗物、或激动剂。
治疗方法依照本发明的更进一步方面，提供使用这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，例如，保护骨髓干细胞避免化学治疗中的化疗剂、去除白血病细胞、刺激免疫应答、调节血细胞生成和淋巴细胞运输、牛皮癣和实体瘤的治疗、增强宿主对抗性、急性和慢性感染的防御，以及刺激创伤愈合。
本发明的另外一方面涉及对体内需要增高水平的MPIF-1、M-CIF或MIP-4活性的个体的治疗方法，包括对这种个体分别施用包含有效治疗量的本发明分离的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽或其激动剂的组合物。
本发明的更进一步方面涉及对体内需要降低水平的MPIF-1、M-CIF或MIP-4活性的个体的治疗方法，包括对这种个体施用包含有效治疗量的MPIF-1、M-CIF或MIP-4拮抗物的组合物。用于本发明的优选的拮抗物分别是M-CIF特异性抗休。
在此所说的本发明的这些和其它方面，对本领域的技术人员是显而易见的。
附图简述
以下附图说明本发明的实施方案，并不是意在限制如权利要求书所包含的本发明的范围。
图1显示编码MPIF-1的cDNA序列(SEQ ID NO：3)和相应的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。最初的21个氨基酸代表推定的前导序列。如通过N-端肽测序所测定的，所有信号序列都属于杆状病毒表达的蛋白质。
图2显示编码M-CIF的cDNA序列(SEQ ID NO：1)和相应的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，最初的19个氨基酸代表前导序列。
图3显示编码MIP-4的cDNA序列(SEQ ID NO：5)和相应的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，最初的20个氨基酸代表前导序列。
图4说明MPIF-1(上)(SEQ ID NO：4)与人MIP-1α(下)(SEQID NO：55)之间的氨基酸同源性。显示了所有趋化因子的4个半胱氨酸的特征。
图5显示两个氨基酸序列，其中上方序列是人MIP-4氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，下方序列是人MIP-1α(人扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白质前体)(SEQ ID NO：55)。
图6说明M-CIF(上)与人MIP-1α(下)(SEQ ID NO：55)之间的氨基酸序列比较。
图7是一张凝胶图，其中HA-标记的M-CIF在COS细胞中表达后将M-CIF进行电泳。
图8是M-CIF在杆状病毒表达系统中表达和纯化后的SDS-PAGE凝胶图。
图9是MPIF-1在杆状病毒表达系统中表达和三步纯化后的SDS-PAGE凝胶图。
图10.使用48-孔微室装置(Neuro Probe，Inc.)经趋化性测定检测MPIF-1的化学引诱物活性。实验步骤如厂商手册所述。对每一浓度的待测MPIF-1检测5个高倍视野中的迁移。显示的结果代表从两个独立的实验获得的平均值。显示了对THP-1(A)细胞和人PBMC(B)的化学引诱物活性。
图11.使用Hitachi F-2000荧光分光光度计测定MPIF-1引起的细胞内钙离子浓度的变化。将细菌表达的MPIF-1加入添加了Indo-1的THP-1细胞至终浓度50mM，监测钙离子浓度的细胞内水平。
图12.将小鼠骨髓细胞的低密度群涂板于(1500个细胞/皿)含或不含所示的趋化因子(100ng/ml)但存在IL-3(5ng/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-1α(10ng/ml)和M-CSF(5ng/ml)的含琼脂培养基中。显示的数据代表从两个独立实验(每个以双份进行)获得的平均值。涂板14天后计数集落。在趋化因子存在下生成的集落数表示为不存在任何添加趋化因子情况下产生的集落的平均百分数。
图13说明MPIF-1和M-CIF对HPP-CFC(A)和LPP-CFC(B)的小鼠骨髓集落形成的作用。
图14说明杆状病毒表达的M-CIF和MPIF-1对M-CFS和SCF-刺激的新分离的骨髓细胞集落形成的作用。
图15说明MPIF-1和M-CIF对IL-3和SCF-刺激的骨髓细胞Lin-群增殖和分化的作用。
图16A-B.图16A-B显示MPIF-1和M-CIF对骨髓细胞谱系缺失群的Gr.1和Mac-1(表面标记)阳性群生成的作用。在单独补加IL-3(5ng/ml)和SCF(100ng/ml)(a)、与补加MPIF-1(50ng/ml)(b)或补加M-CIF(50ng/ml)(c)的生长培养基中温育Lin-细胞。然后用抗髓分化Gr.1、Mac-1、Sca-1和CD45R表面抗原的单克隆抗体对细胞染色，并用FACScan分析。数据表示为在大(图16A)和小(图16B)细胞群中阳性细胞的百分数。
图17说明MPIF-1蛋白质的存在抑制IL-3、M-SCF和GM-CSF引起的骨髓细胞集落形成。
图18.MPIF-1抑制骨髓细胞集落形成的剂量反应。如图19分离和处理细胞。在基于琼脂的集落形成测定中，在不含或含1、10、50和100ng/ml的MPIF-1、及存在IL-3、GM-CSF或M-CSF(5ng/ml)的情况下，以1000个细胞/皿的密度涂板处理后的细胞。数据表示为集落形成占单独用特异因子形成的集落数的百分比。数据描述为双皿的平均值，误差条显示标准差。
图19.编码MPIF-1的RNA在人单核细胞中的表达。从新淘析的单核细胞中分离总RNA，并用100U/ml人rIFN-γ、100ng/ml LPS或同时用两者处理。在1.2％琼脂糖凝胶上电泳分离每一处理的RNA(8μg)，转移至尼龙膜。通过用32P-标记的cDNA探查以定量MPIF-1mRNA，并以光密度定量产生的放射自显影图上的带。
图20A-B.图20A显示MPIF-1氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的分析。显示α、β、转角和螺旋区；亲水性和疏水性；两亲区；柔性区；抗原指数和表面概率。在“抗原指数-Jameson-Wolf”图中，图1(SEQID NO：4)中的氨基酸残基21-30、31-44、49-55、59-67、72-83、86-103和110-120、或图1(SEQ ID NO：4)中的任何范围或值，对应于显示的MPIF-1蛋白质的高度抗原区。图20B显示M-CIF氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的分析。显示α、β、转角和螺旋区；亲水性和疏水性；两亲区；柔性区；抗原指数和表面概率。在“抗原指数-Jameson-Wolf”图中，图2(SEQ ID NO：2)中的氨基酸残基20-36、42-52、52-64、67-75、75-84和/或86-93、或图2(SEQ ID NO：2)中的任何范围或值，对应于显示的M-CIF蛋白质的高度抗原区。
图21A-B.图21A显示MPIF-1对5-Fu诱导的LPP-CFC细胞杀伤的髓保护作用。图21B显示MPIF-1对Ara-C诱导的LPP-CFC细胞杀伤的髓保护作用。
图22显示小鼠的MPIF-1预处理对5-Fu诱导的循环WBC计数减少的作用。
图23显示包括三组小鼠(每组6只动物)的实验设计，它们如下处理：1组，在第1、2和3天注射盐水；2组，在第0和3天注射5-Fu；和3组，在第0和3天注射5-Fu，并在第1、2和3天注射MPIF-1。在第6天和第9天收获骨髓，使用克隆发生测定法测定HPP-CFC和LPP-CFC的频率。
图24显示第二次5-Fu用药前MPIF-1的施用对骨髓中HPP-CFC和LPP-CFC频率的影响。
图25显示MPIF-1变异体。使用单氨基酸字母代码显示MPIF-1(图1(SEQ ID NO：4))的120个氨基酸序列中的前80个，其中前21个残基显示信号序列的特征，将其切除后产生成熟的、野生型蛋白质。突变体-1和-6包含作为N-端残基的、在野生型中不存在的甲硫氨酸。同样，突变体-9的前4个氨基酸(HAAG)在野生型MPIF-1蛋白质中不存在。突变体-1、-6和-9分别对应于SEQ ID NOS：7、8和9。突变体-2对应于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基46-120。突变体-3对应于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基45-120。突变体-4对应于SEQ IDNO：4中的氨基酸残基48-120。突变体-5对应于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基49-120。突变体-7对应于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基39-120。突变体-8对应于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基44-120。
图26A-B.图26A显示人MPIF-1剪接变异体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。与此cDNA序列一起用单字母氨基酸代码显示了编码137个氨基酸(SEQ ID NO：11)的蛋白质的开放阅读框。以下划线标出的N-端21个氨基酸代表推定的前导序列。以斜体字突出了在MPIF-1序列中不存在、只有剪接变异体才具有的18个氨基酸序列的插入。图26B显示MPIF-1变异体(SEQ ID NO：11)与野生型MPIF-1分子(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的比较。
图27显示人单核细胞中MIP-1α诱导的50％最大钙质动用反应所需的MPIF-1突变蛋白质的浓度。
图28显示测定人单核细胞中由图27图例所述100ng/ml指定蛋白质引起的细胞内游离钙浓度的变化。
图29显示MPIF-1突变体在人单核细胞中脱敏MIP-1α刺激的钙质动用的能力(概述)。
图30显示人外周血单核细胞(PBMC)对MPIF-1突变体的趋化反应。圆括号内的数字反映在指定的浓度范围观察到的超过背景的趋化性刺激倍数。
图31显示MPIF-1变异体对低增殖潜能集落-形成细胞(LPP-CFC)在体外生长和分化的作用。
图32显示用重组人M-CIF预处理对小鼠LPS-诱导的脓毒性休克的保护。Balb/c小鼠组(n＝7)于第0天腹膜内注射25mg/kg LPS。从LPS攻击前一天、当天到后一天(－1，0，＋1)，连续三天每天腹膜内给予3mg/kg体重的M-CIF。只接受缓冲液的小鼠作为疾病对照。LPS攻击后观察致死率的动力学56小时。
图33显示M-CIF对致死性休克的保护效果依赖于LPS剂量。Balb/c小鼠组(n＝9)于第0天腹膜内注射25mg/kg LPS进行不同程度的脓毒症诱导。连续三天每天对每一组LPS处理的小鼠腹膜内给予10mg/kg的M-CIF。LPS攻击后观察致死率的动力学56小时。
图34显示对小鼠LPS-诱导的致死性休克的保护依赖于M-CIF剂量。于第0天用25mg/kg LPS腹膜内攻击Balb/c小鼠组(n＝8)，并连续三天(－1，0，＋1)每天用不同剂量(1、3或10mg/kg)的M-CIF处理。只接受缓冲液的小鼠作为疾病对照。LPS攻击后观察致死率的动力学120小时。
图35A-B显示在Balb/c SCID小鼠中M-CIF对LPS-诱导的休克的保护效果。于第0天用20、30或40mg/kg LPS腹膜内攻击Balb/c SCID小鼠组(n＝5－7)；并连续三天(－1，0，＋1)以3mg/kg的每日剂量对每组LPS-注射的小鼠给予M-CIF处理。LPS攻击后观察致死率的动力学120小时。M-CIF预处理对20mg/kg LPS-注射的小鼠的结果与无死亡发生的单独LPS-注射的结果相同。
图36显示来自大肠杆菌和CHO表达载体的M-CIF蛋白质对脓毒症的保护效果。于第0天用25mg/kg LPS注射Balb/c小鼠组(n＝8)；并连续三天(－1，0，＋1)用1mg/kg的两种不同批(E1和C1)的M-CIF处理。只接受缓冲液的小鼠作为疾病对照。LPS攻击后观察致死率的动力学120小时。
图37.在佐剂-诱导的关节炎模型中M-CIF在减轻爪水肿方面的效能。于第0天以尾为基础对Lewis大鼠组(n＝5)皮内注射含5mg/ml乳酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)的100μl/大鼠的弗氏完全佐剂。经腹膜内注射1或3mg/kg缓冲液(40mM乙酸钠；500mM NaCl)中的M-CIF，于第0天开始预防处理，并每日持续(M-CIF，5次/周)共16天，或口服1mg/kg甲基纤维素中的消炎痛，作为药物对照，每天用药(5次/周)共16天。只接受缓冲液或甲基纤维素的大鼠作为疾病对照。在指定的天数用器官充满度测量容器监测两只后爪的肿胀，计算测试药物对爪体积效能的百分数。
图38.M-CIF对总关节炎症的保护效果。在与图40相同的实验结束时，即佐剂免疫后40天，收集每组两只大鼠的两只后肢，用于组织病理分析。结果表示为总组织学得分的平均值。
图39.M-CIF对关节炎慢性特征的保护效果。用延长至佐剂免疫后40天的M-CIF或消炎痛的每日处理进行与图40相似的实验，以进一步分析包括过度生长、纤维化、血管扩张和血管周围淋巴聚集的慢性组织病理变化。结果表示为上述总特征的平均值(n＝5)。进行非成对T检验获得估定的统计学显著性。
图40.M-CIF对骨和软骨糜烂的保护效果。在与图39相同的实验中，评估血管翳的形成、骨和软骨的破坏。结果表示为上述总特征的平均值(n＝5)。进行非成对T检验估计统计学显著性。
图41.M-CIF处理防止DBA/I小鼠中发展II型胶原蛋白-诱导的关节炎。以尾为基础用在完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原蛋白皮内免疫雌性DBA/ilacJ小鼠。20天后，经皮下注射60mg/100的LPS攻击小鼠。LPS注射前两天，分别用3mg/ml消炎痛、M-CIF或其缓冲液对照腹膜内处理3组动物(每组n＝10)。每天继续这些处理共14天。检查动物，半定量其临床表现。％发病率显示于此图中。
图42.如图44所述用牛II型胶原蛋白免疫动物。结果表示为平均严重程度。
图43显示M-CIF对系统TNF-A产生的抑制作用。于第0天用盐水中的来自大肠杆菌血清型0127：B8(Sigma)的25mg/kg脂多糖(LPS)攻击雌性Balb/c小鼠组。LPS注射前一天和当天(1小时前)施用M-CIF或缓冲液。在LPS施用后的不同时间点收集血清，测定TNF-A水平。用非成对T检验分析结果，数据表示为平均值±SEM。
图44显示从M-CIF处理的小鼠中分离的腹膜细胞TNF-(α)产生的减少。用3mg/kg的M-CIF处理小鼠两天。第二次M-CIF注射后一小时，收获腹膜细胞并将其置于培养基中，在存在或不存在LPS下测定细胞因子的产生。用ELISA测定TNF-α水平。
图45显示M-CIF处理的小鼠的腹膜腔中增长的总细胞数。对小鼠不处理、用载体对照处理或用1mg/kg和3mg/kg的M-CIF每天处理，共连续6天。在第7天处死小鼠，收获并定量腹膜细胞。
图46显示M-CIF处理的小鼠的腹膜腔中CD4阳性T淋巴细胞的特异增多。如图48所述处理小鼠。未处理、载体处理、1mg/kg M-CIF和3mg/kg M-CIF组中用不同符号代表每只动物。每组包括10只动物，使用针对CD4、CD5、CD8、Mac1、MHC II类、B220、IgM、GrI和CD14的抗体通过细胞表面染色分析每只动物的细胞。
图47显示M-CIF处理的小鼠的腹膜腔中总T淋巴细胞数(CD5/IgM-、CD4和CD8)的增加。
图48显示M-CIF处理的小鼠的腹膜腔中Mac1＋/MHC II类＋细胞之百分数的降低，及相应的Mac1＋/MHC II类细胞百分数的增加。
图49显示M-CIF处理的小鼠的腹膜腔中Mac1＋/MHCII类-细胞总数的增加。
图50显示MPIF-1施用引起的正常小鼠中的干细胞动用。
图51显示两个周期的5-Fu处理后用FACS Vantage方法测定的MPIF-1与G-CSF对血小板恢复的作用的比较。
图52显示两个周期的5-Fu处理后MPIF-1与G-CSF对血中Gra.1和Mac.1双阳性细胞恢复的作用的比较。
图53显示两个周期的5-Fu处理后用FACS Vantage方法测定的MPIF-1与G-CSF对骨髓中Gra.1和Mac.1双阳性细胞恢复的作用的比较。
图54显示两个周期的5-Fu处理后MPIF-1与G-CSF对骨髓中造血先祖恢复的作用的比较。
图55.每天(5天/周)用1或5mg/kg的M-CIF(n＝8)或缓冲液(n＝9)腹膜内处理14周的3个不同组中MRL lpr小鼠(8周龄)存活率的时程。
图56.每天一次、3天/周用1或5mg/kg的M-CIF(n＝8)或缓冲液(n＝9)腹膜内处理14周的3个不同组中MRLlpr小鼠(8周龄)存活率的时程。
图57.从小鼠8周龄时开始，每天(每周5天)用缓冲液对照、1mg/kg的rhM-CIF或氨甲喋呤(MTX)处理23周龄的MRL lpr/lpr小鼠，共14周，通过对两个肾的多盲组织评估蛋白质管型形成的变化。数值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。
图58.从小鼠8周龄时开始，每天(每周5天)用缓冲液对照、1mg/kg的rhM-CIF或氨甲喋呤(MTX)处理23周龄的MRL lpr/lpr小鼠，共14周，通过对两个肾的多盲组织评估肾小球损伤的变化。通过多盲组织评估估计的肾小球损伤代表基膜增厚、新月体形成和结疤、细胞过多、纤维化和脱核的总和。数值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。
图59.从小鼠8周龄时开始，每天(每周5天)用缓冲液对照、1mg/kg的rhM-CIF或氨甲喋呤(MTX)处理23周龄的MRL lpr/lpr小鼠，共14周，通过对两个肾的多盲组织评估肾硬化的变化。数值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。
图60.从小鼠8周龄时开始，每天(每周5天)用缓冲液对照、1mg/kg的rhM-CIF或氨甲喋呤(MTX)处理23周龄的MRL lpr/lpr小鼠，共14周，通过对两个肾的免疫组织评估巨噬细胞浸润的变化。数值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。
图61.从小鼠8周龄时开始，每天(每周5天)用缓冲液对照、1mg/kg的rhM-CIF或氨甲喋呤(MTX)处理23周龄的MRL lpr/lpr小鼠，共14周，通过对两个肾的多盲组织评估淋巴细胞浸润和血管周炎的变化。数值为每组4-5只小鼠的平均值±SEM。
图62显示pHE4-5表达载体(SEQ ID NO：56)和亚克隆的MPIF-1Δ23 cDNA编码序列的示意图。指出了卡那霉素抗性标记基因、MPIF-1Δ23编码序列、oriC序列和lacIq编码序列的位置。
图63显示产生MPIF-1Δ23的发酵工艺的概述。
图64显示用来回收经图63所示工艺产生的MPIF-1Δ23的方法的流程图。
图65显示MPIF-1Δ23纯化的工艺，MPIF-1Δ23是通过图63和64所示的工艺产生和回收的。
图66显示pHE启动子调节元件的核苷酸序列(SEQ ID NO：57)。指出了两个lac操纵子序列、Shine-Delgarno序列(S/D)和末端HindIII和Nde I限制位点(斜体)。
图67A-E显示pHE4-5载体的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。
实施方案描述
本发明提供使用编码多肽的经分离的多核苷酸分子、或多肽本身的诊断或治疗组合物和方法，如(i)人单核细胞-集落抑制因子(M-CIF)多肽(以前称为MIP1-γ和趋化因子β1(CKβ1或ckb-1))；(ii)人髓先祖抑制因子-1(MPIF-1)多肽(以前称为MIP-3和趋化因子β8(CKβ8或ckb-8))；和/或(iii)巨噬细胞抑制蛋白-4(MIP-4)，以及用于产生上述物的载体、宿主细胞和重组或合成方法。MPIF-1、M-CIF和MIP-4多核苷酸
依照本发明的一个方面，提供经分离的核酸(多核苷酸)，它们分别编码含图1、2或3(SEQ ID NOS：4、2和6)的推断氨基酸序列的全长或成熟MPIF-1、M-CIF和MIP-4多肽，编码于1994年2月9日被保藏为ATCC保藏号75676的克隆之cDNA所编码的成熟MPIF-1多肽，编码于1994年2月9日被保藏为ATCC保藏号75675的克隆之cDNA所编码的成熟MIP-4多肽，编码于1993年10月13日被保藏为ATCC保藏号75572的克隆之cDNA所编码的成熟M-CIF多肽。美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)位于12301Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852。保藏的克隆包含于pBluescript SK(－)质粒(Stratagene，LaJolla，CA)中。
在此提到的保藏，将依据以专利方法为目的之微生物保藏国际公约布达佩斯条约的条目得以维持。仅为方便本领域的技术人员而提供这些保藏，而不许可在35 U.S.C§112下要求的保藏。保藏的物质中包含的多核苷酸序列、以及由此编码的多肽的氨基酸序列在此引入作为参考，并且如果有与此处序列描述的任何冲突则进行控制。制造、使用或出售保藏的物质需要许可证，并且此处没有授权这种许可证。
编码本发明的多肽的多核苷酸在结构上与细胞因子或趋化因子家族中的促炎超基因“胞间分泌”有关。MPIF-1和MIP-4都是M-CIF的同源物，并且与MIP-1α比与MIP-1β更同源。编码MPIF-1的多核苷酸衍生自一个主动脉内皮cDNA文库，包含一个编码120个氨基酸残基的多肽的开放阅读框，该多肽显示与许多趋化因子的显著同源性。最高匹配是对人巨噬细胞炎性蛋白1α，显示36％的同一性和66％的相似性(图4)。
编码MIP-4(SEQ ID NO：5)的多核苷酸衍生自成人肺cDNA文库，包含一个编码89个氨基酸残基(SEQ ID NO：6)的多肽的开放阅读框，该多肽显示与许多趋化因子的显著同源性。最高匹配是对人扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白(SEQ ID NO：55)，显示60％的同一性和89％的相似性(图5)。此外，在所有趋化因子中存在的特征性基元中的四个半胱氨酸残基在两个克隆中都是保守的。基因中前两个半胱氨酸残基位于相邻位置的事实把它们分类为趋化因子的“C-C”亚家族或β亚家族。在另一亚家族，“CXC”或α亚家族中，前两个半胱氨酸残基被一个氨基酸分开。
编码M-CIF(SEQ ID NO：1)的多核苷酸包含一个编码93个氨基酸(SEQ ID NO：2)的多肽的开放阅读框，其中前约19个氨基酸是前导序列，因此成熟肽包含约74个氨基酸残基。M-CIF显示与人巨噬细胞抑制蛋白-α的显著的同源性，在一段80个氨基酸上有48％的同一性和72％的相似性。此外，包含特征性基元的四个半胱氨酸残基是保守的。
本发明的多核苷酸可以是RNA的形式或以DNA的形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链的，如果单链可作编码链或非编码(反义)链的话。编码成熟多肽的编码序列可以与图1、2和3(分别是SEQ ID NO：3、1和5)所示的编码序列相同或与保藏的克隆的编码序列相同，或可以是不同的编码序列，该编码序列作为遗传密码的丰余或简并的结果，编码与图1、2和3(SEQ ID NOS：3、1和5)的DNA相同或与保藏的cDNA相同的成熟多肽。
编码图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)中成熟多肽或编码由保藏cDNA所编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列及另外的编码序列如前导序列或分泌序列或原蛋白质(proprotein)序列；成熟多肽的编码序列(和任选地附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的非编码序列5’和/或3’端。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
除非另外指出，使用自动DNA测序仪(如Applied Biosystems,Inc.的Model 373)测定此处DNA分子的序列而测定所有核苷酸序列，并且通过如上测定的DNA序列之翻译预测在此测定的DNA分子所编码的多肽之所有氨基酸序列。因此，如本领域已知的通过此自动方法测定的任何DNA序列，在此测定的任何核苷酸序列可包含某些错误。通过自动装置测定的核苷酸序列与测序的DNA分子的实际核苷酸序列一般至少约90％相同，更一般地至少约95％到至少约99.9％相同。可通过其它方法包括本领域众所周知的手工DNA测序法更准确地测定实际序列。也如本领域内所知，与实际序列相比，测定的核苷酸序列中的单一插入或缺失将引起核苷酸序列翻译中的移码，以致从靠近此插入或缺失处开始，测定的核苷酸序列所编码的预测氨基酸序列将完全不同于实际由测序的DNA分子所编码的氨基酸序列。
除非另外指出，在此阐明的每个“核苷酸序列”表示为脱氧核糖核苷酸(缩写为A、G、C和T)的序列。然而，核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”对DNA分子或多核苷酸来说，是指脱氧核糖核苷酸的序列，而对RNA分子或多核苷酸来说，是指核糖核苷酸(A、G、C和U)的相应序列，其中特异的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核糖核苷酸(T)被核糖核苷酸尿苷(U)所替换。例如，如使用脱氧核糖核苷酸缩写所述，就含SEQ ID NO：1、3或5的序列的RNA分子而言，意在表示含这样一个序列的RNA分子，其中SEQ ID NO：1的每个脱氧核糖核苷酸A、G或C已被相应的核糖核苷酸A、G或C所替换，并且每个脱氧核糖核苷酸T已被核糖核苷酸U所替换。
使用在此提供的资料，如图1、2或3中的核苷酸序列，可使用标准的克隆和筛选方法，如使用mRNA作为初始物质的克隆cDNA的方法，获得本发明的编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4(分别地)多肽的核酸分子。
本发明进一步涉及上述多核苷酸的变异体，它们编码含图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)的推断氨基酸序列的多肽、或保藏克隆的cDNA所编码的多肽的片段、以及它们的类似物和衍生物。多核苷酸的变异体可以是自然发生的多核苷酸的等位基因变异体或非自然发生的多核苷酸的变异体。
本发明也包括编码与图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)所示相同的成熟多肽、或保藏克隆的cDNA所编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，这些变异体编码图1、2和3(SEQ IDNOS：4、2和6)的多肽、或保藏克隆的cDNA所编码的多肽的片段、以及它们的衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、替换变异体和添加或插入变异体。
如上指出，多核苷酸可具有这样一个编码序列，它是图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)所示的编码序列或保藏克隆的编码序列的自然发生的等位基因变异体。如本领域所知，等位基因变异体是多核苷酸序列的备选形式，可具有基本上不改变编码的多肽的功能的一个或多个核苷酸的替换、缺失或添加。
本发明也包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列能在相同的读框中与一种多核苷酸序列融合，此多核苷酸序列帮助多肽从宿主细胞中的表达和分泌，例如，用于控制多肽从细胞中的转运而作为分泌序列的前导序列。具有前导序列的多肽是前蛋白质，并可具有被宿主细胞切割后形成多肽的成熟形式的前导序列。多核苷酸也能编码原蛋白质，它是成熟蛋白质加上额外附加的5’氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白质是一种原蛋白质，并且是蛋白质的一种非活性形式。一旦切割原序列，就剩余活性的成熟蛋白质。
因此，例如，本发明的多核苷酸能编码成熟蛋白质、或编码具有原序列的蛋白质、或编码同时具有原序列和前序列(presequence)(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可具有在框架内与标记序列融合的编码序列，标记序列用于本发明的多肽的纯化。标记序列可以是pQE-9载体提供的6-组氨酸标记，以在细菌宿主的情况下提供给与标记物融合的成熟多肽的纯化，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素(HA)标记。HA标记对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson，l.等人，细胞(Cell)，37：767(1984))。
术语“基因”意思是参与产生多肽链的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区(前导区和非转录尾区)以及在单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如所示，本发明的核酸分子可以是RNA如mRNA的形式、或是DNA的形式，包括例如通过克隆或合成产生而获得的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链的或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链(也称作有义链)，或者可以是非编码链(也称作反义链)。
术语“经分离的”意思是从其最初的环境中移出的物质(例如，如果是自然发生的则是自然环境)。例如，存在于活动物中的自然发生的多核苷酸或多肽是未经分离的，但相同多核苷酸或DNA或多肽若从自然系统中与某些或全部共存的物质中分开后则是经分离的。这些多核苷酸也许是载体的一部分，并且/或这些多核苷酸或多肽也可是组合物的一部分，并在这些载体或组合物不是其自然环境的部分时仍是分离的。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。根据本发明的经分离的核酸分子进一步包括合成产生的这些分子。
本发明的经分离的核酸分子包括包含MPIF-1、M-CIF或MIP-4cDNA的开放阅读框(ORF)的DNA分子；包含成熟M-CIF、MPIF-1或MIP-4蛋白质的编码序列的DNA分子；以及包含基本上不同于以上所述、但由于遗传密码的简并性仍然编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的DNA分子。当然，遗传密码在本领域中是众所周知的。因此，对于本领域的技术人员，产生上述简并变异体是常规操作。
本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸，如果在这些序列间有至少95％的同一性的话。本发明尤其涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如在此使用的，术语“严格条件”意思是只有在序列间有至少95％、优选地至少97％同一性的情况下才发生杂交。在优选的实施方案中与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样的多肽，这些多肽基本保留与图1、2和3(SEQ ID NO：3、1和5)的cDNA或保藏的cDNA所编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
备择地，多核苷酸可具有至少20个碱基、优选地30个碱基、更优选地至少50个碱基，它们与本发明的多核苷酸杂交、如上所述具有同一性、并且可保留或不保留活性。例如，这些多核苷酸可用作SEQID NO：1、3和5的多核苷酸的探针，例如用于多核苷酸的回收，或用作诊断探针，或用作PCR引物。
另一方面，本发明提供经分离的核酸分子，它包含在严格杂交条件下与上述本发明的核酸分子中的一部分多核苷酸杂交的多核苷酸，例如，包含于ATCC保藏号75572(M-CIF)；ATCC保藏号75676(MPIF-1)；或ATCC保藏号75675(MIP-4)中的cDNA克隆。“严格杂交条件”是指在包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml变性、剪切的鲑精DNA的溶液中42℃温育过夜，然后在大约65℃以0.1×SSC洗涤滤膜。
与多核苷酸的一“部分”杂交的多核苷酸是指与参照多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt)、更优选地至少约20nt、再更优选地至少约30nt、甚至更优选地约30-70nt杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。如上讨论的并在下面更详细讨论的，这些可用作诊断探针和引物。
当然，与参照多核苷酸(例如，保藏的cDNA克隆)的较大部分如长度为50-750nt的部分、或甚至与全长参照多核苷酸杂交的多核苷酸，根据本发明也可用作探针，对应于大多数(如果不是所有)保藏cDNA的核苷酸序列或SEQ ID NO：1(M-CIF)、SEQ ID NO：3(MPIF-1)、或SEQ ID NO：5(MIP-4)所示的核苷酸序列的多核苷酸也一样可用作探针。例如，“至少20nt长”的多核苷酸的一部分，是指来自参照多核苷酸的核苷酸序列的20个或更多的连续核苷酸。如指出的，这些部分在诊断上可根据常规DNA杂交技术用作探针，或用作通过多聚酶链式反应(PCR)对靶序列扩增的引物，例如，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.编写的《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中所描述的，其全部公开内容在此引入作为参考。
由于已保藏了MPIF-1、M-CIF和MIP-4 cDNA克隆，并提供了测定的核苷酸序列，所以产生与MPIF-1、M-CIF或MIP-4 cDNA分子的一部分杂交的多核苷酸对熟练的技术人员是常规操作。例如，能使用MPIF-1、M-CIF或MIP-4 cDNA克隆的限制性内切核酸酶切割或超声处理剪切容易地产生不同大小的DNA部分，它们是分别与MPIF-1、M-CIF或MIP-4 cDNA分子的一部分杂交的多核苷酸。
备择地，可根据已知的技术合成产生本发明的杂交多核苷酸。当然，只与多聚A序列(如cDNA的3’末端多聚A序列段)或与T(或U)残基的互补序列段杂交的多核苷酸，不包含于本发明的用来与本发明的一部分核酸杂交的多核苷酸中，因为这种多核苷酸与包含多聚(A)片段或其互补段的任何核酸分子(例如，几乎任何双链cDNA克隆)杂交。
如指出的，本发明的编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的核酸分子，可以包括、但不限于编码成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子本身；成熟多肽的编码序列和附加序列，例如编码前导或分泌序列，如前-、或原-或前原-蛋白质序列；含或不含上述附加编码序列的成熟多肽的编码序列，伴随附加的非编码序列，例如包括但不限于内含子和非编码5’和3’序列(如转录的非翻译序列，它们在转录、mRNA加工中起作用)，包括剪接和聚腺苷酸化信号，例如核糖体结合及mRNA的稳定；编码附加的氨基酸的附加编码序列，如提供附加功能性的序列。因而，编码多肽的序列可与标记序列融合，例如编码有利于融合多肽纯化的肽的序列。在本发明此方面的某些优选实施方案中，标记氨基酸序列是6-组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标记，其中，许多是可以商业获得的。例如，如Gentz等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：821-824(1989)中所述，6-组氨酸融合蛋白的纯化提供了方便。“HA”标记是可用于纯化的另一个肽，它对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位，已由Wilson等人，细胞(Cell)37：767(1984)描述。如下面所讨论的，其它的这些融合蛋白包括至少一种MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽或在N-或C-末端与Fc融合的片段。
本发明进一步涉及本发明的核酸分子的变异体，它编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的部分、类似物或衍生物。变异体可自然发生，例如自然的等位基因变异体。“等位基因变异体”是指占据了生物体染色体上给定基因座的基因的数个备择形式之一。《基因V》，Lewin，B.编写，牛津大学出版社，纽约(Genes V，Lewin，B.，ed.，OxfordUniversity Press，New York)(1994)。使用本领域内已知的诱变技术可以产生非自然发生的变异体。
这些变异体包括通过核苷酸替换、缺失或添加产生的变异体。替换、缺失或添加可涉及一个或多个核苷酸。可以在编码区、非编码区或两者内改变变异体。在编码区中的改变可以产生保守或非保守的氨基酸替换、缺失或添加。其中特别优选的是沉默替换、缺失或添加，它们不改变MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽或其部分的特性和活性。在这点上同样特别优选的是保守替换。如在此所述，最优选的是编码成熟蛋白质或保藏的cDNA克隆所编码的成熟氨基酸序列的核酸分子。MPIF-1、M-CIF和MIP-4同系物多核苷酸
本发明进一步涉及与编码SEQ ID NO：2、4和6及其片段的多核苷酸具有至少95％同一性的多核苷酸，其片段具有至少30个碱基，优选地至少50个碱基，并且涉及这些多核苷酸编码的多肽。
本发明进一步的实施方案包括含有多核苷酸的经分离的核酸分子，此多核苷酸具有与以下核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列：(a)编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽或片段的核苷酸序列，这些多肽或片段分别具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，包括预测的前导序列；(b)编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽或片段的核苷酸序列，这些多肽或片段分别具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，包括预测的前导序列，但除去N-端甲硫氨酸残基；(c)编码成熟MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽(除去前导序列的全长多肽)的核苷酸序列；(d)编码全长多肽的核苷酸序列，此多肽具有完整的氨基酸序列包括保藏的cDNA克隆所编码的前导序列；(e)编码成熟多肽的核苷酸序列，此多肽具有保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列；或(f)与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中的任何核苷酸序列互补的核苷酸序列。
具有与编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的参照核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可以包括编码多肽的参照核苷酸序列的每100个核苷酸中可达5个的点突变以外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换句话说，要获得与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除、或用另一个核苷酸替换参照序列中高达5％的核苷酸，或者可以将参照序列整个核苷酸的高达5％的许多核苷酸插入参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或末端位置间的任何地方，单个地散布在参照序列的核苷酸之间或在参照序列内一个或多个连续基团中。
作为实际问题，可以使用已知的计算机程序如Bestfit程序(威斯康星序列分析包，用于Unix的第8版，遗传学计算机组，(WisconsinSequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics ComputerGroup)University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)常规确定是否任何特别的核酸分子与例如如图1、3或5所示的核苷酸序列、或与保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同。Bestfit使用Smith和Waterman，应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)2：482-489(1981)的局部同源性算法，以发现两个序列间最佳的同源区段。当使用Bestfit或任何其它的序列比较程序以确定是否特别的序列与根据本发明的参照序列例如95％相同时，需要设置参数，以便计算覆盖参照核苷酸序列全长的同一性的百分数，允许高达参照序列中核苷酸总数5％的同源性中的罚区间。
作为一名普通技术人员应理解，由于以上讨论的测序错误的可能性以及不同已知蛋白质中前导序列切割点的变异性，保藏的cDNA编码的成熟M-CIF多肽包含大约74个氨基酸，但可以是在69-93个氨基酸范围内；并且此蛋白质的实际前导序列是大约19个氨基酸，但可以是大约15到大约24个氨基酸。
作为一名普通技术人员应理解，由于以上讨论的测序错误的可能性以及不同已知蛋白质中前导序列切割点的变异性，保藏的cDNA编码的成熟MPIF-1多肽包含大约99个氨基酸，但可以是75-120个氨基酸范围内；并且此蛋白质的实际前导序列是大约21个氨基酸，但可以是大约15到大约35个氨基酸。
作为一名普通技术人员应理解，由于以上讨论的测序错误的可能性以及不同已知蛋白质中前导序列切割点的变异性，保藏的cDNA编码的成熟MIP-4多肽包含大约69个氨基酸，但可以是60-89个氨基酸范围内；并且此蛋白质的实际的前导序列是大约20个氨基酸，但可以是大约15到大约30个氨基酸。核酸探针
这些分离的分子特别是DNA分子可用作探针，用于通过与染色体的原位杂交进行基因作图，并用于例如通过Northern印迹分析检测人组织中MPIF-1、M-CIF和/或MIP-4基因的表达。本发明进一步涉及在此所述的经分离的核酸分子的片段。具有保藏的MPIF-1、M-CIF或MIP-4 cDNA的核苷酸序列、或如任一或全部图1、2和3(SEQ IDNOS：3、1和5)分别所示的核苷酸序列的经分离的核酸分子的片段，是指至少约15nt、更优选地至少约20nt、再更优选地至少30nt、甚至更优选地至少40nt长的片段，它们用作在此讨论的诊断探针和引物。当然，根据本发明，长度为50-500nt的更大片段也可用作对应于如果不是全部也是大多数的保藏MPIF-1、M-CIF或MIP-4 cDNA、或图1、2和3(SEQ IN NOS：3、1和5)所示的核苷酸序列的片段。例如，长度至少20nt的片段，是指包括保藏cDNA的核苷酸序列或图1、2和3(SEQ ID NOS：3、1和5)所示核苷酸序列的20个或更多连续碱基的片段。由于已经保藏基因而且提供了图1、2和3(SEQ ID NOS：3、1和5)所示的核苷酸序列，产生这些DNA片段对于熟练技术人员是常规操作。例如，限制性核酸内切酶切割或通过超声处理剪切能方便地用来产生不同大小的片段。备择地，能通过合成产生这些片段。
本发明的全长基因的片段可用作cDNA文库的杂交探针，以分离全长的cDNA，并用于分离与基因有高度序列相似性或相似生物学活性的其它cDNA。此型探针优选地有至少30个碱基并可包含例如50个或更多的碱基。探针也可用于鉴定对应于全长转录物的cDNA克隆、基因组克隆或包含全部基因包括调节和启动子区、外显子和内含子的克隆。筛选的一个实例包括使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针以分离基因的编码区。具有与本发明基因互补的序列的标记寡核苷酸被用来筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库，以确定探针与文库的哪一个成员杂交。载体、宿主细胞和蛋白质表达
本发明也涉及包含本发明的经分离的核酸分子的载体、包含重组载体的基因工程宿主细胞、以及MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽或其片段通过重组技术的产生。本发明进一步涉及可用于蛋白质在细菌系统中生产的新型表达载体。这些新型载体例子包括pHE4系列载体，特别是pHE4-5载体(图62和67A-E)。
编码本发明的蛋白质的多核苷酸可以连接到包含用于在宿主中繁殖的选择性标记的载体上。如以下详细讨论的，通常在沉淀物如磷酸钙沉淀物中、或在与带电荷脂类的复合体中将质粒载体引入宿主细胞。如果载体是病毒，可以使用适当的包装细胞系在体外包装，然后转导入宿主细胞。
优选的用于本发明的实践的载体是包含与目的多核苷酸有效连接的顺式作用调控区的载体。顺式作用调控区包括操纵基因和增强子序列。如在此使用的，术语“操纵基因”指通常由调控相邻核苷酸序列之转录的DNA组成的核苷酸序列。操纵基因序列通常自细菌染色体衍生而来。
通过在载体中插入增强子序列，可以增加高等真核生物对编码本发明的多肽的核苷酸序列的转录。增强子通常是大约10到300bp的顺式作用元件，其作用是在给定的宿主细胞型中增加启动子的转录活性。增强子的实例包括位于晚期侧复制起点的100到270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点晚期侧的多形瘤增强子和腺病毒增强子。
可以由宿主、互补载体、或一旦引入宿主则由载体自身提供合适的反式作用因子。
在某些优选实施方案中，在这方面准备用于特定表达的载体，可以是可诱导的和/或细胞型特异的。这些载体中特别优选的是可由容易操作的环境因素如温度和营养添加剂所诱导的。同样优选的用于MPIF-1表达的是实施例30所述的pHE4-5载体。
本发明有用的其它表达载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如由细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒衍生的载体，以及由其组合衍生的载体，如粘粒和噬菌粒。
可通过多种方法将适当的核酸序列插入载体。通常，通过本领域已知的方法将核酸序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。这些及其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
核酸插入应当与合适的启动子有效地连接，例如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早期及晚期启动子和反转录病毒LTR的启动子，以及已知控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的其它启动子。其它适当的启动子对熟练的技术人员是熟知的。如在此使用的，术语“启动子”指核苷酸序列或核苷酸序列组，最低限度地它们提供RNA聚合酶作用的结合位点和起始位点。表达构件进一步包含转录起始、终止位点及转录区中用于翻译的核糖体结合位点。构件表达的成熟转录物的编码部分将优选地包括开始处的翻译起始和适当地位于要翻译的多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。载体也能包括用于增强表达的适当序列。
如在此使用的，短语“有效地连接”指一个核苷酸序列以能够改变序列(或多个序列)功能的这样一种方式连接到另一个核苷酸序列(或多个序列)的连接。例如，与启动子/操纵基因有效连接的蛋白质编码序列将蛋白质编码序列的表达置于这些序列的影响和控制之下。如果启动子功能的诱导导致蛋白质编码序列mRNA的转录，并且如果两个核苷酸序列间连接的性质既不(1)导致移码突变的引入也不(2)阻止调节序列表达以引导mRNA或蛋白质的表达，那么两个核苷酸序列(如一个蛋白质编码序列和与编码序列5’端连接的一个启动子区序列)被认为是有效地连接。因此，如果启动子能够影响核苷酸序列的转录，那么启动子区是与核苷酸序列有效地连接。
如在此使用的，短语“克隆载体”指能在宿主细胞中自主复制的质粒或噬菌体核酸或其它核酸序列，其特征在于具有一个或少量的内切核酸酶识别位点，可以以确定的方式在这些位点切割这些核酸序列而无载体基本生物学功能的丢失，并且为了发生复制和克隆可在这些位点剪接核酸。克隆载体可进一步包含适用于鉴定用克隆载体转化的细胞的标记。例如，标记是红霉素和卡那霉素抗性。术语“vehicle”(载体)有时用作“vector”(载体)。
如在此使用的，短语“表达载体”指与克隆载体相似的载体，在表达载体转化入宿主内之后，它能够表达克隆入表达载体的结构基因。在一个表达载体中，克隆的结构基因(任何目的编码序列)被置于允许这种基因在特定宿主中表达的某些序列的控制(即有效地连接)之下。例如，在pHE4-5载体中，结构基因与T5噬菌体启动子序列和两个lac操纵基因序列有效地连接。表达调节序列可不同，并可另外包含转录元件如终止序列和/或翻译元件如起始和终止位点。
如以上指出，表达载体优选地包括至少一个选择性标记。这些标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性。适当宿主的有代表性的实例包括但不限于细菌细胞如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当的培养基和条件在本领域内是已知的。
在本发明的实践中除表达载体的使用之外，本发明进一步包括新型表达载体，它们包含与编码目的蛋白质的核苷酸序列有效地连接的操纵基因和启动子元件。这种载体的一个实例是pHE4-5(SEQ IDNO：56)，它在下文和实施例30中都有详细描述。一个包含pHE4-5载体的细菌宿主在1997年9月30日保藏于美国典型培养物保藏中心，(ATCC)12301 Park Lawn Drive,Rockville，Maryland 20852，并给予ATCC保藏号____。
如图62和67所概述的，pHE4-5载体(SEQ ID NO：56)的成分包括1).一个作为选择性标记的新霉素磷酸转移酶基因，2).一个大肠杆菌复制起点，3).一个T5噬菌体启动子序列，4).两个lac操纵基因序列，5).一个编码MPIF-1Δ23(SEQ ID NO：27)的核苷酸序列，6).一个Shine-Delgarno序列，7).乳糖操纵子阻抑基因(lacIq)。复制起点(oriC)衍生自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。启动子序列和操纵基因序列是合成制备的。核酸序列的合成产生在本领域内众所周知。CLONTECH 95/96目录215-216页，CLONTECH，1020 EastMeadow Circle，Palo Alto，CA 94303。
如上所述，pHE4-5载体包括一个lacIq基因。LacIq是赋予lac操纵基因紧密调节的lacI基因的一个等位基因。Amann，E.等人，基因(Gene)69：301-315(1988)；Stark，M.，基因51：255-267(1987)。lacIq基因编码与lac操纵基因序列结合并阻断下游(即3’)序列转录的阻抑蛋白。然而，在乳糖或某些乳糖类似物如异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在下，lacIq基因产物与lac操纵基因分离。因而在包含pHE4-5载体的未诱导的宿主细胞中，不产生明显数量的MPIF-1Δ23。然而，通过一种试剂如IPTG的添加诱导这些宿主细胞，导致MPIF-1Δ23编码序列的表达。
pHE4-5载体(SEQ ID NO：57)的启动子/操纵基因序列包括一个T5噬菌体启动子和两个lac操纵基因序列。一个操纵基因位于转录起始位点的5’端而另一个位于相同位点的3’端。当与lacIq基因产物结合存在时，在不存在lac操纵子诱导物如IPTG的情况下，这些操纵基因赋予下游序列的紧密阻抑。可通过lac操纵子诱导物如IPTG的添加来诱导位于lac操纵基因下游的有效连接序列的表达。lac诱导物与lacIq蛋白质的结合导致其从lac操纵基因序列的释放及有效连接序列的转录起始。Devlin，T.，《生化与临床相关性教材》，第4版(TEXTBOOK    OF BIOCHEMISTRY WITH CLINCALCORRELATIONS,4th Edition)(1997)，802-807页中综述了基因表达的lac操纵子调节。
pHE4系列载体包含除MPIF-1Δ23编码序列以外pHE4-5载体的所有成分。pHE4载体的特征包括最佳的合成T5噬菌体启动子、lac操纵基因和Shine-Delgarno序列。此外，这些序列也是最佳隔开的，以便紧密调节插入基因的表达并且一诱导就发生高水平的表达。
在适用于本发明的蛋白质产生的已知细菌启动子中，包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子和trp启动子。合适的真核启动子包括CMT立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期及晚期SV40启动子、反转录病毒LTR启动子如劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、以及金属硫蛋白启动子如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
pHE4-5载体也包括到AUG起始密码子5’端的Shine-Delgarno序列。Shine-Delgarno序列是通常位于AUG起始密码子约10个核苷酸上游(即5’端)的短序列。这些序列基本上将原核核糖体引导至AUG起始密码子。
因此，本发明也涉及用于本发明的蛋白质的产生的表达载体。本发明此方面的一个举例是pHE4-5载体(SEQ ID NO：56)。
用于本发明的蛋白质在细菌中表达的其它优选载体包括pQE70、pQE60和pQE-9(Qiagen)；可从Strategene获得的pBS载体、pD10、Phagescript载体、pBluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可从Pharmacia得到的ptrc99a、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是可从Strategene得到的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可从Pharmacia得到的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。
其它合适的载体对熟练的技术人员来说是显而易见的，包括pBR322(ATCC37017)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“主链”部分是与一个适当的启动子和要表达的结构序列相结合的。合适的宿主株转化和宿主株生长到适当的细菌密度后，通过适当的方法(如变温或化学诱导)诱导选择的启动子，再将细胞培养一个阶段。
在进一步的实施方案中，本发明涉及包含上述构件的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞，或者是低等真核细胞如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。实现将构件引入宿主细胞的方法可以是磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔法、转导、感染或其它方法。这些方法在许多标准实验室手册中有描述，例如Davis等人，《分子生物学基本方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1986)。
可使用众所周知的技术如感染、转导、转染、转位、电穿孔法和转化将重组构件引入宿主细胞。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或反转录病毒载体。反转录病毒载体可以是复制型元件或复制缺损型元件。在后一情况中，通常仅在完整的宿主细胞中发生病毒的增殖。
用本发明的载体例如克隆载体或表达载体基因工程改造(转导或转化或转染)宿主细胞。载体可以例如以质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。可以在改进的常规营养培养基中培养经改造的宿主细胞，此改进培养基适于激活启动子、筛选转化子或扩增MPIF-1、MIP-4和M-CIF基因。培养条件，例如温度、pH等等，是先前选择的宿主细胞表达所使用的条件，这对普通的熟练技术人员来说是显而易见的。
本发明的多核苷酸可用于通过重组技术产生多肽。因此，例如多核苷酸序列可以包含于许多表达载体的任何一种，尤其是表达多肽的载体或质粒。这些载体包含染色体、非染色体和合成的核酸序列，例如，SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体核酸；酵母质粒；由质粒及噬菌体核酸结合衍生的载体，病毒核酸如痘苗、腺病毒、禽痘病毒、甲病毒和假狂犬病。然而，任何其它的质粒或载体只要在宿主中能复制和存活就能使用。
如上所述，包含适当的上述核酸序列以及适当的启动子或控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主以允许宿主表达蛋白质。
作为适当宿主的代表性的实例，可以提到：细菌细胞，如大肠杆菌、链球菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；植物细胞，等等。在此所讲的适当宿主的选择被认为是在本领域技术人员的知识范围之内。
更具体而言，本发明也包括以上广泛描述的包含一个或多个序列的重组构件。构件包含已正向或反向插入本发明的序列的载体，如质粒或病毒载体。在本实施方案的一个优选的方面，构件进一步包含与序列有效连接的调节序列，例如包括启动子。大量的合适载体和启动子对本领域的技术人员是已知的，并可商业获得。以实例的形式提供以下载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Strategene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核的：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Strategene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，任何其它的质粒或载体只要能在宿主内复制和存活就可以使用。
能以常规方法使用宿主细胞中的构件以产生重组序列所编码的基因产物。备择地，可以通过普通的肽合成仪来合成产生本发明的多肽。
可以在适当启动子的控制下，在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟的蛋白质。也可使用无细胞翻译系统用由本发明的核酸构件衍生的RNA产生这些蛋白质。用于原核和真核宿主的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第二版，冷泉港，纽约(Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，)(1989)，其公开内容在此引入作为参考。
通常，重组表达载体包含允许宿主细胞转化的复制起点和选择性标记，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1基因，以及由引导下游结构序列转录的高表达基因衍生的启动子。这些启动子可以衍生自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或尤其是热休克蛋白的操纵子。在适当的阶段，异源结构序列与翻译起始和终止序列结合，优选地与能引导翻译蛋白质向壁膜间隙或胞外介质分泌的前导序列组合。任选地，异源序列能编码包含N-端鉴定肽的融合蛋白，此鉴定肽赋予希望的特征，例如稳定表达的重组产物或便于纯化。
用于细菌的有用表达载体的构建方法是，插入编码希望蛋白质的结构核酸序列、可操作阅读阶段的合适的翻译起始和终止信号及一个功能性启动子。载体将包含一个或更多表型选择性标记和一个复制起点，以确保载体的维持，并在希望时提供宿主内的扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属和葡萄球菌属(Staphylococcus)的不同种，尽管也能使用其它的作为选择。
一般通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎，保留产生的粗提取物用于进一步的纯化。
可通过任何便利的方法破碎在蛋白质表达中使用的微生物细胞，包括反复冻融、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法对于本领域的技术人员是熟知的。
不同的哺乳动物细胞培养系统也能用来表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman，细胞23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞的COS-7系，和能表达适合的载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含一个复制起点、一个合适的启动子和增强子、并且也包含任何必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。由SV40剪接衍生的核酸序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供需要的非转录遗传元件。多核苷酸和多核苷酸片段
本发明进一步提供分离的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽，它具有保藏的cDNA所编码的氨基酸序列，或图1、2或3(分别地SEQ IDNOS：4、2或6)中的氨基酸序列，或包含以上多肽的一部分的肽或多肽。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如一般认为的)，并且如上下文需要以指明一系列通过肽键偶联的至少两个氨基酸时，可交替使用每个术语。“多肽”这个词在此用于包含多于10个氨基酸残基的链。在此所有的寡肽和多肽通式或序列都是从左到右以从氨基端到羧基端的方向书写的。
“具有MPIF-1活性的多肽”是指如特定的生物测定法所测定的，显示与本发明的MPIF-1蛋白质(全长蛋白质或优选地成熟蛋白质)相似、但不必相同的活性的多肽。可通过实施例15、16以及图11所述的测定法测定MPIF-1蛋白质的活性。例如，以下在实施例15中公开了使用体外髓保护测定法测定的MPIF-1蛋白质的活性。
简要地，从小鼠骨髓中分离的细胞谱系-排除群(Lin-细胞)，在含或不含MPIF-1、多种细胞因子的存在下温育。48小时后，一排每种培养物接受5-Fu，然后再继续温育24小时，在每一时点通过本领域技术人员已知的任何合适的克隆发生测定法测定存活的低增殖潜能集落-形成细胞(LPP-CFC)的数量。在MPIF-1存在下较大百分比(例如≥30-50％，如≥40％)的LPP-CFC被保护免于5-Fu-诱导的细胞毒性，而在不存在MPIF-1或存在一种不相关蛋白质的情况下，可观察到对LPP-CFC几乎不保护(≤5％)。此测定中，在MPIF-1存在下，高增殖潜能集落-形成细胞(HPP-CFC)能另外地被保护免于5-Fu-诱导的细胞毒性，但在某些情况中不是。当LPP-CFC不被保护时，通常HPP-CFC不被保护。
因此，在上述测定中，“具有MPIF-1蛋白质活性的多肽”包括显示MPIF-1活性的多肽。尽管活性程度不必与MPIF-1蛋白质的相同，但优选地，与MPIF-1蛋白质相比，“具有MPIF-1蛋白质活性的多肽”将显示基本相似的活性(即，相对于参照MPIF-1蛋白质，候选多肽将显示更高的活性，或至多约低20倍、而优选地至多低约10倍的活性)。
“具有M-CIF活性的多肽”是指如特定生物学测定法所测定时，显示与本发明的M-CIF蛋白质(全长蛋白质或优选地成熟蛋白质)相似但不必相同的活性的多肽。例如，可在以下实施例25中描述的测定法中，使用动物细胞如骨髓细胞的M-CSF-诱导的集落形成的体外抑制来测定M-CIF蛋白质的活性。
因此，在上述测定中，“具有M-CIF蛋白质活性的多肽”包括显示M-CIF活性的多肽。尽管活性程度不必与M-CIF蛋白质的相同，但优选地，与M-CIF蛋白质相比，“具有M-CIF活性的多肽”将显示基本相似的活性(即，相对于参照M-CIF蛋白质，候选多肽将显示更高的活性或至多低约20倍、而优选地至多低约10倍的活性)。
本发明进一步涉及MPIF-1、M-CIF和MIP-4多肽，它们具有图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)的推断的氨基酸序列，或具有保藏的cDNA所编码的氨基酸序列，以及这种多肽的片段、类似物和衍生物。
当涉及图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)的多肽或保藏的cDNA所编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”意思是基本保留与这种多肽相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过原蛋白质部分的切割被激活而产生活性成熟多肽的原蛋白质。
本发明的多肽可以是重组多肽、自然的多肽或合成的多肽，优选地是重组多肽。
图1、2和3(SEQ ID NOS：4、2和6)的、或保藏cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或更多氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选地是保守的氨基酸残基)替换，这种替换的氨基酸残基被或不被遗传密码所编码，或(ii)其中一个或更多的氨基酸残基包括一个替换基团，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物融合，如增加多肽半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)其中附加的氨基酸与成熟多肽融合，如前导或分泌序列或用于成熟多肽纯化的序列或原蛋白质序列。在此所讲的这些片段、衍生物和类似物被认为是在本领域的技术人员的知识范围之内。
优选地以分离的形式提供本发明的多肽，优选地纯化为同质。
本发明的多肽包括SEQ ID NOS：2、4和6的多肽(尤其是成熟的多肽)，以及具有与SEQ ID NOS：2、4和6的多肽至少95％相似性(再更优选地至少95％同一性)的多肽，也包括这些多肽的部分，多肽的这种部分通常包含至少30氨基酸，更优选地至少50个氨基酸。
如本领域所知，两个多肽之间的“相似性”的测定方法是，将第一个多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸替换与第二个多肽的序列相比较。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域的一名普通技术人员将立即认识到，具有与保藏cDNA(ATCC 75676)的核酸序列或图1(SEQID NO：3)所示的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的大量核酸分子，将编码“具有MPIF-1蛋白质活性”的多肽。本领域的一名普通技术人员也将立即认识到，具有与保藏cDNA(ATCC 75572)的核酸序列或图2(SEQ ID NO：1)所示的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的大量核酸分子，将编码“具有M-CIF蛋白质活性”的多肽。另外，本领域的一名普通技术人员将立即认识到，具有与保藏cDNA(ATCC 75675)的核酸序列或图3(SEQ ID NO：5)所示的核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的大量核酸分子，将编码“具有MIP-4蛋白质活性”的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变异体都编码相同的多肽，这对熟练的技术人员来说即使不进行上述比较测定也是清楚的。在本领域中应当进一步认识到，对于这些不是简并变异体的核酸分子中有适当数量的分子也将编码具有MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质活性的多肽。这是因为熟练技术人员完全意识到氨基酸替换较小可能或不可能显著影响蛋白质功能(例如用另一种脂族氨基酸替换一种脂族氨基酸)。
例如，Bowie，J.U.等人，“译解蛋白质序列中的信息：对氨基酸替换的耐受”，科学247：1306-1310(1990)中提供了关于如何进行表型沉默氨基酸替换的指导，其中作者指出研究氨基酸序列对改变的耐受有两个主要的方法。第一个方法依赖于进化的过程，其中突变通过自然选择被接受或者被拒绝。第二个方法使用遗传工程在克隆基因的特定位点引入氨基酸改变，并进行选择和筛选来鉴定保持功能性的序列。如作者所述，这些研究已揭示了蛋白质对于氨基酸替换令人惊奇地耐受。作者进一步指出在蛋白质的某个特定位点氨基酸改变可能是允许的。例如，大多数隐匿的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的少数特征通常是保守的。Bowie，J.U.等人，(出处同前)在此引用的参考文献中描述了其它这些表型沉默替换。
本发明的多肽的片段或部分可以用于通过肽合成产生相应的全长多肽；因此，这些片段可用作产生全长多肽的中间体。本发明的多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。
为了翻译的蛋白质向内质网腔、向壁膜间隙或向细胞外环境的分泌，可将适当的分泌信号引入表达的多肽。信号对于多肽可以是内源的，或者可以是异源的信号。
可以以修饰的形式如融合蛋白的形式表达多肽，并且多肽不仅可包括分泌信号而且可包括附加的异源功能区。例如，可以将附加的氨基酸区尤其是带电荷的氨基酸加到多肽的N-末端，以提高在宿主细胞中、在纯化期间或在随后的处理及贮存期间的稳定性和持久性。同样，可以将肽组分加到多肽上以利于纯化。可在多肽最后制备之前去除这些区。肽组分添加到多肽上可造成分泌或外泌、尤其是提高稳定性并利于纯化，这是本领域贯用和常规的技术。一种优选的融合蛋白包含用来溶解蛋白质的来自免疫球蛋白的异源区。例如，EP-A-O 464 533(Canadian对应申请2045869)公开了包含免疫球蛋白分子恒定区不同部分和另一人蛋白质或其部分的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白的Fc部分十分有利于在治疗和诊断中使用，因而导致例如改善的药物动力学特性(EP-A 0232 262)。另一方面，对于某些用途，希望以所述的有利方式表达、检测和纯化融合蛋白后能够删除Fc部分。当证明Fc部分是用于治疗和诊断的障碍时，例如当融合蛋白将用作免疫的抗原时，就是这样的情况。例如，在药物的发现中，为了鉴定hIL-5拮抗物的高流通量筛选测定法，已将人蛋白质如hIL5-受体与Fc部分融合。见D.Bennett等人，分子识别杂志(Journal of MolecularRecognition)，Vol.8：52-58(1995)和K.Johanson等人，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，Vol.270，No.16：9459-9471(1995)。
可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱，羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最优选地，使用高效液相色谱(“HPLC”)纯化。本发明的多肽包括自然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物，宿主包括例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据在重组体产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或非糖基化的。另外，在某些情况下作为宿主介导的加工结果，本发明的多肽也可包括起始修饰的甲硫氨酸残基。MPIF-1、M-CIF和MIP-4多肽变异体
本领域中应当认识到，MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的某些氨基酸序列可以改变，而对蛋白质的结构和功能没有显著影响。如果考虑序列中的这些差异，应当记住蛋白质上存在决定活性的关键区。通常，假如使用行使相似功能的残基，替换形成三级结构的残基是可能的。其它例子中，如果改变发生在蛋白质的非关键区，则残基的类型完全不重要。
因此，本发明进一步包括MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的变异，它们分别显示基本的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽活性，或者分别包括一个MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质区，如以下讨论的蛋白质的部分。这些突变体包括缺失、插入、倒位、重复和类型替换(例如，用一个亲水性残基替换另一个，但通常不用强亲水的替换强疏水的)。小的改变或这些“中性”氨基酸替换通常对活性没有影响。
一般看来保守替换是在脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间用一个对另一个的代替；羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln间的替换、碱性残基Lys和Arg的交换、以及芳族残基Phe、Tyr间的代替。
另一个特别令人关注的也是用另一带电荷的氨基酸或用中性氨基酸替换带电荷的氨基酸。这可产生具有改善的特征如更不易聚集的蛋白质。聚集的预防是有利的。蛋白质的聚集不仅能导致活性的降低，而且当制备药物制剂时是个问题，因为它们能是免疫原性的(Pinckard等人，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)2：331-340(1967)，Robbins等人，糖尿病(Diabetes)36：838-845(1987)，Cleland等人，治疗药物载体系统综述(Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier System)10：307-377(1993))。
氨基酸的代替也能改变对细胞表面受体结合的选择性。Ostade等人，自然(Nature)361：266-268(1993)，描述某些TNFα突变导致TNFα仅与两个已知TNF受体之一选择性结合。
如上详述的，Bowie，J.U.等人“译解蛋白质序列中的信息：对氨基酸替换的耐受”科学247：1306-1310(1990)中能发现关于氨基酸改变可能是表型沉默的(即，对功能不可能具有显著有害的影响)的进一步指导(见表1)。
如所指出的，改变优选地是本质上较小的，如不显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸替换(见表1)。
表1.保守氨基酸替换
芳族      苯丙氨酸    色氨酸    酪氨酸
疏水性    亮氨酸    异亮氨酸  缬氨酸
极性      谷氨酰胺   天冬酰胺
碱性      精氨酸     赖氨酸    组氨酸
酸性      天冬氨酸    谷氨酸
小        丙氨酸    丝氨酸  苏氨酸  甲硫氨酸  甘氨酸
当然，熟练的技术人员将进行的氨基酸替换的数量依赖于许多因素，包括以上和以下描述的。一般来说，任何给定的MPIF-1或MCIF多肽或其突变体的氨基酸替换的数量，根据目的将不多于50、40、30、20、10、5或3个。以下描述了特定的MPIF-1和MCIF氨基酸替换。MPIF-1变异体
另外，已鉴定和表征了MPIF-1的变异体。几个这种类似物包括氨基端截短。另外，也鉴定和表征了显然由可变剪接位点产生的MPIF-1类似物(图26(SEQ ID NO：11))。实施例17公开了这些MPIF-1类似物的生物学活性。这些类似物的序列显示于图25中(SEQID NO：7、8和9，以及SEQ ID NO：4中的氨基酸残基46-120、45-120、48-120、49-120、39-120和44-120)。
为了改善或改变MPIF-1多肽的特征，可使用蛋白质工程。本领域的技术人员已知的重组DNA技术可用来产生新型蛋白质。突变蛋白质和缺失或融合蛋白质能显示例如提高的活性或增强的稳定性。另外，至少在某些纯化和贮存条件下，它们能以高产量纯化，并显示较好的可溶性。以下是能构建的突变的其它实例。
MPIF-1氨基端和羧基端缺失：通过从蛋白质的羧基端删除8-10个氨基酸残基，干扰素γ显示高达十倍高的活性(Dobeli等人，生物技术杂志(J.of Biotechnology)7：199-216(1988))。Ron等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268(4)：2984-2988(1993)报道了即使丢失3、8或27个氨基端氨基酸残基仍具有肝素结合活性的修饰的KGF蛋白质。任何一名本领域的技术人员都知道许多其它的实例。
以下显示了图1(SEQ ID NO：4)所示氨基酸序列的特别优选的MPIF-1多肽：
Val(23)---Asn(120)    Val(23)---Lys(119)
Thr(24)---Asn(120)    Thr(24)---Arg(118)
Lys(25)---Asn(120)    Lys(25)---Thr(117)
Asp(26)---Asn(120)    Asp(26)---Lys(116)
Ala(27)---Asn(120)    Ala(27)---Ile(115)
Glu(28)---Asn(120)    Glu(28)---Arg(114)
Thr(29)---Asn(120)    Thr(29)---Thr(113)
Glu(30)---Asn(120)    Thr(29)---Asp(112)
Phe(31)---Asn(120)    Thr(29)---Leu(111)
Met(32)---Asn(120)    Thr(29)---Lys(110)
Met(33)---Asn(120)    Met(33)---Leu(109)
Ser(34)---Asn(120)    Ser(34)---Met(108)
Lys(35)---Asn(120)    Ser(34)---Arg(107)
Leu(36)---Asn(120)    Ser(34)---Met(106)
Pro(37)---Asn(120)    Ser(34)---Cys(105)
Leu(38)---Asn(120)    Ser(34)---Val(104)
Glu(39)---Asn(120)    Ser(34)---Gln(103)
Asn(40)---Asn(120)    Ser(34)---Val(102)
Pro(41)---Asn(120)    Ser(34)---Gln(101)
Val(42)---Asn(120)    Ser(34)---Lys(100)
Leu(43)---Asn(120)    Ser(34)---Asp(99)
Leu(44)---Asn(120)    Ser(34)---Ser(98)
Asp(45)---Asn(120)    Ser(34)---Pro(97)
Arg(46)---Asn(120)    Ser(34)---Asn(96)
Phe(47)---Asn(120)    Ser(34)---Ala(95)
His(48)---Asn(120)    Ser(34)---Cys(94)
Ala(49)---Asn(120)    Ser(34)---Phe(93)
Thr(50)---Asn(120)    Ser(34)---Arg(92)
Ser(51)---Asn(120)    Ser(34)---Arg(91)
Ala(52)---Asn(120)    Ser(34)---Gly(90)
Asp(53)---Asn(120)    Ser(34)---Lys(89)
                      Ser(34)---Ile(84)
                      Ser(34)---Ser(79)
                      Ser(34)---Asn(75)
                      Ser(34)---Phe(72)
                      Ser(34)---Leu(68)
因此，一个方面，本发明提供了MPIF-1 N-端缺失突变体。这些突变体包括那些包含图1(SEQ ID NO：4)所示氨基酸序列的突变体，它们具有图1(SEQ ID NO：4)的至少前22个N-端氨基酸残基(即，至少Met(1)-Arg(22)的缺失)但至多前60个N-端氨基酸残基的缺失。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ IDNO：4)的至少前33个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基。备择地，缺失包括至少图1(SEQ ID NO：4)的前37个N-端氨基酸残基(即，至少Met(1)-Pro(37)的缺失)但至多前53个N-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少前48个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基。
除上述MPIF-1N-端缺失突变体的范围外，本发明也涉及上述范围的所有组合，例如，图1(SEQ ID NO：4)的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前48个N-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少前37个N-端氨基酸残基但至多前48个N-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前37个N-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前33个N-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQID NO：4)的至少前33个N-端氨基酸残基但至多前37个N-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少前33个N-端氨基酸残基但至多前48个N-端氨基酸残基的缺失。
另一方面，本发明提供了MPIF-1 C-端缺失突变体。优选地，该MPIF-1 C-端缺失突变体的N-端氨基酸残基是图1(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基1(Met)或22(Arg)。这些突变体包括那些包含图1(SEQ ID NO：4)所示氨基酸序列的突变体，它们具有至少最后C-端氨基酸残基(Asn(120))但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失(例如，图1(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基Glu(69)-Asn(120)的缺失)。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少最后10个或15个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少最后20个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少最后30个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少最后36个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQID NO：4)的至少最后41个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少最后45个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图1(SEQ ID NO：4)的至少最后48个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基。
除上述C-端缺失突变体的范围外，本发明也涉及上述范围的所有组合，例如，图1(SEQ ID NO：4)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后48个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后45个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后41个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后36个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后10个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后10个C-端氨基酸残基但至多最后20个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后10个C-端氨基酸残基但至多最后30个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后10个C-端氨基酸残基但至多最后36个C-端氨基酸残基的缺失；图1(SEQ ID NO：4)的至少最后20个C-端氨基酸残基但至多最后30个C-端氨基酸残基的缺失；等等，等等，等等……。
再另一方面，本发明也包括含从N-端和C-端残基都删除氨基酸的MPIF-1缺失突变体。这些突变体包括上述N-端缺失突变体和C-端缺失突变体的所有组合。这些突变体包括那些包含图1(SEQ ID NO：4)所示氨基酸序列的突变体，它们具有图1(SEQ ID NO：4)的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前52个N-端氨基酸残基的缺失，和图1(SEQ ID NO：4)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。备择地，缺失能包括图1(SEQ ID NO：4)的至少前33、37或48个N-端氨基酸残基但至多前52个N-端氨基酸残基，和图1(SEQ ID NO：4)的至少最后10、20、30、36、41、45或48个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。进一步包括上述范围的所有组合。
氨基酸的替换：本发明的更深一方面也包括氨基酸的替换。特别令人关注的是不显著影响蛋白质折叠的保守氨基酸替换。以上的表1列出了本领域的技术人员已知的保守氨基酸替换的实例。
另外用另一带电荷的氨基酸或中性氨基酸对带电荷氨基酸的替换也是特别令人关注的。这可产生具有改善的特征如更不易聚集的蛋白质。聚集的预防是有利的。蛋白质的聚集不仅能导致降低的活性，而且当制备药物制剂时是个问题，因为它们能是免疫原性的(Pinckard等人，临床实验免疫学2：331-340(1967)，Robbins等人，糖尿病36：838-845(1987)，Cleland等人，治疗药物载体系统综述10：307-377(1993))。
MPIF-1蛋白质可包含自然突变或人操作引起的一个或几个氨基酸替换、缺失或添加。以下提供了图1(SEQ ID NO：4)所示氨基酸序列的某些优选突变的实例。(命名，例如，Ala(21)Met是指图1(SEQID NO：4)的位点21的Ala被Met代替。)
Ala(21)Met    Asp(53)Ser
Thr(24)Ala    Asp(53)Thr
Lys(25)Asn    Asp(53)Met
Asp(26)Ala    Ser(51)Gly
Asp(45)Ala    Ser(34)Gly
Asp(45)Gly    Glu(30)Gln
Asp(45)Ser    Glu(28)Gln
Asp(45)Thr    Pro(60)Thr
Asp(45)Met    Ser(70)Ala
Asp(53)Ala
Asp(53)Gly
MPIF-1137氨基酸剪接变异体的氨基端缺失：
如上所指出，本发明进一步提供人MPIF-1剪接变异体。cDNA序列和137氨基酸序列显示于图26A(分别为SEQ ID NOs：10和11)中。使用真核表达系统，本发明发现此MPIF-1剪接变异体的三个N-端缺失突变体。包括His(60)-Asn(137)；Met(46)-Asn(137)；和Pro(54)-Asn(137)。因此，在更深一方面，本发明提供MPIF-1剪接变异体N-端缺失突变体。这些突变体包括那些包含图26A(SEQ ID NO：11)所示氨基酸序列的突变体，它们具有图26A(SEQ ID NO：11)的至少前45个N-端氨基酸残基但至多前59个N-端氨基酸残基的缺失。备择地，缺失包括图26A(SEQ ID NO：11)的至少前53个N-端氨基酸残基但至多前59个N-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图26A(SEQID NO：11)的至少前45个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基。M-CIF变异体
为了改善或改变M-CIF多肽的特征，可使用蛋白质工程。本领域的技术人员已知的重组DNA技术可用来产生新型蛋白质。突变蛋白质和缺失或融合蛋白质能显示例如提高的活性或增强的稳定性。另外，至少在某些纯化和贮存条件下，它们能以高产量纯化，并显示较好的可溶性。以下是可构建的突变的其它实例。
M-CIF氨基端和羧基端缺失：通过从蛋白质的羧基端删除8-10个氨基酸残基，干扰素γ显示高达十倍高的活性(Dobeli等人，生物技术杂志7：199-216(1988))。Ron等人，生物化学杂志268(4)：2984-2988(1993)报道了即使丢失3、8或27个氨基端氨基酸残基仍具有肝素结合活性的修饰的KGF蛋白质。任何一名本领域的技术人员都知道许多其它的实例。
图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)某些优选突变的M-CIF多肽的特别优选的变异体是：
Gly(19)---Asn(93)    Glu(23)---Asn(93)
Gly(19)---Glu(92)    Thr(20)---Cys(75)
Thr(20)---Asn(93)    Ser(24)---Asn(93)
Thr(20)---Glu(92)    Lys(21)---Glu(92)
Lys(21)---Asn(93)    Ser(25)---Asn(93)
Thr(20)---Lys(91)    Thr(22)---Lys(91)
Thr(22)---Asn(93)    Ser(26)---Asn(93)
Thr(20)---Lys(81)    Glu(23)---Lys(91)
Arg(27)---Asn(93)    His(31)---Asn(93)
Ser(24)---Lys(91)    Ser(25)---Lys(88)
Gly(28)---Asn(93)    Pro(32)---Asn(93)
Ser(25)---Glu(92)    Ser(25)---Lys(81)
Pro(29)---Asn(93)    Ser(33)---Asn(93)
Ser(25)---Lys(91)    Ser(25)---Cys(75)
Tyr(30)---Asn(93)    Glu(34)---Asn(93)
Ser(25)---Met(90)    Ser(26)---Cys(75)
因此，一个方面，本发明提供了M-CIF N-端缺失突变体。这些突变体包括那些包含图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的突变体，它们具有图2(SEQ ID NO：2)的至少前20个N-端氨基酸残基(即，至少Met(1)-Thr(20)的缺失)但至多前40个N-端氨基酸残基的缺失。备择地，缺失包括图2(SEQ ID NO：2)的至少前20个N-端氨基酸残基但至多前33个N-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图2(SEQ IDNO：2)的至少前23个N-端氨基酸残基但至多前33个N-端氨基酸残基。备择地，缺失包括至少图2(SEQ ID NO：2)的前28个N-端氨基酸残基(即，至少Met(1)-Pro(37)的缺失)但至多前33个N-端氨基酸残基。
除上述M-CIF N-端缺失突变体的范围外，本发明也涉及上述范围的所有组合，例如，图2(SEQ ID NO：2)的至少前20个N-端氨基酸残基但至多前28个N-端氨基酸残基的缺失；图2(SEQ ID NO：2)的至少前20个N-端氨基酸残基但至多前23个N-端氨基酸残基的缺失；和图2(SEQ ID NO：2)的至少前28个N-端氨基酸残基但至多前33个N-端氨基酸残基的缺失。
另一方面，本发明提供了M-CIF C-端缺失突变体。优选地，该M-CIF C-端缺失突变体的N-端氨基酸残基是图2(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基1(Met)或20(Thr)。这些突变体包括那些除至少最后C-端氨基酸残基(Asn(93))但至多最后25个C-端氨基酸残基的缺失(例如，图2(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基Lys(69)-Asn(93)的缺失)外，包含图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的突变体。备择地，缺失包括图2(SEQ ID NO：2)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后18个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图2(SEQ ID NO：2)的至少最后3个C-端氨基酸残基但至多最后18个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图2(SEQ ID NO：2)的至少最后5个C-端氨基酸残基但至多最后18个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图2(SEQID NO：2)的至少最后12个C-端氨基酸残基但至多最后18个C-端氨基酸残基。备择地，缺失包括图2(SEQ ID NO：2)的至少最后5个C-端氨基酸残基但至多最后12个C-端氨基酸残基。
再另一方面，本发明也包括含从N-端和C-端残基都删除氨基酸的M-CIF缺失突变体。这些突变体包括上述N-端缺失突变体和C-端缺失突变体的所有组合。这些突变体包括那些包含图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的突变体，它们具有图2(SEQ ID NO：2)的至少前20个N-端氨基酸残基但至多前33个N-端氨基酸残基的缺失，和图2(SEQ ID NO：2)的至少最后C-端氨基酸残基但至多最后18个C-端氨基酸残基的缺失。备择地，缺失能包括图2(SEQ ID NO：2)的至少前23或28个N-端氨基酸残基但至多前33个N-端氨基酸残基，和图2(SEQ ID NO：2)的至少最后3、5或12个C-端氨基酸残基但至多最后18个C-端氨基酸残基的缺失。进一步包括上述范围的所有组合。
M-CIF多肽可包含自然突变或人操作引起的一个或几个氨基酸替换、缺失或添加。图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的某些优选突变的实例是：
Gly(19)Met    Asp(51)Thr
Thr(20)Ala    Asp(51)Met
Lys(21)Asn    Lys(81)Asn
Glu(23)Gln    Lys(81)Ala
Ser(24)Ala    Lys(88)Asn
Ser(24)Met    Lys(88)Ala
Ser(25)Ala    Lys(91)Ala
Ser(25)Gly    Pro(32)Glu
Glu(34)Gln    Ser(33)Leu
Lys(43)Ala    Glu(34)Arg
Asp(51)Ala
Asp(51)Gly
Asp(51)Ser
优选地以分离的形式提供本发明的多肽，优选地是基本纯化的。可用Smith和Johnson，基因(Gene)67：31-40(1988)中描述的一步法基本纯化MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的重组产生形式。
本发明的多肽包括含前导序列的保藏cDNA所编码的多肽；除去前导序列的保藏cDNA所编码的成熟多肽(即成熟蛋白质)；含前导区的图1(SEQ ID NO：4)、图2(SEQ ID NO：2)或图3(SEQ IDNO：6)的多肽；含前导区但除去N-端甲硫氨酸残基的图1(SEQ IDNO：4)、图2(SEQ ID NO：2)或图3(SEQ ID NO：6)的多肽；除去前导区的图1(SEQ ID NO：4)、图2(SEQ ID NO：2)或图3(SEQ ID NO：6)的多肽；以及具有与上述多肽至少95％的相似性、更优选的96％、97％、98％或99％的相似性的多肽。本发明的多肽进一步包括与保藏cDNA所编码的多肽、与图1(SEQ ID NO：4)、图2(SEQ ID NO：2)或图3(SEQ ID NO：6)的多肽至少95％相同、更优选的96％、97％、98％或99％相同的多肽，也包括含至少30个氨基酸、更优选地含至少50个氨基酸的这些多肽的部分。
两个多肽的“％相似性”是指使用Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，W153711)和测定相似性的默认设置通过比较两个多肽的氨基酸序列所产生的相似性得分。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)2：482-489，1981)以发现两个序列间相似性的最佳区段。
含与MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的参照氨基酸序列至少，例如，95％“相同的”氨基酸序列的多肽，是指除了MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的参照氨基酸的每100个氨基酸中，多肽序列可包含多达5个氨基酸的改变以外，多肽的氨基酸序列与参照序列相同。换句话说，为获得含与参照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可删除或用另一个氨基酸替换参照序列中多达5％的氨基酸残基，或者将多达参照序列总氨基酸残基5％的许多氨基酸插入参照序列。这些参照序列的改变可发生于参照氨基酸序列的氨基端或羧基端位置，或末端位置间的任何地方，单个散布于参照序列的残基间或参照序列内一个或多个连续基团中。
作为实际问题，能使用已知的计算机程序如Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)常规确定是否某些特定多肽与，例如，图1(SEQID NO：4)、图2(SEQ ID NO：2)或图3(SEQ ID NO：6)显示的氨基酸序列、或与保藏cDNA克隆所编码的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同。当使用Bestfit或任何其它序列比较程序确定是否特定序列与例如根据本发明的参照序列95％相同时，需要设定参数，以便计算覆盖参照氨基酸序列全长的同一性的百分数，允许可达参照序列中氨基酸残基总数5％的同源性中的罚区间。
使用本领域的技术人员众所周知的方法，本发明的多肽能用作SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱的分子量标准对照物。
如以下详述，本发明的多肽也能用来产生多克隆和单克隆抗体，这些抗体如下所述可用于检测MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质表达的测定，或作为能增强或抑制MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质功能的激动剂和拮抗物。进一步，这些多肽能用于酵母双杂交系统来“捕获”MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质结合蛋白质，后者也是根据本发明的候选激动剂和拮抗物。Fields和Song，自然340：245-246(1989)描述了酵母双杂交系统。携带MPIF-1、M-CIF和MIP-4表位的多肽
另一方面，本发明提供包含本发明多肽之携带表位部分的肽或多肽。此多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”被定义为当全蛋白质是免疫原时引起抗体应答的一部分蛋白质。人们相信这些免疫原性表位限于分子上的几个基因座位。另一方面，抗体能与之结合的蛋白质分子区被定义为“抗原表位”。蛋白质的免疫原性表位的数量通常少于抗原表位的数量。见，例如，Geysen等人，美国国家科学院学报81：3998-4002(1983)。
关于携带抗原表位(即包含抗体能与之结合的蛋白质分子区)的肽或多肽的筛选，模拟一部分蛋白质序列的相对短的合成肽通常能产生与部分模拟蛋白质起反应的抗血清，这在本领域是众所周知的。见，例如，Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.科学219：660-666(1983)。
能引起蛋白质-反应的血清的肽常常显示于蛋白质的一级序列中，其可用一系列简单的化学规则来表征，既不限于完整蛋白质的免疫显性区(即免疫原性表位)也不限于氨基或羧基端。极疏水的肽和六个或更少残基的肽通常在诱导与模拟蛋白质结合的抗体方面无效；较长的肽，特别是包含脯氨酸残基的肽，通常有效。Sutcliffe等人，(出处同前)，661。例如，根据这些原则设计的20个肽中的18个，包含覆盖流感病毒血凝素HA1多肽链75％序列的8-39个残基，诱导与HA1蛋白质或完整病毒反应的抗体；来自MuLV聚合酶的12/12肽和来自狂犬病糖蛋白的18/18肽诱导沉淀各自蛋白质的抗体。
因此本发明的携带抗原表位的肽和多肽可用来产生抗体，包括特异结合本发明的多肽的单克隆抗体。因而，通过将用携带抗原表位的肽免疫的供体之脾细胞的融合，所获得的杂交瘤中有高比例的部分通常分泌与天然蛋白质反应的抗体。Sutcliffe等人，(出处同前)，663。携带抗原表位的肽或多肽产生的抗体可用于检测模拟蛋白质，对不同肽的抗体可用于追踪经受翻译后加工的蛋白质前体不同区的命运。肽和抗-肽抗体可用于对模拟蛋白质的多种定性或定量测定，例如竞争测定，因为在免疫沉淀测定中显示即使短肽(例如约9个氨基酸)也能结合和替换较大的肽。见，例如，Wilson等人，细胞37：767-778(1984)777。本发明的抗-肽抗体也可用于模拟蛋白质的纯化，例如，使用本领域众所周知的方法进行吸附色谱。
根据以上原则设计的本发明的携带抗原表位的肽和多肽，优选地包含至少七个、更优选地至少九个和最优选地约15个到约30个氨基酸的序列，此序列包含于本发明的多肽的氨基酸序列中。然而，包含本发明多肽的较大部分氨基酸序列、包含约30到约50个氨基酸、或可达和包括本发明多肽的完整氨基酸序列的任何长度的肽或多肽，也被认为是本发明的携带表位的肽或多肽，并且也可用于诱导与模拟蛋白质反应的抗体。优选地，选择携带表位的肽的氨基酸序列以提供在水溶剂中的基本可溶性(即，序列包含相对亲水的残基，并优选地避免高度疏水的序列)；包含脯氨酸残基的序列是特别优选的。
能用来产生MPIF-1-特异抗体的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括：包含SEQ ID NO：4中从约21到约30的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约31到约44的氨基酸残基的多肽；包含SEQID NO：4中从约49到约55的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约59到约67的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约72到约83的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约86到约103的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约110到约120的氨基酸残基的多肽。如上指出，发明者已确定上述多肽片段是MPIF-1蛋白质的抗原区。
能用于产生M-CIF-特异抗体的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括：包含SEQ ID NO：2中从约20到约36的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约42到约52的氨基酸残基的多肽；包含SEQ IDNO：2中从约52到约64的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约67到约75的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约75到约84的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约86到约93的氨基酸残基的多肽。如上指出，发明者已确定上述多肽片段是M-CIF蛋白质的抗原区。
可通过制备肽或多肽的任何常规方法，包括使用本发明核酸分子的重组方法，产生本发明的携带表位的肽和多肽。例如，在重组生产和纯化期间可将携带表位的短氨基酸序列与作为载体的较大肽融合，也可在免疫期间以产生抗-肽抗体。也可使用已知的化学合成方法合成携带表位的肽。例如，Houghten描述了一个合成大量肽的简单方法，如10-20mg的248种13个残基的不同肽，它们代表HA1多肽区段的单氨基酸变异体，在不超过四周即完成制备和表征(通过ELISA-型结合研究)。Houghten，R.A.(1985)快速固相合成大量肽的总方法：单个氨基酸水平上抗原-抗体作用的特异性。美国国家科学院学报82：5131-3135。对Houghten等人的美国专利号4,631,211(1986)中进一步描述了此“同时多个肽合成(SMPS)”的方法。此方法中，用于多种肽的固相合成的单个树脂包含于分开的溶剂-可渗透的包装中，使许多参与固相方法的相同的重复步骤的优化使用成为可能。完全手工的方法允许同时进行500-1000或更多的合成。Houghten等人，(出处同前)，5134。
本发明的优选的核酸片段包括编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的携带表位部分的核酸分子。
特别是，本发明的MPIF-1的这些核酸片段包括编码以下多肽的核酸分子：包含SEQ ID NO：4中从约21到约30的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约31到约44的氨基酸残基的多肽；包含SEQID NO：4中从约49到约55的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约59到约67的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约72到约83的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约86到约103的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：4中从约110到约120的氨基酸残基的多肽，或其中的任何范围或值。
特别是，本发明的M-CIF的这些核酸片段包括编码以下多肽的核酸分子：包含SEQ ID NO：2中从约20到约36的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约42到约52的氨基酸残基的多肽；包含SEQID NO：2中从约52到约64的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约67到约75的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约75到约84的氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO：2中从约86到约93的氨基酸残基的多肽，或其中的任何范围或值。
发明者已确定上述多肽片段是MPIF-1和M-CIF蛋白质的抗原区。以下详细描述了测定其它这些MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的携带表位部分的方法。
根据本领域众所周知的方法可使用本发明的携带表位的肽和多肽诱导抗体。见，例如，Sutcliffe等人，(出处同前)；Wilson等人，(出处同前)；Chow，M.等人，美国国家科学院学报82：910-914；和Bittle，F.J.等人，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)66：2347-2354(1985)。通常，可用游离肽免疫动物；然而，可通过将肽与大分子载体如匙孔戚血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素偶联以加强抗-肽抗体效价。例如，可使用接头如间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)将包含半胱氨酸的肽与载体偶联，而可使用更普通的连接剂如戊二醛将其它肽与载体偶联。用游离或载体-偶联的肽，例如，通过腹膜内和/或皮内注射含约100g肽或载体蛋白质和弗氏佐剂的乳剂来免疫动物如兔、大鼠和小鼠。需要几次强化注射，例如，以约两周的间隔，来提供有用效价的抗-肽抗体，例如，使用吸附至固体表面的游离肽经ELISA测定能检测到此抗体。可通过抗-肽抗体的选择来提高免疫动物血清中抗-肽抗体的效价，抗体选择的方法是，例如，根据本领域众所周知的方法对固体载体上的肽的吸附和选择抗体的洗脱。
根据本领域已知的方法鉴定本发明的携带免疫原性表位的肽，即，当全蛋白质是免疫原时引起抗体应答的蛋白质的部分。例如，Geysen等人，(出处同前)，公开了一个在固体支持物上快速同时合成几百个肽的方法，这些肽有足够的纯度在酶联免疫吸附测定中反应。于是不用将它们从支持物上去除即能容易地检测到合成肽与抗体的相互作用。此方法中，一名普通技术人员即可常规鉴定携带希望蛋白质的免疫原性表位的肽。例如，Geysen等人用7个氨基酸的分解定位了免疫学上重要的口蹄疫病毒外壳蛋白的表位，方法是合成一组重叠的覆盖蛋白质完整213氨基酸序列的全部208个可能的六肽。然后，合成完全替换的一组肽，其中全部20个氨基酸在表位内的每个位点都被依次替换，并且确定了赋予与抗体反应的特异性的特定氨基酸。因此，可用此方法常规制备本发明的携带表位肽的肽类似物。Geysen的美国专利号4,708,781(1987)进一步描述了鉴定携带希望蛋白质的免疫原性表位的肽的方法。
再进一步，Geysen的美国专利号5,194,392(1990)描述了检测或测定单体(氨基酸或其它化合物)序列的总方法，此单体是表位的拓扑相同物(即“mimotope”)，其与目的抗体的特定互补位(抗原结合位点)互补。更一般地说，Geysen的美国专利号4,433,092(1989)描述了检测或测定单体序列的方法，此单体是配体的受体拓扑图像相同物，与特定目的受体的配体结合位点互补。同样地，关于过烷基化的寡肽混合物的Houghten，R.A.等人的美国专利号5,480,971(1996)公开了线性C1-C7-烷基过烷基化寡肽和多种这样的寡肽和这些肽的文库，以及使用这些寡肽和文库用来测定优先结合目的受体分子的过烷基化寡肽序列的方法。因而，也能用这些方法常规制备本发明的携带表位肽的非肽类似物。
在此节中引用的关于“多肽和肽”的每个文件的完整公开内容在此引入作为参考。
本领域的一名技术人员应当理解，本发明的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽和上述携带表位的片段可与免疫球蛋白(IgG)恒定区的部分组合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白有利于纯化并显示增加的体内半寿期。已显示了例如，由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的不同结构域组成的嵌合蛋白(EPA394,827；Traunecker等人，自然331：84-86(1988))。由于IgG部分具有二硫键二聚结构的融合蛋白也能在结合及中和其它分子方面比单体MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质或单独的蛋白质片段更有效(Fountoulakis等人，生物化学杂志270：3958-3964(1995))。多肽的纯化和分离
从重组细胞培养物中回收和纯化MPIF-1、M-CIF和MIP-4的方法包括硫酸铵沉淀和乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。如果需要，在完成成熟蛋白质的构型中能使用蛋白质重折叠步骤，最后，可使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是自然纯化的产物、或化学合成过程的产物、或通过重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和培养中的哺乳动物细胞)中产生。根据重组产生过程中使用的宿主，本发明的多肽可用哺乳动物的或其它真核的糖类糖基化，本发明的多肽也可为非糖基化。本发明的多肽也包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。抗体
可产生用于本发明的针对完整MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质或其抗原性多肽片段的MPIF-1、M-CIF或MIP-4-蛋白质特异抗体，对于动物系统(如兔或小鼠)它们可与载体蛋白质如白蛋白一起呈现，或者，如果足够长(至少约25个氨基酸)则不需要载体。
如在此使用的，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意思是包括能特异结合MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的完整分子以及抗体片段(如，例如，Fab和F(ab’)2片段)。Fab和F(ab’)2片段缺少完整抗体的Fc片段，从循环中更快速地被清除，并且可具有更小的完整抗体的非特异组织结合(Wahl等人，核医学杂志(J.Nucl.Med.)24：316-325(1983))。因而，这些片段是优选的。
多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达它们的细胞，都能用作免疫原以产生抗体。这些抗体可以是，例如，多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合、单链和人源化抗体，以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法能用于这些抗体和片段的产生。
能通过直接对动物注射多肽或通过对动物，优选的非人的动物施用多肽，获得针对相应于本发明序列的多肽产生的抗体或其体内受体。如此获得的抗体于是将结合多肽本身。此方法中，甚至仅编码多肽的一个片段的序列可用来产生结合整个天然多肽的抗体。于是这些抗体可用来从表达该多肽的组织中分离该多肽。
对于单克隆抗体的制备，可使用提供经连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然256：495-497)、三瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，今日免疫学(Immunology Today)4：72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，在《(单克隆抗体和癌症治疗》(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)Alan R. Liss,Inc.77-96页)。
所述用于单链抗体产生的技术(美国专利4,946,778)能适合于产生针对本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
可通过多种方法制备本发明的抗体。例如，可对动物施用表达MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质或其抗原片段的细胞，以诱导含多克隆抗体的血清的产生。在一种优选的方法中，制备和纯化一种MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的制剂，以使其基本没有自然污染物。然后将这种制剂引入动物以产生有较高特异活性的多克隆抗血清。
在最优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体(或其MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质结合片段)。可使用杂交瘤技术制备这些单克隆抗体(Kohler等人，自然256：495(1975)；Kohler等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6：511(1976)；Kohler等人，欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等人，在：《单克隆抗体和T-细胞杂交瘤》(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)Elsevier，N.Y.，(1981)563-681页)。通常，这些方法包括用MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质抗原、或更优选地用MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质表达细胞免疫动物(优选的是小鼠)。根据它们结合抗-MPIF-1、抗M-CIF或抗MIP-4蛋白质抗体的能力筛选合适的细胞。这些细胞可培养于任何合适的组织培养基中；然而，优选的是将细胞培养于补加10％胎牛血清(在约56℃灭活)、并补加约10g/l非必需氨基酸、约1000U/ml青霉素和约100g/ml链霉素的Earle’s改进的Eagle’s培养基中。提取这些小鼠的脾细胞，与合适的骨髓瘤细胞系融合。依照本发明可使用任何合适的骨髓瘤细胞系；然而，优选的是使用亲代骨髓瘤细胞系(SP20)，它可从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland得到。融合后，将产生的杂交瘤细胞选择性维持于HAT培养基中，然后如Wands等人所述(胃肠病学(Gastroenterology)80：225-232(1981))经有限稀释法克隆杂交瘤细胞。然后测定通过这种筛选获得的杂交瘤细胞，以鉴定分泌能结合MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质抗原的抗体的克隆。
备择地，可通过抗-独特型抗体的使用以两步法产生能结合MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质抗原的其它抗体。这种方法利用这样一个事实，抗体本身是抗原，因此，能够获得与第二抗体结合的抗体。依照此方法，使用MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质特异抗体免疫动物，优选的是小鼠。然后使用此动物的脾细胞产生杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞以鉴定产生抗体的克隆，产生的抗体与MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质特异抗体结合的能力可被MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质抗原阻断。这些抗体包括对MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质特异抗体的抗-独特型抗体，能用来免疫动物以诱导进一步的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质-特异抗体的生成。
应当理解，可根据在此公开的方法使用本发明的抗体的Fab和F(ab’)2和其它片段。一般使用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)通过蛋白酶剪切产生这些片段。备择地，可通过重组DNA技术的应用或通过合成化学来产生MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质-结合片段。
优选地使用“人源化”嵌合单克隆抗体。可使用由产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞衍生的基因构件来产生这些抗体。产生嵌合抗体的方法在本领域已知。见，综述，Morrison，科学229：1202(1985)；Oi等人，生物技术(BioTechniques)4：214(1986)；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Taniguchi等人，EP171496；Morrison等人，EP 173494；Neuberger等人，WO 8601533；Robinson等人，WO 8702671；Boulianne等人，自然312：643(1984)；Neuberger等人，自然314：268(1985)。
以下提供了用于本发明的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质-特异抗体的更合适的标记物。合适的酶标记物的实例包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母-乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记物的实例包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等等。在使用体内成像时111In是优选的同位素，因为它避免了肝对125I或131I-标记的单克隆抗体的脱卤问题。另外，此放射性核苷酸对成像有更好的γ发射能量(Perkins等人，欧洲核医学杂志(Eur.J.Nucl.Med.)10：296-301(1985)；Carasquillo等人，核医学杂志(J.Nucl.Med.)28：281-287(1987))。
合适的非放射性同位素标记物的实例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记物的实例包括152Eu标记物、荧光素标记物、异硫氰酸标记物、罗丹明标记物、藻红蛋白标记物、藻蓝蛋白标记物、别藻蓝蛋白标记物、邻苯二醛标记物和荧光胺标记物。
合适的毒素标记物的实例包括白喉毒素、蓖麻毒蛋白和霍乱毒素。
化学发光标记物的实例包括鲁米那标记物、异鲁米那标记物、芳族吖啶(acridinium)酯标记物、咪唑标记物、吖啶盐标记物、草酸酯标记物、萤光素标记物、萤光素酶标记物和水母发光蛋白标记物。
核磁共振造影剂的实例包括重金属核如Gd、Mn和铁。
Kennedy等人，临床化学学报(Clin.Chim.Acta)70：1-31(1976)和Schurs等人，临床化学学报81：1-40(1977)提供了上述标记物与抗体结合的典型技术。后者提到的偶联技术是戊二醛法、过碘酸法、双马来酰亚胺法、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基-琥珀酰亚胺酯法，所有这些方法在此引入作为参考。染色体测定
本发明的核酸分子对染色体鉴定也有价值。序列特异地定向于个体人染色体上的特定位置并能与之杂交。而且，当前存在鉴定染色体上特定位点的需要。目前很少有基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记剂可用于标记染色体位置。根据本发明对染色体的DNA作图是将这些序列与疾病相关基因相关联的重要的第一步。
某些优选的实施方案中，在这点上，在此公开的cDNA被用来克隆MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质基因的基因组DNA。这可使用许多众所周知的技术和通常可商业得到文库来完成。然后为了此目的使用众所周知的技术将基因组DNA用于原位染色体作图。一般地，依照染色体作图的常规方法，尝试法对鉴定提供很好的原位杂交信号的基因组探针是必要的。
简要地，可通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)用序列对染色体作图。cDNA的计算机分析用来快速筛选覆盖不超过基因组DNA一个外显子，因而使扩增过程变复杂的引物。然后这些引物用于含个体人染色体的体细胞杂合子的PCR筛选。仅有那些含对应于引物的人基因的杂合子才产生扩增片段。
体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的快速方法。使用本发明相同的寡核苷酸引物，用一系列特异染色体的部分或大基因组克隆库以类似的方法可完成亚定位。可同样用于对染色体作图的其它作图策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选和通过构建染色体特异-cDNA文库的杂交进行预筛选。
cDNA克隆对中期染色体分布的荧光原位杂交(“FISH”)可用来在一步中提供精确的染色体定位。可用短至50或60bp的cDNA的探针使用此技术。关于此技术的综述，见Verma等人，《人类染色体：基本技术手册》(Human chromosome：A Manual of Basic Techniques)，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列定位于精确的染色体位置，就能将染色体上序列的物理位置与基因图谱数据关联起来。这些数据发现于，例如，V.McKusick，《人类孟德尔式遗传》(Mendelian Inheritance In Man)中，是通过JohnsHopkins University，Welch Medical Library在线得到的。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共同遗传)鉴定已经定位于相同染色体区的基因和疾病间的关系。
其次，有必要测定受影响和未受影响个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果在某些或所有受影响个体中观察到突变，但在任何正常个体中观察不到，那么此突变可能是疾病的引发剂。
根据当前的物理作图和遗传作图的分辩率，被精确定位于与疾病相关联的染色体区的cDNA可能是50到500个潜在的致病基因之一。这假定1兆碱基大范围作图分辩率和每20kb一个基因。
受影响和未受影响个体的比较通常包括：首先寻找染色体中的结构改变，如缺失或易位，它们是从染色体分布中可见的、或使用基于cDNA序列的PCR可检测的。最后，需要几个个体基因的完整序列来证实突变的存在，并从多态性中辨别出突变。
本发明进一步涉及通过使用反义技术在体内抑制MPIF-1、M-CIF和MIP-4。反义技术可通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA用来控制基因表达，这两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，使用编码本发明多肽的多核苷酸序列的5’编码部分，来设计长度为约10到40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计一个与参与转录的基因区互补的DNA寡核苷酸(三股螺旋—见Lee等人，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)，6：3073(1979)；Cooney等人，科学，241：456(1988)；和Dervan等人，科学，251：1360(1991))，由此阻止转录以及MPIF-1、M-CIF和MIP-4的产生。反义RNA寡核苷酸与体内mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译为MPIF-1、M-CIF和MIP-4(反义—Okano，神经化学杂志(J.Neurochem)56：560(1991)；《作为基因表达反义抑制剂的寡脱氧核苷酸》(Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors ofGene Expression)CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。
备择地，可通过本领域的方法将上述寡核苷酸送递至细胞，以便在体内表达反义RNA或DNA，以上述方法抑制MPIF-1、MIP-4和M-CIF的产生。
因此，针对MPIF-1、MIP-4和M-CIF的反义构件可用来治疗MPIF-1、MIP-4和/或M-CIF诱导的或增强的疾病，例如，动脉粥样硬化、自身免疫病，例如多发性硬化和胰岛素-依赖的糖尿病、和慢性炎症及传染病、组胺介导的变应性反应、类风湿性关节炎、矽肺、结节病、自发性肺纤维化和肺的其它慢性炎症疾病、自发性嗜曙红细胞过多综合征、内毒素休克、组胺介导的变应性反应、非前列腺素依赖的发热和再生障碍性贫血及骨髓衰竭的其它病例。拮抗物、激动剂和方法
本发明进一步提供筛选用来鉴定本发明趋化因子多肽激动剂和拮抗物的化合物的方法。激动剂是具有与多肽相似的生物学功能、或增强的功能的化合物，而拮抗剂阻断这些功能。可将被本发明的多肽趋化的细胞放置于具有供细胞通过的足够直径的孔(约5μm)的滤膜顶部来测定趋化性。潜在激动剂的溶液置于室的底部，适当的对照培养基于上面的室中，因而通过计数一定时间后迁移至或通过孔膜的细胞来测定激动剂的浓度梯度。
当测定拮抗物时，将本发明的趋化因子多肽置于底室，加入潜在拮抗物以测定是否阻止细胞的趋化性。
备择地，在化合物存在下，将表达多肽受体的哺乳动物细胞或膜制剂与标记的，例如，放射性标记的趋化因子多肽一起温育。然后测定化合物阻断此相互作用的能力。当以这种方式测定激动剂时，应不加趋化因子，测定激动剂本身与受体相互作用的能力。
潜在的MPIF-1、MIP-4和M-CIF拮抗物的实例包括抗体、结合多肽的寡核苷酸(某些情况中)。潜在拮抗物的另一个实例是多肽的负显性突变体。负显性突变体是能结合野生型多肽受体但不能保留生物学活性的多肽。
使用反义技术制备的反义构件也是潜在拮抗物。可使用反义技术通过三股螺旋形成或反义DN或RNA来控制基因表达，两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，使用编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分，来设计长度为约10到40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计一个与参与转录的基因区互补的DNA寡核苷酸(三股螺旋—见Lee等人，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等人，科学，241：456(1988)；和Dervan等人，科学，251：1360(1991))，由此阻止转录和趋化因子多肽的产生。反义RNA寡核苷酸与体内mRNA杂交，并阻断mRNA分子翻译为多肽(反义—Okano，神经化学杂志56：560(1991)；《作为基因表达反义抑制剂的寡脱氧核苷酸》，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。也可将上述寡核苷酸送递至细胞，以便在体内表达反义RNA或DNA，抑制趋化因子多肽的产生。
另一个潜在的趋化因子拮抗物是多肽的肽衍生物，它们是自然或合成修饰的多肽的类似物，丢失了生物学功能却仍能识别并结合多肽的受体，由此有效地阻断受体。肽衍生物的实例包括但不限于小肽或类似肽的分子。
拮抗物可用来治疗MPIF-1、MIP-4和M-CIF诱导的或增强的疾病，例如，自身免疫病和慢性炎症及传染性疾病。自身免疫病的实例包括多发性硬化和胰岛素-依赖的糖尿病。
拮抗物也可通过防止单核吞噬细胞的补充和激活用来治疗传染病，包括矽肺、结节病、自发性肺纤维化。它们也可通过阻止嗜曙红细胞的产生和迁移用来治疗自发性嗜曙红细胞过多综合征。也可用拮抗物通过阻止巨噬细胞的迁移和本发明的趋化因子多肽的产生来治疗内毒素休克。
拮抗物也可通过阻止动脉壁中的单核细胞浸润用于治疗动脉粥样硬化。
拮抗物也可通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒及组胺释放，用于治疗组胺介导的变应性反应和免疫疾病，包括晚期变应性反应、慢性荨麻疹和特应性皮炎。也可治疗IgE-介导的变应性反应如变应性哮喘、鼻炎和湿疹。
拮抗物也可通过防止创伤区对单核细胞的吸引用来治疗慢性和急性炎症。它们也可用来调节正常肺巨噬细胞群，因为慢性和急性炎症肺疾病与肺中的单核吞噬细胞的螯合相关。
拮抗物也可通过防止单核细胞被吸引入患者关节的滑液，用来治疗类风湿性关节炎。单核细胞的流入和激活在退化性和炎症性关节病的发病机理中起显著作用。
拮抗物也可用来干扰主要由IL-1和TNF引起的有害级联反应，它们防止其它炎性细胞因子的生物合成。这样，拮抗物可用来防止炎症。也可使用拮抗物抑制趋化因子诱导的非前列腺素-依赖的发热。
也可使用拮抗物治疗骨髓衰竭的病例，例如，再生障碍性贫血和骨髓发育异常综合征。
拮抗物也可通过防止肺中嗜曙红细胞的积累用来治疗哮喘和变态反应。也可使用拮抗物治疗哮喘肺的显著特征—基膜纤维化。激动剂
M-CIF、MPIF-1和/或MIP-4激动剂包括具有与一个或多个如在此描述的这些多肽相似活性的任何小分子。例如，MPIF-1激动剂可用来增强MPIF-1活性。例如，增强经受化学治疗或骨髓移植的患者中MPIF-1诱导的髓保护。另一实例，M-CIF激动剂能提供一个或多个抗炎症活性、抗-TNFα活性，等等，如在此描述的M-CIF的多种功能活性。疾病诊断和预后
当与相应的“标准”哺乳动物即没有疾病或紊乱的同种哺乳动物相比较时，如以下讨论的某些疾病或紊乱可与增强的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平和编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的mRNA水平相关联。进一步地，人们相信当与没有疾病或紊乱的同种哺乳动物的血清相比较时，在有疾病或紊乱的哺乳动物的某些体液(例如，血清、血浆、尿、和脊髓液)中能检测到增强的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平。因此，本发明提供了一种诊断方法，包括测定哺乳动物细胞或体液中编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的基因的表达水平，以及将基因表达水平与标准MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达水平相比较，由此超过标准的基因表达水平的增高表明某些疾病或紊乱。
根据常规方法进行疾病或紊乱的诊断时，本发明可用作预后指示，由此显示增强的MPIF-1、M-CIF或MIP-4基因表达的患者相对于以较低水平表达基因的患者来说将经历较坏的临床后果。
“测定编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的基因的表达水平”是指直接(例如，通过测定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或相对地(例如，通过与第二种生物样品中的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平或mRNA水平相比较)定性或定量地测定或估计第一种生物样品中MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的水平或编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的mRNA的水平。
优选地，测定或估计第一种生物样品中MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的水平或mRNA的水平，并与标准MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平或mRNA水平相比较，标准来自于从没有疾病或紊乱的个体中获得的第二种生物样品。本领域中技术人员应当理解，一旦已知MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平或mRNA水平，就能作为标准重复用于比较。
“生物样品”是指从个体、细胞系、组织培养物、或者包含MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质或mRNA的其它来源获得的任何生物样品。生物样品包括含分泌的成熟MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的哺乳动物体液(如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)、和卵巢、前列腺、心脏、胎盘、胰、腹水、肌肉、皮肤、腺、肾、肝、脾、肺、骨、骨髓、眼、外周神经、中枢神经、乳房和脐组织。从哺乳动物中获得组织活检和体液的方法在本领域众所周知。生物样品包括mRNA时，组织活检是优选的来源。
本发明可用于检测哺乳动物的疾病。在用于哺乳动物(优选为人)的多种免疫系统-相关疾病的诊断或治疗中，本发明特别有用。这些疾病包括肿瘤、癌症和任何免疫细胞功能的失调，包括但不限于自身免疫病、关节炎、白血病、淋巴瘤、免疫抑制、脓毒症、创伤愈合、急性和慢性感染、细胞介导的免疫、体液免疫、炎症肠疾病、髓抑制等等。优选的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、母牛、猪、马、兔和人。特别优选的是人。
可使用任何合适的技术从生物样品中分离总细胞RNA，如Chomczynski和Sacchi，生物化学年报(Anal.Biochem.)162：156-159(1987)描述的单步硫氰酸胍-乙醇-氯仿法。然后使用任何适当的方法测定编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的mRNA的水平。这包括Northern印迹分析、S1核酸酶作图、聚合酶链反应(PCR)、与聚合酶链反应结合的逆转录(RT-PCR)和与连接酶链反应结合的逆转录(RT-LCR)。
可如Harada等人，细胞63：303-312(1990)所述进行Northern印迹分析。简要地，如上所述从生物样品中制备总RNA。为用于Northern印迹，在适当的缓冲液(如乙二醛/二甲基亚砜/磷酸钠缓冲液)中变性RNA，进行琼脂糖凝胶电泳，将其转移至硝酸纤维素滤膜。RNA与滤膜通过UV接头连接后，在含甲酰胺、SSC、Denhardt溶液、变性鲑精、SDS和磷酸钠缓冲液的溶液中预杂交滤膜。根据任何适当的方法(如32P-多重引物DNA标记系统(Amersham))标记的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质cDNA用作探针。杂交过夜后，冲洗滤膜并暴露于X-射线胶片。在上一节中描述了根据本发明用作探针的cDNA，优选地长度至少为15bp。
可如Fujita等人，细胞49：357-367(1987)所述进行S1作图。为制备用于S1作图中的探针DNA，上述cDNA的有义链用作模板以合成标记的反义DNA。然后使用适当的限制性内切核酸酶消化反义DNA，产生希望长度的进一步的DNA探针。这些反义探针可用来显示对应于靶mRNA(即，编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的mRNA)的保护带。可如上所述进行Northern印迹分析。
优选地，使用Makino等人，技术(Technique)2：295-301(1990)所述的RT-PCR方法测定编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的mRNA的水平。用这种方法，聚丙烯酰胺凝胶带中“扩增子”的放射性与靶mRNA的初始浓度线性相关。简要地，此方法包括将从生物样品分离的总RNA加入含RT引物和适当缓冲液的反应混合物。温育使引物退火后，向混合物补加RT缓冲液、dNTP、DTT、RNase抑制剂和反转录酶。温育以完成RNA的反转录后，使用标记引物对RT产物进行PCR。备择地，标记的dNTP而不是标记引物可包含于PCR反应混合物中。根据常规技术可在DNA热循环仪中进行PCR扩增。经合适数量的循环完成扩增后，在聚丙烯酰胺凝胶上对PCR反应混合物进行电泳。干燥凝胶后，使用图像分析仪定量适当带(对应于编码MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的mRNA)的放射性。RT和PCR反应成分和条件、试剂和凝胶浓度及标记方法在本领域中众所周知。RT-PCR方法的变化对熟练的技术人员来说是显而易见的。
可使用一系列扩增反转录靶mRNA的寡核苷酸引物并如上节所述对其进行设计。
可使用任何本领域已知的方法测定生物样品中的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平。为测定生物样品中MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质水平而优选的是基于抗体的技术。例如，可用经典的免疫组织方法研究MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质在组织中的表达。其中，初级抗体(多克隆或单克隆)提供特异识别，而次级检测系统可应用荧光、酶或其它偶联的次级抗体。结果，获得用于病理检查的组织切片的免疫组织染色。也可使用如尿素和中性去污剂提取组织，用于MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的释放，用于Western印迹或斑点(dot/slot)印迹测定(Jalkanen，M.等人，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)101：976-985(1985)；Jalkanen，M.等人，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))。在基于应用阳离子固相的此技术中，使用分离的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质作为标准完成MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的定量。此技术也能用于体液。对于这些样品，一摩尔浓度的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质将有助于设定对于不同体液如血清、血浆、尿、脊髓液，等等的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质含量的标准值。然后可使用健康个体的值设定MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质含量的正常存在值，其能用于与从测试者获得的值相比较。
用于检测MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。例如，MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质-特异的单克隆抗体既可用作免疫吸附剂又可用作酶标记探针，以检测和定量MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质。可使用线性回归计算机算法参照标准制剂中存在的量计算样品中存在的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的量。在另一种ELISA测定法中，可使用两种独特的特异单克隆抗体检测体液中的MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质。在此测定法中，一种抗体用作免疫吸附剂，而另一种用作酶标记探针。
以上技术基本可按“一步”或“两步”测定法进行。“一步”测定法包括用固定的抗体接触MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质，不必冲洗，将混合物与标记抗体接触。“两步”测定法包括用标记抗体接触混合物之前冲洗。如果合适也可使用其它常规方法。通常希望将测定系统的一种成分固定于支持物上，由此允许系统的其它成分进入并接触此成分，并且易于从样品中去除这些成分。
合适的酶标记物包括，例如，通过与底物反应催化过氧化氢产生的氧化酶。葡萄糖氧化酶是特别优选的，因为它具有良好的稳定性并且它的底物(葡萄糖)易于得到。可通过测定经酶-标记抗体/底物反应形成的过氧化氢的浓度来测定氧化酶标记物的活性。除酶之外，其它合适的标记物包括放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，以及荧光标记物，如荧光素和罗丹明，和生物素。
本发明的多肽和编码这些多肽的多核苷酸可用作研究试剂，用于涉及科学研究、DNA合成和DNA载体制备的体外目的，并用于发展关于人类疾病治疗的治疗学和诊断学。例如，M-CIF和MPIF-1可通过临时阻止细胞分化用于未成熟造血先祖细胞如粒细胞、巨噬细胞或单核细胞的膨胀。这些骨髓细胞可在体外培养。
全长MPIF-1、MIP-4或M-CIF基因的片段可用作cDNA文库的杂交探针，以分离全长基因，并分离具有与此基因的高度序列相似性或相似生物学活性的其它基因。然而优选地，探针至少具有30个碱基并可包含例如50个或更多的碱基。探针也可用来鉴定对应于全长转录物的cDNA克隆和基因组克隆或含完整基因(包括调节和启动子区、外显子和内含子)的克隆。筛选的实例包括使用已知DNA序列合成寡核苷酸探针以分离基因的编码区。用具有与本发明的基因互补的序列的标记寡核苷酸来筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库，以确定探针与文库的哪一部分杂交。
本发明也涉及MPIF-1、MIP-4和M-CIF基因作为诊断测定部分的使用，用于检测与核酸序列中突变的存在有关的疾病或疾病的易感性。这些疾病与趋化因子多肽的表达不足有关。
可通过许多技术在DNA水平上检测具有MPIF-1、MIP-4和M-CIF中突变的个体。用于诊断的核酸可从患者的细胞获得，如来自血、尿、唾液、组织活检和尸检材料。基因组DNA可直接用于检测，或可在分析前使用PCR酶扩增基因组DNA(Saiki等人，自然324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于相同目的。作为一个实例，与编码MPIF-1、MIP-4和M-CIF的核酸互补的PCR引物能用来鉴定和分析MPIF-1、MIP-4和M-CIF突变。例如，能通过与正常基因型相比的扩增产物的大小变化来检测缺失和插入。可鉴定点突变，方法是将扩增DNA与放射性标记的MPIF-1、MIP-4和M-CIF RNA杂交，或备择地，与放射性标记的MPIF-1、MIP-4和M-CIF反义DNA序列杂交。可通过Rnase A消化或通过解链温度的差异从错配双螺旋中辨别出完全配对的序列。
可通过检测在含或不含变性剂的凝胶中DNA片段电泳迁移率的改变来完成基于DNA序列差异的遗传测试。能通过高分辨率凝胶电泳显示小序列的缺失和插入。不同序列的DNA片段可在变性甲酰胺梯度凝胶上辨别，其中根据其特异解链或部分解链温度，不同DNA片段的迁移率在凝胶中在不同的位置被延缓(见，例如，Myers等人，科学230：1242(1985))。
也可通过核酸酶保护测定法，如RNase和S1保护或化学断裂法，揭示在特定位置的序列改变(例如，Cotton等人，美国国家科学院院报85：4397-4401(1985))。
因此，完成特异DNA序列的检测的方法包括如杂交、RNase保护、化学断裂、直接DNA测序或限制酶的使用(例如，限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹。
除更常规的凝胶电泳和DNA测序外，也可通过原位分析检测突变。
本发明也涉及用于检测不同组织中MPIF-1、MIP-4和M-CIF蛋白质的改变水平的诊断测定，因为相比于正常对照组织样品的蛋白质的过量表达可检出疾病例如，肿瘤或疾病易感性的存在。用来检测宿主样品中MPIF-1、MIP-4和M-CIF蛋白质水平的测定法对于本领域的技术人员是众所周知的，包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析、ELISA测定和“夹心”测定。ELISA测定(Coligan等人，《免疫学的当前方案》(Current Protocols in Immunology)1(2)，第6章(1991))最初包括制备对MPIF-1、MIP-4和M-CIF抗原特异的抗体，优选的是单克隆抗体。另外制备抗单克隆抗体的报道抗体。附着于报道抗体的是可检测试剂，如放射性、荧光或此实例中的辣根过氧化物酶。从宿主中移除样品，在结合样品中的蛋白质的固体支持物如聚苯乙烯平皿上温育。然后通过用非特异的蛋白质如BSA温育，覆盖平皿上任何游离的蛋白质结合位点。其次，在平皿中温育单克隆抗体，在此期间单克隆抗体与附着于聚苯乙烯平皿上的MPIF-1、MIP-4和M-CIF蛋白质结合。用缓冲液洗去所有未结合的单克隆抗体。现在将与辣根过氧化物酶连接的报道抗体置于平皿中，导致报道抗体与结合于MPIF-1、MIP-4和M-CIF的任何单克隆抗体结合。然后洗去未附着的报道抗体。然后将过氧化物酶底物加入平皿中，当与标准曲线比较时，在特定时间中显色的量是特定体积的患者样品中存在的MPIF-1、MIP-4和M-CIF蛋白质含量的量度。
可使用竞争测定法，其中对MPIF-1、MIP-4和M-CIF特异的抗体附着于固体支持物，使标记的MPIF-1、MIP-4和M-CIF和来自宿主的样品流过固体支持物，通过例如液体闪烁色谱检测的标记物的量可与样品中蛋白质的量相关。
“夹心”测定法与ELISA测定法相似。在“夹心”测定法中，使MPIF-1、MIP-4和M-CIF流过固体支持物，并与附着于固体支持物的抗体结合。然后使第二抗体与MPIF-1、MIP-4和M-CIF结合。然后使标记的并特异于第二抗体的第三抗体流过固体支持物，并与第二抗体结合，然后可以被定量。
本发明提供了趋化因子多肽的受体的鉴定方法。可通过许多本领域的技术人员已知的方法鉴定编码受体的基因，例如，配体淘筛和FACS分类(Coligan等人，《免疫学的当前方案》1(2)，第5章(1991))。优选地，使用表达克隆，其中从对多肽反应的细胞中制备聚腺苷酸化的RNA，并将由此RNA产生的cDNA文库分为多个库，用来转染COS细胞或不对多肽反应的其它细胞。将生长于载玻片上的转染细胞接触标记的多肽。可通过许多方法标记多肽，包括对位点特异的蛋白激酶的识别位点的碘化或内含。固定和温育后，对载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性库，制备亚库，使用重复亚库和重筛选方法再转染，最后产生编码推定的受体的单克隆。
作为受体鉴定的一个备择方法，标记的多肽可与细胞膜或表达受体分子的提取制剂光亲和地连接。经PAGE分析解离交联物质，并暴露于X-射线胶片。可切下含多肽受体的标记复合物，将其解离为肽片段，进行蛋白质微量测序。从微量测序获得的氨基酸序列将用来设计一系列简并寡核苷酸探针，筛选cDNA文库，鉴定编码推定的受体的基因。治疗
本发明的多肽可以用于多种免疫调节和炎症功能，也用于许多疾病状态。MPIF-1、MIP-4和M-CIF属于趋化因子家族，因此是白细胞(例如单核细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等等)的化学引诱物。
Northern印迹分析显示MPIF-1、MIP-4和M-CIF在造血起源组织中是优势表达的。
MPIF-1治疗/诊断应用
MPIF-1显示在免疫应答及炎症的控制中起着重要的作用。在图19中，显示脂多糖诱导MPIF-1从人类单核细胞中的表达。从而，由于内毒素的存在，MPIF-1从单核细胞中表达，并因此施用MPIF-1可以用来调节宿主的免疫应答。MPIF-1可以用作抗炎症试剂。
如图10中所示，在THP-1细胞(A)和PBMC(B)上，MPIF-1的化学引诱物活性是显著的。MPIF-1也诱导了THP-1细胞内显著的钙离子迁移(图11)，显示MPIF-1对单核细胞具有生物学作用。进一步，MPIF-1在人类单核细胞内产生剂量依赖的趋化性和钙离子迁移应答。
此外，本发明的多肽在抗肿瘤治疗中是有用的，因为有证据表明注射入肿瘤的趋化因子表达细胞引起肿瘤的退化，例如，在卡波西肉瘤的治疗中。MPIF-1可以诱导细胞分泌TNF-α，一种已知的使肿瘤退化的介质，在这种情况下这种蛋白质可以用于诱导肿瘤的退化。MPIF-1也可诱导人单核细胞分泌其它肿瘤或癌症抑制介质，例如IL-6、IL-1和G-CSF。同样，MPIF-1、MIP-4和M-CIF通过其趋化活性刺激宿主防御(杀肿瘤的)细胞的侵入和活化，例如，细胞毒性T细胞和巨噬细胞，而且以这种方式其也能用于治疗实体瘤。
多肽也可以用来抑制造血细胞的增殖及分化，并因此可以在化学治疗中使用这些多肽来保护骨髓干细胞免于化疗剂的损害。图12和13阐明MPIF-1通过低增殖潜能集落形成细胞(LPP-CFC)抑制集落形成。图14阐明M-CIF特异地抑制M-CSF刺激的集落形成，而MPIF-1不这样。因为MPIF-1和M-CIF两者显著地抑制骨髓细胞的生长和/或分化，所以此抗增殖作用可以允许施用更高剂量的化疗剂，并因此允许更有效的化学治疗。
M-CIF和MPIF-1多肽对定向先祖细胞的亚群(例如粒细胞及巨噬细胞/单核细胞)的抑制作用，可以在治疗上使用以抑制白血病细胞的增殖。
更进一步，发明者已经发现MPIF-1和其变异体(例如MPIF-1Δ23)在体外抑制人骨髓和粒细胞前体的增殖和分化。相似地，动物研究显示MPIF-1Δ23在体外和体内都特异地抑制低增殖潜能-集落形成细胞(LPP-CFC)和粒细胞/单核细胞定向先祖细胞的发育。这些发现指出MPIF-1作为一种化学保护剂具有治疗用途，它可以使早期骨髓先祖免于通常使用的化疗药物的细胞毒作用。
因为MPIF-1及其变异体具有选择性地抑制骨髓先祖细胞的能力，所以MPIF-1能用于治疗骨髓增生疾病例如在临床上密切相关的原发性血小板减少症(ET)、红细胞增多症(PV)或特发性骨髓外化生(AMM)。每种疾病是由单个造血干细胞获得的突变引起的，这种突变给予这种干细胞后代生长优势。这些疾病的病理生理是独特的，其中有不同细胞型的过量产生。在PV中，有红细胞、粒细胞和巨核细胞的过量产生。在ET中，根据定义，有血小板以及白细胞的过量产生。AMM也显示除骨髓纤维化之外的血小板增多或白细胞增多。
可以通过静脉切开放血术去除红细胞提高PV患者的稳定性。然而，没有用于提高ET患者中血小板水平的可比较的治疗。几种髓抑制的治疗已被研究用来降低血小板增多症的危险。用放射性的磷、羟基脲、烷基化试剂(白消安和苯丁酸氮芥)、干扰素或anagrelide的治疗已经全部显示了显著的副作用。特别地，除anagrelide之外的每种髓抑制治疗，都有增加患急性白血病的危险。Anagrelide是一种有希望的治疗。然而，需考虑对Anagrelide相反的反应，并且尚未确定它的慢性细胞毒性潜能。干扰素是目前被认为的二线治疗，因为它昂贵、有副作用及不便的肠胃外施用。这些发现指出这些疾病中仍有对治疗的基本需求。用MPIF-1Δ23预处理然后用5-FU处理的小鼠中的体内研究证明了血小板先祖细胞增殖的抑制。
本发明进一步包含MPIF-1及其变异体协同其它髓抑制疗法及治疗剂的使用。
图15、16和17中应用的细胞谱系的定向细胞被去除，而产生的细胞群与M-CIF和MPIF-1接触，引起细胞Mac-1阳性群减少将近50％，这与图14的结果一致，图14显示M-CIF诱导M-CSF反应的集落形成细胞的抑制。如图17中所示，MPIF-1抑制定向先祖细胞在对IL-3、GM-CSF和M-CSF的反应中形成集落的能力。进一步，如图18所示，MPIF-1的剂量反应显示抑制集落形成。这种抑制可能是由于这些因素介导的分化信号的特异性阻断或由于一种对先祖细胞的细胞毒作用。另外，实施例15和16证明MPIF-1具有体外和体内对化疗药物细胞毒性的髓保护活性。因此，MPIF-1能作为一种髓保护剂用于正在经受化学治疗的患者。
如上所述，由化学治疗和放射治疗产生的一种主要的并发症是非病理学细胞型的破坏。本发明提供在个体中通过抑制骨髓细胞增殖对放射和化疗剂的髓保护的方法。这些方法作为放射治疗或化学治疗制度的一部分，包括对一个个体单独地或者与一种或多种趋化因子一起施用髓抑制量的MPIF-1，这些趋化因子选自巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-2α(MIP-2α)、血小板因子4(PF4)、白细胞介素-8(IL-8)、巨噬细胞趋化及活化因子(MCAF)和巨噬细胞炎性蛋白-相关蛋白-2(MRP-2)。因此本发明的髓抑制的组合物提供髓保护作用，并可与对骨髓细胞有相反作用的疗法协同使用。这是因为本发明的髓抑制组合物将骨髓细胞置于一个慢循环状态，从而对细胞的损害提供保护，这些损害是由例如使用细胞周期活化药物例如阿糖胞苷、羟基脲、5-氟脲嘧啶(5-FU)和阿糖胞苷(Ara-C)的放射治疗或化学治疗引起的。一旦在个体的系统中已经去除化疗药物，那么期望刺激先祖细胞的快速增加及分化，先祖细胞原本是通过MPIF-1使用例如骨髓刺激物如白细胞介素-11(IL-11)、红细胞生成素(EPO)、GM-CSF、干细胞因子(SCF)和血小板生成素(Tpo)保护的。
实施例28证明，在化疗剂存在下，MPIF-1赋予体内髓保护的能力。实施例28显示对个体在施用化疗剂之前、甚至在多个周期的5-Fu治疗后施用MPIF-1都加速血液中血小板的恢复。实施例28所述的实验也证明在多周期的5-Fu治疗期间的MPIF-1处理导致粒细胞的更快恢复。另外，实施例28的结果也建议当共同施用MPIF-1和G-CSF时，它们发挥加成的作用。
如所述的，发明者已经发现，MPIF-1及其变异体显示了对来自骨髓的低增殖潜能集落形成细胞(LPP-CFC)的有效的体外抑制。LPP-CFC是产生粒细胞和单核细胞谱系的双能的造血先祖细胞。MPIF-1也可逆地抑制人CD34+干细胞衍生的粒细胞和单核细胞集落形成细胞的集落形成。发明者的体内化学保护实验已经显示，MPIF-1Δ23保护这些造血先祖可免于药物5-氟脲嘧啶(5-Fu)、阿糖胞苷和Taxol_的细胞毒作用。
在体内化学治疗模型中使用MPIF-1变异体(Δ23)已经显示，它产生骨髓先祖细胞和嗜中性粒细胞和血小板的外周细胞群中的更快恢复。进一步，如实施例16和28中所示，在用5-Fu处理的实验动物中，MPIF-1的施用导致嗜中性粒细胞减少和血小板减少的加速恢复。因此，MPIF-1及其变异体，缩短了与化疗剂相关的骨髓发育不全、粒细胞减少和血小板减少的周期，并因此减少了正经受用这些治疗剂治疗的患者中感染的可能性。
因此，本发明涉及保护骨髓先祖细胞的方法，并涉及血小板和粒细胞的加速恢复，它包括对经受优先地杀死分裂细胞的治疗的个体(例如放射治疗或用细胞周期活化药物的治疗)施用MPIF-1。以足够的数量施用MPIF-1以提供对优先杀死分裂细胞的治疗及治疗剂的体内髓保护。“施用MPIF-1”意思是以治疗有效的量施用MPIF-1、MPIF-1的类似物或其组合。MPIF-1的施用模式在下面详细讨论。
可以在优先杀死分裂细胞的治疗之前、之后或期间施用MPIF-1。在一个优选的实施方案中，在放射疗法或施用细胞周期活化药物之前施用MPIF-1，并且对MPIF-1允许充足的时间以抑制骨髓细胞的增殖。本发明进一步预期的是在优先杀死分裂细胞的多周期治疗期间，使用MPIF-1以保护骨髓细胞。在此情况下，在治疗或治疗制度中于不同时点，可以以单剂量施用或多剂量施用MPIF-1。
如上所述，可以单独或与一种或多种骨髓刺激物连同使用MPIF-1。骨髓刺激物当前在本领域中用于经受放射治疗或用细胞周期活化药物治疗个体中的骨髓细胞缺失之后，以刺激骨髓细胞的增殖。见例如Kannan，V.等人，国际放射肿瘤生物生理学杂志(Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.)37：1005-1010(1997)；Engelhardt，M.等人，骨髓移植(BoneMarrow Transplant)19：529-537(1997)；Vadhan-Raj，S.等人，国际医学年报(Ann Intern Med.)126：673-681(1997)；Harker，L.等人，血液89：155-165(1997)；Basser，R，等人，柳叶刀(Lancet)348：1279-1281(1996)；Grossman，A，等人，血液88：3363-3370(1996)；Gordon，M.等人，血液87：3615-3612(1996)。例如，可以在杀死分裂细胞的治疗之前施用MPIF-1，及在这种治疗的过程之后或期间施用一种或多种骨髓刺激物。在此情况下，MPIF-1将在治疗中保护骨髓细胞，然后骨髓刺激物的施用将导致保护的骨髓细胞群的扩充。
一般以治疗有效量给正经受化学治疗的患者施用骨髓刺激物。药用制剂和施用方式可以随许多因素而不同，这些因素包括治疗的个体、被刺激的细胞的条件、在化学治疗方案中的治疗的阶段和使用的骨髓刺激物。例如，GM-GSF和G-CSF的治疗有效的剂量分别是大约1μg/kg和5-10μg/kg体重，而且可以通过皮下注射每日施用。见例如Kannan，V.等人，国际放射肿瘤生物生理学杂志37：1005-1010(1997)；Engelhardt，M.等人，骨髓移植19：529-537(1997)；Sniecinski，I.等人，血液89：1521-1528(1997)。可以以高达10μg/kg体重的剂量通过每日皮下注射施用IL-11。然而，Gordon，M.等人，(出处同前)认为低于10μg/kg的IL-11的剂量在减少化学治疗诱导的血小板减少方面是有效的。可以以0.3-2.5μg/kg体重的剂量通过静脉注射施用Tpo。见，例如，Vadhan-Raj，S.等人，国际医学年报126：673-681(1997)；Harker，L.等人，血液89：155-165(1997)。本领域技术人员应认识到，优化的药用制剂和施用方式将随许多包括上述因素而不同。额外的骨髓刺激物的药用制剂和施用方式在本领域内是已知的。
骨髓刺激物施用的时间选择作为包括优先地杀死分裂细胞的治疗规程的一部分，也随上述药用制剂和施用方式的因素而不同。已经发表许多报告，公开了骨髓刺激物作为包括放射治疗或细胞周期活化药物的治疗的一部分对个体的施用。Vadhan-Raj，S.等人，(出处同前)，例如，报道了在化疗剂施用之前3周单一静脉内施用Tpo的应用。Papadimitrou，C.等人，癌症(Cancer)79：2391-2395(1997)和Whitehead，R等人，临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)15：2414-2419(1997)报道了包括数周过程的施用化疗剂的化学治疗方法。在每种情况下，是在化学疗剂治疗的第一天之后和最后一天之前在多个时点施用G-CSF。在Gordon，M.等人，(出处同前)，和Michael，M.等人，美国临床肿瘤学杂志(Am.J.Clin.Oncol.)20：259-262(1997)中，报道了IL-11和GM-CSF两者的相似的用法。然而，本领域的一名技术人员将认识到，骨髓刺激物施用的最佳时间选择将随使用的特定骨髓刺激物及其施用的条件而不同。
因此，施用骨髓刺激物以减轻优先杀死分裂细胞的治疗对于骨髓细胞的细胞毒作用，在本领域内是已知的。可以通过几个路线施用骨髓刺激物，包括静脉内和皮下注射。施用的骨髓刺激物的浓度随着多个因素变化很大，但通常为0.1到100μg/kg体重，并且可以在化学治疗或放射治疗方案中在不同时点以单剂量或多个剂量施用。然而，通常在化疗剂或放射治疗施用之前或之后施用骨髓刺激物。本领域的技术人员将懂得，使用骨髓刺激物的条件将随特定的骨髓刺激物和治疗方案而不同。
熟练的技术人员将理解，可如上所述使用MPIF-1来增强造血生长因子总的效力。这些造血生长因子包括刺激红细胞产生的红细胞生成素和IL-3，一种刺激更原始的干细胞的多谱系生长因子，因此增加全部血细胞型的数量。其它包括干细胞因子；GM-CSF；及G-CSF和红细胞生成素的杂交分子；IL-3和SCF；和GM-CSF和G-CSF。
本发明的髓抑制的药物组合物也可用于引起过度增殖骨髓细胞状态的白血病治疗。因此，本发明进一步提供治疗白血病的方法，它包括对白血病患者单独或与一种或多种趋化因子一起施用髓抑制量的MPIF-1，趋化因子选自MIP-1α、MIP-2α、PF4、IL-8、MCAF和MRP-2。
“抑制骨髓细胞增殖”是指减低骨髓的细胞增殖和/或增加在慢循环阶段骨髓细胞的百分比。如上，“个体”意指哺乳动物，优选地是人。本发明的髓抑制组合物与乙腈(ACN)预温育显著地增强这些趋化因子抑制骨髓先祖细胞的特异活性。因此，优选地，在施用前，用CAN对本发明的髓抑制组合物预先处理，如Broxmeyer H.E.等人，血液学年报(Ann-Hematol.)71(5)：235-46(1995)和PCT公开WO94/13321中所描述，其全部公开内容在此引入作为参考。
本发明的髓抑制组合物可以与许多化疗剂结合使用，这些化疗剂包括烷基化试剂如氮芥、氮丙啶、甲基三氯氰胺、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗代谢物如叶酸类似物、嘧啶类似物，特别是氟脲嘧啶和阿糖胞苷、以及嘌呤类似物；自然产物如长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、酶和生物学反应调节物；以及混杂产物如铂配位复合物、蒽二酮、取代的脲如羟基脲、甲肼衍生物和肾上腺皮质激素抑制物。
可以根据已知技术以已知的浓度施用化疗剂。本发明的髓抑制组合物可以在化学治疗施用之前或之后与化学治疗剂联合施用、或分开施用。
某些趋化因子例如MIP-1β、MIP-2β和GRO-α阻碍(至少部分阻断)本发明的髓抑制组合物的髓抑制作用。因此，在进一步的实施方案中，本发明提供阻碍髓抑制的方法，包括对早先单独或与一个或多个MIP-1α、MIP-2α、FP4、IL-8、MCAF和MRP-2一起接触髓抑制试剂MPIF-1的哺乳动物，施用选自MIP-1β、MIP-2β和GRO-α的有效量的髓抑制阻碍物。
一名普通的技术人员将理解，对于治疗需要升高水平的MPIF-1活性(包括对髓抑制有效的MPIF-1多肽量，含或不含髓抑制剂或髓抑制阻碍物)的个体所用的MPIF-1多肽的有效量，对于指定MPIF施用的每种情况，MPIF-1的量完全根据经验确定。具有MPIF-1活性的多肽可以在药物组合物中与一种或多种药学可接受的赋形剂结合施用。
MPIF-1也可以通过诱导编程性细胞死亡用于治疗白血病及异常增殖细胞例如肿瘤细胞。MPIF-1在造血先祖细胞群上诱导编程性细胞死亡。
MPIF-1可以通过暂时阻止其分化，用于未成熟造血先祖细胞例如粒细胞、巨噬细胞或单核细胞的膨胀。这些骨髓细胞可以在体外培养。因此，为了骨髓移植和/或基因治疗，MPIF-1也能用作体外造血干细胞的调节剂。因为干细胞很少，并对将基因引入用于基因治疗最有用，所以MPIF-1可以用于分离于细胞的富集群。能够在细胞毒素如快速杀死分裂细胞的5-Fu存在下通过培养细胞富集干细胞，而MPIF-1可保护干细胞。这些干细胞能够返回骨髓移植患者或然后用于期望基因的转染的基因治疗。另外，可以将MPIF-1注射入个体，导致干细胞从个体的骨髓释放入外周血。为了进行自体骨髓移植或基因治疗的操作，可分离这些干细胞。在患者已经完成化学疗法或放射治疗之后，可以将分离的干细胞返回给患者。
另外，因为MPIF-1对T-淋巴细胞及巨噬细胞有作用，所以MPIF-1可以增强抗原呈递细胞(APC)接纳病毒、细菌或其它外来物质、加工并呈送给负责免疫应答的淋巴细胞的能力。MPIF-1也可以调节APC与T-淋巴细胞和B淋巴细胞的相互作用。MPIF-1可以在抗原呈递期间提供共同刺激信号，指导应答细胞存活、增殖、分化、分泌其它细胞因子或可溶性介质、或通过诱导编程性细胞死亡或其它细胞死亡机制选择性地清除应答细胞。因为已经显示APC促进HIV向CD4＋T淋巴细胞的转移，所以MPIF-1也可影响这种能力并防止淋巴细胞被通过APC介导的HIV或其它病毒感染。对于APC、T淋巴细胞或其它细胞型被HIV、EBV或任何其它这些病毒的初始感染，也是如此。
另外，最近证明MIP-1α受体作为在促进HIV侵入人单核细胞或T淋巴细胞中的辅因子，这引起了令人感兴趣的可能性即MPIF-1或其变异体可能干预HIV侵入细胞的过程(见实施例17)。因此，，MPIF-1能用作对通过MIP-1α受体促进其侵入的病毒或反转录病毒的抗病毒剂。
通过刺激T淋巴细胞对抗细菌及病毒感染、以及其他外来物体的内在活性，MPIF-1可以作为一种免疫增强因子。对于外来抗原的正常反应，如变态反应感染以及对肿瘤包括实体瘤和白血病或良性肿瘤生长的免疫应答，这样的活性是有用的。
因为这些原因，本发明可用于对在哺乳动物(优选是人)中许多免疫系统-相关疾病的诊断或治疗。这些疾病包括肿瘤、癌症和任何免疫细胞功能的失调，包括但不限于自身免疫病、关节炎、白血病、淋巴瘤、免疫抑制、脓毒症、创伤愈合、急性及慢性感染、细胞介导的免疫、体液免疫、炎性肠病、髓抑制等等。
M-CIF治疗/诊断应用
M-CIF活性可用于免疫增强或抑制、髓保护、干细胞迁移、急性和慢性炎症控制及白血病的治疗。另外，因为M-CIF对T淋巴细胞和巨噬细胞有作用，所以M-CIF增强抗原呈递细胞(APC)接纳病毒、细菌或其它外来物质、加工并呈送给负责免疫应答的淋巴细胞的能力。另外，MPIF-1也调节APC与T-淋巴细胞和B淋巴细胞的相互作用。例如，M-CIF可以在抗原呈递期间提供共同刺激信号，指导应答细胞存活、增殖、分化、分泌其它细胞因子或可溶性介质，或通过诱导编程性细胞死亡或其它细胞死亡机制选择性地清除应答细胞。因为已经显示APC促进HIV向CD4＋T-淋巴细胞的转移，所以M-CIF也影响这种能力并阻止淋巴细胞被HIV或通过APC介导的其它病毒感染。对于APC、T-淋巴细胞或其它细胞型被HIV、EBV或任何其它这些病毒的初始感染，也是如此。
M-CIF抑制免疫系统
作为一种机制，人们相信，M-CIF通过CTLA-4下调T淋巴细胞的活性。T细胞的活化及随后的分化需要来自APC的两种信号。这两种信号之一是非抗原依赖的信号，它是由T细胞表面分子CD28与APC上B7家族的成员接合所介导的。Allison，免疫学当前观点(Curr.Opin.Immunol.)6：44(1994)；June等人，今日免疫学(Immunol.Today)15：321(1994)。与CD28相反，CTLA-4对T细胞反应的下调十分关键。Waterhouse等人，科学270：985(1995)。最近的研究建议T细胞活化的结果是通过来自CD28的阳性信号和来自CTLA-4的阴性信号间的一种微妙平衡的相互作用所确定的。Waterhouse，等人，科学270：985(1995)。许多研究的累积结果提示CTLA-4阻碍的去除(相反，CTLA-4的聚集)提供下调T细胞应答的抑制信号。Allison等人，科学，270：932-933(1995)。另外，CTLA-4敲除鼠的表型支持CTLA-4在T细胞应答调节中的抑制信号作用。Allison等人，科学，270：932-933(1995)。M-CIF似乎诱导CTLA-4细胞，如上所讨论的，CTLA-4是一种已知的T细胞下调物。另外，M-CIF直接抑制也是一种已知的T细胞下调物的CD8＋T细胞。
M-CIF下调T细胞的能力可用于调节对来自细菌或病毒感染及变态反应的外来抗原的免疫应答，以及对于包括实体瘤及白血病的肿瘤或良性生长的免疫应答。
因为这些原因，本发明可用于对在哺乳动物(优选是人)中许多免疫系统相关的疾病的诊断或治疗。这些疾病包括肿瘤、癌和任何免疫细胞功能失调的疾病，它包括但不限于自身免疫病，关节炎、哮喘、白血病、淋巴瘤、免疫抑制、脓毒症、创伤愈合、急性及慢性感染、细胞介导的免疫、体液免疫、炎性肠病、髓抑制，等等。
M-CIF作为一种抗炎因子，可以用于治疗例如但不限于包括TNFα的异常产生的那些疾病。这些疾病包括但不限于脓毒综合征，包括恶病质、循环性虚脱及休克，它们是由急性或慢性细菌性感染、急性和慢性寄生虫或感染性过程包括细菌、病毒和真菌感染引起的，急性和慢性免疫和自身免疫病理如系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎，乙醇-诱导的肝炎，慢性炎性病理如结节病和阶段性回肠炎病理、血管炎性病理例如弥漫性血管内凝血、移植物抗宿主病理、川崎病；恶性病理，包括分泌TNF的肿瘤和神经退行性疾病。
神经退行性疾病包括但不限于，AIDS痴呆综合症、脱髓壳髓鞘疾病，如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎；锥体外系及小脑失调疾病例如脊髓皮质系统损伤；基底神经节或小脑失调疾病；运动功能亢进的运动失调例如Huntington舞蹈病和老年性舞蹈病；药物-诱导的运动失调，如由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的；运动功能减退的运动疾病如帕金森氏病；渐进性核上麻痹；小脑结构性损伤；脊髓小脑变性，如脊髓共济失调、Friedreich运动失调，小脑皮层变性，多系统变性(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)；系统性紊乱(Refsum’s疾病，无β-脂蛋白血症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体的多系统紊乱)；脱髓鞘核紊乱例如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎；以及运动原单位紊乱如神经性肌肉萎缩(前角细胞变性，例如肌萎缩的侧部硬化症、婴儿脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；Alzheimer氏病；中年的先天愚型；弥散性Lewy躯体疾病；Lewy躯体型老年性痴呆；Wernicke-Korsakoff综合征；慢性酒精中毒；Creutzfeldt-Jackob疾病；亚急性硬化性全脑炎Hallerrorden-Spatz疾病；和拳击员痴呆。一种优选的神经变性性疾病是多发性硬化症。
见例如Berkow等人编，《Merck手册》，第16版，Merckand Co.，Rahway，N.J.，1992，其参考文献及在此引用的参考文献，在此全部引入作为参考。
如上所述，M-CIF也可用于治疗SLE和参与免疫应答及炎症的其它疾病状况。SLE是一种自身免疫性疾病，导致能够诱导肾小球性肾炎和血管炎的补体-结合免疫聚集的形成。Steinberg，A.D.和Klinman，D.M.，北美风湿性疾病临床(Rheum.Dis.Clinics of No.Amer.)14：25(1998)。许多试剂当前正用于、或准备用于治疗SLE以及均与狼疮相关的肾小球性肾炎和血管炎。这些试剂中有具有免疫应答诱导需要的针对细胞表面受体特异性的抗体。例如，抗CD-11a和抗CD-54单克隆抗体已经显示在治疗实验性狼疮肾炎中有效。Koostra，C.J.等人，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)108：324-332(1997)。也已经提议阻断CD28/CTLA-4与其配体(例如CD80和CD86)之间相互作用可作为抑制与狼疮相关的免疫应答的一种方法，而且CD80和CD86特异性单克隆抗体的施用在实验动物模型中已经显示阻止狼疮的发展和进行。Nakajima，A.等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)25：3060-3069(1995)。化学试剂也已经显示在SLE和均与狼疮相关的肾小球性肾炎和血管炎的治疗中具有治疗作用。这些试剂包括抗叶酸化合物(例如氨甲喋呤和MX-68)及免疫抑制剂(例如皮质类固醇、环磷酰胺、霉酚mofetil、咪唑硫嘌呤)。Corna，D.等人，国际肾脏病51：1583-1589(1997)；Mihara，M等人，变态反应与免疫学国际档案(Int.Arch.Allergy Immunol.)；Gansquge，S.等人，风湿性疾病年报(Ann.Rheum.Dis.)56：382-385(1997)。其它试剂对治疗与非狼疮相关免疫复合物相关的疾苦有治疗作用。这些化合物中的两类是自由基清除剂(例如OPC-15161)和血管紧张肽转化酶抑制剂(例如奎宁颗粒)。Sanaka，T.等人，肾单位(Nephron)76：315-322(1997)；Ruiz-Ortega，M.等人，美国肾脏学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)8：756-768(1997)。
如实施例19和29所示，M-CIF抑制与细胞介导免疫相关的肾炎症，并改善狼疮相关肾炎的发展。因此本发明提供治疗SLE以及其他涉及免疫应答的疾病(例如由细胞介导免疫和免疫复合物的形成产生的疾病)的方法，包括对需要的患者施用M-CIF。M-CIF可以作为单独的免疫应答调节剂施用，或可以与一种或多种调节免疫应答的其它治剂联合施用。
因此，MPIF-1、MIP-4和M-CIF能够通过控制靶免疫细胞对创伤区的浸润用于促进创伤愈合。以相似的方式，本发明的多肽能通过对杀微生物的白细胞的吸引和激活，增强宿主对慢性感染如分支杆菌的防御。
本发明的多肽和编码这些多肽的多核苷酸可以用作研究试剂，用于与科学研究、DNA合成及DNA载体制备相关的体外目的，以及用于发展对人类疾病治疗的治疗学和诊断学目的。例如，M-CIF和MPIF-1可以通过暂时阻止其分化，用于未成熟造血先祖细胞如粒细胞、巨噬细胞或单核细胞的膨胀。这些骨髓细胞可以在体外培养。
多肽的另一个用途是通过抑制IL-2生物合成抑制T细胞增殖，例如，在自身免疫疾病及淋巴细胞白血病中。
因为已经发现皮肤中的郎格汉斯细胞产生MIP-1α，所以MPIF-1、MIP-4和M-CIF也能用于抑制表皮角质化细胞的增殖，这在银屑病(角质化细胞过度增殖)中有用。
MPIF-1、MIP-4和M-CIF能通过碎片清除复原和相连的组织促进炎性细胞以及通过控制过度的TGFβ-介导的纤维化，用于预防在创伤愈合中结疤，另外，因为MPIF-1、MIP-4和M-CIF增加血管通透性，这些多肽能用于治疗休克、血小板增多、肺栓塞和骨髓增生性疾病。药物组合物
MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽药物组合物包括，对增加个体中MPIF-1、M-CIF或MIP-4活性水平有效的量的本发明的分离MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽，尤其是成熟形式的MPIF-1、M-CIF或MIP-4。考虑到个体患者的临床条件(特别是用MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽单独治疗的副作用)，以及MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽组合物送递的部位、施用方法、施用日程以及其他医生知道的因素，能够以与优良的医学实践相符的方式配制和施用这些组合物。因此，为了此处的目的，MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的“有效量”是经这些考虑所确定的。
本发明的多肽、拮抗物或激动剂能够与合适的药物载体结合使用。这些组合物包括治疗有效量的蛋白质和药学可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。制剂应适合施用模式。
“药学可接受的载体”意思是无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释剂、胶囊物质或任何类型的辅助制剂。在此使用的术语“肠胃外的”指的是施用模式，包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下及关节内注射及灌注。
MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽也通过持续的释放系统适当地施用。持续释放组合物的适当的实例包括以定形的物体如膜或微胶囊的形式的半渗透性多聚体基质。持续释放基质包括聚交酯(美国专利号3,773,919，EP58，481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸共聚物(Sidman，U.等人，生物多聚体(Biopolymers)22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基异丁烯酯)(R.Langer等人，生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)15：167-277(1981)，和R.Langer，化学技术(Chem.Tech.)12：98-105(1982))，乙烯乙烯基乙酸盐(R. Langer.等人，出处同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽组合物也包括脂质体捕获的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽。包含MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的脂质体是通过下面自身已知的方法制备的：DE 3,218,121；Epstein等人，美国国家科学院学报82：3688-3692(1985)；Hwang等人，美国国家科学院学报77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请(Japanese Pat.Appl.)83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。通常，脂质体是小的(大约200-800埃)单层类型，其中脂含量大于约30mol.百分胆固醇，调整所选的部分用于最佳的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽治疗。
对于肠胃外施用，在一个实施方案中，MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的配制通常是将其以一个单位剂量可注射的形式(溶液、悬液或乳液)，以期望的纯度与药学可接受的溶剂混合，即溶剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并可与制剂的其它成分配伍。例如，制剂优选地不包括氧化剂和其它已知对多肽有害的化合物。
通常，制剂的制备是将MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽与液体溶剂或精细分开的固体载体或两者都有均匀地密切地接触。然后，如果必要，产物定形为期望的制剂。优选地溶剂是肠胃外溶剂，更优选地是与接受者的血液等渗的溶液。这种载体溶剂的实例包括水、盐水、林格溶液和右旋糖溶液。在此也用非水溶剂如不挥发油和油酸乙酯以及脂质体。
溶剂适当地包含较小数量的添加剂如增强等渗性和化学稳定性的物质。这些材料在使用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸及其他有机酸或其盐类的缓冲液；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(小于约十个残基)多肽，例如多精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性多聚体如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、双糖及其它糖类包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；平衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如多山梨酸酯，聚羟亚烃(poloxamers)或PEG。
一般以大约0.1mg/ml到100mg/ml、优选地1-10mg/ml的浓度，以大约pH3-8，在这些溶剂中配制MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽。应当理解，上述的某些赋形剂、溶剂或稳定剂的使用将导致MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽盐的形成。
作为化学治疗方案的一部分，当MPIF-1和/或其变异体作为髓保护剂施用治疗人过度增生性疾病时，静脉内施用的合适的剂量是0.01μg/kg到10μg/kg体重。进一步，可以以0.1、1.0、10和100μg/kg体重的剂量静脉内施用MPIF-1。用来自动物研究的资料外推指出，在人中用于髓保护的MPIF-1合适剂量是0.016μg/kg体重。
进一步，MPIF-1和/或其变异体可以每日一次施用特定的天数(如3天)。另外，当用于化学治疗方案中时，可以在化疗剂的施用之前对人施用MPIF-1。例如，可以在化学疗剂施用的两天之前、一天之前及当天施用MPIF-1。
当对人施用MPIF-1和/或其变异体用于髓增生疾病的治疗时，施用的剂量可以与MPIF-1用作髓保护剂时相同。当对人施用MPIF-1用于髓增生疾病的治疗时，可以皮下施用。
用于治疗性施用的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽必须是无菌的。通过无菌滤膜(例如，0.2微米膜)过滤容易达到无菌。治疗性MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽组合物通常置于有无菌入孔的容器中，例如，静脉内溶液袋或具有可用皮下注射针头穿孔的塞子的小瓶。
MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽通常以水溶液的形式或用于重构的冻干制剂的形式贮存于单元或多-剂量的容器中，例如，密封的安瓿或小瓶。冻干制剂的一个实例，是用5ml无菌过滤的1％(w/v)MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽水溶液装满10ml小瓶，冻干所得的混合物。使用抑菌的注射用水重构冻干的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽来制备输注溶液。
本发明也提供药物包装和试剂盒，它们包含装满一种或多种本发明的药物组合物成分的一个或多个容器。与这些容器结合的可以是以政府机构规定的形式存在的通告，该政府机构调控药物或生物产品的制造、使用或销售，此通告反映制造、使用或销售机构已批准对人施用。另外，本发明的多肽也可与其它治疗化合物结合使用。施用模式
应当理解，个体中由于MPIF-1、M-CIF或MIP-4活性的标准或正常水平的降低引起的病症，能通过MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质的施用来治疗。因而，本发明进一步提供一种治疗方法，治疗需要提高水平的MPIF-1、M-CIF或MIP-4活性的个体，包括对此个体施用药物组合物，药物组合物包含本发明的有效量的分离MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽，尤其是成熟形式的MPIF-1、M-CIF或MIP-4，它对提高此个体的MPIF-1、M-CIF或MIP-4活性水平是有效的。
对患者施用的MPIF-1、MIP-4和M-CIF的量和用药方法依赖于许多因素，如施用模式、所治疗病症的本质和开处方医生的判断。以对特异指征的治疗和/或预防有效的量施用药物组合物。通常，以至少约10μg/kg体重的量施用多肽，在大多数情况下，以每天不超过约10mg/kg体重的量施用，优选的剂量是每天约10μg/kg体重，同时应考虑施用途径、症状等等。
作为一般建议，每次用药时肠胃外施用的MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽的总药物有效量，更优选的是约1μg/kg/天到10mg/kg/天患者体重，尽管如上指出这将服从于治疗判断。甚至更优选地，此剂量是至少0.01mg/kg/天，对人最优选的是约0.01到1mg/kg/天。如果连续给药，一般以约1μg/kg/小时到约50μg/kg/小时的剂量率施用MPIF-1、M-CIF或MIP-4多肽，方法是每天注射1-4次或连续皮下输注，例如使用微型泵。也可使用一种静脉内袋溶液。要观察所需的治疗长度、和治疗之后出现应答的间隔，这似乎根据希望的效果而不同。
包含本发明的MPIF-1、M-CIF或MIP-4的药物组合物的施用可以是口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如经粉剂、软膏、滴剂、透皮途径、颊、或作为口或鼻喷雾。基因治疗
依照本发明，通过这些多肽在体内的表达，可使用趋化因子多肽、和本身是多肽的激动剂或拮抗物，这通常称作“基因治疗”。
因此，例如，能用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)离体改造患者的细胞，然后把改造的细胞提供给患者以用多肽治疗。这些方法在本领域众所周知。例如，可以用本领域已知的方法，通过使用包含编码本发明多肽的RNA的反转录病毒颗粒来改造细胞。
同样，能通过例如本领域已知的方法在体内改造细胞，用于多肽在体内的表达。如本领域所知，可对患者施用产生含编码本发明多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞，用于在体内改造细胞和多肽在体内的表达。本发明所讲的、用这些方法施用本发明多肽的这些和其它方法对熟练技术人员来说是显而易见的。例如，用于改造细胞的表达载体可以不是反转录病毒，例如，是腺病毒，它能在结合合适的送递载体后用于在体内改造细胞。
反转录病毒质粒载体可衍生自反转录病毒，包括但不限于莫洛尼鼠类肉瘤病毒、莫洛尼鼠类白血病毒、脾坏死病毒、劳斯肉瘤病毒和Harvey肉瘤病毒。
在一个优选的实施方案中，反转录病毒表达载体pMV-7的侧翼是莫洛尼鼠类肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)，并且包含在单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(tk)启动子调节下的选择性药物抗性基因neo。单一的EcoR1和HindIII位点利于编码序列的引入(Kirschmeier，P.T.等人，DNA 7：219-25(1988))。
这些载体包括一个或多个合适的启动子，包括但不限于反转录病毒LTR；SV40启动子；和Miller等人，生物技术，卷7，NO.9：980-990(1989)中描述的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或任何其它启动子(例如，细胞启动子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、PolIII和β-肌动蛋白启动子)。在此所讲的、合适的启动子的选择对于熟练技术人员来说是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列位于合适的启动子控制之下，这些启动子包括但不限于，病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹胸苷激酶启动子；反转录病毒LTR、β-肌动蛋白启动子和控制编码多肽的基因的天然启动子。
反转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞的实例包括但不限于，PE501、PA317和GP＋am12。可通过本领域已知的任何方法使载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于电穿孔法、脂质体的使用和CaPO4沉淀。
生产细胞系产生包含编码多肽的核酸序列的感染性反转录病毒载体颗粒。然后可使用这些反转录病毒载体颗粒，在体内或体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞。
将参照以下实施例进一步描述本发明；然而，应该理解，本发明不限于这些实施例。除非另外指出，所有部分或数量都以重量表示。
为了便于理解以下实施例，将描述某些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”命名为之前和/或之后是大写字母和/或数字的小写p。在此的起始质粒是商业可获得的、在非限制基础上可公开获得的、或依照公开的方法从可获得的质粒构建而成的。另外，与所述相同的质粒在本领域中已知，并且对普通技术人员来说是显而易见的。
DNA“消化”指用仅作用于DNA特定序列的限制酶对DNA的催化切割。在此使用的多种限制酶是商业可获得的，并且使用其的反应条件、辅因子和其它要求如普通技术人员所知。用于分析目的，一般在约20μl缓冲液中对1μg质粒或DNA片段使用大约2单位的酶。为了分离DNA片段用于质粒构建，一般在较大体积中用20到250单位的酶消化5到50μg的DNA。厂商指定了用于特定限制酶的适当的缓冲液和底物量。通常使用37℃约1小时的温育时间，但依照使用说明可以不同。消化后将反应液直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，分离希望的片段。
使用Goeddel，D.等人，核酸研究8：4057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行酶切片段的大小分离。
“寡核苷酸”指单链多脱氧核苷酸或能由化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸没有5’磷酸，因而，如果不在激酶的存在下用ATP添加磷酸，则将不能与另一个寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与未被去磷酸化的片段连接。
“连接”指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的方法(Maniatis，T.等人，Id.146页)。除非另外指出，可使用已知缓冲液和条件完成连接，每0.5μg大约等摩尔量的DNA片段用10单位T4DNA连接酶连接。
除非另外说明，如Graham，F.和Vander Eb，A.，病毒学(Virology)52：456-457(1973)的方法所述进行转化。
现已大体描述了本发明，通过参照以下实施例更易理解本发明，实施例是以例子的形式提供的，并且不是本发明的限制。
实施例1MPIF-1的细菌表达和纯化
使用对应于已加工MPIF-1蛋白质(除去信号肽序列)的5’端序列及MPIF-1基因3’端载体序列的PCR寡核苷酸引物，初始扩增编码MPIF-1、ATCC#75676的DNA序列。分别对5’和3’序列添加对应于BamHI和XbaI的附加核苷酸。5’寡核苷酸引物具有序列5’-TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA-3’(SEQ ID NO：12)，包含一个BamHI限制酶切位点，随后是18个核苷酸的MPIF-1编码序列，它开始于已加工蛋白质密码子的假定的末端氨基酸。3’序列5’-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：13)包含与一个XbaI位点的互补序列。
限制酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA)上的限制酶切位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-调节的启动子操纵基因(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-His标志和限制酶切位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。将扩增序列连接入pQE-9，并符合读框地插入编码组氨酸标志和RBS的序列。然后用连接混合物转化可从Qiagen获得的大肠杆菌株M15/rep4。M15/rep4包含多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻抑物，也赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据它们在LB平板上生长的能力鉴定转化子，筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA，并通过在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)限制酶切分析对其进行确定。使用O/N培养物以1∶100到1∶250的比例接种入大量培养基。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖苷”)至1mM的终浓度。IPTG的诱导是通过使lacI阻抑物失活、清除P/O引起增强的基因表达。细胞再生长3到4个小时。然后离心收获细胞。细胞沉淀溶解于离液剂6M盐酸胍中。澄清后，在允许含6-His标志的蛋白质紧密结合的条件下，经镍-螯合柱色谱从此溶液中纯化溶解的MPIF-1。 Hochuli，E.等人，色谱杂志(J.Chromatography)411：177-184(1984)。以6M盐酸胍pH5.0从柱上洗脱MPIF-1(95％纯)，为了复性将其调节至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型)。在此溶液中温育12小时后，蛋白质对10mM磷酸钠透析。
备择地，使用以下非标记引物将基因克隆至质粒pQE70：
5′引物5′CCC GCA TGC GGG TCA CAA AAG ATG CAG3′(SEQ ID NO：14)
                SphI
3′引物5′AAA GGA TCC TCA ATT CTT CCT GGT CTT3′(SEQ ID NO：15)
                BamHI    终止大肠杆菌优化的MPIF-1的构建
为了提高MPIF-1在大肠杆菌表达系统中的表达水平，将基因的密码子优化为高度使用的大肠杆菌密码子。为了MPIF-1优化区的合成，制备一系列4个寡核苷酸：mpif-1 oligo 1-4号(以下列出)。在PCR反应中使用这些重叠的寡核苷酸，以下条件七个循环：
变性  95度  20秒
退火  58度  20秒
延伸  72度  60秒
7个循环的合成后，将对应此区的5’引物(ACA TGC ATG CGUGUU ACC AAA GAC GCU GAA ACC GAA UUC AUG AUG UCC(SEQ ID NO：16))和对应完整区的3’引物(GCC CAA GCT TTCAGT TTT TAC GGG TTT TGA TAC GGG(SEQ ID NO：17))加入包含六种寡核苷酸1微升初始反应液的PCR反应中。使用以下条件扩增此产物30个循环：
变性  95度  20秒
退火  55度  20秒
延伸  72度  60秒
用SphI和HindIII限制酶切此终反应产生的产物，克隆至也用SphI和HindIII酶切的pQE70。表达这些克隆，发现没有以上突变的克隆具有较高的表达水平。
mpif寡核苷酸编号1：
5′GCA TGC GUG UUA CCA AAG ACG CUG AAA CCG AAU UCA UGA UGU
CCA AAC UGC CGC UGG AAA ACC CGG UUC UGC UGG ACC GUU UCC ACG
C3′(SEQ ID NO：18)
mpif-1寡核苷酸编号2：
5′ GCU GGA AUC CUA CUU CGA AAC CAA CUC CGA AUG CUC CAA ACC
GGG UGU UAU CUU CCU GAC CAA AAA AGG UCG UCG UUU CUG CGC UAA
CCC GUC CGA CAA ACA GG3′(SEQID NO：19)
mpif1 寡核苷酸编号3：
5′AAG CTT TCA GTT TTT ACG GGT TTT GAT ACG GGT GTC CAG TTT CAG
CAT ACG CAT ACA AAC CTG AAC CTG TTT GTC GGA CGG GTT AGC GC 3′
(SEQ ID NO：20)
mpif-1寡核苷酸编号4：
5′ GGT TTC GAA GTA GGA TTC CAG CAG GGA GCA CGG GAT GGA ACG
CGG GGT GTA GGA GAT GCA GCA GTC AGC GGA GGT AGC GTG GAA ACG
GTC CAG C3′(SEQ ID NO：21)MPIF-1缺失突变体的构建
使用上述大肠杆菌优化的MPIF-1构件从MPIF-1基因5’端构建缺失突变体。用来构建5’缺失的引物在以下列出。如以上对大肠杆菌优化的MPIF-1构件所述进行PCR扩增。用NcoI限制酶切Delta17-Aqe6、Delta23、Delta28产物的5’位点，用HindIII酶切3’位点，克隆至用NcoI和HindIII消化的质粒pQE60。用SphI限制酶切所有其它产物的5’位点，用HindIII酶切3’位点，克隆至用SphI和HindIII消化的质粒pQE70。
使用的5’引物如下：
Delta 17-A qe6(pQE60)
5′NcoI gc gcag ccatgg aa aac ccg gtt ctg ctg gac 3′(SEQ ID NO：22)
        所得此缺失突变体的氨基酸序列
MENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGR
RFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQ ID NO：23)
Delta 16-A qe7(pQE70)
5′SphI gc cat g gcatgc tg gaa aac ccg gtt ctg ctg gac(SEQ ID NO：24)
        所得此缺失突变体的氨基酸序列
MLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKG
RRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQ ID NO：25)
Delta 23(pQE60)
5′NcoI gc gca g ccatgg ac cgt ttc cac gct acc tcc(SEQ ID NO：26)
        所得此缺失突变体的氨基酸序列
MDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANP
SDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQ ID NO：27)
Delta 24(pQE70)
5′SphI gcc atg gcatgc gtt tcc acg cta cct cc(SEQ ID NO：28)
       所得此缺失突变体的氨基酸序列
MRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPS
DKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQ ID NO：8)
Delta28 (pQE60)
5′NcoI gcg cag ccatgg cta cct ccg ctg act gct gc(SEQ ID NO：29)
    所得此缺失突变体的氨基酸序列
MATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFETNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQ
VQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQ ID NO：30)
S70变为A的突变体(位于70位点的Ser突变为Ala)(pQE70)
反义    ttc gaa gta ggc ttc cag cag(SEQ ID NO：31)
有义ctg ctg gaa gcc tac ttc gaa(SEQ ID NO：32)
5′SphI full gcc atg gcatgc gtg tta cca aag acg ctg aaa cc(SEQ ID NO：33)
      所得此缺失突变体的氨基酸序列
MRVTKDAETEFMMSKLPLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLEaYFE
TNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQID
NO：34)
用于所有构件的3’引物：
3′HindIII
gcc c aagctt tca gt ttt tac ggg ttt tga tac ggg(SEQ ID NO：35)
全长MPIF-1序列(来自大肠杆菌偏好性的nt)
MRVTKDAETEFMMSKLPLENPVLLDRFHATSADCCISYTPRSIPCSLLESYFE
TNSECSKPGVIFLTKKGRRFCANPSDKQVQVCMRMLKLDTRIKTRKN(SEQID
NO：7)
实施例2MIP-4的细菌表达和纯化
使用对应于已加工MIP-4蛋白质(除去信号肽序列)的5’序列的PCR寡核苷酸引物初始扩增编码MIP-4ATCC#75675的DNA序列。分别对5’和3’序列添加对应于BamHI和XbaI的附加核苷酸。5’寡核苷酸引物具有序列5’-TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC-3’(SEQ ID NO：36)，包含一个BamHI限制酶切位点，随后是18个核苷酸的MIP-4编码序列，它开始于已加工蛋白质密码子的假定的末端氨基酸；3’序列5’-CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQID NO：13)包含XbaI位点的互补序列。
限制酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA)上的限制酶切位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-调节的启动子操纵基因(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-His标志和限制酶切位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。将扩增序列连接入pQE-9，并符合读框地插入编码组氨酸标志和RBS的序列。然后用连接混合物转化可从Qiagen获得的大肠杆菌株15/rep4。M15/rep4包含多拷贝的质粒pREP4，该质粒表达lacI阻抑物，也赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据它们在LB平板上生长的能力鉴定转化子，筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA，并通过限制酶切分析确定。包含希望构件的克隆在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。使用O/N培养物以1∶100到1∶250的比例接种入大量培养基。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖苷”)至1mM的终浓度。IPTG的诱导是通过使lacI阻抑物失活、清除P/O引起增强的基因表达。细胞再生长3到4个小时。然后离心收获细胞。细胞沉淀溶解于离液剂6M盐酸胍中。澄清后，在允许含6-His标志的蛋白质紧密结合的条件下，经镍-螯合柱色谱从此溶液中纯化溶解的MIP-4。Hochuli，E.等人，色谱杂志(J.Chromatography)411：177-184(1984)。以6M盐酸胍、pH5.0从柱上洗脱MIP-4(95％纯)，为了复性将其调节至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型)。在此溶液中温育12小时后，蛋白质对10mM磷酸钠透析。
备择地，使用以下非标记引物将基因克隆至质粒pQE60：5′AAA AAG CTT TCA GGC ATT CAG CTT CAG3′(SEQ ID NO：37)pQE60
       HindIII                                      3’引物′5′AAA CCA TGG CAC AAG TTG GTA CCA AC3′(SEQ ID NO：38)pQE60
       NcoI                                         5’引物
实施例3M-CIF的细菌表达和纯化
使用对应于已加工M-CIF蛋白质(除去信号肽序列)的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物初始扩增编码M-CIF(ATCC#75572)的DNA序列。并且将对应于BamHI和XbaI的附加核苷酸分别添加至5’和3’序列。5’寡核苷酸引物具有序列5’-GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC-3’(SEQ ID NO：39)，包含一个BamHI限制酶切位点，随后是15个核苷酸的M-CIF编码序列，它开始于已加工蛋白质密码子的假定的末端氨基酸；3’序列5’-GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG-3’(SEQ    IDNO：40)包含XbaI位点的互补序列、一个翻译终止密码子和M-CIF编码序列的最后20个核苷酸。
限制酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)上的限制酶切位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-调节的启动子操纵基因(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-His标志和限制酶切位点。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9。将扩增序列连接入pQE-9，并符合读框地插入编码组氨酸标志和RBS的序列。图6显示此排列的示意图。然后用连接混合物转化可从Qiagen获得的大肠杆菌株商标为M15/rep4。M15/rep4包含质粒多拷贝的pREP4，该质粒表达lacI阻抑物，也赋予卡那霉素抗性(Kanr)。根据它们在LB平板上生长的能力鉴定转化体，筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA，并通过限制酶切分析确定。包含希望构件的克隆在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。使用O/N培养物以1∶100到1∶250的比例接种大量培养基。细胞生长至光密度600(O.D.600)为0.4-0.6。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖苷”)至终浓度1mM。IPTG的诱导是通过使lacI阻抑物失活、清除P/O引起增强的基因表达。细胞再生长3到4个小时。然后离心收获细胞。细胞沉淀溶解于离液剂6摩尔盐酸胍中。澄清后，在允许含6-His标志的蛋白质紧密结合的条件下，经镍-螯合柱色谱从此溶液中纯化溶解的M-CIF。Hochuli，E.等人，色谱杂志411：177-184(1984)。以6M盐酸胍、pH5.0从柱上洗脱M-CIF(95％纯)，为了复性调节至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型)。在此溶液中温育12小时后，蛋白质对10mM磷酸钠透析。诱导后对应于14kDa的新蛋白质的存在证明M-CIF的表达(图7)。
备择地，使用以下非标记引物将基因插入质粒pQE60：
5′引物5′AAA TCA TGA CCA AGA CTG AAT CCT CCT 3′(SEQ ID NO：41)
               BspHI
3′引物5′AAA AAG CTT TCA GTT CTC CTT CAT GTC 3′(SEQ ID NO：42)
               HindIII
实施例4
用于MPIF-1、M-CIF或MIP-4蛋白质基因序列在哺乳动物细胞中瞬时表达的大多数载体应携带SV40复制起点。在表达病毒DNA合成起始所需的T抗原的细胞(例如，COS细胞)中，这允许载体复制到高拷贝数。任何其它哺乳动物细胞系也能用于此目的。
一种典型的哺乳动物表达系统包括介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白质编码序列和转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子、Kozak序列和侧翼为供体和受体位点的用于RNA剪接的间插序列。能用SV40的早期和晚期启动子、反转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复序列(LTR)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子来实现高效转录。然而，也能使用细胞信号(例如人肌动蛋白启动子)。用于实行本发明的合适的表达载体包括，例如，载体如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。能使用的哺乳动物宿主细胞包括，人Hela、283、H9和Jurkart细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、非洲绿猴细胞、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
备择地，能在包含整合入染色体的基因的稳定细胞系中表达此基因。与选择性标记如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素的共转染允许鉴定和分离转染细胞的。
也可扩增转染基因以表达大量编码蛋白质。为了发展携带几百或甚至几千个拷贝的目的基因的细胞系，DHFR(二氢叶酸还原酶)是有用的标记。另一个有用的选择性标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等人，生物化学杂志227：277-279(1991)；Bebbington等人，生物技术学(Bio/Technology)10：169-175(1992))。使用这些标记，在选择性培养基中生长哺乳动物细胞，筛选有最高抗性的细胞。这些细胞系包含整合入染色体的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞常用于蛋白质的产生。
表达载体pC1和pC4包含劳斯肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等人，分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)438-447(1985年3月))加CMV-增强子的一个片段(Boshart等人，细胞(Cell)41：521-530(1985))。多克隆位点，例如含限制酶切位点BamHI、XbaI和Asp718，利于目的基因的克隆。载体另外包含3’内含子、大鼠前胰岛素原的聚腺苷酸化和终止信号。A.重组MPIF-1在COS细胞中的表达
表达质粒CMV-MPIF-1 HA衍生自载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，包含：1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，随后是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整MPIF-1前体和与3’端符合读框地融合有HA标志的DNA片段克隆至载体的多接头区，因此，在CMV启动子下引导重组蛋白质表达。如前所述(Wilson，H.等人，细胞37：767(1991))HA标志对应于由流感血凝素蛋白衍生的表位。HA标志向靶蛋白质的注入允许用识别HA表位的抗体容易地检测重组蛋白质。
质粒构建策略描述如下：
通过对克隆的原始EST克隆的PCR构建编码MPIF-1的DNA序列，ATCC#75676，使用的两个引物是：5’引物5’-GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT-3’(SEQ ID NO：43)，包含一个HindIII位点，随后是从起始密码子开始的18个核苷酸的MPIF-1编  码  序  列  ；  3’   序   列    5’-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC-3’(SEQ ID NO：44)，包含对XbaI位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标志和MPIF-1编码序列的最后20个核苷酸(不包括终止密码子)。因此，PCR产物包含一个HindIII位点、其后是符合读框地融合HA标志的MPIF-1编码序列、一个与HA标志相邻的翻译终止密码子和一个XbaI位点。用HindIII和XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并连接。用连接混合物转化大肠杆菌株SURE(可从Stratagene Cloning System，11099North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037得到)，将转化培养物涂于氨苄青霉素培养基平板上，筛选抗性菌落。从转化子中分离质粒DNA，限制酶切分析检查正确片段的存在。为了重组MPIF-1的表达，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，《分子克隆：实验室手册》Cold SpringLaboratory Press，(1989))。用放射性标记和免疫沉淀法检测MPIF-1-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，《抗体：实验室手册》Cold SpringHarbor Laboratory Press，(1988))。转染后两天用35S-半胱氨酸标记细胞8小时。然后收集培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl、1％NP-40、0.1％SDS、1％NP-40、0.5％DOC、50mM Tris，pH7.5))裂解细胞(Wilson，I.等人，出处同前37：767(1984))。细胞裂解物和培养基都用HA特异的单克隆抗体沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。B.CHO细胞中的克隆和表达
载体pC1用于MPIF-1蛋白质的表达。质粒pC1是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。两种质粒都包含位于SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。可通过在补加化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(α-MEM，LifeTechnologies)中生长细胞来筛选用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞或其它缺乏二氢叶酸活性的细胞。氨甲喋呤(MTX)抗性细胞中DHFR基因的扩增已被很好地证明(见，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志253：1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学和生物物理学学报(Biochem.et Biophs.Acta)，1097：107-143，Page，M.J.和Sydenham,M.A.1991，生物技术卷9：64-68)。在增高浓度的MTX中生长的细胞通过过量产生靶酶DHFR发展对药物的抗性，这是DHFR基因扩增的结果。如果第二种基因与DHFR基因连接，它通常共扩增并过量表达。作为先有技术发展携带超过1000个拷贝的该基因的细胞系。随后，当不用氨甲喋呤时，细胞系包含整合入染色体的扩增基因。
为了目的基因的表达，质粒pC1包含劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等人，分子和细胞生物学1985年3月：438-4470)，加一个从人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因的增强子中分离的片段(Boshart等人，细胞41：521-530，1985)。启动子下游是之后的允许基因整合的单一限制酶切位点BamHI，随后是3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也能用于表达，例如，人β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒如HIV和HTLVI的长末端重复序列。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可使用如来自人生长激素或珠蛋白基因的其它信号。
也可与选择性标记如gpt、G418或潮霉素共转染，以筛选携带整合入染色体的目的基因的稳定细胞系。开始时使用多于一个的选择性标记是有利的，例如G418加氨甲喋呤。
用限制酶BamHI消化质粒pC1，然后通过本领域已知的方法用牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
使用对应于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码MPIF-1的DNA序列，ATCC号75676。
5’引物具有序列：
5′AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG GTC TCC GTG GTC 3′
        BamHI    KOZAK(SEQ ID NO：45)包含下划线标出的BamHI限制酶切位点和编码图1的MPIF-1蛋白质的部分序列(SEQ ID NO：3)。如下所述，插入表达载体后，编码人MPIF-1的扩增片段的5’端提供有效的信号肽。如Kozak，M.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：947-950(1987)描述，真核细胞中翻译起始的有效信号适当地位于构件的载体部分中。
3’引物具有序列：
  5′AAA GGA TCC TCA ATT CTT CCA GGT CTT 3′
             BamHI   终止(SEQ ID NO：46)包含Asp718限制酶切位点和与图1列出的MPIF-1编码序列互补的部分核苷酸(SEQ ID NO：3)，包括终止密码子。
如上所述从1％琼脂糖凝胶中分离扩增片段，然后用内切核酸酶BamHI和Asp718消化，然后再用1％琼脂糖凝胶纯化。
然后用T4 DNA连接酶连接分离的片段和去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB101细胞，用限制酶BamHI确定细菌包含以正确方向插入的质粒pC1。经DNA测序证实插入基因的序列。CHO-DHFR-细胞的转染
缺乏活性DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞可用于转染。使用脂转染法(Felgner等人，(出处同前))将5μg表达质粒C1与0.5μg质粒pSVneo共转染。质粒pSV2-neo包含一个显性选择性标记、来自Tn5的基因neo，neo编码赋予对一组抗生素包括G418抗性的酶。在补加1mg/mlG418的α-MEM中接种细胞。2天后，胰蛋白酶消化细胞，并接种于杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)，培养10-14天。这个阶段后，胰蛋白酶消化单克隆，然后使用不同浓度的氨甲喋呤(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)将其接种于6-孔培养皿中。然后将在最高氨甲喋呤浓度生长的克隆转移至含甚至更高浓度的氨甲喋呤(500nM、1μM、2μM、5μM)的新6-孔板。重复相同步骤直到克隆在100μM的浓度生长。
通过Western印迹分析和SDS-PAGE分析希望的基因产物的表达。
实施例5A.重组MIP-4在COS细胞中的表达
表达质粒CMV-MIP-4 HA衍生自载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，包含：1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，随后是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整MIP-4前体和与3’端符合读框地融合有HA标志的DNA片段克隆至载体的多接头区，因此，在CMV启动子下引导重组蛋白质表达。如以前所述(Wilson，H.等人，细胞37：767(1984))HA标志对应于由流感血凝素蛋白衍生的表位。HA标志向靶蛋白质的注入允许用识别HA表位的抗体容易地检测重组蛋白质。
质粒构建策略描述如下：
使用两个引物通过PCR构建编码MIP-4的DNA序列ATCC#75675   ，   5’   引   物   是   ：   5’-GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTGCAGCTGCC-3’(SEQ ID NO：47)，包含一个HindIII位点，随后是从起始密码子开始的20个核苷酸的MIP-4  编  码  序  列  ；  3’  序  列   5’-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC-3’(SEQ ID NO：48)，包含对XbaI位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标志和MIP-4编码序列的最后19个核苷酸(不包括终止密码子)。因此，PCR产物包含一个HindIII位点、其后是符合读框地融合有HA标志的MIP-4编码序列、一个与HA标志相邻的翻译终止密码子和一个XbaI位点。用HindIII和XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并连接。用连接混合物转化大肠杆菌株SURE(可从Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA得到)，将转化培养物涂于氨苄青霉素培养基平板上，筛选抗性菌落。从转化子中分离质粒DNA，限制酶切分析检查正确片段的存在。为了重组MIP-4的表达，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，《分子克隆：实验室手册》Cold Spring Laboratory Press，(1989))。用放射性标记和免疫沉淀法检测MIP-4-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，《抗体：实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染后两天用35S-半胱氨酸标记细胞8小时。然后收集培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40、0.1％SDS、1％NP-40、0.5％DOC、50mM Tris，pH7.5))裂解细胞(Wilson，H.等人，细胞37：767(1984))。细胞裂解物和培养基都用HA特异的单克隆抗体沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。B.CHO细胞中的克隆和表达
载体pC1用于MIP-4蛋白质的表达。质粒pC1是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。两种质粒都包含位于SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。可通过在补加化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(α-MEM，Life Technologies)中生长细胞来筛选用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢或其它缺乏二氢叶酸活性的细胞。氨甲喋呤(MTX)抗性细胞中DHFR基因的扩增已被很好地证明(见，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志253：1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学和生物物理学学报，1097：107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术卷9：64-68)。在增高浓度的MTX中生长的细胞通过过量产生靶酶DHFR发展对药物的抗性，这是DHFR基因扩增的结果。如果第二种基因与DHFR基因连接，它通常共扩增并过量表达。作为先有技术发展携带超过1000个拷贝该基因的细胞系。随后，当不用氨甲喋呤时，细胞系包含整合入染色体的扩增基因。
为了目的基因的表达，质粒pC1包含劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等人，分子和细胞生物学19853月：438-4470)，加一个从人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因的增强子中分离的片段(Boshart等人，细胞41：521-530,1985)。启动子下游是之后的允许基因整合的单限制酶切位点BamHI，随后是3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也能用于表达，例如，人β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒如HIV和HTLVI的长末端重复序列。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可使用如来自人生长激素或珠蛋白基因的其它信号。
也可与选择性标记如gpt、G418或潮霉素共转染，以筛选携带整合入染色体的目的基因的稳定细胞系。开始时使用多于一个的选择性标记是有利的，例如G418加氨甲喋呤。
用限制酶BamHI消化质粒pC1，然后通过本领域已知的方法用牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
使用对应于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码MIP-4的DNA序列，ATCC号75675。
5’引物具有序列：
5′AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG GGC CTT GCA AGC 3′
       BamHI    KOZAK(SEQ ID NO：49)包含下划线标出的BamHI限制酶切位点和编码图3的MIP-4蛋白质的部分序列(SEQ ID NO：5)。如下所述，插入表达载体后，编码人MIP-4的扩增片段的5’端提供有效的信号肽。如Kozak，M.，分子生物学杂志196：947-950(1987)描述，真核细胞中翻译起始的有效信号适当地位于构件的载体部分中。
3’引物具有序列：
5′AAA GGA TCC TCA GGC ATT CAG CTT CAG 3′
       BamHI    终止(SEQ ID NO：50)包含Asp718限制酶切位点，随后是图3列出的与一部分MIP-4编码序列互补的核苷酸(SEQ ID NO：5)，包括终止密码子。
如上所述从1％琼脂糖凝胶中分离扩增片段，然后用内切核酸酶BamHI和Asp718消化，然后再用1％琼脂糖凝胶纯化。
然后用T4 DNA连接酶连接分离的片段和去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB101细胞，用限制酶BamHI确定细菌包含以正确方向插入的质粒pC1。经DNA测序证实插入基因的序列。CHO-DHFR-细胞的转染
缺乏活性DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。使用脂转染法(Fe1gner等人，(出处同前))将5μg表达质粒C1与0.5μg质粒pSVneo共转染。质粒pSV2-neo包含一个显性选择性标记、来自Tn5的基因neo，neo编码赋予对一组抗生素包括G418抗性的酶。在补加1mg/mlG418的α-MEM中接种细胞。2天后，胰蛋白酶消化细胞，并接种于杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)，培养10-14天。这个阶段后，胰蛋白酶消化单克隆，然后使用不同浓度的氨甲喋呤(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)将其接种于6-孔培养皿中。然后将在最高氨甲喋呤浓度生长的克隆转移至含甚至更高浓度的氨甲喋呤(500nM、1μM、2μM、5μM)的新6-孔板。重复相同步骤直到克隆在100μM的浓度生长。
通过Western印迹分析和SDS-PAGE分析希望的基因产物的表达。
实施例6A.重组M-CIF在COS细胞中的表达
表达质粒CMV-M-CIF HA衍生自载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，包含：1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，随后是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整M-CIF前体和与3’端符合读框地融合有HA标志的DNA片段克隆至载体的多接头区，因此，在CMV启动子下引导重组蛋白质表达。如以前所述(Wilson，H.等人，细胞37：767(1984))HA标志对应于由流感血凝素蛋白衍生的表位。HA标志向我们靶蛋白质的注入允许用识别HA表位的抗体容易地检测重组蛋白质。
质粒构建策略描述如下：
使用两个引物通过PCR构建编码M-CIF的DNA序列ATCC#75572     ，     5’     引      物     5’-GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGGCTGC-3’(SEQ ID NO：51)，包含一个HindIII位点，随后是从起始密码子开始的20个核苷酸的M-CIF  编  码  序  列  ；  3’ 序  列  5’-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG-3’(SEQ ID NO：52)，包含对XbaI位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标志和M-CIF编码序列的最后19个核苷酸(不包括终止密码子)。因此，PCR产物包含一个HindIII位点、其后是符合读框地融合有HA标志的M-CIF编码序列、一个与HA标志相邻的翻译终止密码子和一个XbaI位点。用HindIII和XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并连接。用连接混合物转化大肠杆菌株SURE(可从Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA得到)，将转化培养物涂于氨苄青霉素培养基平板上，筛选抗性菌落。从转化子中分离质粒DNA，限制酶切分析检查正确片段的存在。为了重组M-CIF的表达，通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，《分子克隆：实验室手册》Cold Spring Laboratory Press，(1989))。用放射性标记和免疫沉淀法检测M-CIF-HA蛋白质的表达(E.Harlow，D.Lane，《抗体：实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染后两天用35S-半胱氨酸标记细胞8小时。然后收集培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl、1％NP-40、0.1％SDS、1％NP-40、0.5％DOC、50mM Tris，pH7.5))裂解细胞(Wilson，H.等人，细胞37：767(1984))。细胞裂解物和培养基都用HA特异的单克隆抗体沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。B.CHO细胞中的克隆和表达
载体pC1用于M-CIF蛋白质的表达。质粒pC1是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。两种质粒都包含位于SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。可通过在补加化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(α-MEM，Life Technologies)中生长细胞来筛选用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞或其它缺乏二氢叶酸活性的细胞。氨甲喋呤(MTX)抗性细胞中DHFR基因的扩增已被很好地证明(见，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R和Schimke，RT.，1978，生物化学杂志253：1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990生物化学和生物物理学学报，1097：107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术卷9：64-68)。在增高浓度的MTX中生长的细胞通过过量产生靶酶DHFR发展对药物的抗性，这是DHFR基因扩增的结果。如果第二种基因与DHFR基因连接，它通常共扩增并过量表达。作为先有技术中发育超过1000个拷贝该基因的细胞系。随后，当不用氨甲喋呤时，细胞系包含整合入染色体的扩增基因。
为了目的基因的表达，质粒pC1包含劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等人，分子和细胞生物学19853月：438-4470)，加一个从人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因的增强子中分离的片段(Boshart等人，细胞41：521-530,1985)。启动子下游是之后的允许基因整合的单限制酶切位点BamHI，随后是3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也能用于表达，例如，人β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒如HIV和HTLVI的长末端重复序列。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可使用如来自人生长激素或珠蛋白基因的其它信号。
也可与选择性标记如gpt、G418或潮霉素共转染，以筛选携带整合入染色体的目的基因的稳定细胞系。开始时使用多于一个的选择性标记是有利的，例如G418加氨甲喋呤。
用限制酶BamHⅠ消化质粒pC1，然后通过本领域已知的方法用牛小肠磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
使用对应于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码M-CIF的DNA序列，ATCC号75572。
5’引物具有序列：
5′AAA GGA TCC GCC ACC ATG AAG ATC TCC GTG GCT 3′
       BamHI    KOZAK(SEQ ID NO：53)包含下划线标出的BamHI限制酶切位点和图2的M-CIF序列(SEQ ID NO：1)。如下所述，插入表达载体后，编码人M-CIF的扩增片段的5’端提供有效的信号肽。如Kozak，M.J.分子生物学杂志196：947-950(1987)描述，真核细胞中翻译起始的有效信号适当地位于构件的载体部分中。
 3’引物具有序列：
5′AAA GGA TCC TCA GTT CTC CTT CAT GTC CTT 3′
         BamHI 终止(SEQ ID NO：54)包含Asp718限制酶切位点和图2列出的一部分M-CIF编码序列(SEQ ID NO：1)，包含终止密码子。
如上所述从1％琼脂糖凝胶中分离扩增片段，然后用内切核酸酶BamHI和Asp718消化，然后再用1％琼脂糖凝胶纯化。
然后用T4 DNA连接酶连接分离的片段和去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB101细胞，用限制酶BamHI确定细菌包含以正确方向插入的质粒pC1。经DNA测序证实插入基因的序列。CHO-DHFR-细胞的转染
缺乏活性DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞可用于转染。使用脂转染法(Felgner等人，(出处同前))将5μg表达质粒C1与0.5μg质粒pSVneo共转染。质粒pSV2-neo包含一个显性选择性标记、来自Tn5的基因neo，neo编码赋予对一组抗生素包括G418抗性的酶。在补加1mg/mlG418的α-MEM中接种细胞。2天后，胰蛋白酶消化细胞，接种于杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)，培养10-14天。这个阶段后，胰蛋白酶消化单克隆，然后使用不同的氨甲喋呤浓度(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)接种于6-孔培养皿。然后将在最高氨甲喋呤浓度生长的克隆转移至含甚至更高浓度的氨甲喋呤(500nM、1μM、2μM、5μM)的新6-孔板。重复相同步骤直到克隆在100μM的浓度生长。
通过Western印迹分析和SDS-PAGE分析希望的基因产物的表达。
实施例7M-CIF在人组织中的表达模式
进行Northern印迹分析以检查M-CIF在人组织中的表达水平。用RNAzolTMB系统(Biotecx Laboratories，Inc.Houston，TX)分离总细胞RNA样品。从每份指定的人组织中分离的约10ug总RNA在1％琼脂糖凝胶上分开，并印迹至尼龙滤膜上。(Sambrook，Fritsch和Maniatis，《分子克隆：实验室手册》Cold Spring Laboratory Press，(1989))。根据Stratagene Prime-It试剂盒用50ng DNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱纯化标记的DNA。(5Prime-3Prime，Inc.，Boulder,CO)。然后在0.5M NaPO4、pH7.4和7％SDS中以1,000,000cpm/ml用放射性标记的全长M-CIF基因杂交滤膜，65℃过夜。用0.5×SSC、0.1％SDS于室温洗两次和于60℃洗两次后，在-70℃用增感屏暴露滤膜过夜。
实施例8MPIF-1在人组织中的表达模式
进行Northern印迹分析以检查MPIF-1在人组织中的表达水平。用RNAzolTM B系统(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分离总细胞RNA样品。从每份指定的人组织中分离的约10ug总RNA在1％琼脂糖凝胶上分开，并印迹至尼龙滤膜上。(Sambrook Fritsch和Maniatis，《分子克隆：实验室手册》Cold SpringLaboratory Press，(1989))。根据Stratagene Prime-It试剂盒用50ng DNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱纯化标记的DNA。(5Prime-3Prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303)。然后在0.5MNaPO4、pH7.4和7％SDS中以1,000,000cpm/ml用放射性标记的全长MPIF-1基因杂交滤膜，65℃过夜。用0.5×SSC、0.1％SDS于室温洗两次和于60℃洗两次后，在.70℃用增感屏暴露滤膜过夜。
实施例9MIP-4在人细胞中的表达模式
进行Northern印迹分析以检查MIP-4在人细胞中的表达水平。用RNAzolTM B系统(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分离总细胞RNA样品。从每份指定的人组织中分离的约10ug总RNA在1％琼脂糖凝胶上分开，并印迹至尼龙滤膜上。(Sambrook，Fritsch和Maniatis，《分子克隆：实验室手册》Cold SpringLaboratory Press，(1989))。根据Stratagene Prime-It试剂盒用50ng DNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱纯化标记DNA。(5Prime-3Prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303)。然后在0.5MNaPO4、pH7.4和7％SDS中以1,000,000cpm/ml用放射性标记的全长MIP-4基因杂交滤膜，65℃过夜。用0.5×SSC、0.1％SDS于室温洗两次和于60℃洗两次后，在-70℃用增感屏暴露滤膜过夜。见图6。实施例10使用杆状病毒表达系统的趋化因子MPIF-1的表达和纯化
用为表达MPIF-1 cDNA而设计的重组杆状病毒感染SF9细胞。以2MOI感染细胞，并于28℃培养72-96小时。低速离心从感染的培养物中去除细胞碎片。将蛋白酶抑制混合物加入上清，终浓度为20μg/mlPefabloc SC、1μg/ml亮抑蛋白酶肽、1μg/ml E-64和1mM EDTA。通过在15％SDS-PAGE凝胶上加样20-30μl上清液监测上清液中MPIF-1的水平。MPIF-1检测为一条可见的9Kd带，对应于每升几毫克的表达水平。通过三步纯化方法进一步纯化MPIF-1：肝素结合的亲和色谱。将杆状病毒培养物上清液与1/3体积的包含100mMHEPES/MES/NaOAc、pH6的缓冲液混合，并通过0.22μM膜过滤。然后将样品应用于肝素结合的柱(HEl poros 20，Bi-Perceptive SystemInc.)。以50mM HEPES/MES/NaOAc、pH6中50-500mM的NaCl线性梯度在大约300mM NaCl时洗脱出MPIF-1；阳离子交换色谱。从肝素色谱富集的MPIF-1用含50mM HEPES/MES/NaOAc、pH6的缓冲液进行5倍稀释。然后产生的混合物用于阳离子交换柱(S/M poros20，Bio-Perceptive System Inc.)。以50mM HEPES/MES/NaOAc、pH6中的25-300mM NaCl线性梯度在大约250mM NaCl时洗脱出MPIF-1；体积排阻色谱。阳离子交换色谱后，应用体积排阻色谱(HW50，TOSO HAAS，1.4×45cm)进一步纯化MPIF-1。在靠近13.7Kd分子量标准(Rnase A)位置处分级分离出MPIF-1，对应于蛋白质的嵌合形式。
上述三步纯化后，如SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色所确定的，判断产生的MPIF-1纯度大于90％(图9)。
对纯化的MPIF-1也测试内毒素/LPS污染。根据LAL测定(BioWhittaker)，LPS含量小于0.1ng/ml。
实施例11杆状病毒表达的M-CIF和MPIF-1对M-CSF和SCF-刺激的新分离骨髓细胞的集落形成的作用
小鼠骨髓细胞的低密度群在经处理的组织培养皿中37℃温育1小时，以去除单核细胞、巨噬细胞和粘附塑料表面的其它细胞。然后将细胞的非粘附群涂板于(10000细胞/平皿)存在或不存在图14所示因子的含琼脂生长培养基中。培养物于37℃温育10天(88％N2、5％CO2和7％O2)，在倒置显微镜下计数集落。数据表示为集落平均数，从一式三份进行的测定中获得。
实施例12MPIF-1和M-CIF对IL-3和SCF刺激的骨髓细胞lin-群的增生和分化的作用
使用负选择方法获得在原始造血先祖中富集的一群小鼠骨髓细胞，其中使用一组单克隆抗体(抗cd11b、CD4、CD8、CD45R和Gr-1抗原)和磁珠去除大多数谱系的定向细胞。将产生的细胞群(谱系排除细胞)在所示趋化因子(50ng/ml)的存在或不存在下涂板(5×104细胞/ml)于补加IL-3(5ng/ml)加干细胞因子(SCF)(100ng/ml)的生长培养基中。在湿润培养箱(5％CO2、7％O2和88％N2环境)中37℃温育7天后，收获细胞，测定HPP-CFC和未成熟先祖。另外，通过FACScan分析细胞特定分化抗原的表达。集落数据表示为集落平均数+/-SD，是从在每个细胞群的六个平皿中进行的测定中获得的(图15)。
实施例13MPIF-1抑制应答IL-3、M-CSF和GM-CSF的集落形成
从股骨和胫骨上冲洗小鼠骨髓细胞，在ficoll密度梯度上将其分开，并通过塑料粘附去除单核细胞。产生的细胞群在补加IL-3(5ng/ml)、GM-CSF(5ng/ml)、M-CSF(10ng/ml)和G-CSF(10ng/ml)的基于MEM的培养基中温育过夜。在基于琼脂的集落形成测定中，在存在IL-3(5ng/ml)、GM-CSF(5ng/ml)或M-CSF(5ng/ml)并含或不含50ng/ml的M-CIF下，将这些细胞以1000细胞/平皿涂板。数据表示为集落形成占单独用特异因子形成的集落数的百分数。用描述为双份平皿平均值的数据显示两个实验，误差条指出每个实验的标准差(图17)。
实施例14经基因治疗的表达
通过皮肤活检从受试者中获得成纤维细胞。将所得的组织置于组织培养基中，并分离为小片。将组织小块置于组织培养瓶的湿表面，每瓶大约放置10片。将瓶倒置，拧紧，置于室温过夜。室温24小时后，将瓶颠倒，组织块贴附于瓶底，加入新鲜培养基(例如，Ham’s F12培养基，含10％FBS、青霉素和链霉素)。然后于37℃温育约一周。此时，加入新鲜培养基并随后每几天更换一次。培养另外两周后，出现成纤维细胞单层。用胰酶消化单层并放大至较大瓶中。
用EcoRI和HindIII消化侧翼为莫洛尼鼠类肉瘤病毒的长末端重复序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等人，DNA 7：219-25(1988))，随后用牛小肠磷酸酶处理。在琼脂糖凝胶上分级分离线性载体，并用玻璃珠纯化。
使用分别对应于5’和3’末端序列的PCR引物扩增编码本发明的多肽的cDNA。5’引物包含一个EcoRI位点，3’引物包含一个HindIII位点。在T4 DNA连接酶的存在下，一起加入等量的莫洛尼鼠类肉瘤病毒线性主链和EcoRI和HindIII片段。产生的混合物在对两个片段的连接合适的条件下保存。连接混合物用来转化细菌HB101，然后将其涂板于含卡那霉素琼脂上，目的是确定载体具有正确插入的目的基因。
兼嗜性pA317或GP＋am12包装细胞在组织培养基中生长至铺满的密度，培养基为含10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbeccol’s改进的Eagles培养基(DMEM)。然后将包含该基因的MSV载体加入培养基中，并用载体转导包装细胞。现在包装细胞产生包含该基因的感染性病毒颗粒(包装细胞现在指生产细胞)。
将新鲜培养基加入转导的生产细胞中，随后从10cm板的铺满的生产细胞中收获培养基。通过微孔滤膜过滤包含感染病毒颗粒的用过的培养基，以去除脱离的生产细胞，然后使用此培养基感染成纤维细胞。从亚铺满的成纤维细胞的板中去除培养基，快速替换为生产细胞的培养基。去除此培养基，替换为新鲜培养基。如果病毒滴度高，事实上所有成纤维细胞都将被感染，因此不需要筛选。如果滴度很低，那么有必要使用具有选择性标记如neo或his的反转录病毒载体。
然后单独或在cytodex 3微载体珠上生长至铺满后，将工程改造的成纤维细胞注射入宿主。现在成纤维细胞产生蛋白质产物。
实施例15体外髓保护
如上证明，MPIF-1是低增殖潜能集落-形成细胞(LPP-CFC)的有效抑制剂，LPP-CFC是产生粒细胞和单核细胞谱系的骨髓先祖。为证明MPIF-1给LPP-CFC提供保护，以免于化疗药物作用的细胞周期的细胞毒性，从小鼠骨髓中分离谱系排除的细胞群(lin-细胞)，并在存在多个细胞因子及含或不含MPIF-1条件下温育。48小时后，一排每个培养物接受5-Fu，继续温育另外24小时，在此时用克隆发生测定法测定存活LPP-CFC的数量。如图21A所示，在MPIF-1存在下约40％的LPP-CFC被保护免于5-Fu-诱导的细胞毒性，而发现在MPIF-1不存在或在非相关蛋白质存在下很少有LPP-CFC的保护(＜5％)。在相同培养条件下MPIF-1不保护高增殖潜能集落-形成细胞(HPP-CFC)，证明MPIF-1保护作用的特异性。
使用化疗剂Ara-C代替5-Fu进行相似实验。如图21B所示，野生型MPIF-1和突变体MPIF-1(即突变体-1，见以下实施例17对此突变体的描述)都对LPP-CFC有惊人的保护。因而，MPIF-1能保护LPP-CFC免于化疗药物5-Fu和Ara-C诱导的细胞毒性。
实施例16体内髓保护
体外髓保护结果建议，如果在化疗药作用期间MPIF-1保护骨髓内的关键细胞型，可以改善细胞毒药物引起的骨髓中毒性，这是在经受化学治疗的癌症患者中发现的严重副作用。为证明体内髓保护，在小鼠中进行两种实验。在一个实验中，一组小鼠(组-4)每天注射(腹膜内)1.0mg/Kg MPIF-1，以24小时间隔注射3天，第三天也给这些小鼠注射(腹膜内)150mg/Kg的5-Fu。注射盐水(组-1)、单独注射MPIF-1(组-2)或单独注射5-Fu(组-3)的动物作为对照。然后，在5-Fu施用后第3、6、10天处死每组中的4只动物，以测定外周血中的白细胞(WBC)计数。如图22所示，MPIF-1的单独注射对WBC计数影响很小。如预期，5-Fu治疗导致注射5-Fu后第6天循环WBC计数的显著减少。值得注意的，与单独用5-Fu处理的动物相比，5-Fu施用前用MPIF-1处理的动物显示的血中WBC计数高约两倍。因此，5-Fu处理前用MPIF-1对小鼠处理引起中性白细胞减少的恢复加速。骨髓中的造血干和多能先祖细胞负责化学治疗后恢复所有造血谱系。在正常个体中，这些细胞分裂很不频繁，因此免受单次施用化疗药物的损害。然而，如果第一次用药后三天内施用第二剂药物，则细胞被杀死，因为骨髓中的关键先祖细胞型在此期间快速分裂。
为证明MPIF-1能保护骨髓中的这些细胞型，进行以下实验。使用如下处理的三组小鼠(每组6只动物)进行实验：组-1，在第1、2和3天注射盐水；组-2，在第0和3天注射5-Fu；以及组-3，在第0和3天注射5-Fu并在第1、2和3天注射MPIF-1(见图23)。在第6和9天收获骨髓，使用本领域的技术人员众所周知的克隆发生测定法测定HPP-CFC和LPP-CFC的频率。结果证明，与单独用5-Fu处理的动物相比，在第二次5-Fu用药之前MPIF-1的施用导致到第9天HPP-CFC和LPP-CFC频率的快速恢复。
实施例17用MPIF-1突变体研究
已鉴定和表征了许多N-端截短的MPIF-1变异体。通过Edman降解法测定的这些变异体的氨基端序列显示于表25中。例如，突变体-2、-3、-7和-8在成熟形式的MPIF-1纯化期间自发产生，此制剂叫做制剂K0871。类似地，在另一批纯化的MPIF-1制剂(制剂HG00300-B7)中发现突变体-2、-3、-4和-5。由于不可能从彼此中纯化这些变异体，在如下所述实验中使用制剂K0871和HG00300-B7。通过体外诱变产生突变体-6，除N-端甲硫氨酸外它的氨基端序列与突变体-3相同。也通过诱变产生突变体-1，它除N-端甲硫氨酸外与野生型相同。另外，发现了MPIF-1的一个选择性剪接的形式(突变体-9)(见图25)，其cDNA克隆编码一个137个氨基酸的蛋白质(图26A)。突变体-9与MPIF-1的氨基酸序列的比较揭示MPIF-1序列中残基45和46间18个氨基酸的插入和MPIF-1精氨酸46的丢失(图26B)。以下总结了这些MPIF-1突变体蛋白质的生物学活性。细胞内钙质迁移
在前述实施例中，显示MPIF-1蛋白质在单核细胞中动用钙。使用人MIP-1α作为阳性对照，检测野生型和突变体MPIF-1蛋白质在人单核细胞中诱导细胞内钙质迁移的能力。实验如下进行：经淘析分离人单核细胞，用Indo-1/乙酰氧基甲基酯负载，方法是将1×106细胞在1ml HBSS中37℃温育30分钟，HBSS含1mM CaCl2、2mM MgSO4、5mM葡萄糖和10mM HEPES、pH7.4加2.5mM Indo-1/乙酰氧基甲基酯。然后用HBSS洗细胞，以5×105细胞/ml重悬浮于相同缓冲液中，用不同浓度的指定蛋白质在37℃刺激。通过用Hatchi F-2000荧光分光光度计监测Indo-1在330nm的激发和在405和485nm的发射，测定细胞内钙((Ca++)i)的改变所诱导的荧光信号。结果显示于图27中。
结果证明制剂K0871、HG00300-B7和突变体-9有10倍于野生型的活性，而突变体-6不能与野生型区分，突变体-1有大约2倍于野生型的活性(见图27)。由于MIP-1α和MPIF-1就一级氨基酸序列而言有45％相同，因此测定它们是否与相同受体相互作用令人关注。为探索这种可能性，研究了MPIF-1减弱MIP-1α诱导的钙质迁移的能力。图28A和图28B显示MIP-1α和MPIF-1野生型蛋白质能彼此减弱在单核细胞中动用钙的能力，但MCP-4(另一种β-趋化因子)不能。
在相似的实验中，制剂K0871、HG00300-B7和突变体-1、-6和-9能阻断MIP-1α-诱导的钙质动用。此实验如下进行：如以上图27中公开的实验所述，测定人单核细胞对100ng/ml指定蛋白质的钙质迁移反应。用于弱化研究，首先将单核细胞暴露于一种因子，当对第一个处理的反应降回至基线时，向相同细胞中加入第二种因子。对第二种因子没有反应表示为(-)符号，对第一种因子的刺激反应表示为(+)符号。(见图29)。
因此，MPIF-1和其突变变异体看来与MIP-1α细胞表面受体的一种成分相互作用并共享之。最近证明MIP-1α受体作为帮助HIV进入人单核细胞和T-淋巴细胞的辅因子，这引起了一种令人感兴趣的可能性，即MPIF-1或其变异体可干扰HIV进入细胞的过程。趋化性
在96-孔neuroprobe趋化室中测定了人外周血单核细胞(PBMC)组分(主要由淋巴细胞和单核细胞组成)对不同浓度的MPIF-1及其变异体反应的趋化性。实验如下进行：在含0.1％BSA的HBSS(HBSS/BSA)中洗细胞三次，以2×106/ml重悬用于标记。加入钙黄绿素-AM(分子探针)至终浓度1mM，细胞于37℃温育30分钟。温育后，在HBSS/BSA中洗细胞三次。然后重悬标记细胞至8×106/ml，将25ml此悬液(2×105细胞)分配至96孔趋化板的每个上室中。在每孔的底室中以不同浓度分配趋化剂。用聚碳酸酯滤膜(3-5mm孔大小；不含PVP；NeuroProbe Inc.)将上室和底室分开。允许细胞迁移45-90分钟，然后使用Cytofiuor 11荧光板读数仪(PerSeptiveBiosystems)定量迁移细胞(与滤膜下表面及在底室中附着的)的数量。值代表一种浓度，此浓度处可观察到峰活性及超过圆括号中指出的背景的相对诱导倍数。
结果显示于图30中，证明制剂K0871和HG00300-B7是比野生型更有效的趋化性诱导物，而突变体-1和-6与野生型无法区分。对LPP-CFC集落形成的作用
为测定MPIF-1变异体对LPP-CFC集落形成的影响，将限制数量的小鼠骨髓细胞涂板于补加多个细胞因子、含或不含不同浓度的MPIF-1变异体的含软琼脂的培养基中。实验如下进行：将小鼠骨髓细胞的低密度群涂板(1500细胞/3.5cm直径平皿)于含琼脂培养基中，其中含或不含不同浓度的指定MPIF-1变异体、但存在以下重组鼠细胞因子IL-3(5ng/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-1α(10ng/ml)和M-CSF(5ng/ml)。然后将平皿在组织培养箱中温育14天，此时在倒置显微镜下计数LPP-CFC集落。数据显示于图31中，是从几个不同的实验汇集的，以双份实验测定每种情况。
结果证明，对于制剂K0871和HG00300-B7，50％最大抑制所需的有效浓度比野生型低20-100倍，对于突变体-6是低2-10倍。(见图31)。因此，MPIF-1蛋白质N-端氨基酸的缺失导致分子潜能的增强。
实施例18脂多糖-诱导的致死性脓毒症的M-CIF保护
脓毒休克，是在人类中具有显著发病率和死亡率的一种疾病，起因于血液-携带的细菌感染引起的无法控制的细胞因子释放。公认细菌内毒素是革兰氏-阴性脓毒休克发病机理中的主要因素(Morrison和Ryan，医学每年综述(Annu.Rev.Med.)38：417(1987)；Wolff和Benett，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)291：733(1974))，脓毒休克似乎由应答内毒素的巨噬细胞介导，用于TNF-α和其它细胞因子的产生(Freudenberg等人，感染与免疫(Infect.Immun.)51：891(1986)，Tracey等人，自然(Lond)330：662(1987))。
M-CIF是β-趋化因子家族的新成员，对单核细胞/巨噬细胞没有体外趋化活性，对T淋巴细胞有某种程度的趋化活性。除通过与MIP-1α和RANTES共享的受体诱导单核细胞/巨噬细胞之细胞内Ca++变化以外，它对大多数白细胞无活性(Schulz-Knappe等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)183：295(1996))。另外，M-CIF显示对M-CSF-诱导的幼单核细胞集落形成具有强烈的抑制作用(Kreider等人，国际干扰素与细胞因子研究协会摘要(Abstract for the International Society forInterferon and Cytokine Research)，Geneva，Switzerland，1996)。
本研究中，我们检查了动物模型中M-CIF对内毒素-诱导的脓毒休克的作用。某些实验中，为绕过已知的小鼠对细胞毒素作用的自然抗性(Peavy等人，免疫学杂志105：1453(1970))，我们通过用D-半乳糖胺预处理提高了它们的敏感性(Galanos等人，美国国家科学院学报76：5939(1979)；Lehmann等人，实验医学杂志165：657(1987))。我们显示用M-CIF对潜在脓毒小鼠的系统处理明显防止了LPS-诱导的致死性休克。材料与方法化学药品与试剂
内毒素LPS(由大肠杆菌0127：B8衍生)和D-半乳糖胺购自SigmaChemical Co.(St Louis，MO)。重组人M-CIF是利用三种不同载体系统产生的：杆状病毒、大肠杆菌和CHO细胞，用于蛋白质表达和纯化。如SDS-PAGE分析测定，体内使用的最终蛋白质制剂包含超过90％的M-CIF，并具有低于4.0EU/mg的内毒素水平。表1实验中使用的M-CIF的批次和载体M-CIF载体    批号％纯度    内毒素水平   缓冲液含量
             (SDS-PAGE)(EU/mg)    (NaOAc；NaCl)1.  杆状病毒  B8＞95         4.0     40mM；pH5.5；500mM2.  杆状病毒  B9＞95         0.2     40mM；pH5.5；150mM3.  杆状病毒  B11＞90        2.4     40mM；pH5.5；150mM4.  大肠杆菌  E1 95          0.04    40mM；pH6.0；400mM5.  CHO       C1＞95         0.75    50mM；pH6.5；500mM动物
进行这些实验使用购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)的Balb/c和CF-1小鼠、和购自国家癌症研究所动物生产设施(AnimalProduction Facility at National Cancer Institute)/Charles River(Frederick，MD)的Balb/c scid/scid(SCID)小鼠。所有小鼠在8-12周龄时使用，维持标准实验室饮食，自由饮用自来水。在控制条件下将动物饲养于塑料分隔的笼中，房中具有过滤顶部、12小时的光照循环(早6点-晚6点，光)，在用于实验前监测22℃温度和65％湿度至少一周。在使用前SCID小鼠有草垫和高压灭菌的水和照射的食物。实验设计
在有或没有预先(注射LPS前1小时)的D-半乳糖致敏的情况下，于第0天经腹膜内注射不同剂量的溶于普通盐水的LPS在小鼠中诱导致死性脓毒。于第－1、0(LPS前1小时)和1天连续3天，每天以不同剂量腹膜内施以来自不同载体/批次的M-CIF。接受缓冲液(40mM乙酸钠，pH5.5；150mM NaCl)的小鼠用作疾病对照。LPS攻击后每天3次监视动物的濒死和发病，共120小时。计算百分存活小鼠：存活小鼠的数量/小鼠总数×100％。结果Balb/c小鼠脓毒休克的两种动物模型中M-CIF的作用
用LPS(25mg/kg，腹膜内)在小鼠中诱导致死性休克的第一种模型。此模型中，LPS注射后52小时85％的动物死亡。与缓冲液对照相比，每天用M-CIF(3mg/kg，腹膜内)处理共3天防止了多达40％的致死(图32)。D-半乳糖致敏(20mg/小鼠，腹膜内)后1小时给小鼠注射LPS(1ug/小鼠，腹膜内)诱导致死性脓毒的第二种模型，所有动物在LPS施用后8小时内死亡。与盐水对照相比，用M-CIF(1mg/kg，腹膜内)以相似的剂量方案对小鼠预处理3天防止了50％的致死，单次用药处理仅在25％的小鼠中防止了致死。另外，M-CIF与LPS(1ug/小鼠)或D-半乳糖(20mg/小鼠)的组合处理导致在动物中没有发病和濒死的迹象，这提示M-CIF制剂中的内毒素水平是可忽略的(表2)。
表2组株     M-CIF   D-gal   LPS     NaCl   8小时   11小时   22小时
     腹膜内  腹膜内  腹膜内  腹膜内         内存活
     1mg/kg  20mg    1ug     0.1ml          存活/总数1 BALB/c  -      +       +    -1,0,+1    0/4    0/4       ND2 BALB/c  0      +       +    -          2/4    1/4       ND3 BALB/c -1,0,+1 +       +    -          2/4    2/4       ND4 BALB/c -1,0,+1 -       +    -          4/4    4/4       ND5 BALB/c -1,0,+1 +       -    -          4/4    4/4       ND
连续3天注射小鼠，注射LPS前1天的第-1天，注射LPS前1小时的第0天，注射LPS后1天的第1天(-1，0，+1)或仅在注射LPS前1小时的第0天(0)。ND＝未做。M-CIF对脓毒的预防效果不依赖于动物株CF-1小鼠也用于D-半乳糖-致敏的LPS-诱导的致死性休克模型中。不象Balb/c小鼠，至注射LPS后11小时在盐水对照组中仅有50％的CF-1小鼠致死，额外每天施用M-CIF共连续3天防止了所有小鼠的死亡(表3)。此结果建议人M-CIF与鼠相应物非常接近，M-CIF对脓毒的保护效果是非动物株-选择性的广泛现象。
表3组 株    M-CIF    D-gal   LPS     NaCl      8小时     11小时  22小时
    腹膜内    腹膜内  腹膜内  腹膜内    内存活
    1mg/kg    20mg   1ug     0.1ml     存活/总数1 CF-1   -         +      +      -2，-1，0  4/4       2/4    2/42 CF-1  -2，-1，0  +      +        -        4/4       4/4    4/43 CF-1  -2，-1，0  -      +        -        5/5       5/5    5/5
连续3天注射小鼠，注射LPS前2天的第-2天，注射LPS前1天的第-1天和注射LPS前1小时的第0天(-2，-1，0)。M-CIF对脓毒休克的预防效果依赖于LPS剂量
在大规模的实验中，用单次施用的LPS(25mg/kg)腹膜内注射攻击Balb/c小鼠，此组中的致死率程度为90％(图33)。以每天10mg/kgM-CIF预处理小鼠共连续3天保护可多达70％(图36)。M-CIF对致死性脓毒的剂量-依赖的作用
此大规模实验基于Balb/c小鼠中的25mg/kg的LPS。LPS注射后48小时内缓冲液对照组中诱导了100％的致死率。相反，用1mg/kg的M-CIF处理的小鼠在相同时期内仍有40％存活，到第5天此组中所有小鼠死亡。此外，3和10mg/kg剂量的M-CIF分别防止了50％和65％的小鼠的致死性休克(图34)。在Balb/c SCID小鼠中M-CIF能防止脓毒
对具有B和T淋巴细胞缺陷的SCID小鼠腹膜内注射20、30、40或50mg/kg的LPS，以测定致死率的最佳程度。不象正常Balb/c小鼠，在注射20mg/kg LPS、有或没有M-CIF处理(n＝8)的小鼠中无死亡发生。在30mg/kg LPS组中仅观察到30％致死率，用3mg/kg M-CIF的额外处理保护了所有SCID小鼠免于休克。当LPS剂量进一步增加到40mg/kg时，在免疫缺陷小鼠的缓冲液对照组中诱导了80％的死亡率，而用3mg/kg M-CIF额外处理连续3天保护了40％的小鼠免于致死(图35A和35B)。一旦给予50mg/kg的LPS剂量，正如正常Balb/c小鼠一样，24小时内缓冲液对照组中所有SCID小鼠死亡；5只动物中没有一只能被额外的M-CIF处理所保护。来自不同载体制剂的M-CIF对脓毒一致的保护效果
在Balb/c小鼠的LPS-诱导的致死性脓毒症中检测从大肠杆菌和CHO表达载体中制备的M-CIF蛋白质。与在25mg/kg LPS攻击后48小时内显示100％致死率的缓冲液对照相比，衍生自CHO载体的M-CIF(1mg/kg)在相同时期内使60％的小鼠免于死亡，而LPS注射后3天的致死率为50％。此外，来自大肠杆菌载体的相同剂量的蛋白质也防止了25％的小鼠免于致死性休克。然而，此M-CIF制剂似乎不如来自其它两种载体的物质有效，建议蛋白质表达和纯化过程中可能存在显著的改变(图36)。
实施例19肾损伤中的M-CIF调节
已显示TNF-α参与几种类型的肾小球损伤的发病机理(Martin等人，临床实验免疫学2：283-288(1995)；Ortiz等人，Necker医院肾脏学进展(Adv.Nephrol.Necker.Hosp.)24：53-77(1995)；Karkar等人，国际肾脏学(Kidney Int.)44：967-973(1993)；Nikolic-Paterson等人，国际肾脏学45：S79-S82(1994)；Egido等人，国际肾脏学43：S59-S64(1993))，并在肾小管间质肾炎、纤维化和肾同种异体移植排斥中起作用(Baud等人，矿物质和电解质代谢(Miner.Electrolyte Metab.)21：336-341(1995)；Tang等人，实验室研究(Lab.Invest.)70：631-638(1994)；Wilson，在《肾》(The Kidney)，Brenner编，Philadelphia，W.B.SaundersCompany，1253页(1996)；Perkins等人，在《肾》，Brenner编，Philadelphia，W.B.Saunders Company，2576页(1996))。为研究M-CIF在改变肾病发病和发展中的效能，将动物模型用于新月体肾小球性肾炎、灶性和节段性肾小球硬化症(FSGS)和药物诱导的间质性肾炎。
在特别倾向于发展为肾小球新月体的一株大鼠(WKY)中诱导抗-GBM病的模型(Huang等人，国际肾脏学46：69-78(1994)；Bolton等人，国际肾脏学44：294-306(1993))。此研究中使用的抗体在雌性新西兰白兔中产生。用富含基膜的肾沉淀物重复免疫兔(Schreiner等人，实验医学杂志147：369-384(1978))。免疫血清于56℃热灭活30分钟，用大鼠红细胞吸附，产生的血清叫做肾毒性血清(NTS)。正常雄性WKY大鼠(125-150g)接受单一静脉内注射亚致肾炎剂量的NTS。选择剂量以使Lewis大鼠中不引起速发的肾小球损伤。
根据已知的方法，对WKY大鼠施用NTS在30分钟内引起巨噬细胞浸润肾小球且在10天期间的数量增长。48小时内肾小球细胞过多十分明显，到第6天出现坏死和早期新月体形成的出现。NTS施用10天后，大多数肾小球显示弥漫性和增生性的肾小球性肾炎。
为检测M-CIF对改变疾病发展的效能，大鼠接受NTS，然后每天腹膜内注射M-CIF和安慰剂。通过每天收集尿和血清分别估计蛋白尿和TNF-α水平来监测疾病的发展。在NTS施用后30分钟到10天的不同时点，处死大鼠，使用商业可获得的对巨噬细胞和T细胞特异的单克隆抗体，通过冰冻切片的免疫组织检查评估对浸润细胞的同一性。
一个慢性氨基核苷肾病的模型用作进行性灶性和节段性肾小球硬化症的原型。此模型中，巨噬细胞浸润肾皮质，其中发现增高的TNF-α水平和提高的内皮缩血管肽受体基因的表达(Diamond等人，美国病理学杂志(Am.J.Pathol)141：887-894(1992)；Diamond等人，实验室研究64：21-28(1991)；Nakamura等人，美国肾脏学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)5：1585-1590(1995))。重125-150g的雄性Sprague-Dawley大鼠用于这些研究。这些大鼠通过右侧颈静脉接受单一静脉内注射嘌呤霉素氨基核苷(50mg/kg；Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)3分钟。两周内动物发展为蛋白尿、严重肾小管间质异常，并显示巨噬细胞的流入。此蛋白尿阶段将缓解，然后至18周重新出现，那时44％的肾小球将显示灶性和节段性肾小球硬化(Diamond等人，国际肾脏学32：671-677(1987))。
为检测M-CIF防止此进行性肾损伤的能力，对大鼠静脉内注射嘌呤霉素氨基核苷，然后每天腹膜内注射M-CIF或安慰剂。在18周研究期内以所选间隔监测蛋白尿和TNF-α血清水平。于不同时点处死大鼠，使用商业可获得的对巨噬细胞和T细胞的单克隆抗体，在肾切片上检查肾皮质浸润。两个个体以盲试方式并使用计算机化的形态测量单元，在用苏木精和曙红染色的标准石蜡切片上估计形态异常程度。
细胞-介导的可导致肉芽肿形成的肾小管免疫损伤的一种模型，用来估计M-CIF改善药物-诱导的间质性肾炎的效能。如以前报道在此模型中使用重140-180g的雄性Brown Norway大鼠(Rennke等人，国际肾脏学45：1044-1056(1994))。半抗原分子(ABA)用作靶抗原。为产生免疫原(ABA-KLH)，将31.4mg的对氨苯砷酸(Eastman KodakCo.，Rochester，NY)溶解于2.5ml 1N HCl中，然后通过亚硝酸钠的缓慢加入使其重氮化，产生活化的ABA。通过在20ml硼酸缓冲盐溶液中溶解500mg匙孔戚血蓝蛋白(KLH)(Calbiochem Corp，La Jolla，CA)制备其溶液，并调节pH至9.2。缓慢加入重氮化的对氨苯砷酸，60分钟后混合物对磷酸缓冲盐溶液透析。产生的ABA-KLH等分样品冻存于－20℃直到使用。
用含5mg/ml H37Ra结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(DifcoLaboratories，Detroit，MI)的完全弗氏佐剂中乳化的1mg ABA-KLH在尾底部皮下免疫大鼠。免疫后10天，用1-2ml含0.05mg/ml异博定的磷酸缓冲盐溶液、2ml活化的ABA(在硼酸缓冲盐溶液中的4mM溶液、pH8.1)、和1ml含0.05mg/ml异博定的磷酸缓冲盐溶液经过肾动脉连续灌注左肾。
为实现这一点，麻醉大鼠，将其置于加热的手术台上，进行剖腹术。分离左肾小管，围绕左肾静脉和腹主动脉放置放松的勒除器。用一个30规格的针插管于左肾动脉，关闭围绕主动脉和肾静脉的勒除器。然后以1.1ml/分钟的速率进行左肾的离体灌注，然后通过临时结扎的左肾静脉的穿孔排出流出物。恢复止血和松开结扎线后，在1-2分钟内进行肾的再灌注。24小时内产生缓和但扩散的炎症细胞浸润，它是由多形核白细胞和单核的细胞组成的。到第5天单核细胞和巨噬细胞占优势。此时(第5天)，75％的肾皮质遭受肉芽肿性炎症。
为检测此模型中M-CIF的效能，每天腹膜内施用M-CIF或安慰剂。在不同时点处死大鼠，定量其血清TNF-α水平，并使用计算机化的形态测量单元在用苏木精和曙红染色的标准石蜡切片上估计参与炎症过程的肾皮质的量。使用商业可获得的对单核细胞/巨噬细胞和T细胞的单克隆抗体，在组织切片上鉴定浸润炎症细胞的同一性。预期在肾损伤中M-CIF导致炎症减少。
实施例20在大鼠佐剂关节炎中M-CIF对慢性关节炎症的保护
类风湿性关节炎中，用当前可获得的药物通常能控制疼痛和肿胀，但中止与此疾病相关的进行性关节破坏是困难的。因此，在解释骨和软骨破坏的细胞和分子机制的更特异的抑制方面进行了很大努力。弗氏佐剂-诱导的大鼠关节炎模型与关节炎患者共有许多特征，包括增生性滑膜炎和四肢肿胀的出现最终导致软骨和骨糜烂(Pearson和Wood，关节炎与风湿病(Arthritis Rheum.)2：440(1959)；Jones和Ward，关节炎与风湿病6：23(1963))。如人类类风湿性关节炎一样，佐剂关节炎大鼠的发炎的滑膜中丰富地存在巨噬细胞(Johnson等人，关节炎与风湿病29：1122(1986))。人们认为巨噬细胞在关节炎中起主要作用，这或是通过分泌组织-降解酶或促炎细胞因子(Lopex-Bote等人，关节炎与风湿病31：769(1988))、或依靠它们在抗原-驱使的应答过程中的免疫调节功能(Unanue和Allen，科学236：551(1987))，以作为组织破坏的效应细胞。已通过定量后爪肿胀(作为急性炎症的测量)和慢性关节损害的软骨和骨中的组织病理学改变，将此动物模型用于抗-炎症和免疫抑制药物的检测。此研究中，我们检测了在佐剂关节炎大鼠模型中M-CIF对急性和慢性炎症关节炎的作用。
第0天，成年雄性Lewis大鼠(120-150g)在尾底部皮内注射弗氏完全佐剂，其制备方法是以5mg/ml的浓度向矿物油中加入乳酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)(Difco Lab，Detroit，MI)。如下所述从第0天到第16天或从第0天到第40天每天对大鼠腹膜内注射M-CIF或其缓冲液。其它组大鼠中每天口服1mg/kg剂量的消炎痛或其甲基纤维素载体。使用器官充满度测量容器(Baxco Electronics，Troy，NY)测量后爪的肿胀。后爪体积表示为两只后爪的体积平均值和爪体积的变化百分比。
在实验最后，切下并处理踝和跗骨关节用于组织学评价。两名研究者以盲试方式使用以下参数评价病理学改变及骨和软骨的变化：血管扩张、纤维化/纤维组织形成、增生/过度生长、管周淋巴聚集、血管翳形成、软骨破坏和骨破坏。用来鉴别变化程度和分布的主观半定量评分系统定义如下：0＝正常；0.5＝轻微；1＝中度；2＝严重；和3＝非常严重。
在第一个实验中，从第0天到第16天处理动物。到第14天(测试的第一时段)动物踝肿胀，第16到20天达到最严重程度。此段时间后急性炎症逐渐消退。M-CIF对踝肿胀的作用显示于图37中。两种剂量的M-CIF都显示爪肿胀的中度减退，然而消炎痛在减退水肿方面更有效。在辅助研究中处理每组两只动物的肢用于组织病理学评分，结果显示于图38中。考虑到急性和慢性特征，与缓冲液对照组相比，从第0天到第16天用M-CIF处理的动物显示总关节炎的显著减少。
根据这些结果，应用第二个实验方案，整个实验中(第0天到第40天)每天处理大鼠。在研究最后，处理每组5只动物的肢用于组织学评价。当每天以3mg/kg的剂量给予M-CIF时，与缓冲液对照相比在慢性滑膜炎(图39)及骨和软骨糜烂(图40)方面有显著减少。消炎痛在慢性关节炎的组织病理中不能显示任何效能。因此，M-CIF对关节炎的慢性特征(最重要的是骨和软骨糜烂)显示显著的保护效果，尽管对急性水肿仅有中度效果。在DBA/1小鼠中M-CIF处理防止发展Ⅱ型胶原蛋白-诱导的关节炎
使用等体积的2mg/ml牛II型胶原蛋白溶液和完全弗氏佐剂制备乳剂。用100μl乳剂在尾底部皮内免疫5-6周龄的雌性DBA/1 LacJ小鼠。18天后，将小鼠分为每组10只小鼠的三个组，腹膜内注射3mg/ml消炎痛、M-CIF、或对照缓冲液。注射重复14天。处理开始两天后(实验开始后20天)，皮下注射100μl总体积中的60μg LPS攻击小鼠。检查动物，并通过以下评分系统半定量关节炎发展的临床表现：发病率＝至少一只爪受影响的小鼠数/小鼠总数×100％临床严重程度得分    性状0.5                 -一只或更多肿胀的趾。  1.0           -全部爪肿胀。2.0           -炎症消退后观察到畸形。3.0           -关节强硬：爪关节功能的全部丧失。
如图41所示，至LPS攻击后4-10天在M-CIF和其缓冲液处理组中都有大约70％的小鼠发展为急性爪水肿。然而，M-CIF处理的小鼠中急性炎症的严重程度明显小于缓冲液组(图42)。随时间延长，缓冲液处理组的发病率和严重程度增加，而M-CIF处理的动物好转。如预期的用作阳性对照的消炎痛在减少发病率和严重程度方面也有效。讨论
佐剂和胶原蛋白诱导的关节炎是具有常见临床和组织特征的广泛使用的类风湿性关节炎的实验模型。类风湿性关节炎中，用当前获得的药物通常可控制疼痛和肿胀，但中止与此疾病相关的进行性关节破坏是困难的。因此，在解释骨和软骨破坏的细胞和分子机制的更特异的抑制方面进行了很大努力。M-CIF对关节炎的慢性特征(最重要的是对导致关节畸形和破坏的骨和软骨糜烂)的保护效果，强烈建议M-CIF具有作为治疗剂用于慢性炎症关节炎如人类风湿性关节炎的良好潜能。尽管M-CIF对急性水肿仅有中度效果，但M-CIF和NSAID的组合处理可治疗急性期关节炎如疼痛和肿胀以及进行性关节破坏。因此，M-CIF显示对关节炎的慢性特征如炎症和疼痛提供保护。实施例21M-CIF对系统性TNF-α产生的抑制作用
脓毒休克是人类中具有显著发病率和死亡率的一种疾病，起因于血液-携带的细菌感染引起的无法控制的细胞因子释放。公认细菌内毒素是革兰氏-阴性脓毒休克发病机理中的主要因素(Morrison和Ryan，医学每年综述38：417(1987)；Wolff和Benett，新英格兰医学杂志291：733(1974))。脓毒休克似乎由应答内毒素的巨噬细胞介导，用于TNF-α和其它细胞因子的产生(Freudenberg等人，感染与免疫51：891(1986)，Tracey等人，自然(Lond)330：662(1987))。
较早的工作显示用M-CIF对小鼠的系统处理在两种动物模型中明显防止了LPS-诱导的致死性休克。由于TNF-α的产生是引起脓毒休克的中心环节，我们提出是否M-CIF干扰TNF-α的产生，并由此保护免于TNF-介导的体内内毒素休克。体内
在第0天用25mg/kg溶于盐水的来自大肠杆菌血清型0127：B8(Sigma，Chemical Co.St.Louis，MO)的脂多糖(LPS)攻击7-8周龄的雌性Balb/c小鼠。LPS注射前1天和前1小时腹膜内施用M-CIF或其缓冲液。于LPS施用后1、2和4小时处死每组4只小鼠。从眼眶后丛获得血清，使用购自Genzyme公司，Cambridge，MA的ELISA试剂盒测定TNF-α水平。如厂商所述进行测定。每个样品1∶4稀释，在双份孔中测定，用不成对T检验分析结果。数据表示为平均值+SEM。
如图43所示，缓冲液对照组中的血清TNF-α水平在LPS注射1小时后最高，然后快速下降。相反，给予3mg/kgM-CIF的小鼠在LPS注射1小时后血清中具有显著少于缓冲液对照组的TNF-α。用1mg/kgM-CIF处理的动物水平减少但未达到统计学显著性。
预期M-CIF对系统性TNF-α产生的抑制作用是M-CIF保护小鼠免于LPS-诱导的脓毒休克的机理的一个方面，此作用将有助于治疗自身免疫炎症疾病如类风湿性关节炎和骨关节炎。体外
将4-6周龄的雌性Balb/c小鼠分为2组，每组10只动物。连续2天对这些组腹膜内注射溶剂对照或注射3mg/kg M-CIF。第二次注射后1小时，处死小鼠并进行腹膜腔灌洗以收集驻留的细胞。然后洗细胞并以1×106细胞/ml的密度重悬浮于培养基中(RPMI1640/20％FBS)。然后将细胞涂于48孔板中，在LPS(1和10ng/ml)存在或不存在下温育过夜。18小时后，收集并冻存每个孔的上清液直到使用。如厂商(Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA)所述进行用于上清液中TNF-α含量测定的ELISA。如图44所见，从M-CIF处理的动物中分离然后用LPS体外处理的细胞，分泌统计学上显著低于从对照小鼠中分离的细胞的TNF-α量。
因而M-CIF具有体内抑制TNF-α产生的能力。此活性将有助于治疗急性和慢性炎症。与以上所示关于循环TNF-α水平的数据一起考虑，能解释M-CIF保护免于LPS诱导的脓毒的机理的一个方面。由于增高的TNF-α水平与很多种免疫细胞疾病或反应相关，所以如在此所述，M-CIF处理能用于这些疾病状况。
最近的研究显示了使用TNF-α抗体或可溶性TNF-α受体抑制TNF-α活性的效能。这些疾病包括急性胰腺炎、同种异体移植排斥、非胰岛素依赖的糖尿病(NIDDM)、哮喘、皮肤中的迟发型超敏反应、肺纤维化和局部缺血/再灌注损伤。相反，TNF-α在肝再生中起旁分泌的作用，并在某些情况下抑制皮肤和心脏的同种异体移植排斥。因此，预期M-CIF或其激动剂有助于治疗这些疾病情况。
实施例22M-CIF作为体内T淋巴细胞的化学引诱物。
将4-6周龄的雌性Balb/c小鼠分为4组，每组10只动物。连续6天对这些组或不处理、或腹膜内注射溶剂对照、或注射1mg/kg或3mg/kg M-CIF。第7天，处死小鼠并进行腹膜腔灌洗以收集驻留的细胞。计算总细胞数，使用如下一系列单克隆抗体对细胞进行细胞表面染色：CD3、CD4、CD8、Mac1、GR1、B220、MHC II类、CD14、CD45和CD5(Pharmingen，San Diego，CA)。
如图45所示，腹膜腔内的总细胞数比未处理或溶剂处理的对照增长2-3倍。这似乎是因为T淋巴细胞的流入，如通过对CD4、CD5和CD8的细胞表面染色所测定的。存在CD4阳性细胞(图46)及CD5和CD8细胞的明显增多，这导致T淋巴细胞相对数量的净增加(图47(2))。另外，存在腹膜腔内细胞Mac1阳性、MHC II类阴性亚群的显著增多，及细胞MHC II类阳性、Mac1阳性亚群百分数的相应减少(图48)。这也反映在腹膜腔内MHC II类阴性、Mac1阳性细胞的总数上(图49)。
因而显示M-CIF是体内T淋巴细胞的化学引诱物。可用于T细胞的CD4、CD8或T细胞的这两个亚群。根据这一点，M-CIF可治疗疾病状况，这得益于此群免疫细胞的吸引和/或激活。这包括细菌或病毒感染、癌症，等等。同样，如果M-CIF对CD4淋巴细胞的Th1或Th2亚类具有特异的作用，也能偏向于细胞因子从这些细胞中的正常产生，并显著地影响其它免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和其它免疫细胞。
在M-CIF处理的动物中Mac1阳性细胞的MHC II类阴性亚群增多，这一事实提示这些动物内的单核细胞群由较高百分数的非激活细胞组成。这与显示来自M-CIF处理的动物之腹膜细胞应答LPS产生较少TNF-α的数据相一致。
实施例23MPIF-1诱导的体内干细胞迁移
为证明MPIF-1刺激体内干细胞迁移，进行以下实验。每一处理组使用6只小鼠(C57Black 6/J，雌性，约6周龄)。对小鼠注射(腹膜内)盐水(溶剂对照)或5μg/鼠的MPIF-1。 30分钟后，将小鼠放血，用库仑特计数器分析WBC。然后，集中每组全部6只动物的血，用FACScan分析Gr.1+细胞和CD34.Sca-1+双阳性细胞。WBC计数表示为平均值±S.D.，FACScan数据表示为％总细胞。由于认为CD34.Sca-1+双阳性细胞显示造血干细胞的预期的特性，所以图50中显示的结果说明MPIF-1能用作干细胞迁移剂。
实施例24M-CIF的纯化
从CHO表达系统中的纯化
M-CIF在中国仓鼠卵巢细胞中表达后，使用以下方法纯化蛋白质。除非另外指明，所有纯化步骤都在5-10℃进行。使用微载体培养系统(cytodex I，Pharmacia)使转染的CHO细胞在HGS-CHO-3培养基中生长4天。用低速离心去除细胞和细胞碎片收获条件培养液。用乙酸调节pH至7.0后，将条件培养液加于用磷酸缓冲盐溶液(PBS)pH7.0预平衡的强阳离子交换柱上(Poros HS-50,Perseptive BiosystemsInc.)。然后用相同缓冲液洗柱，直到280nm的吸光度小于0.01O.D.(10CV)。通过用1M NaCl的磷酸缓冲盐溶液、pH7.0洗柱洗脱希望的蛋白质。然后通过4-20％梯度凝胶用SDS-PAGE分析级分，以确定希望多肽的存在。
然后集中含M-CIF的级分，加于Superdex-75树脂(Pharmacia)的凝胶过滤柱上，此前过滤柱在含50mM乙酸钠和150mM NaCl的“大小分级缓冲液”pH6.0中平衡。所加的样品小于柱体积的10％(V/V)。让样品流入柱后，使用相同缓冲液从凝胶过滤基质中洗脱蛋白质。收集级分，连续监测流出液的280nm吸光度。然后通过SDS-PAGE分析经A280鉴定包含洗脱物质的级分。在中心为0.62柱体积的峰中洗脱出含M-CIF的级分，并将其合并。
将从凝胶过滤色谱合并的级分应用于串联模式的一系列强阴离子(Poros HQ-50，Perseptive Biosystems)和弱阴离子(Poros CM-20)交换柱。两个柱都被预平衡，并在加样后用50mM乙酸钠缓冲液pH6.0洗柱。用相同缓冲系统中的0.3M NaCl随后用0.3M到0.8M NaCl的梯度洗脱阳离子交换柱(CM-20)。经SDS-PAGE分析洗脱的级分，并混合含目的蛋白质的级分。
上述纯化步骤后，如SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色所测，产生的M-CIF纯度大于95％。也对纯化的蛋白质测试了内毒素/LPS污染。根据LAL测定LPS含量少于0.1ng/mg纯化蛋白质。
一种备择的纯化方法也可用来纯化M-CIF。此方法包括以下步骤，除非另外指明，所有步骤都在5-10℃进行。
CHO培养的产生阶段一完成，就使用低速离心去除细胞/细胞碎片获得条件培养液。加入乙酸将培养液pH调节至pH7.0后，将培养液加于用磷酸缓冲盐溶液(PBS)pH7.0预平衡的强阳离子交换柱上(Poros HS-50，Perseptive Biosystems Inc.)。然后用相同缓冲液洗柱，直到280nm的吸光度小于0.01O.D.(10CV)。通过用1M NaCl的磷酸缓冲盐溶液pH7.0洗柱洗脱希望的蛋白质。然后通过4-20％梯度凝胶的SDS-PAGE分析级分，以确定M-CIF的存在。
然后合并含M-CIF的级分，随后加入4倍体积的10mM乙酸钠、pH6.5。然后将稀释的样品加于之前制备的一系列强阴离子(PorosHQ-50，Perseptive Biosystems)和弱阴离子(Poros CM-20，PerseptiveBiosystems)交换树脂的串联柱。用50mM乙酸钠pH6.5平衡柱。用5倍体积的0.2M NaCl、50mM乙酸钠pH6.5洗CM-20柱，并用10倍柱体积从0.2M NaCl、50mM乙酸钠、pH6.5到1.0M NaCl、50mM乙酸钠、pH6.5的线性梯度洗脱。在恒定A280监测流出液收集级分。然后合并那些含目的蛋白质的级分(经4-20％SDS-PAGE测定)。
然后将合并的含M-CIF的级分加于(V/V，5％柱体积)用100mMNaCl、50mM乙酸钠、pH6.5平衡的体积排阻柱上(Superdex-75，Pharmacia)。让样品流入柱后，使用100mM NaCl、50mM乙酸钠、pH6.5从凝胶过滤基质中洗脱蛋白质。收集级分，连续监测流出液的280nm吸光度。然后通过SDS-PAGE分析经A280鉴定为包含洗脱物质的级分。然后合并含M-CIF的级分。
上述三步纯化步骤后，如SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色所测，产生的M-CIF纯度大于95％。也对纯化的蛋白质测试了内毒素/LPS污染。根据LAL测定，LPS含量少于0.1ng/mg纯化蛋白质。来自大肠杆菌的M-CIF的纯化
纯化包括以下步骤，除非另外指明，所有步骤都在4-10℃进行。
大肠杆菌发酵的产生阶段一完成，就将细胞培养物冷却至4-10℃，通过15000转/分连续离心(Heraeus Sepatech)收获细胞。根据每单位重量细胞糊(paste)的预期蛋白质产量和所需纯化蛋白质的量，按重量将适量的细胞糊悬浮于含100mM Tris、50mM EDTA、pH7.4的缓冲液中。使用高剪切混合器将细胞分散为均质的溶液。
然后使溶液以4000-6000psi两次通过微流化器(Microfuidics，Corp.或APV Gaulin，Inc.)裂解细胞。然后将匀浆与NaCl溶液混合至终浓度为0.5M NaCl，随后以7000g离心15分钟。再次使用0.5M NaCl、100mM Tris、50mM EDTA、pH7.4洗涤产生的沉淀。
经洗涤的包涵体用1.5M盐酸胍(GuHCl)溶解2-4小时。7000g离心15分钟后，弃沉淀，将含M-CIF的上清液置于4℃过夜用于进一步的GuHCl提取。
高速离心(30000g)去除不溶颗粒后，重折叠GuHCl溶解的蛋白质，方法是通过剧烈搅拌将GuHCl提取物与20倍体积的含50mM钠、pH4.5、150mM NaCl、2mM EDTA的缓冲液快速混合。进一步的纯化步骤之前，将重折叠的稀释的蛋白质溶液不经混合置于4℃12小时。
为澄清重折叠的M-CIF溶液，使用预先制备的切向过滤单元，它配备具有适当的表面区的0.16um滤膜(Filtron)，并用40mM乙酸钠pH6.0平衡。过滤的样品加样于poros HS-50阳离子交换树脂(Perseptive Biosystems)。用40mM乙酸钠、pH6.0洗柱，以分步方式用相同缓冲液中的250mM、500mM、1000mM和1500mM NaCl洗脱。连续监测流出液的280nm吸光度。收集级分，经SDS-PAGE进一步分析。
然后合并那些含希望蛋白质的级分，与4倍体积的水混合。然后将稀释的样品加样于预先制备的一系列强阴离子(Poros HQ-50，Perseptive Biosystems)和弱阴离子(Poros CM-20，PerseptiveBiosystems)交换树脂的串联柱。用40mM乙酸钠、pH6.0平衡柱子。两种柱都用40mM乙酸钠、pH6.0、200mM NaCl冲洗。然后用10倍柱体积的从0.2M NaCl、50mM乙酸钠、pH6.0到1.0M NaCl、50mM乙酸钠、pH6.5的线性梯度洗脱CM-20柱。在流出液的持续A280监测下收集级分。然后合并那些含目的蛋白质的级分(经16％SDS-PAGE测定)。
以上重折叠和纯化步骤之后，产生的M-CIF纯度大于95％。当加样5ug纯化蛋白质时，从考马斯蓝染色的16％SDS-PAGE凝胶中未发现主要的污染带。也对纯化的蛋白质测试了内毒素/LPS污染。根据LAL测定，LPS含量少于0.1ng/mg。
实施例25M-CIF以剂量依赖的方式抑制M-CSF-刺激的人和小鼠细胞的集落形成。
如此处所述分离并处理先祖细胞。从股骨和胫骨中分离小鼠骨髓细胞，ficoll分离并排除塑料粘附细胞。将两个细胞群都涂板于存在M-CSF(5ng/ml)、含或不含指定浓度的M-CIF的含琼脂培养基中。数据表示为双份进行的样品中集落的平均数+/-S.D.。对小鼠骨髓细胞的克隆发生测定
在双层琼脂培养系统中进行CFU-M集落形成测定。在3.5cm直径的组织培养皿中用1ml MEM培养基制备底层，培养基中补加20％FBS(Sigma Tissue Culture Products，St.Louis，MO)、0.5％Difco琼脂和15ng/ml M-CSF，存在或不存在指定浓度的M-CIF或对照β-家族趋化因子。然后这一层用0.5ml鼠骨髓细胞悬液(104细胞/平皿)覆盖，除含0.3％琼脂和不含细胞因子外，此悬液是如上所述在琼脂培养基中制备的。然后在组织培养箱中温育平皿7天(37℃、88％N2、5％CO2和7％O2)，在倒置显微镜下计数CFU-M集落。对人CD34’衍生细胞的克隆发生测定
将新纯化的CD34’细胞(5×104细胞/ml)在补加人IL-3(10ng/ml)和人SCF(50ng/ml)的Myelocult H5100生长培养基(Stem CellTechnologies Inc.，Vancouver，Canada)中培养4天。计数产生的定向造血先祖群，将1ml MethoCult培养基(Stem Cell Technologies Inc.，Vancouver，BC， Canada)中的1000个细胞涂板于3.5cm直径的组织培养皿中，其中含补充的M-CSF(10ng/ml)、存在或不存在指定浓度的M-CIF或对照β-家族趋化因子。在培养箱中温育14天后(37℃、88％N2、5％CO2和7％O2)，在倒置显微镜下计数集落。
实施例26手术诱导的豚鼠骨关节炎模型中M-CIF的评价
为证明M-CIF减缓骨关节炎(OA)的发病和发展，使用了Hartley豚鼠中手术诱导的OA模型。在实验OA中豚鼠的使用是很好表征的、相关的和可重复的OA模型。这一株显示随年龄增长发展自发的骨关节炎。手术诱导的关节不稳定地产生膝关节中改变的生物力学负载，引起OA。在此模型中发现的病理学改变与在人OA中的发现相似(Meacock，S.C.等人，实验病理学杂志(J.Exp.Pathol.)71(2)：279-93(1990)，Bendele，A.M.等人，兽医病理学(Vet Pathol.)28：207-215(1991)，Jimenez，P.A.等人，炎症研究(Inflam.Res.)44(2)：129-130(1995))。
对用氯胺酮(40mg/kg)、甲苯噻嗪(5mg/kg)、芬太尼(0.06mg/kg)和术后丁丙诺啡(0.05mg/kg)皮下麻醉的8周龄雄性Hartley豚鼠进行手术。手术前，豚鼠禁食12小时。皮肤消毒、手术和术后期间将动物置于加热垫上。用#10刀片切开右膝的关节包膜形成切口。解剖覆盖内侧半月板的筋膜，收缩中间内侧韧带和正中切口。用Tyrel微解剖钩分离前面的内侧半月板，用#15刀片切开前面部分。用连续5-0Vicrylt缝合关节包膜。使用两个创缘夹闭合皮肤，在手术后4天去除。在实验开始时及其后每两周测定动物的重量。
从手术之日起6周每天施用(腹膜内)M-CIF和安慰剂。使用的是：未经处理的对照、安慰剂组和M-CIF处理组。安乐死之前在研究结束时拍摄放射显影图。实验结束时，所有动物都用过量的戊巴比妥钠(300mg/kg)施行安乐死。收获膝关节，在10％福尔马林中固定4天，并在PBS(pH7.2)中的20％甲酸中脱钙4天。以5的间隔切下切片，并用番红精0、固绿和苏木精染色。
使用Mankin评分系统进行组织病理学评估(Mankin HJ.，北美临床整形外科学(Orth.Clin.North America)2：19-30(1971))。
实施例27大鼠肉芽肿性小肠结肠炎的肽聚糖-多糖多聚体模型中M-CIF的评价
为证明M-CIF减缓肉芽肿性小肠结肠炎的发病和发展，使用了Lewis大鼠中手术-诱导的结肠炎模型。在实验结肠炎中Lewis大鼠的使用是很好表征的、相关的和可重复的小肠结肠炎模型。显示在回肠末端、淋巴集结、盲肠和结肠末端的不同区手术植入肽聚糖-多糖(PG-PS)后，Lewis株大鼠易患小肠结肠炎。手术-植入的PG-PS产生急性小肠结肠炎，其高峰在1-2天，保持静止7-9天，到12-17天自发地再活化为可持续多达4个月的活性炎症。(Elson等人，胃肠病学(Gastroenterology)109：1344-1367(1995))。慢性炎症的发展依赖于T-细胞介导的免疫应答、贫乏的可降解的PG-PS和遗传宿主易感性(Sartor等人，方法：酶学方法手册(Methods：A Companion to Methodsin Enzymology)9：233-247(1996))。此模型中观察到的免疫应答与在人小肠结肠炎中观察到的相似。
对用氯胺酮(40mg/kg)、甲苯噻嗪(5mg/kg)、芬太尼(0.06mg/kg)和术后丁丙诺菲(0.05mg/kg)皮下麻醉的130-170g Lewis大鼠(n＝10)进行手术。皮肤消毒、手术和术后期间将动物置于加热垫上。用#10刀片通过腹部切开6-8cm的切口，暴露回肠、盲肠和结肠。对大鼠肌肉内(浆膜下)注射PG-APS(45mg干重和15mg鼠李糖/g体重)。在回盲瓣2和4cm近侧、淋巴集结2个末端、4个中盲肠位置、盲肠末端的淋巴聚集每一部位注射O.05ml(总剂量的1/10)，并在术后4天去除。在实验开始时及其后每5天测定动物的重量。通过踝关节肿胀范围的形态学评分估定炎症的范围。据显示踝关节的大小是肠内炎症存在的可靠指示。
从手术之日起4周每天施用(腹膜内)M-CIF和安慰剂。共有未处理对照组、安慰剂组和M-CIF处理组。
安死术之前2小时，对大鼠注射BrdU(100mg/kg腹膜内)。实验结束时，使用CO2窒息处死所有动物。取自回肠末端、盲肠和结肠末端的样品在10％福尔马林中固定。切成切片并用H&E、粘蛋白胭脂红、三色和抗-BrdU抗体染色。使用Sartor评分系统进行组织病理学评估(Sartor等人，方法：酶学方法手册9：233-247(1996))。
实施例285-Fu治疗期间的MPIF-1处理导致血小板和粒细胞的较快恢复。
化学治疗引起的两个主要并发症是中性白细胞减少(减少的血嗜中性粒细胞计数)和血小板减少(减少的血小板计数)。当前临床用粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)以缓解中性白细胞减少。已知在体外G-CSF刺激粒细胞集落生成单位(CFU-G)的集落形成，并刺激动物模型中的粒细胞产生。血小板生成素(Tpo)在临床试验中用于缓解血小板减少的目的。已知Tpo在体外刺激巨核细胞集落生成单位(CFU-Meg)的集落形成，并刺激动物实验诱导的血小板减少中的血小板产生。G-CSF在临床中的主要限制之一是它在缓解经受多周期化学治疗的患者中性白细胞减少方面无效。这可能是因为G-CSF作用的靶细胞CFU-G在骨髓中耗贫。如最初的临床试验结果所示，Tpo也可遭受同样的命运。任何在化学治疗期间能防止G-CSF和Tpo靶细胞耗贫的试剂都将有很高的临床价值。以下显示的数据建议MPIF-1能满足这一临床需要。
在以前的实施例中，显示MPIF-1在体外抑制双能、粒细胞/单核细胞骨髓先祖的集落形成。尤其是，实施例15-16提供数据证明MPIF-1在体外和体内保护原始、多能骨髓先祖免于5-Fu诱导的细胞毒性。预期这些多能先祖产生包括CFU-G和CFU-Meg的所有骨髓谱系的更多定向先祖。进行以下实验以证明在两个或三个周期的5-Fu治疗期间的MPIF-1处理导致血小板和粒细胞的较快恢复。材料与方法：使用平均体重19.4g(±1.1S.D.，n＝150)的C57BL6雌性小鼠(7-10周龄)。在整个实验过程中，所有小鼠饲养于标准饮食和暗/光循环和温度的居住条件下。MPIF-1制剂(HG00304-E6)在大肠杆菌中制备，代表缺少成熟蛋白质的23个N-端氨基酸的MPIF-1的截短形式(即含一个加入的N-端Met的图25中的MPIF-1突变体-3)。临床等级的G-CSF(Neupogen_)购自Shady Grove Pharmacy，Rockville，MD 20850(Neupogen_是由Amgen Inc.，Amgen Center，Thousand Oaks，CA 91320制造的)。5-氟尿嘧啶(5-Fu)购自SigmaChemicals，它是通过恰好于使用前溶于温水中而新鲜制备的。MPIF-1溶液是通过在普通盐水中稀释而新鲜制备的。同样，在由10mM乙酸钠、5％(wt/v)甘露醇、0.004％(v/v)吐温80组成的pH4.0的缓冲液中稀释G-CSF。合适的与大鼠抗小鼠CD41a、Gra.1和Mac.1抗原的单克隆抗体结合的荧光染料购自Pharmingen。
如下处理5组小鼠(每组30只小鼠)：
组1在第-2、-1、0、6、7和8天腹膜内注射0.1ml普通盐水作为正常对照。
组2在第0和8天腹膜内注射0.2ml 5-Fu溶液(100mg/kg体重)。
组3如组2注射5-Fu，另外在第-2、-1、0、6、7和8天腹膜内注射0.1ml的MPIF-1溶液(1.0mg/kg体重)。
组4如组2注射5-Fu，另外在第1、2、3、9、10和11天腹膜内注射0.1ml的G-CSF溶液(0.5mg/kg体重)。
组5如组2注射5-Fu，如组3注射MPIF-1，如组4注射G-CSF。
然后在所示的天数分析每组6只动物，在外周血和骨髓水平监测血小板和粒细胞恢复。应当指出在第一次注射5-Fu后第6和8天分析的小鼠不接受第二次MPIF-1或5-Fu处理。
从眼眶后沟收集外周血于EDTA-包被的管中，立即经FACSVantage分析以测定血小板(CD41a阳性事件)和粒细胞(Gra.1和Mac.1双阳性细胞)计数。应当指出在此使用的分析方法和动物种不允许获得绝对计数。代替的是，粒细胞表示为总白细胞的百分数，血小板评估为分选仪中每15秒的CD41a阳性事件。然后使用标准方法处死小鼠获得骨髓细胞。也经FACS分析骨髓细胞，监测骨髓中细胞Gra.1和Mac.1双阳性群的百分数。由于无法精确知道这些抗原开始在粒细胞谱系中表达的阶段，所以预期就它们发育和成熟潜能的阶段而言，骨髓中Gra.1和Mac.1双阳性细胞是异质的。
也使用体外克隆发生测定法分析骨髓以测定克隆发生先祖的频率。简要地，在双层琼脂培养系统中进行高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)和低增殖潜能集落形成细胞(LPP-CFC)的测定。用1ml补加20％FBS、0.5％Difco琼脂、7.5ng/ml mIL-3、75ng/ml mCSF、7.5ng/ml hM-CSF和15ng/ml mIL-1α的MEM在3.5cm直径平皿中制备底层。然后此层覆盖0.5ml鼠骨髓细胞悬液，使在含20％FBS和0.3％琼脂的MEM中具有2000个细胞/平皿。允许顶层琼脂在室温固化约15分钟。然后将平皿在组织培养箱(37℃、88％N2、5％CO2和7％O2)中温育14天，在倒置显微镜下计数集落。在此实验中报道了总集落计数。
通过分析从每一时点每组的三只动物中获得的物质产生FACS数据，而用从每一时点每组的六只动物中获得的细胞进行克隆发生测定。最后，当天1组实验的数据点代表从注射盐水的正常小鼠(组1)中获得的值。结果：为监测外周血中血小板的恢复，经FACS Vantage测定CD41a阳性细胞的稳态水平。如图51所示，5-Fu处理前的MPIF-1处理(组3)导致比用5-Fu+盐水处理的小鼠(组2)中所观察到的更快和更强的血小板恢复。如预期，用G-CSF处理的小鼠(组4)中血小板恢复的动力学与用5-Fu+盐水处理的小鼠中所观察到的无差异。同样，与单独用MPIF-1处理的小鼠(组3)中所观察到的相比，向5-Fu处理的小鼠施用G-CSF加MPIF-1(组5)对血小板的总稳态水平很少有作用。因此，5-Fu处理前小鼠的MPIF-1预处理导致外周血中血小板的快速恢复。
通过定量血中Gra.1和Mac.1双阳性细胞的稳态水平来监测外周血中粒细胞的恢复。如图52所示，小鼠的5-Fu处理导致第一次和第二次5-Fu处理6天后血中Gra.1和Mac.1双阳性细胞的稳态水平的急速降低。MPIF-1预处理具有两个有益的作用；与用5-Fu+盐水处理的小鼠(组2)中所观察到的相比，中性白细胞减少的程度(Gra.1和Mac.1双阳性细胞耗贫的程度)更小，并且恢复率更快。如预期，5-Fu处理后G-CSF的施用(组4)导致血中Gra.1和Mac.1双阳性细胞的快速恢复。然而，G-CSF处理的小鼠中中性白细胞减少的程度显著少于第8天在MPIF-1处理的小鼠(组3)中所观察到的。施用MPIF-1加G-CSF(组5)对粒细胞耗贫和恢复的作用很显著，与单独用MPIF-1或G-CSF处理的小鼠中所观察到的相比，这些小鼠显示更高的血中Gra.1和Mac.1双阳性细胞稳态水平。于是，如图52指出，看来当共同施用MPIF-1和G-CSF时它们可行使加成的作用。
如上指出，通过FACS Vantage方法和克隆发生测定来监测骨髓水平的恢复。图53说明了用FACS获得的结果。如预期，在5-Fu处理的骨髓中(组2)从第6天到第14天细胞的Gra.1和Mac.1双阳性群水平保持明显下降，然后到第16天恢复至正常水平。当5-Fu处理之前用MPIF-1处理小鼠(组3)时，5-Fu介导的Gra.1和Mac.1双阳性细胞的耗贫作用完全消除。令人吃惊地，G-CSF(组4)能防止第一次5-Fu施用引起的Gra.1和Mac.1双阳性细胞的耗贫，但第二次不能。这可能是因为G-CSF靶细胞的可得性和G-CSF施用的时间。在用MPIF-1加G-CSF处理的小鼠(组5)中相似的应答是明显的，尽管第一次5-Fu施用后第8天恢复的程度大大高于单独用MPIF-1或G-CSF处理的小鼠中所观察到的。
克隆发生测定的数据显示于图54中。整个实验期的14天中5-Fu引起的骨髓中先祖的频率保持下降，暗示第16天的恢复。在5-Fu处理前用MPIF-1处理的小鼠中，先祖频率的这种减少被消除。相反，在正常或MPIF-1处理的骨髓中发现，对小鼠的G-CSF处理在维持先祖频率方面无效。施用G-CSF加MPIF-1对骨髓中先祖频率的作用看来是复杂的。
实施例29rhM-CIF处理对MRL lpr/lpr小鼠中狼疮肾炎的改善
系统性红斑狼疮(SLE)是多器官相关的自身免疫疾病，其特征在于致病性自身抗体的过量产生、和能诱导危胁生命的肾小球性肾炎和血管炎的补体-结合的免疫聚集的形成(Steinberg，A.D.和Klinman，D.M.，北美风湿性疾病临床(Rheum.Dis.Clinics of No.Amer.)14：25(1988))。
由于在编程性细胞死亡fas受体中的突变(Watanabe-Fukunaga，R.等人，自然356：314-317(1992))，MRL lpr/lpr小鼠自发发展具有与人SLE的血清学和免疫病理学相似的一种自身免疫疾病(Andrews，B.S.，等人，实验医学杂志148：1198(1978))。这种鼠模型的广泛表征提供了对人狼疮病理的许多理解，包括对许多自身抗原的高自身抗体效价、肾小球性肾炎、关节炎、血管炎和过早死亡(Theofilopoulos，A.N.和Dixon，F.J.，免疫学综述(Immunol.Rev.)55：179(1981)；Tarkowski，A.等人，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)72：91(1988))。
MRL lpr/lpr小鼠中异常巨噬细胞和其它细胞和分子缺陷与自身免疫疾病的发病机理有关(Cohen，P.L.和Eisenberg，R.A.，免疫学每年综述9：243-269(1981))。MRL lpr/lpr小鼠具有数量增多的腹膜巨噬细胞，它们处于比正常小鼠的巨噬细胞更激活的阶段(Kelly，V.E.和Roths，J.B.，免疫学杂志129：923(1982)；Dang-Vu，A.P.，等人，免疫学杂志138：1757(1987))。另外，MRL lpr/lpr巨噬细胞产生高水平的促炎细胞因子如IL-1和TNF-α。巨噬细胞很少存在于正常肾小球中，但能在蛋白尿之前在MRL lpr/lpr肾小球中发现，并在肾小球性肾炎发展中更突出(Boswell，J.M.，等人，免疫学杂志141：3050(1988))。
rhM-CIF，一种新的β-趋化因子，具有弱的趋化活性，除经与MIP-1α和RANTES共享的受体诱导单核细胞细胞内Ca2+流出外，它对大多数白细胞无活性(Schulz-Knappe，P.，等人，实验医学杂志183：295(1996))。另外，rhM-CIF对M-CSF-诱导的幼单核细胞集落形成具有强选择性抑制作用(Kreider，B.L.，等人，“特异抑制M-CSF介导的集落形成的β-家族趋化因子”国际细胞因子学会和国际干扰素和细胞因子研究学会第一次联合会议(1996)上的口头介绍)。我们早期的体内工作证明，rhM-CIF对LPS-或活大肠杆菌细菌-诱导的巨噬细胞-介导的致死性脓毒有显著保护作用，这至少部分归因于小鼠中TNF-α的减少和IL-10血清水平的升高(Zhang，J.，等人，“rhM-CIF(HCC-1)对TNF-α和IL-10的选择性调节与其在SCID小鼠中对LPS-介导的致死性脓毒的保护作用相关”。在Keystone Symposia，趋化因子在白细胞运输和疾病中的作用(1997)上的口头和招贴介绍)。在鼠胶原蛋白-诱导的关节炎和大鼠佐剂关节炎模型中也观察到rhM-CIF对中度和进行性关节伤害的显著改善作用(Zhang，J.等人，“佐剂关节炎大鼠模型中rhM-CIF(HCC-1)对进行性关节破坏的保护。”风温病学ILAR大会(1997)张贴介绍；Sturm，B.等人，“rhM-CIF(HCC-1)对小鼠胶原蛋白-诱导的关节炎的改善作用。”提交风湿病学美国大学第61届全国会议的摘要(1997))。
在本研究中，我们检查了rhM-CIF对MRL lpr/lpr小鼠自发狼疮模型的可能的作用。狼疮肾炎发展的整个病程中用rhM-CIF预防处理，显著改善了肾小球损伤和肾硬化，并且通过减少蛋白质管型形成保护了肾功能。rhM-CIF或氨甲喋呤对过早死亡都没有显著作用，或许这是除肾之外其它器官中疾病的严重程度的后果。材料与方法动物
雌性MRLlpr/lpr小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，并在实验使用之前根据推荐标准供养于HGS动物设施中至少一周。化学药品
Amethopterin(氨甲喋呤)购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)。盐溶液从Abbott Labs(North Chicago，IL)获得。重组人M-CIF(批次B9)在杆状病毒载体中表达，并通过SDS-PAGE纯化，分子量为8.677Kd。然后在由40mM NaOAc、150mM NaCl组成的、含少于0.2EU/mg内毒素水平的pH5.5的缓冲液中溶解蛋白质。实验设计
从没有病征的鼠8周龄开始，14周中每周从星期一到星期五，对50只MRL lpr/lpr小鼠，每组8-9只，每天施用缓冲液中的rhM-CIF或盐水中的氨甲喋呤(1或5mg/kg，腹膜内)。接受缓冲液或盐水的小鼠用作疾病对照。监测动物的临床症状和每周或每两周的发病率，直到缓冲液处理组中的致死率达到50％。在实验结束时处死所有剩余的动物进行肾的组织病理学评估。组织病理学分析
移除两只肾，立即置于10％中性缓冲的福尔马林中，用于石腊包埋和切片。组织切片用苏木精和曙红、PAS和三色染色，用于综合检查。用多-盲法进行肾损伤的病理学评估。根据观看所有玻片后的总印象，使用主观评分系统，它通过将0、+/-、+、++、+++、++++给予以下组织病理学特征而提供改变程度和分布的区别：
1)肾小球损伤，如不规则的细胞过多和膨大、基膜增厚、脱核、纤维化和透明化、新月体形成和肾小囊纤维化。
2)肾小管损伤，包括肾小管腔中蛋白质管型的形成(为了便于估定损伤的严重程度，在此将蛋白质管型的形成分类，尽管它也有助于提高肾小球毛细管丛基膜的通透性)和肾小管的实质萎缩和代偿性肥大和扩张。
3)间质损伤，包括炎症浸润、淋巴血管周炎、间质纤维化。
4)总的外观，如颗粒型肾硬化。
使用以下评分系统进行半定量分析：0＝0；+/-＝1；+＝2；++＝4；+++＝6；和+++＝8。
一旦完成个体组织病理学评估，即译解玻片，并与每组相配，用于解释关于处理方式的病理学改变。巨噬细胞免疫组化分析
使用特异的大鼠抗小鼠(F4/80)巨噬细胞抗原的单克隆抗体(Caltag Labs，San Francisco，CA)对MRL lpr/lpr肾石腊切片的巨噬细胞进行染色，随后进行标准的免疫组化技术。用于评估肾中巨噬细胞浸润程度的标准与以上提到的(0到++++)相似。统计分析
将存活小鼠的百分数计算为存活小鼠/总小鼠的数量×100％。实验结束时仅对有不少于4只存活小鼠的组进行组织病理学数据的分析。单独或结合InStat统计软件计算不同病理学特征的平均得分、SEM和P值。结果rhM-CIF对MRL lpr/lpr小鼠存活率的影响
当rhM-CIF的B11批次用尽时，14周中每周从星期一到星期五，每天用缓冲液或盐水中的氨甲喋呤(1或5mg/kg，腹膜内)处理自发自身免疫的MRL lpr/lpr小鼠。与用作疾病发展对照的缓冲液处理组相比，除在实验结束时缓冲液处理组达到56％的致死率、而rhM-CIF1mg/kg处理组为63％的存活率以外，在16周的实验期间rhM-CIF处理显示相似的存活率(图55)。类似于rhM-CIF处理，用低剂量氨甲喋呤(1mg/kg)处理的组显示与盐水对照组平行的模式，直到实验的最后一周有大约20％的保护。然而，用高剂量氨甲喋呤(5mg/kg)处理的组显示死亡率加快，这可能是因为其积累的毒性(图56)。rhM-CIF处理使MRL lpr/lpr肾中蛋白质管型减少
经组织病理学评估测定的蛋白质管型信息被选作对蛋白尿的备择测定方法，用来估计肾功能。此辅助实验结束时只有三组(缓冲液、1mg/kg rhM-CIF和氨甲喋呤)有4只存活的小鼠，对其定量用于随后的组织学分析。如图57所示，缓冲液对照组在MRL lpr/lpr肾的髓袢、远曲小管、集合小管和小管腔中显示大量的蛋白质和细胞管型。相反，在rhM-CIF(1mg/kg)处理的小鼠中只发现少量的蛋白质管型；氨甲喋呤(1mg/kg)组中的一只小鼠显示严重的蛋白质管型形成，而其它三只小鼠完全保持无此病理学特征。当与缓冲液组比较时，rhM-CIF使蛋白质管型形成的减少有统计学显著性(p＝0.02)。rhM-CIF对肾小球损伤的改善作用
肾小球损伤、尤其是毛细管丛和肾小球基膜的损伤是狼疮模型中看到的基本特征。缓冲液对照组中一半的存活小鼠(两只小鼠)在几乎所有可见的肾小球中显示极严重的损害，表现为肾小囊中巨噬细胞的过度增殖和新月体的广泛形成；PAS染色证明的丛中肾小球膜细胞的增殖；由于核破裂的脱核、导致“线-环(wire-loop)损伤”的基膜增厚、红细胞向肾小囊的渗漏以及纤维化和/或透明化。另外，完全或部分功能异常的肾小球在皮质区广泛扩散。新月体形成、壁层和脏层的粘附和肾小囊的纤维化以百分比计与肾小球损伤一样严重。此组中的其它两只小鼠显示不严重的损伤。相反，用rhM-CIF(1mg/kg)处理的大多数存活小鼠(3/5)显示为缓冲液对照约50％的严重程度，而其它(2/5)只显示很轻的损害或没有明显的肾小球损伤。除了只有一只动物显示相对严重的肾小球损伤外，用氨甲喋呤处理的大多数存活小鼠(3/4)中也看到相似的轻度损伤。与缓冲液对照相比rhM-CIF处理的小鼠中减少的肾小球损伤有统计学显著性(p＝0.01)(图58)。rhM-CIF延缓了肾硬化的发展
狼疮肾小球性肾炎的进行性和长期过程最后导致由于病灶萎缩和肾小球及肾小管的代偿性肥大引起的肾硬化。在用缓冲液对照处理的四只小鼠的两只中此晚期特征严重，它们的肾表面显示类似去毛的皮的点状疤痕。其它两只小鼠不显示这种高等变化。比较地，除偶尔观察到较轻的肾小管萎缩外，在rhM-CIF处理的组中没有小鼠显示明显的肾硬化。此外，在氨甲喋呤组(n＝4)中只有一只小鼠发展硬化特征的高等状态，其它三只小鼠保持无肾硬化。统计学分析表明缓冲液对照中的肾硬化严重程度显著高于rhM-CIF和氨甲喋呤处理组(图59)。rhM-CIF适度抑制MRL lpr/lpr肾中的巨噬细胞浸润
MRL lp/lpr肾中巨噬细胞的存在是进行性肾小球性肾炎的一个重要病征。免疫组化分析显示巨噬细胞广泛浸润缓冲液处理的小鼠的肾。严重程度与上述其它病理学特征平行。有明显肾损伤的两只小鼠显示最严重的巨噬细胞浸润。它们出现于与增殖的肾小囊上皮细胞混合的肾小球新月体中、肾小球周围区、肾单位间质和血管周围浸润区。此组中的其它三只小鼠显示中度或轻度巨噬细胞浸润，这也与其损伤严重程度平行。然而，氨甲喋呤处理组中具有轻度组织病理学损伤的两只小鼠显示相对较高的巨噬细胞浸润得分。此组中最严重的小鼠也显示最严重的巨噬细胞浸润。与缓冲液组相比，在rhM-CIF组中似乎适度抑制巨噬细胞的出现，尽管p值是统计学显著性边缘的0.08。rhM-CIF对MRL lpr/lpr肾中淋巴细胞浸润和血管周炎的作用的缺乏
肾间质组织中淋巴细胞大量和扩散的浸润是此MRLlpr/lpr模型中的另一个显著病理学特征。这些浸润主要见于血管周围(较大动脉如小叶间动脉或甚至弓状动脉)区、肾小球周围区和间质。在缓冲液对照中由于大量萎缩的肾小管，间质中的淋巴细胞浸润似乎更严重。然而，在rhM-CIF和氨甲喋呤处理的小鼠中的肾小球周围区发现大量浸润，尽管它们的肾小球损伤很轻。浸润的细胞型不同。在血管周围区(尤其是较大动脉周围)，大多数细胞是原淋巴细胞和原单核细胞。浸润全图显示多细胞型的淋巴细胞，它们类似于增大的淋巴结中看到的细胞分类(数据未显示)。缓冲液、rhM-CIF和氨甲喋呤处理组间的半定量和比较显示没有明显的血管周炎和肾小球周炎的差异(图61)。讨论
在此小规模实验中，实验结束时通过肾组织病理学评估的蛋白质管型形成被选作蛋白尿的备择特征，用来估计肾功能。初步结果显示在狼疮肾炎发展过程中rhM-CIF预防处理14周，导致5-6月龄的MRLlpr/lpr肾中蛋白质管型形成的显著减少，以及肾小球损伤和肾硬化的改善。然而，rhM-CIF对肾炎和/或血管炎-诱导的过早死亡显示作用很小或没有作用。
MRL lpr/lpr肾小球中异常激活的巨噬细胞的存在与狼疮肾炎的发病机理有关；肾中M-CSF mRNA转录物的水平增加和MRLlpr/lpr小鼠循环中的M-CSF蛋白质可能是巨噬细胞浸润和激活的原因(Yui，M.A.，等人，美国病理学杂志(Amer.J.Path.)139：255(1991))。尽管rhM-CIF处理对MRLlpr/lpr肾中的巨噬细胞浸润显示适度抑制，但rhM-CIF对引起组织破坏的M-CSF-介导的肾巨噬细胞功能的可能作用仍不清楚。然而，以前的研究指出rhM-CIF在以下方面有效：(1)抑制M-CSF-诱导的幼单核细胞集落形成，(2)保护免于LPS-诱导的巨噬细胞介导的致死性脓毒，以及(3)在体内系统地下调TNF-α和上调IL-10。所有这些后果可为rhM-CIF对狼疮肾炎的改善作用提供支持的证据。
肾间质组织中淋巴细胞的大量浸润是来自人SLE的MRL lpr/lpr小鼠的独特病理学特征，它是由免疫或自身免疫应答期间淋巴细胞的克隆缺失中fas受体缺陷所引起的。rhM-CIF对MRL lpr/lpr肾中淋巴细胞浸润的作用的缺乏提示，rhM-CIF对MRL lpr/lpr淋巴细胞的迁移、激活和克隆扩充没有抑制作用。确实，rhM-CIF显示在体外对激活的T淋巴细胞有趋化性。综述
初步研究显示，象氨甲喋呤一样，在自发的自身免疫疾病发展期间，延长的rhM-CIF处理通过减少MRL lpr/lpr肾中蛋白质管型形成、肾小球损伤和最后的肾硬化，显著改善了狼疮肾炎的发展。然而，象氨甲喋呤一样，rhM-CIF对肾炎和/或血管炎-诱导的过早死亡显示很小或没有作用。临床前药理学总表
下表(表4、5和6)总结了体外和体内的一级和二级药理学研究。表5、6和8中引用的批次的表关键点MPIF-1批次被称为多成分代码，它指出表达蛋白质的生物和表达产物的形式(例如，成熟、全长或变异体)。在名称最后的连字号后的字母指出表达蛋白质的生物或用于表达的载体(即，B＝杆状病毒，C＝CHO细胞，E＝大肠杆菌)。连字号之前的最后三个数字指出表达的蛋白质的形式或变异体(即，300＝全长的MPIF-1，301＝MPIF-1Δ17变异体，302＝含加至成熟氨基酸序列氨基端的甲硫氨酸残基的成熟MPIF-1，304＝MPIF-1Δ23变异体，311＝全长的MPIF-1)。因而，批次名称指出表达的MPIF-1蛋白质的形式、蛋白质是否将从宿主细胞中分泌、及分泌的蛋白质的形式，如果有的话。例如，HG00300-B5指出使用杆状病毒载体表达全长的MPIF-1蛋白质。进而，由于昆虫宿主细胞加工用此系统表达的MPIF-1，所以此蛋白质的分泌形式是成熟MPIF-1。
以上指出的命名法的一个例外发生于批次HG00300-B7。此批包含四种不同MPIF-1多肽的一种混合物。发明者相信这些多肽的产生是发生于纯化过程中的MPIF-1蛋白酶解剪切的结果。在实施例17中讨论了批次HG00300-B7中存在的MPIF-1变异体。
表4.一级药理学—体外
实验设计 细胞型 MPIF-1Δ23剂量 化学试剂 结果
MPIF-1或MPIF-1Δ23对使用小鼠骨髓的集落形成的作用 HPP-CFCLPP-CFC  0.01-100ng/ml NA -MPIF-1和MPIF-1Δ23都引起LPP-CFC频率的剂量依赖的减少。-在测试的所有浓度上MPIF-1Δ23显著地比MPIF-1更有效。-两个同种型对HPP-CFC频率都没有显著影响。
MPIF-1Δ23对人造血先祖细胞增殖的作用 CD34+人索血 1-1000ng/ml NA -MPIF-1Δ23处理导致细胞存活的20％-40％的抑制。-结果提示MPIF-1Δ23是骨髓先祖抑制因子。
MPIF-1Δ23导向的特异先祖细胞型的测定 CD34+人 50ng/ml NA -MPIF-1Δ23抑制(50％-64％)CFU-GM和CFU-Mix的生成。-BFU-E、CEU-G、CFU-M和CFU-Meg的生成未被抑制。-结果将MPIF-1Δ23定义为人粒细胞/单核细胞前体细胞的抑制剂。
MPIF-1Δ23对小鼠骨髓抑制作用的表征 小鼠骨髓 50ng/ml NA -MPIF-1Δ23将骨髓CFU-GM集落的频率减少至对照的30％。-LPP-CFC集落的频率被减少至对照的24％。-MPIF-1Δ23不抑制CFU-E、BFU-E和HPP-CFC集落的形成。
测定MPIF-1Δ23保护骨髓细胞的谱系-排除群免于5-Fu细胞毒作用的能力 小鼠骨髓 NA 5-Fu -MPIF-1Δ23保护40％-50％的LPP-CFC免于5-Fu诱导的细胞毒性。-MPIF-1Δ23不保护HPP-CFC。
表5.一级药理学—体内
实验设计 种 MPIF-1批次 MPIF-1剂量、日程、途径 化学试剂 剂量、日程、途径 结果
MPIF-1或MPIF-1Δ23对外周血和骨髓中HPP-CFC和LPP-CFC频率的体内作用 小鼠 HG00300-B5HG00304-E2 0.5mg/kg，每天注射两次，8小时间隔，共2天，腹膜内 NA NA -MPIF-1Δ23显著降低骨髓中LPP-CFC的频率。-MPIF-1Δ23对血中LPP-CFC频率的作用是不定的。-MPIF-1Δ23对HPP-CFC的频率没有影响。
用于保护免于5-Fu细胞毒作用的最佳MPIF-1Δ23施用日程的确定 小鼠 HG00304-E2 1mg/kg，第-3和第0天间不定，腹膜内 5-Fu 150mg/kg，第0天，腹膜内 -于第-2、-1和0天给予的MPIF-1Δ23在保护骨髓免于5-Fu的细胞毒作用方面最有效。
MPIF-1Δ23对5-Fu后骨髓恢复的剂量依赖性的测定 小鼠 HG00304-E6 0.01    到10mg/kg，于第-2、-1、0天，腹膜内 5-Fu 150mg/kg，腹膜内 -在第4天观察到剂量-依赖的反应，及在最低检测剂量(0.01mg/kg)发生的最佳恢复。-在第6天未观察到剂量反应。-在第8天获得钟形剂量反应曲线，及在0.1mg/kg观察到的最佳活性。
MPIF-1Δ23在体内保护骨髓先祖免于细胞毒性治疗的能力的测定 小鼠 HG00304-E6 1mg/kg，第-2、-1、0天，腹膜内 5-Fu 150mg/kg，第0天，腹膜内 -用5-Fu处理7天后，用MPIF-1Δ23处理的小鼠的骨髓的集落形成回复至正常。-单独用5-Fu处理的小鼠的骨髓集落形成在此时未显示恢复。
MPIF-1Δ23对多周期化学治疗保护效果的测定 小鼠 HG00304-E6 1mg/kg，第-2、-1、0、6、7、8天 5-Fu 100mg/kg，第0和8天，腹膜内 -两个周期的5-Fu后MPIF-1Δ23保护先祖细胞。-5-Fu的第二个周期后看到最显著的保护。-根据血中造血衍生的CD45+细胞的增长的数量，MPIF-1Δ23的化学保护效果出现于外周。
多周期化学治疗后MPIF-1Δ23加速骨髓集落、嗜中性粒细胞和血小板恢复的能力的测定结合G-CSF的MPIF-1Δ23活性的测定 小鼠 HG00304-E6 1mg/kg；第-2、-1、0、6、7、8天，腹膜内 5-FuG-CSF 100mg/kg，第0和8天，腹膜内0.5mg/kg，第1、2、3、9、10和11天 -与单独用5-Fu处理的小鼠相比，用MPIF-1和5-Fu处理的小鼠中，如通过Gr-1和Mac-1双阳性细胞的排除所测定的，中性白细胞减少的程度显著降低。恢复率更快。5-Fu后用G-CSF处理导致血中双阳性细胞的快速恢复，第8天，G-CSF处理的小鼠中恢复的范围显著少于MPIF-1处理的小鼠中所观察到的。-用MPIF-1和G-CSF处理的小鼠比单独用MPIF-1或G-CSF处理的小鼠在血中具有更高稳定状态水平的阳性细胞。用5-Fu处理的小鼠的骨髓集落形成显著减少。-5-Fu前的MPIF-1处理消除5-Fu对集落形成的作用。相对于单独用5-Fu处理的小鼠中所见到的，在用MPIF-1和5-Fu处理的小鼠中存在更快和更强的血小板恢复。G-CSF的添加没有进一步的效果。
表6.二级药理学—体外
实验设计 细胞型 MPIF-1批次 MPIF-1剂量范围 结果
MPIF-1或MPIF-1Δ23钙质迁移的测定 T细胞、B细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、NK细胞、THP-1细胞 HG00300-B7HG00302-E2HG00302-F3HG00304-E2HG00304-E3HG00304-E6HG00304-E7HG00301-C1HG00311-C1 1到1000ng/ml -100ng/ml时在单核细胞和树突细胞中观察到可检测到的应答。-单核细胞系THP-1对MPIF-1Δ23的应答在100ng/ml时有最大效果。
MPIF-1Δ23趋化活性的测定 T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞、血小板 HG00300-B5HG00300-B7HG00302-E1HG00302-E2HG00303-E1HG00304-E2HG00304-E6HG00304-E7 0.1到1000ng/ml -在休止T细胞中MPIF-1Δ23刺激趋化性，最大应答在10ng/ml.-MPIF-1Δ23对新分离的单核细胞有趋化性，最大效果在100ng/ml。-在嗜中性粒细胞中观察到弱趋化应答。在检测的其它细胞中无应答。
MPIF-1或MPIF-1Δ23对单核细胞的作用 单核细胞 HG00300-B7HG00302-E1HG00302-E2HG00302-E3HG00304-E3HG00304-E6HG00301-C1HG00311-C1  0.5到1000ng/ml -MPIF-1Δ23诱导溶酶体N-乙酰β-D-葡糖苷酶从新分离的单核细胞中的较低但不定的释放。-MPIF-1Δ23对溶酶体酶弹性蛋白酶。葡糖醛酸糖苷酶、和髓过氧化物酶的释放没有影响。-MPIF-1Δ23不诱导单核细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-10或IL-12。-MPIF-1Δ23对激活的巨噬细胞的氧化突发或细胞毒活性没有影响。
MPIF-1或MPIF-1Δ23对组胺释放的影响 嗜碱性粒细胞，人 HG00300-B5HG00300-B7HG00302-E2HG00304-E6 1到1000ng/ml -MPIF-1和MPIF-1Δ23不诱导从嗜碱性粒细胞的组胺释放。
MPIF-1或MPIF-1Δ23对NK细胞-介导的杀伤的影响 NK细胞，人 HG00302-E1HG00300-B7 1到100ng/ml -MPIF-1和MPIF-1Δ23对K562细胞的IL-2刺激的NK细胞-介导的杀伤没有影响。
MPIF-1或MPIF-1Δ23对血小板聚集的影响 血小板，人 HG00302-E1HG00300-B7 0.1到100ng/ml -MPIF-1Δ23不诱导或调节血小板聚集。
MPIF-1Δ23对非转化的人细胞生长的影响 成纤维细胞、星形胶质细胞、神经膜细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、静脉和微血管内皮细胞、骨髓、B细胞、T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、角质细胞 HG00300-B7HG00300-B5HG00302-E1 0.1到1000ng/ml -MPIF-1Δ23不诱导、增强或抑制研究所列细胞的增殖。
MPIF-1或MPIF-1Δ23对IL-6和前列腺素释放的影响 人原代内皮细胞、肺成纤维细胞和主动脉平滑肌细胞 HG00300-B5HG00300-B7HG00302-E1HG00300-E2HG00304-E2HG00301-C1 0.1到1000ng/ml -MPIF-1和MPIF-1Δ23对IL-6或前列腺素的释放没有影响。
MPIF-1Δ23对毛细管形成的影响 原代微血管内皮细胞 HG00304-E2 0.1到100ng/ml -MPIF-1Δ23在体外不诱导毛细管的形成。
MPIF-1对肿瘤细胞浸润内皮细胞汇合单层的能力的影响 原代内皮细胞 HG00300-B7 0.1到10ng/ml -没有影响。
MPIF-1或MPIF-1Δ23对外周血单核细胞或粒细胞粘附IL-1激活的内皮的影响 原代内皮细胞  HG00300-B5HG00300-B5HG00304-E6HG00304-E7HG00301-C1 0.1到100ng/ml -没有影响。
实施例30使用pHE4-5表达载体生产、回收和纯化MPIF-1Δ23
MPIF-1是一种新型人β-趋化因子。MPIF-1的成熟形式分泌为99个氨基酸的肽，分子量为11.2kDa。在MPIF-1的最初表达研究期间也鉴定了长度为76个氨基酸的截短形式(MPIF-1Δ23)。在杆状病毒表达系统中，随后分离并亚克隆MPIF-1Δ23。生物测定表明截短形式比全长的对应物更有效。克隆和表达
将最初从主动脉内皮互补脱氧核糖核酸文库中分离的MPIF-1Δ23基因亚克隆至表达载体pHE4的单限制酶切位点NdeI和Asp718处(图62)，并转化入K12衍生的大肠杆菌株SG 13009(可从Susan Gottesman，National Institutes of Health，Bethesda，MD.获得)。可使用pHE4用作蛋白质表达中合适宿主，其它大肠杆菌株包括DH5α和W3110(ATCC保藏号27325)。pHE4载体包含一个具有两个Lac操纵基因的强合成启动子。此启动子的表达由lac组抑蛋白的存在所调节，并使用异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖诱导。此质粒也包含一个有效的核糖体结合位点和MPIF-1Δ23基因下游的一个合成转录终止子。载体也包含pUC质粒的复制区和导致转化细菌中卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因。生产方法发酵过程概述
在以下阶段概述了MPIF-1Δ23的发酵过程，并在图63中说明。主种子库
在当前的优质生产规范下制备用表达MPIF-1Δ23的质粒转化的大肠杆菌主种子库(MCB)。在含甘油作为冰冻保护剂的培养基中制备此库，并冻于-80℃。制备后，检测MCB以确定不存在噬菌体或其它微生物的污染。初次接种期
在含种子制备培养基的带挡板的摇瓶中制备首次接种期培养物。用解冻的种子原种1∶2000稀释接种摇瓶，并置于摇床中，保持225转/分和37℃12小时。生产阶段
在配备DO2、pH、温度和营养进料控制的100升分批补料发酵罐中制备生产阶段培养物。用初次接种期培养物接种生产培养基(37℃)以提供每毫升0.20单位的600nm处光密度(OD)。当培养物达到600nm处OD为每毫升10加或减2单位时，添加IPTG(终浓度20mM)诱导蛋白质表达。诱导4小时后收获细胞。细胞收获阶段
使用连续流动离心经18000g的离心回收细菌。将产生的细胞糊贮存于-80℃。MPIF-1Δ23的回收
图64中概述了MPIF-1Δ23的回收。细胞裂解
解冻大肠杆菌细胞糊，重悬浮于10倍体积的重悬缓冲液中。然后以7000psi通过(两次)匀浆器后破裂细胞。包涵体的洗涤
将NaCl加入细胞裂解产物至终浓度0.5M，然后使用0.45-μm膜通过切向流过滤将其浓缩两倍。存留的残余物对3倍体积的洗涤缓冲液2(100mM Tris-HCl、500mM NaCl和25mM EDTA-Na2)、随后对1倍体积的洗涤缓冲液1(100mM Tris-HCl、25mM EDTA-Na2)渗滤。用洗涤缓冲液1两倍稀释存留物，通过连续离心收集不溶组分。备择地，可用离心洗涤包涵体。包涵体的溶解
将离心后获得的最终沉淀悬浮于相同的9倍浓缩的包涵体体积的溶解缓冲液中(100mM Tris-HCl、1.75M盐酸胍和25mM EDTA-Na2)。搅拌悬液，温度最初为室温2到4小时，然后在2℃到10℃处理12到18小时。重折叠
离心悬液，收集上清液并与9倍体积的重折叠缓冲液(100mM乙酸钠、125mM NaCl和2mM EDTA-Na2)混合。稀释的物质放置约两个小时(2到10℃)以允许沉淀物沉淀。过滤物质，然后可直接处理或贮存可达72小时然后处理。纯化HS-50阳离子交换色谱
图65中概述了MPIF-1Δ23的纯化。将滤液加样于用50mMNaOAc、150mM NaCl、pH5.8到6.2平衡的POROS HS-50柱中。以分步方式用NaCl(300到1500mM)洗脱蛋白质。汇集用500mM NaCl洗脱的级分，并用注射用水稀释两倍。HQ-50/CM-20阴离子/阳离子交换色谱
将HS-50色谱后获得的汇集的级分加样于用CM-1缓冲液平衡的一系列串联柱中(HQ-50柱随后是CM-20柱)。用NaCl(100到900mM)从CM-20柱上洗脱MPIF-1Δ23。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和反相高效液相色谱(HPLC)分析洗脱的级分，汇集那些含MPIF-1Δ23的级分，经超滤或通过一个另外的HS-50柱浓缩。体积排阻色谱
将CM-20洗脱物加样于用S-100缓冲液平衡的Sephacryl-100 HR上。收集级分，并通过SDS-PAGE和反相HPLC分析。汇集含MPIF-1Δ23的级分，使用0.2μm滤膜无菌过滤，并贮存于2到10℃。大量物质的特征
列于表7中的以下特征已为大量MPIF-1Δ23而建立。
表7：大量MPIF-1Δ23释放的检测和试验特征
描述 特征
外观 清澈、无色的溶液
PH  5.8±0.2
经BCA的蛋白质浓度 1-5mg/ml
纯度*反相HPLC体积排阻HPLCSDS-PAGE(考马斯蓝染色)还原条件非还原条件 ≥90％≥90％≥90％≥90％
残留的DNA ≤100pg每mg蛋白质
内毒素鲎变形细胞溶解物试验 ≤10EU每mg蛋白质
生物测定(经Ca2+动用测定所估定) 报告结果
*MPIF-1Δ23制剂的纯度将与当前已定义特征的标准对照相对比。药物产物的特征
最终的药物产物满足表7中对大量物质所描述的所有特征，也检测了其无菌情况(21CRF610.12)。MPIF-1Δ23介导的集落形成的抑制与MPIF-1在单核细胞中迁移细胞内Ca2+的能力相关
在体外软琼脂测定中MPIF-1Δ23抑制LPP-CFC集落形成，并诱导单核细胞包括THP-1细胞(人骨髓单核细胞系)中细胞内钙的迁移。在纯化和稳定性研究中，两种测定都用来估定MPIF-1Δ23的生物活性。LPP-CFC测定中，将新分离的鼠骨髓细胞涂板于存在多种细胞因子(5ng/ml IL-3、50ng/ml SCF、5ng/ml M-CSF和10ng/ml IL-1α)的软琼脂中。温育培养物14天，然后，使用倒置显微镜计数集落。
钙质迁移测定使用Fura-2负载的(0.2nM每百万)的新分离的人单核细胞或THP-1细胞。当用MPIF-1Δ23刺激细胞时，用荧光计估定Ca2+的迁移。Ca2+迁移测定法提供了一种关于MPIF-1Δ23制剂活性的快速指示法(表8)。
表8：MPIF-1Δ23介导的集落形成的抑制与MPIF-1在单核细胞中迁移细胞内Ca2+的能力相关
MPIF-1构件/批/条件 Ca2+动用(ng/ml)* LPP-CFC抑制(ng/ml)+
MPIF-1/HG00300-B5 1000 20-40
MPIF-1Δ23/HG00304-E2，贮存于4℃3个月 100 5-10
MPIF-1Δ23/HG00304，贮存1周 100 5-10
MPIF-1Δ23/HG00304，贮存4周 100 5-10
MPIF-1/HG00302-E2，贮存于4℃3个月 1000 ＞100
 MPIF-1Δ23/HG00304-E3，CM柱的第一峰 100 5-10
MPIF-1Δ23/HG00304-E4，CM柱的第二峰 100 5-10
MPIF-1Δ23/HG00304-E3，CM柱的第三峰 ＞1000 ＞1000
*在人单核细胞和/或THP-1细胞中动用钙所需的最小浓度
+与对照相比产生LPP-CFC集落形成50％抑制的浓度制剂与贮存
无菌生产大量MPIF-1Δ23，液体制剂是无菌、单次使用的产物。蛋白质在50mM乙酸钠、125mM NaCl、pH5.8中缓冲，装入5-mlWheaton 1型玻璃小瓶中并贮存于2到8℃。稳定性
在温度-80℃、2到8℃、20到25℃和2到8℃，使用pH5、6和7的乙酸钠缓冲的1.0mg/ml蛋白质浓度进行稳定性研究。发现当贮存在pH5到7的10mM乙酸钠、125mM NaCl溶液中、贮存于或低于2到8℃时，MPIF-1Δ23至少稳定6个月。当前正在进行的研究中，测定样品的外观、蛋白质浓度、纯度(SDS-PAGE(还原和非还原)；反相和体积排阻HPLC)和活性(Ca2+迁移生物测定)以满足以前概述的特性。
开始了用于临床前毒理学研究的对于MPIF-1Δ23批次(HG00304-E10)的稳定性研究。在50mM NaOAc、125mM NaCl、pH5.9中以4.0mg/ml的蛋白质浓度配制用于这些研究的MPIF-1Δ23批次。贮存条件是-80℃、2到8℃、25℃和37℃、60％的相对湿度，以及45℃、75％的相对湿度。稳定性研究的持续时间是可达25℃的温度时12个月、37℃6个月和45℃1个月。将测定外观、pH、蛋白质浓度、纯度(SDS-PAGE(还原和非还原)；反相和体积排阻HPLC)和活性(Ca2+迁移生物测定)稳定性。在所选的时点进行内毒素测定和生物负荷检测。
应当清楚本发明可以与前面所述和实施例中所具体描述的不同方式实施。
根据以上所讲，本发明的许多修饰和变异是可能的，并且因此在附加的权利要求书的范围之内。
在此涉及的所有专利、专利申请和发表的公开内容在此引入作为参考。
                        序列表(1)一般信息(i)申请人：Human Genome sciences，Inc.
        9410 Key West Avenue
        Rockville，MD 20850
        美国
申请人/发明人：GENTZ，REINER L.
               PATEL，VICKRAM
               KREIDER，BRENT L.
               ZHANG，JUN
               ANTONACIO，MICHAEL
               MENDRICK，DONNA
               JIMENEZ，PABLO(ii)发明名称：用髓先祖抑制因子-1、单核细胞集落抑制因子和
巨噬细胞抑制因子-4治疗疾病的组合物和方法(iii)序列数目：57(iv)联系地址：
(A)地址：STERNE，KESSLER，GOLDSTEIN&FOX P.L.L.C.
(B)街道：1100 NEW YORK ANENUE，N.W.，SUITE600
(C)城市：WASHINGTON
(D)州：    DC
(E)国家：美国
(F)邮政编码(ZIP)：20005-3934(v)计算机可读信息：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)当前申请数据：
(A)申请号：待分配
(B)递交日：本日
(C)分类：(vi)在先申请数据：
(A)申请号：US 60/027，299
(B)递交日：1996年9月30日(vi)当前申请数据：
(A)申请号：US 60/027，300
(B)递交日：1996年9月30日(viii)代理人/代理机构信息：
(A)姓名：STEFFE，ERIC K.
(B)登记号：36，688
(C)文献/卷号：1448.033 PC09(ix)通讯信息：
(A)电话：(202)371-2600
(B)传真：(202)371-2540
(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：282个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：均有(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..279(xi)SEQ ID NO：1的序列描述ATG AAG ATC TCC GTG GCT GCA ATT CCC TTC TTC CTC CTC ATC ACC ATC      48Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr Ile1               5                  10                  15GCC CTA GGG ACC AAG ACT GAA TCC TCC TCA CGG GGA CCT TAC CAC CCC      96Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro
                 20          25                  30TCA GAG TGC TGC TTC ACC TAC ACT ACC TAC AAG ATC CCG CGT CAG CGG      144Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg
     35                  40                         45ATT ATG GAT TAC TAT GAG ACC AAC AGC CAG TGC TCC AAG CCC GGA ATT      192Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile
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             85                  90(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：93个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：2的序列描述Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr Ile1               5                  10                  15Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro
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             85                  90(2)SEQ ID NO：3 信息：(i)序列特征：
(A)长度：363个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：均有(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..360(xi)SEQ ID NO：3的序列描述ATG AAG GTC TCC GTG GCT GCC CTC TCC TGC CTC ATG CTT GTT ACT GCC          48Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala1               5                  10                  15CTT GGA TCC CAG GCC CGG GTC ACA AAA GAT GCA GAG ACA GAG TTC ATG          96Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met
         20                  25                  30ATG TCA AAG CTT CCA TTG GAA AAT CCA GTA CTT CTG GAC AGA TTC CAT         144Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His
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 50                  55                  60TGT TCA CTC CTG GAG AGT TAC TTT GAA ACG AAC AGC GAG TGC TCC AAG         240Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys65                  70                  75                  80CCG GGT GTC ATC TTC CTC ACC AAG AAG GGG CGA CGT TTC TGT GCC AAC         288Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn
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    115                 120(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：120个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：4的序列描述Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala1                5                  10                  15Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met
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    115                 120(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：270个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：均有(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..267(xi)SEQ ID NO：5的序列描述ATG AAG GGC CTT GCA GCT GCC CTC CTT GTC CTC GTC TGC ACC ATG GCC             48Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met Ala1               5                  10                  15CTC TGC TCC TGT GCA CAA GTT GGT ACC AAC AAA GAG CTC TGC TGC CTC             96Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu
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     35                  40                  45GAA ACC AGC CCC CAG TGC CCC AAG CCA GGT GTC ATG CTC CTA ACC AAG            192Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val Met Leu Leu Thr Lys
 50                  55                  60AGA GGC CGG CAG ATC TGT GCT GAC CCC AAT AAG AAG TGG GTC CAG AAA            240Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys65                  70                  75                  80TAC ATC AGC GAC CTG AAG CTG AAT GCC TGA                                    270Tyr Ile Ser Asp Leu Lys Leu Asn Ala
             85(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：89个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：6的序列描述Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met Ala1               5                  10                  15Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu
         20                  25                      30Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser
     35                  40                  45Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val Met Leu Leu Thr Lys
 50                  55                  60Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys65                  70                  75                  80Tyr Ile Ser Asp Leu Lys Leu Asn Ala
             85(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：100个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：7的序列描述Met Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu1               5                   10                  15Prc Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala
        20                  25                  30Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu
    35                  40                  45Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile
50                  55                  60Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys65                  70                  75                  80Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys
            85                  90                  95Thr Arg Lys Asn
        100(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：76个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：8的序列描述Met Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro1               5                   10                  15Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser
        20                  25                  30Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg
    35                  40                  45Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met
  50                 55                  60Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn65                  70                  75(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：78个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：9的序列描述His Ala Ala Gly Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr1               5                   10                  15Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr
        20                  25                  30Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly
    35                  40                  45Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met
50                  55                  60Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn65                  70                  75(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：599个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：均有(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：35..445(xi)SEQ ID NO：10的序列描述GTCCTCCGGC CAGCCCTGCC TGCCCACCAG GAGG ATG AAG GTC TCC GTG GCT             52
                                  Met Lys Val Ser Val Ala
                                    1               5GCC CTC TCC TGC CTC ATG CTT GTT ACT GCC CTT GGC TCC CAG GCC CGG          100Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Gly Ser Gln Ala Arg
         10                  15                  20GTC ACA AAA GAT GCA GAG ACA GAG TTG ACG ATG TCA AAG CTT CCA TTG          148Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Leu Thr Met Ser Lys Leu Pro Leu
     25                  30                  35GAA AAT CCA GTA CTT CTG GAC ATG CTC TGG AGG AGA AAG ATT GGT CCT          196Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Met Leu Trp Arg Arg Lys Ile Gly Pro
 40                  45                  50CAG ATG ACC CTT TCT CAT GCC GCA GGA TTC CAT GCT ACT AGT GCT GAC          244Gln Met Thr Leu Ser His Ala Ala Gly Phe His Ala Thr Ser Ala Asp55                  60                  65                  70TGC TGC ATG TCC TAC ACC CCA CGA AGC ATC CCG TGT TCA CTC CTG GAG          292Cys Cys Met Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu
             75                  80                  85AGT TAC TTT GAA ACG AAC AGC GAG TGC TCC AAG CCG GGT GTC ATC TTC          340Ser Tyr Phe Glu Thr Ash Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe
         90                  95                 100CTC ACC AAG AAG GGG CGA CGT TTC TGT GCC AAC CCC AGT GAT AAG CAA          388Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln
        105             110                 115GTT CAG GTT TGC ATG AGA ATG CTG AAG CTG GAC ACA CGG ATC AAG ACC          436Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr
120                 125                 130AGG AAG AAT TGAACTTGTC AAGGTGAAGG GGACACAAGT TGCCAGCCAC                  485Arg Lys Asn135CAACTTTCTT   GCCTCAACTA  ACTTCCTGAA  TTCTTTTTTT   AAGAAGCATT  TATTCTTGTG 545TTCTGGATTT   AGAGCAATTC  ATCTTTTCTC  ACCTTTAAAA   AAAAAAAAAA  AAAA       599(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：137个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：11的序列描述Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala1               5                  10                  15Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Leu Thr
         20                  25                  30Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Met Leu Trp
     35                  40                  45Arg Arg Lys Ile Gly Pro Gln Met Thr Leu Ser His Ala Ala Gly Phe
 50                  55                  60His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Met Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile65                  70                  75                  80Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser
             85                  95                  95Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala
        100                 105                 110Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu
    115                 120                 125Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn
130                 135(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：12的序列描述TCAGGATCCG TCACAAAAGA TGCAGA
                                              26(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：13的序列描述CGCTCTAGAG TAAAACGACG GCCAGT    26(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：14的序列描述CCCGCATGCG GGTCACAAAA GATGCAG                           27(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：15的序列描述AAAGGATCCT CAATTCTTCC TGGTCTT                           27(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：48个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：16的序列描述ACATGCATGC GUGUUACCAA AGACGCUGAA ACCGAAUUCA UGAUGUCC    48(2)SEQ ID NO：17的信息：  (i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：17的序列描述GCCGAAGCTT TCAGTTTTTA CGGGTTTTGA TACGGG           36(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：
(A)长度：88个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：18的序列描述GCATGCGUGU UACCAAAGAC GCUGAAACCG AAUUCAUGAU GUCCAAACUG CCGCUGGAAA    60ACCCGGUUCU GCUGGACCGU UUCCACGC                                       88(2)SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征：
(A)长度：104个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA  (xi)SEQ ID NO：19的序列描述GCUGGAAUCC UACUUCGAAA CCAACUCCGA AUGCUCCAAA CCGGGUGUUA UCUUCCUGAC   60CAAAAAAGGU CGUCGUUUCU GCGCUAACCC GUCCGACAAA CAGG                   104(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征：
(A)长度：89个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：20的序列描述AAGCTTTCAG TTTTTACGGG TGGGCAGACG GGTGTCCAGT TTCAGCATAC GCATACAAAC   60CTGAACCTGT TTGTCGGACG GCTTAGCGC                                     89(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征：
(A)长度：94个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：21的序列描述GGTTTCGAAG TAGGATTCCA GCAGGGAGCA CGGGATGGAA CGCGGGGTGT AGGAGATGCA   60GCAGTCAGCG GAGGTAGCGT GGAAACGGTC CAGC                               94(2)SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：22的序列描述GCGCAGCCAT GGAAAACCCG GTTCTGCTGG AC               32(2)SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征：
(A)长度：83个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(xi)SEQ ID NO：23的序列描述Met Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp1               5                   10                   15Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu
        20                  25                  30Ser Tyr Phe Glu Thr Ash Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe
    35                  40                  45Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln
50                  55                  60Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr65                  70                  75                  80Arg Lys Asn(2)SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：24的序列描述GCCATGGCAT GCTGGAAAAC CCGGTTCTGC TGGAC            35(2)SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征：
(A)长度：84个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(xi)SEQ ID NO：25的序列描述Met Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala1               5                   10                  15Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu
        20                  25                  30Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile
    35                  40                  45Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys
50                  55                  60Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys65                  70                  75                  80Thr Arg Lys Asn(2)SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：26的序列描述GCGCAGCCAT GGACCGTTTC CACGCTACCT CC               32(2)SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征：
(A)长度：77个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(xi)SEQ ID NO：27的序列描述Met Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Zle Ser Tyr Thr1               5                   10                  15Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn
        20                  25                  30Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg
    35                  40                  45Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg
50                  55                  60
Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn
65                  70                  75
(2)SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征：
(A)长度：29个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：28的序列描述GCCATGGCAT GCGTTTCCAC GCTACCTCC                   29(2)SEQ ID NO：29的信息：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：29的序列描述GCGCAGCCAT GGCTACCTCC GCTGACTGCT GC                      32(2)SEQ ID NO：30的信息：(i)序列特征：
(A)长度：73个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：肽(xi)SEQ ID NO：30的序列描述Met Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile1               5                   10                  15Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser
            20              25                  30Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala
    35                  40                  45Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu
50                  55                  60Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn65                  70(2)SEQ ID NO：31的信息：(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：31的序列描述TTCGAAGTAG GCTTCCAGCA G                           21(2)SEQ ID NO：32的信息：(i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA  (xi)SEQ ID NO：32的序列描述CTGCTGGAAG CCTACTTCGA A                           21(2)SEQ ID NO：33的信息：(i)序列特征：
(A)长度：35个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：33的序列描述GCCATGGCAT GCGTGTTACC AAAGACGCTG AAACC            35(2)SEQ ID NO：34的信息：(i)序列特征：
(A)长度：100个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(xi)SEQ ID NO：34的序列描述Met Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu1               5                   10                  15Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala
        20                  25                  30Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu
    35                  40                  45Glu Ala Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile
50                  55                  60Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys65                  70                  75                  80 Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Tnr Arg Ile Lys
            85                  90                  95Thr Arg Lys Asn
100(2)SEQ ID NO：35的信息：(i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：35的序列描述GCCCAAGCTT TCAGTTTTTA CGGGTTTTGA TACGGG           36(2)SEQ ID NO：36的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：36的序列描述TCAGGATCCT GTGCACAAGT TGGTACC                     27(2)SEQ ID NO：37的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：37的序列描述AAAAAGCTTT CAGGCATTCA GCTTCAG                     27(2)SEQ ID NO：38的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：38的序列描述AAACCATGGC ACAAGTTGGT ACCAAC                          26(2)SEQ ID NO：39的信息：(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：39的序列描述GCCCGCGGAT CCTCCTCACG GGGACCTTAC                  30(2)SEQ ID NO：40的信息：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：40的序列描述GCCTGCTCTA GATCAAAGCA GGGAAGCTCC AG               32(2)SEQ ID NO：41的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：41的序列描述AAATCATGAC CAAGACTGAA TCCTCCT                     27(2)SEQ ID NO：42的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：42的序列描述AAAAAGCTTT CAGTTCTCCT TCATGTC                     27(2)SEQ ID NO：43的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：43的序列描述GGAAAGCTTA TGAAGGTCTC CGTGGCT                     27(2)SEQ ID NO：44的信息：(i)序列特征：
(A)长度：59个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：44的序列描述CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA TTCTTCCTGG TCTTGATCC    59(2)SEQ ID NO：45的信息：(i)序列特征：
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：45的序列描述AAAGGATCCG CCACCATGAA GGTCTCCGTG GTC              33(2)SEQ ID NO：46的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：46的序列描述AAAGGATCCT CAATTCTTCC AGGTCTT                     27(2)SEQ ID NO：47的信息：(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：47的序列描述GGAAAGCTTA TGAAGGGCCT TGCAGCTGCC                  30(2)SEQ ID NO：48的信息：(i)序列特征：
(A)长度：57个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：48的序列描述CGCTCTAGAT CAABCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG GCATTCAGCT TCAGGTC    57(2)SEQ ID NO：49的信息：(i)序列特征：
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：49的序列描述AAAGGATCCG CCACCATGAA GGGCCTTGCA AGC              33(2)SEQ ID NO：50的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：50的序列描述AAAGGATCCT CAGGCATTCA GCTTCAG                     27(2)SEQ ID NO：51的信息：(i)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：51的序列描述GGAAAGCTTA TGAAGATTCC GTGGCTGC                    28(2)SEQ ID NO：52的信息：(i)序列特征：
(A)长度：58个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：52的序列描述CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG TTCTCCTTCA TGTCCTTG    58(2)SEQ ID NO：53的信息：(i)序列特征：
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)SEQ ID NO：53的序列描述AAAGGATCCG CCACCATGAA GATCTCCGTG GCT              33(2)SEQ ID NO：54的信息：(i)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA  (xi)SEQ ID NO：54的序列描述AAAGGATCCT CAGTTCTCCT TCATGTCCTT                  30(2)SEQ ID NO：55的信息：(i)序列特征：
(A)长度：92个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：不相关
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：55的序列描述Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala1               5                   10                  15Leu Cys Asn Gln Phe Ser Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala
        20                  25                  30Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala
    35                  40                  45Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe
 50                  55                  60Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp65                  70                  75                  80Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala
            85                  90(2)SEQ ID NO：56的信息：(i)序列特征：
(A)长度：4208个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)SEQ ID NO：56的序列描述AAGCTTAAAA AACTGCAAAA AATAGTTTGA CTTGTGAGCG GATAACAATT AAGATGTACC         60CAATTGTGAG CGGATAACAA TTTCACACAT TAAAGAGGAG AAATTACATA TGGACCGTTT        120CCACGCTACC TCCGCTGACT GCTGCATCTC CTACACCCCG CGTTCCATCC CGTGCTCGCT        180GCTGGAATCC TACTTCGAAA CCAACTCCGA ATGCTCCAAA CCGGGTGTTA TCTTCCTGAC        240CAAAAAAGGT CGTCGTTTCT GCGCTAACCC GTCCGACAAA CAGGTTCAGG TTTGTATGCG        300TATGCTGAAA CTGGACACCC GTATCAAAAC CCGTAAAAAC TGATAAGGTA CCTAAGTGAG        360TAGGGCGTCC GATCGACGGA CGCCTTTTTT TTGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT        420CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG        480TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG        540CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG        600GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC        660TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC        720ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG        780AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT        840CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG        900GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA        960TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG           1020TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT           1080CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC           1140GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC           1200GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT           1260GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC           1320GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC           1380AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG           1440AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CGTCGACAAT TCGCGCGCGA           1500AGGCGAAGCG GCATGCATTT ACGTTGACAC CATCGAATGG TGCAAAACCT TTCGCGGTAT           1560GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC CAGTAACGTT           1620ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG TGGTGAACCA           1680GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG CGGAGCTGAA           1740TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC TGATTGGCGT           1800TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA TTAAATCTCG           1860CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG GCGTCGAAGC           1920CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA TCATTAACTA           1980TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG TTCCGGCGTT           2040ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC ATGAAGACGG           2100TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG CGCTGTTAGC           2160GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA AATATCTCAC           2220TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA TGTCCGGTTT           2280TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC TGGTTGCCAA           2340CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC GCGTTGGTGC           2400GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA TCCCGCCGTT           2460AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC GCTTGCTGCA           2520ACTCTCTCAG GGCCAGGCGG TGAAGGGCAA TCAGCTGTTG CCCGTCTCAC TGGTGAAAAG           2580AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG CCGATTCATT           2640AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC AACGCAATTA           2700ATGTAAGTTA GCGCGAATTG TCGACCAAAG CGGCCATCGT GCCTCCCCAC TCCTGCAGTT           2760CGGGGGCATG GATGCGCGGA TAGCCGCTGC TGGTTTCCTG GATGCCGACG GATTTGCACT           2820GCCGGTAGAA CTCCGCGAGG TCGTCCAGCC TCAGGCAGCA GCTGAACCAA CTCGCGAGGG           2880GATCGAGCCC GGGGTGGGCG AAGAACTCCA GCATGAGATC CCCGCGCTGG AGGATCATCC           2940AGCCGGCGTC CCGGAAAACG ATTCCGAAGC CCAACCTTTC ATAGAAGGCG GCGGTGGAAT           3000CGAAATCTCG TGATGGCAGG TTGGGCGTCG CTTGGTCGGT CATTTCGAAC CCCAGAGTCC           3060CGCTCAGAAG AACTCGTCAA GAAGGCGATA GAAGGCGATG CGCTGCGAAT CGGGAGCGGC           3120GATACCGTAA AGCACGAGGA AGCGGTCAGC CCATTCGCCG CCAAGCTCTT CAGCAATATC           3180ACGGGTAGCC AACGCTATGT CCTGATAGCG GTCCGCCACA CCCAGCCGGC CACAGTCGAT           3240GAATCCAGAA AAGCGGCCAT TTTCCACCAT GATATTCGGC AAGCAGGCAT CGCCATGGGT           3300CACGACGAGA TCCTCGCCGT CGGGCATGCG CGCCTTGAGC CTGGCGAACA GTTCGGCTGG           3360CGCGAGCCCC TGATGCTCTT CGTCCAGATC ATCCTGATCG ACAAGACCGG CTTCCATCCG           3420AGTACGTGCT CGCTCGATGC GATGTTTCGC TTGGTGGTCG AATGGGCAGG TAGCCGGATC           3480AAGCGTATGC AGCCGCCGCA TTGCATCAGC CATGATGGAT ACTTTCTCGG CAGGAGCAAG           3540GTGAGATGAC AGGAGATCCT GCCCCGGCAC TTCGCCCAAT AGCAGCCAGT CCCTTCCCGC           3600TTCAGTGACA ACGTCGAGCA CAGCTGCGCA AGGAACGCCC GTCGTGGCCA GCCACGATAG           3660CCGCGCTGCC TCGTCCTGCA GTTCATTCAG GGCACCGGAC AGGTCGGTCT TGACAAAAAG           3720AACCGGGCGC CCCTGCGCTG ACAGCCGGAA CACGGCGGCA TCAGAGCAGC CGATTGTCTG           3780TTGTGCCCAG TCATAGCCGA ATAGCCTCTC CACCCAAGCG GCCGGAGAAC CTGCGTGCAA           3840TCCATCTTGT TCAATCATGC GAAACGATCC TCATCCTGTC TCTTGATCAG ATCTTGATCC           3900CCTGCGCCAT CAGATCCTTG GCGGCAAGAA AGCCATCCAG TTTACTTTGC AGGGCTTCCC           3960AACCTTACCA GAGGGCGCCC CAGCTGGCAA TTCCGGTTCG CTTGCTGTCC ATAAAACCGC           4020CCAGTCTAGC TATCGCCATG TAAGCCCACT GCAAGCTACC TGCTTTCTCT TTGCGCTTGC           4080GTTTTCCCTT GTCCAGATAG CCCAGTAGCT GACATTCATC CGGGGTCAGC ACCGTTTCTG           4140CGGACTGGCT TTCTACGTGT TCCGCTTCCT TTAGCAGCCC TTGCGCCCTG AGTGCTTGCG           4200GCAGCGTG                                                                    4208(2)SEQ ID NO：57的信息：(i)序列特征：
(A)长度：112个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)SEQ ID NO：57的序列描述
AAGCTTAAAA AACTGCAAAA AATAGTTTGA CTTGTGAGCG GATAACAATT AAGATGTACC      60
CAATTGTGAG CGGATAACAA TTTCACACAT TAAAGAGGAG AAATTACATA TG             112

Claims (81)

1.  一种抑制髓先祖细胞增殖或分化的方法，其包括对个体施用有效量的下列多肽，多肽选自：
(a)髓先祖抑制因子-1(MPIF-1)N-端缺失突变体，其包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：4的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基缺失；
(b)MPIF-1 C-端缺失突变体，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：4的至少最末C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基缺失，其中该MPIF-1 C-端缺失突变体的N-端氨基酸残基是SEQ ID NO：4的氨基酸残基1(Met)或22(Arg)；
(c)MPIF-1 N-端和C-端缺失突变体，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：4的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基的缺失以及SEQ ID NO：4的至少最末C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失；
(d)含与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；
(e)含与(b)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；
(f)含与(c)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；
(g)含除至少一个氨基酸替换以外与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽；
(h)含除至少一个氨基酸替换以外与(b)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽；和
(i)含除至少一个氨基酸替换以外与(c)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
2.  权利要求1的方法，其中该个体是人。
3.  权利要求1的方法，其中髓先祖细胞是低增殖潜能-集落形成细胞(LPP-CFC)。
4.  权利要求1的方法，其中髓先祖细胞是粒细胞-单核细胞集落生成单位(CFU-GM)。
5.  权利要求1的方法，其中该个体经受杀死分裂细胞的治疗。
6.  权利要求5的方法，其中该治疗选自化学治疗或放射治疗。
7.  权利要求6的方法，其中在该治疗之前施用该多肽。
8.  权利要求7的方法，进一步包括在该治疗之后施用髓刺激物。
9.  权利要求8的方法，其中该髓刺激物选自粒细胞-集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子、白细胞介素-11和血小板生成素。
10.  权利要求6的方法，其中该多肽的施用导致血小板或粒细胞的加速恢复。
11.  权利要求10的方法，其中该血小板或粒细胞的加速恢复缓解血小板减少或中性白细胞减少。
12.  权利要求1的方法，其中施用该多肽治疗髓增生疾病。
13.  权利要求12的方法，其中该疾病选自特发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)和特发性骨髓外化生(AMM)。
14.  权利要求1的方法，其中该多肽是(a)。
15.  权利要求14的方法，其中该突变体具有至少前37个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基的缺失。
16.  权利要求15的方法，其中该突变体具有至少前48个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基的缺失。
17.  权利要求15的方法，其中该突变体具有至少前37个N-端氨基酸残基但至多前48个N-端氨基酸残基的缺失。
18.  权利要求17的方法，其中该突变体具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，其选自：Leu(38)-Asn(120)；Glu(39)-Asn(120)；Leu(44)-Asn(120)；Asp(45)-Asn(120)；Arg(46)-Asn(120)；His(48)-Asn(120)；Ala(49)-Asn(120)。
19.  权利要求18的方法，其中该突变体具有氨基酸序列Asp(45)-Asn(120)。
20.  权利要求14的方法，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
21.  权利要求15的方法，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
22.  权利要求16的方法，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
23.  权利要求17的方法，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
24.  权利要求18的方法，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
25.  权利要求19的方法，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
26.  权利要求1的方法，其中该多肽是(d)。
27.  权利要求26的方法，其中该氨基酸序列与(a)所述MPIF-1 N-端缺失突变体的氨基酸序列至少97％相同。
28.  权利要求27的方法，其中该氨基酸序列与(a)所述MPIF-1 N-端缺失突变体的氨基酸序列至少99％相同。
29.  权利要求1的方法，其中该多肽是(g)。
30.  权利要求29的方法，其中所述至少一个氨基酸替换选自：Asp(45)Ala；Asp(45)Gly；Asp(45)Ser；Asp(45)Thr；Asp(45)Met；Asp(53)Ala；Asp(53)Gly；Asp(53)Ser；Asp(53)Thr；Asp(53)Met；Ser(51)Gly；Ser(34)Gly；Pro(60)Thr；和Ser(70)Ala。
31.  权利要求1的方法，其中该多肽是(b)。
32.  权利要求31的方法，其中该突变体具有至少最后15个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。
33.  权利要求32的方法，其中该突变体具有至少最后20个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。
34.  权利要求33的方法，其中该突变体具有至少最后36个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。
35.  权利要求34的方法，其中该突变体具有至少最后41个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。
36.  权利要求31的方法，其中该突变体具有至少最后48个C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基的缺失。
37.  权利要求31的方法，其中该氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
38.  权利要求1的方法，其中该多肽是(e)。
39.  权利要求38的方法，其中该氨基酸序列与(b)所述MPIF-1 C-端缺失突变体的氨基酸序列至少97％相同。
40.  权利要求39的方法，其中该氨基酸序列与(b)所述MPIF-1 C-端缺失突变体的氨基酸序列至少99％相同。
41.  权利要求1的方法，其中该多肽是(h)。
42.  权利要求41的方法，其中所述至少一个氨基酸替换选自：Asp(45)Ala；Asp(45)Gly；Asp(45)Ser；Asp(45)Thr；Asp(45)Met；Asp(53)Ala；Asp(53)Gly；Asp(53)Ser；Asp(53)Thr；Asp(53)Met；Ser(51)Gly；Ser(34)Gly；Pro(60)Thr；Ser(70)Ala；Ala(21)Met；Thr(24)Ala；Lys(25)Asn；Asp(26)Ala；Glu(30)Gln；Glu(28)Gln。
43.  权利要求1的方法，其中该多肽是(c)。
44.  权利要求1的方法，其中该多肽是(f)。
45.  权利要求1的方法，其中该多肽是(i)。
46.  一种经分离的多肽，其选自：
(a)髓先祖抑制因子-1(MPIF-1)N-端缺失突变体，其包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：4的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基缺失；
(b)含与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；和
(c)含除至少一个氨基酸替换以外与(a)所述的MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽；
其中经分离的多肽不包含如SEQ ID NO：4所示的选自Glu(39)-Asn(120)；Leu(44)-Asn(120)；Asp(45)-Asn(120)；或Arg(46)-Asn(120)的氨基酸序列；以及
其中经分离的多肽抑制髓先祖细胞的增殖或分化。
47.  权利要求46之经分离的多肽，其中该多肽是(a)。
48.  权利要求47之经分离的多肽，其中该突变体具有至少前37个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基的缺失。
49.  权利要求48之经分离的多肽，其中该突变体具有至少前48个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基的缺失。
50.  权利要求49之经分离的多肽，其中该突变体具有至少前37个N-端氨基酸残基但至多前48个N-端氨基酸残基的缺失。
51.  权利要求50之经分离的多肽，其中该突变体具有如SEQ IDNO：4所示的选自Leu(38)-Asn(120)；His(48)-Asn(120)；和Ala(49)-Asn(120)的氨基酸序列。
52.  权利要求47之经分离的多肽，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
53.  权利要求48之经分离的多肽，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
54.  权利要求49之经分离的多肽，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
55.  权利要求50之经分离的多肽，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
56.  权利要求51之经分离的多肽，其中该突变体的氨基酸序列包含加至N-端的氨基酸甲硫氨酸。
57.  权利要求46之经分离的多肽，其中该多肽是(b)。
58.  权利要求57之经分离的多肽，其中该氨基酸序列与(a)所述MPIF-1 N-端缺失突变体的氨基酸序列至少97％相同。
59.  权利要求58之经分离的多肽，其中该氨基酸序列与(a)所述MPIF-1 N-端缺失突变体的氨基酸序列至少99％相同。
60.  权利要求46之经分离的多肽，其中该多肽是(c)。
61.  权利要求60之经分离的多肽，其中所述至少一个氨基酸替换选自：Asp(45)Ala；Asp(45)Gly；Asp(45)Ser；Asp(45)Thr；Asp(45)Met；Asp(53)Ala；Asp(53)Gly；Asp(53)Ser；Asp(53)Thr；Asp(53)Met；Ser(51)Gly；Ser(34)Gly；Pro(60)Thr和Ser(70)Ala。
62.  权利要求46之经分离的多肽，它是由重组宿主细胞产生的或包含于其中。
63.  权利要求62之经分离的多肽，其中该宿主细胞是大肠杆菌。
64.  权利要求1的方法，其中该多肽与药学可接受的载体或赋形剂一起施用。
65.  权利要求46之经分离的多肽，与药学可接受的载体或赋形剂结合。
66.  编码权利要求46的多肽之经分离的多核苷酸。
67.  权利要求66的经分离的多核苷酸，它是DNA。
68.  一种制备重组载体的方法，包括将权利要求66的多核苷酸插入载体。
69.  一种用权利要求68的方法产生的重组载体。
70.  一种制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求69的重组载体引入宿主细胞。
71.  一种用权利要求70的方法产生的重组宿主细胞。
72.  权利要求46之经分离的多肽，其产生方法包括：
将包含编码该多肽的多核苷酸之重组载体引入宿主细胞；
培养该宿主细胞；以及
回收该多肽。
73.  一种产生多肽的方法，包括：
在表达该载体的条件下培养权利要求71的重组宿主细胞；和
回该多肽。
74.  一种经分离的多肽，其选自：
(a)MPIF-1 C-端缺失突变体，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：4的至少最末C-端氨基酸残基但至多最后52个C-端氨基酸残基缺失，其中该MPIF-1 C-端缺失突变体的N-端氨基酸残基是SEQ ID NO：4的氨基酸残基1(Met)或22(Arg)；
(b)含与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；和
(c)含除至少一个氨基酸替换以外与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
75.  一种经分离的多肽，其选自：
(a)MPIF-1 N-端和C-端缺失突变体，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：4的至少前22个N-端氨基酸残基但至多前53个N-端氨基酸残基的缺失，和SEQ ID NO：4的至少最末C-端氨基酸残基但至多最末52个C-端氨基酸残基的缺失；
(b)含与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；和
(c)含除至少一个氨基酸替换以外与(a)所述MPIF-1缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
76.  一种经分离的多肽，其选自：
(a)髓先祖抑制因子-1(MPIF-1)剪接变异体的N-端缺失突变体，包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：11的至少前45个N-端氨基酸残基但至多前59个N-端氨基酸残基缺失；
(b)含与(a)所述突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；和
(c)含除至少一个氨基酸替换以外与(a)所述突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
77.  权利要求76之经分离的多肽，其中该多肽是(a)。
78.  权利要求77之经分离的多肽，其中该突变体具有如SEQ IDNO：11所示的选自Met(46)-Asn(137)；Pro(54)-Asn(137)；和His(60)-Asn(137)的氨基酸序列。
79.  一种经分离的多肽，选自：
(a)单核细胞集落抑制因子(MCIF)N-端缺失突变体，包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：2的至少前20个N-端氨基酸残基但至多前40个N-端氨基酸残基缺失；
(b)M-CIF C-端缺失突变体，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：2的至少最末C-端氨基酸残基但至多最末25个C-端氨基酸残基缺失，其中该M-CIF C-端缺失突变体的N-端氨基酸残基是SEQ ID NO：2的氨基酸残基1(Met)或20(Thr)；
(c)M-CIF N-端和C-端缺失突变体，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO：2的至少前20个N-端氨基酸残基但至多前40个N-端氨基酸残基的缺失，和SEQ ID NO：2的至少最末C-端氨基酸残基但至多最末25个C-端氨基酸残基的缺失；
(d)含与(a)所述M-CIF缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；
(e)含与(b)所述M-CIF缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；
(f)含与(c)所述M-CIF缺失突变体的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽；
(g)含除至少一个氨基酸替换以外与(a)所述M-CIF缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽；
(h)含除至少一个氨基酸替换以外与(b)所述M-CIF缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽；和
(i)含除至少一个氨基酸替换以外与(c)所述M-CIF缺失突变体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
80.  一种治疗个体的方法，包括对个体施用有效量的权利要求79的多肽，其中施用该多肽的适应症选自：(a)髓保护；(b)抑制造血先祖细胞的生长；(c)治疗脓毒症；(d)抑制TNF-α产生；(e)治疗肾脏损伤；(f)治疗关节炎或关节炎症；(g)治疗小肠结肠炎；(h)治疗狼疮。
81.  一种治疗个体的方法，包括对个体施用有效量之经分离的多肽，多肽包含的序列选自：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1-93；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸20-93；
(c)与(a)的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(d)与(b)的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；
(e)除至少一个保守氨基酸替换以外与(a)相同的氨基酸序列；和
(f)除至少一个保守氨基酸替换以外与(b)相同的氨基酸序列；其中
施用该经分离的多肽的适应症选自：(a)治疗脓毒症；(b)抑制TNF-α产生；(c)治疗肾脏损伤；(d)治疗关节炎或关节炎症；(e)治疗小肠结肠炎；和(f)治疗狼疮。
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