CN1320165A - 来自角蝇的抗凝血酶核苷酸和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了预防家畜中吸血性感染的组合物和方法,以及具抗凝血酶活性的分离蛋白质和编码该蛋白质的核苷酸序列。从西方角蝇唾液腺中分离出了命名为凝血抑制素的蛋白质。该组合物能够作为兽用疫苗预防侵染性角蝇对家畜吸血。本发明的蛋白质在治疗血栓症中也有用。

Description

来自角蝇的抗凝血酶核苷酸和蛋白质
发明领域
本发明涉及预防家畜感染吸血昆虫的兽用疫苗和血栓症的医学治疗。
发明背景
据估计在美国每年由于外部寄生虫感染而引起的家畜产量的损失超过22.6亿美元(Byford等，(1992)美国科学杂志J.Anim.Sci,70:579-602)。在有关的5-6种主要节肢动物害虫种类中，西方角蝇Haematobia irritans linnaeus是最重要和分布最广的。在美国每年由它造成的家畜产量的经济影响估计达730.3百万美元。在加拿大，由于控制这种影响家畜产量的外部寄生虫，以1977年的美元价值计算，每年可以减少71-107百万美元的损失(Haufe和Weintraub(1985)加拿大昆虫学(Can.Entomol.)117:901-907)。而在南美洲，由这种吸血蝇造成的家畜产量的经济影响年均近10亿美元。
角蝇感染引起的生理学表现包括心率，呼吸频率和直肠温度的升高。另外，水消耗和尿生成以及尿氮分泌显著增加。血皮质醇浓度也明显增加。体重增加减缓，活动增多，和食草量减少也有报道(Schwinghammer等(1986)经济昆虫学杂志(J.Econ.Entomol.)79:1010-1014)。
西方角蝇(H.irritans)雌雄成虫阶段是一天24小时内间断地吸血的专性外部寄生虫。不象其它短暂吸血的双翅目昆虫(黑蝇，蚊子，马蝇，厩螫蝇)，西方角蝇的有翼成虫仍逗留在牛宿主上，当需要营养时，将其口器反复地插入皮肤吸食。Harris等(1974)Ann.Entomol.Soc.Am.67:891-894，注意到在实验条件下，雌性西方角蝇平均每天用163分钟吸食，雄性平均每天用96分钟吸食。由于每天吸食次数的不同，每只雌性西方角蝇平均每天摄取17.1mg血，而雄性西方角蝇平均每天吸取12.1mg血(Harris和Frazer(1970)Ann.Entomol.Soc.Am.63:1475-1476)。
描述西方角蝇唾液腺的生理学，尤其是涉及吸血的科学文献很少。Hori等，(1981)Appl.Ent.Zool.16:16-23比较了西方角蝇和厩螫蝇(Stomoxys calcitrans(Linnaeus))消化道和唾液腺中几种消化酶的类别。在西方角蝇的唾液中测到微弱的氨肽酶活性，提示存在于消化道中的蛋白酶和糖苷酶专门负责消化血液。
西方角蝇H.irritans linnaeus与H.i.exigua de Meijere是一亚类，后者是在澳大利亚和南半球的某些地方出现的水牛蝇。Kerlin和Hughes(1992)医学和兽医昆虫学(Med.Vet.Entomol.)6:121-126，比较了H.irritans exigua、微小牛蜱(Boophilusmicroplus(Canestrini))、埃及伊蚊(Aedes aegypti(Linnaeus))和铜绿蝇(Lucilia cuprina(Wiedemann))四种寄生的节肢动物唾液中的酶，观察到这四种昆虫间唾液中的酶是不同的，这明显反映了它们不同的摄食策略。这些不同主要在于糖苷酶和蛋白酶活性的种类和水平。用5-羟色胺刺激并收集H.irritans exigua的唾液，然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，银染产生7-8条带。在这个种类的唾液和唾液腺提取物(SGE)中可模糊地检测到腺苷三磷酸双磷酸酶活性，提示这个亚种不能以与其它许多吸血节肢动物相同的方式阻止牛血小板的凝集(Ribeiro(1987)昆虫学综述年鉴(Ann.Rev.Entomol.)32:463-478)。
更进一步，对暴露于H.irritans exigua的牛的免疫反应的研究显示产生了针对一些但不是所有的水牛蝇(buffalo fly)抗原的高水平的循环抗体；尽管如此，吸食曾暴露于H.irritans exigua的家畜的蝇之死亡率并不比以不曾暴露于H.irritans exigua的家畜为食的蝇高(Kerlin和Allingham(1992)兽医寄生虫学(Vet.Parasitol.)43:115-129)。
在过去的十年间，有关阐明吸血节肢动物采用的生物化学策略已取得了进展。尽管至少在80年前已经知道在节肢动物吸血昆虫的唾液中存在抗凝血剂，直到最近才纯化了一些活性成份并确定了其分子结构。现已明确凝血因子如因子Xa和凝血酶(因子Ⅱ)，即出现在凝血级联反应中的连接物，经常是作用的靶子。
有关几种黑蝇唾液的研究提示特定酶的靶分子可能与宿主的选择相关(Abebe等，(1994))。例如，嗜家畜的动物昆虫类的资料显示，凝血酶是一种重要的靶分子，它的失活可阻止不可逆的血小板聚集，以及阻碍凝血级联反应。见Hudson(1964)加拿大动物学杂志(Can.J.Zool.)42:113-120(有关厩螫蝇)，和Parker和Mant(1979)Thrombos.Haemostas(Stuttg.),42:743-751(有关刺舌蝇(G.morsitans(Westwood))唾液腺)。
由于上述的外部寄生虫对家畜感染的不利影响，在治疗和经济上都需要阻止这种感染。
同样也需要治疗血栓栓塞性疾病。血栓栓塞性疾病是循环系统最重要的疾病之一。血栓是一种部分或完全堵塞血液流过血管的血凝块。栓子是指在身体其它的部位形成的血栓，破裂成游离态，并转移到阻塞发生的部位。脑内阻塞会导致中风，也就是脑梗塞，死细胞的局部区域。肺部的栓子可引起肺栓塞，卧床病人中最主要的肺部疾病之一。卧床病人和老年人尤其容易患血栓性静脉炎，这是由栓子阻断腿部血液循环而引起的。栓子或血栓塞进入一种给心脏供血的血管中会引起部分心脏组织的坏死，即心肌梗塞，通常称心绞痛(heart attack)。
许多心肌梗塞最初的起因是动脉粥样硬化斑内的出血。这种出血常常会导致为梗死区供血的冠状动脉内发生血栓(或血凝块)形成。这种血栓由纤维蛋白和血小板组成。血纤维蛋白-血小板凝块的形成具有严重的临床上的支状分布。由纤维蛋白-血小板凝块引起的闭塞程度和持续时间决定梗死区的大小和损伤的程度。
在循环系统其它部位的纤维蛋白-血小板凝块形成可以通过使用抗凝剂如用肝素，而部分地预防。不幸的是，已证实用肝素预防血管闭塞程度超过或等于70％的心肌梗塞病人，尤其对具有严重残余冠状动脉狭窄的病人的再闭塞不是普遍有效。更有希望的试剂之一是水蛭素及其类似物，它们与凝血酶结合并使其失活。作为抗血凝剂水蛭素较肝素有理论上的优势。凝血酶与血栓或血小板结合可相对地使其免受肝素的抑制，然而水蛭素，至少在体外，仍然是有效的。其它有希望研究的试剂包括纤维蛋白原受体拮抗剂，它们能够以与阿司匹林截然不同的机理阻止血小板的凝集和致密颗粒的释放，还包括凝血噁烷产生的抑制剂。
因此需要其它的具有低毒，低或无抗原性以及很短时间内可以从循环中清除掉的抗凝血酶试剂。
发明概述
本发明提供了分离的具有抗凝血酶活性的蛋白质以及编码该蛋白质的核苷酸序列。名为凝血抑制素(thrombostasin)的蛋白质是从西方角蝇这种吸血角蝇的唾液腺中分离而来。提供的蛋白质和核苷酸尤其可用作预防感染的角蝇对家畜吸血的兽用疫苗。
本发明的蛋白质在治疗血栓症方面也有用。
提供了施用本发明蛋白质和核苷酸序列的方法。
附图简述
图1表示通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上的相对迁移率，比较群体型角蝇的蛋白质与野外收集的角蝇蛋白质的分子量。
图2表示以再钙化时间试验检测西方角蝇唾液中的抗凝活性。
图3表示西方角蝇唾液对无因子Ⅱ血浆的凝集影响。
图4表示西方角蝇唾液对凝血酶水解S238的抑制作用。
图5表示以HPLC纯化的有活性的唾液凝血抑制素。
图6表示用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析以HPLC纯化的唾液抗凝集蛋白质凝血抑制素。
发明详述
本发明提供了预防家畜吸血昆虫(吸血)以及治疗哺乳动物血栓症的方法和组合物。该组合物包含来自吸血昆虫角蝇，即西方角蝇唾液腺的蛋白质，如同Yeates等所描述的，(1999)昆虫学综述年鉴(Annu.Rev.Entemol.)44:397-428。西方角蝇属于双翅目的环裂亚目(Cyclorrhapha)。另外提供了编码该抗凝血酶蛋白质的核苷酸序列。该蛋白质命名为凝血抑制素，其主要的功能是通过抑制凝血酶(因子Ⅱ)的活性来阻止血液凝集。
所谓“吸血性”是指另外一种生物体以宿主生物体的血液为食物。所谓“吸血性感染”是指一种包含寄生虫以宿主血液为食物的宿主与寄生虫之间的关系。所谓“血栓形成”是指血栓的形成，发展或存在。所谓“抗凝血酶活性”是指具有降低或消除凝血酶促凝血作用和/或抑制血栓形成的生物学活性。
众所周知，利用本领域使用的方法可以得到本发明抗凝血酶蛋白质的全部编码序列。这些方法已公开，例如在Sambrook等(1989)分子克隆：实验指南(冷泉港实验室出版社，Planinview,New York)。
提供了基本上纯化的凝血抑制素制剂。这种基本上纯化的制剂包括基本上不含任何通常与其天然状态蛋白质相关联的化合物的蛋白质。该蛋白质的纯度可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，色谱，电泳或其它方法鉴定，见M.P.Deutscher(ed)，蛋白质纯化指南(Guide to ProteinPurification)，科学出版社公司(1990)。
术语“基本纯”或“基本纯化了的”并不意味着排除该蛋白质与其它成份的人为或合成混合物。普遍认为，本发明的抗凝血酶蛋白质包括那些与此处描述的抗凝血酶蛋白质同源的，并具有基本相同的生物学特性的蛋白质，尤其是此处在SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7中公开的蛋白质。这种定义目的是为了包括该基因的天然等位基因变体。普遍认为本发明这里所描述的“基本纯化了的”蛋白质可以是其它种类来源的，包括但不局限于环裂亚目的其它种类。
本发明还提供了公开于SEQ ID NO:1、2、4、5、6和7的抗凝血酶蛋白质的片段和/或核苷酸序列。该蛋白质片段的大小至少是10、20、30或更多氨基酸。该片段可以保留了生物学活性或包含蛋白质的活性区。
多核苷酸片段大小也可以是至少15、20、30或更多个连续的核苷酸。这些序列可用作杂交或分子标记。
这种片段可容易地通过化学方法制备，包括商业可利用的自动化方法或通过本领域技术人员熟知的重组DNA方法，和如下所述的方法。普遍认为，利用上述片段可以实施抗止血的生物学功能，包括与抗凝血酶抗凝集活性相关的和/或免疫应答调节相关的功能。
本发明还包括了编码本发明蛋白质的核苷酸序列。自西方角蝇以PCR克隆的编码序列的核苷酸序列提供于SEQ ID NO:1中；显然，普遍认为本发明克隆的基因也可以来源于其它种类，包括但不局限于环裂亚目的其它种类。
能够与来源于角蝇的抗凝血酶基因杂交的核苷酸序列也是本发明的一个方面。允许其它DNA与此处公开的DNA杂交的条件，可以由一些已知的技术来确定。例如，可以在标准杂交试验中，在低严紧，中等严紧或高度严紧的条件(例如严紧程度不同的洗涤条件依次为：在37℃以含5X Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE的35-40％甲酰胺洗涤；在42℃用含5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE的40-45％甲酰胺洗涤；在42℃以含5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE的50％甲酰胺洗涤)进行该序列与此处公开的基因编码DNA的杂交。见J.Sambrook等，(1989)分子克隆：实验指南(第二版)(冷泉港实验室))。
通常，编码抗凝血酶蛋白质并可与此处公开的核苷酸序列杂交的序列至少与该公开序列有40％的同源性，约60％到70％同源性，甚至约80％、85％、90％的同源性或更高的同源性。这样的序列与此处公开的核苷酸序列基本上同源，并为本发明所包含。更进一步，以与此处公开的DNA杂交分离得到的抗凝血酶蛋白质的氨基酸序列也是本发明的一个方面。遗传密码的简并性，即允许不同的核酸序列编码相同蛋白质或多肽在文献中是公知的。见U.S．专利4,757,006。
杂交的探针可以是cDNA片段或寡核苷酸，可以用本领域熟知的可检测基团标记。可以根据US专利4,683,202和4,683,195中描述的方法使用可用作抗凝血酶基因或其蛋白质的PCR引物的探针对。
本发明的多肽也可经过一种或多种翻译后修饰，如多肽链的硫酸化，羧基端酰胺化，酰化或化学修饰。
普遍认为，对本发明的核苷酸和多肽序列可以给予多种方式的改造，包括氨基酸的替代，缺失，截短和插入。这些操作的方法为本领域普遍熟知。例如，多肽和蛋白质的氨基酸序列变体可以通过DNA的突变而制备。诱变和核酸序列改变的方法为本领域所熟知。见，例如：Kunkel,T.(1985)，美国科学院研究进展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)82:488-492；Kunkel等，(1987)酶学方法(Methods in Enzymol.)154:367-382；U.S．专利4,873,192；Walker和Gaastra(eds)分子生物学技术(Techniques in Molecular Biology),MacMillan出版公司，纽约(1983)，以及其中引用的参考文献。因此，本发明的核苷酸序列包括天然序列和突变序列。同样，本发明的肽和蛋白质包括天然的蛋白质和其修饰形式。这种变体同样具有目的活性。人们认为，在编码变体的DNA上的突变必须不能置于阅读框之外，并且最好不产生不利于基因产物表达的序列，见EP专利申请书公开号75,444。
本发明的蛋白质包括天然形式和其变体。这些变体与天然蛋白基本上同源并与天然蛋白质有相同功能。如此处所用的，当它们的氨基酸序列一般至少有约40％，更典型地至少约60％-70％，最典型地至少约80％，85％,90％或更多的相同，则两种蛋白质(或蛋白质的区域)是基本上同源的。根据本发明，基本上同源的氨基酸序列将由能够与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示的核酸序列或其中的部分杂交的核酸序列编码，或由在如下文更全面描述的就严紧条件所描述的核酸序列编码。
因此，当一种天然蛋白质的变体其氨基酸序列与天然蛋白质的氨基酸序列至少有约40％，更优选地至少约60％-70％，最优选地至少约80％,85％,90％或更多相同，则该变体与天然蛋白质基本同源。变体可以有少至1,2,3或4个氨基酸的不同。变体多肤氨基酸序列的不同可以是有一个或更多个替换，缺失，插入，倒位，融合和截短或它们间的任意不同的组合。
“功能上相同”是指变体序列确定的链产生的蛋白质具有与目的天然蛋白质基本上相同的生物学活性。本发明也包括含有基本序列变异的功能相同的变体。因此，与天然蛋白质功能相同的变体具有充分的生物学活性而在治疗上有用。所谓治疗上有用是指能够有效达到如下所讨论的治疗目的。
本领域有可用的测定功能等价的方法。可利用专门设计用于测定该天然蛋白质活性的试验来检测生物学活性，包括本发明描述的试验。此外，针对有生物活性的天然蛋白质产生的抗体，能够检测其与功能上相同的变体的结合能力。有效的结合则提示该蛋白质具有与天然蛋白质相似的构象。
变体多肽可以具备完整的功能或缺乏一种或多种活性。因此，在此情形下，变异可影响功能，例如，影响本发明的蛋白质或多肽的一种或多种模块，结构域，或功能亚区的功能。
具备完整功能的变体通常仅包含保守的变异或者非关键残基或非关键区域内的变异。有功能的变体也可包含相似氨基酸的替代，这种替代不导致功能的改变或仅导致功能上不重要的改变。或者，在一定程度上这种替代可以正性或负性地影响功能。
无功能突变体通常包含一种或多种非保守氨基酸的替代，缺失，插入，倒位或截短，或者关键残基或关键区域内的替代，插入，倒位或缺失。如所描述的，变体可以是自然发生的，或通过重组的方法或通过化学合成的方法赋予多肽有用和新的特性。
对功能必不可少的氨基酸可以通过本领域公知的方法来确定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham等，科学(Science)244:1081-1085(1989))。后一种方法能够向分子的每一个残基中引入单个丙氨酸的突变，测定突变后分子的生物学活性。也可以通过结构分析来确定关键位点，如结晶、核磁共振或光亲合标记(Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904(1992)；de Vos等，科学255:306-312(1992))。
本发明进一步包含变异多核苷酸和其片段，其核苷酸序列与SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6所表示的，或其他此处描述的核苷酸序列，由于遗传密码的简并性而有所不同，因此编码与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6所表示的或其他此处描述的核苷酸序列所编码的蛋白质相同的蛋白质。
本发明也提供了编码此处描述的变异多肽的核酸分子。这种多核苷酸可以是自然发生的，如等位基因变体(相同位点)，同系物(不同位点)和直向同源物(ortholog)(不同生物体)，或可以通过DNA重组方法或化学合成的方法构建。这种非天然产生的变体可以通过诱变技术，包括适用于多核苷酸，细胞或生物体的技术。综上所述，变体可以包括核苷酸替代、缺失、倒位和插入。
变异可出现在编码区和/或非编码区。变异可产生保守和非保守的氨基酸替代。
可用本领域公知的方法证实直向同源物、同系物和等位基因变体。这些变体包含编码一种蛋白质的核苷酸序列，与SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6所示的或其他此处描述的序列或这种序列的片段通常有至少约40％，更进一步至少约60-70％，最典型地至少为约80％,85％,90％或更高的同源性。由于这种核酸分子能够在严紧的条件下与SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或其他此处描述的核苷酸序列或其片段杂交而容易地证实。应该理解严紧杂交不是指由于广泛同源性的原因，如多聚腺苷酸序列，或因一种生物体或蛋白质组中所有或大多数蛋白质共有的序列的存在而导致的基本同源性。
为确定两种氨基酸序列或核苷酸序列的同源百分数，为实现最佳序列比较的目的，将序列对齐(例如，可将缺口引入一种蛋白质或核酸序列之中以获得与另外一种蛋白质或核酸最佳的对齐)。然后将相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当一个序列中某个位置与另外一个序列对应位置被相同的氨基酸残基或核苷酸所占据时，则在此位点两分子是同源的。如此处所用的，氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”。两序列间的同源百分数是序列间共有的相同位置数目的函数(也就是说：同源百分数等于相同位置数目/总位置数×100)。
本发明也包括具有较低程度相同性的蛋白质或多肽，但其具有的相似性足以使之展现出与此处描述的抗凝血酶蛋白质的一种或多种功能相同的功能。相似性可通过保守氨基酸的替代决定。这种替代是指多肽中特定氨基酸被另外一个特性相似的氨基酸所替代。保守替代有可能是表型沉默型。有关哪种氨基酸变化可能是表型沉默型可参考Bowie等，科学247:1306-1310(1990)。
同一性和相似性能够容易地计算出(计算分子生物学(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W编，科学出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin,A.M和Griffin,H.G编，Humana出版社，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology),von Heinje,G.，科学出版社，1987；和Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M和Devereux,J．编，M Stockton出版社，纽约，1991)。确定两种序列间的同一性和相似性优选的计算机程序包括，但不仅仅局限于GCG程序包(Devereux,J.(1984)核酸研究(Nuc.Acids Res.)12(1):387),BLASTP,BLASTN，和FASTA(Atschul,S.F.(1990)分子生物学杂志，215:403)；其中利用程序内可用的默认参数。所谓序列基本上相似、同一或同源，是指序列间具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的相似性。
DNA序列可以用化学合成或以定点诱变加以修饰以体现宿主细胞的密码子偏性并增加表达效率。
依据本发明，本发明的蛋白质可以通过化学方法或分子生物学技术工程化。由于蛋白质可以通过处理编码它们的DNA序列而被工程化，因此分子生物学方法是最方便的，基因组DNA,eDNA，合成的DNA，和它们的任意组合可以用于该目的。基于蛋白质的氨基酸序列或蛋白质的某些特征，基因组DNA序列或编码蛋白质的cDNA序列可以分离出来。许多分离序列的方法为分子生物学领域所熟知。尤其见Sambrook等(1989)分子克隆：实验指南(冷泉港实验室出版社，Planinview，纽约)，在此引入作为参考。
为了以重组DNA技术生产一种抗凝血酶多肽，可制备编码本发明多肽的基因。DNA编码区通常不包含内含子。分离并纯化DNA序列，将基因插入一种能够启动表达并产生重组产物的表达载体。DNA序列可以是cDNA序列，或也可以是合成的DNA序列。合成的基因通常由化学合成全部与目的基因相同的寡核苷酸制备而成。然后装配合成的寡核苷酸获得基因。
如果需要，可以通过定点诱变以引入一个或多个编码的改变，从而修饰基因。通常，在基因的每一端加上限制性酶切位点，以利于其后的操作。
也可以构建DNA序列使之包含一段前导肽，前导肽能够引导多肽自表达该多肽的细胞中分泌出来。编码前导肽的序列通常被融合在编码多肽的DNA序列的5′端。本领域公知前导肽，包括OmpA导肽；疱疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV G蛋白)前导肽。当在细菌宿主中如大肠杆菌表达时，OmpA前导肽是有用的，而VSVG蛋白前导肽则在昆虫细胞中表达时有用。
也可以构建DNA序列使之包含一种可切割位点以释放本发明多肽。可使用编码一种借助可切割连键融合于本发明多肽N端的载体多肽序列的DNA序列。可切割连键可以是一种能够被溴化氰切割的连键。
为表达多肽，构建包含能够在合适的宿主细胞之中表达该多肽的编码DNA的表达载体。还提供合适的转录和翻译调控元件，包括DNA序列的启动子，转录终止位点，和翻译起始与终止密码子。使该DNA序列处于正确的框架之中，使之能够在与载体相容的宿主细胞中表达该多肽。
表达载体通常包含复制起点，如果需要，还可以含有选择标记基因如抗生素抗性基因。表达载体可以是质粒，病毒，尤其是杆状病毒等。
一旦编码本发明抗凝血酶蛋白质的核苷酸被分离出来，它们即可以被处理并用来在多种宿主包括其他生物体(如微生物)之中表达蛋白质。
一旦核酸序列被证实并已知，本领域技术人员可以生产大量用于治疗的蛋白质。因此，本发明包括重组蛋白质和生产重组蛋白质的方法。如此，可以利用载体在多种类型的宿主细胞中，包括原核和真核细胞中，表达编码抗凝血酶蛋白质的核苷酸序列，从而生产大量的蛋白质，或有活性的类似物，或其片段，以及其他具有抗凝血酶活性的构建体。
通常，本领域熟知表达重组DNA的方法，见，例如，Sambrook等(1989)分子克隆，冷泉港实验室。另外，宿主细胞和表达载体，如杆状病毒的表达在美国专利4,745,051和4,879,236中有描述。一般而言，杆状病毒表达载体包含杆状病毒基因组，其中含有插入在多角体基因中转录起始信号到ATG间的位置并在杆状病毒多角体基因启动子转录控制下的待表达基因。
有许多合适的原核和微生物载体可用。同样，用于外源性蛋白质表达的启动子和其他调控元件在本领域可用。通常用于重组微生物表达载体的启动子为本领域所公知，包括β-lictamase(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等(1987)自然(Nature)275:615和Goeddel等(1979)自然281:544；色氨酸启动子系统(TRP)Goeddel等(1980)核酸研究(Nucleic Acids Res.)8:4057和EPO申请公开36,776)；和Tac启动子(DeBoer等(1983)美国科学院研究进展，80:21)。尽管这些是常用的，其他微生物启动子也是可以用的。有关它们的核苷酸序列细节已经发表，能够使专业技术人员容易地把它们可操作地连接到质粒或病毒载体内编码蛋白质的DNA上。见，例如，Siedenlist等(1980)细胞(Cell)20:269。
可以以适当的编码蛋白质的载体转化真核宿主细胞如酵母。参阅，例如，美国专利NO.4,745,057。酿酒酵母是较低等真核宿主微生物中最常用的，尽管许多其他菌株也是常用的。酵母载体也可包含来源于2μ酵母质粒的复制起点或自主复制序列(APS)，启动子，编码目的蛋白质的DNA，多聚腺苷酸化和转录终止序列，和筛选基因。一种示例性的质粒是YRp7,(Stinchcomb等(1979)自然，282:9；Kingsman等(1979)，基因，7:141；Tschemper等(1980)基因，10:157)。这种质粒含trp1基因，它可作为在色氨酸之中缺乏生长能力的突变株的筛选标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,(1997)遗传(Genetics)85:12)。酵母宿主细胞基因组中trp1损害的存在，为通过生长在缺乏色氨酸的培养基中进行转化子鉴定提供了一种有效的环境。
适用于酵母载体的启动子序列包括金属硫蛋白，乙醇脱氢酶，腺苷酸环化酶，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等(1980)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)255:2073)，和其它的糖酵解酶(Hess等，(1968)酶调控进展杂志(J.Adv.Enzyme Reg.)7:149；和Holland等，生物化学(Biochemistry)17:4900)，如烯醇化酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖异构酶，3-磷酸甘油酸变构酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶基因的启动子。用于酵母中表达的合适的载体和启动子更进一步的描述在R.Hitzeman等，EPO公开73,657。
本发明提供了可选择性地结合本发明蛋白质或已描述的任何变体或其片段的抗体制剂。抗体被认为可选择性地结合，即使它也可以和与抗凝血酶蛋白质基本上无同源性的其它蛋白质结合。这些其它蛋白质与抗凝血酶蛋白质的引起产生抗体的片段或区域有同源性，因同源序列的存在，该抗体可与两种蛋白质结合。基于此，可以认为抗体与抗凝血酶蛋白质的结合仍然是选择性的。
该制剂包含单克隆或多克隆抗体，完整的抗体或其片段(例如，Fab)，纯化的制剂如亲合纯化的制剂，或不纯的制剂如腹水液，血清等。产生抗体的方法为本领域所公知，并包含但不局限于Harlow和Lane(1988)在《抗体，实验室指南》(冷泉港实验室出版社)中描述的方法，其中的内容此处引入作为参考。本发明也描述了能够中和本发明蛋白质，变体和其片段的生物功能的抗体制剂。这种功能包括但不局限于抗凝血酶活性。本发明也提供了能够调控免疫反应的组合物。所谓调节免疫反应是指将此处描述的本发明组合物施于宿主，可引起该宿主生物体免疫系统中可确定的变化。实施这种免疫反应调节的实施例和实施方法以及抗体制剂选择性的评价提供于本申请的实验部分，此处引入做为参考。
本发明的组合物可以用做治疗哺乳动物吸血病(hematophagy)的兽用疫苗。该方法包括给哺乳动物施用一种包含治疗有效量本发明组合物的兽用疫苗。在此方面，治疗有效量是指能够在施用过本发明疫苗的哺乳动物中取得一种可确定的减少、改善、消除或预防吸血性感染的量。尽管本发明的疫苗可用于任何哺乳动物，但其中感兴趣的是家畜，更具体的是马、牛等。该组合物在抗环裂亚目吸血性蝇，更具体的是西方角蝇，尤其是irritans或exigua亚种的接种方面是有用的。然而，以本发明的这种组合物和方法接种本发明抗任何吸血生物的疫苗都是有治疗效果的。
为了兽医方面的应用，本发明的组合物可以制成如下述的任何可接受的药剂学制剂或任何其它可接受的兽用制剂。在本发明的一实施例之中，该疫苗包含治疗有效量的本发明蛋白质或如此处描述的任何变体或其片段。
在其中一个优选的实施方案之中，该疫苗包含如此处描述的本发明的核苷酸组合物。如Cox等，(1993)病毒学杂志(J.Virol.)67:5664-5667；Fynan等，(1993)美国科学院研究进展，90:11478-11482；和Lewis等，(1997)疫苗(Vaccine)15:861-864；和综述Robison(1997)疫苗15:785-787；和Tighe等(1998)今日免疫学(Immunol.Today)19:89-97(所有的内容此处引入作为参考)所述，核酸疫苗可很容易地构建和生产。通常，将编码待用做免疫原的蛋白质的目的DNA序列克隆入真核表达载体。使构建的质粒在细菌之中生长并纯化。通常通过肌肉内注射直接将纯化的质粒DNA注入动物体内，但也可通过皮下注射；在此处接种宿主的细胞表达质粒产生目的蛋白，从而引发免疫反应。见，例如，如Cox等，(1993)病毒学杂志，67:5664-5667，此处引入作为参考。通过皮肤，肌肉和静脉接种DNA，纳克水平的DNA表达蛋白质即可能引起免疫反应，取得抗感染试剂的效果，见，例如，Fynan等，(1993)美国科学院研究进展，90:11478-11482；Cox等，(1993)病毒学杂志，67:5664-5667，此处引入作为参考。这种经肌肉内或皮内注射引入质粒可诱导保护性反应，从而免除攻击后的临床疾病。
本发明的组合物可以制成作为抗凝血酶试剂的有治疗用途的药物制剂。这种组合物可以用于治疗静脉血栓，血管分流栓塞和含凝血酶的弥散性血管内凝集。
本发明的制剂可以单独使用或与其它抗凝血酶和治疗性试剂包括兽医试剂如疫苗联合使用。其他的试剂为本领域所公知。
可以按照已知的方法将抗凝血酶组合物制成药剂学上有用的组合物，例如与药剂学可接受的载体相混合。适宜的载体和其组成也有描述，例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版，Osol.A(编)，Mack Easton PA(1980)．为形成药剂学上可接受的适于有效给药的组合物，这种组合物将包含有效量的单独的或与适量的载体相混合的抗凝血酶蛋白质。
其它药剂学方法也可以用来控制作用的持续时间。能够通过多聚体复合或吸收该组合物实现制剂的受控释放。可以通过选择适宜的大分子(例如，聚酯，多聚氨基酸，聚乙烯吡咯酮，乙烯乙酸乙烯酯，甲基纤维素，羧甲基纤维素，或硫酸鱼精蛋白)实现受控送递。还可以通过改变大分子的浓度控制药物释放的速度。
另外一种可能控制作用持续时间的方法，包括向多聚体微粒中掺入治疗性试剂，如聚酯、多聚氨基酸，水凝胶，多聚乳酸，或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。另外，也可以将治疗性试剂包裹入微囊之中，例如，通过共凝集技术或界面多聚化来制备，例如分别使用羟甲基纤维素或明胶微囊或多聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或包裹在一种胶体药物释放系统，例如脂质体，白蛋白，微球体，微乳剂，纳微粒，纳微囊，或在粗乳剂中。此类内容公开于Remington的药剂学中。
在更具体的实施方案之中，本发明的多肽也可以转变成药剂学上可接受的盐，它也可以转化成与有机酸或无机酸的酸加成盐。合适的酸包括乙酸，琥珀酸，盐酸。可选择地，该肽也可以转化成羧酸盐，如铵盐或碱金属盐如钠盐或钾盐。
多肽或其药剂学上可接受的盐可以与药剂学上可接受的载体或它的赋形剂一起用于药物组合物中。这种制剂通常是经静脉给药(在这种条件下，载体通常是无菌盐水或可接受纯度的水)。因此多肽可用来治疗和预防人或其他哺乳动物的血栓症和血栓栓塞，包括预防手术后血栓形成，用于急性休克的治疗(如败血症性或多发性创伤性休克)，治疗消耗性凝血病，以及血液透析，血液分离和体外循环。在本发明的一个实施方案中，多肽或其盐可以与纤溶酶原激活剂，如组织纤溶酶原激活剂一同施用。
剂量尤其取决于特定的给药形式和治疗或预防的目的。可通过判断疾病的特定状况来很好的确定个体的用量大小和给药方案；本领域技术人员熟知确定为此目的必要的相关血液参数的方法。通常，注射时，本发明化合物治疗有效量的范围大约为0.005或0.01至0.05或0.1mg/kg体重，更优选大约为0.01-约0.05mg/kg体重。
可经静脉内、肌肉内或皮下注射给药。因此，依赖于给药的方式，以单剂形式用于肠胃外给药的药物组合物一个剂量包含从约0.4到大约7.5mg的本发明化合物。除了有活性的组分外，药物组合物中通常也包括缓冲液，例如磷酸缓冲液，其目的是维持pH值在大约3.5至7之间，而且也可以包括氯化钠、甘露醇或山梨醇，以调节等渗性。该制剂可以是冻干的或溶解的。也可包含抗细菌活性的防腐剂，例如，0.2-0.3％4-羟基苯甲酸甲酯或乙酯。
局部使用的组合物可以是水溶液形式，洗液，或凝胶，油性溶液或悬浮液，或者含脂或尤其是乳化的软膏。水溶液形式的组合物可以通过例如将根据本发明的活性成份或其在治疗上可接受的盐溶解于例如pH4-6.5的水性缓冲液中制备，如果必要，还可以加入另外一种活性成份，例如，抗感染试剂，和/或聚合粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，和/或防腐剂。在10ml溶液或10g凝胶之中，活性成份的浓度在约0.1-1.5mg，优选0.25-1.0mg。
局部给药用的油性制剂可通过例如在油内悬浮根据本发明的活性成份或其在治疗上可接受的盐而制备，并可任选添加膨胀剂，如硬脂酸铝，和/或HLB值(亲水-亲脂平衡常数)低于10的表面活性剂，如多元醇的脂肪酸单聚物，例如甘油单硬脂酸酯、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯或失水山梨糖醇单油酸酯。含脂的软膏可通过例如在一种可扩展的脂性基质内悬浮根据本发明的活性成份或其盐而制备，并可任选加入HLB值低于10的表面活性剂。通过在一种柔软的可扩展的脂性基质中研制根据本发明的活性成份或其盐的水溶液，并加入一种HLB值低于10的表面活性剂，可以得到乳化的软膏。这些局部使用的制剂也可以含防腐剂。约10g的基质中活性成份的浓度在约0.1-1.5mg，更优选约0.25-1.0mg。
除上面描述的组合物及在医药上直接用于人或哺乳动物身体的其类似药物组合物外，本发明也涉及活的人体或哺乳动物体外使用的药物组合物和制剂。这种组合物和制剂特别是作为在体外循环或处理(如血液分离)的血液中的抗凝添加剂。这种制剂，诸如贮存液或单剂量形式的制剂，在组成上与上述注射剂是相似的；但活性成份的浓度可方便地由待处理血液量决定，或更精确地由其凝血酶的含量决定。取决于特定的用途，其适宜的剂量是在大约0.01-1.0mg活性成份/升血，上限可以超过而不至于有危险，因为即使在相对高的量，该制剂也是无毒害的。
实验西方角蝇的收集和饲养
蛹两周一次自U.S.D.A家畜昆虫研究室(Kerrville，德克萨斯)运来，贮存在4℃待用。将它们移至不锈钢笼内(18″×18″×18″)在室温下(21-22℃),16:8小时(L:D)以促进成虫的孵化。每个笼子之上放置一个脱酯棉垫，作为每日1次向成虫提供新鲜血液的灯芯。
用在一些试验中的野外捕获的成虫收集自Arizoma大学奶牛群和Auburn大学菜牛和奶牛群。在收集后的1小时内将它们转移至实验室，并按上述方法饲养直到实验。唾液腺的回收：
雌雄西方角蝇都是专性食血昆虫，它们的唾液腺在形态上和在身体上的位置与厩螫蝇(Stomoxys calcitrans)和舌蝇(Glossina spp)是相似的。以下面的方案来解剖唾液腺：(a)以湿润的CO2“击落”角蝇，简单的通过70％的乙醇(ETOH)溶液，并以去离子水冲洗；(b)将其放在一清洁玻璃片上的一滴预冷的0.15M盐水中，切除腿、翅膀和头，用剃刀片或解剖刀沿矢状线切开胸；(c)将角蝇转入到装满石蜡的观察玻璃杯或小盘中的一滴预冷的新鲜盐水中。使用微型解剖针，将两瓣胸拨到后面；(d)用镊子将腹侧外皮揭掉，暴露内部器官。将唾液腺自消化组织中摘下。夹住消化道的前端(前胃)，然后通过拖动它们穿过腹胸连接处，将消化道-唾液腺同时拖出；(e)将腺体自消化道摘下，在冰冷的盐中洗1次，置于冰浴中等待收集的Eppemdorf管中，然后冰冻在-70℃。唾液腺提取物的制备
按Cupp等，(1993)昆虫生理学杂志(J.Insect Physiol.)39:817-821描述的方法或通过超声制备唾液腺提取物(SGE)。前一种方法中：将腺体在1∶1的0.15M NaCl混合物中匀浆，将0.1％Triton X-100溶液加入解冻样品中，之后再冷冻样品。通过解冻溶解的样品，旋涡振荡30秒，在4℃,14,000×g离心30秒制备提取物。后一种方法中：以Sonifier 450(Branson Ultrasoncs,Danbury,CT)按70％的循环和70％的输出强度超声2分钟获得超声破碎的腺体。解冻装有腺体的Eppemdorf管，将每一个试管尖放至浸于冰浴中便于散热的超声探头的底基以裂解内容物，在4℃,12,000×g离心5分钟除去细胞碎片后，将唾液腺提取物转移至一新试管之中。用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Rockford,IL)确定每个腺体的蛋白质量。初步确定通过超声从雌性西方角蝇唾液腺中获得的可溶性蛋白质为0.54±0.09ug/对腺体，雄性为0.63±0.02ug/对腺体。唾液的收集
为确定特别是归属于唾液分泌物的抗凝血酶活性，结合两种以前用于牛蝇(Kerlin和Hughes,(1992)兽医昆虫学(Med.Vet.Entomol.),6:121-126)和蚊子(Hurlbut,(1996)美国营养卫生医学(Am.J.Trop.Med.Hyg.)15:989-993)的方法收集这些昆虫的唾液。将成年角蝇放在室温之中，饥饿24小时，以确保分泌液保留在唾液腺之中，并且全部的消化道内容物已被消化。后一种防范是必须的，由于蝇在进食期间常常有回流。然后用湿润的CO2麻醉角蝇，用微型解剖剪剪去翅膀，将脱翅的蝇粘在敷贴器的杆上使其口部能够置于装矿物油的毛细管内。在此步骤之前，每只角蝇注入1μl 80mM 5-羟色胺。然后将蝇的吻部插入油中，由于油与唾液具不同的粘性，故可作为5-羟色胺诱导分泌物的收集介质。通常唾液分泌在30-60秒内开始，由于唾液被吸入油中时呈清亮的小水滴，很容易看见。凝胶电泳
除非特别指出，按Laemmli,(1970)自然，227:680-685的方法，以15％聚丙烯酰胺/SDS凝胶电泳(SDS PAGE)分辨蛋白质，并通过银染(Bassam等，(1991)生物化学年鉴，196:80-83)显色。扫描染色的凝胶以密度计量学分析条带的迁移和染色强度(Personal DensitometerS.I.,ImageQuaNT for Windows NT,Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)。唾液中的蛋白质
图1描述通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的相对迁移率，比较克隆唾液腺(泳道C)与野外收集角蝇唾液腺(泳道B)中蛋白质的分子量。10-220kDa范围的分子量标准见泳道A和D。除了在田野收集的角蝇在约36kDa处多一条弱带以外，在它们之间观察到非常相似的图谱。但以条带染色的相对强度分析，30只野外收集的角蝇唾液腺中蛋白质(B)的浓度超过84只克隆角蝇唾液(C)中对应条带的浓度。这种差别在银染的胶上常常可观察到，提示野外西方角蝇群比集落化的角蝇株产生更高浓度的唾液蛋白质。三磷酸腺苷双磷酸酶活性
应用标准的试验(见Cupp等，(1993)昆虫生理学杂志，39:817-821)检测SGE中三磷酸腺苷双磷酸酶的活性。这种酶能够迅速地将三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)降解成单磷酸腺苷，从而消除了一种通常促进血小板凝集的关键的化学信号。解剖前将野外捕获的雄性和雌性角蝇在水上维持48小时，然后制备提取物。在西方角蝇唾液腺提取物中该酶的活性可勉强检测到(2.59±0.21毫单位/对唾液腺等价物)。这种三磷酸腺苷双磷酸酶活性的缺乏也可以通过西方角蝇唾液不能够影响富含血小板的牛血浆之中ADP诱导的血小板聚集而证实。(未发表的结果)。因此，三磷酸腺苷双磷酸酶活性被消除是西方角蝇吸血的机理之一。红斑活性
通过皮内注射SGE或直接由雌性和雄性角蝇叮吸新西兰大白兔剃毛的后背，我们评估了西方角蝇唾液诱导红斑的能力。作为对照，我们也注射了带蚋(Simulium vittatum)的SGE，它能够在皮内注射后15分钟内产生持续的红斑(Cupp等，(1994)Am.J.Trop.Med.Hyg.,50:235-240)。一种群体型的带蚋株作为唾液腺材料的来源，(Bernardo等，(1986)Ann.Entomd.Soc.Am.,79:610-621)。无论是以SGE注射或通过叮咬输入，雌性和雄性西方角蝇唾液都没产生红斑。在15分钟之内带蚋的SGE可产生可见的红斑。因此，红斑活性的消除是西方角蝇吸血的一种机制。其他血管舒张活性
在有或无完整的内皮的条件下，利用大鼠胃(前列腺素试验)和兔主动脉条的张力测定进行实验，以检测西方角蝇SGE或唾液中血管舒张活性的存在情况(见Ribeiro等，(1992)实验寄生虫学，74:112-116；Ribeiro等(1994)，医学昆虫学杂志31:747-753)。为确定西方角蝇SGE中缓激肽或组胺活性，按Webstet和Prado(1970)的方法进行测定，该方法是以体外豚鼠回肠的收缩作为激肽活性的一种直接生物测定。获得对待检测物质(对于大鼠胃条为前列腺素E2，对于兔主动脉条为去甲肾上腺素或乙酰胆碱)的正常反应，而西方角蝇SGE无血管活性。起初，在大鼠胃条试验中诱导唾液的收集物确实有活性，当包含methysergidemaleate时，这种活性丧失(Pertz和Eich,(1992)NavnynSchmiedebergs Arch.Pharmacol.,345:394-401)。这种物质是一种已知的5-羟色胺抑制剂，而角蝇利用5-羟色胺这种化合物来诱导唾液分泌。这种活性在5-羟色胺诱导的唾液中存在，但不存在于SGE之中，表明这些样品中5-羟色胺的活性来源于诱导唾液分泌而注射的化合物。西方角蝇SGE的提取物能够加强前列腺素活性的检测，证实了更早期血管舒张研究的阴性结果。在检测缓激肽或组胺的豚鼠回肠试验之中没有检测到唾液活性。因此，检测到的血管舒张活性被消除是西方角蝇吸血的一种机制。当给新西兰大白兔去毛皮肤皮内注射时，应用激光多普勒贯流显像(laser Doppler perfusion imaging)证实在体内角蝇SGE不能诱导血管舒张。抗凝集活性
以再钙化时间试验鉴定抗凝活性，因为这种常用的试验能够探测影响凝血级联反应三个主要步骤：外源性通路，内源性通路和最终的共同通路中任何步骤的抑制剂。从雌性和雄性西方角蝇以及雌性带蚋中制备唾液腺提取物。从后一种类中制备的SGE作为阳性对照，因为以前已用相同的再钙化时间试验来检测该种类中的抗凝活性(Abebe等，(1994)医学昆虫学杂志，31:908-911)。如图2所示，雌性西方角蝇与带蚋的SGE延缓标准血浆的再钙化时间的能力是相同的。雄性SGE也可减缓再钙化时间(未提供资料)。尽管西方角蝇提取物之中测到的蛋白质的含量有50％降低，但有相当的抑制效果。所以，这种抗凝活性为西方角蝇中检测到的唯一抗止血活性。抗止血活性的特并性
再钙化时间试验能够检测最终导致血液凝集(凝血)的凝血级联反应中任一步骤的抑制，因此它是一种探测未知抑制剂的存在常用的试验。因为血液凝集是一系列反应的结果，角蝇唾液可通过抑制血液凝固级联反应中某一特定步骤而延缓血液凝固，或可选择地，可通过在血块形成后将其溶解(纤溶活性)而延迟正常的止血速度。
为了分析的目的，凝集反应通常被分成三个亚通路，这些通路能够通过不同的凝集试验监测；例如，内源性(激活的部分促凝集酶原激酶时间试验=APTT)，外源性(凝血酶原时间试验=PTT)和最终的共同通路(凝血酶时间=TT)。本领域普通的专业技术人员熟知再钙化时间、PTT、TT和APTT试验。例如，再钙化时间试验见Biggs等(1962)人血液凝集和紊乱(Human Blood Coagulation And Its Disorders)，第三版，Blackwell科学出版社，牛津大学)。APTT、PTT和TT试验见Turgeon M.L.((1993)临床血液学原理和方法(Clinical Hematology.Theory andProcedures)，第二版，Little,Brown and Company,Boston)。APTT Ⅱ是APTTⅠ试验的一种改进，它更灵敏。
如表1所示，用这些试验确定了角蝇抗凝活性的几种特征：1)角蝇唾液腺提取物或唾液导致所有试验的凝集延缓，表明至少存在一种在最终的共同途径中起作用，即在凝血酶原变成凝血酶后起作用的抑制剂。2)野生型蝇的唾液比相同数量群体型蝇的唾液含更多的抑制活性。3)克隆蝇在羽化48小时后比羽化24小时后的抑制活性高。
               表1
西方角蝇唾液腺提取物(SGE)或5-羟色胺诱导的唾液减缓血液凝固
来源 #蝇 试验种类 ％对照*
SGE-群体 1 再钙化  106
SGE-群体 2 再钙化  128
唾液-群体(24h) 4 再钙化  143
唾液-群体(48h) 4 再钙化  175
唾液-野生型 1 再钙化  127
唾液-野生型 2 再钙化  161
SGE-群体 1 APTT-Ⅰ  113
SGE-群体 2 APTT-Ⅰ  149
唾液-群体 1 APTT-Ⅰ  112
SGE-群体 1 APTT-Ⅱ  144
唾液-野生型 1 APTT-Ⅱ  210
 SGE-群体 1  PTT  120
 SGE-群体 2  PTT  140
 唾液-野生型 1  PTT  156
 SGE-群体 1  TT  ND
 SGE-群体 2  TT  109
 唾液-野生型 1  TT  158
ND：没有测定
*每个值是4次试验的平均值
角蝇唾液对TT试验中凝集的抑制表明针对的是凝血酶形成后发生的一个反应。在凝血酶形成后有两种反应出现：1)通过凝血酶(因子Ⅱ)作用于纤维蛋白原形成纤维蛋白单体和2)在因子ⅩⅢ的作用下纤维蛋白单体发生交联。凝血酶也参与了因子ⅩⅢ的激活。因此，凝血酶(因子Ⅱ)可能是角蝇唾液腺的靶分子。为检测这种可能性，检测以特定抗体(Sigma Chemical,St.Louis,MO)剔除因子Ⅱ的血浆的凝集时间。加入渐增量的正常血浆(包含因子Ⅱ)，可缩短PTT试验中检测的凝集时间(图3,-唾液)。当角蝇的唾液(相当于两只角蝇)与渐增量的正常血浆(图3,+唾液)一同加入时，凝集时间延缓百分数随因子Ⅱ(存在于正常血浆中)的增加量一同增加。这种结果表明唾液含因子Ⅱ的特异性抑制剂。
可以用人工合成的底物(S238,American Diagnostica Inc.,Greenwich,CT)检测凝血酶的凝集作用，该底物经凝血酶水解后产生一种生色团。底物浓度在2.5-100uM间递增的条件下，检测牛凝血酶单独(250pM；图4，-唾液)和加有角蝇唾液(相当于两只)时水解S238的速度。这些结果证实角蝇唾液含一种凝血酶抑制剂，并提示它可能是一种竞争性抑制剂，因为当底物过量(100μM)时，其效果消失。几种模型能够说明此种生物化学行为(Segel(1976)，生物化学计算，John Wiley＆Sons,New York)。为了分析，通过确定凝血酶在不同固定浓度的底物存在时对底物的水解速度(v)，并作1/V对抑制剂浓度的曲线，绘制Dixon曲线。这样提供了确定抑制类型和确定抑制常数Ki的方法。确定角蝇唾液腺中抗凝成分的物理特性以设计纯化方案
表2中的APTT凝集时间表明，在室温放置60分钟或暴露于100℃ 5分钟后，SGE中的活性丧失。该活性成份可用乙醇沉淀，在以乙腈/TFA处理和冻干时是相当稳定的。这些物理特性与蛋白质抑制剂是一致的，能够在标准HPLC程序下用乙腈/TFA梯度洗脱纯化。
                           表2
确定西方角蝇唾液腺提取物中抗凝活性的物理特性
处理 APTT凝集时间(秒)
对照  52.3
SGE-时间0SGE-室温×60分钟SGE-100℃×5分钟SGE-乙醇沉淀SGE-乙醇上清SGE-冻干SGE-50％乙腈/0.1％TFA  62.656.855.259.850.157.057.8
HPLC纯化和HPLC唾液级分的再钙化试验
分析时，每次HPLC收集100-150只角蝇的唾液。制备型分离时，每次分离收集多于500只角蝇的唾液。在注入柱内之前，总是以配对的梯度洗脱A溶剂的原溶剂稀释收集的唾液。使用大球形C18,4.6×250mm，300柱(AllTech)进行所有的HPLC制备。经检测肽键在220nM处的UV吸收监测蛋白质洗脱。以0.5或1分钟的间隔收集从柱上洗脱的成份。在冻干所有样品除去有机溶剂之前，自每一级分中取一小份转移到含牛血清白蛋白(BSA)的第二个试管中用于活性试验。以Tris缓冲液(5mMTris,150mM NaCl，在37℃ pH为7.4)重新溶解与BSA(用来增加纯化蛋白质的溶解性)一起干燥的组分。利用上述再钙化试验，通过延缓凝集的形成确定组分中的抑制活性。
图5描述了用来获得高纯度的抗凝活性制剂的三种反相HPLC柱程序。黑线是HPLC色谱图，而灰条表示再钙化试验的凝集时间。A图表示用梯度洗脱(乙腈，异丙醇和TFA)时西方角蝇唾液的HPLC分离图谱，B图表示用梯度洗脱(乙腈和TFA)时“A”中具最大抗凝活性的组分的HPLC分离图谱。C图表示利用梯度洗脱(乙腈和HCl)时，“B”中具最大抗凝活性的组分的HPLC分离图谱。来源于第一次分离过程(A)的凝集资料显示角蝇唾液中仅含一种凝集抑制剂，其在所用的条件下大约在45分钟被洗脱。在第二次HPLC分离中，合并来自目的峰的级分并直接注入以初始溶剂平衡后的柱内。连续3次HPLC分离后，抗凝活性依然保留，真空干燥，4℃贮存4天。
图6表示角蝇唾液的抗凝蛋白经3步HPLC分离后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道1为蛋白质浓度标准；泳道2为蛋白质分子量标准；泳道3为具较高抗凝活性的HPLC级分(图5-C)，泳道4为具较低抗凝活性的HPLC级分(图5-C)。这种图谱显示有相对迁移率约为16.5Kda的一种高纯度的单一蛋白质。角蝇唾液腺cDNA文库的构建
融解、合并唾液腺总RNA(贮存于-70℃约3年之久的数等分)，并以poly(A)QuickR试剂(Stratagene,LaJolla,CA)分离mRNA。利用Stratagene的ZAP ExpressTM载体和试剂盒构建CDNA文库。对插入片段数目的原始分析表明获得的原始插入子数目相对较少(～3×104)。贮存约1/5的原始文库，剩余部分用于一轮扩增以达到5.1×106噬斑形成单位(PUF)/毫升的滴度。编码凝血抑制素的cDNA的克隆
将估计约110pmol HPLC纯的凝血抑制素送往哈佛微化学实验室，通过质谱分析获得精确的分子量并确定氨基端(N)30个残基的序列。尽管以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反复地表明其分子量约16.5KDa(见，例如，图6)，但质谱检测到HPLC纯样品为由4种蛋白质组成的明显“家族”，其平均分子量为9.3±0.06kDa。自9kDa的蛋白质获得一段N端序列(SEQID NO:3)，表明可变的分子量源于非常相似的蛋白质，它们可能具有不同的离子对或仅有少至1-2个氨基酸的差别。N端的序列也提示该蛋白质是高度酸性的。经HPLC纯化并送去分析的第二个凝血抑制素样品，得到相似的分子量。以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳再次分析第二个样品的剩余部分。蛋白质电泳的分子量仍约为16.5kDa。检索科学文献揭示了另外一篇有关一种高度酸性蛋白质的报道(Takano等(1988)生物化学，27:1964-1972)，该蛋白质以聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时有异常高的分子量。为确定分子量，以SDS/PAGE分析经再钙化试验确定有活性的第三批凝血抑制素样品。将16.5kDa蛋白质的单一条带转移至PVDF膜上。以丽春红S染色印迹以显示转移的凝血抑制素条带。剪下该条带和相似区域的对照区，送往哈佛实验室进行序列分析。此次N-端序列分析(SAGPI)证实了N-端前5个氨基酸的同一性。
利用列于SEQ ID NO:3中来源于凝血抑制素前30个残基的N-端序列来由Auburn大学Scott-Ritchey研究中心(SRRC)DNA实验室构建简并核苷酸引物。将如上面描述构建cDNA文库时在合成第一条cDNA链后取出并冻存于-20℃的一小部分西方角蝇唾液腺cDNA作为模板DNA。依据凝血抑制素N端序列设计简并性正向引物，寡聚dT为反向引物，以上述模板进行PCR反应，扩增出大约350bp的产物。以1μl PCR产物与PCR2.1载体(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)在14℃连接过夜。以连接产物转化OneShotTM细胞(Invitrogen Corporation)，并转移到含氨苄青霉素的LB琼脂板上。生长过夜后，可观察到各代表包含无插入片段的质粒(蓝色)，和有破坏β-半乳糖苷酶基因之插入片段的质粒(白色菌落)的蓝和白菌落出现。挑选10个白色和2个蓝色克隆接种在液体培养基中，30℃过夜生长扩增。取每种培养物的一部分在-70℃贮存于甘油中。通过溴化乙锭染色并与分子量标准比较目测质粒大小。小量制备DNA并由SRRC DNA实验室以基于质粒载体中多克隆插入位点侧翼序列的引物测序。
由列于SEQ ID NO:1的PCR克隆的cDNA编码的列于SEQ ID NO:2中的蛋白质推断的氨基酸序列被证实与凝血抑制素是同一的，即该cDNA编码一种约9kDa的蛋白质并包含N端测序揭示的全部氨基酸，虽然仅利用一小部分信息合成允许PCR扩增的简并性引物。推断蛋白质的21％由天冬氨酸和谷氨酸残基组成。这些信息也证实了编码有活性凝血抑制素的cDNA包含在西方角蝇cDNA文库之中。在GeneBank的蛋白质数据库中检索未发现相似序列。地高辛标记的凝血抑制素探针的制备
利用上述PCR克隆的凝血抑制素cDNA片段产生地高辛标记探针，用于在很严紧的条件下筛选西方角蝇cDNA文库。利用克隆的凝血抑制素片段为模板和GeniusTM系统(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，在地高辛-11-dUTP与dTTP比值为1∶5条件下，通过PCR合成地高辛标记的探针。以琼脂糖凝胶电泳纯化地高辛标记的DNA。标记探针的产量以滴定和与Genius试剂盒提供的DIG标记的对照DNA相比较来确定。全长cDNA的克隆和序列分析
以来源于扩增文库的50,000噬斑形成单位(pfu)转染XL1blue细胞并铺在150-mm NZY平板上。孵育过夜后，平板在4℃预冷2小时，将噬斑复制到尼龙膜上，并以地高辛标记的DNA片段检测。简而言之，将“粘起的”的DNA在室温变性5分钟，干燥5分钟，中和5分钟，并在Stratalinker 1800(Stratagene,La,Jolla,CA)中按自动交联循环交联；在5×SSC,0.1％N-月桂基肌氨酸，0.02％SDS,2％封闭试剂和50％甲酰胺溶液中，65℃进行预杂交和杂交；洗膜4次，然后通过与抗地高辛缀合的碱性磷酸酶孵育，并加入能够生成蓝色产物的底物，观察杂交的地高辛-凝血抑制素。将从第一轮筛选中挑选的几个噬斑亚克隆以确定第二轮筛选的阳性克隆。从SM缓冲液中的噬斑提取噬菌体，如上所述使其在NZY平板上培养的XL1-Blue MRF细胞中生长而得以扩增。自小量生长过夜的细菌克隆中分离DNA。以凝血抑制素特异性正向引物和基于克隆PCR片段的序列合成的反向内部引物，用PCR扩增检测阳性克隆。以另外一次噬斑试验进一步检测阳性克隆，因所有的集落均与地高辛标记的探针杂交表明阳性克隆是纯的。
利用ExAssist/XLOLR系统和Stratagene的方法，通过自动切割获得包含克隆的插入片段的噬菌粒。在LB-卡那霉素的平板上培养集落，并制备甘油贮存液贮存在-70℃。挑选相似的集落经过夜生长扩增。小量提取DNA，正向以T3和凝血抑制素-F1引物，反向以T7和凝血抑制素-R1引物，以自动循环测序(SRRC)分析，并用正向和反向引物测定内部到末端的序列。得到数个cDNA克隆并测定其序列。命名为TB8的部分cDNA的核苷酸序列列于SEQ ID NO:4，其编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO:5。需要指出的是列于SEQ ID NO:4中263-505位的核苷酸编码的列于SEQ ID NO:5中88-168位的氨基酸残基对应于活性凝血抑制素。
用Genetics Computer Group的Wisconsin PackageTM(GCG,MadisonWI)分析核酸和凝血抑制素cDNA的推算蛋白质序列。
为获得全长cDNA序列，利用唾液腺mRNA和具有对应于上述cDNA克隆3′共有序列的内部引物，使用5′RACE(快速扩增cDNA末端)程序。编辑重叠序列以确定全长cDNA序列组成。通过改建使克隆包含由5′RACE程序所确定的5′端核苷酸，用上述TB8 cDNA克隆构建编码凝血抑制素的全长cDNA。全长cDNA的核苷酸序列列于SEQ ID NO:6，其中编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO:7。需指出的是由列于SEQ ID NO:6中283-525位核苷酸编码的列于SEQ ID NO:7中的95-175位氨基酸残基对应于活性凝血抑制素。重组凝血抑制素蛋白质的产生
以能够切割质粒多克隆位点但不切割凝血抑制素内部序列的2种限制性内切酶消化凝血抑制素质粒DNA和转移载体pBacPAK8(CLONTECH,Palo Alto,CA)。以TAE凝胶电泳纯化切下的凝血抑制素和线性化的pBacPAK8。切下消化条带并以“Sephaglas”Band制备试剂盒(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)提取DNA。建立1∶2(载体：插入片段)连接反应，并在15℃连接过夜。用包含PCR片段部分所述的凝血抑制素插入片段的pBacPAK8质粒转化OneshotTM细胞。将转化的细胞在LB氨苄青霉素平板上生长过夜。挑选数个集落在37℃，液体培养基中生长过夜。制备甘油储存物，并冷冻在-70℃，快速制备质粒以琼脂糖凝胶成像确定大小。以柱纯化法(Qiagen Corp.,Santa Clarita,CA)小量制备DNA，以Bac 2引物(CLONTECH)进行DNA序列分析。
利用lipofectinTM(Life Technologies,6rand Island,NY)为转染试剂和High FiveTM无血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以BacPAK8/凝血抑制素质粒TB8/3和Bsu36I消化的BacPAK6病毒DNA共转染Sf9细胞，获得包含凝血抑制素插入片段的重组杆状病毒。对照包括野生型病毒(阳性对照)和仅DNA质粒本身(阴性对照)。将细胞在室温与转染培养基孵育5小时后，加含10％胎牛血清的TNM-FH培养基(TNM-FH/FBS)，并在27℃继续孵育72小时。收集含病毒的细胞培养上清，并贮存在4℃。进行噬斑试验，从而从细胞上清中分离纯的凝血抑制素病毒克隆。以100μl上清或100μl TNM-FH/FBS培养基中稀释高达10-3的稀释液，感染每个平板含1.5×106个Sf9细胞的35mm平板，重复两份。室温放置1小时后，移去感染培养基，以3.5ml含10％胎牛血清，50μg/ml庆大霉素和1％琼脂糖的Grace培养基(Life Technologies,Grand Island,NY)覆盖在细胞上。将细胞在有湿纸巾的27℃塑料箱中孵育。5天后，在细胞上再铺第二层还含0.16mg/ml中性红染料和250μg/ml Xgal的培养基。在琼脂糖复盖层形成凝胶后，颠倒平板，室温孵育48小时。挑选清晰的阳性噬斑，在TNM-FH培养基中孵育过夜洗脱病毒。用洗脱的病毒感染Sf9细胞并在27℃孵育4天以形成第一代病毒。
将细胞收集在磷酸缓冲盐水(10mM,pH7.4)中，按使用手册中的方案Ⅱ，利用Stratagene DNA小量提取试剂盒提取DNA。以提取的DNA为模板，以凝血抑制素正向引物和反向引物对以及Bac1/Bac2引物对(CLONTHCH)，进行PCR。两种引物对的扩增均证实转化正确，进行第二次噬斑试验以确定克隆的纯度和病毒的滴度。重组凝血抑制素产品的鉴定
以病毒(感染复数=2)感染sf9细胞并在27℃孵育，在12、24、48、72和96小时收集培养液。在CentriplusTM100浓缩仪(Amicon,Beverly,MA)中以3,000×g，在室温下离心2小时浓缩病毒，并从培养基之中移出，按改良的Lowry试验(Sigma Chemical,St.Louis,MQ)评估小于100kDa级分中的总蛋白质。
以上述的生色底物S238试验检测重组凝血抑制素的抗凝集和/或抗凝血酶活性。重组凝血抑制素的RP/HPLC纯化
将无病毒的细胞培养上清之中的大分子量组份(≥10kDa)在CentriplusTM10微型浓缩仪中以3,000×g离心4小时浓缩。以C18大球柱进行RP/HPLC，以乙腈梯度洗脱，从上所述的其他培养基组分之中分离重组凝血抑制素。
检测凝血抑制素在实验室动物模型(兔子)中的免疫特性，作为生产抗吸血角蝇的核酸(DNA)疫苗的第一步。
吸血昆虫唾液中的抗止血蛋白质不是高免疫原性的(见Cupp和Cupp(1997)昆虫药物杂志(J.Med.Entomol.),34:87-94)。这种实验性观察结果与免疫反应的产生，尤其是产生中和性抗体的有可能阻止或减少吸血和子代产生及适应性的直觉性概念相吻合，因此，开发诱导针对这种分子的强大免疫反应的方法十分重要。更重要的是，有效地免疫田野中的家畜也要求有仅需要最小量的处理和贮存的实用疫苗。在过去的几年间，已经证明应用核酸免疫能够产生强的针对所编码蛋白质的免疫反应，通过改变给予核苷酸的位置和/或量可使该蛋白质导向特定的免疫空间。通过相对简单的细菌培养技术，能够廉价生产这种包含带插入的目的DNA的质粒的疫苗，它们在室温下贮存是稳定的，这样就可克服许多基于蛋白质的疫苗存在的问题。因此，首先以凝血抑制素核酸检测兔子的免疫。
构建包含CMV启动子和卡那霉素抗性筛选标记的质粒疫苗。用上文就杆状病毒转移载体的限制性消化和再连接所述的方法，产生含凝血抑制素的疫苗质粒(TS-Vac)。
从由每只兔的大耳静脉采来的血样中获得血清作为免疫前对照，在PBS中将三种Ts-Vac质粒(500μg无插入片段的质粒=对照；200μg或500μgTS-Vac=检测质粒)之一，皮内注射9只兔子。大约4周后采血样，并检测针对凝血抑制素的体液(特异性抗体滴度的存在)和细胞(母细胞形成反应)反应。注射后20周内每周检测一次这些参数。所有的免疫试验均是标准试验，并在以前发表的有关吸血昆虫唾液因子的免疫反应工作(Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:725-734；Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:928-935)中使用过。
以直接ELISA试验确定抗体的滴度(Cross等，(1993)J.Med.Entomol.30:725-734；Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:928-935)。简单地说，以重组凝血抑制素或非特异性蛋白质包被96孔平底微滴定平板，然后用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS液封闭。各孔用免疫前血清或测试血清孵育，然后以PBS-吐温洗孔，再加入碱性磷酸酶缀合的抗-兔IgG(Sigma Immunochemicals,St.Louis,MO)或抗兔IgM(SouthernBiotechnology Assoc.Inc.,Birmingham,AL)。与对硝基苯基磷酸(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)进行底物反应后，用Spectramax微滴定平板读取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在405nm处读取颜色强度。计算抗体滴度并在治疗组中比较以确定产生抗体的最适免疫原剂量。
用重组凝血抑制素，以点印迹(Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:725-734)评估抗体对凝血抑制素的特异性。将重组凝血抑制素或牛血清白蛋白(BSA)对照点在96孔硝酸纤维素底的微滴度平板(Millipore,Manborough,MA)上。用含3％脱脂奶粉的PBS做封闭液。在洗涤和底物反应前，加入待测血清孵育1小时。通过目测确定抗体的特异性反应。
利用在以EDTA为抗凝剂对血液进行Ficoll-Paque离心分离的外周血单核细胞(PBM)，检测对凝血抑制素的细胞反应(Ramachandra和Wikel(1992),J.Med.Entomol.29:818-826)。分离细胞的活力通过取小份细胞用能够明亮地标记健康细胞的二乙酸荧光素(FDA；Sigma,St.Louis,MO)确定。在加入重组凝血抑制素、角蝇唾液或非特异蛋白质之前，将PBM以5×105细胞/孔加入微滴定平板之中。加入有丝分裂原ConA后继续孵育72小时，利用在570nm处读值的MTT比色试验(Denizot和Land(1986)免疫学方法杂志89(2):271-277)确定对检测蛋白质的细胞反应。通过超过对照的增加值来确定对凝血抑制素的母细胞生成反应。比较完整唾液存在时的免疫反应可以探测唾液中的免疫调节因子。
本说明书中提到的全部出版物和专利申请体现本发明所在领域的专业技术人员的水平。全部出版物和专利申请书单独地以同等程度在此处引入作为参考。
本发明的其他修改和实施方案将会被受益于此处提供的教学的本发明所属领域的技术人员所领会。所以，应理解，本发明不仅仅局限于公开的特定实施方案，尽管采用了特殊的术语，但它们仅以普通的和一般的描述性方式被使用，不是用作限制目的，并且修改和实施方案包含在附加的权利要求范围之内的。
序列表
<110>Cupp,Eddie Wayne
 Cupp,Mary Smith
<120>来自角蝇的抗凝血酶核苷酸和蛋白质
<130>5721-10
<160>7
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>370
<212>DNA
<213>Haematobia irritans
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(243)
<400>1agt gcg ggt ccc atc aca ctg caa tta gat gat gat gat gat gac gac   48Ser Ala Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp1               5                   10                  15tct ggt atc ccc ata ttt gaa atg gat gat gaa gat gaa gac tct aat   96Ser Gly Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp Asp Glu Asp Glu Asp Ser Asn20                  25                  30gac aat caa aaa ttt cct tta agt ttt gaa cgg ttt cca gaa aat gaa   144Asp Asn Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Glu Arg Phe Pro Glu Asn Glu35                  40                  45aaa aat caa gta ggc ttg aga gct aga ttt aac aaa ttc atg gca aaa   192Lys Asn Gln Val Gly Leu Arg Ala Arg Phe Asn Lys Phe Met Ala Lys50                  55                  60ttt act tcg ctg ttt ggc cgt cgt cgt ggc gta aat gtt ccc aat gct   240Phe Thr Ser Leu Phe Gly Arg Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Asn Ala65                  70                  75                  80gca taagcaaact aatattatat attaattact tcatttatgt gttctacact        293Alaatataacaaa taaaaggat tattaattaat tcataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 353aaaaaaaaaa aaaaaaa                                                370
<210> 2
<211> 81
<212> PRT
<213> Haematobia irritans
   <400>2Ser Ala Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp1               5                  10                  15Ser Gly Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp Asp Glu Asp Glu Asp Ser Asn20                  25                  30Asp Asn Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Glu Arg Phe Pro Glu Asn Glu35                  40                  45Lys Asn Gln Val Gly Leu Arg Ala Arg Phe Asn Lys Phe Met Ala Lys50                  55                  60Phe Thr Ser Leu Phe Gly Arg Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Asn Ala65                  70                  75                   80Ala
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Haematobia irritans
   <400> 3Ser Ala Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp1               5                  10                  15Ser Gly Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp Asp Glu Asp Glu Glu
        20                  25                  30
<210> 4
<211> 611
<212> DNA
<213> Haematobia Irritans
<220>
<221> CDS
<222> (2)...(505)
<400> 4t gga atc tta gct ctt tca gct gtc tgc cag gcc caa aat gtc tta tca    49Gly Ile Leu Ala Leu Ser Ala Val Cys Gln Ala Gln Asn Val Leu Ser1               5                   10                  15gga cgc cgc caa cat ggt gcc caa gga ctt tct gga tat tct ggt gat      97Gly Arg Arg Gln His Gly Ala Gln Gly Leu Ser Gly Tyr Ser Gly Asp20                  25                  30aat gac tgg gga tat tac ggt gaa gcc gga gct cca gga tcg gac tac       145Asn Asp Trp Gly Tyr Tyr Gly Glu A la Gly Ala Pro Gly Ser Asp Tyr35                  40                   45tct ggt tct tca ggt caa tgg gca ccc tta gat ttt gat tat aac agt       193Ser Gly Ser Ser Gly Gln Trp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Asn Ser50                   55                  60cta cct gga tta tcg gga tat aac cat gaa caa caa gat tac gaa gaa       241Leu Pro Gly Leu Ser Gly Tyr Asn His Glu Gln Gln Asp Tyr Glu Glu65                  70                  75                  80gat agt tat cgc cat gta cgc agt gcg ggt ccc atc aca ctg caa tta       289Asp Ser Tyr Arg His Val Arg Ser Ala Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu                 85                  90                  95gat gat gat gat gat gac gac tct ggt atc ccc ata ttt gaa atg gat       337Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Gly Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp100                 105                 110gat gaa gat gta gac tct aat gac aat caa aaa ttt cct tta agt ttt       385Asp Glu Asp Val Asp Ser Asn Asp Asn Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe115                 120                 125gaa cgg ttt cca gaa aat gaa aaa aat caa gta ggc ttg aga gct aga       433Glu Arg Phe Pro Glu Asn Glu Lys Asn Gln Val Gly Leu Arg Ala Arg130                 135                 140ttt aac aaa ttc atg gca aaa ttt act tcg ctg ttt ggc cgt cgt cgt       481Phe Asn Lys Phe Met Ala Lys Phe Thr Ser Leu Phe Gly Arg Arg Arg145                 150                 155                 160ggc gta aat gtt ccc aat gct gca taagcaaact aatattatat attaattact      535Gly Val Asn Val Pro Asn Ala Ala165tcatttatgt gttctacact atataacaaa taaaaggatt attaattaat tcataaaaaa     595aaaaaaaaaa aaaaaa                                                     611
<210> 5
<211> 168
<212> PRT
<213> Haematobia Irritans
<400> 5Gly Ile Leu Ala Leu Ser Ala Val Cys Gln Ala Gln Asn Val Leu Ser1               5                  10                   15Gly Arg Arg Gln His Gly Ala Gln Gly Leu Ser Gly Tyr Ser Gly Asp20                  25                  30Asn Asp Trp Gly Tyr Tyr Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Ser Asp Tyr35                  40                  45Ser Gly Ser Ser Gly Gln Trp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Asn Ser50                  55                  60Leu Pro Gly Leu Ser Gly Tyr Asn His Glu Gln Gln Asp Tyr Glu Glu65                  70                  75                  80Asp Ser Tyr Arg His Val Arg Ser Ala Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu85                  90                   95Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Gly Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp100                 105                 110Asp Glu Asp Val Asp Ser Asn Asp Asn Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe115                 120                 125Glu Arg Phe Pro Glu Asn Glu Lys Asn Gln Val Gly Leu Arg Ala Arg130                 135                 140Phe ASn Lys Phe Met Ala Lys Phe Thr Ser Leu Phe Gly Arg Arg Arg145                 150                 155                 160Gly Val Asn Val Pro Asn Ala Ala
            165
<210>6
<211>631
<212>DNA
<213> Haematobia Irritans
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(525)
<400> 6atg aag cat ttc gta gtt att gga atc tta gct ctt tca gct gtc tgc         48Met Lys His Phe Val Val Ile Gly Ile Leu Ala Leu Ser Ala Val Cys1               5                   10                  15cag gcc caa aat gtc tta tca gga cgc cgc caa cat ggt gcc caa gga         96Gln Ala Gln Asn Val Leu Ser Gly Arg Arg Gln His Gly Ala Gln Gly20                  25                  30ctt tct gga tat tct ggt gat aat gac tgg gga tat tac ggt gaa gcc         144Leu Ser Gly Tyr ser Gly Asp Asn Asp Trp Gly Tyr Tyr Gly Glu Ala35                  40                  45gga gct cca gga tcg gac tac tct ggt tct tca ggt caa tgg gca ccc         192Gly Ala Pro Gly Ser Asp Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Gln Trp Ala Pro50                  55                  60tta gat ttt gat tat aac agt cta cct gga tta tcg gga tat aac cat         240Leu Asp Phe Asp Tyr Asn Ser Leu Pro Gly Leu Ser Gly Tyr Asn His65                  70                  75                  80gaa caa caa gat tac gaa gaa gat agt tat cgc cat gta cgc agt gcg         288Glu Gln Gln Asp Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Arg His Val Arg Ser Ala85                  90                  95ggt ccc atc aca ctg caa tta gat gat gat gat gat gac gac tct ggt         336Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Gly100                 105                 110atc ccc ata ttt gaa atg gat gat gaa gat gta gac tct aat gac aat         384Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp Asp Glu Asp Val Asp Ser Asn Asp Asn115                 120                 125caa aaa ttt cct tta agt ttt gaa cgg ttt cca gaa aat gaa aaa aat         432Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Glu Arg Phe Pro Glu Asn Glu Lys Asn130                 135                 140caa gta ggc ttg aga gct aga ttt aac aaa ttc atg gca aaa ttt act         480Gin Val Gly Leu Arg Ala Arg Phe Asn Lys Phe Met Ala Lys Phe Thr145                 150                 155                 160tcg ctg ttt ggc cgt cgt cgt ggc gta aat gtt ccc aat gct gca             525Ser Leu Phe Gly Arg Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Asn Ala Ala165                 170                 175taagcaaact aatattatat attaattact tcatttatgt gttctacact atataacaaa       585taaaaggatt attaattaat tcataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                      631
<210>7
<211>175
<212>PRT
<213> Haematobia Irritans
<400>7Met Lys His Phe Val Val Ile Gly Ile Leu Ala Leu Ser Ala Val Cys1               5                  10                  15Gln Ala Gln Asn Val Leu Ser Gly Arg Arg Gln His Gly Ala Gln Gly20                  25                  30Leu Ser Gly Tyr Ser Gly Asp Asn Asp Trp Gly Tyr Tyr Gly Glu Ala35                  40                  45Gly Ala Pro Gly Ser Asp Tyr Ser Gly Ser Ser Gly Gln Trp Ala Pro50                  55                  60Leu Asp Phe Asp Tyr Asn Ser Leu Pro Gly Leu Ser Gly Tyr Asn His65                  70                  75                  80Glu Gln Gln Asp Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Arg His Val Arg Ser Ala85                  90                  95Gly Pro Ile Thr Leu Gln Leu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Gly100                 105                 110Ile Pro Ile Phe Glu Met Asp Asp Glu Asp Val Asp Ser Asn Asp Asn115                 120                 125Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Glu Arg Phe Pro Glu Asn Glu Lys Asn130                 135                 140Gln Val Gly Leu Arg Ala Arg Phe Asn Lys Phe Met Ala Lys Phe Thr145                 150                 155                 160Ser Leu Phe Gly Arg Arg Arg Gly Val Asn Val Pro Asn Ala Ala165                 170                 175

Claims (25)

1．一种基本上纯化的具有抗凝血酶活性的蛋白质，其中所述的蛋白质是从环裂亚目中一个物种的唾液腺中分离的。
2．根据权利要求1的蛋白质，其中所述的蛋白质从角蝇属一个物种的唾液腺中分离的。
3．权利要求2的蛋白质，其中所述的物种是西方角蝇。
4．一种基本上纯化的蛋白质，其具有选自下述的氨基酸序列：
a)来自环裂亚目一个物种的抗凝血酶蛋白质的氨基酸序列；
b)列于SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7之中的氨基酸序列；
c)与列于SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7之中的氨基酸序列具有显著序列相似性的氨基酸序列；
d)是列于SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7之中的氨基酸序列的变体的氨基酸序列；
5．SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的片段；其中所述的片段包含所述序列的至少15个连续的氨基酸。
6．权利要求4的蛋白质，其中所述的蛋白质是通过重组的方法产生的。
7．权利要求4的蛋白质，其中所述的蛋白质能够调节免疫反应。
8．分离的编码具有抗凝血酶活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述的蛋白质是从环裂亚目一个物种的唾液腺中分离的。
9．一种分离的核苷酸序列，其选自：
a)包含列于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列的核苷酸序列；
b)与列于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列具有显著序列相似性的核苷酸序列；
c)是列于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列的变体的核苷酸序列；
d)编码列于SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。
10．一种核苷酸序列，该序列包含列于SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7的氨基酸序列中的至少15个连续氨基酸残基。
11．一种核苷酸序列，该序列在严紧的条件下可与列于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列杂交。
12．一种载体，该载体包含权利要求9的核苷酸序列。
13．一种宿主细胞，该细胞包含权利要求9的核苷酸序列。
14．一种载体，该载体包含权利要求11的核苷酸序列。
15．一种宿主细胞，该细胞包含权利要求11的核苷酸序列。
16．一种可选择性地与具有抗凝血酶活性的蛋白质结合的抗体制剂，其中所述的蛋白质来自环裂亚目一个物种的唾液腺。
17．权利要求16的抗体制剂，其中所述的蛋白质包含根据SEQID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
18．一种抗体制剂，该制剂可选择性地结合权利要求5所述的片段。
19．一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求4的蛋白质。
20．一种兽用疫苗，该疫苗包含治疗有效量的权利要求4的蛋白质。
21．一种兽用疫苗，该疫苗包含治疗有效量的权利要求9-11中任何一项的核苷酸序列。
22．一种治疗家畜中吸血病的方法，所述方法包含将权利要求20或21任何一项的疫苗给予所述家畜。
23．一种治疗哺乳动物血栓症的方法，所述方法包含将治疗有效量的具有抗凝血酶活性的蛋白质给予所述哺乳动物，其中所述的蛋白质具有选自列于权利要求4的氨基酸序列组中的氨基酸序列。
24．权利要求23的方法，其中所述蛋白质由重组方法产生。
25．一种生产具有抗凝血酶活性的蛋白质的方法，该方法包含：
a)在可以生产所述蛋白质的条件下培养以编码权利要求2的蛋白质的核苷酸序列转化了的原核或真核细胞；和
b)分离该蛋白质。
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