CN1396259A - 一种鸡cLATS1基因、核苷酸和蛋白的编码序列，及其制备与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种鸡cLATS1基因，核苷酸和蛋白序列及其制备和用途。现有技术中尚无该类研究的报导。本发明提供了该蛋白的cDNA编码序列、该序列编码的多肽，以及利用重组技术生产所述的鸡cLATS1蛋白的方法。该蛋白可用于诊断和治疗肿瘤疾病、改良经济物种等。

Description

一种鸡cLATS1基因、核苷酸和蛋白的编码序列，及其制备与用途

技术领域

本发明涉及一种新的多聚核苷酸，由该多聚核苷酸编码的多肽，这些多聚核苷酸和多肽的用途，以及所述多聚核苷酸的生产方法。更具体的说，本发明涉及lats肿瘤抑制基因家族的一个新成员。

背景技术

lats肿瘤抑制基因最早是在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现的(Development(1995)121：1053-1063)。lats纯合突变可引起果蝇在发育早期死亡，同时伴有器官和个体的增大。运用FLP/FRT镶嵌分析系统，我们发现lats纯合突变在果蝇的各种组织中都可诱发肿瘤发生。lats基因编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与一系列与细胞周期调控相关的蛋白激酶享有较高的同源性。

lats基因是第一条被发现同时在脊椎动物和非脊椎动物体中起肿瘤抑制功能的基因。我们克隆到的人和小鼠的同源基因hLATS1和mLATS1，在序列和功能上与果蝇lats基因都非常保守。人同源基因hLATS1可被用来拯救果蝇lats突变造成的致死效应，抑制肿瘤发生(NatureGenet(1999)21：177-181)。研究发现，hLATS1与细胞周期蛋白cyclinA和cylinB竞争结合细胞周期依赖性激酶CDC2(Oncogene(2001)20：6516-6523)，同时下调细胞周期蛋白cyclinA和cyclinB的表达量(Oncogene(2002)21：1233-1241)，来抑制其H1激酶活性。这与果蝇体中诱导cyclinA或CDC2的突变可抑制lats基因突变表型的结论相符。推测lats基因通过调控细胞周期来行使其肿瘤抑制的功能。

病理分析表明，mLATS1基因剔除的小鼠具有乳腺发育缺陷、不育、垂体增生、血清激素水平降低等缺陷(Nature Genet(1999)21：182-186)。这与人体中的两类疾病：由黄体促性腺激素分泌不足引起的性腺机能减退、黄体机能不全非常相似。同时发现，所有mLATS1缺失的雌鼠都会长出良性的卵巢基质细胞瘤。而且，mLATS1缺失后小鼠对于致癌刺激特别敏感，易生长恶性的软组织肉瘤。虽然软组织肉瘤在人体中比较少见，但是研究发现该病的发生率在两个著名的肿瘤抑制基因p53和p16的基因缺失小鼠中也非常高(Nature(1992)356：215-221；Cell(1996)85：27-37)。由于p53和p16的基因变异与大多数的人体肿瘤相关，可以推断hLATS1在抑制人体肿瘤发生过程中也相当重要。

用腺病毒载体将人hLATS1基因转入6种不同的肿瘤细胞株中并诱导其表达，我们发现hLATS1蛋白可抑制肿瘤细胞的生长。异源表达的hLATS1蛋白通过诱导细胞分裂G2/M转变期的停滞或细胞凋亡的途径来抑制肿瘤细胞在软琼脂上的贴壁不依赖性生长。同时发现，将hLATS1高表达的肿瘤细胞移植入裸鼠体内也无法形成肿瘤组织。奇妙的是只有在P53未发生变异的肿瘤细胞株中，hLATS1的高表达才可诱导细胞凋亡，否则只能诱导G2/M转换期的停滞。人hLATS1基因通过调节细胞周期和细胞凋亡来抑制肿瘤的这一特性，与其它肿瘤抑制基因非常相似，阐明了它在人体中抑制肿瘤发生的重要性。

lats基因突变果蝇的幼虫或器官原肌与野生型相比，增大可达10倍以上，表明lats参与个体和器官大小的调控。个体和器官大小的差异是多细胞生物进化过程中变化最显著的性状之一。虽然不同物种单个细胞的大小差别并不大，但在器官和个体水平上，这个差异可达几个数量级之多。而且外在环境对多细胞生物个体和器官大小的影响同内在基因的决定作用相比是微不足道的。近来发现，胰岛素信号传导途径可能参与生物器官和个体大小。但遗憾的是，对高等生物特别是脊椎动物中调控大小的分子机制了解甚少。

人hLATS1基因可抑制果蝇lats基因突变造成的器官和个体增大等表型缺陷，表明LATS信号传导途径从果蝇到人是高度保守的。近一步暗示我们LATS1在高等生物中也参与器官和个体大小的调控。研究LATS1基因在脊椎动物器官和个体大小的调控机制，需要遗传背景相同而个体大小相差悬殊的品系作为研究对象。家禽和家禽的品系特点使其中的一些生物与该准则相匹配。本发明就是选取鸡作为研究对象。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的多聚核苷酸，该多聚核苷酸编码lats基因家族的一个新成员，被命名为cLATS1(chicken large tumor suppressor homology 1)。

本发明的另一个目的提供一种新的lats基因家族成员的基因产物，该蛋白被命名为cLATS1。

本发明的另一目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的鸡cLATS1蛋白的方法。

本发明还涉及这种鸡cLATS1蛋白的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从393-3803位的核苷酸序列有至少80％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列杂交。

在本发明中，“分离”和“纯化”的DNA是指，该DNA或片断已经从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，也指该DNA或片断与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的cLATS1蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列或其活性片断、其活性衍生物。

在本发明中，术语“cLATS1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，入SEQ ID NO：1的简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列的编码框393-3803位的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同的简并密码子所取代后而产生的核苷酸序列。该术语还包括能在中等严谨条件下于SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与cLATS1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异包括(但不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和(或)取代，以及在5’和(或)3’端添加数个(通常60个以内，较佳地30个以内，更佳地10个以内，最佳地5个以内)核苷酸。该多肽地变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然变异体、诱导变异体、在高或低的严谨度条件下能与cLATS1核苷酸序列杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用cLATS1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体能转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种能产生具有cLATS1蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(1)将编码具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连与表达调控序列，形成cLATS1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从393-3803位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成cLATS1蛋白的重组细胞；

(3)在适当表达cLATS1蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有cLATS1蛋白活性的多肽。

本发明还提供cLATS1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然cLATS1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机突变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰后产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括cLATS1多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内cLATS1蛋白的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有cLATS1多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续的氨基酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码cLATS1的核酸序列。

本发明还包括检测cLATS1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否与之发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于cLATS1多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

在本分明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本分明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子如大肠杆菌和枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如COS细胞，CHO细胞等。

另一方面，本发明还包括对cLATS1DNA或其片断编码的多肽具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体那结合于cLATS1基因产物或片断。较佳地，指那些能与cLATS1基因产物或片断结合但不识别或结合于其它非相关抗原分子的抗体。本分明中，抗体包括那些能够结合并抑制cLATS1蛋白的分子，也包括那些并不影响cLATS1蛋白功能的抗体。本分明还包括那些能与修饰或未经修饰的cLATS1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片断，如Fab′或(Fab)₂片断；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌和抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的cLATS1基因产物或者其具有抗原性的片断，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达cLATS1或其具有抗原性的片断的细胞可用来免疫动物来产生抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断cLATS1功能的抗体以及不影响cLATS1功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用cLATS1基因产物的片断或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与cLATS1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中产生的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，  可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的cLATS1核苷酸全长序列或其片段通常可以用分子杂交方法从鸡的cDNA文库筛选、PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于cDNA文库筛选法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计探针，从市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库中杂交筛选而克隆到有关序列。当序列较长时，常常需要将多个片断按正确次序拼接在一起。也可通过本发明中的公开序列来设计引物，通过一次或多次的PCR扩增并拼接来获得序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通过是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片断，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

得到了全长的cDNA分子后就可以与特定载体连接，制成探针或作为微矩阵的底物以获得一系列相关核苷酸序列；得到了蛋白后，可制成抗体、受体、拮抗剂、药物或试剂盒诊断、治疗相关疾病；针对cDNA序列，设计一种方法来操纵鸡体内该蛋白活性并来改良鸡、这一重要的经济动物。

在本发明的一个实施方案中，本发明的多聚核苷酸全长为3411个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO：1，其开放阅读框位于393-3803位核苷酸。该多聚核苷酸是如此获得的：利用人hLATS1(gi|4324433)基因cDNA的1-1755位核苷酸为探针，以低严谨度分子杂交方法，从鸡胚Uni-ZAP XR cDNA文库(购自Stratagene)中获取lats同源基因克隆。经序列分析后，通过酶切连接的方法将片断进行拼接，得到含有SEQ ID NO：1的393-3803位核苷酸的克隆。

用cLATS1的全长cDNA序列以其编码蛋白在GenBank+EMBL+PDB+DDBJ数据库中用BLAST进行核酸和蛋白结构及功能域同源检索，发现它与lats家族成员具有较高的同源性，如它与人hLATS1(gi|4324433)基因在蛋白水平上具有94％的同源性(见附表)，与小鼠mLATS1(gi|4324435)基因在蛋白水平上具有90％的同源性，与果蝇lats(gi|903941)基因在蛋白水平上具有42％的同源性。cLATS1编码序列与这三个基因编码蛋白在激酶催化结构域内同源性更高，如cLATS1蛋白与小鼠和人的LATS1蛋白享有98％的同源性，与果蝇LATS蛋白享有75％。因而认为本发明的cLATS1蛋白是该家族的新成员，具有该家族蛋白相似的功能，也可用来诊断和治疗肿瘤、侏儒症、巨人症等疾病，调控家禽(鸡等)的器官和个体大小以改良该经济物种。本发明的cLATS1蛋白可以与合适的药学上可接受的载体联用，这类药物组合物具有治疗有效的蛋白质和药学上可接受的载体和赋形剂；本发明的cLATS1蛋白还可被制备成针剂、片剂和其它治疗剂一起使用的试剂盒。本发明的cLATS1蛋白还可作为靶蛋白，筛选对诊断和治疗肿瘤、侏儒症、巨人症等疾病，控制鸡器官和个体大小有效的小分子药物。通过构建本发明中cLATS1基因的转基因家禽(如鸡)，制备改良经济物种。

附表为本发明的cLATS1与果蝇LATS、小鼠mLATS1和人hLATS1的蛋白序列比较。其中相同的氨基酸已用黑色背景标出。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1

cLATS1的cDNA序列的克隆和测定

由于lats基因家族成员的C端含有与其它丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶非常保守的激酶催化域，所以选取人hLATS1(gi|4324433)基因cDNA的5’端1-1755位核苷酸作为探针。用以低严谨度分子杂交方法，从鸡胚Uni-ZAP XR cDNA文库(购自Stratagene)中获取lats同源基因克隆。具体步骤如下：

将1×10⁶个噬菌体克隆转移到尼龙膜(Amersham)，再用80℃烘烤或紫外交联法将DNA固定。同时运用随机引物延伸法，将探针用[α-³²P]dCTP标记。然后将膜在含有6xSSC、5xDenharts’、0.5％SDS、100微克/毫升鲑鱼精DNA和2纳克/毫升cDNA探针的杂交体系中55℃杂交过夜。最后在含有1xSSC和0.1％SDS的洗脱体系中60℃洗脱30分钟。挑选阳性噬菌体克隆，再用ECL试剂盒(Amersham)进行两轮复筛以选取单克隆(杂交方法见ECL试剂盒说明书)。然后，利用Uni-ZAP XR文库的特性，将各单克隆片断从原来的Uni-ZAP XR噬菌体载体中亚克隆入噬菌粒载体pBluescript SK中并转化大肠杆菌SOLR^TM。最终送交测序公司进行片断序列测序分析。

经测序分析后，分析序列检验片段是否含有全长的cDNA序列。然后选取所需克隆片断，通过酶切连接的方法将片断进行拼接，得到含有SEQ ID NO：1的393-3803位核苷酸的克隆。根据得到的全长cDNA序列推导出cLATS1的氨基酸序列，共1123个氨基酸残基，其氨基酸序列见SEQ ID NO：2。

实施例2

同源比较

用cLATS1的全长cDNA序列以其编码蛋白在GenBank+EMBL+PDB+DDBJ数据库中用BLAST进行核酸和蛋白结构及功能域同源检索，发现它与lats家族成员具有较高的同源性，如它与人hLATS1(gi|4324433)基因在蛋白水平上具有94％的同源性(见附表)，与小鼠mLATS1(gi|4324435)基因在蛋白水平上具有91％的同源性，与果蝇lats(gi|903941)基因在蛋白水平上具有42％的同源性。cLATS1编码序列与这三个基因编码蛋白在激酶催化结构域内同源性更高，如cLATS1蛋白与小鼠和人的LATS1蛋白享有98％的同源性，与果蝇LATS蛋白享有75％。

lats基因家族成员被认为与肿瘤抑制和器官个体大小的调控有关。通过EMBL的InterProScan工具分析，本发明的cLATS1蛋白亦包含lats基因家族蛋白激酶的各种功能域。如UBA结构域，它与特异性降解蛋白的泛素途径相关，在高等生物的LATS1同源蛋白中都有发现，而在果蝇LATS蛋白中不存在；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域，它在一系列与细胞周期调控相关的蛋白激酶中高度保守；SH3域结合位点，在所有的lats家族成员中都存在。研究发现，lats参与的信号传导途径在进化上高度保守：(1)cLATS1蛋白与lats家族的其它成员在序列和功能域上非常相似；(2)mLATS1基因剔除小鼠易生长软组织肉瘤和卵巢基质细胞瘤，而且对致癌刺激特别敏感；(3)高表达hLATS1蛋白可通过诱导细胞分裂G2/M转变期的停滞或细胞凋亡的途径来抑制各种肿瘤细胞的生长；(4)人hLATS1基因可抑制果蝇lats基因突变引起的肿瘤发生和器官、个体的增大(可参与调控果蝇的器官和个体大小)。有力地证明了，若将cLATS1蛋白的抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等制成药物，可用于肿瘤、侏儒症、巨人症等疾病的诊断和治疗。通过转基因等手段，操纵cLATS1蛋白的活性或运用拮抗剂、抑制剂来调节cLATS1的表达水平，以改良鸡这一经济物种。

实施例3

cLATS1在大肠杆菌中的表达

测序结果显示编码cLATS1的cDNA序列插入在载体pBluescript SK的EcoRI和XhoI酶切位点中，其插入方向与该表达载体的转录方向相符。利用该片段起始密码子上游的NotI限制性内切酶酶切位点和终止密码子下游的KpnI限制酶酶切位点(该cDNA片段内部都没有相同的位点)，将该cDNA片段亚克隆入细菌表达载体pET32a(+)(Novagen)。

NotI限制性内切酶酶切位点和XhoI限制酶酶切位点对应于该表达载体pET32a(+)上的多克隆位点。该质粒表达载体含有编码氨苄抗性的基因(Amp^r)、一个噬菌体复制起始位点(f1ori)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调操纵子(lac o)、两个His标记物(His-Tag)、一个S标记物(S-Tag)、一个Trx标记物(Trx-Tag)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个T7转录启动子、一个T7转录终止子及一个限制性内切酶多克隆位点。

先用KpnI内切酶消化带有cLATS1片段的载体pBluescript SK，并将KpnI酶失活。再用利用T4 DNA多聚酶的3’到5’外切酶活性，切除KpnI酶切后引入的3’端突出片段，并失活T4 DNA多聚酶。同时用XhoI内切酶消化载体pET32a(+)，并失活XhoI酶。再利用Klenow酶的5’到3’的聚合酶活性，将XhoI酶切后引入的5’端突出补平，并失活Klenow酶。然后用NotI内切酶分别消化两片段，分别回收pET32a(+)和cLATS1的核酸片段。随后将cLATS1片断连接到pET32a(+)载体中并保持开放阅读框在细菌RBS起始。再把连接产物转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。DE3基因编码由lac启动子启动的T7RNA聚合酶。在该菌株的基因组中还含有编码lacI阻遏物的基因。加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)诱导后，IPTG与lacI阻遏物竞争结合lac启动子和T7启动子的lac o位点，去除了lacI阻遏物对T7RNA聚合酶和本发明的cLATS1的转录抑制。产生的T7RNA聚合酶结合于T7启动子，大幅度地启动本发明的CLATS1的转录。在含有Amp的LB培养基上挑选转化子，在补加Amp(100微克/毫升)的LB液体培养基中过夜培养阳性转化子。抽提质粒，NotI和XhoI酶切鉴定插入片断的大小，测序结果表明cLATS1的cDNA插入片断己正确插入载体。

过夜培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至OD600为1.0时，加入IPTG至终浓度为1mM。。继续培养细胞3-4小时，随后离心(600xg，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含His标记物质蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的cLATS1用6M盐酸胍(Ph5.0)从柱中洗脱SEZ-6。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤出去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以合到第二柱中，该柱中具有递减的线形盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(Ph5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白性质。此外，用常规方法对表达蛋白N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例4

cLATS1在真核细胞(IPLB-Sf21细胞)中的表达

杆状病毒(baculovirus)表达系统可表达分子量比较大的蛋白，与原核表达系统相对更具优势。由于通过杆状病毒介导在昆虫宿主细胞中表达的蛋白经过了翻译后修饰，因此具有与天然蛋白相似的结构和功能，而且其表达量可达整个细胞蛋白重量的30％左右。本实施例使用BakPAK^TM杆状病毒表达系统(Clontech)来表达本发明的cLATS1蛋白。该系统由线性的BacPAK6病毒DNA和环形的转移载体BacPAK8、BacPAK9两部分所组成。BackPAK6病毒DNA缺失了杆状病毒(AcMNPV，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒)复制所必须的基因，因此无法在昆虫体内繁殖。一旦与携带该缺失基因的转移载体BacPAK8或BacPAK9在细胞内重组后就可生成具有侵染能力的病毒。由于多角体蛋白(polyhedrin)缺失的病毒仍可侵染昆虫细胞，所以在BacPAK8和BacPAK9所携带的多角体蛋白的编码片段被一段限制性内切酶多克隆位点所替代。外源基因插入后，可利用多角体蛋白的调控元件来高效表达。

BacPAK8转移载体含有编码氨苄抗性的基因(Amp^r)、一个噬菌体复制起始位点(M13ori)、一个细菌复制起点(ori)及一段改造过的病毒序列。该序列包括AcMNPV复制所必须的基因和一个多角体蛋白启动子(polyhedrin promoter)、一个加尾信号和相应的polyA序列及一个限制性内切酶多克隆位点。

利用实施例3中所述的带有cLATS1片段的pBluescript SK载体上的XbaI和KpnI酶切位点，将本发明的cLATS1的cDNA序列亚克隆入BacPAK8。BamHI限制性内切酶酶切位点和XhoI限制酶酶切位点对应于该表达载体BacPAK8转移载体上的多克隆位点。用NotI和KpnI内切酶消化载体BacPAK8转移载体，随后将插入片断连接到BacPAK8载体中，并将连接产物转化大肠杆菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑选阳性转化子，并在补加Amp(100微克/毫升)的LB液体培养基中过夜培养转化子克隆。抽提质粒，NotI和KpnI酶切鉴定插入片断的大小，测序结果表明cLATS1的cDNA插入片断已正确插入载体BacPAK8。

采用脂质体Bacfectin(Clontech)将BacPAK6和携带cLATS1 cDNA片断的BacPAK8共转染IPLB-Sf21草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞株(按照Clontech公司提供的步骤)。27℃培养5小时后，加入BacPAK完全培养液(Clontech)再培养72小时。然后，收集共转染上清培养基，并用BacPAK杆状病毒效价试剂盒(Clontech)测定病毒的效价。选取20为病毒感染复数(M.O.I.)，侵染单层Sf21贴壁细胞，1小时后更换新鲜培养基，27℃继续培养。每隔2小时收集细胞，按50μl裂解缓冲液/每10⁶个Sf21细胞的比例加入裂解液，同时加入蛋白酶抑制剂，用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白性质。此外，用常规方法对表达蛋白N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。如要大量生产cLATS1蛋白，可用Sf21细胞浓度为2×10⁵个/毫升的100-500毫升培养基，以20为M.O.I.混入重组病毒直至Sf21细胞终浓度为1×10⁶个/毫升。24-60小时后，收集细胞并超声破解。提取裂解液，分离cLATS1蛋白(可用针对cLATS1的特异性抗体沉淀该蛋白)。

实施例5

cLATS1在真核细胞(COS细胞)中的表达

用实施例3中所述的限制性内切酶酶切位点NotI和KpnI，将本发明的cLATS1cDNA序列亚克隆入真核细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen)。NotI和XhoI酶切位点对应于该表达载体的多克隆酶切位点中。将本发明的cLATS1cDNA片断连接入载体后，其转录方向与该表达载体的转录方向相同。pcDNA3质粒表达载体含有编码抗生素抗性的基因(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起始位点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个细菌复制起点(ColE1)、一个病毒启动子(P CMV)、一个SV40加尾信号和相应的polyA序列，一个BGH加尾信号和相应的polyA序列及一个限制性内切酶多克隆位点。

先用KpnI内切酶消化带有cLATS1片段的载体pBluescript SK，并将KpnI酶失活。再用利用T4 DNA多聚酶的3’到5’外切酶活性，切除KpnI酶切后引入的3’端突出片段，并失活T4 DNA多聚酶。同时用XhoI内切酶消化载体pcDNA3，并失活XhoI酶。再利用Klenow酶的5’到3’的聚合酶活性，将XhoI酶切后引入的5’端突出补平，并失活Klenow酶。然后用NotI内切酶分别消化两片段，分别回收pcDNA3和cLATS1的核酸片段。随后将cLATS1片断连接到pcDNA3载体中，并把连接产物转化大肠杆菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑选阳性转化子，并在补加Amp(100微克/毫升)的LB液体培养基中过夜培养转化子克隆。抽提质粒，NotI和XhoI酶切鉴定插入片断的大小，测序结果表明cLATS1的cDNA插入片断已正确插入载体。

采用脂质体Lipofectamine(GIBCOL)转染COS细胞株(按照GIBCOL公司提供的步骤)。转染48-72小时后，经15-20天的持续G418的加压筛选，收集单克隆细胞上清并测定cLATS1蛋白表达量和活性。然后去除G418，连续传代培养；将单克隆细胞混合并极限稀释，挑选具有较高蛋白活性的细胞单克隆。按照常规方法培养阳性单克隆。48-72小时后，收集细胞及上清，用超声破解细胞。以含有0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液和洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集cLATS1蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含有不同浓度NaCl(0-1M)和50mM Tris·HCl(pH8.0)的一系列洗脱液进行梯度洗脱，收集cLATS1蛋白活性峰。最后用PBS(pH7.4)透析cLATS1蛋白溶液，并冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白性质。此外，用常规方法对表达蛋白N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例6：

cLATS1的果蝇在体活性测定

1.高表达实验

在果蝇UAS/GAL4表达系统中，通过组织特异性的GAL4蛋白与UAS序列的结合，诱导UAS下游外源基因的组织特异性表达。

在该实施例中，利用实施例3中所述的带有cLATS1片段的pBluescript SK载体上的NotI和KpnI酶切位点，将本发明的cLATS1的cDNA序列亚克隆入表达载体pUAST。NotI和KpnI酶切位点对应于该表达载体的多克隆酶切位点中。将本发明的cLATS1的cDNA片断连接入载体后，其转录方向与该表达载体的转录方向相同。pUAST质粒表达载体由含有编码抗生素抗性的基因(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个含有5个GAL4蛋白结合位点的上游激活序列(UAS)、一个P转座因子的左端序列，一个P转座因子的右端序列、一个SV40加尾信号和相应的polyA序列，一个mini-w⁺基因，及一个限制性内切酶多克隆位点。

用NotI和KpnI内切酶消化载体pUAST载体，随后将插入片断连接到pUAST载体中，并将连接产物转化大肠杆菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑选阳性转化子，并在补加Amp(100微克/毫升)的LB液体培养基中过夜培养转化子克隆。抽提质粒，NotI和KpnI酶切鉴定插入片断的大小，测序结果表明cLATS1的cDNA插入片断已正确插入载体pUAST。

用一个仅编码转座酶的缺陷型P因子质粒(Δ2-3)，与携带cLATS1 cDNA的pUAST载体一起显微注射到w1118品系果蝇的卵生殖细胞内。通过P转座酶识别pUAST载体上的P因子末端的反向重复序列，将cLATS1 cDNA和mini-w⁺基因整合入果蝇基因组内。同时在子二代，由于mini-w⁺表达使果蝇的眼睛变为浅红或桔红色，所以挑选红眼果蝇建立UAS-cLATS1果蝇品系，并用果蝇平衡系平衡。然后与已构建好的不同GAL4果蝇品系交配，再下一代检测表型。

结果显示，cLATS1 cDNA的表达可调控果蝇的器官和个体大小(附图1)。在pGMR-GAL4果蝇品系中，pGMR启动子诱导GAL4在眼原肌的分化细胞内特异性地表达。UAS-cLATS1品系与该品系交配的得到子一代中，果蝇眼睛粗糙，变小。Ey启动子诱导GAL4在眼原肌的增殖细胞内特异性地表达。UAS-cLATS1品系与Ey-GAL4品系交配的子一代中，果蝇眼睛变小。Actin启动子可诱导GAL4的组成型表达，UAS-cLATS1品系与该Actin-GAL4品系交配的得到子一代个体变小，大约为野生型果蝇个体体积的2/3左右。

2.拯救实验

该实施例中，将本发明中的诱导cLATS1 cDNA在lats突变果蝇体内，检测cLATS1是否能抑制lats突变引起的发育早期致死。

将上述构建的pUAST-cLATS1载体上的NotI和XbaI酶切位点，将本发明的cLATS1的cDNA序列亚克隆入表达载体pCaspeR-hs。NotI和XbaI酶切位点对应于该表达载体的多克隆酶切位点中。将本发明的cLATS1的cDNA片断连接入载体后，其转录方向与该表达载体的转录方向相同。pCaspeR-hs质粒表达载体由含有编码抗生素抗性的基因(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个热激可诱导的启动子(hsp70)、一个P转座因子的左端序列，一个P转座因子的右端序列、一个mini-w⁺基因，及一个限制性内切酶多克隆位点。

用NotI和XbaI内切酶消化载体pCaspeR-hs载体，随后将插入片断连接到pCaspeR-hs载体中，并将连接产物转化大肠杆菌菌株JM109。在含有Amp的LB平板上挑选阳性转化子，并在补加Amp(100微克/毫升)的LB液体培养基中过夜培养转化子克隆。抽提质粒，NotI和XbaI酶切鉴定插入片断的大小，测序结果表明cLATS1的cDNA插入片断已正确插入载体pCaspeR-hs。按照上述构建UAS-cLATS1品系相同的方法，构建hs-cLATS1品系。挑选hs-cLATS1整合在果蝇II号染色体上的品系，与lats^e26-1突变果蝇系交配以获得基因型为：hs-cLATS1/+；las^e26-1/TM6B的果蝇品系(TM6B为果蝇III号平衡染色体)。然后收集该品系的卵，每天37℃诱导1小时直至果蝇羽化，检测是否有lats^e26-1纯合果蝇成虫存在。

结果表明，热激诱导cLATS1的表达可部分拯救lats^e26-1纯合突变引起的表型缺陷(附图2)。lats^e26-1纯合突变引起果蝇在发育的蛹期致死。被cLATS1拯救活的果蝇与野生型果蝇相比，个体偏大、翅膀变宽、交叉翅脉有部分或全部缺失，而且不育。

实施例7：

DNA芯片的底物

DNA芯片，又称微距阵(Microarray)。DNA芯片可通过使用喷墨技术及一系列化学方法如射线、化学、热力学、机械方法等把样品固定在底物上得到，形成的元件有点状、条形等等。一块典型的芯片通常含有一定数量的元件，可通过手工或用适当的仪器设备制备。杂交反应后，洗脱未结合的探针，然后用扫描仪来检测发生杂交反应的元件及反应程度。探针与每一芯片元件的互补性和结合量都可通过对扫描出的图象的分析来判断。

全长cDNA、EST、或基因片段都可以作为固定于底物上的样品。适合于杂交的片段可以用一些著名的生物软件，如DNASTAR来选择。这些全长cDNA、EST、与本发明的核酸序列相关的片段、或与这项发明有关的cDNA库中随机选出的片段被有序的排列于玻璃等载体上。cDNA固着于玻片的方法是：紫外线交联、热学、化学处理、干燥(Science(1995)270：467-470；Genome Res.(1996)6：639-645)等。将探针用荧光标记后，在与固着地反应元件杂交。杂交结果可用于推断基因功能，理解疾病产生的基因基础，诊断疾病，并可改进及监测药剂的活性。

本发明cLATS1核苷酸序列或其全长片段可用作微距阵的对象，监测出基因变异、突变及多态现象，从而对肿瘤、侏儒症、巨人症等疾病的诊断及治疗起辅助作用。

实施例8

多克隆抗体制备

将按实施例3和实施例4的获得的蛋白免疫动物以产生抗体。具体步骤如下，可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，再用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。再将200毫升乳化过的cLATS1蛋白(50-100微克)注射入小鼠腹腔内。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的相同剂量蛋白进行腹腔内注射以加强免疫。每隔14天后，再用相同剂量蛋白免疫，至少3次以上。收集到的血清多克隆抗体的活性，可通过其在体外沉淀cLATS1蛋白的能力来判断。该多克隆抗体可用来亲和纯化相关蛋白或筛选该家族的其它蛋白成员。

实施例9

试剂盒的制备

试剂盒1：

该试剂盒含有进行PCR扩增的特异性引物和使用说明。该试剂盒同时也可含有可将mRNA逆转录成cDNA的试剂和使用说明。特异性引物序列衍生自SEQ ID NO：1的序列，并可对含有cLATSlcDNA序列的核酸片断进行特异性扩增，以检测样品中是否含有cLATS1核酸序列。该试剂盒还可具备进行PCR扩增的其它试剂如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl溶液等。此外，较佳地，该特异性引物对跨越两个外显子，对含有cLATS1序列的基因组片断不进行特异性的扩增。

试剂盒2：

该试剂盒中含有可与天然cLATS1基因和mRNA结合的特异性探针分子(如生物素或同位素标记探针)。该试剂盒还可具有杂交尼龙膜、杂交缓冲液等附属制品。可用该试剂盒中探针分子与cLATS1编码片段的特异性反应来检测样本中是否存在cLATS1的核酸分子。也可用来检测基因变异、突变及多态现象，并找出一系列与cLATS1相关的基因，从而对疾病的治疗和诊断起辅助作用。

试剂盒3：

试剂盒含有针对cLATS1的特异性抗体和使用说明(如按实施例6制备的多克隆抗体或运用杂交瘤技术生产的单克隆抗体)。该试剂盒可直接检测样品中是否含有cLATS1蛋白。可先通过形成特异性的免疫复合物，然后直接检测免疫复合物的成分。

实施例10

制成药物

本发明的蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等都可作为药物，用于诊断和治疗肿瘤或侏儒症、巨人症等疾病，是对于调控经济动物或人体个体、器官大小的有重要价值的小分子药物。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行使用时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配置于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配置物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配置好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

此外，本发明核酸(编码序列或反义序列)可以直接引入细胞，以提高人的表达水平或者抑制的过度表达。本发明的蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

当本发明的蛋白多肽被用作药物时，治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

实施例11

转基因鸡的制备

由于lats家族成员参与器官和个体大小的调控，cLATS1也应该具备该相似的功能。对该本发明的cLATS1编码片段进行修饰后，可调节其蛋白活性。我们可根据实际需要，构建不同的cLATS1转基因鸡品系，以改良鸡这一重要的经济动物。

自八十年代初Palmiter首次获得转基因超级小鼠(Nature(1982)300(16)：611-615)以来，已有许多有关哺乳类乳腺特异表达成功的实例。然而在目前大部分转基因研究中，外源基因的导入仍以显微注射法为主。显微注射技术不仅成本高、难度大，而且效率较低。1989年，Lavitrano等首次利用小鼠附睾内的精子携带外源DNA转基因成功，并以30％的高整合率获得转基因小鼠(Cell(1989)57：717-723)。尽管有人对其转基因的可靠性提出质疑，但由于该技术简便易行且阳性率较高，所以一直为人们所关注。本实施例中即以他们的工作为基础，通过脂质体转染法，应用鸡精子作为转基因载体，携带含有外源融化基因(鸡cLATS1衍生物的组织特异性和组成型表达载体)进行鸡的体外受精和胚胎移植。具体步骤如下：

取出供精公鸡的附睾，剪开附睾管，用一根无菌玻璃针挑取一滴精液，放入预先平衡的CO₂培养箱中的、石蜡油覆盖的0.5ml培养液TYH中，待精子自行扩散后取出玻璃针。将液滴放入37℃、5％CO₂、湿度99％条件下的CO₂培养箱内培养1个小时。此间吸取少量悬液，用血球计数板进行计数确定精子的浓度。培养1小时后，直接将精子加入0.2ml石蜡油覆盖的受精微滴(TYH)中，受精精子浓度为1-2×10⁶/ml。取DOSPER脂质体(Boehringer Mannheim)与外源基因溶液轻轻混合，37℃静置20分钟，按一定比例加入受精微滴中，继续在CO₂培养箱内培养半小时。以性成熟的母鸡分别作为供、受体进行超排卵处理。取出供卵母鸡输卵管，将成熟卵子取出并与受精微滴混合，在37℃、5％CO₂中进行受精培养。胚胎发育到2-4细胞时进行输卵管移植；或发育至桑椹胚以后进行子宫移植。用PCR检测外源基因的整合。提取小鸡组织基因组DNA，于50μl反应体系中，按照93℃1分钟、60℃30秒、72℃延伸2分钟条件进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。同时将基因组DNA用BamHI酶切后，进行Southern杂交检测外源基因整合。

                           序列表<110>复旦大学<120>鸡cLATS1基因，核苷酸和蛋白序列及其应用方法<130>32<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4244<212>核苷酸<213>鸡<220><221>编码序列<222>(393)..(3803)<223><400>1gctggagcta atcccaccgc ggtggcggcc gctctagaac tagtggatcc cccgggctgc     60aggcgcggcg gagacaccga caaaatggcg gcgccgaact gaaagggccc tggcggcggc    120ggcgggccgt ggcggaggga gcgagcggcc gcggcgggca gcgcggaagg ccgcggcggt    180cgtcgctgcg cgggcggggc cggggcgctg ccgccgccgc cctctcgcct caggatatct    240gctttgcatt gtggcacacg tcagcactac aagaatcaca gtctagcagt gaagagtcac    300tgccttcacg tgttctgaaa ctaccagtca gccttcctgg agttttgcat tagcgcgagt    360ccttggtgga ggttgcatat atacatgttt tc atg aag aga agt gag aag cca      413

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    490                 495                 500gtg aaa agt atg cgt gtg tta aag cca gag ctg cag act gcc tta gca     1949Val Lys Ser Met Arg Val Leu Lys Pro Glu Leu Gln Thr Ala Leu Ala

505                 510                 515cca act cac cct tcc tgg atg cca caa cca gta caa acc att cag cct     1997Pro Thr His Pro Ser Trp Met Pro Gln Pro Val Gln Thr Ile Gln Pro520                 525                 530                 535att ccg ttc tcc gag ggt cca tct aca aac atg gct gtt atg cca cct     2045Ile Pro Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr Asn Met Ala Val Met Pro Pro

            540                 545                 550gtg gca gag gct ccg aat tac cag ggt cca ccc cca cct tac ccc aaa     2093Val Ala Glu Ala Pro Asn Tyr Gln Gly Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys

        555                 560                 565cac ttg tta cac cag agt ccg tct gtc cat cct tac gag act gga gcc     2141His Leu Leu His Gln Ser Pro Ser Val His Pro Tyr Glu Thr Gly Ala

    570                 575                 580aag ctt agc aaa gag gaa cca ccc att tca tct aag gag gaa gag aat     2189Lys Leu Ser Lys Glu Glu Pro Pro Ile Ser Ser Lys Glu Glu Glu Asn

585                 590                 595gaa aag aat tat gaa tgt gtt gat tca gca gac aaa gaa aag aaa caa     2237Glu Lys Asn Tyr Glu Cys Val Asp Ser Ala Asp Lys Glu Lys Lys Gln600                 605                 610                 615att aca aca tcg ccc gtt cct gtt aga aaa aac aag aaa gat gaa gaa     2285Ile Thr Thr Ser Pro Val Pro Val Arg Lys Asn Lys Lys Asp Glu Glu

            620                 625                 630cgg cgg gag tct cgt att caa agc tat tcc cct cag gct ttt aag ttc     2333Arg Arg Glu Ser Arg Ile Gln Ser Tyr Ser Pro Gln Ala Phe Lys Phe

        635                 640                 645ttc atg gag cag cat gtg gaa aat ata ctc aag tca cat cag caa cgt     2381Phe Met Glu Gln His Val Glu Asn Ile Leu Lys Ser His Gln Gln Arg

    650                 655                 660tta cat cgg aag aaa caa ctg gag aat gaa atg atg cgg gtt gga ttg     2429Leu His Arg Lys Lys Gln Leu Glu Asn Glu Met Met Arg Val Gly Leu

665                 670                 675tca cca gaa gcc cga gat caa atg agg aaa atg ttg tgc cag aag gag     2477Ser Pro Glu Ala Arg Asp Gln Met Arg Lys Met Leu Cys Gln Lys Glu680                 685                 690                 695tct aat tac att cgg cta aga aga gct aaa atg gac aag tcc atg ttt     2525Ser Asn Tyr Ile Arg Leu Arg Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe

            700                 705                 710gtg aaa att aaa acc ttg gga gtt ggc gca ttt gga gaa gtt tgc cta     2573Val Lys Ile Lys Thr Leu Gly Val Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu

        715                 720                 725gca aga aaa gtg gat act aag gct tta tat gca aca aaa aca ctg aga     2621Ala Arg Lys Val Asp Thr Lys Ala Leu Tyr Ala Thr Lys Thr Leu Arg

    730                 735                 740aaa aaa gat gtg ttg ctt aga aat caa gtt gct cat gtt aaa gct gag     2669Lys Lys Asp Val Leu Leu Arg Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu

745                 750                 755cgg gat atc ctt gca gaa gct gat aac gaa tgg gtg gtt cgt ctg tac     2717Arg Asp Ile Leu Ala Glu Ala Asp Asn Glu Trp Val Val Arg Leu Tyr760                 765                 770                 775tat tca ttc caa gat aag gac aat ttg tac ttt gta atg gac tac att     2765Tyr Ser Phe Gln Asp Lys Asp Asn Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile

            780                 785                 790cct gga ggt gat atg atg agt ctc cta att aga atg ggt gtc ttt cca     2813Pro Gly Gly Asp Met Met Ser Leu Leu Ile Arg Met Gly Val Phe Pro

        795                 800                 805gaa aat ctg gca cgg ttc tac aca gca gag ctg acc tgt gca gtt gaa     2861Glu Asn Leu Ala Arg Phe Tyr Thr Ala Glu Leu Thr Cys Ala Val Glu

    810                 815                 820agc gtt cat aaa atg ggc ttc atc cac aga gat att aaa cct gat aat     2909Ser Val His Lys Met Gly Phe Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn

825                 830                 835att ttg ata gac cgt gat ggt cat att aaa ttg act gac ttc gga ctc     2957Ile Leu Ile Asp Arg Asp Gly His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu840                 845                 850                 855tgt aca ggt ttt cga tgg acc cat gat tca aaa tac tac cag agt ggt     3005Cys Thr Gly Phe Arg Trp Thr His Asp Ser Lys Tyr Tyr Gln Ser Gly

            860                 865                 870gat cac gca cgt cag gac agc atg gat ttt agc aat gaa tgg ggt gac     3053Asp His Ala Arg Gln Asp Ser Met Asp Phe Ser Asn Glu Trp Gly Asp

        875                 880                 885cca gcg aat tgc aga tgt gga gat cgg ctg aag cca ctc gaa cgc agg     3101Pro Ala Asn Cys Arg Cys Gly Asp Arg Leu Lys Pro Leu Glu Arg Arg

    890                 895                 900gct gca cgt cag cac cag cgc tgt ctg gcc cat tcc ctt gtt ggc acg     3149Ala Ala Arg Gln His Gln Arg Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr

905                 910                 915cct aat tat att gca cca gaa gta ttg cta cga aca ggt tac aca cag     3197Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Gln920                 925                 930                 935ttg tgt gac tgg tgg agt gtc gga gta att ctc ttt gaa atg tta gtg     3245Leu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val

            940                 945                 950ggc cag cct cct ttc ctg gca caa aca cct ctg gaa aca cag atg aag     3293Gly Gln Pro Pro Phe Leu Ala Gln Thr Pro Leu Glu Thr Gln Met Lys

        955                 960                 965gtt atc aac tgg caa act tcg ctt cat att cca cct caa gct aag ctg     3341Val Ile Asn Trp Gln Thr Ser Leu His Ile Pro Pro Gln Ala Lys Leu

    970                 975                 980act ccg gag gcc tct gac ctt att att aaa cta tgc cga ggg cca gaa     3389Thr Pro Glu Ala Ser Asp Leu Ile Ile Lys Leu Cys Arg Gly Pro Glu

985                 990                 995gat cgt tta ggc aaa aat ggt gca gat gaa ata aaa gct cat cca         3434Asp Arg Leu Gly Lys Asn Gly Ala Asp Glu Ile Lys Ala His Pro1000                1005                1010ttt ttt aaa act ata gat ttt tca agc gat ctc cgg cgg cag tca         3479Phe Phe Lys Thr Ile Asp Phe Ser Ser Asp Leu Arg Arg Gln Ser1015                1020                1025gct ttc tac att ccc aaa atc gct cat cct aca gac acg tca aac         3524Ala Phe Tyr Ile Pro Lys Ile Ala His Pro Thr Asp Thr Ser Asn1030                1035                1040ttt gat cca gtt gat cca gat aaa ttg tgg agc gac gat gat aag         3569Phe Asp Pro Val Asp Pro Asp Lys Leu Trp Ser Asp Asp Asp Lys1045                1050                1055gaa gga aac gta aat gat aca ctt aac gga tgg tac aaa aat gga         3614Glu Gly Asn Val Asn Asp Thr Leu Asn Gly Trp Tyr Lys Asn Gly1060                1065                1070aaa cat cct gaa cat gcc ttt tat gag ttc aca ttc cga agg ttt         3659Lys His Pro Glu His Ala Phe Tyr Glu Phe Thr Phe Arg Arg Phe1075                1080                1085ttt gat gac aat ggc tac cca tac aac aat cca aag ccc att gag         3704Phe Asp Asp Asn Gly Tyr Pro Tyr Asn Asn Pro Lys Pro Ile Glu1090                1095                1100tat gag tat agc agt tcc cag aac tca gaa cag cag tct gat gat         3749Tyr Glu Tyr Ser Ser Ser Gln Asn Ser Glu Gln Gln Ser Asp Asp1105                1110                1115gat gaa gaa caa gca ggt aga ggg gtt caa aat cgt gac cta gtt         3794Asp Glu Glu Gln Ala Gly Arg Gly Val Gln Asn Arg Asp Leu Val1120                1125                1130tat gtt tag tagaggagta aacactaaat aaacagttta ttttgcagct            3843Tyr Val1135gacatttttt gaaaagtgtt ttctctgaac agaattgaga gaagattgcg agggtgaata  3903tatgcacgtt gtttattgtt attttaaaca ctaagttgtc ttcgctttcc atctctgtac  3963attttgtttc cccaaaatcc aggaaactcc ttttcaaaaa ttaatttatt ccaacatttt  4023taattgttta atttagaaga gattcgatgt taggtgaaaa aattatcact tgaattttct  4083cattgatctc tgtactttaa gtacttaaaa taggaaatag tgatttattt tttccaccct  4143gaaatgatgc ctgatatcta tttgtacata tactaaataa ttttaaaaaa aacaaacaaa  4203aaaaaaaaaa aaaaactcga gggggggccc gggaggggtt t                      4244<210>2<211>1136<212>蛋白质<213>鸡<400>2Met Lys Arg Ser Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Arg Gln Met Arg Pro Lys1               5                   10                  15Thr Phe Pro Ala Ser Asn Tyr Thr Gly Ser Ser Gln Gln Met Leu Gln

        20                  25                  30Glu Ile Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Pro Lys Pro Ser Asp Ala Ala

    35                  40                  45Lys Ala Asp Leu Ser Met Gly Lys Met Ser Ser Glu Asp Pro Arg Gln

50                  55                  60Gly Arg Asn Pro Pro Lys Phe Val Thr Tyr His Lys Val Leu Gln Glu65                  70                  75                  80Ile Arg Asn Ser Leu Leu Pro Phe Ala Asn Glu Ala Thr Ser Ala Val

            85                  90                  95Lys Gly Thr Ser Glu Val Asn Arg Gln Met Leu Gln Asp Leu Gln Ala

        100                 105                 110Ala Gly Phe Asp Glu Asp Met Val Ile Gln Ala Leu Arg Gln Thr Asn

    115                 120                 125Asn Arg Ser Ile Glu Ala Ala Ile Glu Phe Ile Ser Lys Met Ser Tyr

130                 135                 140Gln Asp Pro Arg Arg Glu Gln Met Val Ala Ala Ala Ala Arg Pro Val145                 150                 155                 160Asn Ala Gly Met Lys Pro Pro Gly Thr Val Gln Gln Ser Val Asn Arg

            165                 170                 175Lys Gln Ser Trp Lys Gly Ser Lys Glu Ser Leu Val Pro Gln Arg His

        180                 185                 190Gly Pro Ser Leu Ala Asp Gly Val Val Tyr Arg Ser Glu Ser Pro Ser

    195                 200                 205Ser Gln Pro Asp Val Gly Arg Pro Leu Ser Gly Ser Gly Ile Ala Ala

210                 215                 220Phe Ala Gln Ala His Pro Gly Asn Gly Gln Arg Val Asn Pro Pro Pro225                 230                 235                 240Leu Pro Gln Ile Arg Ser Val Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Gly

            245                 250                 255Gln Thr Pro Pro Pro Arg Gly Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Trp Glu

        260                 265                 270Pro Asn Gly Gln Thr Lys Arg Tyr Ser Gly Asn Met Glu Tyr Val Ile

    275                 280                 285Thr Arg Ile Ser Pro Val Pro Pro Gly Ala Trp Gln Asp Gly Tyr Pro

290                 295                 300Pro Pro Pro Met Asn Pro Pro Pro Met Asn Ser Ser Ser Gln Gly Gln305                 310                 315                 320Arg Gly Met Ser Ala Val Pro Ile Gly Arg Gln Pro Ile Ile Met Gln

            325                 330                 335Ser Ser Ala Asn Ser Lys Phe Ser Phe Pro Ser Gly Arg Ala Gly Met

        340                 345                 350Gln Asn Gly Asn Cys Gln Ala Glu Phe Ile Val His Gln Asn Val Val

    355                 360                 365Ser Gly Asn Ser Val Ser Arg Gln Pro Pro Pro Tyr Pro Met Asn Ser

370                 375                 380Ser Asn Arg Gln Ser Pro Thr Ala Leu Gln Met Gln Ala Gly Gly Ser385                 390                 395                 400Ala Pro Pro Ser Ala Tyr Thr Asn Gly Asn Leu Pro Pro Thr Met Leu

            405                 410                 415Val Pro Asn Arg Asn Ser His Asn Met Glu Leu Tyr Asn Thr Asn Val

        420                 425                 430Ala Gly Ile Pro Ala Ser Trp Ser Gln Pro Pro Pro Val Gln Pro Gln

    435                 440                 445Ser Ser Pro Gly Asn Gly His Glu Ile Pro Thr Trp Gln Pro Asn Leu

450                 455                 460Pro Ala Arg Ser Asn Ser Phe Asn Asn His His Gly Asn Arg Gln Ser465                 470                 475                 480His Thr Ser Ser Ser Gln Pro Ser Ala Thr Thr Val Thr Ala Ile Thr

            485                 490                 495Pro Ala Pro Ile Gln Gln Pro Val Lys Ser Met Arg Val Leu Lys Pro

        500                 505                 510Glu Leu Gln Thr Ala Leu Ala Pro Thr His Pro Ser Trp Met Pro Gln

    515                 520                 525Pro Val Gln Thr Ile Gln Pro Ile Pro Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr

530                 535                 540Asn Met Ala Val Met Pro Pro Val Ala Glu Ala Pro Asn Tyr Gln Gly545                 550                 555                 560Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu His Gln Ser Pro Ser Val

            565                 570                 575His Pro Tyr Glu Thr Gly Ala Lys Leu Ser Lys Glu Glu Pro Pro Ile

        580                 585                 590Ser Ser Lys Glu Glu Glu Asn Glu Lys Asn Tyr Glu Cys Val Asp Ser

    595                 600                 605Ala Asp Lys Glu Lys Lys Gln Ile Thr Thr Ser Pro Val Pro Val Arg

610                 615                 620Lys Asn Lys Lys Asp Glu Glu Arg Arg Glu Ser Arg Ile Gln Ser Tyr625                 630                 635                 640Ser Pro Gln Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln His Val Glu Asn Ile

            645                 650                 655Leu Lys Ser His Gln Gln Arg Leu His Arg Lys Lys Gln Leu Glu Asn

        660                 665                 670Glu Met Met Arg Val Gly Leu Ser Pro Glu Ala Arg Asp Gln Met Arg

    675                 680                 685Lys Met Leu Cys Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Ile Arg Leu Arg Arg Ala

690                 695                 700Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Gly Val Gly705                 710                 715                 720Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Arg Lys Val Asp Thr Lys Ala Leu

            725                 730                 735Tyr Ala Thr Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val Leu Leu Arg Asn Gln

        740                 745                 750Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu Ala Glu Ala Asp Asn

    755                 760                 765Glu Trp Val Val Arg Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln Asp Lys Asp Asn Leu

770                 775                 780Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp Met Met Ser Leu Leu785                 790                 795                 800Ile Arg Met Gly Val Phe Pro Glu Asn Leu Ala Arg Phe Tyr Thr Ala

            805                 810                 815Glu Leu Thr Cys Ala Val Glu Ser Val His Lys Met Gly Phe Ile His

        820                 825                 830Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp Arg Asp Gly His Ile

    835                 840                 845Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe Arg Trp Thr His Asp

850                 855                 860Ser Lys Tyr Tyr Gln Ser Gly Asp His Ala Arg Gln Asp Ser Met Asp865                 870                 875                 880Phe Ser Asn Glu Trp Gly Asp Pro Ala Asn Cys Arg Cys Gly Asp Arg

            885                 890                 895Leu Lys Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ala Arg Gln His Gln Arg Cys Leu

        900                 905                 910Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu

    915                 920                 925Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val

930                 935                 940Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro Phe Leu Ala Gln Thr945                 950                 955                 960Pro Leu Glu Thr Gln Met Lys Val Ile Asn Trp Gln Thr Ser Leu His

            965                 970                 975Ile Pro Pro Gln Ala Lys Leu Thr Pro Glu Ala Ser Asp Leu Ile Ile

        980                 985                 990Lys Leu Cys Arg Gly Pro Glu Asp Arg Leu Gly Lys Asn Gly Ala Asp

    995                 1000                1005Glu Ile Lys Ala His Pro Phe Phe Lys Thr Ile Asp Phe Ser Ser

1010                1015                1020Asp Leu Arg Arg Gln Ser Ala Phe Tyr Ile Pro Lys Ile Ala His

1025                1030                1035Pro Thr Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Pro Asp Lys Leu

1040                1045                1050Trp Ser Asp Asp Asp Lys Glu Gly Asn Val Asn Asp Thr Leu Asn

1055                1060                1065Gly Trp Tyr Lys Asn Gly Lys His Pro Glu His Ala Phe Tyr Glu

1070                1075                1080Phe Thr Phe Arg Arg Phe Phe Asp Asp Asn Gly Tyr Pro Tyr Asn

1085                1090                1095Asn Pro Lys Pro Ile Glu Tyr Glu Tyr Ser Ser Ser Gln Asn Ser

1100                1105                1110Glu Gln Gln Ser Asp Asp Asp Glu Glu Gln Ala Gly Arg Gly Val

1115                1120                1125Gln Asn Arg Asp Leu Val Tyr Val

1130                1135

          附表：同源序列比较

Claims (13)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有鸡cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所示的核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码-多肽，该多肽具有SEQID NO：2所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列。

4.一种分离的cLATS1蛋白多肽，其特征在于，该多肽具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

6.一种用权利要求5所述载体转化的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

9.一种产生具有cLATS1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将编码具有cLATS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成cLATS1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸393-3803位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成cLATS1蛋白的重组细胞；

(3)在合适表达cLATS1蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有cLATS1蛋白活性的多肽。

10.如权利要求10所述的方法，其方法在于，该方法可产生如序列SEQ ID NO：1中从393-3803位的核苷酸。

11.一种能与权利要求4所述的cLATS1蛋白多肽特征性结合的抗体。

12.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

13.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子。