CN1325960A - 人司登尼亚钙蛋白-α - Google Patents
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Abstract
本发明披露了人司登尼亚钙蛋白-α和编码此多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术生产此多肽的程序。本发明还披露了此多肽用于治疗导致肾、骨和心脏疾病的电解质紊乱、骨质疏松症和Paget氏病的方法。还披露了抗此多肽的拮抗剂及其对治疗血钙过少和骨质疏松症的用途。还公开了将司登尼亚钙蛋白-α序列用作检测与司登尼亚钙蛋白-α的突变体形式相关的疾病或疾病易感性的诊断剂的用途。
Description
本申请是申请日为1994年11月10日、申请号为94195213.4、发明名称为“人司登尼亚钙蛋白-α”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及新鉴定的多核苷酸、这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途、和这些多核苷酸和多肽的生产。更具体地说,本发明的多肽被推断鉴定为人司登尼亚钙蛋白-α。本发明还涉及此多肽活性的抑制。
司登尼亚钙蛋白(原称硬骨鱼钙蛋白和血钙蛋白)是一种由有骨鱼类内分泌腺司登尼亚小体产生的抗高血钙的糖蛋白激素。人也产生司登尼亚钙蛋白糖蛋白。
司登尼亚钙蛋白-α具有与甲状旁腺素(PTH)相似的生物学活性且这两种蛋白在哺乳动物中都显示双重功能。它们表现出可能因骨骼回吸作用引起的升高血钙的活性(Endocrinology 119:2249-2255(1986))并在鱼类中表现降低血钙的活性。降低血钙的活性可能是因鳃中钙流入的抑制而引起的(J.Exp.Biol.,140:199-208(1988))。另外,在骨骼的新陈代谢中PTH具有双相活性,即,在低剂量时它增强骨骼的形成,而在高剂量时它增强骨骼的回吸作用。相应地,此多肽本身和其拮抗剂,在不同的条件下,可以用于治疗骨质疏松。
人们对非人类的司登尼亚蛋白小体已有了深入的研究。最近,一个来源于Anguillaaustralis-的司登尼亚蛋白小体已经被纯化和克隆。已经发现硬骨鱼的肾脏中含有分泌颗粒-司登尼亚小体。电子显微镜指示此分泌颗粒有蛋白性质,可能是未知生理生化功能的激素或酶(Butlus,A.et al.Mo1.Cell Endocrinol,54:123-33(1987))。
从鳟鱼的司登尼亚小体也已经分离纯化出了一种糖蛋白,它被认作是血钙蛋白-鱼类主要的血钙激素。这种蛋白在鱼的几个种(特别是欧洲鳗鱼、tilapia金鱼和鲤鱼)的司登尼亚小体中含量相当大。与血钙浓度在实验条件下诱导增加相对应,血钙蛋白典型地从司登尼亚小体中释放出来。超微结构观察显示诱导血钙浓度增加后产生血钙蛋白的司登尼亚小体类型的细胞几乎完全解体。分离得到的糖蛋白表观分子量为54kDa(Lafeber F.P.et al.,Gen Comp.Endocrinolo,69:19-30(1988))。
另外,最近结果显示几个硬骨鱼钙蛋白的合成多肽片段抑制彩虹鳟幼鱼(Salmogairdneri)钙的吸收。鳗鱼和鲑鱼的硬骨鱼钙蛋白的N-端肽段(从氨基酸1到20)在钙吸收循环的高点上明显抑制45Ca的吸收(可达75%),虽然此肽段的摩尔有效剂量20至200倍于完整分子。与此相反,鳗鱼的硬骨鱼钙蛋白的C-端片段(从氨基酸202-231)对钙的吸收没有抑制作用(Milliken C.E.et al.,Gen.Comp.Endocrinol,77:416-22(1990))。
两个鲑鱼司登尼亚钙蛋白的纯化和特性以及用体外和活体模型系统检测相对于钙的激素分泌调节的方法也都有了描述。有关一个来自鲑鱼CSλgt10 cDNA文库的coho鲑鱼司登尼亚钙蛋白信使RNA(mRNA)的分子克隆和cDNA序列分析也有了描述。鲑鱼司登尼亚钙蛋白mRNA长度大约为2Kda,编码一个256个氨基酸的初级翻译产物。前33个残基组成了激素的前蛋白区,而剩下的223个残基构成了激素的成熟形式。(Wagner G.F.et al.,Mol.Cell Endocrinol,90:7-15(1992))。
本发明的多肽被推断鉴定为人司登尼亚钙蛋白-α。此鉴定结果是氨基酸序列同源性比较的结果。
根据本发明的一个方面,提供了一种新的推断的成熟多肽,即人司登尼亚钙蛋白-α,还提供了此多肽的有生物活性的和有助于诊断或治疗的片段、类似物和衍生物。
根据本发明的另一个方面,提供了编码人司登尼亚钙蛋白-α的分离核酸分子,包括mRNAs,DNAs,cDNAs,基因组DNA和其反义类似物及其有生物活性的和有助于诊断或治疗的片段、类似物和衍生物。
根据本发明的另外一个方面,提供了用重组技术生产此多肽的方法,包括在促进所说蛋白的表达和所说蛋白的表达后回收的条件下,培养含有人司登尼亚钙蛋白-α核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
根据本发明的另外一个方面,提供了利用此多肽或编码此多肽的多核苷酸达到治疗目的的方法,例如,治疗引起肾脏、骨骼和心脏疾病的电解质紊乱,和由于此多肽的双相活性而可用于治疗骨质疏松症,Paget氏病和骨质石化症。
根据本发明的另外一个方面,提供了抗此多肽的抗体。
根据本发明的另外一个方面,提供了此多肽的拮抗剂,可用于抑制此多肽的活性,例如,在治疗骨质疏松症和血钙过少症时。引起血钙过少症的原因很多,包括肾功能失调,甲状旁腺肥大,严重感染,胰液不足或烧伤,这些情况导致从胞间液捕获钙。血钙过少导致痉挛,惊厥和其它相关紊乱。
根据本发明的另外一个方面,提供了包括足够长的与人司登尼亚钙蛋白-α序列特异性杂交的核酸分子的核酸探针。
通过本文的讲授,本领域的熟练技术人员应该清楚本发明的这些和其它一些方面。
下列附图是本发明的实施方案的示意,但并不意味对权利要求所限制的本发明的范围的限制。
图1显示人司登尼亚钙蛋白-α蛋白的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。氨基酸用标准的3字母缩写表示。
图2是从Anguilla Australis得到的司登尼亚钙蛋白(下行)和人司登尼亚钙蛋白-α(上行)氨基酸的比较。在170个氨基酸的重叠中有35%的相同氨基酸残基,总体相似性为55%。
图3是人司登尼亚钙蛋白(上行)和人司登尼亚钙蛋白-α(下行)的氨基酸序列比较。
图4是描述细菌表达和纯化后的人司登尼亚钙蛋白-α的凝胶的照片。1道是标准分子量标记物,2道和3道都是人司登尼亚钙蛋白-α蛋白,但3道的蛋白浓度较高。
图5是显示杆状病毒表达人司登尼亚钙蛋白-α的结果的凝胶。
根据本发明的一个方面,提供了编码具有图1的推导的氨基酸序列的成熟多肽,或编码由1994年7月15日保藏的ATCC保藏号75831的克隆的cDNA编码的成熟多肽的分离的核酸(多核苷酸)。
本发明的多核苷酸是从肺成纤维细胞衍生的cDNA文库中发现的。它在结构上与人司登尼亚钙蛋自家族相关。它包含一个编码约251个氨基酸残基的开放阅读框架。其中前40个氨基酸残基是推断的前导序列,因此成熟蛋白包括211个氨基酸。此蛋白和人司登尼亚钙蛋白之间有高度同源性,在整个氨基酸序列中有28%相同且64%相似。
本发明中的多核苷酸可以是RNA形式,或DNA形式,其中的DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链的或单链的,如果是单链的则可以是编码链或非编码链(反义链)。编码此成熟多肽的密码序列可以和图1所示的密码序列相同,也可以和保藏克隆中的相同,或者可以是因为遗传密码的冗余性和简并性而形成的一个不同的密码序列,但此密码序列编码与图1的DNA和保藏的cDNA相同的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽或保藏cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括:只有成熟多肽的密码序列;成熟多肽的密码序列和诸如前导序列或分泌序列或蛋白原序列的附加密码序列;成熟多肽的密码序列(和任选的附加密码序列)和诸如内含子或成熟多肽的密码序列的5'和/或3'端非编码区的非编码序列。
因此,‘编码多肽的多核苷酸’这个术语限定为只包括此多肽密码序列的多核苷酸和包括附加密码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上面描述的多核苷酸的变异体,其编码具有图1推导的氨基酸序列的多肽或保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变体可以是此多核苷酸天然发生的等位变异体或此多核苷酸的非天然发生的变异体。
这样,本发明包括编码与图1所示同样的成熟多肽的多核苷酸,或与保藏克隆cDNA编码的多肽相同的成熟多肽的多核苷酸,还有这些多核苷酸的变异体,这些变异体编码图1所示的多肽或保藏克隆cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体,取代变异体和添加或插入变异体。
如上述所示,此多核苷酸可能是一个图1所示的密码序列或保藏克隆的密码序列的天然发生的等位变异体的密码序列。正如本领域所公知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还包括这样的多核苷酸,其中成熟多肽的密码序列可以在相同的阅读框架中融合到某个多核苷酸序列中以帮助多肽在宿主细胞中的表达和分泌,比如,作为分泌序列起控制多肽从细胞中运输出来的功能的一个前导序列。有前导序列的多肽是一个蛋白原,宿主细胞可以切掉其前导序列以形成此多肽的成熟形式。多核苷酸还可以编码一个由成熟蛋白和附加的5'氨基酸残基组成的蛋白原。有序列原的成熟蛋白是蛋白原,是此蛋白的无活性形式。一旦序列原被切除就形成了一个有活性的成熟蛋白。
这样,例如,本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白,或有序列原的蛋白,或同时具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸还可以具有与标记序列框内融合在一起的密码序列,以利于本发明的多肽的纯化。标记序列最好是由例如pQE-9或pQE-60载体提供的六组氨酸标记,以用于细菌宿主中与标记融合的成熟多肽的纯化,或者,例如,当用哺乳动物宿主(如COS-7细胞)时,标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。HA标记与流感血细胞凝集素蛋白衍生而来的抗原决定簇相对应(Wilson,I.,et al.,Cell,37:767(1984))。
本发明还涉及这样的多核苷酸,即当与上面描述的序列有最少50%和最好70%相同的序列时可与之杂交。特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。正如此处用到的一样,‘严格条件’这个术语是指只有当序列之间有至少95%和最好至少97%相同时才能杂交。在一优选的实施方案中,与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码与图1的cDNA或保藏cDNA编码的成熟多肽的生物功能和活性实质上相同的多肽。
本文提及的保藏物按照国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约而保持。这些保藏物只是为了本领域熟练技术人员方便才提供,不是对根据35U.S.C.§112对保藏物的索取的认可。保藏物中的多核苷酸序列,还有由此编码的多肽氨基酸序列在本文作为参考,在与本文的序列描述有冲突的情况下,它们是决定性的。制造、使用或销售这些保藏物需要许可证。这样的许可证本文不授予。
本发明还涉及这样的司登尼亚钙蛋白-α多肽,即有着图1的推导的氨基酸序列或有保藏cDNA编码的氨基酸序列,和这种多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1的多肽或由保藏cDNA编码的多肽时,术语‘片段’、‘衍生物’和‘类似物’的意思是指保留与此多肽相同的生物学功能或活性的多肽。这样,类似物就包括切除蛋白原部分能被激活产生活性成熟多肽的蛋白原。
本发明中的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽,优选是重组多肽。
图1的多肽或保藏cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(ⅰ)由一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选是保守性氨基酸残基)取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中包括一个取代基团的多肽,或(ⅲ)此成熟多肽与另一个化合物融合的多肽,比如延长此多肽半寿期的化合物(例如,聚乙烯乙二醇),或(ⅳ)有附加氨基酸与此多肽融合的多肽,比如前导序列或分泌序列或用于纯化此多肽的序列或蛋白原序列。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,优选达到了纯化均一性。术语“分离的”是指材料从其原始环境(如,如果是天然发生则是其天然环境)中被移走。例如,在一个活的动物体内存在的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的,而从天然系统中的一部分或所有共存材料中分离出来的同样的多核苷酸或多肽就是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是某组合物的一部分,只要这些载体或组合物不是其天然环境的一部分,则其仍是分离的。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体,用本发明的载体制造的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产的本发明的多肽的产品。
宿主细胞是用本发明的载体(例如克隆载体或表达载体)进行遗传操作(转导或转化或转染)的。载体可以是,例如,质粒、病毒颗粒、噬菌体等等的形式。工程化宿主细胞可以在被修饰成适合激活启动子、选择转化体或扩增司登尼亚钙蛋白-α基因的传统营养培养基上培养。培养条件,如温度、pH值等与以前用在表达用宿主细胞的条件相同,这些条件对一般熟练技术人员是公知的。
本发明中的多核苷酸可以被用来通过重组技术生产多肽。这样,比如,此多核苷酸序列可以包含在用于表达多肽的众多表达载体中的任一种中。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列,比如,SV40的衍生物;细菌质粒;噬菌体DNA;杆状病毒;酵母质粒;质粒和噬菌体DNA组合衍生而来的载体;病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。总之,只要能在宿主体内复制存活,任何质粒和载体都可以用。
适当的DNA序列可以通过各种各样的步骤插入载体。一般来说,DNA序列通过本领域公知的程序插入合适的限制性内切酶位点内。这些和其它步骤对本领域熟练技术人员是公知的。
表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接在一起以指导mRNA合成。这些启动子的一些有代表性的例子有:LTR或SV40启动子,大肠杆菌的lac或trp启动子,λ噬菌体PL启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中的表达的启动子。表达载体还含有翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以含有扩增表达用的适当序列。
此外,表达载体最好含有提供筛选转化的宿主细胞的表型性状的基因,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性,或大肠杆菌用的四环素或氨苄青霉素抗性。
含有上述适当DNA序列和适当启动子或调控序列的载体可以用来转化适当宿主以使宿主表达此蛋白。
适当宿主的一些有代表性的例子有:诸如大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;诸如酵母的真菌细胞;诸如果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;诸如CHO,COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞;腺病毒;植物细胞等。通过本文的讲授,适当宿主细胞的选择是本领域熟练技术人员所公知的。
更具体地说,本发明还包括上面广泛描述的一个或多个序列的重组构建体。这些构建体包括其中本发明中的序列以正向或反向插入的载体,如质粒或病毒载体。在本实施方案的一个优选方面中,此构建体还包括与序列可操作连接的调控序列,包括,比如,启动子。大量的适当载体和启动子都是本领域熟练技术人员所公知的,而且都是可以买到的。下述载体作为例子提供参考。细菌载体:pQE70,pQE60,pQE-9(Qiagen),pBS,pD10,phagescript,psiX174,pbluescript SK,pBSKS,pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A(Stratagene);ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(Pharmacia)。真核载体:pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG(Stratagene);pSVK3,pBPV,pMSG,pSVL(Pharmacia)。总之,只要能在宿主体内复制存活,任何质粒和载体都可以用。
启动子区可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或有选择性标记的其它载体从任何目标基因中选择。两个合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacⅠ,lacZ,T3,T7,gpt,λPR,PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期,HSV胸苷激酶,早期和晚期SV40,反转录病毒的LTRs和鼠金属硫蛋白-Ⅰ。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和启动子。
在一个进一步的实施方案中,本发明还涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞,如哺乳动物细胞,或是低等真核细胞,如酵母细胞,或是原核细胞,如细菌细胞。将构建体导入宿主细胞可以通过磷酸钙转染法,DEAE-葡聚糖介导的转染法,或电穿孔法(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in MolecularBiology,(1986))。
宿主细胞内的构建体可以用传统的方式生产重组序列编码的基因产物。本发明中的多肽也可以用传统的肽合成仪来合成生产。
在适当启动子的控制下,成熟蛋白可以在哺乳动物细胞,酵母细胞,细菌细胞或其它细胞中表达。用本发明的DNA构建体衍生的RNA通过无细胞翻译系统也可以用来生产此蛋白。原核和真核宿主用的适当的克隆和表达载体在Sambrook,et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition,(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)中有描述,此处作为参考文献列出。
编码本发明的多肽的DNA在高等真核细胞中的转录在载体插入一个增强子序列时得到提高。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子增强基因的转录。例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子,细胞肥大病毒早期启动子增强子,在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子,和腺病毒增强子。
一般来说,重组表达载体包括复制起始点和允许宿主细胞转化的选择性标记,如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和S.cerevisiae TRP1基因,和高表达基因来源的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以由编码诸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的糖酵解酶,α-因子,酸性磷酸化酶,热休克蛋白或其它蛋白的操纵子衍生而来。外源结构序列在适当相与翻译起始和终止序列,和能指导翻译的蛋白分泌到周质空间或细胞外培养基的前导序列装配在一起。外源序列可编码包括一个赋予其期望特性的N-端鉴定多肽的融合蛋白,所述特性如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。
细菌细胞用的有用的表达载体通过将编码目标蛋白的结构DNA序列和合适的翻译起始和终止信号插入可操作的阅读框架中,再插入一个功能启动子构建而成。载体将包括一个或多个表型选择性标记和确保载体持续存在的(如果需要,提供载体在宿主体内扩增的)复制起始点。转化用的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各个种,虽然其它的菌也可以用来作宿主。
作为一个有代表性的但非限制性的例子,细菌用的有用的表达载体可以包括一个选择性标记和从市售的包括克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的质粒衍生而来的细菌复制起始点。这些商购载体包括,例如,pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动子和待表达结构序列整合在一起。
当合适的宿主转化并生长到适当的细胞密度后,选用的启动子即可用适当的方法(如温度转换或化学诱导)诱导,细胞再培养一段时间。
细胞经离心后收获,用物理或化学的方法破碎细胞,得到的粗提物留作进一步纯化用。
表达蛋白用的微生物细胞可以用任何传统的方法进行破碎,包括冻融法、超声波法、机械破碎法、或使用细胞裂解试剂,这些方法对本领域熟练技术人员是公知的。
各种各样的哺乳动物细胞培养系统也可以用来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman,Cell,23:175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系,例如,C127,3T3,CHO,HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括一个复制起始点,一个合适的启动子和增强子,和任何必需的核糖体结合位点,多腺苷酸位点,剪接供体和受体位点,转录终止序列,和5'端非转录序列。SV40剪接而来的DNA序列和多腺苷酸位点可以用来提供所需的非转录遗传元件。
用硫酸铵或乙醇沉淀,酸抽提,阴离子或阳离子交换层析,磷酸纤维素层析,疏水相互作用层析,亲和层析,羟基磷灰石层析或植物凝集素层析等方法可将人司登尼亚钙蛋白-α从重组细胞培养物中回收并纯化出来。如果需要,可以使用蛋白质再折叠步骤以完成成熟蛋白的构象。最后,可以使用高效液相层析(HPLC)来完成最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成方案的产物,或是用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌,酵母,高等植物,昆虫和哺乳动物细胞)中生产。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括一个起始的甲硫氨酸氨基酸残基。
人司登尼亚钙蛋白-α可以用于大量电解质类疾病的治疗。动脉血压过高的一个原因是由于Na-K泵缺乏或抑制造成的不正常的Na+穿过血管平滑细胞细胞壁的运输,另外一个原因是如同已经在人的几种形式的高血压中描述的那样的Na+通透性提高。总的结果是细胞内Na+提高,使细胞对血管收缩因子更加敏感。因为Ca++跟随着Na+,推测正是由于细胞内Ca++的积累而非Na+的积累引起交感神经刺激敏感性增加。相应地,因为人司登尼亚钙蛋白-α可以发挥降血钙因子的功能,所以它可以帮助降低这种增加的细胞内Ca++,降低或防止高血压。
另外,高血钙还与心率不齐,昏迷和心跳骤停有关。因此,人司登尼亚钙蛋白-α可以通过降低自由Ca++的浓度来发挥其对这类紊乱的治疗价值。
高血压还直接与肾脏紊乱有关。相应地,过高或过低的电解质浓度可以引起肾脏功能失调,并直接导致其它的紊乱。例如,钙-磷失衡可以引起肌肉和骨骼疼痛,骨骼脱矿化作用和包括大脑、眼睛、心肌和血管的各种器官的钙化。因此,本发明的多肽可以用来缓解由于钙-磷失衡引起的紊乱。肾脏功能失调本身导致血液中不正常的高浓度磷酸盐,用人司登尼亚钙蛋白-α可以将其降至正常浓度。
人司登尼亚钙蛋白-α对某些骨骼疾病的治疗也是很有用的。其中,它在骨骼的新陈代谢中可能具有双相活性,即,在低剂量时它增强骨骼的形成,而在高剂量时它增强骨骼的回吸作用。因此,低剂量的人司登尼亚钙蛋白-α可以用于治疗骨质疏松,高剂量可以用于治疗骨骼石化,骨骼石化是由于骨骼的过度生长和硬化引起的,标志是骨皮质的显著加厚和骨髓腔的窄化和填充。
高血钙的起因可能也是大量不同的紊乱包括甲状旁腺肥厚症,维生素D过多症,通过破坏骨骼升高血清钙浓度的肿瘤,肉样瘤病,甲状腺肿大,肾上腺机能不全,血清白蛋白下降,次生肾脏疾病,过量的胃肠钙吸收和血浆蛋白浓度提高。相应地,人司登尼亚钙蛋白-α在降低高血钙和其相关紊乱方面是有效的。
人司登尼亚钙蛋白-α对与不正常电解质浓度和体液失衡有关的其它紊乱的治疗也是有用的,如migraine头痛。
全长的人司登尼亚钙蛋白-α基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针以分离全长的基因和分离其它的与此基因有高度序列相似性或相似的生物学活性的基因。这种探针可以是,例如,在20和2000个碱基之间。但是探针优选具有30到50个碱基对。此探针还可以用于鉴定与全长转录本相对应的cDNA克隆和含有包括调控和启动子区域,外显子和内含子的完整人司登尼亚钙蛋白-α基因的基因组克隆。筛选的一个例子包括通过使用已知的DNA序列合成一个寡聚核苷酸探针分离基因的编码区。具有与本发明基因互补的序列的标记寡聚核苷酸用于筛选人cDNA,基因组DNA或mRNA文库以测定探针杂交到文库的哪个成员上。
本发明提供了一种鉴定人司登尼亚钙蛋白-α受体的方法。可以通过本领域熟练技术人员所公知的大量方法鉴定编码此受体的基因,例如,配体淘选法和FACS分类法(Coligan,et al.,Current Protocols in Immun.,1(2),Chapter 5,(1991))。优选是,使用表达克隆法,其中多腺苷酸RNA是从对人司登尼亚钙蛋白-α敏感的细胞中制备,将从此RNA产生的cDNA文库分成多个集合体并用于转染对人司登尼亚钙蛋白-α蛋白不敏感的COS细胞或其它细胞。在玻片上生长的转染细胞用标记的人司登尼亚钙蛋白-α处理。可以通过碘化作用或引入位点特异性蛋白激酶的识别位点等不同方法标记司登尼亚钙蛋白-α。固定和温育后,将玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性克隆集合体,制备亚集合体并用迭代亚集合和再筛选程序重新转染,最后得到一个编码推断受体的单克隆。
作为受体鉴定的替代方法,标记的人司登尼亚钙蛋白-α可以与细胞膜或是表达受体分子的抽提制备物光亲合连接。交联材料通过PAGE来分辨并置于X-光胶片上使胶片曝光。可以切下含有配体-受体复合物的标记复合物,分离成多肽片段,并进行蛋白质微量序列测定。从微量序列测定获得的氨基酸序列用来设计一套简并的寡聚核苷酸探针来筛选cDNA文库以鉴定编码推断受体的基因。
本发明还提供了筛选化合物以鉴定人司登尼亚钙蛋白-α的刺激剂和拮抗剂的方法。作为一个例子,可以进行生物分析测定,其中分析成分包括在细胞膜表面表达人司登尼亚钙蛋白-α受体的哺乳动物细胞或膜制备物,标记的钙,例如45Ca++,和待筛选的化合物。如果化合物是一个有效的人司登尼亚钙蛋白-α刺激剂,它将模仿人司登尼亚钙蛋白-α受体配体,以使在无人司登尼亚钙蛋白-α时细胞或膜有45Ca++吸收。通过利用放射性标记可以测定45Ca++吸收的量。当筛选拮抗剂时,将人司登尼亚钙蛋白-α加入生物分析测定中,以同样的方式可以测定化合物通过干扰人司登尼亚钙蛋白-α和其受体之间的相互作用而抑制45Ca++吸收的能力。
或者,可以在此化合物存在和不存在时测定并比较人司登尼亚钙蛋白-α和其受体之间相互作用后一个已知的第二信使系统的反应。此第二信使系统包括但不限于,cAMP鸟甘酸环化酶,离子通道或磷酸肌醇水解。
潜在的人司登尼亚钙蛋白-α拮抗剂包括抗体或在有些情况下包括寡聚核苷酸,它们与人司登尼亚钙蛋白-α结合并消除其功能。拮抗剂还包括与人司登尼亚钙蛋白-α受体结合并有效地将人司登尼亚钙蛋白-α封闭在受体之外的多肽。这些多肽是与人司登尼亚钙蛋白-α紧密相关的但丧失了天然生物学功能的蛋白,一个例子是人司登尼亚钙蛋白-α的突变形式。
人司登尼亚钙蛋白-α拮抗剂还包括反义构建体。反义技术可以通过三螺旋形成或反义DNA或RNA用来控制基因表达,两种方法都是基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如,编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码区用来设计长度为从10到40个碱基对的反义RNA寡聚核苷酸。设计一个DNA寡聚核苷酸与基因的转录区域互补(三螺旋-参考Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooney et al,Science,241:456(1988);和Dervan et al.,Science,251:1360(1991)),从而防止转录和人司登尼亚钙蛋白-α的产生。反义RNA寡聚核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子翻译成人司登尼亚钙蛋白-α多肽(反义-Okano,J.Neurochem.,56:560(1991),Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988))。上面描述的寡聚核苷酸也可以送递到细胞内以使反义RNA或DNA在体内表达,从而抑制人司登尼亚钙蛋白-α蛋白的产生。
人司登尼亚钙蛋白-α拮抗剂还包括与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或类肽的分子。
拮抗剂可以用于阻断高浓度的人司登尼亚钙蛋白-α引起的骨骼回吸作用的激活,并相应地可以用于治疗骨质疏松症。
人司登尼亚钙蛋白-α拮抗剂还可以用于治疗需要提高钙水平的血钙过少症和Paget氏病等紊乱。此拮抗剂可以在一个含有药物可接受载剂的组合物中使用,例如,按照下面的描述。
本发明的人司登尼亚钙蛋白-α多肽和刺激剂和拮抗剂化合物可以与适当的药物载体组合后使用。这样的组合物包括药物有效量的本发明多肽,和药物可接受的载体和赋形剂。这样的载体包括但不限于盐类,缓冲盐类,葡萄糖,水,甘油,乙醇,和它们的组合。配方应当适合给药方式。
本发明还提供了药物包或药盒,包括装有一种或多种本发明的药物组合物成分的一个或多个容器。随这些容器还附有一份控制药品与生物制品的制造,使用或销售的政府机构规定的公告,此公告反映制造,使用或销售机构同意此药物用于人类使用。另外,此药物组合物可以与其它药物化合物联合使用。
此药物组合物可以以诸如口服,局部,静脉内,腹膜内,肌肉内,皮下,鼻内,或皮内途径的传统方式给药。此药物组合物以对特定适应症的治疗和/或预防有效的剂量使用。一般来说,此药物组合物的使用剂量为最低大约每天每千克体重10微克,大多数情况下使用剂量不超过每天每千克体重约8毫克,在大多数情况下,考虑到给药途径、症状等,剂量为每天每千克体重约10微克至1毫克。
根据本发明,人司登尼亚钙蛋白-α多肽,和也是多肽的刺激剂和拮抗剂可以经体内表达而应用,即经常被称为“基因治疗”。
如此,例如,在体外用编码此多肽的多核苷酸(DNA或RNA)可以将病人的细胞进行工程化,然后将工程化的细胞提供给需用此多肽治疗的病人。这些方法是本领域所熟知的。例如,通过使用含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒用本领域公知的程序将细胞进行工程化。
同样地,可以用,例如,本领域公知的程序,将细胞在体内进行工程化,以使多肽在体内表达。正如本领域公知的那样,将生产含有编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞给予患者,以使细胞在体内工程化并在体内表达此多肽。通过本发明的讲授,这些和其它一些有关本发明的多肽的给药方法对本领域熟练技术人员来说应该是清楚的。例如,工程化细胞的表达载体可以不仅仅是反转录病毒,例如,可以是结合一种适当送递载体后用于将细胞在体内工程化的腺病毒。
本发明还涉及司登尼亚钙蛋白-α基因作为检测与突变的人司登尼亚钙蛋白-α的存在相关的疾病或疾病的易感性的诊断测试的一部分。这类疾病涉及人司登尼亚钙蛋白-α的低水平表达,例如,高血压。
可以通过各种各样的技术在DNA水平上检测在人司登尼亚钙蛋白-α基因内携带突变的个体。用于诊断的核酸可以从患者的诸如血液,尿液,唾液,组织活体解剖和尸检材料的细胞中获得。基因组DNA可以直接用于检测或在分析之前通过PCR(Saili etal.,Nature,324:163-166(1986))酶法扩增。RNA和cDNA也可以用于同样目的。作为一个例子,与编码人司登尼亚钙蛋白-α的核酸互补的PCR引物可以用于鉴定和分析人司登尼亚钙蛋白-α突变。例如,可以通过与正常基因型相比扩增产物大小的变化来检测缺失和插入。可以通过将扩增DNA与放射性标记的人司登尼亚钙蛋白-αRNA或与放射性标记的人司登尼亚钙蛋白-α反义RNA序列杂交来鉴定点突变。通过RNaseA消化或通过解链温度的不同可以将配对正确的序列从错配双螺旋中区分出来。
基于DNA序列差异的遗传测试可以通过检测在有或没有变性试剂时凝胶中DNA片段电泳迁移率的改变来完成。通过高分辨率凝胶电泳可以看见小的序列缺失和插入。在变性甲酰胺梯度凝胶上可以区分不同序列的DNA片段,其中根据其特定解链温度或部分解链温度,不同DNA片段的迁移被阻滞在凝胶的不同位置(参考,例如,Myerset al.,Science,230:1242(1985))。
这样,通过诸如杂交,RNase保护,化学裂解,直接DNA测序或使用限制酶(例如,限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern杂交的方法来完成某特定DNA序列的检测。
除了更常规的凝胶电泳和DNA测序外,还可以通过原位分析来检测突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。此序列特别指向并能与某单个人类染色体的特定位点杂交。更进一步地,目前需要鉴定染色体上的特定位点。目前仅有很少几个在实际序列数据(重复多态性)基础上的染色体标记试剂可用于标记染色体位点。根据本发明,将DNA定位到染色体在联系序列与疾病相关基因方面是重要的第一步。
简单地说,通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)可以将序列定位到染色体上。序列的3’不翻译区的计算机分析用于快速选择在基因组DNA中不跨越超过一个外显子的引物,否则将会使扩增过程复杂化。然后这些引物被用于PCR法筛选含有单个人类染色体的体细胞杂交体。只有含与引物相对应的人类基因的杂交体才能产生扩增片段。
体细胞杂交体的PCR定位是将某特定DNA定位于某特定染色体的一个快速方法。用与本发明相同的寡聚核苷酸引物,和特定染色体来源的片段或大的基因组克隆集合体,可以以类似的方式完成亚定位。其它类似的可用于定位到染色体的作图策略包括原位杂交,用标记的流选的染色体预筛选和通过与结构染色体特定cDNA文库杂交进行预筛选。
将某cDNA克隆荧光原位杂交(FISH)到某中期染色体带上可以用来提供精确的一步法染色体定位。此技术可使用短到500或600个碱基的cDNA;但是,大于2,000个碱基对的克隆更有可能以适于简单识别的足够的信号强度结合到一个单一的染色体位点上。FISH需要使用可以产生表达序列标记(EST)的克隆,而且越长越好。例如,2,000碱基对是好的,4,000碱基对更好,从时间的合理百分比的角度来说,超过4,000个碱基对对得到好的结果可能是不必要的。有关此技术的综述,参阅Verme et al.,HumanChromosomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦某序列被精确定位到染色体上,此序列在染色体上的物理位置可以与遗传图谱数据相吻合。举例来说,这些数据在V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man(通过Johns Hopkins University Welch Medical Library可以找到)被发现。然后,已经被定位到相同染色体区域的基因与疾病之间的相互关系通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)进行鉴定。
下一步,有必要分析感染的和未感染的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果观察到在一部分或全体感染个体中有突变,而在正常个体中没有,那么此突变可能就是病因。
以目前的物理图谱和遗传图谱技术的分辨率,精确定位到与疾病相关的某染色体区域的cDNA可能是50-500个潜在病原基因中的一个。(假设图谱分辨率为1百万个碱基,每2万个碱基为一个基因)。
本发明的多肽,它们的片段或其它衍生物,或类似物,或表达它们的细胞可以用来作为抗原以产生抗体。这些抗体可以是,例如,多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合,单链和人源化抗体,还有Fab片段,或Fab表达文库的产物。本领域所公知的各种各样的方案都可以用来生产这样的抗体和片段。
抗与本发明的序列相对应的多肽的抗体可以通过将此多肽直接注射动物或以此多肽给予动物(最好是非人类)的方法得到。这样获得的抗体即可与此多肽结合。以这种方式,甚至只编码此多肽的一个片段的序列也可以用来产生结合整个天然多肽的抗体。这样的抗体可以用来从表达多肽的组织中分离此多肽。
为了制备单克隆抗体,可以使用任何的通过连续细胞系培养提供抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler and Milstein,1975,Nature,256:497),三瘤技术,人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.,1983,Immunology Today,4:72),和生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole,et al.,1985,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。
可以采用描述单链抗体生产的技术(U.S.Patent 4,946,778)来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。转基因小鼠也可以用于表达本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
本发明将以下面的实施例为参考进一步描述;但应理解本发明不限于这些实施例。除非有具体说明,所有的份和量均指重量。
为了理解下面实施例的方便,下面将描述某些常用的方法和/或术语。
“质粒”由置于前面的小写字母p和/或其后的大写字母和/或数字表示。本文的起始质粒或是可以买到的,或是无限制基础上公用的,或是可以根据发表的方案从已有质粒构建。另外,与描述的那些质粒等效的质粒是本领域公知的,对一般熟练技术人员来说是清楚的。
DNA的“消化”是指用对DNA的特定序列起作用的限制酶对DNA的酶促剪切。本文用到的各种各样的限制酶都是可以买到的,其反应条件,辅助因子和其它需要的条件对一般熟练技术人员来说是公知的。为了催化反应的完成,应在约20μl的缓冲液中含1μg质粒或DNA片段和约2个单位的酶。为了分离所需的DNA片段用于质粒构建,应在更大的反应体积中用20-250单位的酶将5-50μgDNA片段消化。特定限制酶所用的适当的缓冲液和底物由制造商详细说明。一般酶切反应在37℃温育约1小时,但也有可能依供应商的说明而有所改变。消化结束后,反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
酶切片段的大小分离用Goeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)描述的8%的聚丙烯酰胺凝胶完成。
“寡核苷酸”是指可以化学合成的单链脱氧多核苷酸或两个互补的脱氧多核苷酸链。这样合成的寡核苷酸没有5’磷酸基团,如果不在激酶存在的情况下用ATP加上一个磷酸基团,将不能与另一个寡聚核苷酸连接。合成的寡聚核苷酸将连接到没有去磷酸化的片段上。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis,T.,et al.,Id.,p.146)。除非用别的连接酶,每0.5μg等摩尔数的待连接DNA片段加10单位的T4DNA连接酶(“连接酶”),用已知的缓冲液和反应条件即可完成连接反应。
除非另有声明,转化是按Graham,F.and Van der Eb,A.,Virology,52:456-457(1973)描述的方法进行。
实施例1人司登尼亚蛋白-α的细菌表达和纯化
编码人司登尼亚蛋白-α(ATCC#75652)的DNA序列首先用与司登尼亚蛋白-α密码序列的5’和3’端序列对应的PCR寡核苷酸引物扩增。5’寡核苷酸引物的序列为5’-GACTACATGTGTGCCGAGCGGCTGGG-3’,其中含有一个AflⅢ限制酶位点和开始于甲硫氨酸起始密码子的20个核苷酸的司登尼亚蛋白-α的密码序列;3’端引物序列3’-GACTAGATCTCTCCTGGGCTCTGGGAGGTG-5’含有BglⅡ位点的互补序列,后接司登尼亚蛋白-α的20个核苷酸。pQE-60载体(Qiagen,Inc.9259EtonAve.,Chatsworth,CA91311)编码抗生素抗性(Ampr),一个细菌性复制起始点(ori),一个IPTG可调节启动子操纵子(P/O),一个核糖体结合位点(RBS),一个6-His标记和限制酶位点。pQE-60用AflⅢ和BglⅡ消化。用AflⅢ和BglⅡ消化后扩增序列连接到pQE-60中且插入带编码组氨酸标记和序列RBS的框架中。然后,用连接混合物转化E.coli菌株M15/rep4,商标为M15/rep4的菌株可以从Qiagen公司得到,连接程序按照Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,(1989)的描述进行。M15/rep4含有质粒pREP4的多个拷贝,pREP4表达lacⅠ阻遏物和带有卡那霉素抗性(Kanr)。通过其在LB板上的生长能力来鉴定转化体,选择有氨苄青霉素/卡那霉素抗性的菌落。分离质粒DNA,并用限制酶分析予以确认。含有所需构建体的克隆在加有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜(O/N)。过夜培养物以1∶100到1∶250的稀释倍数用于大规模培养。细胞生长到光密度600(O.D.600)为0.4到0.6之间。然后,加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM。IPTG通过使lacⅠ阻遏物失活,清除P/O,增加基因表达来诱导。细胞继续生长3到4小时。然后离心(6000×g,20分钟)收获细胞。细胞沉淀物溶于6克分子的盐酸胍离液试剂中。澄清后,在能够使含6-His标记的蛋白与柱结合紧密的条件下,从此溶液中用镍螯合柱层析纯化溶解的司登尼亚钙蛋白-α(Hochuli,E.et al.,Genetic Engineering,Principles & Methods,12:87-98(1990)。从盐酸胍(GnHCl)中复性蛋白可以通过几种方法完成(Jaenicke,R.and Rudolph,R.,Protein Structure-A PracticalApproach,IRL Press,New York(1990)。首先,用透析步骤清除GnHCl,或者是,从镍螯合柱上分离出来的纯化蛋白可以结合到GnHCl以线性梯度下降的第二根层析柱上。当蛋白结合到层析柱上时蛋白质被复性,随后用含250mM咪唑,150mM NaCl,25mMTris-Hcl pH7.5和10%甘油的缓冲液洗脱。最后,可溶性蛋白对含5mM碳酸氢铵的储存缓冲液透析。纯化的蛋白用SDS-PAGE分析(图4)。
实施例2重组人司登尼亚钙蛋白-α在COS细胞中的表达
表达质粒stanniocalcin-αHA来源于一个含有1)SV40复制起始点,2)氨苄青霉素抗性基因,3)大肠杆菌复制起始点,4)CMV启动子,后面跟随着多接头区,一个SV40内含子和聚腺苷酸位点的pcDNAI/Amp(Invitrogen)载体。将编码整个司登尼亚钙蛋白-α前体和框内融合到其3’末端的HA标记的DNA片段克隆到载体的多接头区,因此,重组蛋白的表达是在CMV启动子的指导下进行的。HA标记与以前描述的来源于流感血细胞凝集素蛋白的抗原决定簇相对应(I.Wilson,H.Niman,R.Heighten,ACherenson,M.Connolly,and R.Lerner,1984,Cell 37,767)。用识别HA抗原决定簇的抗体,HA标记与目标蛋白的融合可以容易地检测重组蛋白。
质粒构建策略描述如下:用两个引物通过PCR在克隆的原始表达序列标记(EST)上构建编码司登尼亚钙蛋白-α的DNA序列:5’引物5’GACTAAGCTTATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 3’含有一个HindⅢ位点,后接从起始密码子开始的司登尼亚钙蛋白-α密码序列的21个核苷酸;3’序列5’GACTTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTCCTGGGCTCTGGGAGGTG 3’含有XbaⅠ位点,翻译终止密码子,HA标记和司登尼亚钙蛋白-α密码序列的最后20个核苷酸(不包括终止密码子)的互补序列。因此,PCR产物包含一个HindⅢ位点,司登尼亚钙蛋白-α密码序列,其后的融合到框架中的HA标记,与HA标记相邻的一个翻译终止密码子,和一个XbaⅠ位点。用HindⅢ和XbaⅠ限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAⅠ/Amp并连接。连接混合物用于转化大肠杆菌菌株SURE(Stratagene Cloning Systems,11099 North Torrey Pines Road,La Jolla,CA 92037有售)。转化培养物涂于含氨苄青霉素的培养基平板上,挑选抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA,用限制分析检测正确片段的存在。为了重组司登尼亚钙蛋白-α的表达,用DEAE-DEXTRAN方法使表达载体转染COS细胞(J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,(1989))。司登尼亚钙蛋白-αHA蛋白的表达用放射标记和免疫沉淀的方法检测(E.Harlow,D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988))。转染后两天,蛋白用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基,用去污剂缓冲液(150mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS,1%NP-40,0.5%DOC,50mM Tris,pH7.5))裂解细胞(Wilson,I.et al.,Id.37:767(1984))。细胞裂解物和培养基用HA特异性的单克隆抗体进行免疫沉淀。用15%的SDS-PAGE凝胶分析沉淀的蛋白。
实施例3用杆状病毒表达系统克隆和表达人司登尼亚钙蛋白-α
编码全长司登尼亚钙蛋白-α蛋白的DNA序列ATCC # 75831用与基因的5’和3’序列相对应的PCR寡聚核苷酸引物扩增:
5’引物的序列为5’GACTGGATCCGCCACCATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC3’并包含一个BamHⅠ限制酶位点(粗体),和随后的正好在司登尼亚钙蛋白-α的前21个核苷酸(翻译起始密码子“ATG”有下划线)之后的代表一个有效的在真核细胞中起始翻译的信号的6个核苷酸(Kozak,M.,J.Mol.Biol.,196:947-950(1987))。
3’引物的序列为5’GACTGGTACCCTACTCCTGGGCTCTGGGAGG 3’并包含Asp718限制性内切酶位点和21个与司登尼亚钙蛋白-α基因的3’序列互补的核苷酸。用一个商品试剂盒(“Geneclean,”BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)从1%的琼脂糖凝胶上分离扩增的序列。然后,片段用BamHⅠ和Asp718消化并在1%琼脂糖凝胶上再次纯化。此片段命名为F2。
用杆状病毒表达系统(综述参见:M.D.and Smith,G.E.1987,杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序方法手册Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555)使用载体pRG1(pVL941载体的修饰物,见下述)表达司登尼亚钙蛋白-α蛋白。此表达载体包含首蓿夜纹银蛾核多角体病毒(AcMNPV)的多角体蛋白强启动子,和接下来的限制性内切酶BamHⅠ和Asp718的识别位点。猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒,以与多角体蛋白启动子相同的方向插入大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶基因,接下来是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。在多角体蛋白序列的两侧是用于共转染的野生型病毒DNA的细胞介导的异源重组的病毒序列。可以使用诸如pAc373,pVL941和pAcIM1的很多其它载体代替pRG1(Luckow,V.A.and Summers,M.D.,Virology,170:31-39)。
质粒用限制酶BamHⅠ和Asp718消化,然后通过本领域公知的程序用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后,用一个商品试剂盒(“Geneclean,”BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)从1%的琼脂糖凝胶上分离DNA。此载体DNA命名为V2。
用T4 DNA聚合酶连接片段F2和去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌HB101细胞,用限制酶BamHⅠ和Asp718鉴定含有携带司登尼亚钙蛋白-α基因的质粒(pBac-stanniocalcin-alpha)的细菌。通过DNA序列测定确认克隆片段的序列。
5μg的质粒pBac-stanniocalcin-alpha与1.0μg的商购线性杆状病毒(“BaculoGoldTMbaculovirus DNA”,Pharmingen,San Diego,CA.)用脂转染法(Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7412-7417(1987))共转染。
在含有50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)的无菌微量滴定板的一个孔内混合1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的质粒pBac-stanniocalcin-alpha。然后加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培养基,混合并在室温温育15分钟。然后将转染混合物逐滴加入植于一个含1ml无血清Grace’s培养基的35mm的组织培养板中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711),将培养板前后振荡以混合新加入的溶液。然后将培养板在27℃温育5小时。5小时后从培养板中除去转染溶液并加入1ml补加10%胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。将培养板放回培养箱中继续在27℃培养4天。
4天后收集上清并按Summers and Smith(见上述)描述的相似的方法进行噬斑分析。作为一个修饰方法,使用可以容易地分离蓝色噬斑的带”Blue Gal”(LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg)的琼脂糖凝胶。(在Life Technologies Inc.,Gaithersburg分发的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南的第9-10页也可以找到“噬斑分析”的详细描述)。
系列稀释后4天,将病毒加入细胞,用Eppendoff移液头挑取蓝色噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂重新悬浮在含有200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中。短暂离心除去琼脂,含有重组病毒的上清用于感染植于35mm培养皿的Sf9细胞。4天后收获这些培养皿的上清并于4℃贮藏。
Sf9细胞生长在补加10%热失活的FBS的Grace’s培养基中。以感染复数(MOI)2用重组杆状病毒V-stanniocalcin-alpha感染细胞。6小时后除去培养基并用SF900Ⅱ无甲硫氨酸和半胱氨酸培养基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)代替。42小时后,加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S半胱氨酸(Amersham)。在离心收获前继续将细胞培养16小时,通过SDS-PAGE和放射自显影可以看到标记的蛋白(图5)。在图5中凝胶指示司登尼亚钙蛋白-α以同型二聚体的形式存在。
经上述教导,本发明的大量改进和变动是有可能的,因此,在所附的权利要求的范围内,除了特别描述的以外本发明可以以其它方式实施。
序列表(1)一般信息:(ⅰ)申请者:OLSEN,等(ⅱ)发明题目:人司登尼亚钙蛋白-α(ⅲ)序列数:8(ⅳ)通讯地址:
(A)收信人:CARELLA,BYRNE,BAIN,GILFILLAN,
CECCHI,STEWART&OLSTEIN
(B)街道:6 BECKER FARM ROAD
(C)城市:ROSELAND
(D)州:NEW JERSEY
(E)国家:USA
(F)邮政编码:07068(ⅴ)计算机可读形式:
(A)介质类型:3.5英寸软盘
(B)计算机:IBMPS/2
(C)操作系统:MS-DOS
(D)软件:WORD PERFECT5.1(ⅵ)本申请数据:
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类号:(ⅶ)在先申请数据:
(A)申请号:
(B)申请日:(ⅷ)律师/代理人信息:
(A)姓名:FERRARO,GREGORYD.
(B)登记号:36,134
(C)文档号/案号:325800-200(ⅸ)通讯信息:(A)电话:201-994-1700(B)电传:201-994-1744(2)SEQ ID NO:1信息:(ⅰ)序列特点:
(A)长度:892碱基对
(B)类型:核酸
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(D)拓扑学:线性(ⅱ)分子类型:cDNA(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:1:GAATTCGGCA CGAGAGGAGG AGGAGGAAGA GGGGAGCACA AAGGATCCAG GTCTCCCGAC 60GGGAGGTTAA TACCAAGAAC CATGTGTGCC GAGCGGCTGG GCCAGTTCAT GACCCTGGCT 120TTGGTGTTGG CCACCTTTGA CCCGGCGCGG GGGACCGACG CCACCAACCC ACCCGAGGGT 180CCCCAAGACA GGAGCTCCCA GCAGAAAGGC CGCCTGTCCC TGCAGAATAC AGCGGAGATC 240CAGCACTGTT TGGTCAACGC TGGCGATGTG GGGTGTGGCG TGTTTGAATG TTTCGAGAAC 300AACTCTTGTG AGATTCGGGG CTTACATGGG ATTTGCATGA CTTTTCTGCA CAACGCTGGA 360AAATTTGATG CCCAGGGCAA GTCATTCATC AAAGACGCCT TGAAATGTAA GGCCCACGCT 420CTGCGGCACA GGTTCGGCTG CATAAGCCGG AAGTGCCCGG CCATCAGGGA AATGGTGTCC 480CAGTTGGAGC GGGAATGCTA CCTCAAGCAC GACCTGTGCG CGGCTGCCCA GGAGAACACC 540CGGGTGATAG TGGAGATGAT CCATTTCAAG GACTTGCTGC TGCACGAACC CTACGTGGAC 600CTCGTGAACT TGCTGCTGAC CTGTGGGGAG GAGGTGAAGG AGGCCATCAC CCACAGCGTG 660CAGGTTCAGT GTGAGCAGAA CTGGGGAAGC CTGTGCTCCA TCTTGAGCTT CTGCACCTCG 720GACATCCAGA AGCCTCCCAC GGCGCCCCCC GAGCGCCAGC CCCAGGTGGA CAGAACCAAG 780CTCTCCAGGG CCCACCACGG GGGAAGAAGG ACATCACCTC CCAGAGCCCA GGAGTAGGGA 840GACTGGCCGA GGTGCCAAGG GTGAGCGAGG TAGCAAGAGC CACCCAAACG CC 892(2)SEQ ID NO:2信息:(ⅰ)序列特点:
(A)长度:251个氨基酸
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205 210(2)SEQ ID NO:3信息:(ⅰ)序列特点:
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Claims (5)
1、一种生产能够表达多肽的细胞的方法,包括用包含选自如下一组的DNA的载体遗传工程化细胞,所述的组为:
(a)编码具有图1的推导的氨基酸序列的多肽或所说多肽的片段的DNA,其中所说多肽的片段具有人司登尼亚钙蛋白-α活性;
(b)编码具有由包含在ATCC保藏号75831中的cDNA编码的氨基酸序列的多肽或所说多肽的片段的DNA,其中所说多肽的片段具有人司登尼亚钙蛋白-α活性。
2.抗选自如下一组的多肽的抗体,所述的组为:(ⅰ)具有图1的推导的氨基酸序列的多肽及其片段,和(ⅱ)由ATCC保藏号75831的cDNA编码的多肽和所说多肽的片段,其中所说多肽的片段具有人司登尼亚钙蛋白-α活性。
3.抗选自如下一组的多肽的拮抗剂,所述的组为:(ⅰ)具有图1的推导的氨基酸序列的多肽及其片段,和(ⅱ)由ATCC保藏号75831的cDNA编码的多肽和所说多肽的片段,其中所说多肽的片段具有人司登尼亚钙蛋白-α活性。
4.抗选自如下一组的多肽的刺激剂,所述的组为:(ⅰ)具有图1的推导的氨基酸序列的多肽及其片段,和(ⅱ)由ATCC保藏号75831的cDNA编码的多肽和所说多肽的片段,其中所说多肽的片段具有人司登尼亚钙蛋白-α活性。
5.一种鉴定刺激剂和拮抗剂的方法,包括:
制备在其细胞表面表达司登尼亚钙蛋白-α受体的哺乳动物细胞;
在任选地存在司登尼亚钙蛋白-α的条件下组合哺乳动物细胞,标记的钙和待筛选的化合物;和
测定化合物是否刺激或抑制钙吸收。
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PB01 | Publication | ||
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