JP5257886B2 - マダニのリジンケトグルタル酸レダクターゼ(lkr)とサッカロピンデヒドロゲナーゼ(sdh) - Google Patents
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Description
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(3)配列番号2の第32〜412位のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド;
(4)配列番号2の第32〜412位のアミノ酸からなるポリペプチド;
(5)配列番号2の第493〜929位のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド;
(6)配列番号2の第493〜929位のアミノ酸からなるポリペプチド;
(7)(1)〜(6)のポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなり、LKR及び/又はSDHの活性を有するポリペプチド;
(8)(1)〜(6)のポリペプチドを構成するアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、LKR及び/又はSDHの活性を有するポリペプチド
[2] [1]のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[3] [2]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[4] [2]のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
[5] [4]の形質転換体を培養する工程を含む、[1]のポリペプチドを製造する方法。
[6] [1]のポリペプチド又はその断片、[2]のポリヌクレオチド、および[3]のベクターからなる群より選択される有効成分と薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
[7] マダニに対するワクチンである、[6]の医薬組成物。
[8] [1]のポリペプチドに対する抗体又はその機能的断片。
[9] [1]のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、並びに前記ポリペプチドのLKR及び/又はSDHの活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのLKRおよび/又はSDHの活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
[10] LKR及び/又はSDHの活性の阻害剤、或いは[8]の抗体若しくはその機能的断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤。
[11] LKR及び/又はSDHの活性の阻害剤、或いは[8]の抗体若しくはその機能的断片を有効成分として含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防剤。
[12] [6]若しくは[7]の医薬組成物又は[10]若しくは[11]のマダニ駆除剤を、家畜又は愛玩動物に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法。
[13] [6]若しくは[7]の医薬組成物又は[10]若しくは[11]のマダニ駆除剤を、家畜又は愛玩動物に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法。
本発明は、以下の(1)〜(8)より選択されるポリペプチド。
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(3)配列番号2の第32〜412位のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド;
(4)配列番号2の第32〜412位のアミノ酸からなるポリペプチド;
(5)配列番号2の第493〜929位のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド;
(6)配列番号2の第493〜929位のアミノ酸からなるポリペプチド;
(7)(1)〜(6)のポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなり、LKR及び/又はSDHの活性を有するポリペプチド;
(8)(1)〜(6)のポリペプチドを構成するアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、LKR及び/又はSDHの活性を有するポリペプチド、に関する。
本発明は、前記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。HlLKR/SDHポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、HlLKR/SDHポリヌクレオチドと称する)は、当該ポリペプチドをコードする限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、配列番号1で表される塩基配列における721番〜3531番の塩基からなる配列(すなわち、フタトゲチマダニのLKRとSDHの前駆体をコードする遺伝子(HlLKR/SDH遺伝子))を含むポリヌクレオチド、さらに好ましくは配列番号1で表される塩基配列における721番〜3531番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
本発明は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
本発明は、有効成分として、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、および本発明のベクターからなる群より選択される物質を含む医薬組成物に関する。また、本発明の医薬組成物はさらに、薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤を含むことができ、マダニ駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物(特には、ヒト)に経口的に又は非経口的に投与することができる。
本発明は、前記本発明のポリペプチドに対する抗体又はその断片に関する。「前記本発明のポリペプチドに対する抗体」とは、前記本発明のポリペプチド又はその一部に反応性を有する抗体、或いは当該ポリペプチド又はその一部を認識する抗体である。「その機能的断片」とは、抗体の一部分(部分断片)であって、抗体の抗原への作用を保持するものを意味し、具体的にはF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv(scFv)、およびこれらの重合体等をいう。
本発明のポリペプチドを用いると、試験物質が、本発明のポリペプチドのLKR活性及び/又はSDH活性を修飾(例えば、抑制又は促進)するか否かをスクリーニングすることができる。本発明には、本発明のポリペプチドを含むスクリーニングキットが含まれる。
本発明は、前記本発明の医薬組成物又は前記本発明のマダニ駆除剤を、マダニ駆除の必要な動物に有効量で投与することによる、マダニ駆除方法に関する。
家兎を吸血4日目のフタトゲチマダニ(Haemaphysalis longicornis)の雌成ダニ500匹から、中腸組織を実体顕微鏡下で摘出した。これらから直ちに、アシッドグアニジニウム(Acid Guanidinium)−フェノール−クロロホルム法[Chomczynski et al., Anal Biochem 162: 156-159 (1987)](AGPC法)を用いて全RNAを調製し、この5μgを使用し、G−キャッピング法(G-Capping法)による完全長cDNA合成を行った。pGCAPベクター[Kato et al., DNA Res. 12: 53-62(2005)]に2本鎖cDNAがインサートされたプラスミドは、フェノール抽出後、エタノール沈殿により回収し、TE緩衝液に溶解した。得られたプラスミド溶液は、DH5αコンピテント細胞(Takara社)と混合し、エレクトロポレーション法により形質転換を行い、寒天培地に蒔いて培養した。
フタトゲチマダニ・LKR/SDH成熟体(配列番号2で表されるアミノ酸配列における1番〜937番のアミノ酸からなる配列)をコードする遺伝子断片をPCR法にて増幅した。PCR産物をフェノール/クロロホルム処理した後に、エタノール沈澱法にて回収し、蒸留水中に溶解した。得られたDNA液を制限酵素EcoRIで消化した後に、電気泳動にて分離し、DNA精製キット(Biotechnologies社)にて精製し、蒸留水中に回収した。一方、大腸菌発現用ベクターpGEX-4T3(Pharmacia Biotech社)を制限酵素EcoRIで消化した後に、アルカリホスファターゼにて脱リン酸化処理し、その後、PCR産物と同様な方法にて精製した。
実施例2で得られた組換えプラスミドにて、大腸菌DH5α株を形質転換させた後、37℃でアンピシリン含有LB培地で培養した。組換えタンパク質の発現は、10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動[Laemmli ら, Nature, 227, 680-685 (1970)]を実施した後、クーマシー染色で確認した。
実施例3で得られた組換えSDHタンパク質と組換えLKRタンパク質は、3−10%native gradient polyacrylamide gel(Pagel:アトー,東京)を用いて、20mAで120分間泳動後、以下の染色処理によって酵素活性を測定した。
実施例3で述べた方法により、大腸菌で発現させた組換えHlLKRとSDH融合タンパク質を、市販のキット(Pharmacia Biotech社)に添付のプロトコールに従って精製した。この100μgを含む溶液200μLと、フロイント完全アジュバント(Adjuvant Complete Freund; Difco社)200μLとを混合した後に、BALB/cマウス(8週齢,雌)に腹腔内接種した。腹腔内接種から2週間及び4週間経過後に、それぞれ、組換えHlcyst融合タンパク質100μgをフロイント不完全アジュバント(Difco社)と混合し、追加接種を行なった。最終接種後から2週目に採血し、得られた血清を−20℃に保存した。得られた抗組換えHlLKR/SDH融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法[Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354 (1979)]にて天然型LKR/SDHタンパク質の同定を行なった。なお、試料として、4日間家兎を吸血した雌成ダニの中腸と唾液腺ライセートを使用した。
フタトゲチマダニの卵、幼ダニ、若ダニ、成ダニの全発育期と、タトゲチマダニの雌成ダニを家兎に吸血させ、吸血後1日目から5日目、飽血(吸血後7日目)の雌ダニの主要内部器官における天然型LKR/SDHの発現分布について、常法に従って、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法によりmRNA発現の分析を実施した。RT−PCR法によるmRNA発現分析の発育期別の結果を図4に、吸血に伴う臓器別の発現量の推移の結果を図5に示す。
実施例5で作製した組換えHlLKR/SDH融合タンパク質の抗血清を用いて、家兎を吸血開始4日目の雌成ダニから作製した凍結切片における天然型HlLKR/SDHの局在分析を、常法に従って、感染蛍光抗体法(IFAT)で実施した。結果を図6に示す。
家兎を吸血開始4日目の雌成ダニから作製した凍結切片を、4℃で2日間、0.4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)で固定し、内在性基質を除去するために、同切片を4℃で12時間、PBSで洗浄した後に、4mMのL-サッカロピン、0.1%ニトロブルーテトラジウム、0.01mMフェナジンメタサルフェートを含有する、100mMTris―HCl(pH8.5)で30分間室温にてインキュベートして、天然型HlSDHタンパク質のin situにおける酵素活性の組織化学的検出を実施した。陰性対象としては、サッカロピンを含有しない0.1%ニトロブルーテトラジウム、0.01mMフェナジンメタサルフェートを含有する、100mMTris―HCl(pH8.5)によるインキュベートを行った。結果を図7に示す。
脱皮後3ヶ月目、6ヶ月目、10ヶ月目のフタトゲチマダニの雌成ダニにおける天然型LKR/SDHの発現について、常法に従って、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法によりmRNA発現の分析を実施した。RT−PCR法によるmRNA発現分析の結果を図8に示す。
常法(de la Funte et al.,Trend Parasitol 23:427-433(2007)に従って、RNA干渉法を用いたマダニ体内の天然型LKR/SDH遺伝子の発現のノックダウン(gene silencing)を実施し、LKR/SDHの生物学的機能について解析を行った。LKR/SDHのSDHドメイン(588bp)とLKRドメイン(680bp)をコードするDNA断片テンプレートは、SDHドメインに対しては、オリゴヌクレオチドのT7forward(5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCTGGGTCAACAGGACAACCTGCTTACGTCC-3’:配列番号3)とT7reverse (5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTCTACAACGAATTCCCTCGTTCTTGAGC-3’:配列番号4)プライマーを用いて、またLKRドメインに対しては、オリゴヌクレオチドのT7 forward (5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAAGAATGGCGTCAAAGTCTA-3’:配列番号5) とT7 reverse (5’-GGATCCTAATACGACTCACTATATGGGTCCTTCGGGTCGACCCAT-3’:配列番号6)プライマーを用いて、それぞれPCRによって増幅した。PCR産物は、ゲル精製キット(GENECLEAN、MP Biomedicals)を用いて精製した後、T7 RiboMaxTM Express large-scale RNA kit (Promega, Madison, WI) を用いて、dsRNA構築に供した。得られたdsRNA/LKRとdsRNA/SDHは、それぞれ、マダニ1個体あたり2.5μgを、ガラス毛細管を用いて、第4脚基節付近から未吸血雌成ダニの血体腔に注入した。陰性対象としては、PBS(0.5μl)接種群、ならびに細菌由来のルシフェラーゼdsRNA接種群を用意した。dsRNA接種ダニは、25℃に18時間放置して、接種による機器的ダメージのないことを確認した後、家兎を吸血させ、吸血、飽血、産卵、卵のふ化などの生物学的特性について観察を実施した。また、dsRNA摂取後のマダニのライセートを経時的に作製し、イムノブロット法によって、LKR/SDHタンパクの発現抑制を確認した。
実施例10における天然型LKR/SDHタンパク質の発現をイムノブロット法で解析した。
RNA干渉法によってHlLKR/SDHの発現が抑制された雌成ダニを家兎に寄生させ、吸血、産卵、卵のふ化について解析した。
組換えHlSDH融合タンパク質(GST/SDH)、組換えHlLKR融合タンパク質(GST/LKR)、あるいはこれら2種類の等量混合物(GST/SDH and GST/LKR)いずれかで家兎に頻回免疫し、十分にこれらに対する抗体価が上昇してから、フタトゲチマダニの若ダニ(N)と雌成ダニ(A)を寄生させて、吸血期間、飽血率、損耗個体の出現率、飽血体重、雌1個体当たりの産卵量、若ダニの脱皮率若しくは卵のふ化率に与える効果を解析した。
Claims (11)
- 以下の(1)〜(8)より選択されるポリペプチド。
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(3)配列番号2の第32〜412位のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド;
(4)配列番号2の第32〜412位のアミノ酸からなるポリペプチド;
(5)配列番号2の第493〜929位のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド;
(6)配列番号2の第493〜929位のアミノ酸からなるポリペプチド;
(7)(1)〜(6)のポリペプチドを構成するアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなり、リジンケトグルタル酸レダクターゼ(LKR)及び/又はサッカロピンデヒドロゲナーゼ(SDH)の活性を有するポリペプチド;
(8)(1)〜(6)のポリペプチドを構成するアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、LKR及び/又はSDHの活性を有するポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 請求項1に記載のポリペプチド、請求項2に記載のポリヌクレオチド、および請求項3に記載のベクターからなる群より選択される有効成分と薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
- マダニに対するワクチンである、請求項6に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドに対する抗体又はその機能的断片。
- 請求項1に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、並びに前記ポリペプチドのLKR及び/又はSDHの活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのLKRおよび/又はSDHの活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
- 請求項6若しくは7に記載の医薬組成物を、家畜又は愛玩動物に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法。
- 請求項6若しくは7に記載の医薬組成物を、家畜又は愛玩動物に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法。
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