JP4710001B2 - マダニのロイシンアミノペプチダーゼ - Google Patents
マダニのロイシンアミノペプチダーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4710001B2 JP4710001B2 JP2005065550A JP2005065550A JP4710001B2 JP 4710001 B2 JP4710001 B2 JP 4710001B2 JP 2005065550 A JP2005065550 A JP 2005065550A JP 2005065550 A JP2005065550 A JP 2005065550A JP 4710001 B2 JP4710001 B2 JP 4710001B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- present
- leucine aminopeptidase
- amino acid
- tick
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
「ナショナル・インスティチュート・オブ・アニマルヘルス・クオータリー(トウキョウ)(National Institute of Animal Health Quarterly, Tokyo)」 1978年,18巻,27-38頁 「プラシトロジー・トゥデー(Prasitology Today)」,(オランダ),1999年,15巻,258-262頁
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を示すポリペプチド;又は
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド
により解決することができる。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体に関する。
また、本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記ポリペプチドを製造する方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチド若しくはその断片、前記ポリヌクレオチド、又は前記ベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法に関する。
また、本発明は、前記ポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのロイシンアミノペプチダーゼ活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのロイシンアミノペプチダーゼ活性を修飾する物質のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、ロイシンアミノペプチダーゼ阻害剤、又は前記抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤に関する。
本発明のポリペプチドには、
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する);及び
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が60%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)
が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号1で表される塩基配列における第115番〜第1698番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNA及びRNAの両方が含まれる。
本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
本発明の医薬(好ましくはマダニに対するワクチン)は、有効成分として、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む。すなわち、本発明においては、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、マダニ駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物(特には、ヒト)に経口的に又は非経口的に投与することができる。
本発明のポリペプチドに反応する抗体(例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体)は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、DNAワクチン法(Raz,E.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,9519−9523,1994;又はDonnelly,J.J.ら,J.Infect.Dis.,173,314−320,1996)によっても得ることができる。
本発明のポリペプチドを用いると、試験物質が、本発明のポリペプチドのロイシンアミノペプチダーゼ活性を修飾(例えば、抑制又は促進)するか否かをスクリーニングすることができる。本発明には、本発明のポリペプチドを含むスクリーニングキットが含まれる。
フタトゲチマダニ(Haemaphysalis longicornis)岡山株[Fujisaki et al., Natl Inst Anim Health Q (Tokyo) 16, 122-128, (1976)]の卵から、アシッドグアニジニウム(Acid Guanidinium)−フェノール−クロロホルム法[Chomczynski et al., Anal Biochem 162: 156-159 (1987)]により、全RNAを抽出した。得られた全RNAから、mRNA単離キット(Oligotex-dT30;Takara社)を用いて、前記キットに添付のプロトコールに従い、ポリA+RNAを精製した。
マダニロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子のORF領域をクローニングするために、実施例1で得られたcDNAクローンを鋳型とし、センスプライマー(5'-ACgaatccAATGCTACTGCGCTCGATCG-3';小文字はEcoRIサイトを示す;配列番号7)とアンチセンスプライマー(5'-ACgaatccTTCTGCACCTTGGCAA-3';小文字はEcoRIサイト;配列番号8)とを用いたPCRにて増幅した。PCRは、反応液[鋳型DNA 1μg, 0.1μmol/Lプライマー, 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 2.5U Taq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer社)]50μLを、94℃にて1分間、50℃にて1分間、72℃にて2分間の条件で、反応を40サイクル繰り返すことにより実施した。
実施例2で得られた組換えプラスミドにて、大腸菌DH5α株を形質転換させた後、37℃でアンピシリン含有LB培地で培養した。培養液のOD600nmが0.3〜0.5に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を最終濃度が0.5mmol/Lになるように添加し、更に37℃で4時間培養を続けた。組換えタンパク質の発現は、10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動[Laemmli et al., Nature, 227, 680-685(1970)]を実施した後、クーマシー染色で確認した。その結果、約80kDaの組換えタンパク質の発現が認められ、GSTリーダータンパク質(26kDa)とダニロイシンアミノペプチダーゼタンパク質(54kDa)の融合タンパク質であることが確認された。
実施例3で述べた方法により、大腸菌で発現させた組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質を、市販のキット(Pharmacia Biotech社)に添付のプロトコールに従って精製した。精製後の組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質の電気泳動像を図1に示す。図1において、レーン1は、分子量マーカーの泳動結果であり、レーン2は、精製した組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質の泳動結果であり、レーン3は、精製したGSTタンパク質の泳動結果である。
実施例4で得られた抗組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法[Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354 (1979)]にて天然型ロイシンアミノペプチダーゼタンパク質の同定を行なった。なお、試料として、成ダニライセートを使用した。結果を図2に示す。図2において、レーン1は、分子量マーカーの泳動結果であり、レーン2は、抗組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質免疫血清を用いた場合の結果であり、レーン3は、抗GSTタンパク質免疫血清(陰性対象)を用いた場合の結果である。図2に示すように、成ダニライセートにおいて54kDaの特異的バンドが検出された。天然型ロイシンアミノペプチダーゼタンパク質の分子量が推定理論値(54kDa)と一致すると考えられた。
イムノブロット法を用いて組換えロイシンアミノペプチダーゼタンパク質に対するウサギ免疫血清との反応性を検討した。その結果、組換えロイシンアミノペプチダーゼタンパク質は、ウサギで作製したダニ免疫血清と強く反応することが確認された。このことから、組換えロイシンアミノペプチダーゼタンパク質はダニワクチン候補分子の一つであることが示された。なお、免疫前のウサギ血清と組換えロイシンアミノペプチダーゼタンパク質との反応は認められなかった。
実施例4で述べた方法により精製した組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質を用い、ローリーとジェニファーの方法[RoryとJennifer、JBC. 277 (29), 26057-26065 (2002)]を改変してロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定を行った。基質には6種類の蛍光性合成ペプチドであるL-ロイシン-7-アミノ-4-メチルクマリン、L-メチオニン-7-アミノ-4-メチルクマリン、L-アラニン-7-アミノ-4-メチルクマリン、L-フェニルアラニン-7-アミノ-4-メチルクマリン、L-リジン-7-アミノ-4-メチルクマリン、及びL-アルギニン-7-アミノ-4-メチルクマリン(ペプチド研究所、大阪)を用いた。
[(10回目蛍光強度)−(1回目蛍光強度)]/ 9
により算出した。
結果を図3に示す。図3に示すように、基質にL-ロイシン-7-アミノ-4-メチルクマリン又はL-メチオニン-7-アミノ-4-メチルクマリンを用いた場合に強い活性が検出され、L-フェニルアラニン-7-アミノ-4-メチルクマリン又はL-アルギニン-7-アミノ-4-メチルクマリンでは中等度の活性が検出され、その他の基質(L-アラニン-7-アミノ-4-メチルクマリン又はL-リジン-7-アミノ-4-メチルクマリン)では活性が低かった。なお、陰性対象として用いたGSTについては、ロイシンアミノペプチダーゼ活性は検出されなかった。以上により、組換えロイシンアミノペプチダーゼ融合タンパク質がロイシンアミノペプチダーゼ活性を有することが確認された。
Claims (7)
- (1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を示すポリペプチド;又は
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチド、又は、請求項3に記載のベクターによって形質転換されている形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドに対する抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのロイシンアミノペプチダーゼ活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのロイシンアミノペプチダーゼ活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005065550A JP4710001B2 (ja) | 2005-03-09 | 2005-03-09 | マダニのロイシンアミノペプチダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005065550A JP4710001B2 (ja) | 2005-03-09 | 2005-03-09 | マダニのロイシンアミノペプチダーゼ |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006246747A JP2006246747A (ja) | 2006-09-21 |
JP2006246747A5 JP2006246747A5 (ja) | 2008-04-03 |
JP4710001B2 true JP4710001B2 (ja) | 2011-06-29 |
Family
ID=37087863
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005065550A Active JP4710001B2 (ja) | 2005-03-09 | 2005-03-09 | マダニのロイシンアミノペプチダーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4710001B2 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10507455A (ja) * | 1994-10-18 | 1998-07-21 | ヘスカ コーポレイション | 動物をノミ寄生から防御するためのノミプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤の使用方法 |
-
2005
- 2005-03-09 JP JP2005065550A patent/JP4710001B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10507455A (ja) * | 1994-10-18 | 1998-07-21 | ヘスカ コーポレイション | 動物をノミ寄生から防御するためのノミプロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤の使用方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2006246747A (ja) | 2006-09-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lecordier et al. | Characterization of a dense granule antigen of Toxoplasma gondii (GRA6) associated to the network of the parasitophorous vacuole | |
Acosta et al. | Fasciola hepatica leucine aminopeptidase, a promising candidate for vaccination against ruminant fasciolosis | |
KR20090016671A (ko) | 레플리킨 펩티드 및 이의 용도 | |
JP2004535171A (ja) | レプリキンペプチドおよびその使用 | |
US8057801B2 (en) | Tick galectin | |
JP5055522B2 (ja) | 多包条虫由来の新規蛋白質 | |
Kwon et al. | Recombinant adenylate kinase 3 from liver fluke Clonorchis sinensis for histochemical analysis and serodiagnosis of clonorchiasis | |
Reszka et al. | Haemonchus contortus: characterization of the baculovirus expressed form of aminopeptidase H11 | |
JP4710009B2 (ja) | マダニのアスパラギン酸プロテアーゼ | |
JP4710001B2 (ja) | マダニのロイシンアミノペプチダーゼ | |
JPH10500854A (ja) | 新規な寄生虫プロテアーゼの遺伝子およびタンパク質 | |
JP4452510B2 (ja) | ダニのキチナーゼ | |
CA2224184A1 (en) | Novel filariid nematode cysteine protease proteins, nucleic acid molecules and uses thereof | |
CN113980942B (zh) | 一种猪链球菌重组蛋白抗原Pul及其应用 | |
JP4752054B2 (ja) | バベシア・ギブソニ(Babesiagibsoni)の分泌抗原1タンパク質及びこのタンパク質をコードするDNA、並びにそれらの利用 | |
JP4783901B2 (ja) | マダニのシスタチン | |
US20050260219A1 (en) | Carboxypeptidases B from anopheles gambiae. compositions comprising them, vaccine applications and use as therapeutical targets | |
JP3692396B2 (ja) | 豚回虫(Ascarissuum)感染幼虫の14kDa抗原、それをコードする核酸分子及びそれらの利用 | |
JP5257886B2 (ja) | マダニのリジンケトグルタル酸レダクターゼ(lkr)とサッカロピンデヒドロゲナーゼ(sdh) | |
CN114381445A (zh) | 具有杀灭疟原虫作用的沙雷氏菌脂肪酶及其编码基因 | |
AU726774B2 (en) | Novel parasite protease genes and proteins | |
EP2699677A1 (en) | Protein for use as a medicament | |
JP2009100769A (ja) | レプリキンペプチドとその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080218 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110201 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110222 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4710001 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |