JP4783901B2 - マダニのシスタチン - Google Patents
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Description
[1](1)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド、
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を示すポリペプチド、又は
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が50%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド;
[2][1]のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
[3][2]のポリヌクレオチドを含むベクター;
[4][2]のポリヌクレオチドを含む形質転換体;
[5][4]の形質転換体を培養する工程を含む、[1]のポリペプチドを製造する方法;
[6][1]のポリペプチド若しくはその断片、[2]のポリヌクレオチド、又は[3]のベクターを有効成分として含む、医薬;
[7]マダニに対するワクチンである、[6]の医薬;
[8]抗原虫剤である、[6]の医薬;
[9][1]のポリペプチド若しくはその断片、[2]のポリヌクレオチド、又は[3]のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物;
[10][1]のポリペプチド若しくはその断片、[2]のポリヌクレオチド、又は[3]のベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法;
[11][1]のポリペプチド若しくはその断片、[2]のポリヌクレオチド、又は[3]のベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法;
[12][1]のポリペプチドに対する抗体又はその断片;
[13][1]のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのシスタチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのシスタチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法;
[14]シスタチン阻害剤、又は[12]の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤;
[15]シスタチン阻害剤、又は[12]の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防剤;並びに
[16]シスタチンを有効成分として含む、抗原虫剤
に関する。
本発明のポリペプチドには、
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する);及び
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が50%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)
が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号1で表される塩基配列における126番〜467番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド[例えば、配列番号1で表される塩基配列における72番〜467番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド(すなわち、フタトゲチマダニのシスタチン前駆体をコードする遺伝子(Hlcyst遺伝子))、配列番号1で表される塩基配列における126番〜467番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド(シグナルペプチドを含まない成熟体をコード)、あるいは、配列番号1で表される塩基配列(すなわち、全長)からなるポリヌクレオチド]、あるいは、配列番号1で表される塩基配列における72番〜467番又は126番〜467番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNA及びRNAの両方が含まれる。
本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
本発明の医薬(好ましくはマダニに対するワクチン)は、有効成分として、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む。すなわち、本発明においては、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、マダニ駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物(特には、ヒト)に経口的に又は非経口的に投与することができる。
本発明のポリペプチドに反応する抗体(例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体)は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、DNAワクチン法[Raz, E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994); 又はDonnelly, J.J.ら, J. Infect. Dis., 173, 314-320, (1996)]によっても得ることができる。
本発明のポリペプチドを用いると、試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を修飾(例えば、抑制又は促進)するか否かをスクリーニングすることができる。本発明には、本発明のポリペプチドを含むスクリーニングキットが含まれる。
本発明の抗原虫剤は、有効成分として、シスタチンを含む。
本発明においては、シスタチンを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、原虫駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物(特には、ヒト)に経口的に又は非経口的に投与することができる。また、本発明における有効成分であるシスタチンは、抗原虫剤を製造するために使用することができる。
本発明の抗原虫剤は、所望により、種々の形態で投与することができ、例えば、前記の[4]本発明の医薬、あるいは、[6]本発明のスクリーニング方法並びにそのスクリーニング結果物又は本発明の抗体を含む医薬において先述した形態で投与することができる。
家兎を吸血4日目のフタトゲチマダニ(Haemaphysalis longicornis)の雌成ダニ500匹から、中腸組織を実体顕微鏡下で摘出した。これらから直ちに、アシッドグアニジニウム(Acid Guanidinium)−フェノール−クロロホルム法[Chomczynski et al., Anal Biochem 162: 156-159 (1987)](AGPC法)を用いて全RNAを調製し、この5μgを使用し、G−キャッピング法(G-Capping法)による完全長cDNA合成を行った。pGCAPベクター[Kato et al., DNA Res. 12: 53-62(2005)]に2本鎖cDNAがインサートされたプラスミドは、フェノール抽出後、エタノール沈殿により回収し、TE緩衝液に溶解した。得られたプラスミド溶液は、DH5αコンピテント細胞(Takara社)と混合し、エレクトロポレーション法により形質転換を行い、寒天培地に蒔いて培養した。
シグナルペプチド(配列番号2で表されるアミノ酸配列における1番〜18番のアミノ酸からなる配列)を含まない、フタトゲチマダニ・シスタチン成熟体(配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列)をコードする遺伝子断片をPCR法にて増幅した。PCR産物をフェノール/クロロホルム処理した後に、エタノール沈澱法にて回収し、蒸留水中に溶解した。得られたDNA液を制限酵素EcoRIで消化した後に、電気泳動にて分離し、DNA精製キット(Biotechnologies社)にて精製し、蒸留水中に回収した。一方、大腸菌発現用ベクターpGEX-4T3(Pharmacia Biotech社)を制限酵素EcoRIで消化した後に、アルカリホスファターゼにて脱リン酸化処理し、その後、PCR産物と同様な方法にて精製した。
実施例2で得られた組換えプラスミドにて、大腸菌DH5α株を形質転換させた後、37℃でアンピシリン含有LB培地で培養した。培養液のOD600nmが0.3〜0.5に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を最終濃度が0.5mmol/Lになるように添加し、更に37℃で4時間培養を続けた。組換えタンパク質の発現は、10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動[Laemmli ら, Nature, 227, 680-685 (1970)]を実施した後、クーマシー染色で確認した。
その結果、約38kDaの組換えタンパク質の発現が認められ、GSTリーダータンパク質(26kDa)とフタトゲチマダニ・シスタチンタンパク質(13kDa)の融合タンパク質(以下、組換えHlcyst融合タンパク質と称する)
組換えHlcyst融合タンパク質によるシステイン・プロテアーゼの活性阻害を、市販のパパイン(SIGMA社)、ヒトカテプシンL(SIGMA社)、ヒトカテプシンB(SIGMA社)を用いて確認した。なお、パパイン及びカテプシンLはシステイン・プロテアーゼであり、カテプシンBはアスパラギン酸プロテアーゼである。酵素活性の阻害試験は、リン酸ナトリウム(100 mmol/L)、ジチオトレイトール(DTT; 1 mmol/L)、及びEDTA(2 mmol/L)を含有する反応緩衝液を用いて、溶解後のpHが、パパインはpH6.5、カテプシンLとカテプシンBはpH6.0になるようにして、すべて0.2μmol/L溶液とした。組換えHlcyst融合タンパク質は、0、0.1、0.2、0.4、0.8、又は1.6μmol/Lの濃度になるように、市販システイン・プロテアーゼの0.2μmol/L溶液と混合した後に、ベンジルオキシカルボニル・フェニルアラニン−アルギニン−7−アミド−4−メチルクマリン基質(ペプチド研究所)10μmol/Lを加え、37℃で30分間反応させた。その後、蛍光マイクロリーダ(Thermo Electron社)を用い、355nmの励起光と460nmの放射光にてプロテアーゼ活性を測定した。
25℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、又は100℃に組換えHlcyst融合タンパク質(4μmol/L)を5分間置いた後に、その0.8μmol/L濃度液を用いて、実施例4の方法で、市販パパイン0.2μmol/L溶液に対する活性阻害を検討した。
実施例3で述べた方法により、大腸菌で発現させた組換えHlcyst融合タンパク質を、市販のキット(Pharmacia Biotech社)に添付のプロトコールに従って精製した。この100μgを含む溶液200μLと、フロイント完全アジュバント(Adjuvant Complete Freund; Difco社)200μLとを混合した後に、BALB/cマウス(8週齢,雌)に腹腔内接種した。腹腔内接種から2週間及び4週間経過後に、それぞれ、組換えHlcyst融合タンパク質100μgをフロイント不完全アジュバント(Difco社)と混合し、追加接種を行なった。最終接種後から2週目に採血し、得られた血清を−20℃に保存した。得られた抗組換えHlcyst融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法[Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354 (1979)]にて天然型シスタチンタンパク質の同定を行なった。なお、試料として、4日間家兎を吸血した雌成ダニの中腸と唾液腺ライセートを使用した。
フタトゲチマダニの卵、幼ダニ、若ダニ、成ダニの全発育期と、家兎を4日間吸血して半飽血状態の雌ダニの主要内部器官における天然型シスタチンの発現分布について、常法に従って、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)法によりmRNA発現の分析を実施した。RT−PCR法によるmRNA発現分析の発育期別の結果を図5に、臓器別の結果を図6に示す。
フタトゲチマダニの雌成ダニを家兎に吸血させ、吸血後1日目、4日目、7日目(飽血)の雌ダニ体内における天然型シスタチンの発現の推移について、常法に従って、RT−PCR法によりmRNA発現の分析を実施した。RT−PCR法によるmRNA発現分析の結果を図7に示す。
10μLのガラス毛細管(Microcap;Drummond Scientific社)の一端を加熱によって注射針状にしたものを用いて、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に0.1μg/mLに溶解したLPS(Sigma社)を、1個体当たり1μL、フタトゲチマダニの未吸血雌成ダニ30個体の第4基節付近から血体腔内に接種した。マダニは接種後6時間、25℃に静置し、体内における天然型シスタチンの発現の推移を、常法に従ってRT−PCR法によりmRNA発現の分析を実施した。LPS接種の対照としては、PBSを1個体当たり1μL、合計30個体に接種した。
1歳の摘脾ビーグル犬にイヌバベシア(Babesia gibsoni)のNRCPD株を実験感染させた [Fukumoto S.ら, J. Vet. Med. Sci., 63, 977-981 (2001)]。原虫寄生率(パラシテミア)が5%以上になったときに、雌成ダニを耳袋法で寄生させ、飽血個体を回収し、25℃及び90%相対湿度で産卵させた。1匹の雌ダニの産卵塊からふ化し2ヶ月後の幼ダニにおける天然型シスタチンの発現の推移を、常法に従ってRT−PCR法によりmRNA発現の分析を実施した。あわせて、PCR法によりダニ体内のイヌバベシアのmRNAの発現を調べ、幼ダニにおけるバベシア感染を確認した。
ウシバベシア原虫(Babesia bovis)のインビトロ培養方法[Bork S.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 68, 334-340 (2003)]に従って、ウシバベシア原虫感染血液100μLを非感染ウシ赤血球で希釈してパラシテミアを1%に調整後、この0.1μLに、1、2、又は3μmol/Lの濃度で組換えHlcyst融合タンパク質を加えた0.9μLの培養液(Growth medium)を加え、24穴の培養プレートにて、37℃で4日間培養した。組換えHlcyst融合タンパク質を加えた培養液は、0.9μLを毎日更新し、更新直前に培養液のギムザ染色塗抹を作製して、原虫寄生赤血球数を鏡検し、寄生原虫の形態とパラシテミアの推移を検討することによって、ウシバベシア原虫の増殖に対する組換えHlcyst融合タンパク質の影響を確認した。なお対照として、組換えHlcyst融合タンパク質の代わりにGST3μLを加えた培養液で培養した系を用意した。
Claims (10)
- (1)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を示すポリペプチド;又は
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列における19番〜131番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号2で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 請求項1に記載のポリペプチド若しくはその断片であって、投与対象に投与した場合に免疫を誘導することができる前記断片、請求項2に記載のポリヌクレオチド、又は請求項3に記載のベクターを有効成分として含む、医薬。
- 抗原虫剤である、請求項6に記載の医薬。
- 請求項1に記載のポリペプチド若しくはその断片であって、投与対象に投与した場合に免疫を誘導することができる前記断片、請求項2に記載のポリヌクレオチド、又は請求項3に記載のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドに対する抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのシスタチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのシスタチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
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