JP4719527B2 - ベクターマダニのガレクチン、それをコードする核酸分子及びそれらの利用 - Google Patents
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Description
[1]以下のポリペプチド(a)〜(d)からなる群から選んだポリペプチド:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を示すポリペプチド;並びに
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド、
[2][1]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
[3]以下のポリヌクレオチド(A)及び(B)からなる群から選んだポリヌクレオチドである、[2]に記載のポリヌクレオチド:
(A)配列番号1で表される塩基配列における129番〜1097番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド;及び
(B)配列番号1で表される塩基配列における129番〜1097番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
[4][2]又は[3]に記載のポリヌクレオチドを含む組換え体分子、
[5][2]又は[3]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
[6][2]又は[3]に記載のポリヌクレオチドを含む組換え体細胞、
[7][6]に記載の組換え体細胞を培養し、その培養物から[1]に記載のポリペプチドを採取することを特徴とする、前記ポリペプチドの製造方法、
[8][1]に記載のポリペプチドを認識する抗体又はその断片、
[9]モノクローナル抗体である、[8]に記載の抗体又はその断片、
[10][1]に記載のポリペプチド若しくはその断片、[2]又は[3]に記載のポリヌクレオチド、[4]に記載の組換え体分子、又は[5]に記載のベクターを有効成分として含む、医薬、
[11]マダニに対するワクチンである、[10]に記載の医薬、
[12][1]に記載のポリペプチド若しくはその断片、[2]又は[3]に記載のポリヌクレオチド、[4]に記載の組換え体分子、又は[5]に記載のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物、
[13][1]に記載のポリペプチド若しくはその断片、[2]又は[3]に記載のポリヌクレオチド、[4]に記載の組換え体分子、又は[5]に記載のベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法、
[14][1]に記載のポリペプチド若しくはその断片、[2]又は[3]に記載のポリヌクレオチド、[4]に記載の組換え体分子、又は[5]に記載のベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法、
[15][1]に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドのガレクチン活性を分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのガレクチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法、並びに
[16]マダニガレクチン阻害剤を有効成分として含む、寄生虫駆除剤
に関する。
本発明におけるcDNAライブラリーの作製、遺伝子のクローニング、スクリーニング、及び塩基配列の決定等の分子生物学、寄生虫学、免疫学、並びに生化学的な技術は、J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis (1989): Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ed Harlow and David Lanc(1988):Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press;獣医住血微生物学 近代出版(1986);獣医寄生虫学、獣医臨床寄生虫学編集委員会編、文英堂(1998);標準医動物学 第2版,医学書院(1998)等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って実施することができる。また、DNA解析は、MacVector(登録商標)(コダック社)及びGENETYX(ソフトウェアー開発社)等のソフトウェアを用いて行うことができる。
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する);及び
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)
が含まれる。
前記ベクターマダニのガレクチンをもとに作製した合成ペプチドを、適当なキャリアタンパク質[例えば、牛血清アルブミン(BSA)又はキーホールリンペットヘモグロビン(KLH)]と結合させた複合体を抗原として、当業者に良く知られた方法に従い、例えば、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し、充分に免疫した後、動物から採血し、血清分離し、抗ベクターマダニガレクチン抗体を作製することができる。この際、適当なアジュバントを使用することもできる。
フタトゲチマダニ(Haemaphysalis longicornis) の成ダニは、国立大学法人帯広畜産大学・原虫病研究センターより得ることができる。Fujisaki[Fujisaki et al., Natl Inst Anim Health Q (Tokyo) 16, 122-128, (1976)]らの方法によって成ダニを生産し、以下の操作に供した。ベクターマダニのガレクチンをコードする遺伝子は、国際公開WO 03/072781号に記載のヒメダニのガレクチンをコードする塩基配列情報を利用して、フタトゲチマダニcDNAライブラリーを用いるPCR法に基づいて取得した。
実施例1で得られたマダニガレクチンをコードする完全長cDNAを、センスプライマー(5’- ACGGATCCATGTCAGCAAAGGTCTCAGCCC-3’;BamHIサイト GGATCC;配列番号3)及びアンチセンスプライマー(5’- ACGAATTCTAGGACTGCTGGTGCAGCTTGC -3’; EcoRIサイトGAATTC;配列番号4)を用いたPCR反応にて増幅した。PCR反応は、反応液[1ng 成ダニcDNA、1μmol/Lセンス及び1μmol/Lアンチセンスプライマー、10mmol/L Tris-HCl (pH8.3)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2 、2.5U AmpliTaq DNA polymerase(プロメガ社)](50μL)を調製し、市販機器(DNA Thermal Cycler;パーキンエルマー社)を用いて、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて2分間の反応を35サイクルで実施した。増幅したPCR産物は、ゲル電気泳動を行い、増幅したDNA断片をDNA精製キット(キアゲン社)を用いて蒸留水中に回収し、回収液を制限酵素BamHI及びEcoRIで3時間酵素処理した。プラスミド発現ベクターであるpTrcHis発現ベクター(インビトローゲン社)も、挿入断片と同様に制限酵素BamHI及びEcoRIで3時間酵素処理した。なお、前記プラスミドpTrcHisは、発現対象ポリペプチドを、そのN末端に(His)6(ヘキサ−ヒスチジン・タグ)を付加した融合ポリペプチドとして発現させることができる発現ベクターである。制限酵素処理した挿入断片及びベクターをDNAライゲーションキット(宝酒造社)を用いて、メーカーの推奨する方法に従って、DNA断片を挿入し、大腸菌Top10(インビトローゲン社)の形質転換を行い、L−ampプレートに蒔き、白色のコロニーからベクターマダニのガレクチンコード領域の挿入されたクローンを選択した。
形質転換した大腸菌を37℃にて、アンピシリンを含んだSOB液(バイオ101;フナコシ)で培養し、SOB液のOD600が0.5に到達した時点で1mmol/Lイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加し、更に3時間培養を続けた。経時的に産生されるタンパク質産生の変化は、15%SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動[Laemmli, et al., Nature 227:680-685(1970)]を実施した後、クマーシー染色で確認した。その結果、約36kDa付近に組換えタンパク質の産生が認められ。また、同様に実施した電気泳動のゲルを、ニトロセルロース膜(アマシャム社)に電気的に転写した。転写後、膜を5%スキムミルクで30分間ブロッキングし、次いで、トリス緩衝液(TBS)で10,000倍に希釈されたアルカリホスファターゼ標識されたT7モノクローナル抗体(ノバーゲン社)と1時間反応させた。なお、前記T7モノクローナル抗体は、(His)6と反応するモノクローナル抗体である。ツィーン加TBS(TBST)で洗浄した後、結合したタンパク質を基質(NBT/BCIP;ギブコBRL社)を用いて可視化した。その結果、このウエスタンブロット解析によって、約36kDa付近に確認された組換えタンパク質と反応することが認められ、組換えベクターマダニのガレクチンに(His)6が付加されていることが確認された。
組換えベクターマダニのガレクチンはメタルキレートクロマトグラフィー(インビトローゲン社)を用いてメーカーの推奨するイミダゾール溶出法によって精製した[Tsuji et al., Mol Biochem Parasitol 97: 69-79(1998)]。溶出されたタンパク質は、遠心濃縮カラム(Centrisart I;ザルトリウス社, cut off 10,000 MW) を用いて濃縮し、透析カセット(Slide-A-LyzerTM Dialysis Cassette;ピアス社)を用いてリン酸緩衝食塩液中にて透析を行った。
実施例4で作製したマウスのベクターマダニのガレクチン組換え体タンパク質免疫血清を用いて、ベクターマダニのガレクチンタンパク質抽出液のSDS−PAGE/イムノブロット法を行った。SDS−PAGE[Laemmli, et al., Nature 227:680-685(1970)]で分離した後、定法に従いニトロセルロース膜(アマシャム社)に転写した。転写後、膜を5%スキムミルクで30分間ブロッキングし、次いで、TBSで1,000倍に希釈されたマウスのベクターマダニのガレクチン組換え体タンパク質免疫血清と1時間反応させた。TBSTで洗浄したのち、免疫血清と結合したタンパク質を検出するために、アルカリホスファターゼ標識された抗マウス−IgG抗体(カッペル社)と1時間反応させ、結合したタンパク質を基質NBT/BCIP(ギブコBRL社)を用いて可視化した。その結果、マウス血清と反応する約36Daの単一バンドが確認され、マダニ抽出タンパク質中の内在性ベクターマダニのガレクチンを同定することができた。
フタトゲチマダニの成ダニを、リン酸緩衝液(PBS)にパラホルムアルデヒドを4%になるように調製した溶液で、虫体を固定し、定法に従ってパラフィン切片を作製した。キシレン・アルコール系列を通した組織切片を、10%正常ヤギ血清で30分間ブロッキングした。組織切片にPBSで100倍に希釈されたマウスのベクターマダニのガレクチン組換え体タンパク質免疫血清と一晩反応させた。PBST(PBS-Tween20)で洗浄した後、免疫血清と結合したタンパク質を検出するために、ビオチン標識された抗マウス−IgG抗体(カッペル社)と20分間反応させた。PBSTで洗浄した後、ペルオキダーゼ標識されたアビジンを20分間反応させ、PBSTで洗浄した後、基質ジアミノベンチジンテトラハイドロクロライド(シグマ社)を用いて可視化した。その結果、内在性ベクターマダニのガレクチンの局在を示す陽性反応は、全身性に確認され、特に中腸上皮での最も強い反応が確認された。
ベクターマダニのガレクチンの機能を明らかにするために、酵母発現系(EasySelect Pichia 発現キット;インビトローゲン社)を用いて、組換えベクターマダニのガレクチンを作製した。メーカーの推奨するプロトコールに従ってセンスプライマー(5’- ACGGATCCATGTCAGCAAAGGTCTCAGCCC -3’;配列番号5)とアンチセンスプライマー(5’- ACGAATTCTAGGACTGCTGGTGCAGCTTGC -3’;配列番号6)とを用いてベクターマダニのガレクチンのコード領域をPCR反応にて増幅した。PCR反応物をpPIC ZBベクター(インビトローゲン社)に挿入し、酵母(Pichia pastorisGS115(インビトローゲン社)を用いて形質転換体を作製した。選抜されてゼオシン耐性形質転換体から予備的発現スクリーニングによって高発現クローンを選択し、組換えベクターマダニのガレクチンの大量精製を実施した。精製は組換えベクターマダニのガレクチンに付加されているヘキサ−ヒスチジン・タグ(His-tag)を利用して、実施例4に示した大腸菌発現の組換えベクターマダニのガレクチンの精製と同様に行った。酵母発現の組換えベクターマダニのガレクチンは分子量36.5kDaで、発現ベクターに挿入した遺伝子から推定される分子量と一致した。
ベクターマダニのガレクチンが属するガレクチンファミリーの特徴である、βガラクトシドに対する糖結合活性を調べた。はじめに組換えベクターマダニのガレクチンの血球凝集作用を、Nowak et al., Biochem Biophys Res Commun 68:650-657(1976)に従って検討した。その結果、組換えベクターマダニのガレクチンは、ウサギ赤血球を濃度依存的に凝集させ、その反応はβ-gal1.4(生化学工業)で阻害されることが確認された。次に、ラクトースをリガンドとしたアファニティ精製(生化学工業)によって、組換えベクターマダニのガレクチンはラクトースアガロースに吸着することが確認されたことから、βガラクトシド結合能の保持が確認された(図1)。図1において、レーン1は、組換えガレクチンであり、レーン2は、フコースアガロースに対する非結合画分であり、レーン3は、フコースアガロースに対する結合画分であり、レーン4は、ラクトースアガロースに対する非結合画分であり、レーン5は、ラクトースアガロースに対する結合画分である。以上より、ベクターマダニのガレクチンは糖結合能を有していることが明らかとなった。
組換えベクターマダニのガレクチンと馬バベシア原虫表面タンパク質との結合活性は、インビトロ(In vitro)で培養した馬バベシア原虫[バベシア エクイ(Babesia equi)]の宿主赤血球内ステージのメロゾイト期虫体を用いて調べた[Avarzed et al., J. Clin. Microbiol 36:1835-1839(1998)]。すなわち、4%トリトンX−100で処理したバベシア原虫の可溶性抗原(及び、コントロールとして、赤血球膜のタンパク質)をSDS−PAGEで分離後、ポリビニリデンフルオリド膜(PVD;ミリポア社)に転写した。膜を5%スキムミルクで30分間ブロッキングし、次いで、組換えベクターマダニのガレクチン(His−tagを含む)と反応させた。結合能を示す陽性反応は、西洋ワサビ標識His−tag抗体(ナカライ)及びDAB(3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride;シグマ社)を用いて可視化した。また、前記ガレクチンを反応させることなく、バベシア原虫の主要表面抗原であるEMA2抗原[Huang X et al., J Clin Microbiol. 41:1147-1151(2003)]を認識する一次抗体と、西洋ワサビ標識抗マウスIgG抗体とを順次反応させ、陽性部位を可視化した。更に、対照として、溶血させたウマ赤血球から得られた赤血球膜を用いた。
Claims (10)
- 以下のポリペプチド(a)〜(d)からなる群から選んだポリペプチド:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド;
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を示すポリペプチド;並びに
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 以下のポリヌクレオチド(A)及び(B)からなる群から選んだポリヌクレオチドである、請求項2に記載のポリヌクレオチド:
(A)配列番号1で表される塩基配列における129番〜1097番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド;及び
(B)配列番号1で表される塩基配列における129番〜1097番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 請求項2又は3に記載のポリヌクレオチドを含む組換え体分子。
- 請求項2又は3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2又は3に記載のポリヌクレオチドを含む組換え体細胞。
- 請求項6に記載の組換え体細胞を培養し、その培養物から請求項1に記載のポリペプチドを採取することを特徴とする、前記ポリペプチドの製造方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドを認識する抗体又はその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体である、請求項8に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び
前記ポリペプチドのガレクチン活性を分析する工程
を含む、前記ポリペプチドのガレクチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
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