JP2811190B2 - ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はウシマダニ（Boophilus microplus）から単
離された抗原、該抗原をコードする遺伝子、および該遺
伝子の蛋白質産物に関するものである。該抗原はワクチ
ンとして牛へ投与される免疫原として一部又は全部が用
いられた時ワクチン接種された牛に寄食したダニを障害
する能力のある免疫応答の牛による生産をもたらし、残
存するダニを減少させおよび／またはダニの生殖能力を
遺伝子によってコードされた抗原が該ダニに対して効果
的ワクチンとして用いられる程度に減退させる。 背景技術 ウシマダニ（Boophilus microplus）のようなダニに
よる最初のインフェステーションにおいて、牛のような
動物がそのような寄生動物に非常に感染されやすい。寄
生するダニの幼虫の通常約50％が充血成体として事実上
落下するようなライフサイクルを完遂する。この寄生動
物に長期間さらされると、牛は、それに対する幾らかの
免疫抵抗を獲得するが、この抵抗は牛生産に対する商業
的に重要な損失が依然起きうる比較的固定したレベルに
至っている。生産に対する損失はこの寄生動物に寄食さ
れる間、血液、および組織液を吸い取られた損失による
所が大きい。付随的損失は動物が自然の免疫性と連絡し
たダニの唾液およびセメント質抗原に対して発展させて
来た過敏又はアレルギー応答、即ち、ダニ苦労（tick w
orry）として知られた状態によるものである。 多くのアプローチがダニを制御するため利用されてい
る。最も広範に用いられているものは、ダニを殺す化学
物質、即ち、ダニ駆除剤により処理することである。例
えば、化学物質に対する抵抗はダニ量を増加させ、かつ
新たな種類の化学物質はしばしば導入しなければならな
い。この化学物質はほとんど残存効果を持たないので、
牛は効果的にダニを駆除するために頻繁に処理されねば
ならない。この化学物質は、牛、人体、および環境に有
害な影響を与える。ダニを駆除するための第２の方法は
宿主の抵抗を作り出すことである。ゼブ種およびゼブ交
配種は高度に感染し易い英国種に比べダニに対する抵抗
が強い。しかしながら、ゼブ交配種は純英国種に比べて
生産量が少なく、しかも、化学物質の使用によるダニに
対する抵抗の程度は理想から程遠いものである。ダニ駆
除の他の方法として、牧草の交替、ダニの根絶がある
が、これらは世界を通じて大部分の牛生産地域において
現実的問題となっている。ダニに対する効果的ワクチン
がダニ制御の現代的に有用な方法に対して非常に魅力的
な選択の道を提供する。 ダニに対して動物を免疫するという間欠的な試みが過
去行なわれた。（後述の参照文献１−5,復習の為には13
を参照）これらの研究の大部分はダニ−宿主系を用いた
ものであり、この系において強い免疫性が自然に発展す
ると考えられ、また、通常、宿主として実験動物が用い
られている。通常、観察される効果は飽食（充血）体重
および成虫ダニの卵重量の減少であり、また、２つのリ
ポート（3,4）において飽食する成虫の生存能力の減退
を報じているが、これらの印（１〜５）の生存能力の減
退である。これらの研究の多くは自然に免疫性をまねる
ことを試みるため唾液腺由来の抗原を用いたものであ
る。しかしながら、自然の免疫性をまねたワクチンは一
度自然の免疫性が表現されてもなお生じる経済的損失お
よびダニに対する過敏応答の有害な影響に起因する多大
な商業的利益があるとは考えられそうにない。 選択すべきアプローチは「隠された」または「新し
い」抗原で動物にワクチンを接種することである。この
「隠された」または「新しい」抗原とはそれらの動物に
ワクチンを接種するために（部分的に、または十分に精
製した形で）用いられる時動物に防衛的な免疫応答を生
起させるために利用できる寄生動物の成分であって、自
然に獲得された免疫性において包含される抗原ではな
い。 隠された、又は、新しい抗原を用いたダニに対するワ
クチン接種の成功例が報じられている（2,5）。動物は
ダニ全体またはダニの中腸から抽出された物で免疫され
た。免疫は飽食重量、寄食期間、卵重量および卵生存能
力の減少をもたらすが、重要なダニの死の増加は観察さ
れなかった。しかしながら、これらの実験に用いられた
抗原分画は非常に複雑であったため、観察された効果を
与える固有のダニ抗原を同定することができなかった
し、その効果の理由は詳細に研究されなかった。 最近の特許願（オーストラリア特許願No.86−59707）
において、ダニのシンガングリア（synganglia）由来の
抗原がダニのインフェステーションに対して効果的なワ
クチンとして機能することができることをクレームに開
示している。しかしながら、その特許にはシンガングリ
ア抗原が単独で効果的であるという証明がない。この仕
事では、切開した腸およびシンガングリアを単離し、腸
細胞を溶解し、遠心して上清とペレットをある場合に
は、シンガングリアの細胞懸濁液と一諸に同じ動物にワ
クチン接種をするために用いた。報じられた実験の全て
の牛はダニの腸成分および幾つかの付加的に受容された
シンガングリアでワクチン接種された。従って、ここで
およびCSIRO特許願（85−45963）で述べている腸細胞抗
原のようなダニの腸成分に対する免疫応答の結果として
の腸障害は、シンガングリアー特異抗原に対する免疫応
答からに因る可能性がある任意の２次的な防衛的効果に
実質的に必須である物であると実験的考察において明確
に暗示される。 上述の引用した例の全てにおいて、ワクチン接種に用
いられたダニ抽出物は、非常に複雑なものである。この
報告の大部分において、用いられた抽出物はダニの器官
の均一物およびある場合には、遠心分離によりそれから
得られたペレットである。上述及びその他の研究におい
て、分画物の複雑性のデータは報じられていないが、そ
の分画物には数百、あるいは推定数千の成分を含有する
ことは確かなことである。免疫能力のある分画の精製及
び特徴化が（オーストラリア特許願No.85−45936）行な
われているが、その高度に精製した分画、GF5/6でさえ
後述するようになお非常に複雑なものである。また、こ
の研究からは防衛的免疫応答を与えるこの画分の固有の
成分（あるいは諸成分）を同定することは不可能であ
る。本発明においてはそのような抗原を精製及び特徴化
している。 ウシマダニ（Boophilus microplus）は特に、取り組
みべき問題を提供している。自然に獲得された免疫性は
単に部分的に効果があるに過ぎないので人口的免疫化に
よる自然の免疫性の複製は、比較的商業的価値はほとん
どないだろう。ウシマダニは牛の寄生動物であり、容易
には実験動物に寄生しない。ウシマダニに対する「非自
然免疫性」を導入する可能性が調べられ、示されている
（6,7,8,オーストラリア特許願No.85−45936）。しか
し、この実現的研究には第１段階としてその抗原、即
ち、信頼性ある抗原を単離すること、および、第２段階
として、商業的使用に十分な量を提供できる効果的抗原
を生産する方法の発展性を必要としている。 問題となっている抗原の精製の第１段階及びこれら抗
原の有効性の証明はすでに記載されている（オーストラ
リア特許願No.85−45936）。要約すれば、牛から採取さ
れたダニを破砕し、超音波で処理し、表皮及び破片を低
速遠心にて除去し、その上清を100000×ｇ、１時間の高
速遠心にかけて、膜リッチのペレットを非イオン界面活
性剤で抽出する。その抽出物をひき続きセファクリルＳ
−300カラムクロマトグラフィーにかけ、次いで、広範
囲な等電点電気泳動、次いで、狭範囲等電点電気泳動お
よびHPLCによるゲルロ過クロマトを行なう。各ステップ
で得られた分画を免疫原としての有効性を試験し、最も
高度な防衛的免疫性を示す画分を次の精製段階へ進ませ
る。この最も高度な防衛的免疫性を示す画分は膜質のも
のであり、等電点（P^I）から5.05から5.65の範囲でかつ
分子量が205から79キロダルトンの範囲であると同定さ
れた。他の量は少ない高度な防衛的免疫性を示す画分も
すでに記載され、先のオーストラリア特許願85−45936
と共に興味がある。 本発明に記載される精製法の更なる進展は、最も高度
な防衛的免疫性を示す抗原を一層明確に定義すると共に
一層正確に特徴化し、更に高度に精製された免疫原調製
により動物のワクチン接種を可能にする。このような抗
原の一つは、ほとんど均一に精製され、このダニ成分で
牛をワクチン接種すると免疫応答はこの牛に寄食するダ
ニの大部分を死に至らしめるように機能することが示さ
れた。ダニから単離されたこの抗原は分子量が約89キロ
ダルトンであり、かつ等電点が5.30から5.67の範囲の糖
蛋白質であることが示された。この糖蛋白質（後述のWG
L⁺抗原あるいはWGL⁺として言及されている）の精製法
は、改善されたものであり、本発明に開示されている方
法は以前に記載された方法（オーストラリア特許願No.8
5−45936）により得られる抗原より一層多くの収量をも
たらす。本発明および従来の研究において、防衛能を与
える他の画分が同定されている。 本発明法によってWGL⁺抗原をより多量得られるが（商
業的使用には不十分）、抗原の蛋白質部の各部分の構造
を分析するため実験が行なわれた。精製調製品を還元、
カルボキシメチル化し、エンドプロティナーゼlyc−Ｃ
で消化した。生成したペプチド断片を精製し、幾つかの
ペプチドの該部分アミノ酸配列を決定した。このアミノ
酸配列データはWGL⁺抗原をコードするcDNAを含有するバ
クテリア細胞を単離するため用いられるオリゴヌクレオ
チドの形成を可能にした。バクテリア細胞からのDNAの
分析は、一つの防衛能のある抗原をコードする遺伝子を
明確に同定し、かつダニに対する効果的ワクチンとして
用いられる組換え蛋白質の生産を可能にする。これらの
進展が本発明の目的である。 （定義） 本発明はダニのインフェステーションに対する牛の防
衛に適切な産物と方法を提供することにあるが、本発明
の原理はダニのインフェステーションに対する他の動
物、例えば、馬、鹿、ヤギ、ヒツジ、犬、猫および豚の
防衛に同等に適用され得ると考えるべきである。 世界に分布するダニ集団は生殖する全ての有機体がそ
うであるように遺伝的に多様である。集団の各個体はそ
の集団の他の個体と若干異なり、これらの相違は各個体
がその両親から受け継いだDNA配列における相違の結果
である。 更に、有性または無性生殖生物に起こる偶発的突然変
異が遺伝的多様性の源となる。 従って、特別な蛋白質をコードする各遺伝子が、個体
の集団間でその遺伝子配列が異なることが考えられる。 その様な関連分子は本発明においては、本発明による
抗原の相同蛋白質としておよび本発明の範囲に含まれる
ものと定義された免疫原の諸機能を発揮する範囲に言及
される。 相同抗原は進化に関連した抗原であって、必ずしも機
能に関連した抗原ではない。近似するが必ずしも一致し
ないDNAまたは蛋白質の配列が提供される。しかし、こ
の意味における機能は自然のインビボ（in vivo）にお
ける蛋白質の機能と関連するものである。 この点の説明は下記の考察により得られよう。 1. ウシマダニおよび他のダニ種からのWGL⁺ 2. ウシマダニ集団の変体あるいは異なる個体からのWG
L⁺ 3. WGL⁺及び本発明で定義したWGL⁺抗原の相同抗原であ
るダニからの関連腸細胞原形質膜糖蛋白質。 本発明の目的のため、相同抗原は本発明で定義された
免疫原と同じ機能を有するWGL⁺関連原形質膜糖蛋白質の
み含むことが強張される。 その様な相同WGL⁺関連原形質質膜糖蛋白質は世界中の
ダニ集団に存在し、ダニのインフェステーションに対す
る商業的に用いられるワクチンの範囲でそのワクチンに
含有させた時、ダニを殺生する能力のある免疫応答を引
き出す能力があり、それはダニの腸を障害することによ
りなされるが、付加的にダニの飽食体重の減退をもたら
し、あるいはダニの卵生産を減少させる様な方法で生き
残っているダニに障害を与えるものである。例えば、そ
のようなダニとしては、Boophilus spp,Haemaphysalis
spp,Otobius spp,Rhiphicephalus spp,Ambylomma spp,D
ermacentor spp,Ixodes spp and Hyalomma spp,が挙げ
られ特にＢ．annulatus，Ｂ．decoloratus，Otobius m
egnini，Rhiphicephalus appendiculatus，Dermacento
r andersoni, Ｄ．variabilis，Haemaphysalis longic
ornis，Ambylomma variegatumおよびIxodes holocycl
usである。 更に、進化あるいは必然的な構築によりWGL⁺抗原に関
連しない化学物質を生じる可能があるが、WGL⁺抗原上の
エピトープに対する免疫応答を生じる免疫原としてか
つ、それにより効果的なワクチンとして機能すると考え
られるべきである。これらの分子は本発明において相似
及び免疫原の機能を発揮する範囲として言及している
が、これらは本発明の範囲内である。このような相似は
WGL⁺分子のアミノ酸骨格の部分に対応する配列を有する
化学的に合成されたオリゴペプチド分子、免疫原として
用いた時、ダニの本来のWGL⁺抗原を認識する免疫応答を
引き出すオリゴペプチド、抗原として用いた時ダニのWG
L⁺抗原を認識する免疫応答を引き出す任意の源からの炭
水化物構造、およびWGL⁺抗原のエピトープ（複数も含
む）を認識する抗体の可変領域に対して生じる抗イディ
オタイプ抗体を包含する。 （発明の開示） 第１の態様では、本発明は、ダニ種あるいはダニ細胞
系由来の免疫原が投与された哺乳動物宿主のダニのイン
フェステーションに対する免疫を引き出す能力を有する
抗原からなる該免疫原において、該免疫が該宿主を寄食
したダニの腸細胞の原形質膜を障害して、ダニの大部分
を成虫段階で死滅させるか、あるいは、生き残ったダニ
を赤色にし、かつ該生き残ったダニの生殖能力を実質的
に減退させる免疫応答を該哺乳動物宿主に生じさせるも
のであり、該免疫原が該抗原の、部分、相似抗原、相同
抗原、誘導体およびこれらの組合せを含む該抗原に対し
て類似する免疫学的活性を示す免疫原を含むことを特徴
とする免疫原を提供することにある。 抗原は好ましくは、ウシマダニ（Boophilus microplu
s）の由来のものである。 好ましい態様において、誘起される免疫はBoophilus
種のインフェステーションに対する免疫である。 誘起される免疫は更に好ましくは、B.microplusのイ
ンフェステーションに対する免疫である。 また、免疫は他のダニ種、例えば、Haemaphysalis sp
p,Otobius spp,Rhiphicephalus spp,Ambylomma spp,Der
macentor spp,Ixodes sppおよびHyalomma spp,および特
に他のBoophilus種、例えば、B.anulatusまたはB.decol
otusに対して誘起される。 免疫が誘起される他のダニ種の好ましい種として、Ot
obiusmegnini,Rhiphicephalus appendiculutus,Dermace
ntor andersoni,D.rariabllis,Haemaphysalis longicor
nis,Ambyloma variegatumおよびIxodes holocyclusが含
まれる。 他のダニ種例えば、Boophilus spp,Haemaphysalis sp
p,Otobius spp,Rhiphicephalus spp,Ambylomma spp,Der
macentor spp,Ixodes sppおよびHyalomma spp,から単離
される関連抗原によって免疫することによって、他のダ
ニによるインフェステーションに対する免疫もまた誘起
される。関連抗原が単離される好ましい種として、B.an
nulatus,B.decoloratus,Otobius megnini,Rhiphicephal
us appendiculutus,Dermacentor andersoni,D.rariabil
is,Haemaphysalis longicornis,Ambylomma variegatum
およびIxodes holocyclusが包含される。 ダニのインフェステーションに対して防衛することに
より、該抗原はたる作因によって起こる病気、例えばBa
besia bvis,Babesia bigemina,Anaplasma marginale,Co
wdriaruminantiusn,Theileria parva parva,T.parva la
wrencii,T.annulataおよびT.hirciに対する防衛をも提
供することができる。 本発明は、第２の態様において、本発明による免疫原
のアミノ酸配列をコードする配列として機能する第１の
ポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列を
提供し、該第１の配列にハイブリッド形成するポリヌク
レオチド配列または該第１の配列に関連したポリヌクレ
オチド配列または１個または複数の塩基の置換、欠失、
挿入および逆位を含む突然変異によるハイブリッド形成
する配列を提供する。 該ポリヌクレオチド配列は好ましくはDNA配列であ
る。 本発明の更に好ましい形態においては、該DNA配列はc
DNA配列である。 ウシマダニから単離される防衛的抗原の一部または全
部をコードするDNA配列は、DNAハイブリッド形成におい
て、他のダニ種からの関連DNA配列を同定するため用い
ることができる。これら後者のDNA配列は遺伝子工学の
技術により構成でき、他のダニ種からの抗原の全部又は
一部を、バクテリア細胞または真核細胞、例えば、酵
母、植物、昆虫、ダニまたは哺乳動物の細胞系によって
発現させることにより得られ、それらダニ種に対する効
果的ワクチンを提供でき、それにより人に対する病的状
態の損失あるいは経済的損失または動物に対する病的状
態の損失および生産的損失を回避するものである。 本発明は、また、本発明による少なくとも１つのDNA
配列およびベクターDNAからなる組換えDNA分子を提供す
るものである。 ベクターDNAの好ましい形態はプラスミド、ファージ
またはウィルスDNAからなるものである。 好ましいベクターとしてラムダgtll,pUR290,pUR291,p
UR282,pUK270,pUC8,pUC9,バキュロウィルス、pZipNeo、
SV40ベースベクター、ラムダgt10,EMBLベクター、pBR32
7,pBR329,または等価な遺伝子座を含有するpBR329が包
含される。 本発明は更に形質転換細胞系を提供し、該細胞系は本
発明による少なくとも１つの組換えDNA分子を担持する
ものである。 更に本発明の態様は、本発明の少なくとも１つの免疫
原と薬理学的に許容なキャリヤー、アジュバント、免疫
増強剤あるいは希釈剤とからなるワクチンを提供するも
のである。 本発明によるダニ種由来の抗原は精製および特徴化さ
れたものであり、牛にこのワクチン接種を施した時、ダ
ニの寄生に対して高度な免疫を誘起させることができ
る。 更に、ダニ種由来のDNA配列を含有するバクテリア細
胞を作り、ダニ種の防衛的抗原の部分をコードするDNA
配列を含有するバクテリア細胞を同定した。該抗原をコ
ードするダニの遺伝子のDNA配列を決定し、この抗原を
用いて他のダニ種からのその関連遺伝子を含有するバク
テリア細胞を更に同定した。該抗原または抗原の一部は
バクテリアまたは他の微生物あるいは真核細胞、例え
ば、酵母、昆虫、ダニ、植物および哺乳動物などの細胞
をin vitroで生育して発現させることにより、ウシマダ
ニおよび他のダニ種のインフェステーションに対する牛
および他の家畜の防衛のための免疫原として有効な抗原
を大量に得ることができる。 また、本発明は防衛的免疫応答を与える本発明の免疫
原の単数または複数のエピトープをも本発明の範囲内に
含む。これらのエピトープはオリゴヌクレオチドの合成
的生成により人工的に作ることができるが、該オリゴヌ
クレオチドは該抗原の配列部分を含むものであり、この
ような配列部分はバクテリアで生産された抗原の断片、
または本来のペプチドまたは組換えペプチドの化学的ま
たは酵素的切断の結果得られる断片の免疫化学的試験の
結果から推定できる。また、これらのエピトープはそれ
らの抗原、オリゴペプチド、イディオタイプおよび抗イ
ディオタイプからの関連したエピトープを含みこれは、
それらのエピトープに類似するか、それらのエピトープ
を認識し、能動的または受動的に動物をこれにより免疫
した防衛的効果を有することができる。 更に本発明の態様は、本発明による抗原、特に、ダニ
由来の防衛的抗原の精製方法を提供する。 本発明は小麦胚レクチンまたは小麦胚レクチンと同一
あるいは類似の末端糖の特異性を有するレクチン上で実
施されるクロマトグラフィーの段階からなる免疫原の調
製方法を提供する。 本発明は好ましくは、均質化されたダニから得られた
膜リッチな画分を界面活性剤により抽出すること、およ
び該可溶化物質を小麦胚レクチンセファロースクロマト
グラフィーにかけてＮ−アセチルグルコサミンによる溶
離、または小麦胚レクチンまたは小麦胚レクチンに対し
て同一または類似の末端糖の特異性を有するレクチンを
用いたクロマトグラフィーにかけることからなる免疫原
の調製方法を提供する。 該界面活性剤は、好ましくはNP40,NP40誘導体、ツウ
ィッタージェント（Zwittergent）３−14またはSDSから
選択される。 該調製方法は更に、コンカナバリン−Ａセファロース
クロマトグラフィーおよびメチル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシドによる溶離、調製的等電点電気泳動段階またはサ
イズ排除クロマトグラフィーを含んでもよい。 該調製方法の好ましい形態は、ダニのホモジネートを
調製、膜リッチ画分を得るための遠心分離、ツウィッタ
ージェント３−14のような界面活性剤でそれらの膜を処
理すること、小麦胚レクチン−セファロース6Bカラムの
ようなレクチンアフィニティ−カラムでの界面活性剤可
溶物質のクロマトグラフィー、ツウィッタージェント３
−14のような界面活性剤含有緩衝液中の等電点電気泳動
によってレクチン結合抗原を分離すること、一連の界面
活性剤含有緩衝液におけるBio−Sil TSK4000およびPP30
0SWカラムのようなカラムでのサイズ排除HPLCによるこ
れら抗原のクロマトグラフィーおよびSDS電気泳動によ
り得られた種々の画分の分析を包含する。 また、本発明は本発明法により得られた抗原を提供す
る。 本発明は天然物質を精製計画に従って実施して得られ
る抗原、および組換えDNAまたは化学的合成方法の結果
得られる組換えまたは合成免疫原も各々本発明に従う方
法によって得られる免疫原の範囲に含まれる。 更なる態様において、本発明はエンドlys−Ｃのよう
な蛋白質分解酵素で精製抗原を処理する方法例、蛋白質
分解酵素消化により得られたオリゴペプチド断片をAqua
pore RP−300 C8またはAqapore RP−318カラムのような
カラムでのHPLCクロマトグラフィーによって精製するこ
とおよびこのようにして提供および精製されたオリゴペ
プチドのアミノ酸配列の幾つかを欠撤することを提供す
る。 本発明は更に下記ペプチド断片のようなペプチド配列
情報を提供する。 注：信頼性の低いと考えられるアミノ酸は括弧に入れて
示した。Ｘはこの位置に帰すことのできるアミノ酸を示
していない。［］は混合された配列を示す。 本発明の好ましい態様では、以下のペプチド配列であ
る。 F1 KDPDGK F2,F11 KWYEDRVLEAIRTSIGK F3,F17 KLQACEHPIGEWCMMYPK F4 KEAGFVCK F5 KGPDGQCINACK F6 KAGVSCNENEQSECADK F8 KDQEAAYK F9,F10 KCPRDNMYFNAAEK KANCQCPPDTKPGEIGCIE KANCQCPPDTRPGEIGCIE F12 AESSICSDFGNEFCRNAECEVVPG F13 KTRECSYGRCVESNPSK F14 KAYECTCPRAFVAEDGITCK KAYECTCPSGRTVAEDGITCK F15 KNLLQRDSRCCQ F16 KGTVLCECP 本発明は又それらのアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドをコードする核酸配列を同定するためのハイブリッ
ド形成プローブとして用いるために適切なオリゴヌクレ
オチド配列をそのアミノ酸配列データからデザインする
ため利用できる方法例は、ダニからの相補DNAおよびゲ
ノムDNA断片を含有するバクテリア細胞の構築方法、該
抗原をコードする相補およびゲノムDNA断片を含有する
バクテリア細胞を同定するためのオリゴヌクレオチドの
利用、そのようなcDNA断片のDNA配列、組換えDNA技術を
用いてその蛋白質の全部又は１部を合成するバクテリア
又は真核細胞を得ることのできる方法およびそれらの細
胞を培養する方法およびダニに対する効果的ワクチンに
含有されるダニ抗原またはその一部の精製方法を提供す
る。 該ワクチンの作用機構の好ましいモデルにおいて、免
疫応答がワクチン接種された動物に誘起され、抗体のよ
うな宿主免疫系の成分を接種したダニの腸細胞の表面と
この成分が相互作用することにより、および該成分単
独、またはこの成分と宿主血液の補体成分のような他の
因子と相互作用することにより、ダニは効果的に血液を
消化することができなくなり腸細胞の溶解のような障害
を起こすが、これは該ダニの腸は宿主血液成分に対して
透過可能になるためで、この血液成分、アルブミン、ヘ
モグロビン、免疫グロブリンおよび血液細胞がダニの血
リンパ中に同定され、ダニは赤色を呈している。一方、
このダニの障害は充血段階前にワクチン接種された動物
に寄食したダニの大部分を死に至らしめ、少数の生き残
ったダニは非常に強く障害を受けているので、ダニの充
血体重は減少しおよび／またはダニの生殖能力が減退す
る（6,7,8）。 本発明は又本発明の抗原のエピトープに対して生じる
抗体（即ち、イディオタイプ抗体）およびそれら第１抗
体の可変領域に対して生じる抗体（即ち、抗イディオタ
イプ抗体）に関し、この後者の抗体は抗原のエピトープ
に類似するものである。本発明は効果的ワクチンとして
の動物の受動的防衛（イディオタイプ）または、動物の
能動的防衛（抗イディオタイプ）に用いることができ、
これにより効果的な防衛をもたらす。 （図面の簡単な説明） 第１図は「IEF後のWGLプール」および「IEF後のLLプ
ール」の単離方法を示す図である。 第２図は「LL⁺抗原」単離のための分画法を示す図で
ある。 第３図は「WGL⁺抗原」単離のための分画法を示す図で
ある。 第４図はWGL⁺およびLL⁺抗原単離のための精製法を簡
明に示した図である。 第５図はWGL⁺抗原の純度を示す。 第６図はcDNA合成のフローダイアグラムを示す。 第７図はWGL⁺遺伝子のDNA配列を示す。 第８図はDNA配列から導かれるWGL⁺抗原の翻訳アミノ
酸配列を示す。 第９図は発現計画例を示すWGL⁺遺伝子部分の制限酵素
地図である。 第10図はバクテリアによるWGL⁺発現を証明するSDSポ
リアクリルアミドゲルおよびイムノブロットを示す。 第11図はWGL⁺をコードするウシマダニDNAと他のダニ
種からのDNAとのハイブリッド形成を示す。 （発明を実施するための最良の形態） 以下、実施例に従って本発明を更に詳述するが、本発
明はこれに限定されるものではない。 試剤元 Sephacryl（セファクリル） Sepharose6 MB（セファロース6MB） Zwittergent3−14（ツウィッタージェント３−14） Sephadex（セファデックス） Brij35（ブリッジ35） Bio−gel（バイオゲル） 臭化シアン Sarkosyl（サルコシル） エンドプロテナーゼlys−ｃ トリフルオロ酢酸 HFBA アセトニトリル HPLCカラム ポリＵセファロース オリゴdTセルロース dATP,dCTP,dGTPおよびdTTP³² P−ラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸 スペルミジン PEIセルロース コンカナバリンＡ−セファロース CNBr−セファロース Pharmacia（ファルマシア） ファルマシア Calbiochem（カルビチオエム） ファルマシア Sigma（シグマ） Bio Rab（バイオラット） Sigma又はAjax（シグマ又はアジャックス） シグマ Bcehringer（ベーリンガー） Pierce（ピアス） ピアス Mallinckrodt（マリンクロット） Waters（ウォーターズ），バイオラット,Beckman（ベッ
クマン） 共同研究 共同研究 ベーリンガー Amersham（アマーシャム） Calbiochem Merck（メルク） ファルマシア ファルマシア 他の用いられた化学物質は試薬級のものである。 略語 HPLC 高速液体のクロマトグラフィー SDS ドデシル硫酸ナトリウム EDTA エチレンジアミン四酢酸 WGL 小麦胚レクチン WGL1 抗原プール１結合小麦胚レクチン WGL2 抗原プール２結合小麦胚レクチン WGL⁺ 小麦胚レクチン結合抗原 WGL^- 小麦胚レクチン非結合 IEF 等電点電気泳動 LL ヒラマメレクチン LL⁺ ヒラマメレクチン結合抗原 LL^- ヒラマメレクチン非結合 HEPES N−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２
−エタンスルホン酸 エンドlys C エンドプロティナーズlys C DTT ジオチスレイトール pI 等電点 HEBA ヘプタフルオロブタン酸 BSA 牛血清アルブミン MMLV ネズミ科マロニー白血病ウイルス dNTP デオキシヌクレオチド三リン酸 dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアニジン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 ｄ（GTC）TP dGTP,dCTPおよびdTTPの混合 NAD ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド ATP アデノシン三リン酸 PEI ポリエチレンイミン BRL ベセスダリサーチボラトリーズ IBI 国際バイオテクノロジー Inc. A260,A280 260または280nmでの吸光度 cDNA 補助DNA dS ２重鎖 g グラム gav 平均重力単位 m,μ,n,p （接頭辞）ミリ，マイクロ，ナノ，ピコ M グラム分子 l リットル U 活性単位（制限酵素） bp 塩基対 kb キロ塩基対（千塩基対） TCL 薄層クロマトグラフィー ELISA イライザ 緩衝液 10×第１成分 0.5Mトリス pH7.5 0.75M KCl 0.03M MgCl₂ ５×第２成分（RNaceH） 0.2M トリス pH7.5 0.05M MgCl₂ 0.1M（NH₄）₂SO₄ 1M KCl 1.5mm B−NAD 10×メチラーゼ緩衝液 0.5M トリス pH7.5 0.01M EDTA 0.33M トリス−酢酸pH7.9 0.66M 酢酸カリウム 0.1M 酢酸マグネシウム ５×キナーゼ緩衝液 0.05M トリス pH7.5 0.05M MgCl₂ 0.05M DTT 0.5mM スペルミジン 10×ライゲーション緩衝液 0.3Mトリス pH8 17mM EDTA 70mM MgCl₂ 10mM ATP 0.1M DTT 10μg/ml BSA 1mM スペルミジン 10×高温緩衝液 1M NaCl 0.5M トリス p7.5 0.1M MgCl₂ 10mM DTT 10×Sl緩衝液 0.3M 酢酸ナトリウム pH4.4 2.5M NaCl 10mM ZnCl₂ 10mM トリス pH7.5 1mM EDTA TE 10mM トリスpH7.5 1mM EDTA PEIセルロース緩衝液 0.75M KH₂PO₄ pH3.5 緩衝液Ａ 0.05M トリス 0.03M 酢酸 0.1M NaCl TEAB緩衝液 TEABは溶液にW₂を吹き込むことによってpH7に平衡化
されたトリエチルアミン溶液である。これは1M溶液とし
て４℃下貯蔵される。このpHは使用前にチェックされ、
必要ならばCO₂ペレットで再平衡化される。 実施例１ （ａ） 少なくとも幾つかの防衛的抗原が糖蛋白質であ
ることの証明 原形質膜蛋白の大部分が糖蛋白質であるため、レクチ
ンアフィニティで濃縮された防衛的抗原の特徴化が第１
に試みられる。小麦胚レクチンおよびコンカナバリンＡ
はダニ抗原調製成分B4/B5を結合することが分った。従
って、ダニ調製抗原の幾つかはＮ−アセチルグルコサミ
ン残基を有していると考えられた。小麦胚レクチンは精
製計画において、他の同一又は類似の末端特異性を有す
るレクチンと代替されうる。 約2.1mgの抗原B4/B5は狭範囲等電点濃縮（オーストラ
リア特許願No.85−45936号に記載）により精製され、こ
れを0.05Mトリスクロライド緩衝液中１％ツウィッター
ジェント３−14、pH8中MGL−セファロース6MB（14）カ
ラムにかけ、同一の緩衝液で洗浄した。結合糖蛋白質を
次いで該同一緩衝液に100mg/mlのＮ−アセチルグルコサ
ミンを含む溶液にて溶離した。結合および非結合物質を
用いて羊に免疫した（グループ当り５頭用いてフロイン
ド不完全アジュバンド下２回ワクチン接種した）。誘起
された免疫の測定は、脱皮したばかりの成虫のダニを羊
に付着させ、３日後その皮膚に付いているダニの数に対
して、充血に成功したダニの割合を算出した（表１）。 表１ 糖蛋白質調製品による羊の免疫 グループ 充血したダニの割合（％） コントロール 100,100,100,100,100 WGL非結合物質 100, 6, 93,100,100 WGL結合物質 0, 93, 0, 83, 28 ワクチン接種されたグループの幾頭かはダニの寄生に
対して高度に防衛されたことが明らかである。ダニの寄
生前にワクチン接種後、各羊から血清を得て、ワクチン
に用いた抗原に対する各該血清試料の抗体力価をラジオ
イムノアッセイにて測定した。ダニの障害を示した各グ
ループの動物は投与された抗原調製品に対して高抗体力
価を有した。一方、障害の見られなかった充血したダニ
の大くを許容した動物は低い力価しか有しなかった（デ
ータは示していない）。防衛的抗原はこの実験の両画分
に存在したと考えられるが、幾頭かに見られたダニへの
障害の失敗は、目下不明確な理由のためワクチン接種に
対して積極的に応答したためである。 （ｂ） 羊での一連の実験において、画分GF5および
６、即ち、更に高度に精製したゲルロ過画分（オースト
ラリア特許願No.85−45936号）をWGL−セファロースア
フィニティカラムクロマトグラフィーにかけ、特異的に
結合したおよび結合しなかった物質を上述と同様に羊に
ワクチンを接種するために用いた。再び、各グループの
幾頭かの動物に対して各画分のワクチン接種を施して誘
起された免疫応答のダニへの障害能力を（残存率％）赤
色を呈した割合（障害％）生き残ったか充血したダニの
平均体重において評価したが、免疫応答したものは残存
率、 特に、アフィニティカラムに結合した物質はここで特
徴化されているが、非結合画分でも防衛能力を明らかに
示している。 （ｃ） 上述と同様な試験を牛にWGL−セファロースカ
ラム結合および非結合物質でワクチン接種した（表−
３）。ワクチン接種に続いて両画分により誘起された免
疫応答により寄食ダニに障害を与えた。この実験ではWG
L−セファロースカラムに結合しなかった物質が特に効
果かがあった。 注：ここでおよび後述でダニNo.とは１日当り各動物か
ら落下した充血雌ダニの平均数を意味する。ワクチン接
種後３週間、少なくとも16日間１日当り約1000の幼虫を
牛につける。ダニが成熟し、充血したダニが見られるよ
うになる時、充血ダニを各日ごとに集めて少なくとも16
日間計数する。この数はダニNo.欄に挙げたもので平均
したものである。この期間各一日において、目にみえて
障害されたダニ数（赤色ダニ）を計数し、障害（％）欄
に平均値を示した。また充血ダニの平均体重も決定し
た。 （ｄ） この実験と共にWGL−セファロースカラムに特
異的に結合した物質をSDSポリアクリルアミドゲルにて
分画した。これらゲルの銀染色は画分（S2およびS4）と
して切り出された２染色主成分を示し、また、同様にそ
の中間領域のゲル（画分S1,S3,S5およびS6）を牛へのワ
クチン接種に用いた。最も高度に免疫を示した分画はＳ
（表−４）であった。このS2はファルマシアおよびBRL
の分子量マーカーと比較するこのゲル系において約80−
90キロダルトンの見かけの分子量を有する染色ゲルに見
られるバンドの一つと一致する。 この実験において、S2でワクチン接種された牛の残存
ダニ数は他のグループと比較して減少している（ダニN
o.欄−21日間における１日および１頭当りの平均充血落
下雌ダニ数）更に、残存ダニの大部分は赤色化し、ある
いは、目視して異常（障害％）であり、S2グループの残
存ダニの体重は他のグループの動物のダニと比較して減
少していた（表−４）。 （ｅ） WGL−セファロースカラムに保存されない物質
と反応できるのはどんな範囲のレクチンであるか決定す
るためインビトロ実験を実施した。ヒラマメレクチンは
反応性があることが分った。そこで、WGL−セファロー
スに結合しなかった物質をヒラマメレクチンカラム（1
5）にて画分した。牛にこれらの画分をワクチン接種し
た所、WGLに結合されなかった物質に対して免疫応答が
あり、LL−セファロースに結合した物質はワクチン接種
の牛に寄生したダニへの障害は若干小さいことがわかっ
た（表−５）。この画分のSDSゲル分析は上述の実験で
同定したS2抗原と同じ範囲の分子量を有するバンドを示
している。 この実験に用いた両画分はこの実験において、防衛を
与える免疫応答を有する能力があった。 ヒラマメチレンクロマトグラフィー段階は小麦胚レク
チンクロマトグラフィー段階によりS2抗原と同様な分子
量を有する物質を非常に高収量で得られる。 この分子量の類似およびレクチンアフィニティにおけ
る相違は、共通のペプチド骨格と異なるグリコシル化に
関連すると考えられた。 これは、供述の通り誤りであることが分った（実施例
2g）。 S2との予想される類似性およびLL結合物質の量の多さ
のため、更なる精製のための出発物質として用いられる
と考えられた。 しかし、WGL結合物質（実施例３）を用いた効果的な
ワクチン接種に対してこの物質の薄弱な効果のワクチン
接種およびアミノ酸組成の相違の証明は、S2またはWGL⁺
物質の更なる精製計画とクローニング計画を押し進める
こととなった。 実施例２ 上述の結果として、主要防衛的抗原（S2として言及）
の等電点、分子量、およびレクチン結合特性を知ること
ができたので、単離操作の効果的改善をするため何度か
実験が行なわれた。下記の方法はS2抗原（小麦胚レクチ
ン結合抗原、WGL⁺抗原またはWGL⁺として言及）およびヒ
ラマメレクチン結合抗原（LL⁺抗原またはLL⁺として言
及）をオーストラリア特許願No.85−45936に比較し少な
くとも10倍量得ることが新たに分った。この操作の要点
を流れ図（第１〜４図）に示した。 主要防衛的抗原単離操作の改善 （ａ） ダニ膜および微粒子物質の単離および抽出雌ウ
シマダニの半充血成虫1290gを充血が完了する前に牛か
ら採取した。これらを、0.05Mトリス、0.025M酢酸、0.1
M NaCl、1mM EDTAでホモジナイズし、このホモジネート
をガーゼで大部分の外皮片を漉し、緩衝液で洗浄した。
この抽出において、ダニ1g当り3mlの緩衝液を用いた。 このダニ物質サスペンションを１当りフェニルメタ
ンスルフォニルフルオライト300mgと混合し、15分、600
×gav下遠心した。この上清を30分、20,000×gav下遠心
し、更にこの上清を１時間、100,000×gav下遠心した。
これらの遠心の各沈殿物を集め、用いるまで−20℃に凍
結した。 600×gav 20,000×gavおよび100,000×gavの沈殿物を
溶解し、緩衝液Ａ（0.05Mトリス、003M酢酸）に懸濁し
て蛋白質濃度で測定した。この懸濁液をブリッジ35含有
緩衝液Ａで希釈し、蛋白質と界面活性剤の濃度が各々５
および10mg/mlとした。ダニ物質を37℃、１時間抽出
し、20℃,30分3,300×gavで遠心した。この沈殿物を緩
衝液Ａにて再懸濁し、蛋白質濃度を再測定した。ブリッ
ジ35に代えてツウィッタージェント３−14を用い上記と
同様の蛋白質および界面活性剤濃度下抽出を繰り返し
た。抽出時間は90分まで延長した。この懸濁液を上述と
同様に遠心して上清を保存した。 （ｂ） レクチンアフィニティクロマトグラフィーおよ
び等電点電気泳動（第１図） ツウィッタージェント３−14抽出上清（3255ml）を20
℃、16時間WGLセファロース90mlと撹拌し、次いでろ過
し、このWGLセファロース複合体を18×2.5cmカラムに流
し込み、１％ツウィッタージェント３−14含有緩衝液で
洗浄し、１％ツウィッタージェント３−14およびＮ−ア
セチルグルコサミン100mg/ml含有緩衝液にて溶離した。
画分をA280吸光度をもとに小麦胚レクチン結合プール１
（WGL1）を与える特異溶離物質としてプールした。WGL
セファロースによる界面活性剤上清の吸着およびその結
合物質の溶離を上述と同様に繰り返しWGL2を得た。この
２つの溶離液をプール（WGLプール）した。 このWGLプールを２×2.5の水に対して透析し、次い
で0.1Mアンモニウムチオシアネート含有0.05Mトリス−
クロライド緩衝液pH7.5に対して透析した。コンカナバ
リンＡ−セファロース（ファルマシア）を2.5×11cmカ
ラムに流し込み、0.05Mトリス、１％ツウィッタージェ
ント３−14、0.1mM塩化カルシウム、0.1mM塩化マグネシ
ウム、0.1Mアンモニウムチオシアネート含有のHCl pH調
整pH7.5緩衝液で洗浄した。WGLプールをこのカラムにか
け、洗浄し、特異的結合物質を50mg/mlメチル−α−Ｄ
−マンノピラノシドを追加した同様の緩衝液にて溶離し
た。画分をプールし、水に対して透析し、調製用等電点
電気揺動にかけた。 等電点電気泳動は、１％（w/v）ツウィッタージェン
ト３−14および１〜15倍希釈ファルマライト４−6.5含
有IEFセフファデックスフラットベッドにて10,000Vhr実
施した。各々の画分をSDSゲル電気泳動にて分析した。
必要な蛋白質はpI5.3〜5.7の画分に存在すると考えられ
たが「IEF後WGLプール」を与えるプールはpI5.4〜5.6の
画分のみとした。 WGLセファロースを用いた２度目の抽出後残ったツウ
ィッタージェント可溶物質をLL−セファロース70mlと混
合し、20℃24時間撹拌し、この懸濁液をろ過し、集めた
セファロース複合体を2.5×14cmカラムとして流し込ん
だ。これを、次いで、トリス−酢酸、１％ツウィッター
ジェント３−14緩衝液で洗浄し、50mg/mlメチル−α−
Ｄ−マンノーピラノシド含有の上述と同様の緩衝液にて
溶離した。画分をA280を基にプール１、水に対して透析
した。更に、WGL結合物質の所ですでに記載した条件を
用いて調製的等電点電気泳動により分画した。画分をSD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。単
離される蛋白質はpI4.8〜5.2の範囲で電気泳動された
が、次の精製のためにプールされた画分はpF4.8〜5.0で
あった。 最初のアフィニティクロマトグラフィーからのLL非結
合物質を再びLL−セファロースに再吸着させ、メチル−
α−Ｄ−マンノピラノシドの特異的溶離物質をIEFにて
分離した。同じpI4.8〜5.0の範囲を有する物質をプール
し、これら２実験の精製品を混合し「IEF後LLプール」
を得た。 「IEF後WGLプール」および「IEF後LLプール」の単離
方法を第１図に説明的に示した。 （ｃ） IEF後LLプールの疎水クロマトグラフィー（第
２図） LL−セファロースの1.6×6.5cmのカラムを0.1Mトリス
−酢酸緩衝液、１％ツウィッタージェント３−14pH8.0
で平衡化した。「IEF後LLプール」をpH7.1に調整してこ
のカラムにかけ、次いで緩衝液、そして、0.1Mトリス−
酢酸緩衝液、0.1％ブリッジpH7.5で洗浄した。結合物質
を50mg/mlメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド含有0.1M
トリス−酢酸緩衝液で溶離した。 溶離物質を0.1Mトリス−酢酸−ブリッジ緩衝液に対し
て透析し、次いで酢酸アンモニウム濃度を最終0.5Mとな
るように添加した。この試料を0.1Mトリス−酢酸、0.5M
硫酸アンモニウム、0.1％ブリッジ、pH7.5で平衡化した
7.5×75mm TSKフェニル−５−PWカラムにかけた。次い
で、洗浄後、このカラムをこの出発緩衝液から0.1Mトリ
ス−酢酸、0.1％ブリッジpH7.5までの線形勾配にて溶出
した。画分をSDSゲル電気泳動で分析し、必要な蛋白部
分を「LL⁺抗原」またはLL⁺を得るためプールした。 この操作を第２図に示した。 （ｄ） IEF後WGLプールのサイズ排除クロマトグラフィ
ー（第３図） 「IEF後WGLプール」のpHを7.3に増大し、0.05Mトリス
−HCl、0.26％ツウィッタージェント３−14pH7.5で平衡
化したWGLセファロースカラムにかけた。このカラムを
0.05Mトリス−HCl、0.1％SDSで洗浄し、次いで結合物質
を100mg/mlN−アセチルグルコミサン含有トリス−HCl−
SDS緩衝液にて溶離した。画分をSDS電気泳動で分析し、
必要な蛋白含有部分をプールし、0.05Mトリス−HCl緩衝
液pH7.5で透析し、Savant Speedvac.下濃縮した。 サイズ排除クロマトグラフィーをWaters HPLC系を用
いて実施し、続いて、Si200ポリオール保護カラム（セ
ルバ、ハイデルベルグ）、7.5×30cm BiopSil TSK4000
および7.5×30cm PP300SW（ウォーター）を実施した。
クロマトグラフィーは0.05M HEPES.0.1Mナトリウムチオ
シアネート、0.1％SDS含有NaOH pH調整pH7.0緩衝液に
て、流速1ml/分およびカラム温度37℃下実施した。この
系では、牛血清アルブミンは溶出時間13.8分、リボヌク
レアーゼＡは17.7分であった。画分をSDSゲル電気泳動
にて分析した。注目物質は14〜15分の間にHPLCカラムか
ら溶出することが分り、これらの画分をプールした。 この段階の精製品はまた低分子量物質を若干不純物と
して含有していた。従って、これを0.05Mトリス−HCl、
0.1％SDS pH7.5の0.6×10cm WGL−セファロースカラム
にかけ、この緩衝液で洗浄し、最初20mg/ml、次いで100
mg/ml N−アセチルグルコミサン含有の上記と同様の緩
衝液にて溶離した。画分をSDSゲル電気泳動にて分析
し、各所望蛋白質の量及び純粋さに基づきプールした。
これらは、上述と同様にHPLCサイズ排除クロマトグラフ
ィーにかけると共に濃縮した。所望抗原（「WGL⁺抗
原」）含有画分の最終プールを上述と同様にSDS電気泳
動分析後に得た。 この操作を第３図に示した。 （ｅ） 蛋白質の決定 蛋白質決定の４方法を抗原単離の間用いたが、この方
法は必要とされる感度および予想される妨害物質の性質
を基に選択された。これらの方法は第１〜３図に略語で
示した： 1.ビュレット法：（Ｂ） 2.A280およびA260測定の分光的方法：（Ｓ） 3.o−フタルアルデヒド修飾高分子の積分蛍光の蛍光
法：（Ｆ） 4.蛋白質1mg/ml溶液の1cmの光通過が280μｍで１の吸光
度を示すと考えられ、HPLCクロマトグラフィー間の積分
A280に基づく吸光度法：（Ａ） （ｆ） 単離操作におけるコメント 上述の操作で残った主要な問題はWGL⁺抗原の調製にお
いて、低分子量の不純物がSDSゲル電気泳動によって観
察されることである。この不純物は、SDS緩衝液のWGL−
セファロースアフィニティクロマトグラフィーおよび２
倍濃度のＮ−アセチルグルコサミンによる溶離により部
分的に、全体的でなく除去できる。 この不純物量は調製から調製へと変化する。一連の抗
原単離において、それは微量存在するが、良好な抗原の
純粋さはpI5.30〜5.67の範囲で調製的等電点電気泳動し
た画分をプールした後、単独HPLCサイズ排除クロマトグ
ラフィーを実施することにより得られる。従って、WGL⁺
抗原の収率は一層高い（1.3kgのダニから約300μｇ）。 第５図は、画分GF5/6、即ち、この研究の出発物質
（レーン１）、精製WGL⁺抗原（レーン４および５）およ
びLL⁺抗原（レーン６および７）およびこれらと共に適
当な分子量マーカー（レーン2,3および８）のSDS−ポリ
アクリルアミドゲルの側面図を示した。これらのゲルか
ら明らかな通り、GF5/6画分は非常に不純であり、WGL⁺
抗原に加えて非常に多くの成分を含有している。この画
分では、WGL⁺抗原は他の成分から区別できない微量成分
である事実を示している。該WGL⁺及びLL⁺抗原は高度に
精製されている。レーン５において、WGL⁺抗原は過剰か
けられたので、低分子量の不純物の微量が観察される。 （ｇ） WGL⁺およびLL⁺抗原のアミノ酸組成 この新規な方法により単離されたWGL⁺およびLL⁺抗原
試料をアミノ酸分析した。このHPLCプロットおよびHPLC
プリントアウトの各ピーク下の積分値から計算したアミ
ノ酸配列から、その抗原は異なるアミノ酸組成を有する
ことを示した（表−６）。加えて、これらの抗原は異な
るレクチン結合特性を有することから異なる末端糖残基
を明らかに有する。 実施例３ WGL⁺およびLL⁺抗原のワクチン活性 WGL⁺抗原（21μｇ）およびLL⁺抗原（400μｇ）の各試
料をフロインド完全アジュバントにホモジナイズし、こ
れをオーストラリア特許願No.85−45936に記載された通
り（ワクチン接種動物当り各調製品の1/10）牛にワクチ
ン接種するため用いた。ワクチン接種された動物は、コ
ントロールの動物と共にダニに寄生され、実験動物から
落下した雌の充血ダニ数を16日間計数した（表−７）。
非常に少量のWGL⁺抗原でワクチン接種した牛は１日当り
各動物から落下したダニ数が減少していることからイン
フェステーションから強く防衛された。また、残存ダニ
は一層減少し、かつ残存ダニの大部分はダニの血リンパ
内へ牛の血液成分を通す腸障害の結果として障害が目視
された（赤色％欄）。加えて、WGL⁺抗原でワクチン接種
した牛に残存したダニは、コントロールに比べて卵生産
能力が非常に減退した。 より多量投与されたLL⁺抗原は、イライザによるこの
ワクチンに対する強い免疫応答（データ示さず）を示し
た事実にもかかわらず、牛への意義ある防衛能力を与え
ていなかった。両WGL⁺およびLL⁺抗原はSDSゲル電気泳動
により非常に純粋であると思われかつ両者は、BRL分子
量標準物と比較したゲル系で約89kdの類似した分子量を
有する。 上述の要点を示した新規精製操作は、従来の出発物質
のダニ1.29kg当り「S2」抗原約３μｇと比較し、33−30
0μg WGL⁺抗原の収量を得るという改善がある。これら
２抗原（WGL⁺およびS2）は分子量類似、等電点、レクチ
ン結合特性、アミノ酸組成およびワクチン活性に基づき
同一の糖蛋白質である。 実施例４ エンドプロティナーゼlys−ＣによるWGL⁺抗原消化、
オリゴプペチドの分別、オリゴヌクレオチドのアミノ酸
配列決定およびWGL⁺ペプチドをコードするDNA配列含有
組換え有機体を検知するハイブリッド形成プローブとし
て有用なオリゴヌクレオチド配列のデザイン実施例２に
記載の精製WGL⁺抗原約40μｇを20mMジチオスレイトール
および２％（w/v）SDSを含有する0.1Mトリス−−HCl緩
衝液pH8.3 100μと混合し、56℃、30分インキュベー
トした。この溶液を室温まで冷却し、ヨウ素酢酸ナトリ
ウムを最終濃度0.14Mになるまで添加した。暗所にて45
分後、メタノール：試料（v/v）が9:1となるよう冷メタ
ノールを添加した。試料を一晩−20℃下放置して遠心
し、上清を除去し沈殿物を乾燥した。 沈殿物を4M尿素含有0.1Mトリス−HCl緩衝液76μ、p
H8.5に溶解し、次いでエンドlyc−C4μ（ml当り６単
位）を添加した。37℃、２時間後、別に酵素４μ添加
し更に17時間この消化を続行した。 この消化物を0.1％トリフルオロ酢酸のアクアポアRP
−300 C−８カラムに直接かけ、ペプチドを0.1％トリフ
ルオロ酢酸中０〜60％v/vアセトニトリル／水、線形勾
配にて溶離した。必要により、ペプチドをアクアポア31
8カラムを用いた同一溶媒系で再クロマトにかけた。ペ
プチドを集め、ロータリーエバポレータにより50〜100
μに濃縮した。このオリゴペプチドのアミノ酸配列を
かけられたバイオシステムのアミノ酸配列機を用いて決
定した。下記のペプチド配列を得た。１文字および３文
字コードのアミノ酸を表−８に示した。 加えて、下記のペプチド配列は、大変不確実（特にF
7）ではあるが、クローンの特徴化に寄与することので
きる混合配列から演繹された。 オリゴヌクレオチドはこれらのアミノ酸配列を用いて
調製される。例えば、下記を用いることができる。 注：下記の考えはペプチド配列を翻訳する場合およびオ
リゴヌクレオチドプローブを構成する場合になされる： Nos.1〜６は上記ペプチド配列の肩に言及ものである。 1. エンドlys−Ｃ特異性により各ペプチドに決定され
る第１アミノ酸に先行するリジン（Ｋ）と考えられる。 2. これらのアミノ酸は予想されるより低いモル比を検
知するものの正しいと考えられる。 3. Ｘとして示される位置に確かに帰属されるアミノ酸
がない。 4. この位置は数種のアミノ酸を含む。オリゴヌクレオ
チド形成のため、正確なアミノ酸はD,AまたはＬと考え
られるが、他のアミノ酸かもしれない。 5. 幾つかの配列では１種以上のアミノ酸が検知され
る。この不確実はカッコで示す。 6. これらの配列は混合され（かぎカッコ）、各サイク
ルにおいて検知されるアミノ酸の相対モル量は略同一で
ある。 7. ハイブリッド形成プローブとして利用されるオリゴ
ヌクレオチドを形成するには公知の手段が用いられる。
例えば、イノシン塩基は冗長コドンの第３位置において
数種のデオキシリボヌクレオチドが用いられる位置に含
有される。それらに対する逆相補配列もまたハイブリッ
ド形成プローブとして同等に用いられる。実施例におい
て示されるコドン利用は海エビ伸長因子（12）をコード
スル配列に基づく。 実施例５ WGL⁺抗原約40μｇを実施例４に記載の通りエンドlys
−Ｃで消化した。消化産物を0.1％ヘプタフルオロブタ
ン酸（HFBA）のアクアポアRP−300 C−８カラムにか
け、ペプチドを0.1％HFBA中０〜60％アセトニトリル／
水の線形勾配により溶離した。選択画分をHFBAに代えて
トリフルオロ酢酸を用いたアクアポアRP−300 C−８ま
たはＣ−18カラムにて再クロマトを実施した。最も対称
性の良い画分は試料の1/10の加水分解、塩酸蒸発による
アミノ酸存在のために分析され、HPLCの逆相分別の後ｏ
−フタルアルデヒドによる修飾次いで蛍光によって検知
した。試料の残部をロータリーエバポレーターにより50
〜100μの容量に濃縮し、提供されたバイオシステム
のアミノ酸配列機を用いてそのアミノ酸配列を決定し
た。 下記のペプチド配列が得られた。 注： リジンは各断片の（Ｋ）として先行すると考えら
れる。Ｘはペプチド配列決定の間確実に帰属できるアミ
ノ酸がないことを示す。F10およびF15は各々２および３
ペプチド断片の混合である（［］で示す。）。F10はF9
で分析された２ペプチドと同じ混合配列である。ペプチ
ド分画操作がそれら２実施例で相違するような両者にお
いてこれら２オリゴペプチドを共に精製したことは驚き
である。 F11とF2は同一断片と考えられるが、唯一の違いはF2
では不確実な２アミノ酸がF11配列では共に12であるこ
とである。F11では多量存在したのでこちらが正しいと
考えられる。F17およびF3は同一配列と考えられる。F3
は多量存在すれば更に解読できたのであるが、F17は不
純物が少ないので第１残基が同定できたと考えられる。 これらのアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドが調製
され、これはWGL⁺抗原をコードする遺伝子を同定するた
めのcDNA及びゲノムDNAバンクをスクリーニングするの
に適用できる。下記の例が用いられる（実施例４の注７
参照。下記例において、コドンの第３塩基は二次構造を
最小にするよう選択され、実施例４に用いられるような
海エビ利用にもとづくものではない。） 加えて、縮重のより短かいオリゴヌクレオチドが合成
できる。例えば64倍縮重17マーのオリゴヌクレオチドが
F12配列のDFGNEF配列およびF14からのKAYECTとYECTCP配
列を用いて形成される。16倍縮重17マーオリゴヌクレオ
チド混合物は実施例４に示したF3のアミノ酸配列からCM
MYPK配列を用いて構成できる。これらの縮重配列はWGL⁺
配列をコードする所望のDNA配列を含有する長オリゴヌ
クレオチド利用によって単離されたクローンを確認する
ため有用である。 実施例６ WGL⁺（S2）抗原の遺伝子工学 WGL⁺抗原利用の商業的ワクチンの普及を制限する大き
な障害は天然資源から得られるWGL⁺資源が限定されてい
るためである。この制限を越える手段として、バクテリ
ア、酵母または他の哺乳あるいは昆虫細胞系を含む容易
に培養される細胞を用いた遺伝子工学技術による構成が
包含され、これによりWGL⁺抗原の全部または一部の大量
合成が可能になる。この目的を達成する手段は幾つかあ
るが、それらは基本的に下記の通り数少ない段階に分け
られるが、単に実施例としてのみ示したにすぎない。 WGL⁺抗原の蛋白質骨格をコードするダニ遺伝子の情報
を含有する組換え有機体を同定するため、適切な試薬が
第１に創造されねばならない。これは、精製された防衛
的抗原またはSDSのような適当な界面活性剤による好ま
しくは抗原の変性に従った抗原を含有する部分精製品に
よってワクチン接種された動物の抗体である。部分また
は全WGL⁺抗原を合成するバクテリア、酵母または他の細
胞が構成されると共に抗血清によりスクリーニングされ
ねばならない。 WGL⁺抗原は抗原の蛋白部分のアミノ酸配列または抗原
断片を決定するため十分量単離されることが好ましく、
抗原断片は、トリプシン，エンドlys−Ｃまたはペプシ
ンのような酵素を用いたエンドプロテアーゼ消化あるい
は臭化シアンのような試薬を用いてペプチドを化学的に
開裂することにより得られる。これらの処理の結果生成
された断片の分別・単離は、HPCL逆相液体クロマトグラ
フィーまたは疎水性レジン、イオン交換レジンまたはサ
イズ分画レジン含有カラムのHPLCのような公知技術を用
いて実施される。好ましくは、C1,C8またはC18のような
逆相レジンを選択された酵素的または化学的処理の結果
生じた断片の特性に応じて単独または連続して用いる。 これらの処理の結果生成したWGL⁺ペプチド断片は、公
知のガス相アミノ酸配列機により分析される。このアミ
ノ酸配列および各アミノ酸をコードする公知のDNA配列
から、該抗原をコードするDNA配列と相補のオリゴヌク
レオチド配列を調製される。そして、これら配列は抗原
をコードするDNA含有組換え有機体を同定するハイブリ
ッド形成実験に用いられる。これら活性なクローンのDN
A配列はその配列が所望の一つであるかどうか確認する
ため決定される。このDNA配列は微生物によるポリペプ
チドの大量生産が可能な最良の方法を構成するため用い
られる。 （ａ） 遺伝子ライブラリーの構成 WGL⁺防衛的抗原をコードする遺伝子情報を含有する容
易に培養される微生物は、適当な成長段階のダニら単離
されるRNAに相補な合成DNAまたは任意の成長段階、好ま
しくは、牛血液を含有しない卵または幼虫のダニから単
離されるDNA断片を用いて構築される。 WGL⁺抗原含有クローン検知に用いることのできる唯一
の試薬が抗体プローブであるならば、cDNAまたはゲノム
DNAライブラリーはダニ抗原またはその一部を発現をも
たらすファージ、ウィルスあるいはプラスミド系に構築
されねばならない。このようなベクターとして、ラムダ
gt11、バクテリアプラスミド、例えば、pUR290,pUR291,
pUR282,pUK270,pUC8,pUC9などまたは真核細胞ウィルス
ベクター例えば、バキュロウィルス、pZipNeoなど、ま
たはSV−40ベースベクターなどが包含される。オリゴヌ
クレオチドプローブが利用できるならば、クローンライ
ブラリーは、ファージ、プラスミドおよびウィルス系、
例えばラムダgt10,EMBLベクターなど、またはpBR327,pB
R329またはpBR322のようなプラスミドベクターをげのむ
包含する広範な系においてcDNAまたはゲノムDNAを用い
て構築される。 好ましくは、cDNAライブラリーは、より少数のクロー
ンをスクリーニングしかつイントロンを含む発現上の課
題を回避するため作成される。理想的にはWGL⁺抗原の最
大レベルを合成するダニの成育段階を第１に決定するこ
とである。抗体がこれをするための唯一の利用手段であ
るならば、種々な成育段階のダニから単離したRNAのイ
ンビトロ転写に続き抗体と転写産物との免疫沈澱および
SDSゲル電気泳動分析およびフルオログラフィーによりc
DNAバンクの構成のためのRNA抽出における最適なダニの
成育段階が決定される。明らかにWGL⁺抗原の量が少ない
ためこのアプローチを非常に困難にしている。もし、オ
リゴヌクレオチドが利用されるならば種々の成育段階の
ダニから単離されたRNAとのハイブリッド形成が可能な
ため、WGL⁺抗原をコードするmRNAを最も多量に含有する
RNA源段階を決定することができる。 RNAはダニから単離され、公知の手段によりcDNAの合
成およびクローン化が行なわれる。 （ｂ） エタノール沈澱 次の方法において、エタノール沈澱は核酸溶液へその
1/10倍容量の3M酢酸ナトリウムおよび３〜４倍容量の純
粋エタノールを添加することを包含する。次いで、この
混合物を−20℃下少なくとも２時間または、−70℃下ま
たは、エタノール／ドライアイス浴下溶液が粘稠になる
まで設置される。次いで、この混合物を通常12,000×ga
v、少なくとも10分遠心分離する。この上清を注意して
除き、核酸物質（および／他の巨大分子）含有ペレット
を次の操作に用いる。 （ｃ） 2M酢酸アンモニウムからのエタノール沈澱 高塩溶液（2M酢酸アンモニウム）において、含有され
ていないデオキシヌクレオチド三リン酸（および他の低
分子量物質）の大部分はエタノール沈澱後の上清に残存
する。この操作は上述で用いた酢酸ナトリウムに代えて
等容量の4M酢酸アンモニウムを用いた位が同様で、上述
の通りこれを添加後３〜４倍容量のエタノール添加、冷
却される。 （ｄ） フェノールまたはフェノール／クロロホルム抽
出 フェノールまたはフェノール／クロロホルム抽出は核
酸溶液へ同容量の再蒸留フェノールまたは1:1（v/v）＝
フェノール：クロロホルムの0.1Mトリスにより平衡化さ
れたpH0.8溶液の添加が包含される。試験管内容物を混
合し、遠心により相を分離する。上（水）層を新しい試
験管へ除き、フェノールまたはフェノール／クロロホル
ムは捨てる。通常、水相を再抽出し、次いでエーテルで
残存フェノールを除くため抽出する。第１抽出のフェノ
ールまたはフェノールクロロホルム相は適宜TE添加、混
合および遠心により再抽出される。この場合、２つの水
相はエーテル抽出および次の操作前に一諸にする。 （ｅ） PEIセルロースTLC 本操作の種々の反応の間、核酸中への放射活性なdATP
の挿入を監視するため、PEIセルロース薄層クロマトグ
ラフィーを0.75Mリン酸緩衝液pH3.5で実施した。監視す
べき物質の一部を薄層の端部にかけ、クロマトグラムを
分析した後、薄層をＸ線フィルムにさらす。オートラジ
オグラフィーに従って、放射活性を含むPEI薄層の領域
を切り出し、バイアスに移し、シンチレーションカウン
ターのチェレンコフ測定により各々の放射活性を決定す
る。クロマトグラフィー時の最初の放射活性物質との比
が反応の成功を決定するため用いられる。この操作はPE
Iセルロースクロマトグラフィーとして言及する。 （ｆ） DNAおよびRNAの抽出 高分子量DNAおよびRNAは異なる成育段階において、宿
主から採取されるダニから単離される。ダニを室温下、
オムニミキサーにて２〜３分、グアニジンイソチオシア
ネート（4.7M）、サルコシル（7.4％）、トリス（5mM）
およびβ−メルカプトエタノール（70mM）含有緩衝液中
ホモジナイズする。このホモジネートを４℃、14000×g
av、10分遠心分離する。固体CsClをこのホモジネート
（1g/2.5ml）に添加し、これをCsClクッション（2.5g/m
l）上へ乗せ、SW28ローター（ベックマン）により48時
間、25000rpm遠心する。上相を吸収し、DNAバンドを回
収し、そしてRNAバンドを回収し、エタノール沈澱、70
％エタノールでの数回の洗浄、そして使用されるまで−
70℃下TE中保存する。 ポリアデニル化mRNAは製作者（Callaborative Resear
ch）により記載された方法を用いたオリゴdTセルロース
カラムまたはポリＵセファロースカラムにて単離され
る。 （ｇ） cDNAの合成 ファージまたはプラスミドベクターにおけるcDNAバン
クの構築のため種々の方法を用いることができる。実施
例のみによる下記の手段ラムダgt11におけるcDNAバンク
の構築のための「RNaseH」法の変法である。この方法の
要点を第６図に示す。 （ｈ） 第１鎖合成 ポリA⁺RNA2μｇをTEに溶解し、水を最終25μになる
まで添加する。この溶液を70℃、３分加熱し、次いで急
速に氷で冷却する。この冷却溶液に５μ 10×第１鎖
緩衝液、５μ01.M DTT、５μオリゴdT［ベーリンガ
ー100mg/1μ］、1.25μ RNasin［プロメガ40U/μ
］、２μBSA（5mg/ml）、５μ 10mMd（GCT）TP、
0.5μ 10mM dATPおよび３μ M−MLV逆転写酵素［BR
L/200U/μ］を添加する。 この混合溶液の2.5μを試験管Ａ（合成監視のため
の分析的反応）へ移して、0.2μ［³²P］dATP（0.2μc
i）を添加した。 残りのバルク反応溶液へ0.5μ 50mM dATPを添加す
る。これらの試験管を42℃、30分間インキュベートす
る。次いで、0.25μ 10mM dATPを試験管Ａに添加し、
更にインキュベーションを30分間続ける。試験管Ａから
0.5μ採取し、ゲル分析のためエタノール沈澱する。
更に、0.2μをＡから採取しPEIセルロースTLCにより
モニターする。 この反応において添加されたRNA2μ全てがポリＡ−
アデニル化されたならば、核酸へ［³²P］dATPの約30％
結合は第１鎖合成が100％有効に等しいと計算される。
通常、一度オリゴdTセルロースを通すると６〜10％結合
を与える。第２鎖反応をモニターする試料を調製するた
め、バルク反応の2.5μを分取し、2M酢酸ナトリウム
からエタノール沈澱する。この試料を70％エタノールで
２回洗浄し、試験管Ｂにおいて2.5μ１×第１鎖緩衝
液に再懸濁した。 （ｉ） 第２鎖（RNaseH） 28μ水、10μ 10×RNaseH緩衝液;1μ 5mg/μ
BSA、1.25μ 10mMd（GCT）TP、0.5μ 10mMdATP、
1.6μ RNaseH［BRL 20U/μ］、５μ DNAポリメラ
ーゼ１（ホロエンザイム（バイオラブス）100U/μ）
および２μ E.coliD NAリガーゼの溶液を調製した。 この溶液を混合し、この1.8μを試験管Ａに分配
し、この残りをバルク試験反応管に分配する。0.75μ
10mM dATPをバルク反応試験管に添加する。この３本の
試験管を15℃、60分インキュベートし、次いで更に22
℃、６分インキュベートする。 試験管Ｂからの0.2μ試料は反応をモニターするた
めPEIセルロースのクロマトグラフィーを実施する。試
験管Ｂからの更なる試料はグル分析のため2M酢酸アンモ
ニウムからエタノール沈澱する。第１鎖合成からの試験
管Ａ試料および試験管Ｂの第２鎖合成試料を合成された
cDNAのサイズを決定するため15％アガロースゲルにかけ
る。 T₄ポリメラーゼ反応をモニターするための試料を調製
するため、0.5μをバルク反応試験管により分取し、
試験管Ｃに移す。 試験管ＡおよびＢの残存物をバルク反応物と共にプー
ルする。バルク反応および試験管Ｃの両内容物をフェノ
ール／クロロホルム（1:1）で抽出し、2M酢酸アンモニ
ウムからのエタノール沈澱、次いで70％エタノールで２
度洗浄する。 （ｊ） EcoR1メチル化 29.5μ水、４μ0.1M DTT、２μ 10×EcoR1メチ
ラーゼ緩衝液、４μ 1mM S−アデノシルメチオニン
［バイオラブス］及び0.5μ EcoR1メチラーゼ［バイ
オラブス20U/μ］の溶液を新たな試験管で調製する。
この溶液の２μを管Ｃへ分配し、この残りをバルク反
応管へ分配する。この両管を37℃、30分インキュベート
し、次いで更に70℃、15分間インキュベートし、次いで
氷にて冷却する。新たな試験管に下記の緩衝液を調製す
る:4μ 10×AT緩衝液、２μ 5mg/ml BSA、1.4μ
0.1M DTT、２μ T₄ DNAポリメラーゼ［バイオラブス1
U/μ］および29.5μ水。２μを管Ｃへ添加し、次
いでこれを37℃、10分間インキュベートする。該残りの
溶液に10mMd（GCTA）TP含有溶液が0.5μを添加し、こ
れをバルク反応管へ添加し37℃、50分、70℃15分インキ
ュベートし、次いで氷冷する。 管Ｃへ、50μM d（GTC）TP、［³²P］dATP［0.2μCi］
および５μM dATPの各0.2μを添加し、インキュベー
ションを37℃で更に50分行った後、この0.2μをPETセ
ルロースにスポットしクロマトを実施した。 0.2mM dATP0.2μは、各分子の５′端へ２アデノシ
ン残基を付加するに必要な約３倍量のdATPを表わし、第
２鎖合成後のdscDNAの平均サイズは1kbで全量２μｇと
考えられる。 （ｋ） キナーゼ−キナーゼ段階は必要でなくかつ除去
できうるとの幾つかの指摘がある。バルク反応に対して
20μ５×キナーゼ緩衝液、0.2μ 0.1M ATP、および
0.5μポリヌクレオチドキナーゼ［バイオラブス4U/μ
］が添加される。この混合液を37℃、60分インキュベ
ートする。この反応液をフェノール／クロロホルム混合
（1:1）の等容量で抽出し水相プールし、2M酢酸アンモ
ニウムからエタノール沈澱し、70％エタノールで洗浄す
る。 （ｌ） リンカー結合 リンカー結合反応をモニターするため、試料をアガロ
ースおよびポリアクリルアミドゲル分析のため調製す
る。 アガロースゲル：バルク反応からの試料（³²PcDNA） 試料１ 冷リンカー結合前cDNA 試料２ 冷リンカー結合後cDNA 試料３ 冷リンカー結合後cDNA EcoR1消化 ポリアクリルアミドゲル:³²Pリンカー試料 試料４ 試験管D³²Pリンカー＋EcoR1消化前cDNA 試料５ 試験管D³²Pリンカー＋EcoR1消化後cDNA 試料６ 試験管E EcoR1消化前³²Pリンカー単独 試料７ 試験管E EcoR1消化後³²Pリンカー単独 結合化合物は、新たな試験管に９μEcoR1リンカー
（バイオラブス200ng/μ）、および17μDNAリガー
ゼ［IBI 3U/μ］を添加して調製した。この結合混合
物の15μをバルク反応管に分取し、すばやく混合後、
0.25μ試料を分取し、アガロースゲル分析のためすぐ
にドライアイス下凍結する（試料１）。 バルク反応管１から１μ分取し、0.2μ³²Pラベル
化EcoR1リンカーを添加する（試験管D:cDNA＋リンカ
ー）。 残りの結果混合物から１μ分取し、0.2μI³²Pラ
ベル化EcoR1リンカーを添加する（試験管E:リンカー単
独）。 バルク反応液および管Ｄおよび管Ｅを25℃、４時間イ
ンキュベートする。バルク反応管から0.25μおよび管
ＤとＥから0.6μ分取し、アガロースまたはポリアク
リルアミドゲル分析のため用いる（試料2,4,および
６）。 バルク反応の残りおよび管ＤおよびＥを70℃、５時間
加熱し、次いで氷冷する。 （ｍ） EcoR1消化 新たな試験管に11μEcoR1消化緩衝液、２μEcoR1
［IBImU/μおよび82μ水を添加する。この混合溶液
の４μをバルク反応管へ分配する。３本の試験管を37
℃、60分インキュベーションする。更にバルブ反応管に
EcoR1［36U］の２μを分配し、インキュベーションを
更に60分続行する。管ＤおよびＥの残りの試料を上術の
管ＤとＥからの試料と共にアガロースおよびアクリルア
ミドゲルで電気泳動する。これらゲルのオートラジオグ
ラフは反応が行なわれたかどうか証明する。 このバルク反応管から1.4μ試料を分取する（試料
３）。バルク反応の残りをフェノール／クロロホルムで
抽出する。試料1,2および３の0.25μを１％アガロー
スゲルにかける。試料4,5,6および７を12％ポリアクリ
ルアミドゲルにかける。両ゲルをオートラジオグラフィ
ーにより全ての反応が成功したかどうかを同定する。 （ｎ） cDNAからのリンカー分離 1.2×21cmセファロース4Bカラムを0.1M TEABで平衡化
する。150μのEcoR1消化リンカー結合cDNA試料をこの
カラムにかけ、画分をTEAB緩衝液に集める（250〜500μ
）。アガロースまたはポリアクリルアミドゲルの移動
度により決定した600bpより大きいサイズのcDNA含有画
分をプールし、ロータリーエバポレーターにより蒸発乾
固し、TEに懸濁し、EcoR1消化およびホスファターゼ処
理されたラムダgt11またはgt10と連結し、インビトロパ
ッケージし、そして提供者の教示（プロメガ又はインデ
クレイテッド サイエンズ）に従って、Y1090またはY10
89のよううな適当な宿主株に感染させる。 （ｏ） オリゴヌクレオチドによるクローンのスクリー
ニング WGL⁺蛋白質のアミノ酸配列、WGL⁺蛋白質の化学的開裂
から得られるペプチド断片またはWGL⁺蛋白質由来のエン
ドプロテアーゼ消化ペプチドから、この蛋白質をコード
するDNAの特別な部分をコードするオリゴヌクレオチド
を構築し、公知の操作によるハイブリッド形成試験に用
いられる。ライブラリーから単離されるハイブリッド形
成断片のDNA配列が決定され、効果的ワクチンに含有さ
れるWGL⁺蛋白質又はこの部分を発現するための遺伝子工
学の計画を構成するため用いられる。 cDNAライブラリーは約16日間牛に寄生した若成アシマ
ダニから単離されるRNAを用いたラムダgt11に構築され
た。ファージを大腸菌株RY1090に付着させ、37℃、16hr
培養する。ニトロセルロースフィルターをプレートに置
き、３重のフィルターを各プレートから取り出す。フィ
ルター上のDNAを変成し減圧下80℃で加熱し固定する。
このフィルターを２〜４時間プレハイブリッド形成でイ
ンキュベートし、次いで実質的に（10）に記載された通
り、16時間ハイブリッド形成溶液にインキュベートす
る。ハイブリッド形成溶液はポリヌクレオチドキナーゼ
使用³²Pラベル化オリゴヌクレオチド（10）およびψ³²P
−ATP（用いた各オリゴヌクレオチドは約10⁵cmp/ml）を
含有する。３フィルターの各セットにおいて、２つは63
マーオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成させ、残
りは51,72,50および53マーオリゴヌクレオチドの混合物
をハイブリッド形成した。洗浄の後、オートラジオグラ
フィーを実施し、３フィルター全てにシグナルを生じた
プラークを同定採取し、単一プラークまで精製した。 実施例７ WGL⁺抗原をコードする遺伝子のDNA配列分析 １つのクローンから単離したDNAについて詳述する。
本ラムダgt11クローンは約4kb、1.5kbおよび0.3kbの3Ec
oR1断片を含有するサザンハイブリッド形成（10）試験
は4kb断片が用いられたプローブとハイブリッド形成す
ることを示した。従って、この断片は宿主株JM101（組
換え宿主／プラスミドはBTA1751 ATCC67548として言
及）において修飾pUC18プラスミド（pBTA707を与える）
ヘサブクローニングした。この4kb断片は次いで音波処
理され、DNA配列分析のためM13mp18にザブクローニング
された。M13サブクローンは無作為に配列解析され、挿
入された4kbの完全DNA配列は提携コンピュータプログラ
ムの利用によってサブクローンの配列の集合により編集
された。 第７図は4kb DNA断片のDNA配列を示し、かつWGL⁺抗原
の蛋白質骨格として同定される蛋白質配列へそのDNA配
列の一領域から翻訳されるアミノ酸配列を示す。第８図
はアミノ酸の１文字略表示（表８）を用いたアミノ酸配
列を示す。 ダニから単離されたWGL⁺抗原からのエンドlys−Ｃ消
化産物のペプチド配列分析の間に同定されたペプチド断
片は第７図および第８図の下線により同定され、表−９
に要旨を示す。 該DNA配列とこのDNA配列から演繹されるアミノ酸配列
から、WGL⁺抗原のプレープローポリペプチドは650アミ
ノ酸よりなることが分る。 ペプチドF12をコードするDNA配列はDNA配列の90〜152
bp（第７図）領域に同定されその蛋白質のアミノ酸配列
（第８図）のアミノ酸20〜40に一致する。F12で同定さ
れたＮ−末端のglu残基に先行するアミノ酸はもしF12が
エンドlys−Ｃ消化の結果生じたとして予想されるよう
なlysine（Ｋ）でない。従って、F12ペプチド断片はエ
ンドlys−Ｃ以外のプロティナーゼの作用により生じた
と考えられる。F12のＮ−末端glu残基に先行する19アミ
ノ酸配列はメチオニンに始まり、真核細胞（９参照）の
他の分泌されかつ膜に結合された蛋白質を先行するリー
ダー配列に非常に分類する。加えて、ペプチドのリーダ
ー配列の大部分は後続するＡ残基（９）の位置で開裂さ
れる。従って、F12配列は成熟WGL⁺ポリペプチドのＮ−
末端であると考えられる。これは、成熟WGL⁺ポリペプチ
ドの蛋白部分は631アミノ酸長であり、分子量69729ダル
トンを有することを示している。 Ｎ−結合グリコシル化のコンセンサス配列は他真核細
胞の場合に報告されたと同様にダニにおいてもAsnx（Se
vまたはThr）であると考えられ、Ｎ−結合グルコシル化
の５つの可能なサイトが成熟ポリペプチド配列（第７
図）に同定されるダニ産生WGL⁺抗原のこれらの残基また
は他のアミノ酸に付加される炭水化物は、DNA配列から
予測されるものと比較して、天然抗原に観察される分子
量に相違が見られる。 エンドlys−Ｃ消化画分由来ペプチドのアミノ酸配列
（表−９）の比較によって、F7を除く（F1−17）の全ペ
プチドが同定されている。多くの場合、ペプチド配列解
析間不確定であったアミノ酸はDNA配列からのアミノ酸
配列と下記の通り比較することにより正確に示すことが
できる。 ペプチド断片F1,F11,F13およびF17のアミノ酸配列
は、全てアミノ酸配列と対応するDNA領域におけるDNA配
列から導かれるアミノ酸配列と正確に一致する（表
９）。 ペプチドF2はDNA断片1104〜1152bpによってコードさ
れると考えられる。表９はF2ペプチド配列の５と11位置
に不確実に帰属すると考えられるＧおよびＸは共にＲで
ある。Ｒはガス相配列解析間検知することは非常に困難
であり、また試料中非常に量が少ない。F2はF11と同一
ペプチドであり、全てのアミノ酸はF11断片の配列解析
間正確に帰属する。 ペプチドF3およびF17はWGL⁺を２つの異なるエンドlys
−Ｃ消化（実施例３および４）から得られた同一ペプチ
ド配列を示す。F17のアミノ酸配列はWGL⁺ペプチドのア
ミノ酸405から412の転写配列と正確に一致する。F3を配
列解析した時、最初の位置にアミノ酸を帰属させること
ができなかったが（DNA配列からＬ）、これは背景に大
量存在したためであるが他のアミノ酸はDNA配列由来の
アミノ酸と正確に一致する（アミノ酸405〜421第８
図）。 F4はWGL⁺蛋白質のアミノ酸213〜219に見られる（第８
図）。この配列はほぼ完全に一致し、不確定なC/QはDNA
配列よりＣであることが分る。カルボキシメチル化Ｃは
配列解析反応に従った修飾アミノ酸を分離するためのHP
LCにおいて、Ｑとする類似する保持時間へ移動する。 F5断片は配列解析可能でも非常に少量であったので不
確定なアミノ酸がいくつかあった。しかしこの配列は、
第８図のアミノ酸200〜210に一致することは明らかであ
る。各ペプチドに帰属する不確定な２アミノ酸の１つ
は、DNA配列由来のアミノ酸配列に存在し、確実な配列
は予想されるオーダーにあると考えられる。 F6断片はWGL⁺蛋白質配列のアミノ酸488〜503に対応す
る。F6断片の配列残基は、DNA配列からの残基と異な
る。該F6配列は混合配列由来であったが、DNA配列から
正しく示されたアミノ酸配列が事実存在した。 F7はDNA配列由来のアミノ酸配列を確実に同定されな
かった。F6と同じくF7は混合配列由来であり、この位置
に帰属される確実性は非常に小さい。F8断片は量が少な
かったので配列に幾つか不確実な所があった。しかし、
F8アミノ酸配列は第８図のアミノ酸444〜450に一致する
と考えられる。繰り返すが、全アミノ酸残基はDNA配列
転写において同定できる。 F9およびF10は２つのアミノ酸配列の混合であった。
これら配列の１つは第８図のアミノ酸51〜63に一致する
ことは明白である。両者の場合、ペプチド配列解析間同
定された２アミノ酸配列はDNA配列由来アミノ酸配列と
予想されるオーダーにおいて帰属される。 F9およびF10の残りのペプチド配列は第８図のアミノ
酸514〜531に一致する。F9の11位のＲはDNA配列からは
Ｐであり、これはF10配列の場合と一致する。DNA配列は
このペプチドの10位がＫであることを示している。この
DNA配列はWGL⁺抗原の１分子をコードするものなので、
異種ダニはこの配列といくらか異なるものを有すると考
えられる。この点はF14配列を論じる時にも拡張され
る。 F12として配列解析された断片は第８図のアミノ酸20
〜41と明確に一致する。また、前述した様にこの断片は
成熟WGL⁺ペプチドのＮ−末端断片と考えられ、配列解析
された第１アミノ酸に先行するＫはこの場合正しくなか
った。また、このペプチド断片の６位の不確実な残基は
DNA配列からＳである。Ｓはこの場合特にガス相配列解
析間検知することが非常に困難であるのは、先行するア
ミノ酸がＣの時カルボキシ−メチル化Ｃは修飾アミノ酸
を溶解して用いるHPLC系においてＳと類似の保持時間を
有するためである。その他のF12ペプチド配列はWGL⁺由
来の配列と正確に一致する。 F14は非常に興味深い（アミノ酸228〜247）。ペプチ
ド配列においてアミノ酸８〜10のRAFを示し、一方、DNA
配列は、転写された場合これらの位置ではSGSを示す。
両配列は遡及的に正しいとは思われるが、両配列の間に
は明らかな不一致が存在する。これの最も可能性ある説
明としては、両配列は配列解析された分子（cDNAの場
合）および分子の混合（F12の場合）のためには正し
い。 世界に分布するダニ集団は有性生殖する全ての生物の
場合と同様、遺伝的に多様である。集団内の各個体は集
団の他の個体と微妙に異なる。またこれらの相違は各個
体が両親から受け継いだDNA配列の相違の結果である。
特殊蛋白質をコードする各遺伝子のため、個体集団間の
配列に相違があると考えられ、本明細書において相同と
して言及している。ここで述べた特別な例において、実
施例４での消化でF12を与えたWGL⁺蛋白質は多数ダニ（6
0,000〜70,000）から抽出されら。F12（および配列解析
された残りのペプチド断片）のため決定されたペプチド
配列はダニ集団WGL⁺分子の大部分のペプチド配列であ
る。WGL⁺分子のダニ集団間において、小さな変化（相
同）はペプチド配列分析間で検知されるには低すぎるレ
ベルにある。第７図に示したcDNA配列および第８図のア
ミノ酸配列は集団における１個体からの由来のものであ
る。この個体はWGL⁺抗原の小さな変化をコードするDNA
配列を含有したかもしれない。もちろん、他のcDNA分子
が世界中のダニ集団の他の個体群から由来されてもよ
く、このcDNA配列は第７図に示したDNA配列と幾つかの
小さな態様において類似的に変化しているであろう。こ
れらの相同は本発明の範囲内に包含される。 上述の該相違の１つは、ワクチン接種後のWGL⁺分子に
対して生じた防衛的免疫応答のために重要なエピトープ
であるWGL⁺分子の領域に見られる。第７図に示した配列
の相同であるWGL⁺産生品を有するダニはワクチン接種さ
れた宿主に寄生しても生き残るかもしれない。この場
合、cDNAは合成され、DNAは上述の通りあるいは公知の
方法によりこれらの個体から単離される。ハイブリッド
形成試験において4kb DNA断片（またはその部分）にこ
れらは変種のWGL⁺蛋白質をコードするDNA含有クローン
を同定するためハイブリッド形成プローブとして用いら
れるが、また、該DNA含有はクローン変種ダニ集団に対
して効果的なワクチンとして含有される変種WGL⁺抗原を
合成するバクテリアまたは他の微生物を構築するため用
いられる。この原理は、ウシマダニおよび世界のあらゆ
る地域の他のダニ種に対して適用される。 DNA配列由来のWGL⁺ペプチド配列と比較されるF14の配
列における相違は18位のアミノ酸残基（これに帰属され
るF14のＳ又はＨは信頼性が低い）はDNA配列からではＴ
である。 F15は少なくとも３つのオリゴペプチドの混合物であ
った。これらの間において、１つはアミノ酸166〜176の
０オリペプチド内に表わされていると考えられる。 F16配列はWGL⁺アミノ酸断片274〜281（第８図）に見
られると。このF16ペプチド配列で不確実な２残基の第
２位はＸ＝Ｔであり、第７位はＸ＝Ｃである。これはこ
のペプチド試量が非常に少量であったためである。 要約すれば、表−９に示したDNA配列はダニWGL⁺ポリ
ペプチドの１つの相同をコードするが、ダニから単離さ
れた抗原から生じた17エンドlys−Ｃペプチド断片の16
がそのDNA配列によってコードされる。その遺伝子の相
同がダニ集団に存在する可能性の証明が得られた。ま
た、相同がウシマダニまたは世界中に見られる他のダニ
種から起源であるならば本発明の範囲内である。 上述した操作の要点はウシマダニ由来WGL⁺抗原に言及
したものである。この抗原または他のダニ種から単離し
た同等な抗原はB.annulatusのような他のBoophilus種、
他のダニ種、例えばHaemaphysalis spp,Otobius spp,Rh
ohircephalus spp,Ambylomma spp,Dermacentor spp,Ixo
des spp and Hyalomma spp,及び特にそのダニ種としてO
tobius megnini，Rhiphicephalus appendiculatus，A
mblyomma variegatum，Harmaphyalis longicornis, De
rmacentor andersoni，Ｄ．variabilis and Ixodes h
olocyclusが挙げられ、これらの各々は、インフェステ
ーションの結果あるいは、Babesia bovis，Babesia b
igemina，Anaplasma marginale，Cowdria ruminatu
m，Theileria parva prava,T.Prava lawrwncii,T.ann
ulataおよびT.hieciのような病気の媒介昆虫として世界
中の経済的損失を引き起こしているものである。WGL⁺遺
伝子産物またはその関連かつ他のダニ由来の同等な遺伝
子産物はここで述べた研究の延長として寄生ダニに対す
る効果的ワクチンを提供できることが期待される。 使用されたハイブリッド形成プローブに対するコメント 選択されたオリゴヌクレオチドプローブは遡及的に同
定できる幾つかの欠点がある。これら欠点の幾つかは、
第３コドン位の塩基の不正確な選択によるものである。
また、もちろんペプチド配列分析不確実性によった。最
重量に依存するオリゴヌクレオチドは63マーであり、そ
の時点で得られた最も信頼できるアミノ酸配列を基にし
た。クローンを単離する時、このプローブとハイブリッ
ド形成する信号が理論的考察から予測されるよりも弱い
ことは驚くべきことであった。また、ある一段階で、単
離されたクローンがWGL⁺ペプチドをコードするかという
問題があった。この不確実性はプローブとして上述した
縮重オリゴヌクレオチド配列の使用によってある範囲に
緩和された。これらのプローブはクローン中のDNAと強
くハイブリッド形成した。63マーにおける上記予測信号
より弱いという理由はこの領域に期待される信号からの
DNA配列における変化によって説明される。多数の他の
クローンを１または２つのプローブで得られたハイブリ
ッド形成信号に基づき精製したが、これら全てはDNA配
列解析によってWGL⁺遺伝子と無関係であると判明した。
従って三重フィルターを用いることによってクローンを
単離するための実験計画およびクローンのWGL⁺抗原をコ
ードする遺伝子を確認するためのバイブリッド形成プロ
ーブとして高縮合オリゴヌクレオチド配列の使用は、正
当であった。 実施例８ WGL⁺抗原合成組換え有機体の構築 WGL⁺抗原またはその相同抗原に基づく商業的ワクチン
の進展の主要な制限はダニから得られる抗原の量が限定
されていることである。この不足を打破する手段として
大量の抗原を合成するバクテリアまたは真核細胞を加工
する組換えDNA技術の使用が包含される。後述する実施
例は取り得る手段の一例の概要にすぎない。 第９図はB.microplusから単離されたWGL⁺をコードす
る遺伝子の制限酵素地図を示す。高水準に遺伝子産物を
発現するバクテリアを加工するために、たぶん該産物分
子の疎水性部分を除去することが望ましいだろう。これ
らは疎水性リーダー配列（アミノ酸１〜19）を含むが、
これは成熟ポリペプチドには見られないものである。ま
た、疎水性Ｃ−末端配列（アミノ酸630〜650）はアンカ
ー配列と考えられ、これはダニ細胞の外表面へ抗原をつ
なぎとめている。第９図において、制限酵素開裂部位と
しては、Xmn I（116塩基）、Pst I（1915塩基）、およ
びBamH I（1889塩基）が興味部深い。Xmn I、加えてBam
H IまたはPst Iを用いたWGL⁺遺伝子の消化DNA断片はＮ
−末端疎水性配列またはＣ−末端疎水性配列のない遺伝
子の大部分のコード領域を含む。これら1773bpおよび17
99bp断片はプラスミド内へサブクローニングされるが、
該プラスミドとして、pPTA603およびpBTA224が包含さ
れ、これはWGL⁺ペプチドの大部分を含む融合蛋白質の合
成を指示する組換えプラスミドとなる。 プラスミドpBTA603は下記クローンサイトを含有するM
S2ポリメラーゼ遺伝子のＮ−末端からの配列に先行する
pPLプロモーターを有する。 制限酵素BamH Iは５′端に４塩基を付けて（１）の所
でDNAを切断する。これのDNAポリメラーゼＩで補充する
と、MS2−−TCG ATG GAT Cが生じる。これにXmn I切断W
GL⁺DNA（Xmn IはGAANN NNTTC配列位を切断する。即ち、
120塩基の所）を連結すると、配列MS2−−TCG ATG GAT
CAG TTC TGT−−−WGL⁺が生じる。このように構築され
たプラスミドはMS2ポリメラーゼからの15N末端アミノ酸
を含む蛋白質をコードし、成熟WGL⁺配列のＮ−末端11ア
ミノ酸の位置のクローニングサイト配列は続いて、BamH
I断片のためのWGL⁺アミノ酸31〜620または、Pst I断片
のためのアミノ酸31〜628となる。cIリプレッサーをコ
ードする遺伝子の突然変異（cI^ts）を含有する例えばN4
830のような適当な宿主に形質転換された時、融合ポリ
ペプチドの発現は30℃の温度で抑制されるが、42℃の温
度では活性である。この発現の温度依存性は融合産物が
細胞に有害である時有利である細胞は30℃で望ましい細
胞密度になり、温度が42℃に増大すると融合蛋白の合成
を誘起する。 発現ベクターpBTA224はβ−ガラクトシダーゼーWGL⁺
融合蛋白質を産生する能力のある株を生じさせるため用
いられる。pBTA224はβ−ガラクトシダーゼコード領域
の外にあるEcoR Iサイトを除くことによりpUR292（EMBO
J.２,1791〜1794（1983））から得られた。pBTA224DNA
を抑制酵素Sac IおよびPst Iで切断し、得られた4221bp
切断をアガロースゲル電気泳動で精製した。Sac Iはlac
Z遺伝子内、３′端から1181bpsを切断する。Pst Iはlac
Zの３′端のpBTA224を切断する。このベクターの発現に
適当なWGL⁺遺伝子断片を約2kbのXmn I制限酵素断片（11
6位からWGL⁺遺伝子の３′端過ぎ）をベクターM13um 31
（インターナショナルバイオテクノロジーズ、Inc.より
入取）に挿入することにより第１に得られる。これをSa
c IおよびPst Iで切断することにより、WGL⁺の大部分を
コードし、かつSac IおよびPst I粘着末端を有する断面
が得られる。 この切断は上述した大きなpBTA224 Sac I Pst I断片
に連結されて以下の配列を得る。 IPTGによる誘起の後産生の期待される融合蛋白質はβ
−ガラクトシダーゼの最初の651アミノ酸、WGL⁺の599ア
ミノ酸および多クローニングサイトのような発現ベクタ
ーの他の部分より成る。計画分子量は143,054ダルトン
である。 上述のプラスミドはpBTA708と命名した。lac I^q遺伝
子含有の好適な大腸菌宿主はJM101である。BTA1752はpB
TA708で形質転換されたJM101である。 IPTGにより誘起されて調製された細胞溶解物およびコ
ントロール培養物はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析した。１ゲルをクーマシーブリクアンド
ブルーで染色して予想されるサイズ付近のバンドが見ら
れた（第10図）。このバンドは非誘起コントロールには
見られなかった。同一のSDS−ポリアクリルアミドゲル
にかけた蛋白質をニトロセルロースに転写した。このニ
トロセルロース紙をBLOTTO（トリス塩の５％粉乳溶液）
中、２時間インキュベートし、次いでGF5および６（上
記参照）画分でワクチン接種したウサギの血清の1/500
希釈含有BLOTTOに13時間、４℃へインキュベートし、次
いで、BLOTTOで３度洗浄し、そしてアルカリリン酸塩複
合ヤギ−抗−ウサギ抗体含有溶液（プロメガバイオテ
ク）にインキュベートした。１時間インキュベーション
の後、ニトロセルロースを除去し、BLOTTO中２度洗浄
し、ニトロブルーテトラゾリムおよび５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルリン酸含有緩衝液にインキュベ
ートした。バンドはバクテリアにより合成されたβ−ガ
ラクトシダーゼーWGL⁺融合ポリペプチドと該ウサギ抗体
とが結合した所に表われた。このバンド位置はクーマシ
ー染色ゲルに見られたバンドの位置と一致する。 実施例９ rDNA技術産生WGL⁺抗原に基づく発酵精製およびワクチン
の構成 WGL⁺抗原またはその部分を発現する株を産生株コレク
ションにおいて凍結乾燥されるバイアルとして保存す
る。保存バイアルからの細胞は再構成されかつ選択培地
に移植される。そしてこの培地からの細胞は発酵器接種
材料を調製するため用いられる。該接種材料は適切な育
成培地含有発酵器に接種するため用いられる。また、発
酵はWGL⁺蛋白質の産生に適した条件下進行する。発酵完
了時、細胞は採取され、生産物は細胞から遊離され、か
つ精製される。生産物は分析された品質制御され、かつ
良好な安定性のための適切な条件下貯蔵される。生産物
は厳密な接種条件において他の成分と混合されて使用さ
れる。 この株はインビボで封入体と言われる不溶な塊として
WGL⁺融合蛋白が生産され、例えば下記の例によって精製
される。 １晩経過したBTA1752培養液を２の調節装置付フラ
スコ内に２×１新鮮LB（１当り10gリプトン/5g酵母
抽出物/5gNaCl pH7.5）へ1:15に希釈し、培養密度がOD
0.3〜0.4に達するまで30℃下振とうする。IPTGを最終10
mMになるまで添加し更に10時間インキュベーションを続
ける。細胞を集め、最初の培養１当り水20mlに再懸濁
し、フレンチプレスを用いて破壊する。この懸濁液をフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）およびトリ
トンＸ−100に0.1mMとし、次いで12,000×gav、10分遠
心する。上清を除き、ペレットを超音波にて50ml 1M Na
Cl/5％トリトンＸ−100に再懸濁し、再遠心する。この
洗浄段階を繰り返し、ペレットを最終的に超音波を用い
て１オリジナル培養当り2.5ml 1M NaCl/5％トリトン
Ｘ−100に再懸濁する。 精製細胞含有物を8M尿素/0.1M DTT/0.1MトリスHCl8.0
における2mg/mlに37℃、２時間窒素下溶解する。この溶
液を20,000×gav、20分遠心し、上清を0.1μｍフィルタ
ーに通す。この上清の流れは30kダルトンの分子量をカ
ットオフするフィルターに通され、保持された物質を0.
1Mトリス緩衝液と洗浄したカラムDEAEレジンにかけられ
る。次いで、このカラムは8M尿素0.1MトリスpH0.8中０
〜5M NaClの線形勾配により溶出される。この画分はSDS
−ポリアクリルアミドゲルにより分析される。所望蛋白
質画分をプールし、XM30フィルターにて濃縮、脱塩す
る。この部分的に精製した蛋白質はマルコール52:モン
タニド888（9:1）またはフロインド完全または不完全ア
ジュバンドのようなアジュバンドに懸濁し、動物に投与
する。 実施例10 ウシマダニ以外のダニ種WGL⁺抗原をコードするDNA配列
の同定 世界の様々な国において、ウシマダニ以外のダニ種な
ダニのインフェステーションまたはダニが媒介する他の
寄生虫あるいは両者の組合せによる広範な生産性の損失
をもたらす。これらのダニに対するワクチン発展が非常
に望まれている。これはウシマダニ由来のWGL⁺抗原また
は本明細書およびオーストラリア特許願No.85−45936に
記載の免疫原画分由来WGL⁺抗原によって動物をワクチン
接種することにより達成される。本発明の組換え微生物
により生産したWGL⁺抗原で動物にワクチン接種すること
および他のダニ種によって動物のインフェステーション
に対して防衛する免疫応答を引き出すことが可能であ
る。 上述の通り、他のダニ種はたぶんウシマダニのWGL⁺抗
原と機能的に関連した分子を含有するだろうが、第８図
に示したものと配列を異にするだろう。もし、防衛的免
疫応答を誘起する領域にその相違が生じたなら、ウシマ
ダニWGL⁺抗原は防衛的でないだろう。しかしながら、他
のダニ種からのWGL⁺抗原関連遺伝子産生物をワクチンに
含ませるなら、これらダニ種に対して防衛的になると考
えられる。 この提案を試験する方法は、ワクチン接種／寄生実験
を他のダニ種のホモジネート由来画分を用いて実施し、
このダニ種由来のWGL⁺相同抗原を精製することである。
そして、本発明のウシマダニWGL⁺遺伝子の同定法と類似
の方法を用いて、プロティナーゼ消化、ペプチド断片配
列解析、オリゴヌクレオチド形成および該遺伝子含有組
換え微生物同定ができる。 好ましいアプローチは、他のダニ種から抽出された核
酸由来cDNAまたはゲノムDNAライブラリーを構築するこ
と、他のダニ種から相同遺伝子含有クローンを同定する
ためのハイブリッドプローブとして第７図に示したDNA
配列またはその一部を用いることである。そして、化工
された組換え微生物によって合成された相同遺伝子産物
は他のダニ種に対する効果的ワクチンの中に含有され
る。 このアプローチが実行可能であることを証明およびク
ローンライブラリーへのハイブリッド形成を実施すべき
条件に関する情報を生むために、予備的な「サザンブロ
ット」ハイブリッド形成が実施される。一実施例として
要約すれば、数種のダニから単離したDNAを精製し、制
限酵素消化する。生じたDNA断片はアガロースゲル電気
泳動によりサイズ排除分画が施され、毛細管作用により
ナイロンまたはニトロセルロースフィルターに転写と変
成される。このフィルターをプレハイブリッド形成溶液
および次いでハイブリッド形成溶液（WGL⁺遺伝子コード
領域由来放射活性ラベル化DNA断片含有）にインキュベ
ートする。ハイブリッド形成そしてフィルターの洗浄に
続いて、Ｘ線フィルムにさらし、得られたオートラジオ
グラフはWGL⁺DNA断片へハイブリッド形成した種々のダ
ニ種からのDNA断片と一致する領域を示す。 この操作を実施するための種々の変法は当技術分野の
人にとって当然知りうることであり、下記に詳述される
実施例は単に一例を挙げたにすぎない。 雌のダニ種、Rhiphicepalus appendiculatus,Amblyom
ma variegatim,Boophilus decoloratusおよびBoophilus
microplusから卵を得た。これらを湿したインキュベー
ターに入れ２〜４日インキュベートした。次いで冷TE緩
衝液に懸濁し、洗浄した。次に0.5％SDS含有TE緩衝液に
これを懸濁し、弱く接触したガラスホモジナイザーで卵
を破壊してホモジネートを得た。プロティナーゼＫを添
加し最終濃度50μg/mlとしこの混合物を静かに撹拌しつ
つ37℃、１〜２時間インキュベートした。この粘稠溶液
を0.1Mトリス−HCl pH8.0で飽和されたフェノールで３
度静かに抽出し、次いでエーテルで２度抽出した（フェ
ノール抽出の間の相を分離するため5000×gav、10分の
遠心を用いた）。酢酸ナトリウムを0.3M添加し、２倍容
のエタノールを撹拌しつつゆっくり添加した。繊維状沈
澱として溶液から析出してきたDNAをパスツールピペッ
トで採取し、エタノール洗浄し、TEに知座かに再溶解し
た。 これらDNA試料の一部づつ（通常10μｇ含有）を製造
元の指示に従って制限酵素により消化した。消化産物の
一部をSED緩衝液（10）中1.6％アガロースゲルで電気泳
動により分画した。このDNAを２倍容0.25M HClで15分脱
プリン化した。このDNAを毛細管作用によりナイロン膜
に移した（Zetaprobe、バイオラッド）。この膜をにし
ん精子DNA含有溶液（10）中プレハイブリッド形成に２
〜４時間、55℃インキュベートした。ハイブリッド形成
は、WGL⁺遺伝子の熱変成［³²P］ラベル化DNA断片（約10
⁵カウント／分/ml）含有の上述と同様の溶液にて68℃、
20時間実施した。膜をそれぞれ２×SSC、0.1％SDSで55
℃、30分洗浄し、次いで、60℃、15分３度洗浄した。Ｘ
線フィルムに少なくとも24時間さらした後、既知サイズ
のマーカーDNA断片と比較してハイブリッド形成断片サ
イズを決定できた。 第11図はこのような実験の１つのオートラジオグラム
を示す。DNAは制限酵素Sau3Aで消化された。WGL⁺DNAは
明らかにダニ４種全てのDNAとハイブリッド形成してい
る。この実験において、DNAは手をつけていないわけで
はないので、全ての場合汚れが観察されるが、同一ゲル
上のコントロールDNAにハイブリッド形成が検知されな
かったことからこのハイブリッド形成は特異的である。 実施例11 他のダニ種からのWGL⁺相同をコードするクローンの単離 試験された各種からのDNAはウシマダニからのWGL⁺抗
原をコードするDNAと相同かつ類似する配列を有する。
他のダニ種からのそれらDNA配列を含有するクローンは
他のダニ種のためのcDNAまたはゲノムDNAライブラリー
を構築することによりかつ、それらライブラリーとウシ
マダニDNA断片とをハイブリッド形成することにより、
そして、相同遺伝子にハイブリッド形成するDNA断片を
含有する組換え有機体を純化することにより単離され
る。 更に詳述すれば、列挙されたダニ種から単離されたゲ
ノムDNAは制限酵素Sau 3Aで部分消化されてゲル分析で
計算される平均サイズ15〜20kbの断片を与える。これら
断片を実質的に提供者（プロメガバイオテク）により記
載されたラムダEMBL3腕のBamH I部位に連結された。ラ
イブラリーは制限的宿主K62に移植され、37℃、１晩イ
ンキュベーションされた。このプラークを三重ニトロセ
ルロースフィルターに転写し、1.5M NaCl/0.5M NaOHでD
NAを変成し、3M NaCl/0.5Mトリス−HCl pH7.0で中和し
た。次いでフィルターを減圧下80℃、２時間加熱し、³²
Pラベル化ウミシマダニDNAプローブとハイブリッド形成
したオートラジオグラフィーの後、再フィルターでプロ
ーブとハイブリッド形成したプラークを同定し、採取
し、再ハイブリッド形成を繰返すことにより単一プラー
クに精製した。 DNAはB.decoloratusゲノムライブラリーからの１プラ
ークから単離され、制限酵素Hac IIIおよびApa Iで消化
された。このように提供された断片は1.6％アガロース
ゲル電気泳動により分離された。１ゲルはエチジウムブ
ロマイド溶液で染色され、このバンドは紫外線下目視で
きた（第11図）。同一ゲルをナイロン膜に転写し、WGL⁺
抗原をコードするウシマダニDNAとハイブリッド形成し
た。第11図はBoophilus decoloratus、Amblyomma varie
gatumゲノムクローンからの断片とWGL⁺遺伝子とのハイ
ブリッド形成を示す。 Hae IIIにおけるハイブリッド形成バンドは約980,630
および340bpにあり、Apa I消化においては27,300bpにあ
る。この場合Hind III消化のバクテリオファージラムダ
からのDNA断片と比較される。 各ダニ種からのWGL⁺抗原のための相同遺伝子部分をコ
ードする各プラークのDNA領域は配列解析され、上述し
たウシマダニWGL⁺抗原のための組換え微生物における発
現のための技術と実質的に同一の技術が用いられる。同
一のアプローチがこれらおよび他のダニ種からのcDNAク
ローンを単離するため用いることができる。 微生物により発現される相同WGL⁺抗原蛋白質は発酵器
中で成長され、組換え抗原の発現が誘起され、抗原は精
製され、アジュバンドまたはキャリーと一緒に構成さ
れ、そして動物へのワクチン接種のため用いられる。 この操作はWGL⁺関連抗原をコードするクローンを単離
するための任意に等しく適用されることができ、またこ
のように遺伝子工学的に構築された微生物によって発現
されるWGL⁺関連抗原は家畜および人に対する生産的損
失、病的状態および死をもたらす範囲のダニに対して効
果的なワクチンとして用いることができる。 微生物の寄託 本発明において言及したBTA1751株は1987年10月26日
付ブタペスト条約規定に従ってアメリカ パークローン
ドライブ ロックビル MD20852のアメリカ菌型培養収
集に寄託され、No.ATCC67548を取得している。 BTA1751株は輸入ライセンス IL−87044およびCTCCと
名づけられ菌型培養収集のための中国センターに寄託さ
れている。 産業上の利用可能性 最新の本発明は、ダニ、例えば、ウシマダニ（Boophi
lus microplus）、Boophilus annulatus;Haemaphysalis
spp.Otbius spp.Rhiphicephalus spp.Ambylomma spp.D
ermacentor spp.Ixodes sppおよびHyalomma sppのよう
な他の種；および特にそれらの例、Otobius megnini Rh
iphicephalus appendiculatus,Dermacentor andersoni,
D.variabilisおよびIxodes holocyclusを包含するダニ
のインフェステーションに対して牛にワクチン接種する
方法を提供する。更に本発明は、Babesia bovis,Cowdri
a ruminatum,The leria parva parva,T.parva lawrenci
l,T.annulataおよびT.hirciによって引き起こされる病
気に対して牛を防衛する方法を提供する。更に本発明
は、ダニ抗原の同定および定量のための診断学的道具を
提供する。 参照文献 1.Brown,S.J.,Shapiro,S.Z.およびAskenase,P.W.J.Immu
nol.133,1984,3319−3325。 2.Ackerman,S.,Floyd,M.およびSonenshine,D.E.J.Med.E
ntomol.17,1980,391−397。 3.McGowan,M.J.,Barker,M.J.,Homer,J.T.,McNew,R.W.お
よびHolscher,K.M.1971,J.Med.Entomol.18,1981,328。 4.Wikel,S.K.,Am.J.Trop.Med.Hyg.30,1981,284。 5.Allen,J.R.およびHumphries,S.J.Nature,280,1979,48
1−493。 6.Johnston,L.A.Y.,Kemp,D.H.およびPearson,R.D.Int.
J.Parasitol.16,27−34,1986。 7.Kemp,D.H.,Agbede,R.I.S.,Johnston,L.A.Y.およびGou
gh,J.M.Int.J.Parasitol.16,121−130,1986。 8.Agbede,R.I.S.およびKemp,D.H.Int.J.Parasitol.16,3
5−42,1986。 9.Briggs M.S.およびGierasch,L.M.（1986），蛋白質分
泌の分子機構：シグナル配列の役割、アカデミックプレ
ス、Vol 38,蛋白質化学の進歩110〜180頁 （Molecular Mechanisms of Protein Secretion:The Ro
le of the Signal Sequence,Pages110−180 in Advance
s in Protein Chemistriy,vol.38,Academic Press.） 10.Maniatis,T.,Fritsch,E.F.およびSambrook,J.（198
2），分子クローニング（Molecular cloning）：研究マ
ニュアル（A Laboratory Manual）コールドスプリング
ハーバー研究所（Cold Spring Harbouv Laboratory）。 11.Kornfeld,R.およびKornfeld,S.,1985,Ann.Rev.Bioch
em 54,631−664。 12.Van Hemert,F.J.,Amons,R.,Pluijms,W.J.M.,Van Orm
ondt,H.およびMoeller,W.EMBO ３,1109−1113 1984。 13.Willadsen,P.,Int.J.Parasitol,17,671−677（198
7）。 14.Vretblad,P.,BiochemicaおよびBiophysica Acta,43
4,169−176（1976）。 15.Sage,H.J.およびGreen,R.W.,酵素学の方法（Methods
in Enzymology,28,Guinsburg,V.編集,332−339（197
2），ロンドン アカデミック プレス（Loudon Academ
ic Press）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ＰＩ４９１２ (32)優先日 1987年10月16日 (33)優先権主張国 オ−ストラリア（ＡＵ） (72)発明者 コボン，ゲイリー・スチュワート オーストラリア国、ニユー・サウス・ウ エールズ 2086、フレンチス・フォレス ト、ムーンビ・クレセント 13 (72)発明者 ムーア，ジョアンナ・テリー オーストラリア国、ニユー・サウス・ウ エールズ 2088、モスマン、アヴェニュ ー・ロード ２／１Ｅ (72)発明者 ジョンストン，ロー・アンソニー・ヨー ク オーストラリア国、クイーンズランド 4074、リヴァー・ヒルズ、パリナップ・ ストリート １ (72)発明者 ウイラドセン，ピーター オーストラリア国、クイーンズランド 4069、チャペル・ヒル、ストラロック・ ストリート ７ (72)発明者 ケンプ，デヴィッド・ハロルド オーストラリア国、クイーンズランド 4069、アッパー・ブルークフィールド、 ギリーズ・ロード 105 (72)発明者 スリスカンサ，アラガコーン オーストラリア国、ニユー・サウス・ウ エールズ 2067、チャツウッド、パシフ ィック・ハイウェイ ３／641 (72)発明者 ライディング，ジョージ・アルフレッド オーストラリア国、クイーンズランド 4068、インドゥールーピリー、ノリナ・ コート ５ (72)発明者 ランド，ケイス・ノーマン オーストラリア国、ニユー・サウス・ウ エールズ 2068、フレンチス・フォレス ト、ナンディ・アヴェニュー 54 (56)参考文献 特開 昭62−84029（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/435 C12P 21/02 A61K 39/35 C12N 15/11 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．実質的に下記アミノ酸配列を有する単離されたWG
   L⁺、及びWGL⁺の相同体である抗原であって、該抗原はワ
   クチンとして哺乳動物に投与されると、該宿主に寄食し
   たダニの腸細胞を障害して、ダニの大部分を成虫段階で
   死滅させるか、あるいは、生き残ったダニを赤色にし、
   かつ該生き残ったダニの生殖能力を実質的に減退させる
   か充血体重を減少させる免疫応答を該宿主に生じさせる
   ものであることを特徴とする抗原。２．抗原が約5.30〜約5.67のpIを有する請求の範囲第１
   項記載の抗原。 ３．抗原が約89キロダルタンの分子量を有する請求の範
   囲第１項記載の抗原。 ４．抗原が糖蛋白質である請求の範囲第１項記載の抗
   原。 ５．抗原が実質的に均一な純粋な形態である請求の範囲
   第１項記載の抗原。 ６．抗原がBoophilus spp,Haemaphysalis spp,Otobius
   spp,Rhiphicephalus spp,Ambylomma spp,Dermacentor s
   pp,Ixodes spp,またはHyalomma spp由来である請求の範
   囲第１項記載の抗原。 ７．抗原がB.annulatus,B.decoloratus,Otobius megnin
   i,Rhiphicephalus appendiculatus,Dermacentor anders
   oni,D.variabilis,Haemaphysalis longicornis,Ambylom
   ma variegatumまたはIxodes holocyclus由来である請求
   の範囲第６項に記載の抗原。 ８．抗原がウシマダミ（Boophilus microplus）由来で
   ある請求の範囲第１項記載の抗原。 ９．前記抗原が非グリコシル化されていることを特徴と
   する請求の範囲第１項記載の抗原。 １０．実質的に下記アミノ酸配列を有する単離されたWG
   L⁺、及びWGL⁺の相同体である抗原であって、該抗原はワ
   クチンとして哺乳動物に投与されると、該宿主に寄食し
   たダニの腸細胞を障害して、ダニの大部分を成虫段階で
   死滅させるか、あるいは、生き残ったダニを赤色にし、
   かつ該生き残ったダニの生殖能力を実質的に減退させる
   か充血体重を減少させる免疫応答を該宿主に生じさせる
   ものであることを特徴とする抗原の製造方法において、
   該抗原をコードする組換えDNA分子で形質転換された形
   質転換宿主細胞を該抗原の発現のために好適な条件で培
   養し、該抗原を回収することを特徴とする抗原の製造方
   法。１１．実質的に下記アミノ酸配列を有する単離されたWG
   L⁺、及びWGL⁺の相同体である抗原であって、該抗原はワ
   クチンとして哺乳動物に投与されると、該宿主に寄食し
   たダニの腸細胞を障害して、ダニの大部分を成虫段階で
   死滅させるか、あるいは、生き残ったダニを赤色にし、
   かつ該生き残ったダニの生殖能力を実質的に減退させる
   か充血体重を減少させる免疫応答を該宿主に生じさせる
   ものであることを特徴とする抗原の少なくとも１つの抗
   原および少なくとも１つのキャリヤー、アジュバント、
   免疫増強剤または希釈剤からなるワクチン。 １２．ワクチン接種される哺乳動物宿主が牛、馬、鹿、
   ヤギ、犬、猫、羊または豚である請求の範囲第１項記載
   の抗原。 １３．ワクチン接種により誘起される免疫がBoophilus
   種によるインフェステーションに対する免疫である請求
   の範囲第１項記載の抗原。 ４．ワクチン接種により誘起される免疫がB.microplus,
   B.annulatusまたはB.decoloratusのインフェステーショ
   ンに対する免疫である請求の範囲第13項記載の抗原。 １５．ワクチン接種により誘起される免疫がHaemaphysa
   lis spp,Otobius spp,Rhiphicephalus spp,Ambylomma s
   pp,Dermacentor spp,Ixodes spp,またはHyalomma sppの
   インフェステーションに対する免疫である請求の範囲第
   １項記載の抗原。 １６．ワクチン接種により誘起される免疫がOtobius me
   gnini,Rhiphicephalus appendiculatus,Dermacentor an
   dersoni,D.variabilis,Haemaphysalis longicornis,Amb
   ylomma variegatumまたはIxodes holocyclusによるイン
   フェステーションに対する免疫である請求の範囲第15項
   記載の抗原。 １７．抗原はダニ制御の結果としてある作因によって起
   こるBabesia bovis,B.bigemia,Anaplasma marginale,Co
   wdria ruminatum,Theleria parva parva,T.parva lawre
   ncii,T.annulataまたはT.hirciのような病気に対する付
   随的防衛をも提供する請求の範囲第１項記載の抗原。 １８．前記抗原がそのアミノ酸配列において下記アミノ
   酸配列から選択される少なくとも１個のポリペプチドを
   含有する請求の範囲第１項記載の抗原。 または １９．前記抗原がそのアミノ酸配列において下記アミノ
   酸配列から選択される少なくとも１個のポリペプチドを
   含有する請求の範囲第１項記載の抗原 F1 KDPDGK F2,F11 KWYEDRVLEAIRTSIGK F3,F17 KLQACEHPIGEWCMMYPK F4 KEAGFVCK F5 KGPDGQCINACK F6 KAGVSCNENEQSECADK F8 KDQEAAYK F9,F10 KCPRDNMYFNAAEK KANCQCPPDTKPGEIGCIE KANCQCPPDTRPGEIGCIE F12 AESSICSDFGNEFCRNAECEVVPG F13 KTRECSYGRCVESNPSK F14 KAYECTCPSGSTVAEDGITCK F15 KNLLQRDSRCCQ または F16 KGTVLCECP