JPH01502115A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン 技術分野 本発明はウシマダニ（Ｂ　ｏｏｐｈｉｌｕｓ　ｍ１ｃｒｏｐｌｕｓ）から単離さ れた抗原、該抗原をコードする遺伝子、および該遺伝子の蛋白質産物に関するも のである。該抗原はワクチンとして牛へ投与される免疫原として一部又は全部が 用いられた時ワクチン接種された牛に寄食したダニを陣害する能力のある免疫応 答の牛による生産をもたらし、残存するダニを減少させおよび／またはダニの生 殖能力を遺伝子によってコードされた抗原が該ダニに対して効果的ワクチンとし て用いられる程度に減退させる。

背景技術 ウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ　ｍ１ｅｒｏｐｌｕｓ）のようなダニによる最 初のインフェステーションにおいて、牛のような動物がそのような寄生動物に非 常に感染されやすい、寄生するダニの幼虫の通常的５０％が充血成体として事実 上落下するようなライフサイクルを完遂する。この寄生動物に長期間さらされる と、牛は、それに対する幾らかの免疫抵抗を獲得するが、この抵抗は牛生産に対 する商業的に重要な損失が依然起きうる比較的固定したレベルに至っている。生 産に対する損失はこの寄生動物に寄食される間、血液、および組織液を吸い取ら れた損失による所が大きい、付随的損失は動物が自然の免疫性と連絡したダニの 唾液およびセメント質抗原に対して発展させて来た過敏又はアレルギ一応答、即 ち、ダニ苦労（ｔｉｃｋ　ｗｏｒｒｙ）として知られた状態によるものである。

特表千１−５０２１１５　（５） 多くのアプローチがダニを制御するため利用されている。最も広範に用いられて いるものは、ダニを殺す化学物質、即ち、ダニ駆除剤により処理することである ０例えば、化学物質に対する抵抗はダニ量を増加させ、かつ新たな種類の化学物 質はしばしば導入しなければならない、この化学物質はほとんど残存効果を持た ないので、牛は効果的にダニを駆除するため頻繁に処理されねばならない、この 化学物質は、牛、人体、および環境に有害な影響を与える。ダニを駆除するため の第２の方法は宿主の抵抗を作り出すことである。ゼブ種およびゼブ交配種は高 度に感染し易い英国種に比ベダニに対する抵抗が強い、しかしながら、ゼブ交配 種は純英国種に比べて生産量が少なく、しかも、化学物質の使用によるダニに対 する抵抗の程度は理想から程遠いものである。ダニ駆除の他の方法として、牧草 の交替、ダニの根絶があるが、これらは世界を通じて大部分の牛生産地域におい て現実的問題となっている。ダニに対する効果的ワクチンがダニ制御の現代的に 有用な方法に対して非常に魅力的な選択の道を提供する。

ダニに対して動物を免疫するという間欠的な試みが過去行なわれた。（後述の参 照文献１−５．復習の為には１３を参照）これらの研究の大部分はダニ−宿主系 を用いたものであり、この系において強い免疫性が自然に発展すると考えられ、 また、通常、宿主として実験動物が用いられている０通常、観察される効果は飽 食（充血）体重および成虫ダニの卵重量の減少であり、また、２つのリポート（ ３，４＞において飽食する成虫の生存能力の減退を報じているが、これらの印（ １〜５）の生存能力の減退である。これらの研究の多くは自然に免疫性をまねる ことを試みるため唾液腺由来の抗原を用いたものである。しかしながら、自然の 免疫性をまねたワクチンは一度自然の免疫性が表現されてもなお生じる経済的損 失およびダニに対する過敏応答の有害な影響に起因する多大な商業的利益がある とは考えられそうにない。

選択すべきアプローチは「隠された」または「新しい」抗原で動物にワクチンを 接種することである。この「隠された」または「新しい」抗原とはそれらの動物 にワクチンを接種するために（部分的に、または十分に精製した形で）用いられ る時動物に防衛的な免疫応答を生起させるために利用できる寄生動物の成分であ って、自然に獲得された免疫性において包含される抗原ではない。

隠された、又は、新しい抗原を用いたダニに対するワクチン接種の成功例が報じ られている（２．５）、動物はダニ全体またはダニの中腸から抽出された物で免 疫された。免疫は飽食重量、寄食期間、卵重量および卵生存能力の減少をもたら すが、重要なダニの死の増加は観察されなかった。しかしながら、これらの実験 に用いられた抗原分画は非常に複雑であったため、観察された効果を与える固有 のダニ抗原を同定することができなかったし、その効果の理由は詳細に研究され なかった。

最近の特許願（オーストラリア特許１ｉＪＩＮｏ、８６−５９７０７）において 、ダニのシンガングリア（ｓｙｎｇａｎｇｌ　ｉａ）由来の抗原がダニのインフ ェステーションに対して効果的なワクチンとして機能することができることをク レームに開示している。しかしながら、その特許にはシンガングリア抗原が単独 で効果的であるという証明がない、この仕事では、切開した腸およびシンガンダ リアを単離し、腸細胞を溶解し、遠心して上滑とペレットをある場合には、シン ガングリアの細胞懸濁液と一諸に同じ動物にワクチン接種をするために用いた。

報じられた実験の全ての牛はダニの腸成分および幾つかの付加的に受容されたシ ンガンダリアでワクチン接種された。従って、ここでおよびＣ５ＩＲＯ特許願（ ８５−４５９６３）で述べている腸細胞抗原のようなダニの腸成分に対する免疫 応答の結果としての腸障害は、シンガングリアー特異抗原に対する免疫応答から に因る可能性がある任意の２次的な防衛的効果に実質的に必須である物であると 実験的考察において明確に暗示される。

上述の引用した例の全てにおいて、ワクチン接種に用いられたダニ抽出物は、非 常に複雑なものである。この報告の大部分において、用いられた抽出物はダニの 器官の均−物およびある場合には、遠心分離によりそれから得られたベレットで ある。

上述及びその他の研究において、分画物の複雑性のデータは報じられていないが 、その分画物には数百、あるいは推定数千の成分を含有することは確かなことで ある。免疫能力のある分画の精製及び特徴化が（オーストラリア特許願Ｎｏ、　 ８５−４５９３６）行なわれているが、その高度に精製した分画、ＧＦ５／６で さえ後述するようになお非常に複雑なものである。また、この研究からは防衛的 免疫応答を与えるこの画分の固有の成分（あるいは諸成分）を同定することは不 可能である０本発明においてはそのような抗原を精製及び特徴化している。

ウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ　ｍ１ｅｒｏｐｌｕｓ）は特に、取り組みべき 問題を提供している。自然に獲得された免疫性は単に部分的に効果があるに過ぎ ないので人口的免疫化による自然の免疫性の複製は、比較的商業的価値はほとん どないだろう、ウシマダニは牛の寄生動物であり、容易には実験動物に畜生しな い、ウシマダニに対する「非自然免疫性」を導入する可能性が調べられ、示され ている（６．７，８．オーストラリア特許願Ｎｏ、８５−４５９３６）、Ｌかし 、この現実的研究には第１段階としてその抗原、即ち、信頼性ある抗原を単離す ること、および、第２段階として、商業的使用に十分な量を提供できる効果的抗 原を生産する方法の発展性を必要としている。

問題となっている抗原の精製の第１段階及びこれら抗原の有効性の証明はすでに 記載されている（オーストラリア特許願Ｎｏ。

８５−４５９３６）、要約すれば、牛から採取されたダニを破砕し、超音波で処 理し、表皮及び破片を低速遠心にて除去し、その上清を１０００００　Ｘ　ｇ、 １時間の高速遠心にかけて、膜リッチのペレットを非イオン界面活性剤で抽出す る。その抽出物をひき続きセファクリルＳ−３００カラムクロマトグラフイーに かけ、次いで、広範囲な等電点電気泳動、次いで、狭範囲等電点電気泳動および ＨＰＬＣによるゲル口過クロマトを行なう、各ステップで得られた画分を免疫原 としての有効性を試験し、最も高度な防衛的免疫性を示す両分を次の精製段階へ 進ませる。この最も高度な防衛的免疫性を示す両分は膜質のものであり、等電点 （Ｐ’）　から５．０５から５．６５の範囲でかつ分子量が２０５から７９キロ ダルトンの範囲であると同定された。他の量の少ない高度な防衛的免疫性を示す 両分もすでに記載され、先のオーストラリア特許願８５−４５９３６と共に興味 がある。

本発明に記載される精製法の更なる進展は、最も高度な防衛的免疫性を示す抗原 を一層明確に定義すると共に一層正確に特徴化し、更に高度に精製された免疫原 調製により動物のワクチン接種を可能にする。このような抗原の一つは、はとん ど均一に精製され、このダニ成分で牛をワクチン接種すると免疫応答はこの牛に 寄食するダニの大部分を死に至らしめるように機能することが示された。ダニか ら単離されたこの抗原は分子量が約８９キロダルトンであり、かつ等電点が５． ３０から５．６７の範囲の糖蛋白質であることが示された。この糖蛋白質（後述 の−ＧＬ”抗原あるいはＷＧＬ＋とじて言及されている）の精製法は、改善され たものであり、本発明に開示されている方法は以前に記載された方法（オースト ラリア特許願Ｎｏ、８５−４５９３６）により得られる抗原より一層多くの収量 をもたらす０本発明および従来の研究において、防衛能を与える他の両分が同定 されている。

本発明法によってＷＧＬ”抗原をより多量得られるが（商業的使用には不十分） 、抗原の蛋白質部の各部分の構造を分析するため実験が行なわれた。精製調製品 を還元、カルボキシメチル化し、エンドプロティナーゼ１ｙｅ−Ｃで消化した。

生成したペプチド断片を精製し、幾つかのペプチドの該部分アミノ酸配列を決定 した。このアミノ酸配列データはＷＧＬ″″抗原をコードするｃＤＮＡを含有す るバクテリア細胞を単離するため用いられるオリゴヌクレオチドの形成を可能に した。バクテリア細胞からのＤＮＡの分析は、一つの防衛能のある抗原をコード する遺伝子を明確に同定し、かつダニに対する効果的ワクチンとして用いられる 組換え蛋白質の生産を可能にする。これらの進展が本発明の目的である。

（定義） 本発明はダニのインフェステーションに対する牛の防衛に適切な産物と方法を提 供することにあるが、本発明の原理はダニのインフェステーションに対する他の 動物、例えば、馬、鹿、ヤギ、ヒツジ、犬、猫および豚の防衛に同等に適用され 得ると考えるべきである。

世界に分布するダニ集団は生殖する全ての有機体がそうであるように遺伝的に多 様である。ｔＡ団の各個体はその集団の他の個体と若干異なり、これらの相違は 各個体がその両親から受け継いだＤＮＡ配列における相違の結果である。

更に、有性または無性生殖生物に起こる偶発的突然変異が遺伝的多様性の源とな る。

従って、特別な蛋白質をコードする各遺伝子が、個体の集団間でその遺伝子配列 が異なることが考えられる。

その様な関連分子は本発明においては、本発明による抗原の相同蛋白質としてお よび本発明の範囲に含まれるものと定義された免疫原の諸機能を発揮する範囲に 言及される。

相同抗原は進化に関連した抗原であって、必ずしも機能に関連した抗原ではない 、近似するが必ずしも一致しないＤＮＡまたは蛋白質の配列が提供される。しか し、この意味における機能は自然のインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）における蛋白質 の機能と関連するものである。

この点の説明は下記の考察により得られよう。

１、　ウシマダニおよび他のダニ種からのＷＧＬ”２、　ウシマダニ集団の変体 あるいは異なる個体からのＭにＬ”３、ＷＧＬ＋及び本発明で定義したＷＧＬ′ ″抗原の相同抗原であるダニからの関連腸細胞原形質膜糖蛋白質。

本発明の目的のため、相同抗原は本発明で定義された免疫原と同じ機能を有する ＷＧＬ＋関連原形質膜糖蛋白質のみ含むことが強張される。

その様な相同ＷＧＬ”関連原形質質膜糖蛋白質は世界中のダニ集団に存在し、ダ ニのインフェステーションに対する商業的に用いられるワクチンの範囲でそのワ クチンに含有させた時、ダニを殺生する能力のある免疫応答を引き出す能力があ り、それはダニの腸を障害することによりなされるが、付加的にダニの飽食体重 の減退をもたらし、あるいはダニの非生産を減少させる様な方法で生き残ってい るダニに障害を与えるものである。

例えば、そのようなダニとしては、Ｂ」立篩ｊＬ」、ｓｐｐ。

Ｈａｅ吐ｈ　５ａｌｉｓ　ｓｐｐ、　０ｔｏｂｉｕｓ　ｓｐｐ、Ｒｈｉ　ｈｉｃ ｅ　ｈａｌｕｓ　ｓｐｐ。

７　ｓｐｐ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ　ｓｐｐ、Ｉｘｏｄｅｓ　ｓｐｐ　ａｎｄ ＄　ｓｐｐ、が挙げられ特に　Ｂ、　ａｎｎｕｌａｔｕｓ。

びＩｘｏｄｅｓ　眩肢旺吐姐　である。

更に、進化あるいは必然的な構築によりＷＧＬ＋抗原に関連しない化学物質を生 じる可能があるが、ＷＧＬ＋抗原上のエピトープに対する免疫応答を生じる免疫 原としてかつ、それにより効果的なワクチンとて機能すると考えられるべきであ る。これらの分子は本発明において相似及び免疫原の機能を発揮する範囲として 言及しているが、これらは本発明の範囲内である。

このような相似はＷＧＬ＋分子のアミノ酸骨格の部分に対応する配列を有する化 学的に合成されたオリゴペプチド分子、免疫原として用いた時、ダニの本来のＷ ＧＬ＋抗原を認識する免疫応答を引き出すオリゴペプチド、抗原として用いた時 ダニのＷＧＬ”抗原を認識する免疫応答を引き出す任意の源からの炭水化物構造 、およびＷＧＬ＋抗原のエピトープ（複数も含む）を認識する抗体の可変領域に 対して生じる抗イデイオタイプ抗体を包含する。

（発明の開示） 第１の態様では、本発明は、ダニ種あるいはダニ細胞系由来の免疫原が投与され た哺乳動物宿主のダニのインフェステーションに対する免疫を引き出す能力を有 する抗原からなる該免疫原において、該免疫が該宿主を寄食したダニのＬ１％細 胞の原形質膜を障害して、ダニの大部分を成虫段階で死滅させるか、あるいは、 生き残ったダニを赤色にし、かつ該生き残ったダニの生殖能力を実質的に減退さ せる免疫応答を該哺乳動物宿主に生じさせるものであり、該免疫原が該抗原の、 部分、相似抗原、相同抗原、誘導体およびこれらの組合せを含む該抗原に対して 類似する免疫学的活性を示す免疫原を含むことを特徴とする免疫原を提供するこ とにある。

抗原は好ましくは、ウシマダニ（Ｂｏｏｐｂｉｌｕｓ　ｍ１ｃｒｏｐｌｕｓ）の 由来のものである。

好ましい態様において、誘起される免疫はＢｏｏｐｈｉｌｕｓ　種のインフェス テーションに対する免疫である。

誘起される免疫は更に好ましくは、Ｂ　、　ｍ１ｃｒｏｐｌｕｓのインフエステ ーションに対する免疫である。

また、免疫は他のダニ種、例えば、Ｈｓ＋ｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ　ｓｐｐ。

０ｔｏｂｉｕｓ　ｓｐｐ、　Ｒｈ１ｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓｐｐ、Ａ＋ａｂ ｙｌｏａｍａ　ｓｐｐ。

Ｄｅｒｍａｅｅｎｔｏｒ　ｓｐｐ、Ｉｘｏｄｅｓ　ｓｐｐおよびＨｙａｌｏｍｍ ａ　Ｓｐｐ＋および特に他のＢｏｏｐｈｉｌｕｓ　種、例えば、Ｂ、　ａｎｕｌ ａｔｕｓまたはＢ、　ｄｅｃｏｌｏｔｕｓに対して誘起される。

免疫が誘起される他のダニ種の好ましい種として、Ｏｔｏｂｉｕｓｍｅｇｎｉｎ ｉ、Ｒｈ１ｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌｕｔｕｓ、Ｄｅｒ＋ ＊ａｃｅｎｔｏｒａｎｄｅｒｓｏｎｉ、Ｄ、　ｒａｒｉａｂｌｌｉｓ、Ｈａｅｍ ａｐｈｙｓａｌｉｓ　Ｉｏｒ＋ｇｉｃｏｒｎｉｓ。

Ａｍｂｙｌｏｍａ　ｖａｒｉｅｇａｔｕｍおよびＩ　ｘｏｄｅｓ　ｈｏｌｏｅｙ ｃｌｕｓが含まれる。

他のダニ種例えば、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｐｐ、Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ 　ｓｐｐ。

０ｔｏｂｉｕｓ　ｓｐｐ、　Ｒｈ１ｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓｐｐ、Ａｍｂｙ ｌｏｍｍａ　ｓｐｐ。

Ｄｅｒｍａｅｅｎｔｏｒ　ｓｐｐ、Ｉｘｏｄｅｓ　ｓｐｐおよびＨｙａｌｏ＋ｕ ａａ　Ｓｐｐ＋から単離される関連抗原によって免疫することによって、他のダ ニによるインフエステーションに対する免疫もまた誘起される。

関連抗原が単離される好ましい種として、Ｂ、　ａｎｎｕｌａｔｕｓ。

Ｂ、ｄｅｅｏｌｏｒａｔｕｓ、　０ｔｏｂｉｕｓ　ｍｅｇｎｉｎｉ、　Ｒｈ１ｐ ｈｉｅｅｐｈａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌｕｔｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ 　ａｎｄｅｒｓｏｎｉ、Ｄ、　ｒａｒｉａｂｉｌｉｓ。

Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ　ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ、Ａｍｂｙｌｏｍｍａ　 ｖａｒｉｅｇａｔｕ−およびＩ　ｘｏｄｅｓ　ｈｏｌｏｃｙｅｌｕｓが包含され る。

ダニのインフェステーションに対して防衛することにより、該抗原はたる作因に よって起こる病気、例えばＢａｂｅｓｉａｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ　ｂｉｇ ｅｍｉｎａ、Ａｎａｐｌａｓｍａ　ｍａｒｇｉｎａｌｅ、Ｃｏｗｄｒｉａｒｕｍ ｉｎａｎｔｉｕｓｎ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ　ｐａｒｖａ　ｐａｒｖａ、Ｔ、　ｐ ａｒｖａｌａｗｒｅｎｃｉｉ、Ｔ、　ａｎｎｕｌａｔａおよびＴ、ｈｉｒｃｉに 対する防衛をも提供することができる。

本発明は、第２のＲ様において、本発明による免疫原のアミノ酸配列をコードす る配列として機能する第１のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配 列を提供し、該第１の配列にハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列または 該第１の配列に関連したポリヌクレオチド配列または１個または複数の塩基の置 換、欠失、挿入および逆位を含む突然変異によるハイブリッド形成する配列を提 供する。

該ポリヌクレオチド配列は好ましくはＤＮＡ配列である。

本発明の更に好ましい形態においては、該ＤＮＡ配列はｅＤＮＡ配列である。

ウシマダニから単離される防衛的抗原の一部または全部をコードするＤＮＡ配列 は、ＤＮＡハイブリッド形成において、他のダニ種からの関連ＤＮＡ配列を同定 するため用いることができる。これら後者のＤＮＡ配列は遺伝子工学の技術によ り構成でき、他のダニ種からの抗原の全部又は一部な、バクテリア細胞または真 核細胞、例えば、酵母、植物、昆虫、ダニまたは哺乳動物の細胞系によって発現 させることにより得られ、それらダニ種に対する効果的ワクチンを提供でき、こ れにより人に対する病的状態の損失あるいは経済的損失または動物に対する病的 状態の損失および生産的損失を回避するものである。

本発明は、また、本発明による少なくとも１つのＤＮＡ配列およびベクターＤＮ Ａからなる組換えＤＮＡ分子を提供するものである。

ベクターＤＮＡの好ましい形態はプラスミド、ファージまたはウィルスＤＮＡか らなるものである。

好ましいベクターとしてラムダｇｔｌｌ、ｐＵ　Ｒ２９０、ｐＵ　Ｒ２９１、ｐ ＵＲ２８２，ｐＵＫ２７０．ｐＵＣ８，ｐＵｃ９．バキュロウィルス、ｐＺｉｐ Ｎｅｏ、ＳＶ４０ベースベクター、ラムダｇｔ１０．ＥＭＢＬベクター、ｐＢＲ ３２７，ｐＢＲ３２９，または等価な遺伝子座を含有するｐＢＲ３２９が包含さ れる。

本発明は更に形質転換細胞系を提供し、該細胞系は本発明による少なくとも１つ の組換えＤＮＡ分子を担持するものである。

更に本発明の態様は、本発明の少なくとも１つの免疫原と薬理学的に許容なキャ リヤー、アジュバント、免疫増強剤あるいは希釈剤とからなるワクチンを提供す るものである。

本発明によるダニ種由来の抗原は精製および特徴化されたものであり、牛にこの ワクチン接種を施した時、ダニの寄生に対して高度な免疫を誘起させることがで きる。

更に、ダニ種由来のＤＮＡ配列を含有するバクテリア細胞を作り、ダニ種の防衛 的抗原の部分をコードするＤＮＡ配列を含有するバクテリア細胞を同定した。該 抗原をコードするダニの遺伝子のＤＮＡ配列を決定し、この抗原を用いて他のダ ニ種からのその関連遺伝子を含有するバクテリア細胞を更に同定した。

該抗原または抗原の一部はバクテリアまたは他の微生物あるいは真核細胞、例え ば、酵母、昆虫、ダニ、植物および哺乳動物などの細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで生 育して発現させることにより、ウシマダニおよび他のダニ種のインフェステーシ ョンに対する牛および他の家畜の防衛のための免疫原として有効な抗原を大量に 得ることができる。

また、本発明は防衛的免疫応答を与える本発明の免疫原の単数または複数のエピ トープをも本発明の範囲内に含む、これらのエピトープはオリゴヌクレオチドの 合成的生成により人工的に作ることができるが、該オリゴヌクレオチドは該抗原 の配列部分を含むものであり、このような配列部分はバクテリアで生産された抗 原の断片、または本来のペプチドまたは組換えペプチドの化学的または酵素的切 断の結果得られる断片の免疫化学的試験の結果から推定できる。また、これらの エピトープはそれらの抗原、オリゴペプチド、イディオタイプおよび抗イデイオ タイプからの関連したエピトープを含みこれは、それらのエピトープに類似する か、それらのエピトープを認識し、能動的または受動的に動物をこれにより免疫 した防衛的効果を有することができる。

更に本発明の態様は、本発明による抗原、特に、ダニ由来の防衛的抗原の精製方 法を提供する。

本発明は小麦胚レクチンまたは小麦胚レクチンと同一あるいは類似の末端糖の特 異性を有するレクチン上で実施されるクロマトグラフィーの段階からなる免疫原 の調製方法を提供する。

本発明は好ましくは、均質化されたダニから得られた膜リッチな両分を界面活性 剤により抽出すること、および該可溶化物質を小麦胚レクチンセファロースクロ マトグラフィーにかけてＮ−アセチルグルコサミンによる溶離、または小麦胚レ クチンまたは小麦胚レクチンに対して同一あるいは類似の末端糖の特異性を有す るレクチンを用いたクロマトグラフィーにかけることからなる免疫原の調製方法 を提供する。

該界面活性剤は、好ましくはＮＰ４０．ＮＰ４０誘導体、ツウィッタージェント （ＺｗｉｔｔｅｒＢｅｎｔ）３　１４またはＳＤＳから選択される。

該調製方法は更に、コンカナバリン−Ａセファロースクロマトグラフィーおよび メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドによる溶離、調製的等電点電気泳動段階また はサイズ排除クロマトグラフィーを含んでもよい。

該調製方法の好ましい形態は、ダニのホモジネートを調製、膜リッチ画分を得る ための遠心分離、ツウィッタージェント３−１４のような界面活性剤でそれらの 膜を処理すること、小麦胚レクチンーセファロース６Ｂカラムのようなレクチン アフィニティーカラムでの界面活性剤可溶物質のクロマトグラフィー、ツウィッ タージエント３−１４のような界面活性剤含有緩衝液中の等電点電気泳動によっ てレクチン結合抗原を分離すること、一連の界面活性剤含有緩衝液におけるＢ　 ｉｏ　−Ｓ　ｉｆ　Ｔ　Ｓ　Ｋ４０００およびＰＰ３００ＳＷカラムのようなカ ラムでのサイズ排除ＨＰＬＣによるこれら抗原のクロマトグラフィーおよびＳＤ Ｓ電気泳動により得られた種々の画分の分析を包含する。

また、本発明は本発明法により得られた抗原を提供する。

本発明は天然物質を精製計画に従って実施して得られる抗原、および組換えＤＮ Ａまたは化学的合成方法の結果得られる組換えまたは合成免疫原も各々本発明に 従う方法によって得られる免疫原の範囲に含まれる。

更なる態様において、本発明はエンドＩｙｓ−Ｃのような蛋白質分解酵素で精製 抗原を処理する方法例、蛋白質分解酵素消化により得られたオリゴペプチド断片 をＡ　ｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ　−３００Ｃ８またはＡｑａｐｏｒｅ　ＲＰ　３１ ８カラムのようなカラムでのＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製すること およびこのようにして提供および精製されたオリゴペプチドのアミノ酸配列の幾 つかを決定することを提供する。

本発明は更に下記ペプチド断片のようなペプチド配列情報を提供する。

断片Ｎｏ。

Ｆｌ　（Ｋ）　Ｄ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　に　ＫＦ２　（Ｋ）　Ｍ　Ｙ　Ｅ　Ｄ　（に） 　Ｖ　Ｌ　Ｅ　Ａ　Ｉ（Ｘ）　Ｔ　Ｓ　Ｉ　Ｇ　ＫＦ３　（Ｋ）　（Ｘ）　Ｑ　 Ａ　ＣＥ　（Ｈ）　Ｐ　Ｉ　Ｇ　Ｅ　（Ｗ）　ＣＭ　Ｍ　Ｙ　Ｐ　Ｋ（Ｃ） Ｆ４　（Ｋ）　Ｅ　Ａ　Ｇ　Ｆ　Ｖ　Ｑ　ＫＮ　（＾）（＾） ＦＢ　（に）　Ｄ　Ｑ　Ｅ　（Ｙ）　（Ｙ）　ＹＦｉｌ　（Ｋ）　Ｗ　Ｙ　Ｅ　 Ｄ　ＲＶ　Ｌ　Ｅ　Ａ　Ｉ　ＲＴ　Ｓ　Ｉ　に　ＫＦ１２　（Ｋ）　Ｅ　Ｓ　Ｓ 　Ｉ　ＣＸ　Ｄ　Ｆ　（：　Ｎ　Ｅ　Ｆ　ＣＲＮ　Ａ　Ｅ　ＣＥ　Ｖ　Ｖ　ＰＦ １３　（Ｋ）　Ｔ　ＲＥ　ＣＳ　Ｙ　Ｇ　ＲＣＶ　Ｅ　Ｓ　Ｎ　Ｐ　Ｓ　ＫＦ１ ４　（Ｋ）＾ＹＥＣＴＣＰＲＡＦＴＶ＾Ｅ　Ｄ　Ｇ　Ｉ　Ｓ／ＨＣＫＦｌ６　（ Ｋ）　Ａ　Ｘ　Ｖ　Ｌ　ＣＥ　Ｘ　ＰＦｌ７　（Ｋ）　”’　Ｑ　Ａ　ＣＥ　Ｈ Ｐ　１注：信頼性の低いと考えられるアミノ酸は括弧に入れて示した。

Ｘはこの位置に帰すことのできるアミノ酸を示していない。

［コは混合された配列を示す。

本発明の好ましい態様では、以下のペプチド配列である。

ＦＩ　Ｋ　Ｄ　Ｐ　Ｄ　ＣＫ Ｆ２．Ｆｉｌ　Ｋ　１１　Ｙ　Ｅ　Ｄ　ＲＶ　Ｌ　Ｅ　＾　ＴＲＴＳＩにＫＦ３ ．ＦＩ７　Ｋ　Ｌ　Ｑ　Ａ　ＣＥ　ＨＰ　Ｉ　に　Ｅ　ＨＣＭ　Ｍ　Ｙ　Ｐ　Ｋ Ｆ４　Ｋ　Ｅ　Ａ　に　Ｆ　Ｖ　ＣＫ Ｆ５　Ｋ　（：　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｑ　ＣＩ　Ｎ　Ａ　ＣＫＦ６　Ｋ　Ａ　に　Ｖ　 Ｓ　ＣＮ　Ｅ　Ｎ　Ｅ　Ｑ　Ｓ　Ｅ　ＣＡ　ＤにＦ８　ＫＤＱＥ＾＾Ｙに Ｆ９．ＦＩＯＫ　ＣＰ　ＲＤ　Ｎ　Ｍ　Ｙ　Ｆ　Ｎ＾＾ＥＫＫＡＮＣＱＣＰＰＤ ＴＫＰＧＥＩＧＣＩＥＫＡＮＣＱＣＰＰＤＴＲＰにＥＩにＣＩＥＦ１２　Ａ　Ｅ 　Ｓ　Ｓ　Ｉ　ＣＳ　Ｄ　Ｆ　Ｇ　Ｎ　Ｅ　Ｆ　ＣＲＮ　Ａ　Ｅ　ＣＥ　Ｖ　Ｖ 　Ｐ　ＣＦ１３　Ｋ　Ｔ　ＲＥ　ＣＳ　Ｙ　Ｇ　ＲＣＶ　Ｅ　Ｓ　Ｎ　Ｐ　Ｓ　 ＫＦ１４　Ｋ　Ａ　Ｙ　Ｅ　ＣＴ　ＣＰ　ＲＡ　Ｆ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ｄ　ＣＩ　Ｔ 　ＣＫＫＡＹＥＣＴＣＰＳＧＲＴＶＡＥＤＧＩＴＣＫＦ１５　Ｋ　Ｎ　Ｌ　Ｌ　 Ｑ　ＲＤ　Ｓ　ＲＣＣＱＦ１６　Ｋ　Ｇ　Ｔ　Ｖ　Ｌ　ＣＥ　ＣＰ本発明は又そ れらのアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核酸配列を同定するた めのハイブリッド形成プローブとして用いるために適切なオリゴヌクレオチド配 列をそのアミノ酸配列データからデザインするため利用できる方法例は、ダニか らの相補ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ断片を含有するバクテリア細胞の構築方法、 該抗原をコードする相補およびゲノムＤＮＡ断片を含有するバクテリア細胞を同 定するためのオリゴヌクレオチドの利用、そのようなｃＤＮＡ断片のＤＮＡ配列 、組換えＤＮＡ技術を用いてその蛋白質の全部又は１部を合成するバクテリア又 は真核細胞を得ることのできる方法およびそれらの細胞を培養する方法およびダ ニに対する効果的ワクチンに含有されるダニ抗原またはその一部の精製方法を提 供する。

該ワクチンの作用ｔｊ！１楕の好ましいモデルにおいて、免疫応答がワクチン接 種された動物に誘起され、抗体のような宿主免疫系の成分を接種したダニの賜細 胞の表面とこの成分が相互作用することにより、および該成分単独、またはこの 成分と宿主血液の補体成分のような他の因子と相互作用することにより、ダニは 効果的に血液を消化することができなくなり腸細胞の溶解のような障害を起こす が、これは該ダニの腸は宿主血液成分に対して透過可能になるためで、この血液 成分、アルブミン、ヘモグロビン、免疫グロブリンおよび血液細胞がダニの血リ ンパ中に同定され、ダニは赤色を呈している。一方、このダニの障害は充血段階 前にワクチン接種された動物に寄食したダニの大部分を死に至らしめ、少数の生 き残ったダニは非常に強く障害を受けているので、ダニの充血体重は減少しおよ び／またはダニの生殖能力が減退する（６．７．８）。

本発明は又本発明の抗原のエピトープに対して生じる抗体（即ち、イディオタイ プ抗体）およびそれら第１抗体の可変領域に対して生じる抗体（即ち、抗イデイ オタイプ抗体）に関し、この後者の抗体は抗原のエピトープに類似するものであ る０本発明は効果的ワクチンとして動物の受動的防衛（イディオタイプ）または 、動物の能動的防衛（抗イデイオタイプ）に用いることができ、これにより効果 的な防衛をもたらす。

（図面の簡単な説明） 第１図はｒＩＥＦ後のＷＧＬプール」およびｒＩＥＦ後のＬＬプール」の単離方 法を示す図である。

第２図はｒＬＬ”抗原」単離のための分画法を示す図である。

第３図はｒＷＧＬ＋抗原」単離のための分画法を示す図である。

第４図はＷＧＬ”″およびＬＬ”抗原単離のための精製法を簡明に示した図であ る。

第５図はＷＧＬ”抗原の純度を示す。

第６図はｃＤＮＡ合成のフローダイアグラムを示す。

第７図はＷＧＬ＋遺伝子のＤＮＡ配列を示す。

第８図はＤＮＡ配列から導かれるＷＧＬ”抗原の翻訳アミノ酸配列を示す。

第９図は発現計画例を示すＷＧＬ“遺伝子部分の制限酵素地図である。

第１０図はバクテリアによるＷＧＬ＋発現を証明するＳＤＳポリアクリルアミド ゲルおよびイムノプロットを示す。

第１１図はＷＧＬ＋をコードするウシマダニＤＮＡと他のダニ種からのＤＮＡと のハイブリッド形成を示す。

（発明を実施するための最良の形態） 以下、実施例に従って本発明を更に詳述するが、本発明はこれに限定されるもの ではない。

試剤元 ５ｅｐｈａｅｒｙｌ（セファクリル） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　ＭＢ（セファロース６ＭＢ＞Ｚ　ｗｉ　ｔｔｅｒｇｅ ｎｔ　３　１４　（ツウィッタージェント３−１４＞Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ（セフ ァデックス）Ｂｒｉｊ３５（ブリッジ３５） Ｂｉｏ−ｇｅｔ（バイオゲル） 臭化シアン ５ａｒｋｏｓｙｌ（サルコシル） エンドプロテナーゼＩｙｓ−ｅ トリフルオロ酢酸 ＦＢＡ アセトニトリル ＨＰＬＣカラム ポリＵセファロース オリゴｄＴセルロース ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ３２ｐ−ラベル化デオキシヌクレ オチド三リン酸スペルミジン ＰＥＩセルロース コンカナバリンＡ−セファロース ＣＮＢｒ−セファロース Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ファルマシア） ファルマシア Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅｓ＋（カルビチオエム）ファルマシア Ｓｉｇｍａ（シグマ） Ｂｉｏ　Ｒａｂ（バイオラット） Ｓｉｇ＋ｍａスはＡｊａｘ（シグマ又はアジャックス）シグマ Ｂｃｅｈｒｉｎｇｅｒ（ベーリンガー）Ｐ　１ｅｒｃｅ（ピアス） ピアス Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ（マリンクロット）Ｗａｔｅｒｓ（ウォーターズ）、 バイオラット、　Ｂ　ｅｃｋｓａｎ　（ベックマン）共同研究 Ａｍｅｒｓｈａｍ（アマ−ジャム） Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｓ Ｍｅｒｃｋ（メルク） 他の用いられた化学物質は試薬級のものである。

略語　− ＨＰＬＣ高速液体のクロマトグラフィーＳＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸 ＷＧＬ　小麦胚レクチン ＷＧＬＩ　抗原プール１結合小麦胚レクチンＷＧＬ２　抗原プール２結合小麦胚 レクチンＷＧＬ＋　小麦胚レクチン結合抗原 ＷＧＬ−小麦胚レクチン非結合 ＩＥＦ　等電点電気泳動 ＬＬ　ヒラマメレクチン ＬＬ”　ヒラマメレクチン結合抗原 ＬＬ−ヒラマメレクチン非結合 ＨＥＰＥＳ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’　−２−エタンスルホ ン酸 ｘンドＩｙｓ　ＣエンドプロティナーゼＩｙｓ　ＣＤＴＴ　ジチオスレイトール ｐＩ　等電点 ＨＦＢＡ　ヘプタフルオロブタン酸 ＢＳＡ　牛血清アルブミン ＭＭＬＶ　ネズミ科マロニー白血病ウィルスｄＮＴＰ　デオキシヌクレオチド三 リン酸ｄＡＴＰ　デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ　デオキシチジン三リン 酸 ｄＧＴＰ　デオキシグアニジン三リン酸ｄＴＴＰ　デオキシチミジン三リン酸 ｄ（ＧＴＣ）ＴＰ　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合ＮＡＤ　ニコチン アミドアデノシンジヌクレオチドＡＴＰ　アデノシン三リン酸 ＰＥＩ　ポリエチレンイミン ＢＲＬ　ベセスダリサーチラボラトリーズＴＢＩ　国際バイオテグノロジ−Ｉｎ ｃ。

＾２６０．＾２８０２６０または２８０ｎ＋ｍでの吸光度ｃＤＮＡ　補助ＤＮＡ ｄＳ　２重鎖 ｇ　グラム ｆｌａＶ　平均重力単位 輪、μ＋ｎ＋１’　（接頭辞）ミリ、マイクロ、ナノ、ピコＭ　グラム分子 １　リットル Ｕ　活性単位（制限酵素） ｂｐ　塩基対 ｋｂ　キロ塩基対（千塩基対） ＴＣＬ　薄層クロマトグラフィー ＥＬＩＳ＾　イライザ 緩衝液 １０×第１成分　０．５Ｍ　）リス　ｐＨ７，５０，７５Ｍ　ＫＣｌ ０．０３Ｍ　ＭｇＣｌ２ ５×第２成分（ＲＮａｃｅＨ）０．２Ｍ　トリス　ｐＨ７，５０，０５Ｍ　Ｍｇ Ｃ１ｚ Ｏ，ＩＭ　（Ｎ　Ｈ４）２　Ｓ○。

ＩＭ　ＫＣｌ １．５ｍｍ　Ｂ　ＮＡＤ １０×メチラーゼ緩衝液　０．５Ｍ　）リス　ｐＨ７，５０、ＯＩＭ　ＥＤＴＡ ０．３３Ｍ　）リス−酢酸ｐＨ７，９ ０，６６Ｍ　＃酸カリウム ０．１Ｍ　酢酸マグネシウム ５×キナーゼ緩衝液　０．０５Ｍ　）リス　ｐＨ７，５０，０５Ｍ　ＭｇＣｌ２ ０．０５Ｍ　ＤＴＴ ０．５ｍＭ　スペルミジン １０×ライゲーシヨン緩衝液　０．３Ｍ）リス　ｐＨ８１７ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　 Ａ ７０ｔａＭ　ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ Ｏ，ＩＭ　ＤＴＴ ２０Ｍｇ／Ｉａｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ １軸Ｍ　スペルミジン １０×高温［衝液　ＩＭ　ＮａＣ１ ０，５Ｍ　）リス　ｐＨ７，５ ０、１Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２ １０ｍＭ　ＤＴＴ １０ＸＳ！ｌ夏衝液　０．３Ｍ　耐１俊ナトリウム　ｐＨ４，４２，５Ｍ　Ｎａ Ｃ１ １０ｍＭ　Ｚ　ｎＣ１２ １０ｎ＋Ｍ　）リス　ｐＨ７，５ １ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡ ＴＥ　１０蒙Ｍ　トリスｐＨ７，５ １ｍＭ　ＥＤＴＡ Ｐ　Ｅ　Ｉ　−ｔ＝ニル−スフ７衝液　０．７５Ｍ　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４１１１Ｈ ３，５緩衝液Ａ　０．０５Ｍ　）リス ０．０３Ｍ　酢酸 ０．１Ｍ　ＮａＣＩ ＴＥＡＢＩＩ衝液 ＴＥＡＢは溶液にＷ２を吹き込むことによってｐＨ７に平衡化されたトリエチル アミン溶液である。これは１Ｍ溶液として４℃下貯蔵される。このｐＨは使用前 にチェックされ、必要ならばＣＯ□ベレットで再平衡化される。

実施例１ （、）　少なくとも幾つかの防衛的抗原が糖蛋白質であることの証明 原形質膜蛋白の大部分が糖蛋白質であるため、レクチンアフィニティで濃縮され た防衛的抗原の特徴化が第１に試みられる。小麦胚レクチンおよびコンカナバリ ンＡはダニ抗原調製成分Ｂ４／Ｂ５を結合することが分った。従って、ダニ調製 抗原の幾つかはＮ−アセチルグルコサミン残基を有していると考えられた。小麦 胚レクチンは精製計画において、他の同−又は類似の末端糖特異性を有するレク チンと代替されうる。

約２．１Ｂの抗原Ｂ４／Ｂ５は狭範囲等電点濃縮（オーストラリア特許願Ｎｏ、 ８５−４５９３６号に記載）により精製され、これを０．０５Ｍ）リスクロライ ド緩衝液中１％ツウイッタージエン）３−１４、ｐＨ８中Ｍ　Ｇ　Ｌ−セファロ ース６　Ｍ　Ｂ　（１４）カラムにかけ、同一のＭ衝液で洗浄した。結合糖蛋白 質を次いで該同−［衝？？Ｉに１００Ｂ／ｍ１のＮ−アセチルグルコサミンを含 む溶液にて溶離した。結合および非結合物質を用いて羊に免疫した（グループ当 り５頭用いてフロインド不完全アジュバント下２回ワクチン接種した）、誘起さ れた免疫の測定は、脱皮したばかりの成虫のダニを羊に付着させ、３日後その皮 膚に付いているダニの数に対して、充血に成功したダニの割合を算出した（表１ ）。

表１ 糖蛋白質調製品による羊の免疫 グループ　充血したダニの割合（％） コントロール　１００，１００，１００，１００，１００ＷＧＬ非結合物質　１ ００．　６．９３，１００，１００ＷＧＬ結合物質　０．９３．　０．８３．２ ８ワクチン接種されたグループの幾頭かはダニの寄生に対して高度に防衛された ことが明らかである。ダニの寄生前にワクチン接種後、各年から血清を得て、ワ クチンに用いた抗原に対する各該血清試料の抗体力価をラジオイムノアッセイに て測定した。ダニの障害を示した各グループの動物は投与された抗原調製品に対 して高抗体力価を有した、一方、障害の見られなかった充血したダニの大くを許 容した動物は低い力価しか有しなかった（データは示していない）、防衛的抗原 はこの実験の両画分に存在したと考えられるが、幾頭かに見られたダニへの障害 の失敗は、目下不明確な理由のためワクチン接種に対して積極的に応答したため である。

（ｂ）　羊での一連の実験において、画分ＧＦ５および６、即ち、更に高度に精 製したゲル口過両分（オーストラリア特許願Ｎｏ。

８５−４５９３６号）をＷＧＬ−セファロースアフイニテイ力ラムクロマトグラ フィーにかけ、特異的に結合したおよび結合しなかった物質を上述と同様に羊に ワクチン接種をするために用いた。再び、各グループの幾頭かの動物に対して各 両分のワクチン接種を施して誘起された免疫応答のダニへの障害能力を（残存率 ％）赤色を呈した割合（障害％）生き残ったか充血したダニの平均体重において 評価したが、免疫応答したものは残存率、特に、アフィニティ力ラムに結合した 物質はここで特徴化されているが、非結合画分でも防衛能力を明らかに示してい る。

（ｅ）　上述と同様な試験を牛にＷＧＬ−セファロースカラム結合および非結合 物質でワクチン接種した（表−３）、ワクチン接種に続いて両両分により誘起さ れた免疫応答により寄食ダニに障害を与えた。この実験ではＷＧＬ−セファロー スカラムに結合しなかった物質が特に効果かがあった。

表−３ グループ　動物Ｎｏ、ダニＮｏ、障害（％）　体重（醇）注：ここでおよび後述 でダニＮｏ、とは１日当り各動物から落下した充血雌ダニの平均数を意味する。

ワクチン接種後３週間、少なくとも１６日間１日当り約１０００の幼虫を牛につ ける。

ダニが成熟し、充血したダニが見られるようになる時、充血ダニを各日ごとに集 めて少なくとも１６日間計数する。この数はダニＮｏ、欄に挙げたもので平均し たものである。この期間各−日において、目にみえて障害されたダニ数（赤色ダ ニ）を計数し、障害（％）欄に平均値を示した。また充血ダニの平均体重も決定 した。

（ｄ）　この実験と共にＷＧＬ−セファロースカラムに特異的に結合した物質を ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて分画した。

これらゲルの銀染色は両分（Ｓ２およびＳ４）として切り出された２染色主成分 を示し、また、同様にその中間領域のゲル（画分Ｓ　１　、Ｓ　３　、Ｓ　５お よびＳ６）を牛へのワクチン接種に用いた。

最も高度に免疫を示した分画はＳ（表−４）であった、このＳ２はファルマシア およびＢＲＬの分子量マーカーと比較するこのゲル系において約８０−９０キロ ダルトンの見かけの分子量を有する染色ゲルに見られるバンドの一つと一致する 。

この実験において、Ｓ２でワクチン接種された牛の残存ダニ数は他のグループと 比較して減少している（ダニＮｏ、欄−２１日間における１日および１頭当りの 平均充血落下値ダニ数）更に、残存ダニの大部分は赤色化し、あるいは、目視し て異常（障害％）であり、Ｓ２グループの残存ダニの体重は他のグループの動物 のダニと比較して減少していた（表−４）。

Ｓｌ　９４７　１９６　１０　２１５ Ｓ２　９４１　１１５　６８　１４７ Ｓ３　９６１　１６６　３　２１２ Ｓ４　２３９　１６３　１　２２９ Ｓ５　９３７　２７６　３　２４８ Ｓ６　９４６　２６９　１２　２２２ （ｅ）　ＷＧＬ、−セファロースカラムに保持されない物質と反応できるのはど んな範囲のレクチンであるが決定するためインビトロ実験を実施した。ヒラマメ レクチンは反応性があることが分った。そこで、ＷＧＬ−セファロースに結合し ながった物質をヒラマメレクチンカラム（１５）にて分画した。牛にこれらの両 分をワクチン接種した所、ＷＧＬに結合されなかった物質に対して免疫応答があ り、ＬＬ−セファロースに結合した物質はワクチン接種の牛に寄生したダニへの 障害は若干率さいことがわかった（表−５）、この画分のＳＤＳゲル分析は上述 の実験で同定したＳ２抗原と同じ範囲の分子量を有するバンドを示している。

コントロール　９９０　１９５　０．７　２５２９８０　２２０　０．７　２４ ３ ９７９　２４８　０．６　２５２ ９８８　１８５　３０．８　１９７ この実験に用いた両両分はこの実験において、防衛を与える免疫応答を誘起する 能力があった。

しラマメレクチンクロマトグラフィ一段階は小麦胚レクチンクロマトグラフィ一 段階より８２抗原と同様な分子量を有する物質を非常に高収量で得られる。

この分子量の類似およびレクチンアフィニティにおける相違は、共通のペプチド 骨格と異なるグリコジル化に関連すると考えられた。

これは、後述の通り誤りであることが分った（実施例２ｇ）。

Ｓ２との予想される類似性およびＬＬ結合物質の量の多さのため、更なる精製の ための出発物質として用いられると考えられた。

しかし、ＷＧＬ結合物質（実施例３）を用いた効果的なワクチン接種に対してこ の物質の薄弱な効果のワクチン接種およびアミノ酸組成の相違の証明は、Ｓ２ま たはＷＧＬ”″物質の更なる精製計画とクローニング計画を押し進めることとな った。

実施例２ 上述の結果として、主要防衛的抗原（Ｓ２として言及）の等電点、分子量、およ びレクチン結合特性を知ることができたので、単離操作の効果的改善をするため 何度か実験が行なわれた。下記の方法はＳ２抗原（小麦胚しクチン結合抗原−Ｗ ＧＬ＋抗原またはＷＧＬ”として言及）およびヒラマメレクチン結合抗原（ＬＬ ”抗原またはＬＬ＋として言及）をオーストラリア特許願Ｎｏ、８５−４５９３ ６に比較し少なくとも１０倍量得ることが新たに分った。この操作の要点を流れ 図（第１〜４図）に示した。

主要防衛的抗原単離操作の改善 （ａ）　ダニ膜および微粒子物質の単離および抽出雌ウシマダニの半充血成虫１ ２９０ｇを充血が完了する前に牛から採取した。

これらを、０．０５Ｍ）リス、０．０２５Ｎ酢’１ｍ、０．１ＨＮａＣ１，１ｍ ＭＥＤＴＡでホモジナイズし、このホモジネートをガーゼで大部分の外皮片を漉 し、緩衝液で洗浄した。この抽出において、ダニ１２当り３ｍｌの緩衝液を用い た。

このダニ物質サスペンションを１１当りフェニルメタンスルフォニルフルオライ ド３００１と混合し、１５分、６００×ｙｓｔｖ下遠心した。この上清を３０分 、２０．ＯＯＯＸｇａｖ下遠心し、更にこの上滑を１時間、１００，０ＯＯＸｙ ａｖ下遠心した。これらの遠心の各沈殿物を集め、用いるまで一２０℃に凍結し た。

６００　ＸｆＩａｖ　２０，０００Ｘｇａｖおよび１００，０ＯＯＸＩ？ａｖの 沈殿物を溶解し、緩衝液Ａ（０，０５Ｍ）リス、０．０３Ｍ酢酸）に懸濁して蛋 白質濃度で測定した。この懸濁液をブリッジ３５含有緩衝液Ａで希釈し、蛋白質 と界面活性剤の濃度が各々５および１０１１１ＦＺＩ１１とした。ダニ物質を３ ７℃、１時間抽出し、２０℃、３０分３．３００ｘｇａｖで遠心した。この沈殿 物を）！街液Ａにて再懸濁し、蛋白質濃度を再測定した。ブリッジ３５に代えて ツウィッタージェント３−１４を用い上記と同様の蛋白質および界面活性剤濃度 上抽出を繰り返した。抽出時間は９０分まで延長した。この懸濁液を上述と同様 に遠心して上清を保存した。

（ｂ）　レクチンアフィニティクロマトグラフィーおよび等電点電気泳動（第１ 図） ツウィッタージェント３−１４抽出上清（３２５５ｍｌ）を２０℃、１６時間Ｗ ＧＬセファロース９０＊１と撹拌し、次いでろ過し、このＷＧＬセファロース複 合体をｌ　８Ｘ２．５ｃｍカラムに流し込み、１％ツウィッタージェント３−１ ４含有緩衝液で洗浄し、１％ツウィッタージェント３−１４およびＮ−アセチル グルコサミン１００　ｗａｇ／　ｍｌ含有緩衝液にて溶離した１画分をＡ２８０ 吸光度をもとに小麦胚レクチン結合プール１（ＷＧＬＩ）を与える特異溶離物質 としてプールした。ＷＧＬセファロースによる界面活性剤上清の吸着およびその 結合物質の溶離を上述と同様に繰り返しＷＣｌ２を得た。この２つの溶離液をプ ール＜ＷＧＬプール）した。

このＷＧＬプールを２Ｘ２．５ｆの水に対して透析し、次いで０．１Ｈアンモニ ウムチオシアネート含有０．０５Ｍ）−リス−クロライド緩衝液ｐＨ７，５に対 して透析した。コンカナバリンＡ−セファロース（ファルマシア）を２．５Ｘ　 １１ｃｍカラムに流し込み、０．０５Ｍトリス、１％ツウィッタージェント３　 １４．０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍアン モニウムチオシアネート含有のＨｅｌ　ｐＨ調整ｐＨ７，ｓ緩衝液で洗浄した。

ＷＧＬプールをこのカラムにかけ、洗浄し、特異的結合物質を５０ｍ１Ｆ／ｙａ ｌメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを追加した同様の緩衝液にて溶離した０両 分をプールし、水に対して透析し、調製用等電点電気泳動にかけた。

等電点電気泳動け、１％（−／ν）ツウィッタージェント３−１４および１〜１ ５倍希釈ファルマライト４−６．５含有ＩＥＦセフフアデツクスフラツトベツド にて１０，０ＯＯＶｈｒ実施した。各々の画分をＳＤＳゲル電気泳動にて分析し た。必要な蛋白質はｐ　１５．３〜５．７の画分に存在すると考えられたがｒＩ ＥＦ後ＷＧＬプール」を与えるプールはｐ　Ｉ　５．４〜５．６の両分のみとし た。

ＷＧＬセファロースを用いた２度目の抽出ｆ＆残ったツウィッタージェント可溶 物質をＬＬ−セファロ−スフ０ｍｌと混合し、２０℃２４時閏撹拌し、このり濁 液をろ過し、集めたセファロース複合体を２．５Ｘ　１４ｃｍカラムとして流し 込んだ、これを、次いで、トリス−酢酸、１％ツウィッタージェント３−１４緩 衝液で洗浄し、５０　Ｂ／　ｖａｎメチル−α−Ｄ−マンノーピラノシド含有の 上述と同様の緩衝液にて溶離した０両分をＡ２８０を基にプール１、水に対して 透析した。更に、ＷＧＬ結合物質の所ですでに記載した条件を用いて調製的等電 点電気泳動により分画した０両分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ り分析した。単離される蛋白質はｐ１４．８〜５．２の範囲で電気泳動されたが 、次の精製のためにプールされた分画はｐＩ４．８〜５．０であった。

最初のアフィニティクロマトグラフィーからのＬＬ非結合物質を再びＬＬ−セフ ァロースに再吸着させ、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドの特異的溶離物質を ＩＥＦにて分離した。同じｐ　Ｉ　４．Ｓ〜５．０の範囲を有する物質をプール し、これら２実験の精製品を混合しｒｌＥＦ後ＬＬプール」を得た。

ｒＩＥＦ後ＷＧＬプール」およびｒＩＥＦ後ＬＬプール」の単離方法を第１図に 説明的に示した。

（ｃ）　ＩＥＦ後ＬＬプールの疎水クロマトグラフィー（第２図）ＬＬ−セファ ロースの１．６　Ｘ　６．５ｃ納のカラムを０．ＩＭ）リス−酢酸緩衝液、１％ ツウィッタージェント３−１４　ｐＨｓ、ｏで平衡化した。「ＩＥＦ後ＬＬプー ル」をｐＨ７，１に調整してこのカラムにかけ、次いで緩衝液、そして、０．Ｉ Ｍ）リス−酢酸緩衝液、０．１％ブリッジｐＨ７，５で洗浄した。結合物質を５ ０ｕ／ｍｆメチルーα−Ｄ−マンノピラノシド含有０．ＩＭ）リス−酢酸緩衝液 で溶離した。

溶離物質を０．ＩＭ）リス−酢酸−ブリッジ緩衝液に対して透析し、次いで酢酸 アンモニウム濃度を最終０．５Ｍとなるように添加した。

この試料を０．ＩＭ）リス−酢酸、０．５ＭＴｆＬ酸アンモニウム、０．１ニブ リツジ、ｐＨ７，５で平衡化した７、５Ｘ７５ｎｎ＋Ｔ　Ｓ　Ｋフェニル−５− ＰＷカラムにかけた０次いで、洗浄後、このカラムをこの出発Ｍ衝液から０．Ｉ Ｍ）リス−酢酸、０．１１ブリッジｐＨ７，５までの線形勾配にて溶出した０画 分をＳＤＳゲル電気泳動で分析し、必要な蛋白部分をｒＬＬ”抗原」またはＬＬ ＋を得るためプールした。

この操作を第２図に示した。

（ｄ）　ＩＥＦ後ＷＧＬプールのサイズ排除クロマトグラフィー（第３図） ｒｌＥＦ後ＷＧＬプール」のｐＨを７．３に増大し、０．０５Ｍ）リス−Ｈ（Ｊ 、０．２６＄’７ウイツタージエント３−１４　ｐＨ７，５で平衡化したＷＧＬ セファロースカラムにかけた。このカラムを０．０５Ｍ　）リス−ＨＣｆ、０． １１Ｓ　Ｄ　Ｓで洗浄し、次いで結合物質を１００Ｂ／ｍｆＮ−アセチルグルコ サミン含有トリス−ＨＣｌ−５ＤＳ緩衝液にて溶離した０画分をＳＤＳ電気泳動 で分析し、必要な蛋白含有部分をプールし、０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液ｐ Ｈ７，５で透析し、５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄｖａｃ、下濃縮した。

サイズ排除クロマトグラフィーを＃Ｉａｔｅｒｓ　ＨＰ　Ｌ　Ｃ系を用いて実施 し、続いて、５ｉ２００ポリオール保護カラム（セルバ、ハイデルベルグ）、７ ．５＄Ｓ０ｃｍ　Ｂｌｏ−５ｉｔ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　４０００および７．５＄Ｓ０ｃ ｍ　ＰＰ３００　ＳＷ（ウォーター）を実施した。クロマトグラフィーは０．０ ５Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　０．１Ｍナトリウムチオシアネート、０．１＄Ｓ 　Ｄ　Ｓ含有Ｎ　ａ　ＯＨｐＨ１１整ｐＨ７，０［衝液にて、流速１ｔａｌ／分 およびカラム温度３７℃下実施した。この系では、牛血清アルブミンは溶出時間 １３．８分、リボヌクレアーゼＡは１７．７分であった６画分をＳＤＳゲル電気 泳動にて分析した。注目物質は１４〜１５分の間にＨＰＬＣカラムから溶出する ことが分り、これらの両分をプールした。

この段階の精製品はまだ低分子量物質を若干不純物として含有しマイタ。従ッテ 、これヲｏ、ｏｓｓトリｘ−Ｈｃｌ、Ｏ，Ｉ＄Ｓ　Ｄ　５ｐＨ７，５の０．６　 Ｘ　１０ｅｍ　Ｗ　Ｇ　Ｌ−セファロースカラムにかけ、この緩衝液で洗浄し、 最初２０す／ｌａ１、次いで１００　ｍｇｌ　ｍ１Ｎ−アセチルグルコサミン含 有の上記と同様の緩衝液にて溶離した０画分をＳＤＳゲル電気泳動にて分析し、 各所望蛋白質の量及び純粋さに基づきプールした。これらは、上述と同様にＨＰ ＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにかけると共に濃縮した。所望抗原（ｒＷＧ Ｌ＋抗原」）含有画分の最終プールを上述と同様にＳＤＳ電気泳動分析後に得た 。

この操作を第３図に示した。

（ｅ）　蛋白質の決定 蛋白質決定の４方法を抗原単離の開用いたが、この方法は必要とされる感度およ び予想される妨害物質の性質を基に選択された。これらの方法は第１〜３図に略 語で示しな：１、ビユレット法＝（Ｂ） ２、Ａ２８０およびＡ２６０測定の分光的方法＝（Ｓ）３、ｏ−フタルアルデヒ ド修飾高分子の積分蛍光の蛍光法＝（Ｆ） ４、蛋白質１す７社溶液のＩＣｌ１１の光通過が２８０μ−で１の吸光度を示す と考えられ、ＨＰＬＣクロマトグラフィー間の積分Ａ２８０に基づく吸光度法＝ （Ａ）（ｆ）単離操作におけるコメント 上述の操作で残った主要な問題はＷＧＬ＋抗原の調製において、低分子量の不純 物がＳＤＳゲル電気泳動によって観察されることである。この不純物は、５ＤＳ ｉ衝液のＷＧＬ−セファロースアフィニティクロマトグラフィーおよび２倍濃度 のＮ−アセチルグルコサミンによる溶離により部分的に、全体的でなく除去でき る。

この不純物量は調製から調製へと変化する。一連の抗原単離において、それは微 量存在するが、良好な抗原の純粋さはｐＩ５．３０〜５．６７の範囲で調製的等 電点電気泳動した画分をプールした後、単独ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフ ィーを実施することにより得られる。従って、ＷＧＬ＋抗原の収率は一層高い（ １，３ｋｙのダニから約３００μｆＩ）。

第５図は、両分ＧＦ５／６、即ち、この研究の出発物質（レーン１）、精製ＷＧ Ｌ＋抗原（レーン４および５）およびＬＬ＋抗原（レーン６および７）およびこ れらと共に適当な分子量マーカー（レーン２．３および８）の５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲルの側面図を示した。これらのゲルから明らかな通り、ＧＦ５／６ 両分は非常に不純であり、ＷＧＬ′″抗原に加えて非常に多くの成分を含有して いる。この画分ては、ＷＧＬ”抗原は他の成分から区別できない微量成分である 事実を示している。該ＷＧＬ＋及びＬＬ”抗原は高度に精製されている。レーン ５において、Ｗ　Ｇ　Ｌ　”抗原は過剰かけられたので、低分子量の不純物の微 量が観察される。

（ｇ）ＷＧＬ”およびＬＬ＋抗原のアミノ酸組成この新規な方法により単離され たＷＧＬ＋およびＬＬ”抗原試料をアミノ酸分析した。このＨＰＬＣプロットお よびＨＰＬＣプリントアウトの各ピーク下の積分値から計算したアミノ酸配列か ら、その抗原は異なるアミノ酸組成を有することを示した（表−６）。加えて、 これらの抗原は異なるレクチン結合特性を有することから異なる末端糖残基を明 らかに有する。

表−６ ダニ抗原のアミノ酸組成（モル％） ＷＧ　Ｌ　’″抗原　ＬＬ＋抗原 Ａｓｐ　７．４　１１．０ Ｇｌｕ　６．８　１０．３ Ｓ　ｅｒ　９．７　７．４ Ｇ１７　７．４　１０．５ Ｈｉｓ　２．９　２．９ Ａｒｇ５．０　５．２ Ｔｈｒ　９．０　５．６ Ａｌａ　９．１　６．８ Ｐｒｏ　５．９　５．２ Ｔｙｒ　４．８　３．９ Ｖａｌ　７．９　６．５ 八ｆｆｅｔ　１．９　２．９ Ｃｙｓ　１．４　０．５ Ｉ　ｌｅ　４．７　４．５ Ｌｅｕ　６．６　８．８ Ｐｈｅ　４．１　４．０ Ｌｙｓ　５．４　３．８ 注：この測定ではＴｒｐは破壊される。この結果は、２４．４８および７２時間 酸加水分解後に得られた試料による。

実施例３ ＷＧＬ”およびＬＬ！抗原のワクチン活性ＷＧＬ”抗原（２１μｇ）およびＬＬ ＋抗原（４００μ２）の各試料をフロイント完全アジュバントにホモジナイズし 、これをオーストラリア特許願Ｎｏ、８５　４５９３６に記載された通り（ワク チン接種動物当り各調製品の１／１０）牛にワクチン接種するため用いた。ワク チン接種された動物は、コントロールの動物と共にダニに寄生され、実験動物か ら落下した雌の充血ダニ数を１６日間計数した（表−７）、非常に少量のＷＧＬ ”抗原でワクチン接種した牛は１日当り各動物から落下したダニ数が減少してい ることからインフエステーションから強く防衛された。また、残存ダニは一層減 少し、かつ残存ダニの大部分はダニの血リンパ内へ牛の血液成分を通す腸障害の 結果として障害が目視された（赤色％欄）、加えて、ＷＧＬ”抗原でワクチン接 種した牛に残存したダニは、コントロールに比べて非生産能力が非常に減退した 。

表−７ 動物Ｎｏ、卵ｗｔ／ダニｗｔ　抗原　ダニＮ　ｏ、ダニｗｔ　赤色（％）２６　 ０．４９　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　１９９　２２４　６２９　０．５２　２３７　２ ３１　３ ３１　０．４７　２２７　２２０　１ ３６　ＷＧＬ−１８６２２８３ ４０Ｌし　１７０　１９９　４ より多量投与されたＬＬ＋抗原は、イライザによるこのワクチンに対する強い免 疫応答（データ示さず）を示した事実にもかかわらず、牛への意義ある防衛能力 を与えていなかった０両ＷＧＬ＋およびＬＬ＋抗原はＳＤＳゲル電気泳動により 非常に純粋であると思われかつ両者は、ＢＲＬ分子量標準物と比較したゲル系で 約８９ｋｄの類似した分子量を有する。

上述の要点を示した新規精Ｍ操作は、従来の出発物質のダニ１．２９に、当りｒ Ｓ２Ｊ抗原約３μ２と比較し、３３−３００μ２ＷＧＬ＋抗原の収量を得るとい う改善がある。これら２抗原（ＷＧＬ、＋およびＳ２）は分子量類似、等電点、 レクチン結合特性、アミノ酸組成およびワクチン活性に基づき同一の糖蛋白質で ある。

実施例４ エンドブロティナーゼ１ｙｓ−ＣによるＷＧＬ＋抗原消化、オリゴペプチドの分 別、オリゴペプチドのアミノ酸配列決定およびＷＧＬ”ペプチドをコードするＤ ＮＡ配列含有組換え有機体を検知するハイブリッド形成プローブとして有用なオ リゴヌクレオチド配列のデザイン実施例２に記載の精製ＷＧＬ”″抗原約４０μ ２を２０ｍＭジチオスレイトールおよび２％（ｗ／　ｖ）　Ｓ　Ｄ　Ｓを含有す る０、１Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８，３１００μｌと混合し、５６℃、３０ 分インキュベートした。この溶液を室温まで冷却し、ヨウ素酢酸ナトリウムを最 終濃度０．１４Ｍになるまで添加した。暗所にて４５分後、メタノール：試料（ ｖ／ｖ）が９：１となるよう冷メタノールを添加した。試料を一晩−２０℃下放 置して遠心し、上清を除去し沈殿物を乾燥した。

沈殿物を４Ｍ尿素含有０．ＩＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液７−６μｌ、ｐＨ８，５に 溶解し、次いでエンド１ｙｅ−Ｃ４μｍ（論！当り６単位）を添加した。３７℃ 、２時間後、別に酵素４μ！添加し更に１７時間この消化を続行した。

この消化物を０．１ｇ）リフルオロ酢酸のアクアボアＲＰ−３００Ｃ−８カラム に直接かけ、ペプチドを０．ＩＳ）リフルオロ酢酸中０〜６０％Ｖ／Ｖアセトニ トリル／水、線形勾配にて溶離した。

必要により、ペプチドをアクアボア３１８カラムを用いた同一溶媒系で再クロマ トにかけた。ペプチドを集め、ロータリーエバポレータにより５０〜１００μｌ に濃縮した。このオリゴペプチドのアミノ酸配列をかけられたバイオシステムの アミノ酸配列機を用いて決定した。下記のペプチド配列を得た。−文字および３ 文字コードのアミノ酸を表−８に示した。

断片Ｎｏ。

Ｆｌ　（Ｋ）　Ｄ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　Ｇ　Ｋ　（２０−で−すりゴス２レオチド）加 えて、下記のペプチド配列は、大変不確実（特にＦ７）ではあるが、クローンの 特徴化に寄与することのできる混合配列から演鐸された。

オリゴヌクレオチドはこれらのアミノ酸配列を用いて調製さ２０−ｍｅｒ　Ｔ　 Ｔ　Ａ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＴ　ＣＣ；　Ａ　Ｔ　ＣＣＴ　Ｔ”。

５゜ 注二下記の考えはペプチド配列を翻訳する場合およびオリゴヌクレオチドプロー ブを構成する場合になされる：Ｎｏｓ、　１〜６は上記ペプチド配列の肩に言及 するものである。

１、　エンドＩｙｓ−Ｃ特異性により各ペプチドに決定される第１アミノ酸に先 行するリジン（Ｋ）と考えられる。

２、　これらのアミノ酸は予想されるより低いモル比を検知するものの正しいと 考えられる。

３、Ｘとして示される位置に確かに帰属されるアミノ酸がない。

４、　この位置は数種のアミノ酸を含む、オリゴヌクレオチド形成のため、正確 なアミノ酸はり、ＡまたはＬと考えられるが、他のアミノ酸かもしれない。

５、　幾つかの配列では１種以上のアミノ酸が検知される。この不確実はカッコ で示す。

６、　これらの配列は混合され（かぎカッコ）、各サイクルにおいて検知される アミノ酸の相対モル量は略同−である。

７、　ハイブリッド形成プローブとして利用されるオリゴヌクレオチドを形成す るには公知の手段が用いられる０例えば、イノシン塩基は冗長コドンの第３位置 において数種のデオキシリボヌクレオチドが用いられる位置に含有される。それ らに対する逆相補配列もまたハイブリッド形成プローブとして同等に用いられる 。実施例において示されるコドン利用は海エビ伸長因子（１２）をコードする配 列に基づく。

表−８ アミノ酸　三文字コード　−文字コードアラニン　ａｌａ　＾ アルギニン　ａｒｌｉ　Ｒ アスパラギン　ａｓｎ　Ｎ アスパラギンａ　ａ　ｓ　ｐ　Ｄ システィン　ｅｙｓ　Ｃ グルタミン酸　ｇｌｕ　Ｅ グルタミン　ｇｌｎ　Ｑ グリシン　εｌｙ　ｃ ヒスチジン　ｈｉｓ　Ｒ メチオニン　＋ｓｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　ｐｈｅ　Ｆ トリプトファン　ｔｒｐ　Ｈ チロシン　ｔｙｒ　Ｙ バリン　ｖａｌ　Ｖ 実施例５ ＷＧＬ”抗原的４０μｇを実施例４に記載の通りエンドＩｙｓ−Ｃで消化した。

消化産物を０．１！ヘプタフルオロブタン酸（ＨＦＢＡ）の７’７ボ７ＲＰ−３ ００Ｃ−８カラムにかけ、ペプチドを０．ＩＸＨＦ　Ｂ　Ａ中０〜６０％アセト ニトリル／水の線形勾配により溶離した０選択画分をＨＦＢＡに代えてトリフル オロ酢酸を用いたアクアボアＲＰ−３００Ｃ−８またはＣ−１８カラムにて再ク ロマトを実施した。最も対称性の良い画分は試料の１７１０の加水分解、塩酸蒸 発によるアミノ酸存在のために分析され、ＨＰ　Ｌ　Ｃの逆相分別の後。−フタ ルアルデヒドによる修飾次いで蛍光によって検知した。試料の残部をロータリー エバポレーターにより５０〜１００μｌの容量に濃縮し、提供されたバイオシス テムのアミノ酸配列機を用いてそのアミノ酸配列を決定した。

下記のペプチド配列が得られた。

断片Ｎｏ。

Ｆｉｌ　（Ｋ）　ＨＹ　Ｅ　Ｄ　ＲＶ　Ｌ　Ｅ　Ａ　Ｉ　ＲＴ　Ｓ　Ｉ　に　Ｋ Ｆ１３　（Ｋ）ＴＲＥＣ５ＹＧＲＣＶＥＳＮＰＳＫ　５１−躊ｅｒＦ１６　（Ｋ ）　Ａ　Ｘ　Ｖ　Ｌ　ＣＥ　Ｘ　ＰＦ１７　（Ｋ）　Ｌ　Ｑ　Ａ　ＣＥ　ＩＩ　 Ｐ　Ｔ注：　リジンは各断片の（Ｋ）として先行すると考えられる。Ｘはペプチ ド配列決定の間確実に帰属できるアミノ酸がないことを示す。ＦＩＯおよびＦ１ ５は各々２および３ペプチド断片の混合である（［コで示す。）。ＦＩＯはＦ９ で分析された２ペプチドと同じ混合配列である。ペプチド分画操作がそれら２実 施例で相違するような両者においてこれら２オリゴペプチドを共に精製したこと は驚きである。

ＦｉｌとＦ２は同一断片と考えられるが、唯一の違いはＦ２では不確実な２アミ ノ酸がＦＩＬ配列では共に１２であることである。Ｆｌｌでは多量存在したので こちらが正しいと考えられる。Ｆ１７およびＦ３は同一配列と考えられる。Ｆ３ は多量存在すれば更に解読できたのであるが、Ｆ１７は不純物が少ないので第１ 残基が同定できたと考えられる。

これらのアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドが調製され、これはＷＧＬ’抗原 をコードする遺伝子を同定するためのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡバンクをスクリ ーニングするのに適用できる。下記の例が用いられる（実施例４の注７参照、下 記例において、コドンの第３塩基は二次構造を最小にするよう選択され、実施例 ４に用いられるような海エビ利用にもとづくものではない、） ５１−＋ａｅｒ　５’　ＣＴＴ　ＣにＡ　ＣＧＣＡＴＴ　ＧＧ＾ＴＴＣにＡＣに ＣＡ　ＴＣＴ　にＣＣＡＴＡ　にＣＴ＾ＣＡ　ＴＴＣＣＣＴ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　 ３’加えて、縮重のより短かいオリゴヌクレオチドが合成できる。

例えば６４倍縮重１７マーのオリゴヌクレオチドがＦ１２１００ＤＦＧＮＥＦ配 列およびＦ１４からのＫＡＹＥＣＴとＹＥＣＴＣＰ配列を用いて形成される。１ ６倍縮重１７マーオリゴヌクレオチド混合物は実施例４に示したＦ３のアミノ酸 配列からＣＭ　Ｍ　Ｙ　Ｐ　Ｋ配列を用いて構成できる。これらの縮重配列はＷ 　Ｇ　Ｌ　”配列をコードする所望ＤＮＡ配列を含有する長オリゴヌクレオチド 利用によって草茎されたクローンを確認するため有用である。

実施例６ ＷＧＬ”　（Ｓ２）抗原の遺伝子工学 ＷＧＬ、＋抗原利用の商業的ワクチンの普及を制限する大きな障害は天然資源か ら得られるＷＧＬ＋資源が限定されているためである。この制限を越える手段と して、バクテリア、酵母または他の噴孔あるいは昆虫細胞系を含む容易に培養さ れる細胞を用いた遺伝子工学技術による構成が包含され、これによりＷＧＬ＋抗 原の全部または一部の大量合成が可能になる。この目的を達成する手段は幾つか あるが、それらは基本的に下記の通り数少ない段階に分けられるが、単に実施例 としてのみ示したにすぎない。

ＷＧＬ”抗原の蛋白質骨格をコードするダニ遺伝子の情報を含有する組換え有機 体を同定するため、適切な試薬が第１に創造されねばならない。これは、精製さ れた防衛的抗原またはＳＤＳのような適当な界面活性剤による好ましくは抗原の 変性に従った抗原を含有する部分精製品によってワクチン接種された動物の抗体 である０部分または全ＷＧＬ＋抗原を合成するバクテリア、酵母または他の細胞 が構成されると共に抗血清によリスクリーニングされねばならない。

ＷＧＬ＋抗原は抗原の蛋白部分のアミノ酸配列または抗原断片を決定するため十 分量単にされることが好ましく、抗原断片は、トリプシン、エンド１ｙｓ−Ｃま たはペプシンのような酵素を用いたエンドプロテアーゼ消化あるいは臭化シアン のような試薬を用いてペプチドを化学的に開裂することにより得られる。

これらの処理の結果生成された断片の分別・単離は、ＨＰＣＬ逆相液体クロマト グラフィーまたは疎水性レジン、イオン交換レジンまたはサイズ分画レジン含有 カラムのＨＰＬＣのような公知技術を用いて実施される。好ましくは、ＣＩ、Ｃ ８またはＣ１８のような逆相レジンを選択された酵素的または化学的処埋の結果 生じた断片の特性に応じて単独または連続して用いる。

これらの処理の結果生成したＷＧＬ＋ペプチド断片は、公知のガス相アミノ酸配 列機により分析される。このアミノ酸配列および各アミノ酸をコードする公知の ＤＮＡ配列から、該抗原をコードするＤＮＡ配列と相補のオリゴヌクレオチド配 列を調製される。そして、これら配列は抗原をコードするＤＮＡ含有組換え有機 体を同定するハイブリッド形成実験に用いられる。

これら活性なりローンのＤＮＡ配列はその配列が所望の一つであるかどうかＮ認 するため決定される。このＤＮＡ配列は微生物によるポリペプチドの大量生産が 可能な最良の方法を構成するため用いられる。

（、）　遺伝子ライブラリーの構成 ＷＧＬ＋防衛的抗原をコードする遺伝子情報を含有する容易に培養される微生物 は、適当な成長段階のダニら単離されるＲＮＡに相補な合成り　Ｎ　Ａまたは任 意の成長段階、好ましくは、牛血液を含有しない卵または幼虫のダニから単離さ れるＤＮＡ断片を用いてｉ築される。

ＷＧＬ”抗原含有クローン検知に用いることのできる唯一の試薬が抗体プローブ であるならば、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａまたはゲノム［ｌｌＮ＾ライブラリーはダニ抗原 またはその一部を発現をもたらすファージ、ウィルスあるいはプラスミド系に構 築されねばならない。

このようなベクターとして、ラムダｇｔｌｌ、バクテリアプラスミド、例えば、 ｐｔＪＲ２９０，ｐＵＲ２９１，ｐＵＲ２８２，ｐＵＫ２７０、ｐＵｃ８．ｐＵ ｃ９などまたは真核細胞ウィルスベクター例えば、バキュロウィルス、ｐＺｉｐ Ｎｅｏなど、または５ｖ−４０ベースベクターなどが包含される。オリゴヌクレ オチドプローブが利用できるならば、クローンライブラリーは、ファージ、プラ スミドおよびウィルス系、例えばラムダｇｔｌｏ。

ＥＭＢＬベクターなど、またはｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２９またはｐ　Ｂ　Ｒ３ ２２のようなプラスミドベクターを包含する広範な系においてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａま たはゲノムＤＮＡを用いて構築される。

好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、より少数のクローンをスクリーニングし かつイントロンを含む発現上の課題を回避するため作成される。理想的にはＷＧ Ｌ“抗原の最大レベルを合成するダニの成育段階を第１に決定することである。

抗体がこれをするための唯一の利用手段であるならば、種々な成育段階のダニか ら単離したＲＮＡのインビトロ転写に続き抗体と転写産物との免疫性３およびＳ ＤＳゲル電気泳動分析およびフルオログラフィーによりｅＤＮ、Ａバンクの構成 のためのＲＮＡ抽出におけるＲ適なダニの成育段階が決定される。明らかにＷＧ Ｌ＋抗原の量が少ないためこのアプローチを非常に困難にしている。もし、オリ ゴヌクレオチドが利用されるならば種々の成育段階のダニから単離されたＲＮＡ とのハイブリッド形成が可能なため、ＷＧＬ“抗原をコードする一ＲＮＡを最も 多量に含有するＲ　Ｎ　Ａ源段階を決定することができる。

ＲＮ　Ａはダニから単離され、公知の手段によりｃＤＮＡの合成およびクローン 化が行なわれる。

（ｂ）　エタノール沈澱 次の方法において、エタノール沈澱は核酸溶液へその１７１０倍容量の３Ｍ酢酸 ナトリウムおよび３〜４倍容量の純粋エタノールを添加することを包含する１次 いで、この混合物を一２０℃下少なくとも２時間または、−７０℃下または、エ タノール／ドライアイス浴下溶液が粘稠になるまで設置される０次いで、この混 合物３通常１２，０ＯＯＸＩＩａｖ、少なくとも１０分遠心分跳する。

上清を注意して除き、核酸物質（および／他の巨大分子）含有ペレットを次の操 作に用いる。

（ｅ）　２Ｍ酢酸アンモニウムからのエタノール沈澱高温溶液（２Ｍ酢酸アンモ ニウム）において、含有されていないデオキシヌクレオチド三リン酸（および他 の低分子量物質）の大部分はエタノール沈澱後の上滑に残存する。この操作は上 述で用いた酢酸ナトリウムに代えて等容量の４Ｍ酢酸アンモニウムを用いた以外 同様で、上述の通りこれを添加後３〜４倍容量のエタノール添加、冷却される。

（ｄ）　フェノールまたはフェノール／クロロホルム抽出フェノールまたはフェ ノール／クロロホルム抽出は核酸溶液へ同容量の再蒸留フェノールまたは１：１ （ｖ／ｖ）＝フェノール：クロロホルムの０．ＩＭ）リスにより平衡化されたｐ Ｈ０，８溶液の添加が包含される。試験管内容物を混合し、遠心により相を分離 する。上（水）層な新しい試験管へ除き、フェノールまたはフェノール／クロロ ホルムは捨てる。通常、水相を再抽出し、次いでエーテルで残存フェノールを除 くため抽出する。第１抽出のフェノールまたはフェノールクロロホルム相は適宜 Ｔ　Ｅ　ｉｆ＝加、混合および遠心により再抽出される。この場合、２つの水相 はエーテル抽出および次の操作前に一諸にする。

（ｅ）　ＰＥＩセルロースＴＬＣ 本操作の種々の反応の間、核酸中への放射活性なｄＡＴＰの挿入を監視するため 、ＰＥＩセルロース１層クロマトグラフィーを０．７５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ３， ５で実施した。監視すべき物質の一部を１層の端部にかけ、クロマトグラムを分 析した後、薄層をＸ線フィルムにさらす。オートラジオグラフィーに従って、放 射活性を含むＰＥｌｆｆ層の領域を切り出し、バイアルに移し、シンチレーショ ンカウンターのチェレンコフ測定により各々の放射活性を決定する。クロマトグ ラフィ一時の最初の放射活性物質との比が反応の成功を決定するため用いられる 。この操作はＰＥＩセルロースクロマトグラフィーとして言及する。

（ｆ）　ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出 高分子ＪｉＤＮＡおよびＲＮＡは異なる成育段階において、宿主から採取される ダニから単離される。ダニを室温下、オムニミキサーにて２〜３分、グアニジン イソチオシアネート（４，７Ｍ）、サルコシル（７，４ｇ）、）リス（５−Ｍ） およびβ−メルカプトエタノール（７０ｍＭ）含有緩衝液中ホモジナイズする。

このホモジネートを４℃、１４０００Ｘｙａｖ、　１０分遠心分離する。固体Ｃ ｓＣ１をこのホモジネート（１ｇ７２．５ｍＲ＞に添加し、これをＣｓＣｌクッ ション（２，５ｙ／ｍ／）上へ乗せ、５Ｗ２８０−ター（ベックマン）により４ ８時間、２５０００ｒｐｍ遠心する。上相登吸収し、ＤＮＡバンドを回収し、そ してＲＮＡバンドを回収し、エタノール沈澱、７０％エタノールでの数回の洗浄 、そして使用されるまで一７０℃下ＴＥ中保存する。

ポリアデニル化＊　ＲＮ　、Ａは製作者（Ｃａｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅｌ（ｅｓ ｅａｒｃｈ）により記載された方法を用いたオリゴｄＴセルロースカラムまたは ポリＵセファロースカラムにて単離される。

（ｇ）ｅＤＮＡの合成 ファージまたはプラスミドベクターにおけるｃＤＮＡバンクの構築のため種々の 方法を用いることができる。実施例のみによる下記の手段ラムダεｔｌｌにおけ るｅＤＮＡバンクの構築のためのｒＲＮａ５ｅＨＪ法の変法である。この方法の 要点を第６図に示す。

（ｈ）　第１Ｍ合成 ポリＡ”ＲＮＡ２μ９をＴＨに溶解し、水を最終２５μｌになるまで添加する。

この溶液を７０℃、３分加熱し、次いで急速に氷で冷却する。この冷却溶液に５ μ１１０×第１鎖緩衝液、５μｍ０１．Ｍ　ＤＴＴ、５μＺオリゴｄＴ［ベーリ ンガー１００ｍｇ／１μｍ］、１．２５μ１ＲＮａｓｉｎ［１０メガ４０Ｕ／、 ｕ／］、２１１１Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｓ　ＩＴ１ｇ／　ｍｊり、５μｌ　１０ｍＭｄ （ＧＣＴ）ＴＰ、０．５μｆ１０　ｍＭ　ｄＡ　Ｔ　Ｐおよび３μ１Ｍ−ＭＬ、 Ｖ逆転写酵素［ＢＲＬ２００Ｕ／μｍ］を添加する。

この混合溶液の２．５μ！を試験管Ａ（合成監視のための分析的反応）へ移して 、０．２μｍ［３２Ｐ　３ｄＡ　Ｔ　Ｐ　（０，２μｃｉ）を添加した。

残りのバルク反応溶液へ０．５μｌ　５０５Ｍ　ｄＡＴＰを添加する。これらの 試験管を４２℃、３０分間インキュベートする。

次いで、０．２５μｍ　１Ｃ）ｍＭ　ｄＡＴＰを試験管Ａに添加し、更にインキ ュベーションを３０分間続ける。試験管Ａから０．５μ！採取し、ゲル分析のた めエタノール沈澱する。更に、０．２μ！をＡから採取しＰＥＩセルロースＴＬ Ｃによりモニターする。

この反応において添加されたＲＮＡ２μ！全てがポリＡ−アデニル化されたなら ば、核酸へ［２２Ｐ　］ｄＡ　Ｔ　Ｐの約３０％結合は第１鎖合成が１００％有 効に等しいと計算される０通常、一度オリゴｄＴセルロースを通すると６〜１０ ％結合を与える。

第２鎖反応をモニターする試料を調製するため、バルク反応の２．５μｌを分取 し、２Ｍ酢酸ナトリウムからエタノール沈澱する。

この試料を７０％エタノールで２回洗浄し、試験管Ｂにおいて２．５μＮＩＸ第 １鎖緩衝液に再懸濁した。

（ｉ）　第２鎖（ＲＮａｓｅＨ） ２８μｆ水、１０１１１１０　ＸＲＮａｓｅＨ緩衝液；１μｍ５ｍｇ／μＩＢＳ Ａ、１．２５μ／　１０ｍＭｄ（ＧＣＴ）ＴＰ　、　０．５μｍ１０ｎＭｄＡＴ Ｐ、１．６μｆＲＮａｓｅＨ［ＢＲＬ　２０Ｕ／μｒｌ、５１１１ＤＮＡポリメ ラーゼ１（ホロエン・ザイム（バイオラプス）１００Ｕ／μＩ）および２　μＩ 　Ｅ　−ｃｏ　ｌ　ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼの溶液を調製した。

この溶液を混合し、この１．８μｌを試験管Ａに分配し、この残りをバルク反応 試験管に分配する。　０．７５μｍ　１０ｎＭ　ｄＡＴＰをバルク反応試験管に 添加する。この３本の試験管を１５℃、６０分インキュベートし、次いで更に２ ２℃、６０分インキュベートする。

試験管Ｂからの０．２μ！試料は反応をモニターするためＰＥＩセルロースのク ロマトグラフィーを実施する。試験管Ｂからの更なる試料はゲル分析のため２Ｍ 酢酸アンモニウムからエタノール沈コする。第１鎖合成からの試験管Ａ試料およ び試験管Ｂの第２Ｍ合成試料を合成されたｃＤＮＡのサイズを決定するため１５ ｚアガロースゲルにかける。

Ｔ、ポリメラーゼ反応をモニターするための試料を調製するため、０．５μｌを バルク反応試験管より分取し、試験管Ｃに移す。

試験管ＡおよびＢの歿存物をバルク反応物と共にプールする。

バルク反応および試験管Ｃの両内容物をフェノール／クロロホルム（１：１）で 抽出し、２Ｍｒ＃９アンモニウムからのエタノール沈澱、次いで７０％エタノー ルで２度洗浄する。

（ｊ）　ＥｅｏＲ１メチル化 ２９．５μｍ水、４μＮＯ，ＩＭ　ＤＴＴ、２．ｔｔｌ　１０ＸＥｃｏＲ１メチ ラーゼ緩衝液、４μｍ１ｍＭ５−アデノシルメチオニン［バイオラプス］及び０ ．５μ１ＥｃｏＲ１メチラーゼ［バイオラプス２０Ｕ／μｆ］の溶液を新たな試 験管で調製する。この溶液の２μｌを管Ｃへ分配し、この残りをバルク反応管へ 分配する。この両管を３７℃、３０分インキュベートし、次いで更に７０℃、１ ５分間インキュベートし、次いで氷にて冷却する。新たな試験管に下記の緩衝液 を調製する＝４μｍ’１ＯＸＡＴ緩衝液、２μｍ！５ｍｇ７’ｎｌ　ＢＳＡ、１ ．４μｆｏ、ＩＭ　ＤＴＴ、２μＩＴ。

Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ［バイオラプスＩＵ／μｍ］および２９．５μ！水。

２μＩを管Ｃへ添加し、次いでこれを３７℃、１０分間インキュベートする。該 残りの溶液に１０＋ａＮりｄ（ＧＣＴＡ）ＴＰ含有溶液が０．５μｌを添加し、 これをバルク反応管へ添加し３７℃、５０分、７０℃１５分インキュベートし２ 次いで氷冷する。

管Ｃへ、５０．ｕＭ　ｄ（ＧＴＣ）ＴＰ、［３２Ｐ　ｉｄＡ　Ｔ　Ｐ　［０，２ μＣｉ］および５ＢＭｄＡＴＰの各０，２μｌを添加し、インキュベーションを ３７℃で更に５０分行った後、この０．２μｍとＰＥＴセルロースにスポットし クロマトを実施した。

０．２ｍＭｄＡ　Ｔ　Ｐ　Ｏ，２μ！は、各分子の５゛端へ２アデノシン残基を 付加するに必要な約３倍量のｄＡＴＰを表わし、第２鎖合成後のｄｓｃＤＮＡの 平均サイズはｌｋｂで全量２μ２と考えられる。

（ｋ）　キナーゼ−キナーゼ段階は必要でなくかつ除去できうるとの幾つかの指 摘がある。バルク反応に対して２０μ１５Ｘキナーゼ緩衝液、０．２μｍ　０． ＩＭ　ＡＴＰ、および０．５μＩポリヌクレオチドキナーゼ［バイオラプス４Ｕ ／μＮ］が添加される。この混合液を３７℃、６０分インキュベートする。この 反応液をフェノール／クロロホルム混合（１：１）の等容量で抽出し水相プール し、２Ｍ酢酸アンモニウムからエタノール沈澱し、７０％エタノールで洗浄する 。

（１）　リンカ−結合 リンカ−結合反応をモニターするため、試料をアガロースおよびポリアクリルア ミドゲル分析のため調製する。

アガロースゲル：　バルク反応からの試料（′２ＰｃＤＮＡ）試料１　冷すンカ ー結合前ｃＤＮＡ 試料２　冷すンカー結合後ｃＤＮＡ 試料３　冷リンカ−結合ｆ＆ｃＤ　Ｎ　Ａ　Ｅ　ｃｏＲ１消化ポリアクリルアミ ドゲル、ｆｆ２ｐリンカ−試料試料４　試験管［）　ｊ　２　ｐリンカ−＋Ｅｃ ｏＲ１消化前ｃＤ消化前科ＤＮＡ試料５コ２Ｐリンカー＋ＥｃｏＲ１消化ｆ＆ｅ ＤＮＡ試料６　試験管ＥＥｃｏＲ１消化前３２消化前片２ｐリンカ７　試験管Ｅ ＥｃｏＲ１消化後ｆｆ２ｐリンカ−単独結合混合物は、新たな試験管に９μＩＥ ｃｏＲ１リンカ−（バイオラプス２００ｎｇ／μＩり、および１７．ｃｚＩＤＮ Ａリガーゼ［ＩＢＩ　３Ｕ／μｌ］を添加して調製した。この結合混合物の１５ μｌをバルク反応管に分取し、すばやく混合後、０．２５μ！試料を分取し、ア ガロースゲル分析のためすぐにドライアイス下凍結する（試料１）。

バルク反応管から１μＩ分取し、０．２μＩ”Ｐラベル化ＥｃｏＲ１リンカ−を 添加する（試験管Ｄ　：ｃＤ　Ｎ　Ａ＋リンカ−）。

残りの結合混合物から１μＩ分取し、０．２μ１２２ｐラベル化ＥｃｏＲ１リン カ−を添加する（試験管Ｅニリンカー単独）。

バルク反応液および管りおよび管Ｅを２５℃、４時間インキュベートする。バル ク反応管から０．２５μｌおよび管りとＥから０．６μＩ分取し、アガロースま たはポリアクリルアミドゲル分析のため用いる（試料２，４．および６）。

バルク反応の残りおよび管りおよびＥを７０℃、５時間加熱し、次いで氷冷する 。

（＋＋＋）　ＥｃｏＰｊｌ消化 新たな試験管に１１μｊ！ＥｃｏＲ１消化緩衝液、２μｊ！ＥｃｏＲ１［ＩＢＩ ｍＵ／μ！および８２μｌ水を添加する。この混合溶液の４μｌをバルク反応管 へ分配する。３本の試験管を３７℃、６０分インキュベーションする。更にバル ク反応管にＥｃｏＲｌ［３６０１の２μｌを分配し、インキュベーションを更に ６０分続行する。管りおよびＥの残りの試料を上述の管りとＥからの試料と共に アガロースおよびアクリルアミドゲルで電気泳動する。これらゲルのオートラジ オグラフは反応が行なわれたかどうか証明する。

このバルク反応管から１．４μ！試料３分取する（試料３）。バルク反応の残り をフェノール／クロロホルムで抽出する。試料１゜２および３の０．２５μｌを １％アガロースゲルにかける。試料４゜５．６および７を１２％ポリアクリルア ミドゲルにかける。両ゲルをオートラジオグラフィーにより全ての反応が成功し たかどうかを同定する。

（ｎ）ｃＤＮＡからのリンカ−分離 １．２Ｘ２１ｃｎセフアロース４Ｂカラムを０．１ＭＴＥＡＢで平衡化する。１ ５０μｌのＥｃｏＲ１消化リンカ−結合ｃＤＮＡ試料をこのカラムにかけ、画分 をＴＥＡＢｌｉ液に集める（２５０〜５００μｍ）。アガロースまたはポリアク リルアミドゲルの移動度により決定した６００ｂｐより大きいサイズのｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａ含有画分をプールし、ロータリーエバポレーターにより蒸発乾固し、ＴＨ に悲濁し、ＥｃｏＲ１消化およびホスファターゼ処理されたラムダεｔｌｌまた はεｔｌｏと連結し、インビトロパッケージし、そして提供者の教示（プロメガ 又はインデクレイテッド　サイエンズ）に従って、Ｙ１０９０またはＹ１０８９ のよううな適当な宿主株に感染させる。

（０）　オリゴヌクレオチドによるクローンのスクリーニングＷＧＬ＋蛋白質の アミノ酸配列、ＷＧＬ＋蛋白質の化学的開裂から得られるペプチド断片またはＷ Ｇ　Ｌ　”蛋白質由来のエンドプロテアーゼ消化ペプチドから、この蛋白質をコ ードするＤＮＡの特別な部分をコードするオリゴヌクレオチドを構築し、公知の 操作によるハイブリッド形成試験に用いられる。ライブラリーから単離されるハ イブリッド形成断片のＤＮＡ配列が決定され、効果的ワクチンに含有されるＩＶ 　Ｇ　Ｌ　’蛋白質又はこの部分を発現するための遺伝子工学の計画を構成する ため用いられる。

ｃＤＮＡライブラリーは約１６日間中に寄生した構成アシマダニから単離される ＲＮＡと用いたラムダｇｔｌｌに構築された。

ファージを大腸菌株ＲＹ１０９０に付着させ、３７℃、１６ｈｒ培養する。ニト ロセロルースフイルターをプレートに置き、３重のフィルターを各プレートから 取り出す、フィルター上のＤＮＡを変成し減圧下８０℃で加熱し固定する。この フィルターを２〜４時間プレハイブリッド形成でインキュベートし１次いで実質 的に（１０）に記載された通り、１６時間ハイブリッド形成溶液にインキュベー トする。ハイブリッド形成溶液はポリヌクレオチドキナーゼ使用３２ｐラベル化 オリゴヌクレオチド（１０）およびψ３２Ｐ−ＡＴＰ（用いた各オリゴヌクレオ チドは約１０’ｃｐｓ／＋ａｆ）を含有する。３フイルターの各セットにおいて 、２つは６３マーオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させ、残りは５１，７ ２．５０および５３マーオリゴヌクレオチドの混合物をハイブリッド形成した。

洗浄の後、オートラジオグラフィーを実施し、３フイルター全てにシグナルを生 じたプラークを同定採取し、単一プラークまでｍ製した。

実施例７ ＷＧＬ”抗原をコードする遺伝子のＤＮＡ配列分析１つのクローンから単離した ＤＮＡについて詳述する０本ラムダｇｔ１１クローンは約４ｋｂ、１．５ｋｂお よび０．３ｋｂの３ＥｅｏＲ１断片を含有する。サザンハイブリッド形成（１０ ）試験は４ｋｂｒ！Ｒ片が用いられたプローブとハイブリッド形成することを示 した。

従って、この断片は宿主株ＪＭＩＯＩ（ｆｆｌｆＱえ宿主／プラスミドはＢＴＡ １７５１　ＡＴＣＣ６７５４８として言及）において修飾ｐＵｃ１８プラスミド （ｐＢＴＡ７０７を与える）へサブクローニングした。この４ｋｂ断片は次いで 音波処理され、ＤＮＡ配列分析のためＭ１３ｉｎｐ１８にサブクローニングされ た０Ｍ１３サブクローンは無作為に配列解析され、挿入された４ｋｂの完全ＤＮ Ａ配列は提携コンピュータプログラムの利用によってサブクローンの配列の集合 により編集された。

第７図は４ｋｂ　ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を示し、かつＭＧＬ”抗原の蛋白質骨 格として同定される蛋白質配列へそのＤＮＡ配列の一領域から翻訳されるアミノ 酸配列を示す、第８図はアミノ酸の１文字略表示（表８）を用いたアミノ酸配列 を示す。

ダニから単層されたＷＧＬ“抗原からのエンドＩｙｓ−Ｃ消化産物のペプチド配 列分析の間に同定されたペプチド断片は第７図および第８図の下線により同定さ れ、表−９に要旨を示す。

表−９ Ｆｌ　（Ｋ）　Ｄ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　ＣＫ ａａ６１９−６２５　Ｋ　ＤＰＤＰにＫＦ２　（Ｋ）１４　Ｙ　Ｅ　Ｄ　（に） 　Ｖ　Ｌ　Ｅ　Ａ　Ｔ　Ｘ　Ｔ　Ｓ　Ｉ　に　Ｋａａ　３５７−３７３　に１４ ＹＥＤ　ＲＶＬＥ＾ＩＲＴＳＩＧＫＦｉｌ　（Ｋ）ＷＹＥＤ　ＲＶＬＥＡＩＲＴ ＳＩＧＫＦ３　（Ｋ）　Ｘ　Ｑ　Ａ　ＣＥ　（１１）　Ｐ　Ｉ　Ｇ　Ｅ　（すＣ ＭＭＹＰＫｔａ４０４−４２１　Ｋ　ＬＱＡＣＥ　ＨＰＩにＥ　ＨＣＭＮＹＰＫ Ｆ１７　（Ｋ）ＬＱＡＣＥ　ＨＰＩ Ｆ４　（Ｋ）　Ｅ　Ａ　に　Ｆ　Ｖ　Ｃ／Ｑ　Ｋａａ　２１２−２１９　Ｋ　Ｅ 　Ａ　Ｇ　Ｆ　Ｖ　ＣＫＦ５　（Ｋ）　Ｇ　（Ｐ）（Ｓ／’Ｄ）　Ｇ　Ｑ　（Ｖ ／’Ｃ）　Ｉ　Ｎ　（Ｖ／Ａ）　＜１／Ｃ）　Ｋａａ１９９−２１０　ＫＧＰ　 ＤＧＱＣＩＮＡ　ＣＫＦ６　（Ｋ）　Ａ　（Ｄ／に）　Ｖ　Ｓ　（Ｔ）　Ｎ　Ｅ 　Ｎ　Ｅ　Ｑ　（Ｌ）　Ｅ　（Ｑ）　Ａ　Ｄ　Ｋａａ４８７−５０３　Ｋ　Ａ　 ＣＶＳＣＮＥ　ＮＥＮＥＱ　Ｓ　Ｅ　ＣＡＤＫＦｈ　（Ｋ）　ＣＰ　ＲＤ　Ｎ　 Ｍ　Ｙ　Ｆ　Ｎ＾八へＫａａ　５０−６３　Ｋ　ＣＰ　ＲＤ　Ｎ　Ｍ　Ｙ　Ｆ　 Ｎ　Ａ　Ａ　Ｅ　ＫＦｌｏａ　（Ｋ）　ＣＰ　ＲＤ　Ｎ　Ｍ　Ｙ　Ｆ　Ｎ＾＾Ｅ ＫＦｅｂ　（Ｋ）＾ＮＣＱＣＰＰＤＴＲＲＧＥＩ（：ＣＩＥａａ５１３−５３１ 　Ｋ　Ａ　Ｎ　ＣＱ　ＣＰ　Ｐ　Ｄ　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ＧＥ　Ｉ　Ｇ　ＣＴ　ＥＦｌ ｏｂ　（Ｋ）　＾ＮＣＱＣＰＰＤＴＲＰＧＥＩＧＣＩＥＦ１２　（Ｋ）　Ｅ　Ｓ 　Ｓ　Ｉ　ＣＸ　Ｄ　Ｆ　Ｇ　Ｎ　Ｅ　Ｆ　ＣＲＮ　Ａ　Ｅ　ＣＶ　Ｖ　Ｐ（Ｋ ）ａａ１９−４２　Ａ　ＥＳＳＩＣＸＤＦＧＮＥＦＣＲＮＡＥＣＶＶＰＧＦ１３ （に）ＴＲＥＣＳＹにＲＣＶＥＳＮＰＳＫａａ　７２−８８　Ｋ　Ｔ　ＲＥ　Ｃ Ｓ　Ｙ　に　ＲＣＶ　Ｅ　Ｓ　Ｎ　Ｐ　Ｓ　ＫＦ１４　（Ｋ）　Ａ　Ｙ　Ｅ　Ｃ Ｔ　ＣＰ　ＲＡ　Ｆ　Ｔ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ｄ　に　Ｉ　Ｓ／ＨＣＫａａ　２２７− ２４７　Ｋ　Ａ　Ｙ　Ｅ　ＣＴ　ＣＰ　ＲＡ　Ｆ　Ｔ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ｄ　Ｇ　Ｉ 　Ｔ　ＣＫＦ１５ａ　（Ｋ）　Ｎ　Ｌ　Ｌ　Ｑ　ＲＤ　Ｓ　−ＣＣＱａａ１６５ −１７６　Ｋ　ＮＬＬＱＲＤＳＲＣＣＱＦ１６　Ｋ　Ｘ　Ｘ　Ｖ　Ｌ　ＣＥ　Ｘ 　Ｐａａ　２７３−２８１　Ｋ　ＧＴ　Ｖ　Ｌ　ＣＥ　ＣＰ該ＤＮＡ配列とこの Ｄ　Ｎ　Ａ配列から演鐸されるアミノ酸配列から、ＷＧＬ＋抗原のプレープロー ポリペプチドは６５０アミノ酸よりなることが分る。

ペプチドＦ１２をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡ配列の９０〜１５２ｂｐ（第７ 図）領域に同定されその蛋白質のアミノ酸配列（第８図〉のアミノ酸２０〜４０ に一致する。Ｆ１２で同定されたＮ−末端のｇｌｕ残基に先行するアミノ酸はも しＦ１２がエンドＩｙｓ−Ｃ消化の結果生じたとして予想されるような１ｙｓｉ ｎｅ（Ｋ）でない、従って、Ｆ１２ペプチド断片はエンドＩｙｓ−Ｃ以外のプロ ティナーゼの作用により生じたと考えられる。Ｆ１２のＮ−末端ｇｌｕ残基に先 行する１９アミノ酸配列はメチオニンに始まり、真核細胞（９？照）の他の分泌 されかつ膜に結合された蛋白質を先行するリーダー配列に非常に類似する。加え て、ペプチドのリーダー配列の大部分は後続するＡ残基（９）の位置で開裂され る。従って、Ｆ１２配列は成熟Ｗ　Ｇ　Ｌ　”ポリペプチドのＮ−末端であると 考えられる。これは、成熟ＷＧＬ＋ポリペプチドの蛋白部分は６３１アミノ酸長 であり、分子量６９７２９ダルトンを有することを示している。

Ｎ−結合グリコシル化のコンセンサス配列は他真核細胞の場合に報告されたと同 様にダニにおいてもＡｓｎｘ（ＳｅｖまたはＴｈｒ）であると考えられ、Ｎ−結 合グリコシル化の５つの可能なサイトが成熟ポリペプチド配列（第７図）に同定 されるダニ産生ＷＧＬ＋抗原のこれらの残基または他のアミノ酸に付加される炭 水化物は、ＤＮＡ配列から予測されるものと比較して、天然抗原に観察される分 子量に相違が見られる。

エンドＩｙｓ−Ｃ消化画分由来ペプチドのアミノ酸配列（表−９）の比較によっ て、Ｆ７を除＜（Ｆｌ−１７＞の全ペプチドが同定されている。多くの場合、ペ プチド配列解析間不確定であったアミノ酸はＤ　Ｎ　Ａ配列からのアミノ酸配列 と下記の通り比較することにより正確に示すことができる。

ペプチド断片Ｆｌ、Ｆｉｌ、Ｆ１３およびＦ１７のアミノ酸配列は、全てアミノ 酸配列と対応するＤＮＡ領域におけるＤＮＡ配列から導かれるアミノ酸配列と正 確に一致する（表９）。

ペプチドＦ２はＤＮＡ断片１１０４〜１１５２ｂｐによってコードされると考え られる０表９はＦ２ペプチド配列の５と１１位置に不確実に帰属すると考えられ るＧおよびＸは共にＲである。Ｒはガス相配列解析間検知することは非常に困難 であり、また試料中非常に量が少ない、Ｆ２はＦｉｌと同一ペプチドであり、全 てのアミノ酸はＦｉｌ断片の配列解析可能確に帰属する。

ペプチドＦ３およびＦ１７はＷＧＬ＋を２つの異なるエンドＩｙｓ−Ｃ消化（実 施例３および４）から得られた同一ペプチド配列を示す、Ｆ１７のアミノ酸配列 はＷＧＬ＋ペプチドのアミノ酸４０５から４１２の転写配列と正確に一致する。

Ｆ３を配列解析した時、最初の位置にアミノ酸を帰属させることができなかった が（ＤＮＡ配列からし）、これは背景に大量存在したためであるが他のアミノ酸 はＤＮＡ配列由来のアミノ酸と正確に一致する（アミノｉ！２４０５〜４２１第 ８図）。

Ｆ４はＷＧＬ＋蛋白質のアミノ酸２１３〜２１９に見られる（第８図）、この配 列はほぼ完全に一致し、不確定なＣ／ＱはＤＮＡ配列よりＣであることが分る。

カルボキシメチル化Ｃは配列解析反応に従った修飾アミノ酸を分離するためのＨ ＰＬＣにおいて、Ｑとする類似する保持時間へ移動する。

Ｆ５断片は配列解析可能でも非常に少量であったので不確定なアミノ酸がいくつ かあった。しかしこの配列は、第８図のアミノ６２００〜２１０に一致すること は明らかである。各ペプチドに帰属する不確定な２アミノ酸の１つは、Ｄ　Ｎ　 Ａ配列由来のアミノ酸配列に存在し、確実な配列は予想されるオーダーにあると 考えられる。

Ｆ６断片はＷＧＬ”蛋白質配列のアミノ酸４８８〜５０３に対応する。Ｆ６断片 の配列残基は、ＤＮＡ配列からの残基と異なる。該Ｆ６配列は混合配列由来であ ったが、ＤＮＡ配列から正しく示されたアミノ酸配列が事実存在した。

Ｆ７はＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を確実に同定されなかった。Ｆ６と同じ＜ Ｆ７は混合配列由来であり、この位置に帰属される確実性は非常に小さい、Ｆ８ 断片は量が少なかったので配列に幾つか不確実な所があった。しかし、Ｆ８８ア ミノ酸配は第８図のアミノ酸４４４〜４５０に一致すると考えられる。繰り返す が、全アミノ酸残基はＤＮＡ配列転写において同定できる。

Ｆ９およびＦＩＯは２つのアミノ酸配列の混合であった。これら配列の１つは第 ８図のアミノ酸５１〜６３に一致することは明白である０両者の場合、ペプチド 配列解析間同定された２アミノ酸配列はＤＮＡ配列由来アミノ酸配列と予想され るオーダーにおいて帰属される。

Ｆ９およびＦＩＯの残りのペプチド配列は第８図のアミノ酸５１４〜５３１に一 致する。Ｆ９の１１位のＲはＤＮＡ配列からはＰであり、これはＦ１０１００場 合と一致する。ＤＮＡ配列はこのペプチドの１０位がＫであることを示している 。このＤＮＡ配列はＷＧＬ＋抗原の１分子をコードするものなので、異種ダニは この配列といくらか異なるものを有すると考えられる。この点はＦ１４配列を論 じる時にも拡張される。

Ｆ１２として配列解析された断片は第８図のアミノ酸２０〜４１と明確に一致す る。また、前述した様にこの断片は成熟ＷＧＬ”ペプチドのＮ−末端断片と考え られ、配列解析された第１アミノ酸に先行するＫはこの場合正しくなかった。ま た、このペプチド断片の６位の不確実な残基はＤ　Ｎ　Ａ配列からＳである。Ｓ はこの場合特にガス相配列解析間検知することが非常に困難であるのは、先行す るアミノ酸がＣの時カルボキシ−メチル化Ｃは修飾アミノ酸を溶解して用いる） （ＰＬＣ系においてＳと類似の保持時間を有するためである。その他のＦ１２ペ プチド配列はＷＧ　Ｌ　”由来の配列と正確に一致する。

Ｆ１４は非常に興味深い（アミノａ２２８〜？４７）。ペプチド配列においてア ミノ酸８〜１０のＲＡＦを示し、一方、ＤＮＡ配列は、転写された場合これらの 位置ではＳＯ３を示す。

両配列は遡及的に正しいとは思われるが、両配列の間には明らかな不一致が存在 する。これの最も可能性ある説明としては、両配列は配列解析された分子（ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａの場合）および分子の混合（Ｆ１２の場合）のためには正しい。

世界に分布するダニ集団は有性生殖する全ての生物の場合と同様、遺伝的に多様 である。集団内の各個体は集団の他の個体と微妙に異なる。またこれらの相違は 各個体が両親から受け継いだＤＮＡ配列の相違の結果である。特殊蛋白質をコー ドする各遺伝子のため、個体集団間の配列に相違があると考えられ、本明細書に おいて相同として言及している。ここで述べた特別な例において、実施例４での 消化でＦ１２を与えたＷＧＬ”蛋白質は多数ダニ（６０，０００〜７０，０００ ）から抽出された。Ｆ１２（および配列解析された残りのペプチド断片）のため 決定されたペプチド配列はダニ集団ＷＧＬ”分子の大部分のペプチド配列である 。ＷＧＬ”分子のダニ集団間において、小さな変化（相同）はペプチド配列分析 間で検知されるには低すぎるレベルにある。

第７図に示したｃＤＮＡ配列および第８図のアミノ酸配列は集団における１個体 からの由来のものである。この個体はＷＣＬ”抗原の小さな変化をコードするＤ ＮＡ配列を含有したかもしれない。もちろん、他のｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子が世界中 のダニ集団の他の個体群から由来されてもよく、このｅＤＮＡ配列は第７図に示 したＤＮＡ配列と幾つかの小さなｉｍにおいて類似的に変化しているであろう。

これらの相同は本発明の範囲内に包含される。

上述の該相違の１つは、ワクチン接種後のＷＧＬ＋分子に対して生じた防衛的免 疫応答のために重要なエピトープであるＷＧＬ＋分子の領域に見られる。第７図 に示した配列の相同であるＷＧＬ”産生品を有するダニはワクチン接種された宿 主に寄生しても生き残るかもしれない、この場合、ｃＤＮＡは合成され、ＤＮＡ は上述の通りあるいは公知の方法によりこれらの個体から単離される。ハイブリ ッド形成試験において、４ｋｂＤＮＡ断片（またはその部分）はこれら変種のＷ 　Ｇ　Ｌ　’蛋白質をコードするＤＮＡ含有クローンを同定するためハイブリッ ド形成１０−ブとして用いられるが、また、該ＤＮＡ含有はクローン変種ダニ集 団に対して効果的なワクチンとして含有される変種ＷＧＬ＋抗原を合成するバク テリアまたは他の微生物を構築するため用いられる。この原理は、ウシマダニお よび世界のあらゆる地域の他のダニ種に対して適用される。

ＤＮＡ配列由来のＷＧＬ”ペプチド配列と比較されるＦ１４の配列における相違 は１８位のアミノ酸残基（これに帰属されるＦ１４のＳ又はＨは信頼性が低い） はＤＮＡ配列からではＴである。

Ｆ１５は少なくとも３つのオリゴペプチドの混合物であった。

これらの間において、１つはアミノ酸１６６〜１７６のポリペプチド内に表わさ れていると考えられる。

Ｆ１６配列はＷＧＬ＋アミノ酸断片２７４〜２８１（第８図）に見られる。この Ｆ１６ペプチド配列で不確実な２残基の第２位はＸ＝Ｔであり、第７位はＸ＝Ｃ である。これはこのペプチド試量が非常に少量であったためである。

要約すれば、表−９に示したＤＮＡ配列はダニＷＧＬ＋ポリペプチドの１つの相 同をコードするが、ダニから単離された抗原から生じた１７エンド１ｙｓ−Ｃペ プチド断片の１６がそのＤＮＡ配列によってコードされる。その遺伝子の相同が ダニ集団に存在する可能性の証明が得られた。また、相同がウシマダニまたは世 界中に見られる他のダニ種からの起源であるならば本発明の範囲内である。

上述した操作の要点はウシマダニ由来ＷＧＬ“抗原に言及したものである。この 抗原または他のダニ種から単離した同等な抗原はＢ、　ａｎｎｕｌａｔｕｓのよ うな他のＢｏｏｐｈｉｌｕｓ種、他のダニ種、例えば旦７±ｉｓ　ｓｐｐ、０ｔ ｏｂｉｕｓ　ｓｐｐ、Ｒｈｏｈｉｃｅ　ｈａｌｕｓｓｐｐ、７　ｓｐｐ、Ｄｅｒ ｍａｃｅｎｔｏｒ　ｓｐｐ、Ｉｘｏｄｅｓ　ｓｐｐ　ａｎｄ比ム七阜咀ｓｐｐ　 、及び特にそのダニ種として０ｔｏｂｉｕｓ　駐釘力住。

Ｄ、　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ　ａｎｄ　Ｉｘｏｄｅｓ　ｌ肢旺吐岨が挙げられ、 これらの各々は、インフエステーションの結果あるいは、Ｂａｂｅｓｉｍｂｏｖ ｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ　ｂｊ」Ｌ旦！（Ｌｎ」２１．へ７　７　、　Ｃｏ　ｗ　 ｄ　ｒ　ｉ　ａｒｕｍｉｎａｔｕ＋ｉ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ　ｐ」Ｌエコ（豊− ｐ〕しｒ】（ミー、Ｔ、Ｐａｒｖａ　Ｉａｗｒｗｎｅｉｉ。

Ｔ、　ａｎｎｕｌａｔａおよびＴ、ｈｉｅｃｉのような病気の媒介昆虫として世 界中の経済的損失を引き起こしているものである。ＷＧＬ”″遺伝子産物または その関連かつ他のダニ由来の同等な遺伝子産物はここで述べた研究の延長として 寄生ダニに対する効果的ワクチンを提供できることが期待される。

使用されたハイブリッド形成プローブに対するコメント選択されたオリゴヌクレ オチドプローブは遡及的に同定できる幾つかの欠点がある。これら欠点の幾つか は、第３コドン位の塩基の不正確な選択によるものであり、また、もちろんペプ チド配列分析不確実性によった。最重量に依存するオリゴヌクレオチドは６３マ ーであり、その時点で得られた最も信頼できるアミノ酸配列を基にした。クロー ンを単離する時、このプローブとハイブリッド形成する信号が理論的考察から予 測されるよりも弱いことは驚くべきことであった。また、ある一段階で、単離さ れたクローンがＷＧＬ“ペプチドをコードするかと、いう疑問があった。この不 確実性はプローブとして上述した縮重オリゴヌクレオチド配列の使用によっであ る範囲に緩和された。

これらのプローブはクローン中のＤＮＡと強くハイブリッド形成した。６３マー における上記予測信号より弱いという理由はこの領域に期待される信号からのＤ ＮＡ配列における変化によって説明される。多数の他のクローンを１または２つ のプローブで得られたハイブリッド形成信号に基づき精製したが、これら全ては ＤＮＡ配列解析によってＷＧＬ、＋遺伝子と無関係であると判明した。従って三 重フィルターを用いることによってクローンを単離するための実験計画およびク ローンのＷＧＬ”抗原をコードする遺伝子を確認するためのハイブリッド形成プ ローブとして高縮重オリゴヌクレオチド配列の使用は、正当であった。

実施例８ ＷＧＬ、＋抗原合成組換え有機体の構築ＷＧＬ″″抗原またはその相同抗原に基 づく商業的ワクチンの進展の主要な制限はダニから得られる抗原の量が限定され ていることである。この不足を打破する手段として大量の抗原を合成するバクテ リアまたは真核細胞を加工する組換えＤＮＡ技術の使用が包含される。後述する 実施例は取り得る手段の一例の概要にすぎない。

第９図はＢ、　ｍ１ｅｒｏｐｌｕｓから単離されたＷＧＬ”をコードする遺伝子 の制限酵素地図を示す、高水準に遺伝子産物を発現するバクテリアを加工するた めに、たぶん該産物分子の疎水性部分を除去することが望ましいだろう、これら は疎水性リニダー配列（アミノ酸１〜１９）を含むが、これは成熟ポリペプチド には見られないものである。また、疎水性Ｃ−末端配列（アミノ酸６３０〜６５ ０）はアンカー配列と考えられ、これはダニ細胞の外表面へ抗原をつなぎとめて いる。第９図において、制限酵素開裂部位としては、Ｘｍｎ　Ｉ　（１１６塩基 ）、Ｐ　ｓｔ　Ｉ　（１９１５塩基）、およびＢａ５ＨＩ（１８８９塩基）が興 味部深い、ＸｍｎＩ、加えてＢａｍＨＩまたはＰｓｔＩを用いたＷＧＬ＋遺伝子 の消化ＤＮＡ断片はＮ−末端疎水性配列またはＣ−末端疎水性配列のない遺伝子 の大部分のコード領域を含む、これら１７７３ｂｐおよび１７９９ｂｐ断片はプ ラスミド内へサブクローニングされるが、該プラスミドとして、ｐＰＴＡ６０３ およびｐＢＴＡ２２４が包含され、これはＷＧＬ”ペプチドの大部分を含む融合 蛋白質の合成を指示する組換えプラスミドとなる。

プラスミドｐＢＴＡ６０３は下記多クローンサイトを含有するＭ　Ｓ　２ポリメ ラーゼ道伝子のＮ−末端からの配列に先行するｐＰＬプロモーターを有する。

ＡＴＧ　ＴＣＧ　＾＾Ｇ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　＾＾Ｇ　八＾に　ＴＴＣ八＾ＣＴＣ Ｔ　ＴＴＡ　ＴＣ（：　ＡＴに／（：ＡＴ　ＣＣＣ制限酵素Ｂａ５ＨＩは５°端 に４塩基を付けて（１）の所でＤＮＡを切断する。これをＤＮＡポリポリーゼエ で補充すると、ＭＳ２−−ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　Ｃが生じる。これにＸｍｎ Ｉ切断ＷＧ　Ｌ”　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｘｍｎ　ＩはＧＡＡＮＮ　ＮＮＴＴＣ配列位 を切断する。即ち、１２０塩基の所）を連結すると、配列ＭＳ２−−ＴＣＧ　Ａ ＴＧ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＴＴＣＴＧＴ−−−Ｗ　Ｇ　Ｌ　”″が生じる。このよ うに構築されたプラスミドはＭＳ２ポリメラーゼからの１５Ｎ末端アミノ酸を含 む蛋白質をコードし、成熟ＷＧＬ”配列のＮ−末端１１アミノ酸の位置のクロー ニングサイト配列は続いて、ＢａｍＨＩ断片のためのＷＧＬ＋アミノ酸３１〜６ ２０または、ＰｓｔＩ断片のためのアミノ酸３１〜６２８となる。ｅＩリプレッ サーをコードする遺伝子の突然ｓ 変異（ｃＩ）を含有する例えばＮ４８３０のような適当な宿主に形質転換された 時、融合ポリペプチドの発現は３０℃の温度で抑制されるが、４２℃の温度では 活性である。この発現の温度依存性は融合産物が細胞に有害である時有利である 細胞は３０℃で望ましい細胞密度になり、温度が４２℃に増大すると融合蛋白の 合成を誘起する。

発現ベクターｐＢＴＡ２２４はβ−ガラクトシダーゼ−ＷＧＬ”Ｉｉ合蛋白質を 産生ずる能力のある株を生じさせるため用いられる。ｐＢＴＡ２２４はβ−ガラ クトシダーゼコード領域の外にあるＥｅｏＲＩサイトを除くことによりｐＵＲ２ ９２（Ｅ　Ｍ　Ｂ　ＯＪ　、　２．１７９１〜１７９４（１９８３））カら得ら れ７’、：＠ｐＢＴＡ２２４ＤＮＡを制限酵素５ａｃＩおよびＰｓｔＩで切断し 、得られた４２２１ｂｐｌＪｉ片をアガロースゲル電気泳動で精製した。５ａｅ ＩはＩａｅＺ遺伝子内、３゛端から１１８１ｂｐｓを切断する。Ｐｓｔｌは１ａ ｃＺの３°端のｐＢＴＡ２２４を切断する。このベクターの発現に適当なＷ　Ｇ 　Ｌ　”遺伝子断片を約２ｋｂのＸｍｎＩ制限酵素断片（１１６位からＷＧＬ＋ 遺伝子の３′端過ぎ）をベクターＭ１３ｕ＋５３１（インターナショナルバイオ テクノロジーズ、Ｉｎｃ、より入寂）に挿入することにより第１に得られる。こ れを５ａｃＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、ＷＧＬ＋の大部分をコード し、かつ５ａｃＩおよびＰｓｔＩ粘着末端を有する断面が得られる。

１２１ＷＧＬ”配列１９１１ Ｓａｃｌ端　５°　＞　＞　Ｐｓｔｌ端Ｃ（：ＧＴＡＣＣＣＡｎ；　ＴＴＣＴに Ｔ　ＡＧＴ　にＣＴ　ＣＣＡＴＣＧＡｆ；ＣＣＡＴＧＧに　ＴＣ＾八に　ＡＣＡ 　ＴＣＡ　Ｃ［；３°　Ｍ１３ｕｍ３１から　阿ＣＬ＋遺伝子からこの切断は上 述した大きなｐＢＴＡ２２４　５ａｃＩ　ＰｓｔＩ断片に連結されて以下の配列 を得る。

ＩＰＴＧによる誘起の後産生の期待される融合蛋白質はβ−ガラクトシダーゼの 最初の６５１アミノ酸、ＷＧＬ＋の５９９アミノ酸および多クローニングサイト のような発現ベクターの他の部分より成る。計画分子量は１４３，０５４ダルト ンである。

上述のプラスミドはｐＢＴＡ７０８と命名した。１ａｅＩ’遺伝子含有の好適な 大腸苗宿主はＪＭＩＯＩである。ＢＴＡ１７５２はｐＢＴＡ７０８で形質転換さ れたＪ　Ｍ　１０１である。

ＩＰＴＧにより誘起されて調製された細胞溶解物およびコントロール培養物は５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。１ゲルをクーマシーブ リクアンドブルーで染色して予想されるサイズ付近のバンドが見られた（第１０ 図）、このバンドは非誘起コントロールには見られなかった。同一の５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲルにかけた蛋白質をニトロセルロースに転写した。このニト ロセルロース紙をＢＬＯＴＴＯ（トリス塩の５％粉乳溶液）中、２時間インキュ ベートし、次いでＧＦ５および６（上記参照）画分でワクチン接種したウサギの 血清の１１５００　希釈含有ＢＬＯＴＴＯに１３時間、４℃へインキュベートし 、次いで、ＢＬＯＴＴＯで３度洗浄し、そしてアルカリリン酸塩複合ヤギ−抗− ウサギ抗体含有溶液（プロメガバイオチク）にインキュベートした。１時間イン キュベーションの後、ニトロセルロースを除去し、ＢＬＯＴＴＯ中２度洗浄し、 ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ ン酸含有緩衝液にインキュベートした。

バンドはバクテリアにより合成されたβ−ガラクトシダーゼ−ＷＧＬ”　Ｍ合ポ リペプチドと該ウサギ抗体とが結合した所に表われた。このバンド位置はクーマ シー染色ゲルに見られたバンドの位置と一致する。

実施例９ ｒＤＮＡ技術産生ＷＧＬ＋抗原に基づく発酵精製およびワクチンの構成 ＷＧＬ“抗原またはその部分を発現する株を産生株コレクションにおいて凍結乾 燥されるバイアルとして保存する。保存バイアルからの細胞は再構成されかつ選 択培地に移植される。

そしてこの培地からの細胞は発酵器接種材料を調製するため用いられる。該接種 材料は適切な育成培地含有発酵器に接種するため用いられる。また、発酵はＷＧ Ｌ”蛋白質の産生に適した条件下進行する０発酵完了時、細胞は採取され、生産 物は細胞から遊離され、かつ精製される。生産物は分析されて品質制御され、か つ良好な安定性のための適切な条件下貯蔵される。生産物は厳密な摂取条件にお いて他の成分と混合されて使用される。

この株はインビボで封入体と言われる不溶な塊として礼し＋融合蛋白が生産され 、例えば下記の例によって精製される。

１晩経過したＢＴＡ１７５２培養液を２１の調節装置付フラスコ内に２×１１新 鮮ＬＢ（Ｉｌ当り１０ｇトリプトン７５１１酵母抽出物／　５１７ＮａＣｊ！　 ｐＨ７，５）へ１：１５に希釈し、培養密度がＯＤｏ、３〜０．４に達するまで ３０℃下振とうする。ＩＰＴＧを最終１０＋ｓＭになるまで添加し更に１０時間 インキュベーションを続ける。、！ｌｉＩ胞を集め、最初の培養１１当り水２０ ｊ！に再懸濁し、フレンチプレスを用いて破壊する。この懸濁液をフェニルメチ ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびトリトンｘ−ｉｏ。

にＯ，ｂ＋Ｍとし、次いで１２，０００Ｘ６ａｖ、１０分遠心する。上滑を除き 、ペレットを超音波にて５０ｍ１　ＩＭ　ＮａＣ１７５％トリトンＸ−１００に 再懸濁し、再遠心する。この洗浄段落を繰り返し、ベレットを最終的に超音波を 用いて１１オリジナル培養当り２．５ｍ１１Ｍ　ＮａＣ１７５％トリトンＸ−１ ００に再懸濁する。

精製細胞含有物を８Ｍ尿素１０．１Ｍ　ＤＴＴｌｏ、１Ｍ　トリスＨＣｌ８．０ における２Ｂ／＋ｓＺに３７℃、２暗闇窒素下溶解する。

この溶液を２０，０００Ｘｇａｖ−２０分遠心し、上清を０．１μ論フイルター に通す、この上清の流れは３０にダルトンの分子量をカットオフするフィルター に通され、保持された物質を０．ＩＭ　）リスＭｆｌｌ液と洗浄したカラムＤＥ ＡＥレジンにかけられる０次いで、このカラムは８Ｍ尿素０．ＩＭ）リスｐＨ０ ，８中０〜５　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＩの線形勾配により溶出される。この両分は５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲルにより分析される。所望蛋白質画分３プールし、Ｘ Ｍ３０フィルターにて濃縮、脱塩する。この部分的に精製した蛋白質はフルコー ル５２：モンタニド８８８（９：１）またはフロイント完全または不完全アジュ バントのようなアジュバントに懸濁し、動物に投与する。

実施例１０ ウシマダニ以外のダニ種ＷＧＬ＋抗原をコードするＤＮＡ配列の同定 世界の様々な国において、ウシマダニ以外のダニ種はダニのインフエステーショ ンまたはダニが媒介する他の寄生虫あるいは両者の組合せによる広範な生産性の 損失をもたらす、これらのダニに対するワクチンの発展が非常に望まれている。

これはウシマダニ由来のＷ　Ｇ　Ｌ　”抗原または本明細書およびオーストラリ ア特許願Ｎｏ、８５−４５９３６に記載の免疫原画分由来ＷＧＬ＋抗原によって 動物をワクチン接種することにより達成される０本発明の組換え微生物により生 産したＷＧＬ＋抗原で動物にワクチン接種することおよび他のダニ種によって動 物のインフェステーションに対して防衛する免疫応答を引き出すことが可能であ る。

上述の通り、他のダニ種はたぶんウシマダニのＷＧＬ、＋抗原と機能的に関連し た分子を含有するだろうが、第８図に示したものと配列を異にするだろう、もし 、防衛的免疫応答を誘起する領域にその相違が生じたなら、ウシマダニＷＧＬ＋ 抗原は防衛的でないだろう、しかしながら、他のダニ種からのＷＧＬ”抗原関連 遺伝子産生物をワクチンに含ませるなら、これらダニ種に対して防衛的になると 考えられる。

この提案を試験する方法は、ワクチン接種／寄生実験を他のダニ種のホモジネー ト由来画分を用いて実施し、このダニ種由来のＷＧＬ”相同抗原を精製すること である。そして、本発明のウシマダニＷＧＬ”遺伝子の同定法と類似の方法を用 いて、プロティナーゼ消化、ペプチド断片配列解析、オリゴヌクレオチド形成お よび該遺伝子含有組換え微生物同定ができる。

好ましいアプローチは、他のダニ種から抽出された核酸由来ｃＤＮＡまたはゲノ ムＤＮＡライブラリーを構築すること、他のダニ種から相同遺伝子含有クローン を同定するためのハイブリッドプローブとして第７図に示したＤＮＡ配列または その一部を用いることである。そして、化工された組換え微生物によって合成さ れた相同遺伝子産物は他のダニ種に対する効果的ワクチンの中に含有される。

このアプローチが実行可能であることと証明およびクローンライブラリーへのハ イブリッド形成を実施すべき条件に関する情報を生むために、予備的な「サザン プロット」ハイブリッド形成が実施される。一実施例として要約すれば、数種の ダニから単離したＤＮＡを精製し、制限酵素消化する。生じたＤＮＡ断片はアガ ロースゲル電気泳動によりサイズ排除分画が施され、毛細管作用によりナイロン またはニトロセルロースフィルターに転写と変成される。このフィルターをプレ ハイブリッド形成溶液および次いでハイブリッド形成溶液（ＷＧＬ＋遺伝子コー ド領域由来放射活性ラベル化ＤＮＡ断片含有）にインキュベートする。ハイブリ ッド形成そしてフィルターの洗浄に続いて、Ｘ線フィルムにさらし、得られたオ ートラジオグラフはＷＧＬ”ＤＮＡ断片へハイブリッド形成した種々のダニ種か らのＤＮＡ断片と一致する領域を示す。

この操作を実施するための種々の変法は当技術分野の人にとって当然知りうろこ とであり、下記に詳述される実施例は単に一例を挙げたにすぎない。

雌のダニ種、Ｒｈ１ｐｈｉｅｅｐａｌｕｓ　ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ａ ｍｂｌｙｏｍｍａｖａｒｉｅ６ａｔｉｍ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ　ｄｅｃｏｌｏｒ ａＬｕｓおよびＢ　ｏｏｐｈ　ｉ　Ｉ　ｕｓｍｉｃｒｏｐｌｕｓ　から卵を得た 。これらを湿したインキュベーターに入れ２〜４日インキュベートした０次いで 冷ＴＥＭ衝液に懸濁し、洗浄した０次に０，５％ＳＤＳ含有ＴＥｉ街液にこれを 懸濁し、弱く接触したガラスホモジナイザーで卵を′破壊してホモジネートを得 た。ブロティナーゼＫを添加し最終濃度５０μ２／社としこの混合物を静かに撹 拌しつつ３７℃、１〜２時間インキュベートした。この粘稠溶液を０．ＩＭ）− リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０で飽和されたフェノールで３度靜かに抽出し、次いで エーテルで２度抽出した（フェノール抽出の間の相を分離するため５０００　Ｘ 　ｇａｖ、１０分の遠心を用いた）、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ添加し、２倍容 のエタノールを撹拌しつつゆっくり添加した。繊維状沈澱として溶液から析出し てきたＤＮＡをパスツールピペットで採取し、エタノール洗浄し、ＴＥに静かに 再溶解した。

これらＤ　Ｎ　Ａ試料の一部づつ（通常１０μｓ含有）を製造元の指示に従って 制限酵素により消化した。消化産物の一部をＳＥＤ緩衝２　（１０）中１．６ｚ アガロースゲルで電気泳動により分画した。

このＤＮＡを２倍容０．２５Ｍ　ＨＣＺで１５分脱プリン化した。このＤＮＡを 毛細管作用によりナイロン膜に移した（Ｚｅｔａｐｒｏｂｅ、バイオラッド）、 この膜をにしん精子ＤＮＡ含有溶液（１０）中ブレハイブリッド形成に２〜４時 間、５５℃インキュベートした。

ハイブリッド形成は、ＷＧＬ＋遺伝子の熱変成［１２ｐ］ラベル化ＤＮＡ断片（ 約１０５カウント／分／ｌ１１）含有の上述と同様の溶液にて６８℃、２０時間 実施した。膜をそれぞれ２ｘＳＳＣ１０、ＩＳＳ　Ｄ　Ｓ　テ５５℃、３０分洗 浄し、次いで、６０℃、１５分３度洗浄した。Ｘ線フィルムに少なくとも２４時 間さらした後、既知サイズのマーカーＤＮＡ断片と比較してハイブリッド形成断 片サイズを決定できた。

第１１図はこのような実験の１つのオートラジオグラフを示す、ＤＮＡは制限酵 素５ａｕ３Ａで消化された。ＷＧＬ”ＤＮＡは明らかにダニ４種全てのＤＮＡと ハイブリッド形成している。

この実験において、ＤＮＡは手をつけてないわけではないので、全ての場合汚れ が観察されるが、同一ゲル上のコントロールＤＮＡにハイブリッド形成が検知さ れなかったことからこのハイブリッド形成は特異的である。

実施例１１ 他のダニ種からのＷ　Ｇ　Ｌ　”相同をコードするクローンの単離試験された各 種からのＤＮＡはウシマダニからのＷＧＬ”″抗原をコードするＤＮＡと相同か つ類似する配列を有する。他のダニ種からのそれらＤＮＡ配列を含有するクロー ンは他のダニ種のためのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーを構築するこ とによりかつ、それらライブラリーとウシマダニＤＮＡ断片とをハイブリッド形 成することにより、そして、相同遺伝子にハイブリッド形成するＤＮＡ断片を含 有する組換え有機体を純化することにより単離される。

更に詳述すれば、列挙されたダニ種から単離されたゲノムＤＮＡは制限酵素Ｓａ ｕ　３Ａで部分消化され、ゲル分析で計算される平均サイズ１５〜２０ｋｂの断 片を与える。これら断片を実質的に提供者（プロメガバイオチク）により記載さ れたラムダＥＭＢＬ３腕のＢａｍＨＩ部位に連結された。ライブラリーは制限的 宿主に６２に移植され、３７℃、１晩インキユベーシヨンされた。このプラーク を三重ニトロセルロースフィルターに転写し、１．５ＨＮａＣ１１０，５Ｎ　Ｎ ａＯＨ″ＣＤ　Ｎ　Ａを変成し、３ＭＮａＣｊ！１０．５Ｍ）リス−ＨＣｌ　ｐ Ｈ７，０で中和した０次いでフィルターを減圧下８０℃、２時間加熱し、３２ｐ ラベル化ウシマダニＤＮＡプローブとハイブリッド形成したオートラジオグラフ ィーの後、再フィルターでプローブとハイブリッド形成したプラークを同定し、 採取し、再ハイブリッド形成を繰返すことにより単一プラークに精製した。

ＤＮＡはＢ、　ｄｅｃｏｌｏｒａｔｕｓゲノムライブラリーからの１プラークか ら単離され、制限酵素ＨａｃｌｌおよびＡｐａＩで消化された。

このように提供された断片は１．６ｚアガロースゲル電気泳動により分望された 。１ゲルはエチジウムブロマイド溶液で染色され、このバンドは紫外縁下目視で きたく第１１図）、同一ゲルをナイロン膜に転写し、ＷＧＬ＋抗原をコードする ウシマダニＤＮＡとハイブリッド形成した。第１１［］はＢ　ｏｏｐｈｉｌｕｓ 　ｄｅｃｏｌｏｒａｔｕｓ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ　ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ　ゲノ ムクローンからの断片とＷＧＬ”遺伝子とのハイブリッド形成を示す。

Ｈａｅｌ［［消化におけるハイブリッド形成バンドは約９８０，６３０および３ ４０ｂｐにあり、ＡｐａＩ消化においては２７，３００ｂｐにある。この場合旧 ｎｄ■消化のバクテリオファージラムダからのＤＮＡ断片と比較される。

各ダニ種からのＷＧＬ”抗原のための相同遺伝子部分をコードする各プラークの ＤＮＡ領域は配列解析され、上述したウシマダニＷＧＬ“抗原のための組換え微 生物における発現のための技術と実質的に同一の技術が用いられる。同一のアプ ローチがこれらおよび他のダニ種からのｃＤＮＡクローンを単離するため用いる ことができる。

微生物により発現される相同ＷＧＬ＋抗原蛋白質は発酵話中で成長され、組換え 抗原の発現が誘起され、抗原は精製され、アジュバントまたはキャリヤーと一緒 に構成され、そして動物へのワクチン接種のため用いられる。

この操作はＷＧＬ“関連抗原をコードするクローンを単離するための任意のダニ に等しく適用されることができ、またこのように遺伝子工学的に構築された微生 物によって発現されるＷＧＬ＋関連抗原は家畜および人−に対する生産的損失、 病的状態および死をもたらす範囲のダニに対して効果的なワクチンとして用いる ことができる。

微生物の寄託 本発明において言及したＢＴＡ１７５１株は１９８７年１０月２６日付ブタベス ト条約規定に従ってアメリカ　パークローンドライブ　ロックビル　ＭＤ　２０ ８５２のアメリカ菌型培養収集に寄託され、Ｎ　ｏ　、　Ａ　Ｔ　ＣＣ６７５４ ８を取得している。

Ｂ　Ｔ　Ａ　１７５１株は輸入ライセンス　ＩＬ−８７０４４およびＣＴＣＣと 名づけられ菌型培養収集のための中国センターに寄託されている。

産業上の利用可能性 最新の本発明は、ダニ、例えば、ウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓｍｉｃｒｏｐ ｌｕｓ）、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ　ａｎｎｕｌａｔｕｓ；　Ｈａｅｍａｐｈｙｓａ ｌｉｓ　ｓｐｐ。

０ｔｂｉｕｓ　ｓｐｐ、　Ｒｈ１ｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓｐｐ、　Ａ＋ｍｂ ｙｌｏｍｍａ　ｓｐｐ。

Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ　ｓｐｐ、Ｉｘｏｄｅｓ　ｓｐｐおよびＨｙａｌｏＩＩ ＩＩｎＩＩＳｐｐのような池の種：および特にそれらの例、Ｏｔｏｂｉｕｓ　ｍ ｅＨｎｉｎｉＲｈｉｐｈｉｅｅｐｈａｌｕｓ　ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、 Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ　ａｎｄｅｒｓｏｎｉ。

Ｄ、　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓおよびＩ　ｘｏｄｅｓ　ｈｏｌｏｃｙｅｌｕｓを包 含するダニのインフェステーションに対して牛にワクチン接種する方法を提供す る。更に本発明は、Ｂａｂｅｓｉａ　ｂｏｖｉｓ、Ｃｏｗｄｒｉａ特表千１−５ ０２１１５（２１− ５０２１１５（２５）ｒｕ　Ｉｅｒｉｉ　ｐａｒｖａ　ｐａｒｖａ、Ｔ、ｐａｒ ｖｉ　Ｉａｗｒｅｎｃｉｌ。

Ｔ、　１ｌｎｕｌａｔａおよびＴ、　ｈｉｒｃｉによって引き起こされる病気に 対して牛を防衛する方法を提供する。更に本発明は、ダニ抗原の同定および定量 のための診断学的道具を提供する。

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１５、　Ｓｉｇｅ、Ｈ，Ｊ、およびＧｒｅｅｎ、Ｒ，Ｗ、　、酵素学の方法（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２８．Ｇｕｉｎｓｂｕｒｇ、Ｖ、 　ｉｌｌ集。

３３２−３３９（１９７２）　、ロンドン　アカデミツク　プレス（Ｌｏｕｄｏ ｎＡ　ｅａｄｅｍｉｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ）。

第１図 非結合　結合−一一−ＩＥＦ　−＋　ＩＥＦ後ＬＬ１第２図 ＩＥＦ後ＬＬプール　４．１　ｍｇ　（Ｆ）フェニルＳ　ＰＷ　前　ＬＬ ＬＬ抗原約　４゛８０μｇ　（Ａ） 第３図 ＩＥＦ後ＷＧＬプール２．４　Ｑ　（Ｆ）０．８８１１？ 部分精製ＷＧＬ抗原 ＷＧＬ抗原　約３３μｇ　（Ａ） 第４図 粗膜調製 沈澱 上清　沈澱 結合　非結合　結合　非結合 ＷＧＬ＋抗原 Ａ　Ｂ Ｌ／−７４ＷＧＬ　０．２μｇ レーン７　ＬＬ　０１１７μｇ レーン２．３　＆８　ＢＲＬマーカー ミオシンＨ鎖　２０００００　Ｄ ホスホリラーゼＢ　９７４００　Ｄ 牛血清アルブミン　６８０００　Ｄ オボアルブミン　４３０００　Ｄ αキモトリプシン　２５７００　Ｄ Ｉラクトグロブリン　１８４００　Ｄ リゾチーム　１２３００　Ｄ ｃＤＮＡりｐ−ンライブラリー 分析的アッセイ　第６図 Ｐ　−ＰＥＩセルロースおよびオートラジオグラフィーＧ−ゲル分析およびオー トナジオグラフィー特表千１−５０２１１５（２７） 第９図　続き １切断する酵素　３切断する酵素 Ａｐａ菖１００７Ａｅｃ１７０１９１！１１４０４１１ｇ１１　７コｏ　Ｈｇ１ ＡＩ　７２２　８４３　１２ココＦｓｐｌ　：Ｉ９７　）１ｈａｌ　コ９１１　 ４１８　１４２９Ｈａｔ…１００８Ｈｐｈ１４コ５１０６６１り６６Ｎｃｏｉ　 ９８７　Ｍａｅｌ　２９８　８８８　２０５４Ｎｈｅ１２９７Ｒｓａ１２００７ １６１６２７Ｐｓｔｌ　１９１５　５ａｌｌ　７０１　９１８　１４０４Ｓｓｐ Ｈ５４７Ｈｇａ１２２３０４９１６１コ９６Ｓｔｙｌ　９８７　８ｉｎｄｌｌ　 ７０１　９１８１０１７１＝ｏ４Ｘｍｎｌ　１１６　Ｈｐａｌｌ　４６４　Ｇ３ ３　７０６　１００５Ａｖ−鵞Ｉ　６３０　１１３Ｌ　Ｂｉｎ＋　１１１２　１ ３６１　１ＢＢ９　１８９０　１８９６Ｂｅｌｌ　１コ００　１７２１　８ｓｐ Ｍｌ　５０４　５２９　Ｇ９７　７６５　１１１６Ｂｉｒｎｌ　６９３　１２≦ ９　εｃｏＲＩＩ　１５３　５５７　６１５　１Ｇ０２　１８９９ＦｎｕＯ１１ ２１１１７Ｆｏｋ１９４１Ｆ＋４４０４６９３１２６ＯＮｃ１曹　４６コ　１０ ０５　７ｔｈｌｌｌｌｌ　ＧＳコ　６８６　１０７２　１２４１３　１８２６Ｎ ｓｐ７５：１４１　１２５１　１１ｉ３２６切断する酵素 Ｍａｅｌｌｌ　２１１３　４２７　１４３８　１７３２　１９４３　１９６５Ｎ ｌａｌ１１４５５６９０９８８１２５２１２８０１６３３ＮｌｉｌＶ　１４９　 ６１９　１００７　１４２０　１７３９　１ＥＩＱ９ＳｆａＮｌ　３２　４０　 ３１５　６９４　１２５９　１９７４Ａ　Ｂ ２０〇− ＧＥＬ　Ａ　クーマシー染色 ＧＥＬ　Ｂ　ウェスタン転写 ＬＡＮＥ　１：　ＢＲＬ高分子量マーカー２．４：非誘起ＢＴＡ溶解物 ３．５：　ＩＰＴＧ誘起ＢＴＡ溶解吻 第１Ｏ図 ＡＴＣＣＧＴ　ＧＧＣＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＣＧ丁ＣＭｅｔ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｙ　ｌｉｅ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａ１ＡＧＣＴＡＴ　ＧＧＡ　ｃａｒ　 ＴＧＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＧ丁Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　；Ｉｙ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖａ ｉ　Ｇｌｕ　Ｓｅ＋。

ＴＣＧ　ＧＡＣＧＡＴ　ＣＴＡ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＴＧＣＳｅｒ　Ａｓ ｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＣｙｓＡＡ丁　ＣＧＡ　ＧＧＴ 　ＧＧＣＡＣＴ　ＧＣ”　ＡＡＧ　ＴＴＧ’ｓｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 ＴｔｎｏＡｈａ　ＬｙＳ　ＬｅｕＣｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａ ｈａ　Ｍｅｔ　ＡｓｎＣＣＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＳＧＴＴＣＧＡＣＧＣ ＡＧＴＧＡＧ「 廖 ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＧＡＣＴＧＴ　ＧＧＣＧＴＡ　ＴＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＣＧ ＡＰｒ＋ｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　）ｌｅｔ　Ａ ｓｎ　ＡｒｇＭｅｔ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＩＩ ｓ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＧＴＧ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣＣＣＧ　ＴＧＧ　 ＡＡＴ　ＣＡＡＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａ ｓｎ　ＧｉｎＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＧＣＣＡＣＣＡＡ　ＧＡＡ Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ、 ＣＡＡ　ＡＧＣＴＧＣ丁ＡＴ　ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＡＡＡ　ＴＣＡｌＧｉ ｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　ＳｅｒＧＡＡ 　ＴＧＣＣＴＡ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＡＣＧｌｕ　Ｃｙ ｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　丁ｙ＋°　Ｔｙｒ　ＴｙｒＡＧＴ　ＡＴ ＣＧＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＧＴＴＳｅｒ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｉｕ％／ａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　’／ａ１ＧＡＡ　ＧＣＴ　 ＧＣＣＴＡＣＡＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＣ八ＡＡＧｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓしｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｉ ｌｅ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＡＣＴ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧ Ｇ　ＧＡＧ　ＡＴ丁　ＧＧＣＴＧＣＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓｌｌｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　／１．ｓｐ　Ａｓｐ　 ）（ｉｓ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　ＳｅｒＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＴＧＣＡ、、Ａ１．１ＧＡＡ 　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡＬｙｓ　Ａｌａ　１．’ａｌ　Ｃｙｓ　Ｉ−；ｚ＝　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＴＧＴ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＴＧＡ　ど二　・二 ＧＧ　ＡＡＣ区 国際調査報告 、、、、、、、醪、、、、、、、、、、、、、ＰＣＴ／ＡＵ８７１００４０１に ９圧ズ’１１０　ＴＦＥＤ江ロ引ＭゴαａＬ９スにΣだツボごＯＮＢ！ＩコＮＡ Ｌ　λＰＰＬ工ＣＡＴ丁ＣＮＮコ、　ｐごｒ入Ｕ　８７００４０１ＡＵ　５９７ ０７／８６　ＥＰ　２０８５０７　ＭＵ　４３７９１　ｊ’Ｐ６２０Ｂ４０２９ 話　８６０４８８５　認　５１７８６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ダニ種あるいはダニ細胞系由来の免疫原が投与された哺乳動物宿主のダニの インフェステーションに対する免疫を引き出す能力を有する抗原からなる該免疫 原において、該免疫が該宿主に寄食したダニの腸細胞の原形質膜を障害して、ダ ニの大部分を成虫段階で死滅させるか、あるいは、生き残ったダニを赤色にし、 かつ該生き残ったダニの生殖能カを実質的に減退させる免疫応答を該哺乳動物宿 主に生じさせるものであり、該免疫原が該抗原の、部分、相似抗原、相同抗原、 誘導体およびこれらの組合せを含む該抗原に対して類似する免疫学的活性を示す 免疫原を含むことを特徴とする免疫原。 ２．免疫原が約５．３０〜約５．６７のｐＩを有する請求の範囲第１項記載の免 疫原。 ３．免疫原が約８９キロダルタンの分子量を有する請求の範囲第１項又は第２項 記載の免疫原。 ４．免疫原が糖蛋白質である請求の範囲第１項〜第３項何れか１項に記載の免疫 原。 ５．免疫原が実質的に均一な純粋な形態である請求の範囲第１項〜第４項何れか １項に記載の免疫原。 ６．哺乳動物宿主が牛、馬、鹿、ヤギ、犬、猫、羊または豚である請求の範囲第 １項〜第５項何れか１項に記載の免疫原。 ７．抗原がウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ　ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ）由来である 請求の範囲第１項〜第６項何れか１項に記載の免疫原。 ８．誘起される免疫がＢｏｏｐｈｉｌｕｓ種によるインフェステーションに対す る免疫である請求の範囲第１項〜第７項何れか１項に記載の免疫原。 ９．誘起される免疫がＢ．ｍｉｃｒｏｐｌｕｓのインフェステーションに対する 免疫である請求の範囲第８項記載の免疫原。 １０．誘起される免疫がＢ．ａｎｎｕｌａｔｕｓまたはＢ．ｄｅｃｏｌｏｒａｔ ｕｓのインフェステーションに対する免疫である請求の範囲第８項記載の免疫原 。 １１．誘起される免疫がＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｓｐｐ，ＯｔｏｂｉｕｓＳ ＰＰ，Ｒｈｉｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓｓｐｐ，ＡｍｂｙｌｏｍｍａＳＰＰ，Ｄｅ ｒｍａｃｅｎｔｏｒｓｐｐ，Ｉｘｏｄｅｓｓｐｐ，またはＨｙａｌｏｍｍａｓｐ ｐによるインフェステーションに対する免疫である請求の範囲第１項〜第７項何 れか１項に記載の免疫原。 １２．誘起される免疫がＯｔｏｂｉｕｓｍｅｇｎｉｎｉ，Ｒｈｉｐｈｉｃｅｈａ ｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ，Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒａｎｄｅｒｓｏ ｎｉ，Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ，Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｌｏｎｇｉｃｏ ｒｎｓＡｍｂｙｌｏｍｍａｖａｒｉｅｇａｔｕｍまたはＩｘｏｄｅＳｈｏｌｏｃ ｙｃｌｕｓによるインフェステーションに対する免疫である請求の範囲第１１項 記載の免疫原。 １３．抗原がＢｏｏｐｈｉｌｕｓｓｐｐ，Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｓｐｐ， Ｏｔｏｂｉｕｓｓｐｐ，Ｒｈｉｐｈｉｃｅｐｈａｌｕｓｓｐｐ，Ａｍｂｙｌｏｍ ｍａｓｐｐ，Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒｓｐｐ，ＩｘｏｄｅｓｓｐｐまたはＨｙａ ｌｏｍｍａｓｐｐ由来である請求の範囲第１項〜第１２項何れか１項に記載の免 疫原。 １４．抗原がＢ．ａｎｎｕｌａｔｕｓ，Ｂ．ｄｅｃｏｌｏｒａｔｕｓ，Ｏｔｏｂ ｉｕｓｍｅｇｎｉｎｉ，Ｒｈｉｐｉｃｅｐａｌｕｓａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕ ｓ，Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒａｎｄｅｒｓｏｎｉ．Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ， Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ，Ａｍｂｙｌｏｍｍａｖａ ｒｉｅｇａｔｕｍｏｒＩｘｏｄｅＳｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ由来である請求の範囲 第１３項に記載の免疫原。 １５．一免疫原はダニ制御の桔呆としてある作因によって起こるＢａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ，Ｂ．ｂｉｇｅｍｉａ，Ａｎａｐｌａｓｍａｍａｒｇｉｎａｌｅ，Ｃ ｏｗｄｒｉａｒｕｍｉｎａｔｕｍ，Ｔｈｅｌｅｒｉａｐａｒｖａｐａｒｖａ，Ｔ ．Ｐａｒｖａｌａｗｒｅｎｃｉｉ，ａｎｎｕｌａｔまたはＴ．ｈｉｒｃｉのよう な病気に対する防衞をも提供する請求の範囲第１項〜第１４項何れか１項に記載 の免疫原。 １６．第５図に描出されたアミノ酸配列を実質的に有する請求の範囲第１項から 第１５項何れか１項に記載の免疫原。 １７．下記アミノ酸配列を有するポリペプチドから選択されるポリペプチド。 【配列があります】または Ｆ１７（Ｋ）ＬＱＡＣＥＨＰ１ １８．下記アミノ酸配列からなる請求の範囲第１７項記載のポリペプチド。 【配列があります】または Ｆ１６ＫＣＴＶＬＣＥＣＰ １９．実質的に下記アミノ酸配列からなるポリペプチドからなるかまたは該免疫 原に対して類似する免疫学的活性を示す該ポリペプチドの、部分、相似、相同、 誘導体またはこれらの組合せからなる請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項に 記載の免疫原。 【配列があります】 ２０．グリコシル化された形態の請求の範囲第１７項から第１９項何れか１項に 記載のポリペプチド。 ２１．前記において定義されたＷＧＬ＋。 ２２．グリコシル化された形態の前記において定義されたＷＧＬ＋。 ２３．エビトープが哺乳動物宿主におけるダニによるインフェステーションに対 して免疫を誘起する能力を有する請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項記載の 免疫原のエビトープ。 ２４．合成的にまたは天然または組換え免疫原の化学的または酵素的開裂の結果 として生成された請求の範囲第２３項記載のエビトープ。 ２５．請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項記載の免疫原または請求の範囲第 １７項〜第２２項何れか１項記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配 列として機能する第１のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド配列に おいて、該第１の配列または該第１の配列に関連したポリヌクレオチド配列また は１個または複数の塩基の置換、欠失、挿入および逆位を含む突然変異によるハ イブリッド形成する配列。２６．該配列がＤＮＡ配列である請求の範囲第２５項 記載のポリヌクレオチド配列。 ２７．ＤＮＡ配列かｃＤＮＡ配列である請求の範囲第２６項記載のＤＮＡ前列。 ２８．実質的に下記配列からなるＤＮＡ配列または請求の範囲第１項から第１６ 項において定義された免疫原に対して類似する免疫学的活性を示すポリペプチド をコードする下記配列の、部分、相似、相同、誘導体またはこれらの組合せから なるＤＮＡ配列。 【配列があります】 ２９．下記から選択されるハイブリッド形成プローブ。 【配列があります】 または 【配列があります】 ３０．請求の範囲第２項〜第２８項の何れか１項に従う少なくとも１つのＤＮＡ 配列およびベクターＤＮＡからなる組換えＤＮＡ分子。 ３１．ベクターＤＮＡがファージ、ウィルスまたはプラスミドＤＮＡである請求 の範囲第３０項記載の組換えＤＮＡ分子。 ３２．ベクターＤＮＡがラムダｅｔｌｌ，ｐＵＲ２９０，ｐＵＲ２９１，ｐＵＲ ２８２，ｐＵＫ２７０，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，バキュロウイルス，ｐＺｉｐＮｅ ｏ，ＳＶ４０ベースベクター，入ｇｔ１０，ＥＭＢＬベクター，ｐＢＲ３２７， ｐＢＲ３２９または等価な遺伝子座を含有するｐＢＲ３２９である請求の範囲第 ３０項または第３１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３３．前記において定義されたｐＢＴＡ７０７。 ３４．ＤＮＡ分子が発現制御配列を付加的に構成している請求の範囲第３０項〜 第３３項何れか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３５．発現制御配列がプロモーターおよび転写開始点からなる請求の範囲第３４ 項記載の組換えＤＮＡ分子。 ３６．請求の範囲第３０項〜第３５項何れか１項に記載の少なくとも１つの組換 えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞系かちなる形質転換体。 ３７．該宿主がバクテリア、酵母、哺乳動物又は昆虫の細胞系である請求の範囲 第３６項記載の形質転換体。 ３８．該形質転換体宿主がＹ１０９０またはＹ１０８９またはＪＭ１０１である 請求の範囲第３７項記載の形質転換体。 ３９．前記において定義されたＡＴＣＣ６７５４８。 ４０．請求の範囲第１項から第１６項何れか１項に記載の免疫原または請求の範 囲第１７項〜第２２項何れか１項に記載のポリペプチドからなるインビトロ生育 宿主細胞系の発現産物。 ４１．請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項に記載の少なくとも１つの免疫原 または請求の範囲第１７項〜第２２項何れか１項に記載の少なくとも１つのポリ ペプチドおよびキャリヤー、アジュバント免疫増強剤または希釈剤からなるワク チン。 ４２．ＷＧＬ＋からなる請求の範囲第４１項記載のワクチン。 ４３．請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項に記載の免疫原または請求の範囲 第１７項〜第２２項何れか１項に記載のポリペプチドに対して生じるイディオタ イプ抗体。 ４４．請求の範囲第４３項記載の抗体に対して生じる抗−イディオタイプ抗体。 ４５．請求の範囲第４３項又は第４４項の各イディオタイプ又は抗−イディオタ イプ抗体からなるワクチン。 ４６．請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項に記載の免疫原文は請求の範囲第 １７項〜第２２項何れか１項に記載のポリペプチドを小麦胚レクチンまたは小麦 胚レクチンと同一あるいは類似の末端糖の特異性を有するレクチン上で実施され るクロマトグラフィー段階にかけて、該免疫原またはポリペプチドを該レクチン に結合させ、次いでそれから溶離させる免疫原の調製方法。 ４７．均質化されたダニから得られた膜リッチな画分を界面活性剤により抽出す ること、および該可溶化物質を小麦胚レクチンセファロースクロマトグラフィー にかけてＮ−アセチルグルコサミンによる溶離、または小麦胚レクチンまたは小 麦胚レクチンに対して同一あるいは類似の末端糖の特異性を有するレクチンを用 いたクロマトグラフィーにかけることから成る、請求の範囲第４６項記載の免疫 源の調製方法。 ４８．界面活性剤がＮＰ４０またはＮＰ４０誘導体、ツウィッタージェント３− １４またはＳＤＳから選択される請求の範囲第４７項記載の方法。 ４９．コンカナバリンＡ−セファロースクロマトグラフィーおよびメチル−ａ− Ｄ−マンノピラノシドによる溶離を付加的に構成する請求の範囲第４８項記載の 方法。 ５０．調製的等電点電気泳動段階を付加的に構成する請求の範囲第４９項記載の 方法。 ５１．サイズ排除クロマトグラフィーを付加的に構成する請求の範囲第５０項記 載の方法。 ５２．ダニのホモジネートの調製； 膜リッチ画分を得るための遠心分離； 界面活性剤による該膜面分の処理； 界面活性剤可溶化物質の小麦胚レクチンカラムまたは小麦歴レクチンに対して同 一または類似の末瑞穂の特異性を有するカラムのクロマトグラフィー； 界面活性剤含有緩衝液中の等電点電気泳動によるレクチン結合抗原の分離； 界面活性剤含有緩衝液中のサイズ排除ＨＰＬＣによる該抗原のクロマトグラフィ ー： 得られた画分のＨＰＬＣクロマトグラフィーによるクロマトグラフィー；および 得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析からなる請求の範囲第４６項〜第５ １項何れか１項に記載の方法。 ５３．膜がツウィッタージェント３−１４で処理される請求の範囲第５２項記載 の方法。 ５４．小麦胚レクチンカラムが小麦胚レクチンセファロース６Ｂカラムである請 求の範囲第５２項又は第５３項記載の方法。 ５５．該緩衝液が界面活性剤としてツウィッタージェント３−１４を含有する請 求の範囲第５２項〜第５４項何れか１項に記載の方法。 ５６．該サイズ排除ＨＰＬＣが組をなしたＢｉｏ−ＳｉｌＴＳＫ４０００および ＰＰ３００ＳＷカラムで実施される請求の範囲第５２項〜５５項何れか１項に記 載の方法。 ５７．請求の範囲第４６項から第５６項何れか１項に記載の方法によって得られ る免疫原。 ５８．請求の範囲第２６項〜第２８項何れか１項に記載のＤＮＡ配列をベクター ＤＮＡへ挿入することからなる請求の範囲第３０項〜第３５項何れか１項に記載 の組換えＤＮＡ分子の調製方法。 ５９．請求の範囲第３０項〜第３５項何れか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を宿 主細胞系へ挿入することからなる請求の範囲第３６項〜第３９項何れか１項に記 載の形質転換体細胞系の調製方法。 ６０．請求の範囲第３０項〜第３５項何れか１項に記載の組換えＤＮＡ分子を得 ること；請求の範囲第１２項〜第１６項何れか１項に記載の免疫原または請求の 範囲第１７項〜第２２項何れか１項に記載のポリペプチドからなる蛋白質産物を 発現する能力を有するように該組換えＤＮＡ分子により宿主細胞系を形質転換す ること；該発現を得るために該宿主を培養すること；および該蛋白質産物を収集 することからなる請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項に記載の免疫原または 請求の範囲第１７項〜第２２項何れか１項に記載のポリペプチドの生物合成方法 ．６１．該免疫原が封入体として形成されている請求の範囲第６０項に記載の免 疫原の生物合成方法。 ６２．該哺乳動物宿主へ請求の範囲第４１項，第４２項または第４５項何れか１ 項に記載のワクチンを投与することからなるダニのインフェステーションに対す る哺乳動物宿主の防衛方法。 ６３．請求の範囲第２９項記載のハイブリッド形成プローブを得ることおよび一 連のＤＮＡまたはＤＮＡ配列のどれが該プローブとハイブリッド形成するかを決 定することからなる請求の範囲第１項〜第１６項何れか１項に記載の免疫原また は請求の範囲第１７項〜第２２項何れか１項に記載のポリペプチドをコードする ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を選択する方法。 ６４．該ハイブリッド形成プローブを初めに放射往ラベル化することからなる請 求の範囲第６３項に記載の方法。