JPH06500996A - マラリア原虫の肝内発育期抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １７、Ｅ、ｃｏｌｊ、　Ｐｂｌ　１　（ＮＣＩＭＢ　４０３１４）。

１８．請求項７または８に記載のモノクローナル抗体を生成し得るハイブリドー マ細胞系。

１９、ハイブリドーマ細胞系２３．４６．７８　（ＥＣＡＣＣ受託番号第９００ ９１１１０１号）。

明細書 マラリア　由の 本発明は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の寄生虫由来の抗原性タンパク様物質の単離 および生成、それに対し応答性のモノクローナル抗体の生成、およびそれらを含 有する抗マラリアワクチンに関する。

宵効な抗マラリアワクチンの研究は主として次の２つの要因により妨げられてき た：マラリア寄生虫の低免疫原性、およびその極めて多彩で複雑な生活サイクル 。

感染性蚊の刺咬により、哺乳類マラリアのスポロゾイトが肝細胞に侵入し、そこ で、次の２−１５日間（寄生虫の種により異なる）増殖する。その後、肝臓メロ ゾイトが血流中に放出され、赤血球内での有性生殖および病原性を宵する無性生 殖を経て、増殖し、マラリアの症候および病状に関連する血液同発育期の症状が 開始される。無性生殖的血液内発育期＜Ｐａｔａｒｒｏｙｏら、１９８１１）お よび有性生殖的発育期（Ｃａｒｔｅｒら、１９８８）のスポロゾイト（Ｅｅｒｒ ｊｎｇｔｏｎら、１９８７）由来の抗原を基礎としたマラリアワクチンが現在検 討されている。対照的に、肝門発育期の抗原は、これらの細胞内発育期が宿主の 免疫系に到達し難いと考えられていたため、ワクチンの候補としてはほとんど研 究されてこなかった（　Ｃｏｘ、１９８８）。しかし、げっ歯頚マラリア原虫モ デル（Ｌ−ｌ１」ｌｊｌおよびＬコ空江ユ）の研究から、放射線照射されたスポ ロゾイトで免疫することにより得られる感染防護のかなりの部分は、循環スポロ ゾイト上のスポロゾイト周縁タンパク質（ｃｓｐ）に特異的な抗体に起図すると いうよりは、むしろ感染肝細胞に特異的なＣＤ８’Ｔ細胞の活性に起因すること が現在明らかにされている（Ｗｅｉｓｓ。

１９８７；　５ｃｈｏｆｉｅｌｄら、１９ｇ７ＨＨｏｆｆｍａｎら、１９８９） 。感染された肝細胞表面上のクラス１主要組織適合遺伝子複合体に関連する処理 されたＣ３Ｐは、そのような細胞障害性Ｔ細胞に対する１つの標的であるようだ （Ｋｕｒｉａｒら、１９１１８：　５ａｄｏｆｆら、１９８Ｂ、　Ｈｏｆｆｍａ ｎら、！９＋１９ａＨＲｏｍｅｒｏら、１９８９）。熱帯熱マラリア原虫のＣ３ Ｐの単一のＣＤ８”　Ｔ細胞エピトープは高度に多形性を示しており（Ｌｏｃｋ ｙｅｒら、１９８９）、それに対する応答性もまた一般に制限サレ得る（　Ｇｏ ｏｄら、１９８Ｂ）。これらの現象が合成ワクチンの基礎としてのＣＳＰの使用 をどの程度まで危うくするのかはいまだ明らかではない（Ｄｅ　Ｇｒｏｏｔら、 １９８９ＨＨｏｆｆｍａｎら、１９８９ｂ；　Ｄｅ　ｌａ　Ｃｒｕｚら、１９１ １８）。肝門発育期においても発現される多数の血液内発育期抗原（Ｄａｎｆｏ ｒｔｈ、　０ｒｊＩｈおよびＮＩＩＳＳｅｎＺｌｌｅｆｇ、　１９７８：　Ｓｚ ａｒｆｍａｎら、１９８７．５ｕｂｒｂｉｅｒら、１９８９ａ）および肝門発育 期に特異的である抗原（Ｄｒｕｉｈｌｅら、１９８４；　Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍａｒ ｓｈａｎｄら、１９１１７）は全て、感染防護性ＣＤ８’Ｔ細胞の潜在的な標的 であり得る（　ＴｏｖｎｓｅｎｄおよびＢｏｄｎｅｒ、　１９！１９）。肝門発 育＃））寄生虫カサイトカイン（生としてガンマインターフェロン）　（Ｍａｚ ｉｅｒら、１９８８；　５ｃｈｏ１ｆｉｅｌｄら、１９１１７）および食細胞（ Ｓｈｏｒｔｔ　＆　Ｇａｒｎｈａｍ、１９８４；　Ｔｅｒｚａｋｊｓら、１９７ ９；　Ｍｅｉｓら、１９８７）により殺滅され得ることを示した研究はさらに、 肝門発育期での免疫性に関連する抗原を同定する必要性を強調する。

本発明により、肝門発育期抗原（Ｐｂｌ　１）が同定され、−ｓｏ　ｕＩｌｂｅ ｒ　ｈｅ’の培養物より単離され、そしてその抗原に特異的なモノクローナル抗 体（抗−Ｐｂｌ　１）が生成された。

従って、最も広い局面において、本発明は以下を意図している： １、Ｌ］□■旦の肝門発育期抗原Ｐｂｌ　１およびＰ］ａｓｉ＋ｏｄｉｕｍ属の 、とりわけ熱帯熱マラリア原虫（Ｌコ尤」１旺■）および三日熱マラリア原虫（ Ｌ工旦■）由来のＰｂｌ　１相同体（本明細書では相同Ｐｂ！　１と称する）を 含む精製単離物。

２、肝門発育期抗原であって、発現ビヒクル中で、それをコードするゲノムまた はｃＤＮＡの発現により得られる、第１項に記載の肝門発育期抗原。

３、第１または２項に記載のマラリア原虫の肝門発育期抗原に特異的な、モノク ローナル抗体。

４、第１または２項に記載のマラリア原虫の肝門発育期抗原、または第３項に記 載のモノクローナル抗体を含有する、抗マラリアワクチン。

５、第１項に記載のマラリア原虫の肝門発育期抗原をフードするゲノムまたはｃ 　ＤＮＡフラグメント０６、第５項に記載のゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント を含有し、宿主細胞中でＰｂｌ　１または相同１’ｂｌ　１を発現し得る、トラ ンスフェクションベクター。

７、第５項に記載のゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントを含有し、培養すると、 Ｐｂｌ　１または相同Ｐｂｌ　１を発現し得る発現ベクターを含有する、トラン スフェクトされた細胞。

８、箪３項に記載のモノクローナル抗体を生成するハイブリ　ドーマ。

より特異的な局面において、本発明は以下を提供する：１．１　本明細書におい てＰｂｌ　１と同定するし」肛肢虹の肝門発育期抗原を含む精製単離物。

３．１　モノクローナル抗体：抗Ｐｂｌ　１　（２３，４６，７８）５．１　Ｌ ］区ｎ旦の肝門発育期抗原Ｐｂｌ　１をコードするゲノムまたはｃＤＮＡフラグ メント。予備的分析によると、この配列は以下の特徴を宵する。

それは３１４塩基対の長さである；停止コドンは有さない；β−ガラクトシダー ゼを有するオープンリーディングフレーム中にあった；一端にＥｃｏ　Ｒ１部位 を有する８４丁に非常に富む（マラリアＤＮＡの特性）　；　１２．０８２の総 Ｍ、Ｗ、を有する１０３アミノ酸をコードする、すなわちそれは天然分子の画分 のみである（約１／３−１／４）　；この配列は入手可能な遺伝子データベース 中の他のいかなる配列とも相同性を有さない。

この配列は、付表にＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　１として掲載する。

６．１　第５．１項に記載のゲノムまたはｅＤＮＡフラグメントを含有する発現 ベクター。

７．１　第６，１項に記載のベクターでトランスフェクトされ、培養されるとＰ ｂｌ　１を生成し得る宿主細菌。

７．２　Ｌ並且りローンＥｃｏ、Ｐｂｌ　１゜８．１　モノクローナル抗体２３ ．４６．７　（モノクローナル抗ｐｂ１１）を生成するハイブリドーマ。

本明細書においてＰｂｌ　１と同定するし」肛肚五肝門発育期抗原は、インビボ では、寄生虫保持小胞、すなわち感染された肝細胞中の感染寄生虫周辺の区域、 および寄生虫保持小胞膜の表面上に局在するものとして同定された。単離された 抗原の分子量の研究結果は、３５±５ｋＤＡの分子量（Ｍｒ）を示す。抗原はモ ノクローナル抗体２３．４６．７　（以下に記載）により特異的に認識される。

感染スポロ／イトの侵入より３−５時間経過後からメロゾイトが肝から血流中に 放出されるまでの、肝門発育期間中ずっと、Ｌ」肛■旦抗原は発現される。

すでに示唆したように、本発明はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の寄生虫由来のＰｂｌ 　１相同体、とりわけヒトの寄生虫である熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラ リア原生をもその範囲に含める。

本明細書において、相同的ＤＮＡには、同属または同種の生物由来のＤＮＡと同 等の直鎖状配列を指し、それらは互いに同一、または同等の対立遺伝子の置換ま たは遺伝子コードの縮重が異なるだけの実質的に同一のものであり、属内の２つ 以上の種、または種において２つ以上の菌株において同一または実質的に同一で あるタンパク質をフードするものであり、相同タンパク質または抗原相同体と称 されるそのようなタンパク質は、実質的に同じ構造および特性を有し、かつ、同 様に解釈される用語、相同、相同の、相同体等と称されるそれぞれの菌株または 種牛で、実質的に同じまたは同等な生物学的機能を果たす。

爽鳳 棒Ｐｂｌ　モノクローナル　の 初めに、Ｌ」虹肚ムの４８時間肝肝門育期シゾントを、ヒトのＨｅｐＧ２細胞中 でＨｏｌｌｉｎｇｄａｌｅおよび５ｕｈｒｂｉｅｒの技術を用いて培養した（Ｈ ｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ、１９８３．および５ｕｈｒｂｉｅｒら、１９８８、下記 参照）。

それとは別に、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＦｆｅｐＧ２１Ｍ胞のみで免疫し、その後 に生じるＨｅｐＧ２細胞に対する応答を抑制するためにシクロホスファミドで処 理した。３週間の回復期間の後、２週間の間隔をおいて、上述のように増殖させ て凍結解凍した４８時間ＥＥシゾント（１０−２０％の感染率を宵する約２．　 ＳＸ　１０５細胞）で、動物を３回免疫した。■ｅｐＧ２細胞中でアセトン固定 した培養ＥＥシゾントの間接免疫蛍光アッセイによる血清の分析によれば、いく らかのＨｅｐＧ２バックグラウンドの活性が生じたが、個々のマウスは寄生虫に 対して膏意な抗体応答性を示した。５力月後、マウスに２日続けて、毎日１０′ のスポロゾイトを経静脈的に接種した。スポロゾイト接種後６および／または７ ８目、Ｇｉｅ＋ｅｓａ染色した血液スミアが陽性の寄生虫血症を示した時に、マ ウスを殺して膵臓を融合のために取り除いた。融合プロトコルはＷｕｎｇｅｒら （１９ｇ？）の記載のように行った。得られたハイブリドーマの上清を、生きた ままアセトン固定培養した肝シゾント、洗浄した寄生血液スミア、および固定染 色され空気乾燥したスポロゾイトについて、間接免疫蛍光法によりスクリーニン グした。選択したモノクローナル抗体の腹水液は、肝寄生虫について１／１００ ．０００から１１５００．０００の免疫蛍光力価を有しており、モノクローナル 抗体の肝特異性を立証するために、高度に寄生された血液を厚膜上で１７５０に 希釈して用いた。

ｉ監免皮二直上 モノクローナル抗体１７．９．１５（オオキネート表面抗原に特異的、ｆｉｎｇ ｅｒら、１９８７）、１７．６．１（肝メロゾイトの統合された抗原および全て の血液内発育期の寄生虫に結合するＨ　５ｕｈｒｂｊｅｒら１９８９ｂ）、２３ ．８．１（抗スポロゾイト周縁タンパク質抗体、データ示さず）、および抗−Ｐ ｂ１１（上述のようにして得た阿ａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒ　ｅｉ肝臓１）を腹 水液から精製した（Ｒｅｉｋら１９８７）。全ての抗体はＩｇＧＬサブクラスで あった。タンパク質レベルをＢｉｏｒａｄタンパク質基卓を用いて、２８０ｒｖ での分光光度計分析により決定した。ネズミガンマインターフェロンについてＥ ＬＩＳ＾を用いると、ｔｓｇ　ＩｇＧ当り９７ｐｃｇまたはＩＵのレベルのこれ ら調製物中において、いかなるガンマインターフェロンも検出されなかった。１ つの実験で、抗体をプロティンＧアフィニティーカラム（Ｂｉｏｒａｄ）上でさ らに精製した。６つの一連の実験で、ＰＢＳ中のＭ製したモノクローナル抗体１ ｍｇを、同数のスポロゾイト（約５Ｘ　１０３）で感染させてから２４時間後の ３または４匹のマウスのグループに静脈注射し、血液の寄生虫血症を、感染から ５．６．７および８日月にモニターした。

実験は二重盲検法で行い、Ｇｉｅｓｍａ染色したスミアは読み取りの前に無作為 化し、暗号化した（　ＩＱ’ｒｂｃ／スライド）。

ＨｅｐＧ２細胞の集密単層を有する１３＋ａｍのカバーグラスを、ｌｌ１ｇ／＊ Ｉの精製抗−Ｐｂｌ　１、または同密度の対照抗体１７．６．１の存在下で約２ ×１０′スポロゾイトを用いて感染させた。次に寄生虫を、固定する前に抗体の 存在下で４８時間培養し、その寄生虫の数、サイズ、成熟度を光学顕微鏡により 測定した。

■ 融合により合計３４のクローンが生成された。そのうち１６は肝門発育期および 血液内発育期の両方と反応し、５つはスポロゾイトと、１２はＨｅｐＧ２と、そ して１つは肝門発育期と特異的に反応した。このモノクローナル抗体は抗−Ｐｂ ｌ　１　（肚ｕ鮫皿ｕ」肛肢ユ肝臓１）と命名され、間接免疫蛍光染色法を行う とＬ」肛勧且の血液内発育期寄生虫、スポロゾイト、またはオオキ不−トと交差 反応を示さなかった。始原マウス肝細胞中で培養した、それと近縁のげっ書類寄 生虫Ｌコ立Ｌ■の肝門発育期は抗−Ｐｂｌ　１と反応しなかった。ＨｅｐＧ２細 胞（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ、１９８８）中で培養したヒト寄生虫である三日熱 マラリア原虫の肝門発育期もまた抗−Ｐｂｌ　１と反応しなかった。

Ｐｂｌ　１は、間接免疫蛍光抗体染色法により、侵入から３時間後の肝門発育期 の細胞内Ｌ］肛註旦トロフォゾイトで初めて明確に検出された。トロフォゾイト および発育したシゾントは、周縁染色パターンを示したことが観察されたが、そ れはしばしば宿主細胞の細胞貫中への突出物と関連していた。これらの突出物は しばしば小さな小胞の鎖の外観を呈しており、その存在は寄生虫発達の成長相（ おそらく栄養に関する）と相関関係にあった。宿主細胞としてはやや不十分なＷ １３８細胞中で増殖する寄生虫はより小さく、成熟のためにより長い時間を要し 、そのような構造に富んでいることが示された。

最初に胞子虫生殖体を、続けてメロゾイトを形成する、寄生虫セグメントを成熟 させる際、寄生虫細胞膜および／または寄生虫保持小胞に関連する抗原が陥入す る。この期間中、抗−Ｐｂｌ　１の周縁染色パターンが維持されるが、このこと はｐｂｌｌが寄生虫保持小胞、およびその境界膜（ＰＶＭ）と関連していること 、およびそれは寄生虫の分割期間中は陥入しないことを示している。予備的な免 疫電子顕微鏡法による研究によって、この局在性が立証された。分割体で見られ るパターンはＰＶＭ上の局在性と一致しており、それはこの発育期までに出現し てくるメロゾイトにより粉砕された。感染された細胞の表面上にも、また分裂体 から離脱した遊離肝メロゾイト上にも、いかなる染色も検出されなかった。

Ｐｂｌ　１は、照射されたスポロゾイト由来の肝臓内トロフォグイト上にも発現 した。

抗−Ｐｂｌ　１モノクローナル抗体が、２４時間前にスポロゾイト接種されたマ ウスに受動的に転移されると、異種のモノクローナル抗体またはリン酸緩衝生理 食塩水（ＰＢＳ）を接種された対照宿主と比較して、その後に起こる寄生虫血症 は約１２時間はど遅れて現われた。

）：、　ｃｏｌｉ　でのＰｂｌ　１ １、Ｐ、ｂｅｒｈｅｌのＤＮＡライブラリー２０匹のマウスを、Ｌ」肛ｎ旦のＡ ’４ＫＡｍ株を用いて、血液経路により感染させた。２０−５０％の寄生虫血症 で、マウスを採血し、計２５＋ｍｌのヘパリン処理した血液を、白血球細胞を取 り除くためｌこワットマンＣＦＩＩカラムのフィルターにかけた。血液を１．５ ００−３．０００ｇで１０分間遠心分離し、ヘマトクリ・ノドが５０％になるま で細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁し、白血球細胞／寄生虫の 最大最終比率１：１０．ＯＯＱが得られるようにカラムに通した。寄生虫を含有 する最終調製物を得るために、濾過されたものを回収して、再び上述のようにス ピンした。

ＤＮＡを、ベレット状にした寄生虫から以下のようにして抽出した：　３０ｍ１ のリーシス緩衝液（５０ｍｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ９、ｌｏｈｍＥＤＴＡ、 　２００ｍｍ　ＮａＣＩ）をペレットに添加した；この混合物１こプロテイナー ゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍ　ｌになるまで添加し、混合物を６５℃で３０ 分間インキュベートした。これに続けて、第２のインキニベーションを３７°Ｃ で１，５時間行った。このインキ二ベーション後、核酸をフェノール／クロロホ ルム抽出の標準的方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら；　１９８２　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｐ 、　４５８）を用いて抽出した。精製した核酸をエタノール沈澱させて、ＲＮＡ を、濃度１００μｇ／ｍｌまでＲＷＡｓｅ酵素を添加することによって、この沈 澱物から消化した。この消化に続し＼で、以下Ｌ」肛ｎ亘ＤＮＡと称する最終Ｄ ＮＡ抽出物を得るために、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱 を繰り返した。

Ｐ、ｂ肛ｎ旦ゲ／ムライブラリ−を以下のようにＬ］肛■旦ＤＮ＾から構築した ：１０μｇのし」虹肢ユＤＮＡを、過剰のＥｅｏＲ１酵素（ＳＯＵ／　ｕ　ｇ　 Ｌ」肛ｎユＤＮＡ）を用いて、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，５，２ｒ ＭＭノＭｇｃ１２およびＢＳＡ　（１０ｇｇ／ｍｌ）　（７）存在下、３７０″ ｃで２２時間、Ｅｃｏｌ？１／ｌ’ｌ化した（Ｐｏｌｆｓｋｙ、Ｂ、ら、１９７ ５、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７２．３３１０−３３ｉ４）。そのＤＮＡを、 次にＹｏｕｎｇ。

Ｒ，Ａ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　（１９１１３、Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ。

８０．１１９４−１１９８）に記載のλｇｔｌｌゲノム叶Ａライブラリーを構築 するために用いた。ライブラリー構築のために用いられる条件および試薬は、Ａ ＋ｍｅｒｓｈａ１ｅＤＮＡ　λｇｔｌｌクローニングキット（コード番号ＲＰＮ 　１２８０）中に製造者が記載の通りであった。

’Ａｔ５ｅｒｓｈａｔｐ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、 　Ｂｕｃｋｓ２、モノクローナル　を　いたライブラリーのスクリーニングおよ び　クローンの ライブラリーを、確立したプロトコルを用いて、モノクローナル抗体２３．４６ ．７でスクリーニングした（　Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、ら、１９８５、ＤＮＡ 　ＣｌｏｎｉｎｇＳａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｄ、Ｍ、　 Ｇｌｏｖｅｒｌ：。

ｒＲｃ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｖｏｌ、１．　ｐ、　４９−１（ｌａ ）。

λｇｔｌｌライブラリーを、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＹＩＱ９０細胞の菌叢上のプラー クとしてスクリーニングした。ライブラリーをプレートアウトし、４２°Ｃで３ 時間、またはｐｉｎ−ｐｒｉｃｋプラークが認められるまでインキュベートした 。顕著な方向性を有するニトロセルロウスフイルターディスクを、１ｈＭのＩＰ ＴＧに浸漬してｍ′Ｈ上に置き、２時間３７°Ｃでインキュベートした。次にニ トロセルロウスフイルターを取り除き、非特異的結合部位を、リン酸緩衝生理食 塩水中０．１％Ｔｖｅｅｎ　２０中の５％ミルクパウダーでブロックした。次に フィルターを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｖｅｅｎ中５０μｇ／ｌの濃度のモノクロー ナル抗体２３．４６．７８の１０ｍ１中でインキュベートした。このインキュベ ーションを室温で１．５時間行った。

次にフィルターを０．１％の丁マｅｅｎ　２０／ＰＢＳ中で２０分間洗浄し；こ の洗浄を３回繰り返した。ホースラディツシュペルオキシダーゼ標識したヤギ抗 マウスＩｇＧ（旧ｏｒａｄ）を第１抗体に結合させるために、洗浄緩衝液中で１ ／１，０００に希釈して用い、室温で１．５時間インキュベーンコンした。次に フィルターを上述のように洗浄して、最終濃度５００μｇ／ｍｌのジアミノベン ジジン基質および１００ｍ１のリン酸緩衝生理食塩水中３０％過酸化水素２０μ ｌ中でインキュベートした。陽性プラークを元のプレートに並べ、陽性コロニー を同定および選択した。純粋なりローンのストックが得られるまで、これらを上 述の方法を用いて、繰り返しスクリーニングした。

３、Ｎ１３　ＮＰＩＯへ　されたＤＮＡのＰＣＨによる　−λｇｔ１１中のＥｃ ｏＰＢｌ、　１と同定した上述の陽性クローンを、ＡｒｅｐｌｉＴａｑ”″ＤＮ Ａポリメラーゼを使用し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｉｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＧｅｎｅＡ ｍｐ増幅試薬キット中に提供されるプロトコルおよび試薬を用いて、標’ｊｌＰ ｃＲ法により増幅させた（　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｎ、　、９０１−００５５、Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　ｏ　プロトコルに従って鉱油の存在下 で反応させた、すなわち＝１０ｘ反応緩衝液；　ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ各１．２５ｄを有するｄＮＴＰの混合物；　ＥｃｏＰｂｌ 　１、ファージストツタ、凍結解凍；順プライマー；逆プライマー、およびＴａ ｑポリメラーゼ。

増幅は、１分間の９４℃での変性、１分間の５０℃でのプライマーとのアニーリ ング、および２分間の７２℃でのＴａｑポリメラーゼを用いての伸張、という通 常の３工程を含んでいた。このサイクルを合計５時間繰り返した。プライマー（ 順および逆）は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ 、　１２１８および１２２２）上述のようにして得たＰＣＲ生成物を一２０℃で 凍結し、鉱油を表面から取り除いた。次いでＤＮＡを１度フェノール／クロロホ ルム抽出し、５０μｍの水相をセファデックスＣＬＵＢカラムに通した。増幅し たＤＮＡの突出した末端部分を、標準法を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｔ２１４１２）から得た２、５Ｕ／ μｍのＬ」旦■ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを用いて充した（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋＳＦｒｉｔｓｅｂＳＭａｎｉａｔｕｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　ｌａｂ　ｍａｎｕａｌ、第２版、５章、ｐ　５．４２）。この反応を１５分 間室温で行い、６５°Ｃで１０分間加熱することにより停止させた。

次いで増幅したＤＮＡを、セファロースＣＬＵＢカラムに通して、３分間１．５ ０Ｏｒｐｍでスピンした。次に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｓｅｒｓｈ ａ＋ｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２０２０Ｙ）を添 加しくＩＯＵ／μｉ）、リガーゼ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ■ＣＬ　ｐＨ６ ，５０１ＩＭのＭｇＣ１２、ＳＯｔａＭのジチオトレイトール、５００ｍｇ／ｍ ｌのＢＳＡ、１ｈＭのＡＴＰン存在下で２時間３７℃でインキュベートし、この 反応を１Ｏ分間、６５″Ｃで加熱処理することにより停止させた（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ、　Ｆｒ１ｊｓｃｈ、　Ｍａｎｒａｔｒｓｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、　Ａ　ｌａｂ　ｍａｎｕａｌ、第２版、５章、ｐ５．６８ン。ＰＣＲ 増幅したＤＮＡを、ベクターＭ１３ｍｐｌＯおよびＰｕｃ１３に連結するために 取り出した。

以下の連結を、Ｍ１３ｍｐｌＯ（ＡＩｌｅｒｓｈａａ＋　１ｆ４５３１）および Ｐｕｃ１３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　２７−４９７５−０１）を用いて行った。

両ベクターをＳｍａ　ｆを用いて切断し、ホスファターゼ処理した。ＰＣＲ挿入 物を１０Ｘリガーゼ緩衝液；ベクター（１０ｎｇ／μｍ）　：　Ｔ４　ＤＮＡリ ガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃａｔ　Ｎｏ、　Ｔ２Ｏ５０Ｙ）と混合し、容量を Ｈ２Ｏで調整し、混合物を４°Ｃで一晩インキュベートした。

次に連結混合物を１／１００に希釈し、その５μｌを、Ｈａｎａｈａｎ。

Ｄ、　（１９１１５、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａ ｐｐｒｏａｃｈ、　Ｄ、Ｍ、　Ｇｌ。

ｖｅｒｌＭ、　ＩＲＣＰｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｖｏｌ　１、り　１０９ −１３５）に記載のプロトコルにより、ＯＨ５αＦ°宿主細胞はＮ１３で、また ＤＢＳ宿主細胞はｐｕｅ１３で形質転換するために用いた。　（ＤＩ（５αおよ びＤＨ５αＦ゛細胞は、それぞれＧｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｃａｔ、　Ｎｏｓ、　５ ３０８２６５ＳＡおよび５３０８２６４ＳＡから得た）。形質転換した細胞を１ ００μ■のＩＰＧＴおよび２％のＸ−ｇａｌの存在下でプレートアウトし、３７ ℃で一晩インキユベートした。組換え体をそれらの色調で同定した。青のプラー クは親であり、Ｎ１３組換え体は無色であり、Ｐｕｅ１３組換え体は白であった 。

５、　［に・　るＭ３ミニブレ、プ Ｍ１３組換え体を取り出して、２　ｘ　ＴＹ培地（１リットル当り１６ｇｍのＢ ａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、　１０ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣＩ）中のＪＭ Ｉ０１細胞（Ｐｈａｒａｍａｅｉａ、　Ｃａｔ、　Ｈａ、　２７１５０９０１） の１／１００希釈物１，５１中へ接種し、３７°Ｃで６時間増殖させた。

プラーク調製物（エッベンドルフ遠心機で２Ｘスピンされた細胞）からの１ｍｌ の透明な上清を、２５０μｌのＰＥＧ　ＮａＣ１（２０％ＰＥＧ　５，０００： 　２．５ｄ　ＮａＣＤに添加し、次に混合し、室温で１５分間インキュベートし た。

このＲ型物を５分間、ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中でスピンし、デカントし、次に白い ウィルスのベレット（Ｍ１３ファージを含有）を１００μｍのＴＥ緩衝液ｐＨ８ （１ｈＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ；　１　＋ａＭ　ＥＤＴＡ）中で再懸濁し、フェノ ール／りｏｏホルムを上述のようにＤＮＡを抽出するために用いた。ＤＮＡを、 最終濃度０．３Ｍ％ｐ［Ｉ５．３５で、酢酸ナトリウム沈澱により水相から取り 除き、続いて無水エタノールを２１７２容量添加した。ＤＮＡは後に遠心分離に かけて回収し、７０％エタノール中で洗浄し、真空下で乾燥させ、次に２５μｌ の丁Ｅ緩衝液中で再懸濁した。アガロースゲル上にＨＡのミニブレノブをかける ことにより、非組換えＭ１３一本鎖ＤＮＡに対して組換え体を確認した。組換え 体の同定は、２つの調製物からのＤＮＡサイズの違いに基づいて行った。Ｍ１３ 　ＤＮＡミニブレツブ中に得られた陽性りａ−ンをシークエナーゼ牛ノド（ＵＳ Ａ　Ｂｉｏｃｂｅｔａ＋ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて配列決定し た。鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆｌ、Ｍｉｋｌｅｎ、　Ｓ、およびＣｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，，１９７７、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６ ７）を用いて行った。この技術（Ｔａｂｏｒ、　Ｓ、およびＲｊｃｈａｒｄｓｏ ｎ、　Ｃ，Ｃ，，１９８７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ ＪＳＡ、　８４、Ｎｏ、ｆ４．４７６７−４７７１）には、Ｍ１３ｍｐｌ（ｌか らの一本鎖ＤＮＡ鋳型および製造者説明書に記載の組換えクローンを使用する、 バクテリオファージＴ７の改変ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）によるＤ ＮＡ鎖の合成が必要とされた（　−３ｅｑｕｅｎａｓｅ：　５ｔｅｐ−ｂｙ−ｓ ｔｅｐ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔ ｈ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ＋第５版、１９８９、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　。

１ＩＩＬ″　マラリア　および＝ＦＥｍマラｆア　δ　の巣崖 既にＭ１３中にクローン化した挿入物Ｐｂｌ　１は、上述の挿入物配列に基づく 合成オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＢ増幅（上述）し得る。次にＰＣＩ？増 幅された挿入物は、３２ｐ　（ＦａｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、 　１９８４、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３７．２６ ６−２６７）を用いてヘキサラベルされ得、次いで熱帯熱マラリア原虫λｇｔｌ ｌライブラリーおよび上述のし」虹劫旦ライブラリーと同様に構築された、他の 入手可能なライブラリー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、　（上述１＃照）２ 章、ｐ　２．１０８−２．１１１および９２゜１１４−２．１１７）をスクリー ニングするために用いられ得る。

あるいは、標識された挿入物は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫 の制限消化ＤＮＡのサザンプロットをスクリーニングするために用いられ得、標 準プロトコル（５ａｒａｂｒ。

ｏｋら、１９８９　（上記参照）９車、９９．３１−９．４０および９９．５２ −９．５５）を用いて、これらの菌株とＬユ肛肢虹との間の適切な相同体を同定 する。上述した手順による熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫の相同 体の同定に引き続いて、最終的に熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫 の所望の相同Ｐｂｌ　１抗原を得るために、Ｌ１肛肢旦に関する上述の手順を活 用して、これらの相同体が単離され、サブクローン化され得る。

寄」ＬのＪＬ阿 Ｅ、　ｃｏｌｊクローンＥｃｏ、Ｐｂｌ　ｌブダペスト条約の規定に基づき、１ ９９０年８月３０Ｅｉ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎ ｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　□ＪＣ［ＭＢ） 、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　５ｃｏｔｌａｎｄに、受託番号第％ＣＩＭＢ　４０３１ ４号で寄託した。

ハイブリドーマ細胞系（２３，４６，７８）ブダペスト条約の規定に基づき、１ ９９０年９月１８日、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉ ｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ＥＣＡＣＣ，Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｔｎに 、受託番号第９００９１８０１号で寄託した。

最後に、本発明の範囲について考慮すると、抗原または抗体の種々のフラグメン トは、そのフラグメントのサイズおよび位置に依存して十分な抗原／特異的結合 （抗体）能力を保持すること、その結果実際的な事象として、フラグメントは問 題の抗原／抗体と実質的に同等であり得ることは公知であると理解される。よっ て、用語、抗原／抗体はそのような機能的に同等であるフラグメントをも含意す る。同様に、ＤＮＡ配列への言及は、完全な配列の機能性を実際的に保育するフ ラグメント、対立遺伝子およびその変性した変異体をも含むと意図される。

仕立 針及」１」値−」 配列の型：　ヌクレオチド 配列の長さ：３１４塩基対 鎖の数二　一本鎖 トポロジー：　直鎖状 配列の種類：　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ起源生物名；　Ｌ」肛紅亘 直接の起＠：　Ｅ、ｃｏｌｉクローンＥｃｏ、Ｐｂｌ　１　（ＮＣＩＭＢＬ　４ ０７１４）配列の特徴：　（ｂｐ−１から−１７、およびｂｐ　３１５から３２ ３：）λｇｔ　１１ベクターの連続するヌクレオチド配列ｂｐ　１から３１４： 推定ペプチドをコードする配列江虹到Ｎｏ、　１ ５’　ＣＣＣ１ｔＣａ　！４ＥａＬｃｇ１４ｃｇｆ４　ＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣ； 　ＴＧ’ｒへＧＡＴＣＧＡ　ＧＡＴＴＣＴＡ（’；ＣＴ　３O ＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴ　ＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴ　ＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧ　６０Ａ ＴＧ’ｒＴＧＡＴＧＡ　’ｒＴｃ’ｔ”ｒＧＴＴＧＴ　ＣＧＴＧＣＴＡＡＴＴ　 ９（’ＩＣＡＣＣＡＧＡＡ−＼ＡＡＴＡＴＡＴＡ（’；ＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴ Ａ＋２０ＡＧＣＡＣ丁ｌ＼ＣＡＵ　ＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴ　ＣＴＡにＡＡＣＡＡ Ｔ　＋５０Ａ’ｒＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＴＣ，ＶｒＡＣＡ Ｔ　＋８０八（、ｘＧＴＴＡＴＡＵ　ＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡ　ＧＡＡＧＣＡＴＡ ＴＡ　２＋　＋ＡＣＡＣＡＣＡＴＴＡ　ＴＡＴＧＧＣＡＴＣＡ　ＧＡＴＡＣＴＣ ＡＴＧ　２／４０ＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧ　ＣＡＡＡＣＴＡＴＴＴ　ＡＣＡＧＡＴ ＧＡＡＣ２７０ＡＴＡＡＧＧＡＣＧＡ　ＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴ　ＡＡＴＡＴＡＧ ＴＴＴ　３００ＡＴＣＡＣＧＡＴＧＡ　ＡＴＴＣｃａｇｃＬｇａｇｃ　３’　３ １４補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法策ｔｇ４条の８）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ肝内発育期抗原Ｐｂｌ　１およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ 属の他の寄生虫に由来するその相同体を含む、精製単離物。
2. ２．熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫の種の寄生虫に由来する相同 Ｐｂｌ　１。
3. ３．請求項１または２に記載の肝内発育期抗原であって、それをコードするゲノ ムまたはｃＤＮＡフラグメントの発現ビヒクル中での発現によって得られる、肝 内発育期抗原。
4. ４．前記ゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントが配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１また は実質的に（少なくとも９０％）それと相同である配列を含む、請求項３に記載 の肝内発育期抗原。
5. ５．Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ肝内発育期抗原Ｐｂｌ　１の精製単離物。
6. ６．クローン化されたＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ肝内発育期抗原Ｐｂｌ　１。
7. ７．請求項１から６のいずれかに記載のマラリア原虫肝内発育期抗原に特異的な モノクローナル抗体。
8. ８．モノクローナル抗体２３，４６，７８。
9. ９．請求項１から６のいずれかに記載の肝内発育期抗原、または請求項７または ８に記載のモノクローナル抗体を含む、抗マラリアワクチン。
10. １０．請求項１から６のいずれかに記載のマラリア原虫肝内発育期抗原をコード する、ゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント。
11. １１．Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ肝内発育期抗原Ｐｂｌ　１をコードするゲノムまたは ｃＤＮＡフラグメント。
12. １２．前記フラグメントが配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１または実質的に（少なく とも９０％）それと相同である配列を含む、請求項１１に記載のゲノムまたはｃ ＤＮＡフラグメント。
13. １３．請求項１０、１１または１２に記載のゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント を含む、トランスフェクションベクター。
14. １４．前記ゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントがλｇｔｌ　１ファージ、Ｍ１３ およびＰｕｃに挿入されて含む、請求項１３に記載のベクター。
15. １５．請求項１３または１４に記載の発現ベクターを含み、培養されるとＰｂｌ または相同Ｐｂｌ　１を発現し得る、トランスフェクトされた細胞。
16. １６．細菌細胞である、請求項１５に記載のトランスフェクトされた細胞。
17. １７．Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐｂｌ　１（ＮＣＩＭＢ　４０３１４）。
18. １８．請求項７または８に記載のモノクローナル抗体を生成し得るハイブリドー マ細胞系。
19. １９．ハイブリドーマ細胞系２３，４６，７８（ＥＣＡＣＣ受託番号第９００９ １８０１号）。