CA2245727A1 - Proteine recombinante contenant un fragment c-terminal de msp-1 tde plasmodium - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une protéine recombinante, fabriquée dans un système à baculovirus, dont la séquence polypeptidique constitutive essentielle est celle d'un fragment C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1) de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium, en particulier Plasmodium falciparum, infectieux pour l'Homme, ce fragment p42 étant particulièrement délété de sa région II et, le cas échéant, aussi de sa région III. Cette protéine recombinante est applicable à la production de vaccins contre la malaria.

Description

CA 0224~727 l998-08-0~
WO 97/30159 PCT/FRg7/00291 ,~ PROTEINE RECOMB~ANTE CONTENANT UN FRAGMENT C-TERMINAL DE MSP-I TDE PLASMODIUM

L'invention concerne de nouveaux principes actifs de vaccins o dérivés de la protéine majeure de surface de formes mérozoïtes d'un plasmodium infectieux pour des mammiferes, notamment l'homme, plus généralement connue sous la désignation MSP-1.
Cette protéine a déjà fait l'objet d'études nombreuses. Elle est synthétisée dans le stade schizonte des parasites du type P~asmod~um, notamment Plasmodium falciparum, et est exprimée sous forme de l'un des constituants majeurs de la surface des mérozoïtes aussi bien pendant le stade hépatique que pendant le stade érythrocytique du paludisme (1, 2, 3, 4). En raison du caractère prédominant et de la conservation dans toutes les espèces de Plasmodium connues de cette protéine, il a été suggéré
qu'elle pourrait représenter un candidat pour la constitution de vaccins anti-paludiques (~, 6).
Il en a encore été de meme pour des fragments de cette protéine, particulièrement des produits naturels de clivage dont l'on observe la formation, par exemple au cours de l'invasion par le parasite des érythrocytes de l'hote infecté. Parmi, ces produits de clivage, on relevera le fragment C-terminal ayant un poids moléculaire de 42 kDa (7,8) qui est à
son tour clivé une nouvelle fois en un fragment N-terminal ayant un poids moléculaire apparent conventionnel de 33 kDa et en un fragment C-terminal ayant un poids moléculaire apparent conventionnel de 19 kDa (9) qui reste normalement fixé à la membrane du parasite au terme des CA 0224~727 1998-08-0~
WO 97/30~59 PCT/E~97/00291 modifications dont il est lui-même t~objet, par l'intermédiaire de groupes du - type glycosylphosphatidylinositol (GPI) (10, 11~.
On le retrouve encore au stade anneau précoce du cycle de développement intraérythrocytique (15, 16), d'où les observations qui ont été faites que ce fragment de 19 kDa pourrait jouer un rôle non encore connu, mais sans doute essentiel dans les processus réinvasifs. De là
découlent les hypothèses déjà formulées dans le passé que cette protéine pourrait constituer une cible particutièrement efficace pour d'éventuels vaccins .
ll sera entendu que les références souvent faites dans ce qui suit à
des protéines p42 et p19 issues d'un certain type de Plasmodium s'entendent comme se rapportant aux produits de clivage C-terminaux correspondants de ia protéine MSP-1 de ce Plasmodium, ou, par extension, à des produits contenant sensiblement les mêmes séquences en acides aminés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique selon les techniques classiques, par exemple par synthétiseur de type ~ Applied System >~ ou par synthèse sur phase solide de type ~ Merrifield ~. Pour la commodité du langage, les références à des ~ p42 recombinantes ,~ et des ~ p19 recombinantes ~ se rapportent à des ~ p42 ~

2() et ~ p19 ~ obtenues par des techniques comportant au moins une étape de génie génétique.
Devant la difficulté d'obtenir des quantités importantes de parasites pour P.falciparum et l'impossibilité de cultiver P.vivax in vitro, il est devenuévident que le seul moyen de produire un vaccin antipaludique nécessite un recours aux techniques permettant l'utilisation des peptides ou protéines recombinantes. Mais, le MSP-1 est tres difficile à produire en entier à cause de sa ~rande taille d'environ 200 kDa, un ~ait qui a conduit les chercheurs à s'intéresser à la partie C-terminale- dont la fonction, encore inconnue, est vraisemblablement la plus importante.

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WO 97/301~9 PCT/FR97/00291 Au titre, des protéines recombinantes concernant la partie C-terminale de MSP-1 de ~.falciparum, qui ont été produites et testées chez Ie singe (12, 40, 41), on mentionnera:
. une p19 fusionnée avec une glutathione-S-transférase produite dans E coli (~4~;)), . une p42 fusionnée avec une glutathione-S-transférase produite dans E.coli;
une p19 fusionnée avec un polypeptide issu d'une anatoxine tétanique et porteur d'épitopes de cellules T auxiliaires produites dans o S cerevisiae (12), . une p42 produite dans un système baculovirus (41).

Une composition contenant la protéine de fusion p1 g avec une glutathione-S-transférase produite dans E.coli en association avec alun ou s liposomes n'a pas exercé d'effet protecteur sur aucun des six singes Aotus nancymai vaccinés (40).
Une composition contenant la protéine de fusion p42 avec une glutathione-S-transférase produite dans E.coli en association avec un adjuvant complet de Freund n'ont pas exercé d'effet protecteur dans les deux types de singes Aotus (A.nancymai et A.vociferans) auxquels elles avaient été administrées. ~a protéine p19 produite dans S.cerevisiae a exercé un effet protecteur dans deux singes Aotus de type A.nancymai (12). Par contre elle n'a pas exercé d'effet protecteur dans deux singes Aotus de type A. vociferans.
2~ Certains chercheurs (Chang et al . ) ont également rapporté des essais d'immunisation réalisés chez le lapin avec une protéine recombinante p42 produite dans un système baculovirus et contenant une séquence d'acides aminés en commun avec P.falciparum (18). Ainsi ces derniers auteurs indiquent-ils que cette p42 recombinante se comporte 3t) chez le lapin sensiblement de la même façon que la protéine MSP-1 recombinante entière (gp195). Cette protéine p42 en association avec un CA 0224~727 1998-08-0~

adJuvant complet de Freund a fait l'objet d'un essai de vaccination dans un - - primate non-humain susceptible à l'infection par P.falciparum, Aotus, lemurinus grisemembra (40). Les résultats montrent que 2 sur 3 animaux ont été complètement protégés et le troisième, bien que montrant une s parasitémie semblable aux controles, avait une période latente plus longue. Il est néanmoins hasardeux de conclure au caractère protecteur chez l'homme des anticorps ainsi induits à l'encontre des parasites eux-memes. Rappelons en effet qu'il n'existe pas actuellement de modèles expérimentaux très satisfaisants chez le primate pour P. vivax et P.falciparum. Le modèle Saimiri, qui a été développé pour P.falciparum et P. vivax, et le modèle Aotus pour P.falcipanrm, sont des systèmes artificiels, nécessitant l'adaptation de souches de parasite et souvent la splénectomie des animaux pour obtenir des parasitémies significatives. En conséquence, les résultats de vaccination provenant de ces modèles ne s peuvent avoir qu'une valeur prédictive limitée pour l'Homme.
Outre que l'on peut donc s'interroger sur ce que serait un taux réel de vaccination susceptible d~etre éventuellement obtenu avec de telles protéines recombinantes, la présence dans les p42 issues des Plasmodiums de la meme espèce, et plus particulièrement dans les p33 2() correspondantes, de régions hypervariables pourraient rendre aleatoires en de nombreux cas l'efficacité immunoprotectrice des anticorps induits chez des personnes vaccinées par une p42 issue d'une souche de Plasmodium à l'encontre d'une infection par d'autres souches de la même espèce (13).
2~ Le polymorphisme important des régions centrales de la p42 pourrait meme jouer un role significatif dans l'echappement immunitaire, souvent observe pour ce type de parasites.
Mais il s'avère que les p42 issues de divers PJasmodiums infectieux pour l'homme comportent des regions hypervariables se concentrant :~(i principalement dans leurs régions lll, et plus encore dans leurs régions ll respectives: voir la publication de Longacre, S. (1 3) dans laquelle les CA 0224~727 1998-08-0~

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séquences des p42 de P.cynomolgy, P.vivax (Belem) et P.vivax (Sal-i) ont - ~ été mises en alignement. La séquence ~ consensus ~ de la ~igure 4 jointe a~outée aux séquences des p42 de ces trois parasites en témoigne.
On se rapportera à l'article de Longacre, S. (13) dans lequel sont exposées les conditions dans lesquelles lesdites régions ont été
déterminées. Il est remarqué que la figure 4 Jointe n'est autre qu'une reproduction de la figure 1 de l'article de Longacre. Le lecteur est donc invité à se reporter à la légende de cette figure. Celle-ci fait également apparaître les tailles relatives des quatre régions de la p42 (la région IV
correspondant à la séquence de la p19) exprimées en pourcentages vis-à-vis de la taille de la séquence codante de la p42 en son entier.
Comme cela découle également de la figure 4 de la présente demande, les pourcentages d'homologie sont élevés entre les séquences des régions I des P.cynomolgi et P.vivax: 84% dans la région 1, 86% dans la région IV. En revanche, ce pourcentage d'homologie décroît fortement dans la région lll (69%) et plus encore dans la région 11(47%).
Un premier objectif de l'invention est par conséquent de fournir des principes actifs de vaccins issus de la p42 davantage capables de protéger i'hôte cont~e l'échappement immunitaire dont il était question ci-dessus.
2() 11 va de soi que la fragmentation de la p42 qui vient d'être envisagéepeut également être étendue à P.falciparum, le parasite principalement responsable de formes aiguës du paludisme chez l'homme, et cela d'autant plus que les localisations des zones séparant les régions 1, Il, lll etIV des séquences constitutives de P.cynomolgi et des deux variétés de 2:~ P.vivax ont été déterminées par analogie avec des sites correspondants, identifiés au préalable dans P.falciparum, comme cela a été décrit par (34) (3~) L'invention concerne plus particulièrement des compositions vaccinantes contre un parasite du type Plasmodium infectieux pour

- 3() I'homme, contenant a titre de principe actif une protéine recombinante WO 97/30159 PCT/FRg7/00291 glycosylée ou non, dont la séquence polypeptidique constitutive - - -- essentielle est celle ~ soit de la p42 dont ont été déletées la région ll et, le cas échéant, tout ou partie de la région lll;
~ soit d'une partie de ce fragment dès lors qu'elle est apte aussi à induire une réponse immune capable d'inhiber une parasitémie in vivo par le parasite correspondant;
. soit d'un peptide immunologiquement équivalent à ce fragment p42 ou à
la susdite partie de ce fragment, et cette proteine recombinante comportant en outre des épitopes conformationnels instables en milieu réducteur et constituant, de préférence, la majorité des épitopes reconnus par des antisérums humains formés contre le Plasmodium correspondant.
L'invention concerne donc plus particulièrement une protéine recombinante, glycosilée ou non issue de la p42 et contenant à la fois les parties essentielles de la région I et la région IV définie ci-dessus pour la constitution de compositions immunogènes, notamment de vaccins.
La susdite protéine recombinante, glycosylée ou non, contient le cas échéant aussi la partie conservée de la région lll qui se situe du côté C-2() terminal de la p33, proche de la p19, en particulier celle qui s'étend entre les acides aminés 255 à 273, ou plus particulièrement encore entre les acides aminés 255 à 270 (voir numérotation de la séquence consensus de la figure 4).
En d'autres termes tout ou partie peu conservée de la région lll peut être délatée de la partie N-terminale de ia région lll.
Pour la commodité du langage, il sera souvent fait référence dans ce qui suite à une ~ p42 partiellement délétee ~ pour désigner la p42 modifiée, selon ce qui a été défini ci-dessus.
La présence dans ce principe actif des susdits épitopes ~ 3(~ conformationnels pourrait Jouer un rôle important dans l'efficacité
protectrice qu'il est susceptible de conférer à l'hôte vacciné. On les CA 0224~727 l998-08-0~

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retrouve tout particulièrement dans les principes actifs présentant par - - ailleurs les autres caractéristiques définies ci-dessus, lorsqu'ils ont été
produits dans un système vecteur baculovirus. S'il en est besoin, il est mentionné ci-après que par l'expression ~ système de vecteur baculovirus ~ on entend l'ensemble que constitue le vecteur type baculovirus lui-même et les lignées cellulaires, notamment cellules d'insectes transfectables par un baculovirus modifié par une séquence à
transférer dans ces lignées cellutaires avec pour résultat l'expression de cette sequence trans~erée. Des exemples préférés de ces deux partenaires o du système baculovirus, ont éte décrits dans l'article de Longacre et al.
(19). C'est le même système qui a été utilisé dans les exemples qui suivent. Il va naturellement de soi que des variants, tant du baculovirus que des cellules infectables par ce baculovirus peuvent être utilisés en lieu et place de celui qui a été choisi.
Le caractère instable en milieu réducteur de ces épitopes conformationnels peut être mis en évidence, notamment par le test décrit plus loin dans les exemples, notamment en présence de ,~-mercaptoéthanol .
De ce point de vue, des protéines recombinantes dérivées de la p42 recombinante produite par S. Longacre et al. (14) peuvent être mises en oeuvre dans de tels compositions. Il est rappelé que S. Longacre et al.
réussirent à produire une p19 recombinante issue de la MSP-1 de P.vivax dans un système vecteur à baculovirus contenant une séquence nucléotidique codant pour la p19 de Plasmodium vivax, en particulier par 2:~ transfection de cultures de cellules d'insectes [lignée de Spodoptera frugiperda (Sf9)] avec des baculovirus vecteurs contenant, sous le contrôle du promoteur de la polyhédrine, une séquence codant pour les fragments ,. peptidiques définis ci-dessous, dont les séquences étaient placées dans l'ordre suivant dans le vecteur baculovirus utilisé:

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WO 97/30159 PCT/FR97/00~91 fragment 5'-terminal de 35 paires de bases de la séquence signal de la polyhédrine, dont avait été muté (en ATT) le codon méthionine d'initiation de l'expression de cette protéine;
~ un fragment 5'-terminal nucléotidique codant pour un peptide de 32 acides aminés correspondant à la partie N-terminale de MSP-1, y compris le peptide signal de MSP-1;
soit une séquence nucléotidique codant pour la p19, soit une séquence codant pour la p42 de la protéine MSP-1 de Plasmodium vivax, ces séquences étant aussi, selon le cas, soit pourvues (formes ~ ancrées ~), soit depourvues (formes solubles) des régions d'extrémité 3' de ces séquences de nucléotides dont les produits d'expression C-terminaux extrêmes sont réputés jouer un rôle essentiel dans l'ancrage de la protéine finale p19 sur la membrane du parasite;
~ 2 codons stop TAA.
Poùr la p42, les séquences dérivées de la région C-terminale de MSP-1 s'étendaient par conséquent de l'acide aminé Asp 1325 à l'acide aminé Leu 1726 (forme ancrée) ou à l'acide aminé Ser 1705 (forme soluble) et pour la p19, ies séquences s~etendaient de l'acide aminé lle 1602 à l'acide aminé Leu 1726 (forme ancree) ou à l'acide aminé Ser 1705 2() (forme soluble), étant entendu que les séquences en acides aminés complètes de p42 et p19 dont les acides aminés initiaux et terminaux ont été indiqués dans ce qui précède découlent du gene de l'isolat Belem de P.vivax qui a été séquencé (20).
Des résultats semblables ont été obtenus en mettant en oeuvre 2:) dans les mêmes systèmes de vecteurs des sequences nucléotidiques codant pour 1~3 p19 et la p42 de Plasmodium cynomolgj. P.cynomo/gi présente un double intérêt: c'est une espèce parasitaire très proche de P.vivax, qui est très infectieuse pour le macaque très proche de P.vivax. Il peut aussi infecter l'Homme. On a egalement accès à des hôtes naturels 3() de P.cynomolgi, les singes rhésus et les singes toques, pour tester CA 0224~727 1998-08-0~

') I'efficacité de protection du MSP-1 de P.cynomolgi dans des systèmes - - naturels. Le singe rhésus est considéré comme une des espèces les plus représentatives des réactions immunitaires chez l'Homme.
En particulier, on a obtenu d'excellents résultats dans des essais de 5 vaccination réalisés chez le singe toque avec deux polypeptides recombinants: la p42 et la p1 9 solubles, dérivées de P.cynomolgi, respectivement produites dans un système baculovirus et purifiées sur colonne d'affinité avec des anticorps monoclonaux reconnaissant ies régions correspondantes de la protéine MSP-1 native. Les observations suivantes ont été faites: les six singes immunisés avec le seul p19 (trois singes) et le 19 et p42 ensemble (3 singes) ont tous témoigné d'une immunité presque stérile après infection d'épreuve. Les résultats obtenus chez les trois singes immunisés avec le p42 ont été moins significatifs.
Deux d'entre eux se sont comportés comme les précédents, mais si le troisième a manifesté une parasitémie moins importante que des témoins immunisés avec un tampon PBS en présence de l'adjuvant de Freund (3 singes) ou non immunisés (3 singes), elle n'en n'était pas moins patente.
Les résultats des essais particulièrement efficaces réalisés chez le macaque avec des polypeptides recombinants produits dans un système 2() baculovirus mettant en oeuvre une p42, en association avec une p19 recombinante de P.cynomolgi, établissent que des polypeptides recombinants contenant respectivement des p42 recombinantes issus d'autres Plasmodiums doivent se comporter de la même manière. Ces essais sont ~ plus parlants ~ pour le paludisme chez l'Homme que les résultats d'essais réalisés avec P.vivax ou P.~alciparum dans leurs ~ hôtes artificiels ~.
Les protéines recombinantes de baculovirus, dérivées d'une partie C-terminale de MSP-1 (p42~, et plus particulièrement les p42 partiellement delétées, ont un effet protecteur antipaludique très significatif dans un -- 30 système naturel, qui constitue le modèle d'évaluation de l'effet protecteur de MSP-1 le plus représentatif pour l'homme.

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L'effet protecteur obtenu pourrait être d'autant meilleur que la p42 - partiellement délétée est dépourvue de la région hypervariable de la partie N-terminale du p42, dont l'effet peut être délétère dans des situations naturelles dans lesquelles le sujet vacciné est confronté à un polymorphisme important Mais la délétion de la région ll et de tout ou partie de la région lll conduit normalement à des résultats meilleurs. Il est clair que l'homme du métier n'éprouverait aucune difficulté à réaliser des protéines de fusion entre des régions I et IV des p42 correspondantes, voire même entre une o région I et une région IV provenant respectivement de deux p42 issues de deux variétés différentes de P/asmodium. Il va naturellement de soi que ces proteines de fusion peuvent aussi contenir des éléments de liaison correspondant encore à des parties de la région ll, de préférence de la région lll, choisies de préférence parmi les mieux conservées. A titre s d'exemple, on mentionnera la séquence polypeptidique C-terminale de la p33, lorsqu'elle est présente, comprend moins de 50 résidus d'acides aminés voire même moins de 35, ou même moins de 10 résidus d'acides aminés.
Cela étant, la séquence polypeptidique de la protéine p42 2() partiellement delétée peut ne pas comporter la totalité de la séquence codant pour la p1g (ou de la région IV~, naturellement sous réserve que cette dernière conserve la capacité d'induire des anticorps protecteurs contre le parasite. En particulier la susdite ~ partie de fragment a un poids moléculaire de 10 à 25 kDa, notamment de 10 à 15 kDa. De préférence, 2:~ cette partie de fragment polypeptidique contient au moins l'une des deux régions EGF (abréviation de i'expression anglaise ~ Epidermal Growth Factor ~).
Naturellement les mêmes observations valent pour la région I de la proteine recombinante selon l'invention.
3() 11 est clair que l'homme du métier est a même de faire la différence entre les fragments actifs et ceux qui cesseraient de l'être, notamment de CA 0224~727 1998-08-0~
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façon expérimentale en produisant des vecteurs modifiés contenant, par - - exemple, des insérats comportant des parties de la p42 et notamment de la p42 délétée, de longueurs différentes, respectivement produits à partir de la séquence codante pour la p42, le cas échéant, partiellement delétée, par réaction avec des enzymes de restriction appropriés, ou encore des enzymes exonucléolytiques qui auraient été maintenus au contact du fragment codant pour la p42 initiale, le cas échéant, partiellement délétée pendant des temps variables; la capacité des produits d'expression de ces insérats dans des cellules eucaryotes correspondantes, notamment des cellules d'insectes, transformees par les vecteurs modifiés correspondants, à exercer un effet protecteur, pouvant alors etre testée, notamment dans les conditions expérimentales qui seront décrites plus loin, à propos des exemples. En particulier, les produits d~expression de ces insérats doivent etre aptes à inhiber une parasitémie induite tn vivo par le parasite correspondant entier.
De meme, I'invention inclut toutes compositions immunogènes, voire vaccinantes dans lesquelles la séquence polypeptidique constitutive essentielle du principe actif serait constitué d'un peptide capable d'induire une réponse immunGlogique ~e type cellulaire et/ou humorale équivalente 2() à celle produite par la protéine partiellement délétée telle que définie ci-dessus, dès lors que l'addition, la délétion ou la substitution dans sa séquence de certains acides aminés par d'autres n'entralneraient pas une modification importante de la capacité du peptide ainsi modifié -ci-après appelé ~ peptide immunologiquement équivalent ~- à aussi inhiber la 2~ susdite parasitémie.
La p42 partiellement délétée peut naturellement aussi être associée que ce soit du côté N-terminal ou du côté C-Terminal ou par l'intermédiaire d'une liaison peptidique, à un autre fragment de protéine plasmodiale ayant un potentiel vaccinant comme par exemple une protéine (~ Duffy - 3() Binding Protein ~ de P. vivax (29) ou EBA-175 de P. falciparum (30~ et ~31 ) dont une région est spécifiquement riche en cysteine), sous réserve que -CA 0224~727 1998-08-0~

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ne soit pas altérée, au contraire amplifiée, sa capacité d'inhiber une - - - parasitémie normalement introduite in vivo par ie parasite correspondant.
Le fragment codant pour la p42 partiellement délétée ou une partie de celle-ci, peut contenir également, en amont de son extrémité N-terminale, une séquence peptidique encore différente, par exemple un fragment C-terminal du peptide signal de la protéine MSP-1. Cette séquence comprend de préférence moins de 50 acides aminés, par exemple de 10 à 35 acides aminés.
Ces observations s'étendent de la même ~açon à des p42 o partiellement délétées issues d'autres Plasmodium, en particulier P.falciparum, I'espèce dominante des parasites, responsable d'une des formes les plus graves de paludisme.
Mais les techniques rappelées ci-dessus pour la production dans un système de baculovirus d'une p42 recombinante issue de P. vivax ou s P.cynomolgi sont difficilement transposables telles quelles à la productiond'une p42 recombinante de P.falciparum avec un rendement satisfaisant, ne fût-ce que pour obtenir des quantités appréciables autorisant la réalisation d'essais d'immunoprotection.
L'inventior, fournit également un procédé remédiant en grande 2() partie à cette difficulté. Il devient aussi possible d'obtenir des rendements beaucoup plus importants en p42 de P falciparum --et d'autres plasmodiums lorsque l'on rencontre des difficultés semblables--en mettant en oeuvre une séquence nucléotidique synthétique de substitution à la séquence nucléotidique naturelle codant pour la p42 de Plasmodium 2:) falciparum dans un vecteur d'expression d'un système baculovirus, cette sequence nucléotidique synthétique codant pour la même p42, mais étant caractérisée par une proportion de nucléotides G e~ C plus élevée que dans la séquence nucléotidique naturelle.
Il et clair pour l'homme du métier que ce résultat peut être obtenu en - 3() tirant profit à la fois de sa capacité de synthétiser des ADNs par synthèse nucléotidique et de choisir parmi les possibilités que lui offre le code CA 0224~727 1998-08-0~
WO 97/301!i9 PCT/FR97/00291 génétique, de substituer, chaque fois que le code génétique l'autorise, des - - codons synthétiques ayant des teneurs en C et/ou en G pius élevées que les codons naturels qui, au sein des sequences natives codant pour les p42 natives correspondantes, codent pour le même acide aminé.
ll va de soi que les mêmes observations étendent leurs effets à des p42 dont des séquences ont été partiellement délétées comme défini plus haut.
En d'autres termes, I'invention découle de la découverte que l'expression dans un système baculovirus d'une séquence nucléotidique o codant pour une p42, partiellement delétée ou non, était apparemment liée à une compatibilité améliorée des codons successifs de la séquence nucléotidique à exprimer avec la ~ machinerie cellulaire ~ des cellules hôtes transformables par des bacuiovirus, à l'instar de ce qui est observé
pour les séquences nucleotidiques naturelles normalement contenues s dans ces baculovirus et exprimées dans les cellules hôtes infectées; d'où
la mauvaise expression, sinon parfois l'absence totale d'expression d'une séquence nucléotidique native de P. faJciparum; d'où également une explication possible à l'expression plus efficace observée de la p42 de P.vivax dans un système baculovirus par Longacre et al. (19) et, comme les inventeurs l'ont aussi constaté, de la séquence de P.cynomoJgi à partir des séquences nucléotidiques p42 natives correspondantes, en raison de leurs teneurs relatives en nucléotides G et C beaucoup plus élevées que celles des sequences nucléotidiques natives codant pour les p42 de P.falclparum.
2~ L'invention concerne donc aussi, plus généralement, un vecteur modifié du type baculovirus recombinant contenant sous le contrôle d'un promoteur contenu dans ce vecteur et susceptible d'être reconnu par des , cellules transfectables par ce vecteur, une première séquence nucléotidique codant pour un peptide signal exploitable par un système - ' 3() baculovirus, caractérisé par une deuxième séquence nucléotidique en aval de la première, également sous le contrôle de ce promoteur et codant pour une séquence peptidique comportant néanmoins dans sa propre séquence - - constitutive, celle:
~ soit d'un fragment peptidique codant de la p42 ou une p42 dont ont eté
délétées la région ll et, le cas échéant, tout ou partie de la région lll;
~ soit d'une partie de ce fragment peptidique dès lors que le produit d'expression de la deuxième séquence dans un système baculovirus est apte aussi à inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant;
. soit d'un peptide immunologiquement equivalent dérivé du susdit fragment peptidique C-terminal (p19) ou de la susdite partie de fragment peptidique par addition, délétion ou substitution d'acides aminés n'entraînant pas une modification importante de la capacité de ce peptide immunologiquement équivalent a induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale semblable à celle s produite par ce fragment peptidique p19 ou à la susdite partie de ce fragment, et ladite séquence nucleotidique ayant le cas echeant une teneur en nucléotides G et C comprise entre 40 et 60%, de préférence d'au moins 50% de la totalité des nucléotides dont elle est constituee. Cette séquence 2(t peut être obtenue par construction d'un gène synthétique dans lequel les codons natùrels ont été changes par des codons riches en G/C sans que leur traduction soit modifiée (maintien de la sequence peptidique).
En l'occurrence ladite séquence nucléotidique, fournie par un ADN
synthétique, peùt présenter au moins 10% de codons modifiés par rapport à la séquence du gène ou du cDNA naturel tout en conservant les caractéristiques de la séquence nature~e traduite, c'est-à-dire le maintien de la sequence en amino-acides.
Cela étant, on n'exclut pas que cette teneur en nucléotides G et C
pourrait être davantage accrue, dès lors que les modifications qui en 3(~ résulteraient quant à la sequence en acides aminés du peptide recombinant -ou peptide immunologiquement équivalent-produit CA 02245727 l998-08-05 n'entraîneraient pas une perte des propriétés immunologiques, voire - - protectrices, des protéines recombinantes formées, notamment dans les essais qui seront illustrés plus loin.
Ces observations s'appliquent naturellement à d'autres Plasmodium infectieux pour l'homme, en particulier dès lors que des séquences nucléotidiques natives codant pour les p42 correspondantes, le cas échéant partiellement délétées, auraient des teneurs en nucléotides T et A
difficilement compatibles avec une expression efficace dans un système baculovirus .
La séquence codant pour le signal utilise peut être celle normalement associee à la séquence native du Plasmodium concerné.
Mais elle peut également être issue d'un autre Plasmodium, par exemple P.vivax ou P.cynomolgi ou d'un autre organisme s'il est susceptible d'être reconnu en tant que signal dans un système baculovirus.
La séquence codant pour la p42 ou une partie de celle-ci au sein du vecteur considéré est, le cas écheant, dépourvue de la séquence d'ancrage de la protéine native au parasite dont elle est issue, cas dans lequel la proteine exprimée est en géneral excrétée dans le milieu de culture (forme soluble~.
2() L'invention concerne tout autant les vecteurs dans lesquels la séquence codante contient la sequence d'extrémité 3' terminale codant pour la séquence d'extrémité C'-terminale hydrophobe de la p19 et qui est normalement impliquee dans l'induction de l'ancrage de la protéine native à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée. Cette région d'extrémité 3'-terminale peut d'ailleurs être hétérologue vis-à-vis de la séquence codant pour le reste de la p42 correspondante, par exemple correspondre à la séquence 3'-terminale issue de P.vivax ou d'un autre organisme dès lors qu'elle code pour une séquence d'ancrage de l'ensemble de la protéine recombinante produite à la membrane de l'hôte - - ~() cellulaire du systeme bacu~ovirus mis en oeuvre. A titre d'exemple de telles séquences d'ancrage on cite la GPI de l'antigène CD59 exprimable dans CA 0224~727 1998-08-0~

des cellules d'insectes du type spodoptera frugiperda (32) ou la GPI d'une - - -- protéine humaine CD14 (33).
L'invention concerne naturellement aussi les protéines recombinantes, ces protéines comportant des épitopes conformationnels s reconnus par des serums humains formés contre le Plasmodium correspondant.
D'une façon générale, I'invention concerne également toute protéine recombinante du type indiqué ci-dessus, dès lors qu'elle comporte des épitopes conformationnels tels que produits dans le système baculovirus, notamment ceux qui se trouvent être instables en milieu réducteur.
L'invention concerne naturellement lesdites protéines recombinantes, qu'elles soient sous la forme dite soluble ou sous la forme pourvue d'une région d'ancrage, en particulier aux hôtes cellulaires mis en oeuvre dans le système baculovirus.
L'invention porte également sur tout produit de conjugaison entre une p42 ou une p42 partiellement délétée telle que définie ci-dessus, d'une part, et une molécule porteuse --par exemple une polylysine-alanine-- utilisable pour la production des vaccins, d'autre part, par l'intermédiaire de liaisons cGvalentes ou non. Les compositions 2() vaccinantes les mettant en oeuvre font également partie de l'invention.
L'invention concerne également les compositions de vaccins mettant en oeuvre ces protéines recombinantes ou conjuguées, y inclus d'ailleurs les protéines issues de Plasmodium vivax.
Font également partie de l'invention les compositions dans 2:~ lesquelles les protéines recombinantes susmentionnées sont associées à
un adjuvant, par exemple un alun Les protéines recombinantes comportant l'extrême région C-terminale permettant leur ancrage à la membrane des cellules dans lesquelles elles sont produites sont avantageusement utilisees en combinaison avec des lipides aptes à former .() des liposomes et appropriés à la production de vaccins Sans qu'il y ait eu lieu de s'y limiter, on peut avoir recours aux lipides décrits à cet effet par CA 0224~727 1998-08-0~

exemple dans llouvrage intituie ~ Les liposomes aspects technologi~ue, biologique et pharmacologique ~ de J. Delattre et al., édition INSERM, 1 993.
La présence de la région d'ancrage dans la protéine recombinante, qu'il s'agisse d'une région d'ancrage homologue ou hétérologue vis-à-vis de la partie vaccinante proprement dite, est de nature à favoriser la production d'anticorps cytophiles, notamment du type IgG2a et IgG2b chez la souris qui pourraient avoir une activité protectrice particulièrement élevée, au point que l'on pourrait se dispenser d'associer les principes actifs de vaccins ainsi constitués avec des adjuvants autres que les lipides utilisés pour la constitution des formes liposomiques. Il s'agirait là d'un avantage important, puisque les liposomes peuvent être Iyophilisés dans des conditions permettant leur stockage et leur transport, sans que des chaînes de froid ne soient alors indispensables.
D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemples, de protéines recombinantes mettant en jeu des protéines recombinantes dont les séquences actives, soit contiennent celles de la p42, soit sont limitées à celle des protéines p19 correspondantes. Sans que ces exemples soient à proprement parler 2() toujours directement couverts par les revendications qui suivent, ils n'en contribuent pas moins a l'établissement du caractère opérationnel de l'invention qui fait l'objet de la présente demande.

Description de la cons~ruction P~MSP1 p,gS (soluble) (p19 solub~e 2~ issue de P.falciparum) La construction recombinante PfMSP1 p~gS contient de l'ADN
correspondant aux 8 paires de base de la séquence leader et les 32 premiers acides amines de MSP1 de Plasmodium vivax de Met1 à Asp32 (isolat Belem; Del Portillo et al. 1991. P.N A.S. 88, 4030.) suivis par un 3u GluPhe, du au site EcoR1 faisant la liaison des deux fragments. Le tout estsuivi par le gène synthetique, décrit dans Figure 1, codant le Plasmodium CA 0224~727 l998-08-0~

1~

falciparum MSP1p1g de Asn1613 à Ser,705 (isolat Uganda-Palo Alto; Chang et al. 1988. Exp. Parasitol. 67,1). La construction est terminée par deux codons stop de TAA. Cette construction donne lieu à une protéine recombinante qui est sécrétée dans le surnageant de culture des cellules infectées.
De la même façon et à des fins de comparaisons, on a produit une construction recombinante dans des conditions semblables à celles utilisees pour la production de la p19 ci-dessus, mais en travaillant avec une sequence codante consistant en une copie directe de l'ADN
correspondant de la souche P.falcipar~lm (FUP) décrite par Chang et al., Exp. Parasit. 67,1; 1989. La copie de ce gène naturel ~s'étendant de l'asparagine 1613 à la sérine 1705) a été formée par PCR à partir du gène natif.

On a representé dans la Figure 1A les séquences à la fois du gène synthétique (Bac19~ et du ~ gène natif ~ (PF19).
On remarque que ~;7 codons sur les 93 codons de la séquence codante native pour la p19 issue de P.fa/ciparum ont été modifiés (pour ce qui est du troisième nucleotide dans 55 d'entre eux et du premier et 2() troisième nucléotides dans les deux codons restant~. Des codons nouveaux ont été ajoutés à l'extrémité 5' pour introduire le peptide signal dans les conditions qui ont été indiquées ci-dessus et pour introduire un site EcoRI pour ie clonage, d'une part, et de même ont été ajoutés deux codons stop non présents dans la p19 de P.falciparum aux fins d'obtenir 2:) des signaux de terminaison de l'expression. Les lettres individualisées placées respectivement au dessus des codons successifs correspondent aux acides aminés respectifs successifs. Les astérisques (~) se rapportent aux codons stop. Les iignes verticales soulignent les nucléotides qui sont les mêmes dans les deux séquences.
~1) -CA 0224~727 1998-08-0~

Description de la construction PfMSP1p1~A (ancré GPI) (p19 ancrée de P.~alciparum~
~a construction PfMSP1p19A a des caracteristiques de la précédente sauf que la séquence synthétique (Figure 1B) code pour le MSP1p19 de s Plasmodium falciparum (isolat Uganda-Palo alto) de Asn1613 à tle1726 suivie par deux codons stop de TAA. Cette construction donne lieu à une protéine recombinante qui est ancrée dans la membrane plasmique des cellules infectées par une structure du type glycosyl phosphatidyl inositol (GPI).
I() La figure 1~ est représentative de la séquence de la protéine recombinante PfMSP1p19S avant coupure de la séquence signal.

La figure 1 D est représentative de la séquence de la protéine recombinante PfMSP1pl9S après coupure de la séquence signal.

Les acides amines soulignés dans les figures 1 C et 1 D proviennent du site EcoR1 utilise pour joindre les sequences nucléotidiques dérivées de ia partie N-terminale de MSP1 de P.vivax (avec séquence signal) et de MSP1 pl9 de P.falciparum.
Figure 2 - L'antigène recombinant PfMSP1 pl9 soluble purifié par immunoaffinite a été analysé par immunoblot après SDS-PAGE en présence (réduit) ou absence (non réduit) de B-mercaptoéthanol. Les échantillons sont chargées sur gel après chauffage à 9~C en présence de 2:~ 2% SDS. Dans ces conditions seulement des liaisons du type covalent (ponts disulfure) peuvent resister à la desagregation. Le blot de gauche a été révélé avec un anticorps monoclonal qui réagit avec un épitope linéaire de la p19 naturelle Le blot de droite a été revélé avec un mélange de 13 antisera humains provenant des sujets avec une immunité acquise au 3() paludisme dû à Plasmodium falciparum. Ces resultats montrent que la molécule recombinante de baculovirus reproduit bien les épitopes CA 0224~727 1998-08-0~

~() conformationnels en forme de polymère qui sont reconnus en majorité par i'antiserum humain.

Figure 3 - L'antigène recombinant PvMSP1p42 soluble (Longacre et al. 1994, op.cit.) a eté incube pendant ~ heures à 37~ en présence des fractions de protéines dérivées des mérozoïtes de P falciparum et séparées par isoélectrofocalisation. Par la suite les échantillons ont été
analysés par immunoblot en présence (reduit) ou absence (non réduit) de B-mercaptoéthanol. Les fractions ~ à 12 d'isoelectrofocalisation, ainsi que deux extraits totaux de mérozoïtes faits en présence (Tex) ou absence (T) de détergent ont été analysés. L'immunoblot a été révélé avec des anticorps monoclonaux spécifiques pour le MSP1p42 et p19 de P.vivax. Les re~sul~ats suggèrent qu'il y a une activité protéolytique dans les mérozoïtes de P.falciparum qui peut être extraite en détergent. La digestion du p42 dans certaines fractions semble provoquer une polymérisation des produits de digestion (p1 9); cette polymérisation est probablement liée à la formation de ponts disulfure puisqu'en présence de B-mercaptoéthanol, les formes de haut poids moléculaire disparaissent en faveur d'une molécule 2(3 d'environ 19 kDa (Tex-R). La polymérisation du p19 observée dans ces expériences pourrait donc être une propriété intrinsèque de cette molécule in vivo.

Description de la construction PcMSP1p19S (soluble) (p19 soluble de 2:) P.cynomolgi~
L'ADN utilisé pour la construction susdite a été obtenu à partir d'un clone de la souche de Plasmodium cynomolgi ceylonesis (22-23). Cette souche a eté maintenue par des passages successifs dans son hôte naturel (Macaca sinica) et des transmissions cycliques par l'intermédiaire 3() de moustiques (27).

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~1 Des parasites sanguins ont été obtenus à partir des singes infectés au stade schizonte mature quand les parasitémies ont atteint un niveau de 5%. Ils ont alors été purifiés selon la méthodes décrites dans ~25). L'ADN a ensuite été extrait comme décrit dans (26).
Un fragment de 1200 paires de base a ensuite été produit en ayant recours à la réaction PCR mettant en oeuvre les oligonucléotides soulignés dans la Figure 4 et issus de P.vivax. L'oligonucléotide 5' comprenait un site de restriction EcoRI et l'oligonucléotide 3' deux codons synthétiques stop TAA suivis d'un site de restriction Bglll. Ce fragment a ete introduit par ligation et par l'intermédiaire de ces sites EcoRI et Bglll dans le plasmide pVLSV200.contenant déjà la séquence signal de la protéine MSP-1 de P.vivax (19). Le nouveau plasmide (pVLSV200C42) a été
utilisé pour l'analyse de séquences d'ADN.
Les sequences de P.cynomolgi et des séquences correspondantes de P.vivax ont été mises en alignement. Les flèches noires désignent les sites de clivage primaire et secondaire présumés. Ils ont été détermines par analogie avec les sites connus dans P.falciparum (27, 28). Des lignes verticales et des fleches horizontales localisent les limites des quatre régions qui ont été étudiées. La région 4 correspond à la séquence codant 2() pour la p19 de P.cynomolgi. Des sites de glycosylation sont encadrés et les cystéines conservées sont soulignées. Dans la partie inférieure de la Figure 4 sont indiqués les pourcentages identite entre les deux isolats de P.vivax et P.cynomolgi.
La construction recombinante PcMSP1p19S contient de l'ADN
2:) correspondant aux 8 paires de bases de la séquence ~ leader ~ et les 32 premiers acides aminés de VISP1 de Plasmodium vivax de Met1 à Asp32 (isolat Belem; Del Portillo et al. 1991. P.N.A.S. 88, 4030.) suivis par un GluPhe, du au site EcoR1 faisant la liaison des deux fragments. Le tout est suivi par la séquence codant pour le MSP1p19 de Plasmodium cynomolgi :~() (souche Ceylon) de Lys276 à Ser380. La construction est terminée par deux codons stop de TAA. Cette construction donne lieu à une protéine recombinante qui est sécrétée dans le surnageant de culture des cellules infectées.

Puri~ication de la pro~eine recombinante PfMSP1 p~ 9 par chromatographie d'immunoaffinité avec un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement la p19 de Plasmodium falciparum.
La résine de chromatographie a été préparée en liant 70 mg d'un anticorps monoclonal (obtenu à partir d'un hybridome G17.12 déposé à la CNCM (Paris, France) le 14 février 1g97 sous le n~1-1846; cet hybridome G17.12 a eté construit à partir du myélome X63 Ag8 653 produisant des IgG 2a/k reconnaissant la p19 de P.falciparum) à 39 de CNBr-Sepharose 4B activé (Pharmacia) par des méthodes standards détaillées dans le mode d'emploi fourni par Pharmacia. Les surnageants de culture contenant le PfMSP1p19 soluble ont eté incubés en batch avec la résine de chromatographie pendant 16 heures à 4~C. La colonne a eté lavée une fois avec 20 volumes de 0.05% NP40, 0.5M NaCI, PBS; une fois avec 5 volumes de PBS et une fois avec 2 volumes de 10 mM phosphate de sodium, pH 6.8. L'élution a éte effectuée avec 30 ml de 0.2 M glycine, pH
2.2. L'éluat a été neutralisé avec 1 M phosphate de sodium, pH 7.7 puis 2() concentré par ultrafiltration et dialysé contre du PBS. Pour la purificationdu PfMSP1p19 ancré, toutes les solutions de lavage et élution contenaient en supplément 0.1% 3-(Dimethyl-dodecylammonio)-propane sulfonate (Fluka).

2~ Essai de vaccination de MSP1 recombinant de P/asmod;um vfvax (p42 et p19) chez le singe écureuil Saimiri sc;ureus.
Cet essai de vaccination a eté fait chez des Saimiri sciureus boliviensis mâles de 2 à 3 ans, non splenectomisés. Trois singes ont été
injectes 3 fois par voie intramusculaire à 3 semaines d'intervalle avec un 3() melange d'environ 50 à 100 ,ug chacun, de PvMSP1 p42 et p19 soluble recombinant (19), purifie par immunoaffinité. L'adjuvant de Freund complet et incomplet etait utilisé comme suit: 1ere injection: 1:1 FCA/FIA; 2eme - injection 1:4 FC~VFIA; 3~me injection: FIA. Ces compositions d'adjuvant étaient melangees par la suite 1:1 avec l'antigène en PBS. Les cinq singes controles recevaient l'antigène glutathione-S-transferase (GST) produit dans E.coli selon le même protocole. L'infection d'épreuve était effectuée en injectant 2.1 o6 hématies infectées avec une souche adaptée de Plasmodium vivax (Belem) 2.5 semaines après la dernière injection. La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux par examen des frottis colores avec giemsa.
Les courbes de la Figure 5 sont représentatives de la variation de la parasitémie mesurée en nombre d'hematies parasitees par microlitre de sang (sur l'axe des ordonnées à l'échelle logarithmique) en fonction du temps écoulé après l'infection (en jours). La courbe A correspond aux s valeurs moyennes observées chez les trois singes vaccinés, la courbe B;
les valeurs moyennes chez cinq singes témoins, De l'examen de la figure découle une très forte réduction de la parasitémie sous l'effet de la vaccination.

2() Essai de vaccination de MSP1 recombinant de Plasmodium cynomolgi (p42 et p19~ chez le singe toque, Macaca sinica.
Quinze singes capturés ont été utilisés comme suit: (1) 3 animaux injectes avec 100,ug PcMSP1p42 soluble; 3 animaux injectés avec 35,ug (1ere injection) ou 50 ,ug (2~me et 3eme injections) PcMSP1p,9 soluble; ~3) 3 animaux injectés avec un mélange de PcMSP1p42 et p,g; (4) 3 animaux injectes avec l'adjuvant plus PBS; ~5) 3 animaux non injectés. L'adjuvant de Freund complet et incomplet a été utilisé selon le protocole décrit ci-dessus, Les injections on été faites par voie intramusculaire à 4 semaines d'intervalle. L'infection d'épreuve était faite en injectant 2.105 hématies infectées avec Plasmodillm cynomolgi 4 semaines après la dernière CA 0224~727 1998-08-0~
WO 97/301~9 PCTIEl~97/00291 ~4 injection. La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les parasitémies avec giemsa. Les parasitemies ont été classees comme négatives uniquement après comptage de 400 champs de frottis. Les parasitémies sont s exprimées en pourcentage d'hématies parasitées.
Les Figures 6A-6G sont illustratives des résultats obtenus. ~ans chacune d'elles apparaissent les parasitémies (exprimées en pourcentages d'hématies parasitées sur l'axe des ordonnées à l'échelle logarithmique~ observées chez les animaux d~épreuve en fonction des temps après l'infection (en jours sur les axes des abscisses).
Les résultats concernent:
. dans la figure 6A; des animaux contrôles non vaccinés;
~ Ia figure 6B concerne des animaux qui avaient reçu une solution saline contenant en outre l'adjuvant de Freund;
~ Ia figure 6C est une superposition des figures 6A et 6B, dans le but de faire apparaître les résultats relatifs résultant de l'administration de l'adjuvant de Freund aux animaux (les variations ne sont évidemment pas significatives);
. Ia figure 6D fournit les résultats obtenus a l'issue d'une vaccination 2() avec la p42;
Ia figure 6E concerne des animaux vaccines avec la seule p19;
~ enfin, ia figure 6F concerne les animaux vaccinés avec un mélange de p19 et p42.
La p42 induit certes un certain niveau de protection. Mais comme en 2:~ témoignent les figures 6E et 6F, la protection conférée par la p19 recombinante selon l'invention est considérablement améliorée.
On peut formuler l'hypothese que l'amélioration de la protection résulte d'un clivage secondaire de la p42 qui s'accompagne du dévoilement de cysteine libre qui forme, par la suite, des ponts disulfure 3() intermoléculaires donnant lieu à des multimères du p19 tres CA 0224~727 1998-08-0~

~5 caractéristiques de cette forme dans les protéines recombinantes des trois espèces testées.
..
Les chiffres utilises pour eiaborer les graphiques (6A-6F) sont précisés dans la Figure 6G.

Essai de vaccination P.cynomolgilsinge toque; deuxième infection d'épreuve sur singes vaccinés avec p19 seule et contrôles (Figures 8) Six mois plus tard, sans autre immunisation, les 3 singes ayant reçu 1() le MSP-1 p19 seule avec FCA/FIA (Figure 6E) et les 3 singes ayant reçu une solution saline contenant l'adjuvant de Freund (Figure 6B) ainsi que 2 nouveaux singes naïfs non vaccines ont subi une nouvelle infection d'épreuve par injection de 1.1 o6 hématies infectées avec Plasmodium cynomolgi. La protection a eté évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les frottis avec du giemsa. Les parasitémies ont été classées comme négatives uniquement après comptage de 400 champs de frottis. Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitees (les chiffres utilisés pour élaborer les graphiques 8A-C sont précisés dans la Figure 8D). Les six 2() animaux immunises qui avaient subi une infection d'épreuve six mois auparavant n'avaient pas de parasitémie détectable sauf pour 1 animal dans chaque groupe qui a presenté une parasitemie à 0.008% pendant 1 jour (Figures 8A et 8B). Les deux controles naïfs montrent une parasitémie classique avec un maximum de 0.8% et pendant 21 jours 2:) (Figure 8C). Donc, les 3 animaux vaccinés avec le MSP-1 p19 étaient aussi protégés six mois plus tard que les 3 controles qui presentaient une infection complète classique après le première infection d'épreuve, malgre une absence ou un très faible parasitémie après la première infection - - d'épreuve. Ces résultats suggèrent que la durée de protection du p19 est :3U au moins de six mois.

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2~

Essai de vaccination avec p19 en association avec alun dans le système P.cynomolgifsinge toque (Figures 9) Les résultats positifs de protection précédents ont été obtenus en utilisant l'adjuvant complet (FCA) ou incomplet (FIA) de Freund.
Cependant, le seul adjuvant admis actuellement chez l'homme est l'alun.
Pour cette raison, nous avons fait un essai de vaccination avec le MSP-1 p19 de P. cynomolgi chez le singe toque en présence d'alun comme adjuvant. Six singes capturés ont été utilisés comme suit: (1) 3 animaux injectés avec 4 doses de 50 mg MSP-1 p19 recombinant de P. cynomolgi avec 20 mg d'alun (2) 3 animaux injectés 4 fois avec de l'eau physiologique et 10 mg de alun. Les injections ont été faites par voie intramusculaire à 4 semaines d'intervalle. L'infection d'épreuve était faite en injectant 2.105 hématies infectees avec P. cynomolgi 4 semaines après la dernière injection. La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les frottis avec le giemsa. Les parasitémies ont été classees comme négatives uniquerrlent après comptage de 400 champs de frottis. Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitées. Les résultats de 2() cette expérience sont les suivants: 2 des 3 singes immunisés avec le p19 recombinant en alun avaient environ 30 fois moins de parasitemie totale pendant la durée de l'infection (Figures 9A et 9B) que les 3 singes contrôles immunisés avec de l'eau physiologique et de l'alun (Figure 9D) après l'infection d'épreuve. Le troisième singe immunisé avec p19 (Figure 2:~ 9C) n'était pas très différent des contrôles. Pour l'essai de vaccination de Plasmodi~/m cynomolgi p19 chez le singe toque, Macaca sinica, décrit dans la Figure 9, les chiffres utilisés pour élaborer les graphiques (9A-9D) sont précisés (Figure 9E). ~ien que ces resultats soient un peu moins spectaculaires que les précédents (Figures 6, 8); c'est la première fois WO 97/30159 PCT/FR97/OOZ9l ~7 ~u'une protection significative est observee pour MSP-1 recombinante en alun.
-Figure 10: Essai de vaccination avec une p19 recombinante de Plasmodium falciparum chez le singe écureuil.
Vingt singes Saimiri sciureus guyanensis (singe écureuil) d'environ 3 ans éleves en captivité ont été utilisés comme suit: (~) 4 animaux injectés avec 50 mg de Pf MSP-1 p19 soluble en présence d'adjuvant de Freund comme suit: 1 ère injection: 1:1 FCA/FIA; 2ème injection: 1:4 FCA/FIA; 3ème injection: FIA . Ces compositions d'adjuvant ont ensuite été mélangees avec l'antigène en PBS 1:1; (2) 2 animaux contrôles recevaient l'adjuvant de Freund comme décrit pour (1) avec uniquement PBS; (3) 4 animaux injectés avec 50 mg de Pf MSP-1 p19 soluble en présence de 10 mg d'alun (Alu-Gel-S, Serva); (4) 2 animaux contrôles i recevaient 10 mg d'alun avec uniquement PBS; (5) 4 animaux injectés avec environ 50-100 rng Pf MSP-1 p19 ancré GPI reconstitués en liposomes comme suit: 300 mmoles de cholestérol et 300 mmoles de phosphatidyl choline étaient séchés sous vide et resuspendus en 330 mM
N-octylglucoside en PBS avec 1.4 mg de Pf MSP-1 p1 9,GPI. Cette 2() solution avait été dialysée contre PBS avec des Bio-Beads SM-2 adsorbant (Bio-Rad) et les liposomes ainsi formés etaient concentrés par centrifugation et resuspendus en PBS. La 1ère injection était faite avec des liposomes frais maintenus a 4~C et les 2éme et 3éme injections étaient faites avec des liposomes ayant été congelés pour conservation; (6) 2 animaux injectés avec des liposomes contrôles faits de la même façon en absence de l'antigène p19, GPI, comme décrit pour (5); (7) 2 animaux injectés avec de l'eau physiologique. Trois injections ont été faites par voie intramusculaire à 4 semaines d'intervalle. L'infection d'epreuve était faite en injectant 1.106 hématies infectées avec Plasmodium falciparum.

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-~X

La protection a été évaluée en déterminant les parasitémies journalières chez tous les animaux en examinant les frottis avec giemsa. Les parasitémies sont exprimées en pourcentage d'hématies parasitées. Les resultats de cet essai de vaccination sont exposés dans les Fi~ures 10, A-G.
Les groupes immunisés avec le p~9 en adjuvant de Freund ou en liposome ont démontré des parasitémies semblables aux groupes contrôles après une infection d'épreuve (un animal (numéro 29) vacciné
avec p19 en adjuvant de Freund est mort quelques jours après l'infection 1~3 d'épreuve pour des raisons indépendantes de la vaccination (crise cardiaque)) Des irrégularités dans l'administration de l'antigène dans ces 2 groupes (mauvaise emulsion de Freund, liposomes congelés) ne permettent pas d'évaluer de façon complète la signification de ces résultats. Dans le groupe alun 2 animaux ont montré des parasitémies 13 totales pendant la durée de l'infection environ 4 fois moins importantes queles contrôles, I animal environ 3 fois moins importante et 1 animal était semblable aux contrôles. Celte expérience est un peu difficile a interpréter à cause de la variabilité dans les contrôles, probablement due à la souche de parasite utilisée pour l'infection d'épreuve qui n'aurait pas été assez adaptée au modèle Saimiri non spénectomise mis au point que récemment à Cayenne. Néanmoins, I'effet réel, quoiqu'imparfait, avec l'alun est encourageant dans la mesure où nos antigènes semblent être les seules versions recombinantes MSP-1 de P. falciparum qui, pour l'instant, ont démontré une certaine efficacité en association avec l'alun.

Essai de vaccination ~vec une p19 recombinante de Plasmodium ~alciparum chez le singe écureuil (même essai que figure 10).
Des singes élevés en captivite ont été injectés avec 1 ml d'inoculum par voie intramusculaire 2 ~ois à 4 semaines d'intervalle comme suit: (1) 4 3(3 animaux injectés avec 50 llg de PfMSP1p19 soluble en présence CA 0224~727 l998-08-0~
WO 97/3~159 PCT/FRg7/00291 d'adjuvant de Freund comme suit: lère injection 1:1 FCA/FIA; 2ème injection 1:4 FCAIFIA; et mélangés par la suite 1:1 avec l'antigène en PBS; ~2) 4 animaux injectés avec ~0 ~ug de PfMSP1 p19 soluble en présence de 10 mg d'alun; (3) 4 animaux injectés avec environ 50 ,ug de PfMSP1p19 ancré- GPI reconstitués en liposomes composés 1:1 en molarité de cholestérol et phosphatidyl choline Les animaux ont été
saignés 17 jours après la deuxième injection.
Les globules rouges provenants d'un singe ecureuil avec 30% de parasitémie due à P. falciparum (avec des formes mûres en majorite) ont été laves en PBS et le culot était dilué 8 fois en presence de 2% SDS et 2% dithiothreitol et chauffé à 95~ avant d'etre chargé sur un gel de polyacrylamide de 7.5% (gel de séparation) et 4% (gel de stacking) (haut du gel~. Après transfère en nitrocellulose l'analyse par immunoblot (immunoempreinte) a été fait avec des antisera comme suit: (1 ) pool :. d'antisera des 4 singes vaccinés avec PfMSP1p19 soluble en adjuvant de Freund dilue au vingtième; (2~ pool d'antisera des 4 singes vaccinés avec PfMSP1 p1 9 soluble en adjuvant alun dilué au vingtième; (3) pool d'antisera des 4 singes vaccinés avec PfMSP1 p19 ancre en liposomes dilué au vingtième; (4~ I'anticorps monoclonal, qui reagit avec un épitope 2() linéaire de PfMSP1p19, à ~0 ~ug/ml; (5) pool d'antisera SHI90 provenant d'un vingtaine de singes infectés à répétition par P. falciparum et devenus réfractaires à toute infection ultérieure de P. falciparum, dilué au cinq centième; (6) pool d'antisera des singes naifs (n'ayant jamais été exposés à P falciparum) dilue au vingtieme.
2:) Les résultats montrent que les 3 pools d'antisera des singes vaccinés avec le PfMSP1p19 réagissent de façon importante et specifique avec des complexes de très haut poids moléculaire (se trouvant de façon diffuse dans le gel de stacking) et présents dans des extraits de parasite ~- contenant davantage de formes mûres. Ces résultats confortent ~) I'hypothèse de la présence d'une agrégation spécifique du MSP1p19 in 3() vivo comportant des épitopes qui sont reproduits dans les molécules recombinantes PfMSP1p1~ synthétisées dans le système baculovirus, en particulier celles en forme d'oligomère.

s La figure 7 illustre également ces résultats. Elle se rapporte aux immunoempreintes produites sur gel. Les trois premières colonnes du gel illustrent la réponse in vivo de singes à des injections de p19 [(1) avec l'adjuvant de Freund, (2) avec de l'alun, (3) sous forme de liposome3 et notamment l'existence de complexes de haut poids moléculaire confortant I'hypothèse de l'agrégation in vivo de p19 sous forme d'oligomere, spécifique du stade de maturation (quand p42 est coupé en p19 et p33).
Cet essai de vaccination comprend également une troisième injection identique aux précédentes. L'injection avec l'adjuvant de Freund comprend uniquement du FIA.

Figure 7B: Les données pour cette figure sont dérivées de l'essai de vaccination de P. falciparum / singe écureuil (Figure 10 ci-après~. Les chiffres correspondent aux singes individuels notés dans la Figure 10. Les techniques et méthodes pour cette figure sont les mêmes que pour la 2() Figure 7 sauf que l'antisérum individuel de chaque singe noté a été testé
après trois injections le jour de l'infection d'épreuve et l'antisérum SHI a été dilue 1:250. Les résultats montrent que l'antisérum des 4 singes vaccinés avec le p19 et alun réagissent de façon importante et spécifique avec des complexes de très haut poids moléculaire tandis que les singes des autres groupes vaccinés avec le p19 et l'adjuvant de Freund ou des liposomes ne montrent qu'une faible réactivité avec ces complexes.
Puisque les singes vaccinés avec p19 et alun ont aussi été le mieux protégés, cette réactivité avec les complexes de haut poids moléculaire paraît indiquer un effet protecteur, et cela malgré qu'un singe dans le groupe alun n'était pas protégé par rapport aux contrôles et qu'un autre ne l'était que partiellement.

L'invention concerne naturellement d'autres applications, par - exemple celles exposées ci-après en rapport avec certains des exemples, lesquels ne présentent aucun caractère limitatif.

Thérapeutique Les molécules recombinantes selon l'invention peuvent être utilisees pour produire des anticorps spécifiques éventuellement utilisables par transfert passif dans un but de thérapeutique adaptée au paludisme l~t sévère dû à P. falc;parum avec risque de mortalité.
Diaqnostic Les molécules recombinantes PvMSP1p42 et PvMSP1p19 et selon l'invention, dérivées de baculovirus peuvent et ont été utilisées pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques murins. Ces anticorps, en s combinaison avec des antisera polyclonaux anti p42 provenant d'une autre espèce telle que le lapin ou la chèvre, peuvent etre à la base d'un test de diagnostic semi-quantitatif pour le paludisme et capable de distinguer entre un paludisme du à P. falciparum, qui peut etre mortel, et un paludisme dû à
P. vivax, qui n'est généralement pas mortel. Le principe de ce test serait de 2() piéger et quantifier toute molécule de MSP1 contenant la partie p42 dans le sang.
Dans ce cadre, les avantages des p42 recombinantes, et en particulier des p42 recombinantes partiellement délétées, sont les suivants:
(i) elles sont à la fois bien conservées au sein d'une même espèce et suffisamment divergente entre des espèces différentes pour permettre de produire facilement des réactifs spécifiques d'espèce, dans des conditions faisant en sorte que peuvent être produits des anticorps dérivés de Plasmodiums différents, notamment contre P.falciparum et P.vivax qui 3() ne donnent pas lieu à des réactions croisees;

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WO 97/301~;9 PCT/FR97/00291 3~

(ii) puisque les molécules recombinantes p42 dérivées de baculovirus semblent reproduire davantage la structure native des protéines natives correspondantes, les anticorps produits contre ces protéines seraient bien adaptés à un usage diagnostique.
Les microorganismes identifiés ci-dessous ont été déposés suivant la règle 6.1. du Traité de Budapest à la date du 01 février 1996, sous les numéros suivants:

Références d'identification Numéros d'enreqistrement PvMS P 1 p19A I - 1659 PvMSP1 p19S I - 1660 PfMSP1 p19A I - 1661 PfMSP1 p19S I - 1662 PcMSP1p19S I - 1663 1~
L'invention concerne également l'utilisation de ces anticorps, alors de préférence préalablement fixes sur un support solide (par exemple pour chromatographie d'affinité), pour la purification de peptides du type p19 initialement contenus dans un mélange.
2() La purification fait alors intervenir une mise en contact de ce mélange avec l'anticorps, la dissociation du complexe antigène-anticorps et la récupération du peptide de type p19 purifié.
Lorsqu'il est dit dans les revendications qui suivent que la p42 est délétée d'une partie ou de parties les moins bien conservées de la région 2:~ Ill, il s'agit de préférence de régions ayant au moins 10 acides amines et dont le degré de conservation dans P.vivax, P.cynomolgi et P.falciparum est inferieur à 70% (moins de sept acides amines identiques sur 10, lorsqu'ils sont mis en alignement.
Les anticorps polyclonaux et monoclonaux de la présente invention 3() présentés comme reconnaissant les p42, sont de préférence ceux qui reconnaissent plus spécifiquement des régions autres que la région IV, à

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I'exclusion de la région IV elle-même De préférence ils reconnaissent la région I de la p42.
L'invention concerne également les hybridomes sécréteurs d'anticorps spécifi~ues reconnaissant sélectivement la p42 d'une protéine s MSP-1 de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium infectieux pour l'homme autre que Plasmodium vivax et ne reconnaît pas Plasmodium vivax.
En particulier, ces hybridomes sécrètent des anticorps qui ne reconnaissent pas la p42 de Plasmodium vivax ou qui reconnaissent o spécifiquement la p42 de Plasmodium falciparum.
L'invention concerne également un hybridome caractérisé en ce qu'il produit un anticorps monoclonal qui reconnaît spécifiquement la p42 de P. vivax et de P.cynomolgi. Un hybridome F10-3 a été construit à partir du myélome X63 Ag8 653 produisant des IgG 2b/k reconnaissant la p42 de P vivax.

L'invention concerne également des compositions de vaccin, comprenant également des mélanges de proteines ou de fragments, notamment des mélanges du type:
2() - p42 de P.falciparum et p42 de P.vivax, - p42 de P falciparum et p19 de P.falciparum, - p42 de P.vivax et p19 de P.vivax, - p42 de P.falciparum, p19 de P.falciparum et p19 de P.vivax, p42 de P.vivax.

Dans toutes ies compositions qui précèdent la p42 est le cas echeant dépourvue de ses régions les plus hypervariables.
Par exemple sa région qui correspond à celle du fragment p19 normalement inclus dans la p42, est elle-même partiellement délétée, cette CA 0224~727 1998-08-0~

3~

région comprenant au moins l'une des deux régions EGF normalement contenues dans cette p19.
Ou encore elle est dépourvue de la région ll, voire même aussi de la région N-terminale de la région lll ou la totalité de la région lll.
L'invention n'est pas limitée à la production de vaccins humains.
Elle s'applique tout autant à la production de compositions de vaccin vétérinaire mettant en oeuvre les protéines ou antigènes correspondants dérivés de parasites infectieux pour des mammifères et produits dans les mêmes conditions. Il est en effet connu que des infections du même type, la babésiose, apparaissent aussi chez les bovins, les canins et les équins.
un des antigènes des espèces Babésia présente une forte homologie conformationnelle (notamment les deux domaines ~ EFG-like ~ et richesse en cystéine) et fonctionnelle avec une partie protéique de MSP-1 [(36), (37) et (38)].
Des exemples de vaccins vétérinaires utilisant un antigène soluble contre de tels parasites on été décrits (39).
Il va sans dire que les p42 mises en oeuvre dans ces mélanges peuvent également donner lieu à toutes les modifications dont il a été
question dans ce qui précède, lorsqu'elles étaient prises en considération 2() de façon isolée.

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Claims (39)

REVENDICATIONS

1. Protéine recombinante dont la séquence polypeptidique constitutive essentieile est celle:
~ soit d'un fragment C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1) de la forme mérozoite d'un parasite du type Plasmodium et infectieux pour l'Homme, et dont ont été délétées la région II et, le cas échéant, une ou des parties de la région III, en particulier les parties les moins bien conservées;
~ soit d'une partie de ce fragment dès lors qu'elle est apte aussi à inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant;
~ soit d'un peptide capable d'induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par ce fragment p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et cette protéine recombinante comportant le cas échéant des épitopes conformationnels instables en milieu réducteur et constituant la majorité
des épitopes reconnus par des antisérums humains formés contre le Plasmodium correspondant.

2, Protéine recombinante selon ia revendication 1, caractérisée en ce que sa région qui correspond a celle du fragment p19 normalement inclus dans la p42, est elle-même partiellement délétée, cette région comprenant au moins l'une des deux régions EGF normalement contenues dans cette p19.

3. Protéine recombinante selon la revendication 2, caractérisée en ce que le poids moléculaire de cette partie de fragment p19 est comprise entre 10 et 25 kDa, notamment entre 10 et 15 kDa.

4. Protéine recombinante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient à la fois les parties essentielles de la séquence polypeptidique de la région I et de la région IV de la p42 et qu'elle est dépourvue de la région II.

5. Protéine recombinante selon la revendication 4, caractérisée en ce que sa séquence polypeptidique est celle de la p42 dont a été
délétée la région II.

6. Protéine recombinante selon la revendication 5 dont a également été délétée la région N-terminale de la région III ou la totalité de la région III.

7. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comporte également un groupe glycosylphosphatidylinositol (GPI) du type de ceux qui permettent un ancrage du fragment p19 dont la séquence est normalement comprise dans celle de la p42 à l'hôte cellulaire, notamment une cellule eucaryote, préférentiellement une cellule d'insecte infectable par un baculovirus, dans lequel ladite protéine recombinante est exprimée.

8. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est dépourvue de la partie C-terminale extrême hydrophobe qui intervient dans l'induction de l'ancrage de cette protéine recombinante à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée, notamment dans une cellule eucaryote, préférentiellement une cellule d'insecte infectable par un baculovirus.

9. Protéine recombinante selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est hydrosoluble.

10. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence partiellement délétée susdite de la p42 de la protéine MSP-1 de Plasmodium falciparum ou ladite partie du fragment correspondant.

11. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence partiellement délétée susdite de la p42 de la proteine MSP-1 de Plasmodium cynomolgi ou ladite partie du fragment correspondant.

12. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient la séquence partiellement déletée susdite de la p42 de la protéine MSP-1 de Plasmodium vivax ou ladite partie du fragment correspondant.

13. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle est conjuguée à une molécule porteuse utilisable pour la production de vaccins.

14. Composition vaccinante contre un parasite du type Plasmodium infectieux pour l'homme, contenant a titre de principe actif la protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.

15. Anticorps spécifique reconnaissant sélectivement la p42 d'une protéine MSP-1 de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium infectieux pour l'homme autre que Plasmodium vivax et ne reconnait pas Plasmodium vivax.

16. Anticorps spécifique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il ne reconnait pas Plasmodium vivax.

17. Anticorps spécifique selon la revendication 15, caractérisé en que qu'il reconnait spécifiquement la p42 de P.falciparum.

18. Anticorps spécifique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement la p42 de P.vivax.

19. Procédé de diagnostic différentiel permettant de distinguer entre une infection parasitaire due à P vivax, d'une part, et une infection parasitaire due à un autre plasmodium, d'autre part, caractérisé par les mises en contact d'un prelèvement biologique infecté par un plasmodium avec un anticorps selon la revendication 18, d'une part, et avec un anticorps selon la revendication 16 ou 17, d'autre part, et la detection selon le cas, de la production ou non d'une reaction immunologique.

20. Vecteur modifié du type baculovirus recombinant contenant sous le contrôle d'un promoteur contenu dans ce vecteur et susceptible d'être reconnu par des cellules transfectables par ce vecteur, une première séquence nucléotidique codant pour un peptide signal exploitable par un système baculovirus, caractérisé par une deuxième séquence en aval de la première, également sous le contrôle de ce promoteur et dont au moins une partie code pour la séquence peptidique:
~ soit d'un fragment peptidique C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1) de la forme mérozoïte d'un parasite du type Plasmodium, infectieux pour l'homme, et dont, le cas échéant, ont été délétées la région II et, le cas échéant aussi, une ou des parties de la région III, en particulier les parties les moins bien conservées de celles-ci;
~ soit d'une partie de ce fragment peptidique dès lors que le produit d'expression de la deuxième séquence dans un système baculovirus est apte aussi à inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant;
~ soit d'un peptide capable d'induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par ce fragment peptidique p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et ladite séquence nucléotidique ayant en outre une teneur en G et C
comprise entre 40 et 60%, de préférence d'au moins 50% de la totalité des nucléotides dont elle est constituée.

21. Vecteur modifié selon la revendication 20, caractérisé en ce que la susdite deuxième séquence polypeptidique est conforme à celle définie dans l'une quelconque des revendications 2 à 9.

22. Vecteur modifié selon la revendication 20, caractérisé en ce que la deuxième séquence nucléotidique est une séquence synthétique.

23. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que la première séquence nucléotidique code pour un peptide signal issu de Plasmodium vivax et normalement associé à
la protéine MSP-1 de ce Plasmodium.

24. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que la deuxième séquence nucléotidique est dépourvue à son extrémité 3' terminale de la séquence d'extrémité
C-terminale hydrophobe qui est impliquée dans l'induction de l'ancrage de cette protéine recombinante à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée, notamment dans une cellule d'insecte infectable par un baculovirus.

25. Vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 24, caractérisé en ce qu'il consiste en un baculovirus modifié.

26. Organisme, notamment cellule d'insecte du type Sf9, transfectable et transfecté par le vecteur modifié selon l'une quelconque des revendications 20 à 24.

27. ADN synthétique contenant une première séquence nucléotidique dont au moins une partie code pour la séquence peptidique:
~ soit d'un fragment peptidique C-terminal de 42 kilodaltons (p42) de la protéine 1 de surface (protéine MSP-1) de la forme mérozoïte Plasmodium falciparum, infectieux pour l'homme et dont, le cas échéant, ont été délétées la région II et, le cas échéant aussi, une ou des parties de la région III, en particulier les parties les moins bien conservées de celles-ci;
~ soit d'une partie de ce fragment peptidique dès lors que le produit d'expression de cet ADN dans un système baculovirus est apte a inhiber une parasitémie normalement induite in vivo par le parasite correspondant;
~ soit d'un peptide capable d'induire une réponse immunologique de type cellulaire et/ou humorale équivalente à celle produite par ce fragment peptidique p42 ou à la susdite partie de ce fragment, et ladite séquence nucléotidique ayant en outre une teneur en nucléotides G
et C comprise entre 40 et 60%, de préférence d'au moins 50% du total des nucléotides dont est constitué le susdit ADN synthétique.

28. ADN synthétique selon la revendication 27, caractérisé en ce que sa première séquence nucléotidique est dépourvue à son extrémité 3' terminale de la séquence codant pour la région d'extrémité C-terminale hydrophobe normalement impliquée dans l'induction de l'ancrage de la protéine p19 dont la séquence est incluse dans celle de la p42, à la membrane cellulaire de l'hôte dans lequel elle est exprimée, notamment dans une cellule d'insecte infectable par un baculovirus.

29. ADN synthétique selon la revendication 27 ou la revendication 28, caractérisé en ce que la première séquence nucléotidique est précédée d'une séquence nucléotidique signal codant pour un peptide signal normalement associe à une protéine MSP-1 de Plasmodium, homologue ou hétérologue vis-à-vis de la séquence principale.

30. ADN synthétique selon la revendication 29, caractérisé en ce que la séquence signal est issue de P.vivax.

31. ADN synthétique selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, caractérisé en ce que la susdite première séquence nucléotidique inclut une séquence 3'-terminale codant pour une région polypeptidique d'ancrage à la membrane cellulaire, ladite région d'ancrage se fixant sur la protéine recombinante exprimée à la surface de la membrane de l'hôte cellulaire transformé avec un vecteur contenant ledit ADN synthétique, ladite séquence 3' étant homologue à celle de la séquence nucléotidique principale, ou hétérologue, notamment celle issue de P.vivax.

32. ADN synthétique selon la revendication 31, caractérisé en ce que la séquence 3'-terminale est issue de P.vivax.

33. ADN synthétique selon l'une quelconque des revendications 27 à 31, caractérisé en qu'il est dépourvu de ladite séquence 3'-terminale.

34. Hybridome sécréteur d'anticorps monoclonaux ayant les spécificités des anticorps selon l'une quelconque des revendications 15 à
18.

35. Procédé de séparation d'un peptide p42 de spécificité
donnée à partir d'un mélange de peptides, caractérisé par la mise en contact de ce mélange de peptides avec un anticorps correspondant, conforme à l'une quelconque des revendications 15 à 18, de préférence préalablement fixé sur un support insoluble, par la dissociation ultérieure du composé antigène-anticorps formé et par la récupération du peptide p42 purifié.

36. Utilisation de la protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la préparation d'une composition immunogène susceptible d'induire une réponse immune contre une infection à
Plasmodium.

37. Composition de vaccin comprenant à titre de principes actifs un mélange d'une protéine conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 13 et soit de la p19 correspondante, soit d'une autre protéine recombinante, de type p42 ou p19, provenant d'un parasite homologue de celui dont est issu la susdite protéine.

38. Composition de vaccin selon la revendication 37 caractérisée en ce que son mélange de principes actifs est choisi parmi les mélanges suivant:
- p42 de P.falciparum et p42 de P.vivax, - p42 de P.falciparum et p19 de P.falciparum, - p42 de P.vivax et p19 de P.vivax, - p42 de P.falciparum, p19 de P.falciparum et p19 de P.vivax, p42 de P. vivax, la p42 étant le cas échéant dépourvue de ses régions les plus hypervariables.

39. Hybridome selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il a été déposé à la CNCM sous le numéro 1-1846, le 14 février 1997.