JP2000506381A

JP2000506381A - マラリア原虫ｍｓｐ―１のｃ末端断片を含む組換えタンパク質

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Publication number: JP2000506381A
Application number: JP09529058A
Authority: JP
Inventors: ロンガークル・アンドレ，シュルリー; ロス，チャールズ; ナト，ファリダバノ; バーンウェル，ジョン，ダブリュ; メンディス，カミニ
Original assignee: インスティチュートパスツール; ニューヨークユニバーシティ
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2000-05-30
Also published as: WO1997030159A3; KR20000065265A; WO1997030159A2; FR2744723A1; EP0880589A2; CA2245727A1; AU1884297A

Abstract

(57)【要約】本発明は、バキュロウイルス系において産生される組換えタンパク質に関し、その必須の構成ポリペプチド配列は、ヒトに対して感染性であるマラリア原虫属、特にPlasmodeum falciparumのメロゾイト寄生虫の表面タンパク質１（タンパク質ＭＳＰ−１）の４２キロダルトン（ｐ４２）のＣ末端断片の配列であつて、該Ｃ末端断片は、その領域II及び必要ならばその領域IIIが特に欠失されているものに関する。前記組換えタンパク質はマラリアに対するワクチンの産生に適用できる。

Description

【発明の詳細な説明】マラリア原虫ＭＳＰ−１のＣ末端断片を含む組換えタンパク質本発明は、哺乳動物、特にヒトに感染するマラリア原虫(プラスモディウム属) のメロゾイト形態の主な表面タンパク質、より一般的にはＭＳＰ−１と称されているものから得られるワクチン用の新規活性成分に関する。ＭＳＰ−１は既に多くの研究の対象となっている。ＭＳＰ−１は、プラスモディウム属寄生虫、特に熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparumのシゾント(sc hizont)段階で合成され、マラリアの肝臓段階と赤血球段階の双方でメロゾイト( merozoite)の主要表面構成成分の一つである（１、２、３、４）。このタンパク質は、その主たる特性と全ての既知のマラリア原虫種間で保存性が高いことから、抗マラリアワクチンを作る材料となり得ることが示唆されている（５、６）。同じことがそのタンパク質の断片についても言え、特に、例えば、感染宿主の赤血球中へ寄生虫が侵入する際に形成されることが観察されている、天然切断物についてもしかりである。このような切断物としては、分子量４2ｋＤａのＣ末端断片（７、８）が挙げられる。これ自身は再度切断され、見かけの分子量３３ｋＤａのＮ末端断片と、グルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基を介した（１０、１１）修飾で寄生虫膜に通常は固定されたままである、見かけの分子量１９ｋＤａのＣ末端断片（９）とになる。また、赤血球内発育サイクルの初期環状体段階において（１５、１６）、まだ知られてはいないが、再侵入プロセスで、１９ｋＤａの断片が、本質的な役割を担っているにちがいないことが観察されている。これが、このタンパク質が、出来得るワクチンの、特に効果的な標的と成り得るという従来の仮説の基礎をなしている。以下に頻繁に言及するある型のマラリア原虫からのｐ４２およびｐ１９タンパク質とは、そのマラリア原虫のＭＳＰ−１タンパク質の対応するＣ末端切断物、または拡大して、遺伝子組換えによって、または従来の技法、例えば「アプライド・システム」シンセサイザーを用いた化学合成法、もしくは「メリフィールド」型固相合成法によって得られる実質的に同一のアミノ酸配列を含む合成物を指すものとする。便宜上、「組換えｐ４２」および「組換えｐ１９」は、少なくとも一つの遺伝子工学的工程を含んだ技術により得られた「ｐ４２」および「ｐ１９」を指す。熱帯熱マラリア原虫P．falciparumを大量に得ることは困難で、三日熱マラリア原虫P．vjvaxの試験管内(in vitro)での培養が不可能なため、抗マラリアワクチンを製造するには、組換えタンパク質またはペプチドを使用する技術に依存するのが唯一の手段であることが明らかになった。しかし、ＭＳＰ−１は、約２００ｋＤａと大きいため、その全体を製造するのは非常に困難である。そのため、研究者は、まだ機能はわかっていないが、おそらくはより重要なＣ末端部分を研究するようになった。 P．falciparumのＭＳＰ−１のＣ末端部分を組換えタンパク質（１２、４０，４１）として、以下の系で産生しサルで試験した：・E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ１９（４０）；・E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ４０（１２）；・S．cerevisiae中で産生されたヘルパーＴ細胞エピトープを保有する、破傷風アナトキシン由来のポリペプチドと融合したｐ１９（１２）：・バキュロウイルス系中で産生されたｐ４２（４１）；である。 E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ１９タンパク質をミョウバンまたはリポソームに取り込ませたものを、６匹のAo tus nancymaiサルにワクチン接種したが、いずれも保護効果を示さなかった（４０）。 E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ４２タンパク質を完全フロイントアジュバントと混合したものを、２種のAotus 種（A．nancymaiおよびA．vociferans）のサルに投与したが保護効果を示さなかった。S．cerevisiae中で産生されたｐ１９タンパク質は、２匹のA．nancymai種 A otusサルで保護効果を示した（１２）。これに対して、２匹のA．vociferan種Ao tusサルには保護効果がなかった。また、Changらは、P．falciparumと共通するあるアミノ酸配列を含む組換えｐ４２タンパク質をバキュロウイルス系中で産生し、これを使用してウサギで実施された免疫試験を報告している（１８）。彼らは、ウサギでは、組換えｐ４２が組換えＭＳＰ−１タンパク質全体（ｇｐ１９５）と実質的に同様の挙動をとること明らかにしている。完全フロイントアジュバントとこのｐ４２タンパク質との混合物は、P．falciparumに感染可能なヒト以外の霊長類、Aotus,lemurinus gri semembraのワクチン接種試験に用いられた（４０）。その結果、３匹の動物のうち２匹は完全に保護され、3匹目は、対照体のものに似た寄生虫血症を示したが、潜伏期間は長かった。しかし、寄生虫自体で誘導されるヒトの抗体のような保護特性があると結論するのは危険である。P．falciparumおよびP．vivaxに対する霊長類の実験モデルはあまり満足のいくものはないことを思い起こすべきである。P.falcjparumおよびP．vivaxに対して開発されたSaimiriモデル、およびP． falciparumに対するAotusモデルは、寄生虫株を適応させることを必要とし、有意な寄生虫血症とするために動物の脾臓摘出をしばしば必要とする人工系である。そのため、このようなモデルから得られたワクチン接種では、ヒトに対して、ある限られた的中率を持つに過ぎない。そのような組換えタンパク質で得られうる実際のワクチン化率がどのようになるかの疑問に加えて、同一種のマラリア原虫由来のｐ４２上の高頻度可変領域の存在、より具体的には対応するｐ３３におけるその存在のために、同一種の他の株による感染に対してマラリア原虫のｐ４２でワクチン接種された個体に誘発される抗体の免疫保護効率が多くの場合に不確かになりうる（１３）。この種の寄生虫にしばしば観測されるｐ４２の中央領域の高多型性が、免疫逃避において重要な役割を果たしうる。しかしながら、ヒトに感染する種々のマラリア原虫のｐ４２は、その領域III に主に集中して高頻度可変領域を含み、領域IIにも更に多く含む：P．cynomolgi 、P．vivax(Belem)及びP．vivax(Sal-I)のｐ４２配列が整列したS．Longacreの論文（１３）を参照のこと。これらの３種の寄生虫のｐ４２配列に付加された添付図４の「共通」配列はこのことを裏付ける。 S.Longacreの論文（１３）には領域を決定した時の条件が記載されている。添付図４はLongacreの論文の図１を再現したものに過ぎないことに留意すべきである。読者はその図面に対するキーワードを参照すべきである。これは、ｐ４２の４つの領域（領域IVはｐ１９の配列に対応する）の相対サイズを、ｐ４２の全体をコードする配列のサイズに対してのパーセントとして明らかにしている。また、本願の図４は、P.cynomolgiとP.vivaxの相同性が領域Ｉの配列間で高く、領域Ｉで８４％、領域IVで８６％であることを示している。一方、領域IIIで相同性は大きく減少し(６９％)、領域IIで更に減少する(４７％)。しかして、本発明の第１の目的は、先に議論したように免疫逃避から宿主を更に保護しうるｐ４２から、ワクチン用の有効成分を提供することにある。（３４）及び（３５）に記載されているように、ここで考えたｐ４２の断片化は、ヒトにおけるマラリアの急性形態の主たる原因であるP.falciparum（P.falc iparum）に拡張され得、P.cynomolgiとP．vivaxの２種の構成配列の領域I、II、 III及びIVを分離する領域の位置がP.falciparumで既に同定された対応部位との相似性によって決定された場合にはなおさらである。より具体的には、本発明は、有効成分として、グリコシル化されていてもされていなくてもよい組換えタンパク質であって、その必須構成ポリペプチド配列が：・領域II及び、必要ならば、領域IIIの全てまたは一部が欠失させられたｐ４２の配列か；・対応する寄生虫による生体内(in vivo)で寄生虫血症を阻害する免疫応答を誘発しうる断片の部位の配列か；・上記ｐ４２断片もしくは断片の上記部位の免疫学的に等価なペプチドの配列であり、上記組換えタンパク質が還元培地中で不安定で、対応するマラリア原虫に対して形成されたヒト抗血清によって認識されるエピトープの大部分を好ましくは構成するエピトープの高次構造を更に含む、ヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫に対するワクチン組成物を提供する。そして、より詳細には、本発明は、免疫原性組成物、特にワクチンを構成するために上述の領域Ｉと領域IVの必須部分を双方とも含み、ｐ４２から由来する、グリコシル化されていてもされていなくてもよい組換えタンパク質を提供する。必要ならば、グリコシル化されていてもされていなくてもよい上記の組換えタンパク質は、ｐ１９に近い、ｐ３３のＣ末端側に位置する領域IIIの保存部分、特にアミノ酸２５５から２７３までの間、あるいはより詳細には、アミノ酸２５５から２７０の間の部位（図４の共通領域の番号付けを参照のこと）を含む。換言すれば、領域IIIの少ない保存部分の全てもしくは一部は領域IIIのＮ末端から欠失されうる。便宜上、以下では、「部分的に欠失されたｐ４２」で上記の修飾されたｐ４２を示すものとする。このようなエピトープの高次構造の存在は、ワクチンの活性成分の保護効果において重要な役割を果たしている。それらは、特に、バキュロウイルス系で産生された場合、上で規定した他の特徴を示す、特別な活性成分は全て他の部位に見出される。必要ならば、「バキュロウイルスベクター系」という表現は、バキュロウイルス型ベクター自身と株化細胞、特にこれらの細胞系に導入された導入配列が発現するように修飾されたバキュロウイルスとこれに感染可能な昆虫の細胞により構成される集合体を意味する。バキュロウイルス系におけるこれら２つのパートナーの好ましい例は、Longacreらの論文（１９）に記載されている。同じ系を以下の実施例において使用した。もちろん、バキュロウイルスとバキュロウィルスが感染する細胞の変異体を、選択したものに代えて使用することができることは言うまでもない。還元培地中でのエピトープの高次構造の不安定性は以下の実施例に記載されている試験、特にβ−メルカプトエタノールの存在下の試験により証明することができる。この観点から、Longacreらにより産生された組換えタンパク質（１４）を以下のような組成で使用することができる。S.Longacreらは、特に、使用したバキュロウイルスの、ポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターのコントロール下に、 Plasmodium vivaxのＭＳＰ−１のｐ１９をコードするヌクレオチド配列を組み込み、これを昆虫細胞[Spodoptera frugiperda(Sf９)系]に感染させ、培養し、組換えｐ１９を産生することに成功したことを思い起こすべきである。使用されたバキュロウイルスベクターのポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターのコントロール下に、以下に記載するペプチド配列をコードする配列を導入した：・ポリヘドリンシグナル配列の５’末端３５塩基対の断片で、このタンパク質の発現を開始するメチオニンコドンを（ＡＴＴに）変異されたもの；・ＭＳＰ−１シグナルペプチドを含み、ＭＳＰ−１のＮ末端部位に対応する３２アミノ酸残基から成るペプチドをコードする５’末端ヌクレオチド断片：・ｐ１９をコードするヌクレオチド配列あるいはPlasmodium vivaxのＭＳＰ−１タンパク質のｐ４２をコードするヌクレオチド配列の何れかで、場合に応じて、ヌクレオチド配列の３’末端領域を備え（「固定」形態）または欠失し（可溶形態）た配列。この発現産物のＣ末端側は、最終産物であるｐ１９タンパク質を寄生虫膜へ固定する際に本質的役割を担うと考えられている；・２つの終止コドンＴＡＡ。ｐ４２の、ＭＳＰ−１のＣ末端領域に由来する配列は、Ａｓｐ１３２５からＬｅｕ１７２６（固定された形態）か、Ｓｅｒ１７０５（可溶性の形態）までで、ｐ１９では、その配列はＩｌｅ１６０２からＬｅｕ１７２６（固定された形態）か、Ｓｅｒ１７０５（可溶性の形態）までで、上に示されたｐ４２またはｐ１９の完全なアミノ酸配列は、開始から末端アミノ酸までP．vivaxのベレム（Belem ）単離体で配列決定された遺伝子であることがわかる（２０）。同様の結果が、同じベクター系において、三日熱マラリア原虫Plasmodium cyn omolgiのｐ４２およびｐ１９をコードするヌクレオチド配列を使用して得られた。P.cynomolgiにおける興味は２倍である：これはマカクに対して感染性であるP .vivaxに非常に近い寄生虫種である。またこれはヒトにも感染可能である。さらに、天然系におけるP.cynomolgi由来のＭＳＰ−１の保護効果を検証するために、P.cynomolgiの自然宿主、アカゲザルおよびトクマカクへの感染も可能である。アカゲザルはヒトの免疫応答に対応する最も代表的な種の一つであると考えられる。特に、２つの組換えポリペプチド：P.cynomolgi由来の可溶性ｐ４２と、可溶性ｐ１９は、それそれバキュロウイルス系で産生され、未変性のＭＳＰ−１タンパク質の対応領域を認識するモノクローナル抗体を使ったアフィニティカラム上で精製され、トクマカクを用いて実施したワクチン接種試験により、特に可溶性ｐ１９では優れた結果が得られた。次の観察がなされた：ｐ１９のみ（３匹のサル）とｐ１９とｐ４２の併用（３匹のサル）で免疫化された６匹のサルは、全て、抗原投与感染後、現実的にはほとんど免疫性を示さなかった。ｐ４２で免疫化された３匹のサルにおいて得られた結果にも有意の差はなかった。３匹のうち２匹は上述した通りであるが、３匹目は、免疫化されていないサル（３匹）またはフロイントアジュバントの存在下でＰＢＳ緩衝液とともに免疫化された対照（３匹のサル）よりもより低い寄生虫血症を示したため、あまり明確ではなかった。 P.cynomolgi由来の組換えｐ１９とｐ42を組み合わせて導入したバキュロウイルス系中で産生された組換えポリペプチドを用いて、マカクで実施した特に効果的な試験結果から、他のプラスモディウム属由来の組換えｐ42をそれぞれ含む組換えポリペプチドが同様に挙動しなければならないことが示された。これらは、「人工宿主」においてP．vivaxまたはP．falciparum行われた試験結果よりも、ヒトにおけるマラリアに対して、より意味がある。Ｃ末端ＭＳＰ−１タンパク質（ｐ42）由来のバキュロウイルス組換えタンパク質は、ヒトに対するＭＳＰ−１の保護効果を評価する最も代表的なモデルを構成する、天然系において非常に有意な抗マラリア保護効果を奏する。ｐ４２の形態が、ワクチン接種された患者が多くの多型性に直面する自然の状況において有害となりうる効果を持つｐ４２のＮ末端部位の高頻度可変領域が除去されたものである場合は、得られる保護効果はさらに改善される。しかしながら、領域II及び領域IIIの全てもしくは一部の欠失は通常は最良の結果をもたらす。当業者であれば、対応するｐ４２の領域ＩとIV間の融合タンパク質、あるいは更には２つの異なった種のマラリア原虫からの２つのｐ４２から、それぞれに由来する領域Ｉと領域IVを融合させたタンパク質でさえ産生しうることは明らかである。これらの融合タンパク質が、最も良好に保存されたものから選ばれた、領域IIの部分、好ましくは領域IIIに対応する結合エレメントを含むことができることは言うまでもない。例として、ｐ３３のＣ末端ポリペプチド配列は、それが存在するときは、５０未満のアミノ酸残基、あるいは３５未満、あるいは更には１０未満のアミノ酸残基を含む。部分的に欠失されたｐ４２タンパク質のポリペプチド配列は、ｐ１９が寄生虫から保護する抗体を誘発する能力を維持するならば、(領域IVあるいは)ｐ１９をコードする配列の全てを含む必要はない。特に、「断片部分」の分子量は１０から２５ｋＤａ、好ましくは１０から１５ｋＤａである。おそらくは、このポリペプチド断片部分は、２つのＥＧＦ（上皮細胞成長因子）領域の少なくとも一方を含む。本発明の組換えタンパク質の領域Ｉにも当然同じ知見が当てはまる。明らかに、当業者であれば、活性断片ともはやそうではないものとを、ｐ42をコードする断片のエキソヌクレアーゼによる切断時間を変えるか、または適当な制限酵素との反応により、ｐ42をコードする配列から得られた断片からそれぞれ単離したｐ42由来の長さの異なる挿入断片を含む修飾ベクターを産生することによって実験的に識別することができる：ついで対応の修飾ベクターにより形質転換し、保護効果を呈する対応の真核細胞、特に昆虫細胞におけるこれら挿入断片による発現物質の能力を、特に以下の実施例において記載される実験条件下で試験することができる。特に、これら挿入断片の発現物質は、対応する寄生虫全体によって生体内で誘導される寄生虫血症を阻害することができるものでなくてはならない。しかして、本発明は、活性成分の必須構成ポリペプチ配列が、他のものによる所定のアミノ酸配列の付加、欠失もしくは置換が、修飾ペプチドの寄生虫血症阻害能力に大きな変化をもたらさないことを前提として、上述した断片により得られるものに等価な細胞および／または体液型免疫学的応答を誘導しうるペプチド −以下「免疫学的等価ペプチド」と称する−により構成される全てのワクチン用組成物を含む。また、部分的に欠失されたｐ４２は、対応寄生虫により生体内で通常誘発される寄生虫血症を阻害する能力を変化させないで増大させるならば、当然に、Ｎ末端側またはＣ末端側で、またはペプチド結合を介して、ワクチン増強作用を持つ更なるマラリア原虫のタンパク質断片（例えば、特にシステインに富んだある領域を持つP．falciparum(３０)および(３１)由来のＥＢＡ−１７５、あるいは P．vivax(２９)由来のダフィー(Duffy)結合タンパク質）に結合していてもよい。また、部分的に欠失したp42あるいはその一部をコードする断片のＮ末端上流に、異なるペプチド配列、例えばＭＳＰ−１タンパク質に対するもののような、使用シグナルペプチドのＣ末端断片を含むことができる。この配列は、５０アミノ酸残基末満が好ましい、例えば10から35のアミノ酸を含む。これらの知見は、例えば他のマラリア原虫、特にマラリアの最も深刻な状態の一つの原因であり、寄生虫の優性種であるP．falciparum由来のｐ42にも同様に当てはまる。しかしながら、バキュロウイルス系においてP．vivaxまたはP.cynomolgi由来の組換えｐ42を産生するための上に要約した技術では、単に免疫保護試験の実施を可能にする程のかなりの量を得ようとするのであっても、満足のいく収量でP ．falciparumの組換えｐ42の産生を変化させないように導入するのは困難である。本発明は、この問題を大部分解決するための方法をまた提供する。さらにバキュロウイルス系の発現ベクターにおけるPlasmodium falciparumのｐ42をコードする自然ヌクレオチド配列を合成ヌクレオチド配列を使用して置換し、非常に高い収率でP．falciparum−および同様の困難性を有する他のマラリア原虫−のｐ4 2を得ることが可能になり、該合成ヌクレオチド配列は、同じｐ42をコードするが、自然ヌクレオチド配列よりもヌクレオチドのＧおよびＣの割合が高いことを特徴とする。ヌクレオチド合成によってＤＮＡを合成し、遺伝コードが許容する場合は常に、天然配列のｐ42をコードする部分を天然のコドン以上のＣおよび／またはＧ濃度を有する合成コドンによって置換して同様のアミノ酸をコードする遺伝コードを提供するものを選択することでこの結果が得られることは当業者に明らかである。したがって、配列が上述のように部分的に欠失させられたｐ４２まで同じ知見が拡張されうることとなる換言すれば、本発明は、バキュロウイルス系においてｐ42をコードするヌクレオチド配列の発現が、これらバキュロウイルス中に通常含まれ感染宿主細胞で発現する自然ヌクレオチド配列に対して観察されるように、バキュロウイルスにより形質転換可能な宿主細胞の「細胞機構」で発現するヌクレオチド配列の連続したコドンの適合性の改善と明らかに関連しており；よって、本来のP．falciparu mヌクレオチド配列は全く発現しないか、ほとんど発現せず；falciparumのｐ42 をコードするのヌクレオチド配列のものよりもＧおよびＣの量が比較的より高いため、Longacreら（１４）により観察されたバキュロウイルス系のP．vivaxのｐ 42、および発明者がまた示したように、本来のｐ42ヌクレオチド配列から改変したP.cynomolgi配列のｐ42に対する効果的な発現の説明が可能となる。しかして、本発明は、より一般的には、バキュロウイルス系に摂取されうるシグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を、ベクターに含有され、ベクターにより移入可能な細胞により認識されうるプロモータのコントロール下で、含む組換えバキュロウイルス型修飾ベクターであって、第１のものの下流にあって、またプロモーターのコントロール下で・ｐ４２、または、領域IIと場合によっては領域IIIの一部または全てが欠失したｐ４２をコードするペプチド断片の配列；・バキュロウイルス系における第２配列由来の発現物質が、対応寄生虫による寄生虫血症を生体内で阻害しうる免疫応答を誘導しうる場合には、該ペプチド断片の一部；・上記断片の上記一部または上記ｐ１９ペプチド断片により得られるものと同様の細胞および／または体液型免疫学的応答を誘導する上記免疫学的に等価なペプチドの能力に大きな変更を生じないアミノ酸の付加、欠失もしくは置換した上記Ｃ末端ペプチド断片（ｐ１９）もしくは前記断片の一部と免疫学的に等価なペプチド；のペプチド配列をコードし、前記ヌクレオチド配列が、必要に応じて、それを構成しているヌクレオチドの全体の４０％から６０％の範囲、好ましくは少なくとも５０％ＧおよびＣのヌクレオチド含有量を有することを特徴とする。この配列は、本来のコドンに対応する翻訳を変えることなく（ペプチド配列を維持して）Ｇ／Ｃに富んだコドンに変化している合成遺伝子を作ることによって得ることができる。合成ＤＮＡにより与えられるヌクレオチド配列は、本来の翻訳配列の特徴を保持しながら、すなわちアミノ酸配列を維持しながら、ｃＤＮＡまたは本来の遺伝子配列に対し少なくとも１０％の修飾コドンを有しうる。産生された組換えペプチド−あるいは免疫学的に等価なペプチド−のアミノ酸配列が修飾されても、特に以下に記載する試験において、形成された組換えタンパク質の免疫学的特性または保護特性の消失にならない場合には、ＧおよびＣヌクレオチド含有量がさらに増大されうることを排除するものではない。これらの知見は、ヒトに感染性である他のマラリア原虫、特に、本来のヌクレオチド配列がバキュロウイルス系における有効な発現とあまり適合性のないＴおよびＡのヌクレオチド含有量を持つ対応ｐ42をコードするものにも当然適用される。使用されるシグナルをコードする配列は、関連したマラリア原虫の本来の配列と通常結合したものでありうる。しかし、それは、他のマラリア原虫、例えばP ．vivaxまたはP.cynomolgiまたはそれがバキュロウイルス系におけるシグナルとして認識されうるならば他の生物体からでも得ることができる。考慮中のベクターにおいてその断片またはｐ42をコードする配列は、ある場合は、由来している寄生虫への未変性タンパク質の固定配列が剥奪されており、その場合、発現したタンパク質は一般的に培地中に排出される（可溶性の形態）。また本発明は、コードする配列が、通常、それが発現する宿主の細胞膜への末変性タンパク質の固定を引き起こすｐ１９の疎水性Ｃ末端配列をコードする３’ 末端配列を含むベクターに関する。さらに、この３’末端領域は、使用したバキュロウイルス系の宿主の細胞膜に産生した組換えタンパク質の全体を固定する配列をそれがコードする場合に他の生物体由来の、あるいはP．vivaxからの３’末端配列に例えば対応する、可溶性のｐ42部分をコードする配列に対して異種性でありうる。このような固定配列の例としては、Spodoptera fruglperda(３２)型昆虫の細胞で発現可能なＣＤ５９抗原のＧＰＩ（３２）またはＣＤ１４ヒトタンパク質のＧＰＩ（３３）がある。またさらに本発明は、当然組換えタンパク質にも関連しており、これらタンパク質は対応マラリア原虫に対して形成されるヒト血清が認識するエピトープの高次構造を含む。一般には、本発明は、それがエピトープの高次構造、例えばバキュロウイルス系で産生されたもの、特に還元培地中で不安定なものを含む場合には、上述した型の任意の組換えタンパク質に関する。また本発明は、もちろん、特にバキュロウイルス系で使用される細胞宿主への、固定領域を持つ形態であるか、可溶性の形態であるかにかかわらず、前記組換えタンパク質にも関する。また、本発明は、上述のp４２または部分的に欠失したp４２と、割く朕の生産に用いられる担体分子、たとえばポリリシン−アラニンとの、共有あるいは非共有結合によるあらゆる抱合生成物をカバーする。これらを用いるワクチン組成物もまた本発明の一部を形成する。またさらに、本発明は、Plasmodium vivax由来のタンパク質を含む、これらのオリコマー様、または抱合した組換えタンパク質を使用するワクチン用組成物にも関する。また本発明は、上述した組換えタンパク質がアジュバント、例えばミョウバンと混合した組成物を包含する。それらが産生された細胞膜への固定を許容するＣ末端領域を含む組換えタンパク質は、有利には、ワクチン産生に適切なリポソームを形成しうる脂質と組合わせて使用される。限定するものではないが、例えば J．Delattreらによる「リポソーム：技術的、生物学的および薬理学的アスペクト(Les liposomes aspects technologique，biologique et pharmacologiqus)」（INSERM社、1993年）と題された刊行物に記載されている脂質を用いることができる。適切にワクチン接種をすれば、相同の固定領域であろうと異種の固定領域であろうと、組換えタンパク質に固定部位が存在すると、特に高い保護活性を有しうる細胞親和性抗体、特にＩｇＧ_2aおよびＩｇＧ_2bの産生がマウスにおいて促進され、このように構成されたワクチンの活性成分を脂質以外のアジュバントと会合させて、リポソーム形態にすることは不要になる。リポソームは、冷貯蔵せずに貯蔵および移送することができ、ある条件下で凍結乾燥も可能なので、これは大きな利点である。本発明の他の特徴は、以下に記載する本発明の組換えタンパク質の実施例およびそれらを産生可能な条件から明らかになるであろう。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを意図はしていない。ＰｆＭＳＰ１_p19Ｓ（可溶性）（P．falciparum由来の可溶性ｐ１９）の構造の記載組換え構成体ＰｆＭＳＰ１_p19Ｓは、８塩基対のリーダー配列と、Ｍｅｔ₁からＡｓｐ₃₂までのPlasmodium vivax由来のＭＳＰ−１の最初の３２アミノ酸残基［ベレム単離体：Del Portilloら、1991、P.N.A.S、88、4030］に対応し、ＥｃｏＲＩ切断部位により２つの断片が連結しているＧｌｕＰｈｅが続くＤＮＡを含む。これに、図１に記載され、Ａｓｎ₁₆₁₃からＳｅｒ₁₇₀₅までのPlasmodium falci parumのＭＳＰ１_p19をコードする合成遺伝子が続く[Uganda-Palo Alto単離体：C hangら、1988、Exp.Parasitol、67、1]。構造体は２つのＴＡＡ終止コドンで終了する。この構造により、感染した細胞からの培養上清に分泌された組換えタンパク質が生じる。同じ方法で比較するために、ChangらによりExp.Parasit．(67、１；1989)に記載されたP．falciparum株(ＦＰＵ)の対応ＤＮＡを直接コピーしたものからなるコード配列を使った以外は、上述したｐ１９を産生させたのと同様の条件下で組換え構造体を産生した。遺伝子のコピー（アスパラギン１６１３からセリン１７０５）は、ＰＣＲに本来の遺伝子から合成した。図１Ａは合成遺伝子（Ｂａｃ１９）と「本来の遺伝子」（ＰＦ１９）の両方の配列を示している。これから、P．falciparum由来のｐ１９をコードする本来の配列９３コドンのうち５７コドンが修飾された（５５はコドンの３番目のヌクレオチド、他の２つのコドンは１番目および３番目（２番目では？）のヌクレオチド）ことが分かる。上述した条件下でシグナルペプチドを導入し、クローニングのためのＥｃｏＲＩ切断部位を導入するために５’末端に新規のコドンが加えられ、また同様に発現終止信号を入れるために、P．falciparump19に存在しなかった２つの終止コドンが加えられた。連続するコドンの上部に付けた個々の文字は、連続する各アミノ酸に対応する。星印（＊）は終止コドンを示している。２つの配列が同一の場合はヌクレオチドを垂直線で示している。ＰｆＭＳＰ１_p19Ａ（固定ＧＰＩ）（P．falciparumの固定ｐ１９）構造の記載ＰｆＭＳＰ１_p19Ａ構造は、合成配列（図１Ｂ）が、２つの終止コドンＴＡＡが続くＡｓｎ₁₆₁₃からＩｌｅ₁₇₂₆までのPlasmodium falciparumのＭＳＰ１_p19（ Uganda−Palo Alto単離体）をコードすることを除けば、上述の特徴を有していた。この構造により、感染した細胞の原形質膜に、グルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）型構造体によって固定された組換えタンパク質が生じる。図１Ｃは、シグナル配列を切断する前のＰｆＭＳＰ１_p19Ｓ組換えタンパク質の配列を表す。図１Ｄは、シグナル配列を切断した後のＰｆＭＳＰ１_p19Ｓ組換えタンパク質の配列を表す。図１Ｃおよび１Ｄにおいて下線が付されたアミノ酸残基は、（シグナル配列を有する)P．vivaxのＭＳＰ−１のＮ−末端部とP．falciparumのＭＳＰ−１_p19由来のヌクレオチド配列を連結するためのＥｃｏＲI部位をもつ。図２−免疫親和性により精製された可溶性の組換えＰｆＭＳＰ１_p19抗原を、 β−メルカプトエタノールの存在（還元）下または非存在（非還元）下でＳＤＳ −ＰＡＧＥし、免疫ブロット法により分析した。２％のＳＤＳの存在下でサンプルを９５℃まで加熱した後ゲル上に添加した。これらの条件下では、共有結合( ジスルフィド架橋)のみが非凝集化に抗しうる。左手のブロットは未変性ｐ１９の直線状エピトープと反応したモノクローナル抗体で染色した。右手のブロットはPlasmodium falciparumによるマラリアに対して獲得した免疫性を有する患者から生じた１３のヒト抗血清の混合物で染色した。これらの結果は、組換えバキュロウイルス分子の大半が、ヒトの抗血清により認識されるポリマーの形態でエピトープの高次構造を再生しうることを示している。図３−可溶性のＰｖＭＳP１_p42組換え抗原（Longacreら、1994、前掲）をP．f alciparumのメロゾイト由来のタンパク質画分と共存させ、で３７℃で５時間インキュベートし、等電点電気泳動により分離した。ついでサンプルを、β−メルカプトエタノールの存在（還元）下または非存在（非還元）下で免疫ブロット法により分析した。等電点電気泳動画分５ないし１２および界面活性剤の存在下( Ｔｅｘ)または非存在下（Ｔ）で得られた２つの全メロゾイト抽出物が分析された。免疫ブロットはP．vivaxのＭＳＰ１_p42および_p19に特異的なモノクローナル抗体で明らかになった。この結果は、界面活性剤で抽出されうるP．falciparum のメロゾイトにタンパク質分解活性があることを示唆している。ある画分によるｐ４２の消化は、消化物質（ｐ１９）の重合を引き起こすようである：β−メルカプトエタノールが存在すると、約１９ｋＤａの分子（Ｔｅｘ−Ｒ）が優位になって、高分子量の形態のものが消失するため、この重合は、おそらくジスルフィド架橋の形成に関連している。よって、これらの実験で観察されたｐ１９の重合が、生体内でのこの分子固有の性質であると思われる。ＰｃＭＳＰ１_p19Ｓ（可溶性）構造（P.cynomolgiの可溶性ｐ１９）の記載上述した構造体で使用されたＤＮＡは、Plasmodium cynomolgi ceylonesi株のクローンから得られた（２２−２３）。この株はその自然宿主［マカカシニカ（Macaca sinica）］を連続して通過し、蚊を介して循環伝染することにより保持された（２７）。成熟したシゾント段階における血液寄生虫を、寄生虫血症が５％のレベルに達成したときに、感染したサルから得た。ついでそれらを（２５）に記載された方法を使用して精製した。ついでＤＮＡを（２６）で記載されているようにして抽出した。１２００の塩基対の断片を、P．vivac由来の図４で下線が施されているオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ反応を使用して産生した。５’末端オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲI切断部位を含み、３’オリゴヌクレオチドはＢｇｌII切断部位に続く２つの合成終止コドンＴＡＡを含有する。この断片をP．vivaxのＭＳＰ −１タンパク質に対するシグナル配列を既に含むｐＶＬＳＶ₂₀₀プラスミドに、これらＥｃｏＲＩおよびＢｇｌII切断部位を介し、連結反応させて導入した（１９）。新規のプラスミド（ｐＶＬＳＶ₂₀₀Ｃ₄₂）はＤＮＡの塩基配列を分析するために使用した。 P.cynomolgiおよび対応P．vivax配列を並べた。黒い矢印は推定される第１および第２切断部位を示している。それらはP．falciparumの既知の部位との相似性によって決定した（２７、２８）。垂直線および水平矢印は研究された４つの領域の境界に配されている。領域４はP.cynomolgiのＰ１９をコードする配列に相当する。グリコシル化部位を箱で囲み、保護されたシステインに下線を付した。図４の下部はP．vivaxとP.cynomolgiの２つの単離体間での相同性の割合を示している。組換え構造体ＰｃＭＳＰ１_p19Ｓは、８塩基対のリーダー配列と２つの断片を連結しているＥｃｏＲIのためにＧｌｕＰｈｅが続くＭｅｔ₁からＡｓｐ₃₂までの Plasmodium vivax由来ＭＳＰ−１の最初のアミノ酸３２個［ベレム単離体：Del Portilloら、1991、P.N.A.S、88、4030］に相当するＤＮＡを含有する。これにはＬｙＳ₂₇₆からＳｅｒ₃₈₀までのPlasmodium cynomolgiのＭＳＰ１ｐ１９をコードする配列が続く［セイロン（Ceylon）株］。構造体は２つのＴＡＡ終止コドンで終了する。この構造体により、感染した細胞からの培養上清に分泌された組換えタンパク質が生じる。 Plasmodium falciparumのｐ１９を特異的に認識するモノクローナル抗体での免疫アフィニティークロマトグラフィーによる組換えＰｆＭＳＰ１ｐ１９の精製ファルマシア社(Pharmacia)で使用されている手順を詳述した標準的な方法に従い、３ｇの活性化ＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社）に、７０ｍｇのモノクローナル抗体（１９９７年２月１４日にＣＮＣＭ［国立微生物培養菌株保存機関］（フランス，パリ）に登録番号１−１８４６で寄託されたＧ１７．１２ハイブリドーマから得られたもの、；このＧ１７．１２ハイブリドーマはP. falciparumのｐ１９を認識するＩｇＧ２ａ／ｋを産生するＸ６３Ａｇ８６５３ミエローマから構成された）を結合させてクロマトグラフィー用の樹脂を調製した。可溶性のＰｆＭＳＰ１ｐ１９を含有する培養上清を４℃で１６時間、クロマトグラフィー樹脂とともにバッチでインキュベートした。カラムを２０倍量のＰＢＳ（0.05% NP40を含む0.5 M NaCl）で一度、５倍量のＰＢＳで一度、さらに２倍量の10mMリン酸ナトリウムpH6.8で一度洗浄した。溶離は0.2MのグリシンpH2 .2 30mlで行った。溶出液は1Mリン酸ナトリウムpH7.7で中和し限外濾過により濃縮し、ＰＢＳで透析した。吸着したＰｆＭＳＰ１ｐ１９を精製するために洗浄液および溶出液の全てに、0.1%の３−(ジメチル−ドデシルアンモニオ)−プロパンスルホネート［フルカ（Fluka）社］を補足的に加えた。リスザルSaimiri sciureusにおけるP．vivaxの組換え（ｐ４２およびｐ１９）ＭＳＰ１のワクチン接種試験このワクチン接種試験は、雄で脾臓摘出されていない２から３才のSaimiri sc iureus boliviensisモンキーについて行った。３匹のサルに、免疫アフィニティーで精製した、それそれ約５０から１００μｇの可溶性の組換えＰｖＭＳＰ１_p4 ₂ および_p19（１９）の混合物を、３週間の間隔で３回筋肉注射して感染させた。完全（ＦＣＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を次のように使用した：第１回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：１；第２回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：４；第３回目の注射：ＦＩＡ。ついでこれらのアジュバント組成物をＰＢＳ中で抗原と１：１で混合した。５匹の対照サルは、同様のプロトコールを用いてE．coliで産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ) を抗原として投与した。抗原投与後の感染は、最終の注射後２．５週間適応させたPlasmodium vivax株（ベルム）に感染した２×１０⁶の赤血球細胞を注射することにより行った。なすりつけ標本をギムザ染色ご検査することにより全ての動物における寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。図５の曲線は、測定された寄生虫血症発症率の変動を、感染後の経過時間（日数）の関数としての血液１マイクロリットル毎の寄生された赤血球の数（縦座標は対数尺）として示している。曲線Ａは３匹のワクチン接種されたサルにおいて観察された平均値に相当し;曲線Ｂは５匹の対照サルにおける平均値に相当する。図は、ワクチン接種により、寄生虫血症を大きく減少させる効果があることを示している。トクマカクMacaca sinicaにおけるPlasmodium cynomolgiの組換え（ｐ４２およびｐ１９）ＭＳＰ１のワクチン接種試験１５匹の捕獲したサルを次のように使用した：（１）３匹に１００μｇの可溶性のＰｃＭＳＰ１_p42を注射した；（２）３匹に３５μｇ（第１回目の注射）または５０μｇ(第２回目および第３回目の注射)のＰｃＭＳＰ１_p42を注射した；（３）３匹にＰｃＭＳＰ１_p42および_p19の混合物を注射した；（４）３匹にアジュバントとＰＢＳを注射した：（５）３匹には何も注射しなかった。上述の実験手順では、完全および不完全フロイントアジュバントを使用した。注射は筋内注射で４週間の間隔をおいた。抗原投与後の感染は、最終の注射後４週間適応させたPlasmodium cynomolgiに感染した２×１０⁵の赤血球細胞を注射することによりなされた。ギムザ染色で寄生虫血症を検査することにより全ての動物における寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。４００のなすりつけ標本を計数しても寄生された赤血球数細胞がなければ陰性に分類した。寄生虫血症は寄生された赤血球数細胞のパーセンテージとして表した。図６Ａ−６Ｇに得られた結果を示す。それら各々には感染後の時間（横座標に日数）の関数として、抗原投与動物において観察された寄生虫血症発症率(縦座標の対数尺に沿って寄生された赤血球細胞のパーセンテージとして表す)を示す。結果は次のものに関する：・図６Ａ：ワクチン接種されていない対照動物；・図６Ｂはフロイントアジュバントを含有する塩類溶液を投与した動物に関する；・図６Ｃは、動物にフロイントアジュバントを投与した結果の相対結果を強調する目的で、図６Ａおよび６Ｂを重ね合わせたもの（変動は明らかに重要ではない）；・図６Ｄはｐ４２でのワクチン接種の終わりに得られた結果を示す；・図６Ｅはｐ１９を単独でワクチン接種された動物に関する；・最後に、図６Ｆはｐ１９とｐ４２の混合物をワクチン接種された動物に関する。ｐ４２は確かにあるレベルの保護度を誘発した。しかしながら、図６Ｅおよび６Ｆに示されるように、本発明の組換えｐ１９により付与される保護度は一層良好であった。遊離のシステインの出現に伴うｐ４２の２つ目の切断により保護度が改善され、試験された３つの種の組換えタンパク質において、この形態の大きな特徴であるｐ１９多重結合体を生じるジスルフィド分子間架橋が形成されるという仮説を述べることができる。グラフ（６Ａ−６Ｆ）を作成するために使用された数を図６Ｇに示す。 P.cynomolgiトクマカクでのワクチン接種試験；対照体およびｐ１９を単独でワクチン接種したサルの二回目の抗原投与後の感染（図８）他のワクチンを接種しないで６ケ月後、ＦＣＡ／ＦＩＡとともに、ｐ１９ＭＳＰ−１を単独で投与した３匹のマカク（図６Ｅ）、フロイントアジュバントを含む塩類溶液を投与した３匹のマカク（図６Ｂ）、および２匹の新たな感染をしておらず、ワクチン接種もされていないサルに、Plasmodium cynomolgiに感染させた１×１０⁶の赤血球細胞を注射することにより新規の抗原投与感染をさせた。ギムザ染色によるなすりつけ標本の検査により全ての動物における寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。４００のなすりつけ標本を計数しても寄生された赤血球数細胞がなければ陰性に分類した。寄生虫血症を寄生された赤血球細胞のパーセンテージとして表した(グラフ８Ａ−Ｃを作成するために使用した図は図８Ｄである)。６ケ月前に抗原投与した６匹の免疫化された動物からは、１日で０．００８％の寄生虫血症発症率を示した各グループ１検体を除き、検出可能な寄生虫血症はみられなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。影響を受けていない２匹の対照体は２１日で最大０．８％の通常の寄生虫血症を示した（図８Ｃ）。よって、最初の抗原投与による免疫後、寄生虫血症がないかまたは非常にわずかであるにもかかわらず、１回目の抗原投与後の感染で、完全に通常の感染を示す３匹の対照体より、ＭＳＰ−１ｐ１９をワクチン接種された３匹の動物は、６ケ月間以上保護されていた。これらの結果は、ｐ１９の保護期間は少なくとも６ケ月であることを示唆している。 P.cynomolgiトクマカク系におけるミョウバンと混合したｐ１９でのワクチン接種試験（図９）先の正の保護結果は完全（ＦＣＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を使用することにより得られた。しかしながら、現在ヒトにおいて許容されている唯一のアジュバントはミョウバンである。このため、アジュバントとしてのミョウバンの存在下で、トクマカクにP.cynomolgiのＭＳＰ−１ｐ１９のワクチン接種試験を行った。６匹の捕獲したマカクを次のように使用した：（１）３匹の動物には２０ｍｇのミョウバンと５０ｍｇのP.cynomolgiの組換えＭＳＰ −１ｐ１９を４量注射した；（２）３匹の動物には１０ｍｇのミョウバンと生理水を４回注射した。注射は筋内注射を４週間の間隔でおこなった。最後の注射の４週間後、P.cynomolgiに感染した２×１０⁵の赤血球細胞を注射することにより感染させた。ギムザ染色によるなすりつけ標本を検査することにより全ての動物における寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。４００のなすりつけ標本を計数しても寄生された赤血球数細胞がなければ陰性に分類した。。寄生虫血症発症率を寄生された赤血球数のパーセンテージとして表した。この実験の結果は次の通りであった。抗原投与後の感染は、ミョウバンと組換えｐ１９とで免疫化された３匹のマカクのうち２匹は、ミョウバンと生理水とで免疫化された３匹の対照マカク（図９Ｄ）よりも、感染期間中、全寄生虫血症発症率が約３０倍少なかった（図９Ａおよび９Ｂ）。ｐ１９で免疫化された３匹目のマカク（図９Ｃ）は対照とあまり違わなかった。図９に記載されている、トクマカクMacaca sinicaにおけるPlasmodium cynomolgiのｐ１９を使用するワクチン接種試験については、グラフ（９Ａ−９Ｄ）を作成するために使用したデータを（図９Ｅ）に与える。結果は、先の結果（図６、８）よりもあまり著しいものではないが、かなりの保護度がミョウバンと組換えＭＳＰ−１について観察されるのはこれが初めてである。図１０：リスザルにおけるPlasmodium falciparumの組換えｐ１９を用いたワクチン接種試験捕獲状態で飼育された約３才のSaimiri sciureus guyanensis(リスザル)２０匹を次のように使用した：（１）４匹の動物に、次のようにフロイントアジュバントの存在下で５０ｍｇの可溶性ＰｆＭＳＰ−１ｐ１９を注射した：第１回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：１；第２回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：４；第３回目の注射：ＦＩＡ。ついでこれらのアジュバント組成物をＰＢＳ中で抗原と１：１で混合した；（２）２匹の対照動物には、ＰＢＳのみを（１）に記載されたようにしてフロイントアジュバントと接種した；（３）４匹の動物に１０ｍｇのミョウバン［Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、セルバ社（Serva）］の存在下で５０ｍｇの可溶性ＰｆＭＳＰ−１ｐ１９を注射した；（４）２匹の対照動物にＰＢＳのみを１０ｍｇのミョウバンと注射した；（５）４匹の動物に、次のようにしてリポソーム中で再生された約５０−１００ｍｇのＧＰＩ固定化ＰｆＭＳＰ−１ｐ１９を注射した：３００ｍｍｏｌのコレステロールと３００ｍｍｏｌのホスファチジルコリンを真空乾燥させ、１．４ｍｇのＰｆＭＳＰ−１ｐ１９、ＧＰＩを有するＰＢＳにおいて３３０ｍＭのＮ−オクチルグルコシドに再懸濁させた。この溶液を吸着性のバイオビーズ・ＳＭ−２［バイオ・ラッド社（Bio-Rad）］を用い、ＰBSに対して透析し、形成されたリポソームを遠心分離して濃縮し、ＰＢＳに再懸濁させた。第１回目の注射は４℃に保たれた新鮮なリポソームで行ない、第２回目および第３回目の注射は保存のために凍結されたリポソームで行った；（６）２匹の動物に、（５）に記載されたようにｐ１９，ＧＰＩ抗原の不在下で、同様の方法で作製された対照リポソームを注射した；（７）２匹の動物に、生理水を注射した。４週間の間隔で３回の筋内注射を行った。Plasmodium falciparum に感染した１×１０⁶の赤血球細胞を注射することにより抗原投与後感染させた。ギームザ染色によるなすりつけ標本を検査することにより全ての動物における寄生虫血症発症率を毎日測定することで保護度を評価した。寄生虫血症発症率は寄生赤血球数のパーセンテージとして表した。このワクチン接種試験の結果を図１０，Ａ−Ｇに示す。抗原投与による感染後、リポソームまたはフロイントアジュバントとｐ１９で免疫化されたグループは対照グループと同様の寄生虫血症を示した（フロイントアジュバントとｐ１９でワクチン接種した１匹の動物（２９番）はワクチン接種と関連のない理由（心臓停止）で抗原投与後数日で死亡した）。これら２つのグループ（貧フロイントエマルション、凝結リポソーム）における抗原投与は不規則で、これらの結果の有意性を完全に評価することはできなかった。ミョウバングループでは、感染期間中、２匹の動物は対照の約４倍少ない全寄生虫血症発症率を示し、１匹の動物は約３倍未満、および１匹の動物は対照と同様であった。対照における変異性、おそらく抗原投与感染に使用された寄生虫株がカイエンヌ（Cayenne）でごく最近開発された脾臓未摘出Saimiriモデルに十分適合していなかったために、この実験を説明することは少し困難である。しかしながらミョウバンとの実際の効果は、不十分ではあるが、現在のところ我々の抗原はミョウバンと組み合わせときに効果を示しす唯一のP．falciparumの組換えＭＳＰ−１であると思われる。リスザルにおけるPlasmodium falciparumの組換えｐ１９を用いたワクチン接種試験（図１０と同じ試験）捕獲状態で飼育されたサルに、次のようにして、４週間の間隔で２回、１ｍｌの接種物を筋内注射した：（１）４匹の動物に、以下のようなフロイントアジュバントの存在下で５０μｇの可溶性ＰｆＭＳＰ１ｐ１９を注射した：第１回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：１；第２回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：４；ついでＰＢＳ中で抗原と１：１で混合した；（２）４匹の動物に、１０ｍｇのミョウバンの存在下で５０μｇの可溶性ＰｆＭＳＰ１ｐ１９を注射した；（３）４匹の動物に、１：１モルのコレステロールとホスファチジルコリンからなるリポソーム中で再構成された約５０μｇのＧＰＩ固定化ＰｆＭＳＰ１ｐ１９を注射した。動物は第２回目の注射後１７日間飼育した。 P．falciparumによる寄生虫血症発症率３０％のリスザルからの赤血球(多くは成熟した形態)をＰＢＳで洗浄し、残査を２％ＳＤＳおよび２％ジチオスレイトールの存在下で８倍に希釈し、９５℃で加熱後、７．５％(分離ゲル)および４％（濃縮ゲル）のポリアクリルアミドゲル上に添加した。ニトロセルロース膜に移した後、免疫ブロット分析を次のようにして抗血清で行った：（１）フロイントアジュバントと可溶性のＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種した、４匹のサルの抗血清プールを２０倍希釈；（２）ミョウバンアジュバントと可溶性のＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種した、４匹のサルの抗血清プールの２０倍希釈；（３）リポソームと固定化ＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種した、４匹のサルの抗血清プールの２０倍希釈；（４）５０ｍｇ／５０ｍｌの、ＰｆＭＳＰ１ｐ１９の直線状エピトープと反応するモノクローナル抗体；（５）P．falciparumを繰り返し感染させた約２０匹のサル由来のＳＨＩ９０抗血清プール。これはP．falci parumでの続く感染により影響を受けなくなった。５００の希釈、（６）影響を受けていない（P．falciparumにさらされたことがない）抗血清プール、２０希釈。結果は、ＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種されたサルの３つの抗血清プールがより成熟した形態のものを含む寄生抽出物中に存在する、非常に高分子量の複合体（濃縮ゲルに拡散）と強く特異的に反応したことを示した。これらの結果は、ＰｆＭＳＰ１ｐ１９の特定の凝集体が、特にオリゴマーの形態で、バキュロウイルス系中で合成される組換えＰｆＭＳＰ１ｐ１９分子に再生産されるエピトープを含んで生体内で存在するという仮説を支持している。図７もまたこれらの結果を示している。図７は、ゲル上にできた免疫ブロットを示している。初めの３レーンは、ｐ１９を［（１）フロイントアジュバントとの、（２）ミョウバンとの、（３）リポソームの形態での］注射したサルの生体内での応答、特に、成熟段階（ｐ４２がｐ１９とｐ３３に切断される時）に特有の、オリゴマーの形態で生体内のｐ１９が凝集するという仮説を支持する高分子複合体の存在を示している。またこのワクチン接種試験は先の注射と同一の３回目の注射を含む。フロイントアジュバントでの注射はＦＩＡのみを含む。各々のグループには２匹の対照動物：すなわち、ＰＢＳとフロイントアジュバントとを注射した２匹の対照動物；ＰＢＳとミヨウバンとを注射した２匹の対照動物；タンパク質を含有しないリポソームを注射した２匹の対照動物；およびアジュバントを含有しないＰＢＳを注射した２匹の対照動物；がいる。保護度は上述したようにして評価した。図７Ｂ：この図のデータは、リスザルP．falciparum／ワクチン接種試験（図１０下）から得られた。番号は図１０に記載されている個々のサルに対応する。この図の技術と方法は、各々のサルの抗血清が、試験注射の日に３回注射した後に試験されたこと、およびＳＨＩ抗血清が１：２５０まで希釈されたことを除けば、図７と同様である。ｐ１９とミョウバンをワクチン接種した４匹のサルの抗血清はかなりの高分子量複合体と強く特異的に反応するが、ｐ１９およびフロイントアジュバントまたはリポソームをワクチン接種した他のグループのサルは、これらの複合体と少ししか反応性を示さなかった。また、ｐ１９とミョウバンをワクチン接種されたサルが最も保護されていたため、この高分子量複合体との反応性は、グループの１匹のサルは対照体に対して保護されておらず、他のものが部分的にのみ保護されているにもかかわらず、保護効果を示すものであると思われた。本発明は、限定する性格のものではないが、もちろん、他の応用、例えばある実施例に関連して以下に記載されるものにも関している。治療組換え分子ＰｖＭＳＰ１ｐ１９は、死の危険性があるP．falciparumによる深刻なマラリア感染を治療するための受動的な転移に使用可能な特異的抗体を産生するのに使用することができる。診断バキュロウイルス由来の組換え分子ＰｖＭＳＰ１ｐ４２、ＰｖＭＳＰ１ｐ１９およびＰｆＭＳＰｐ１９は、特異的なネズミ科のモノクローナル抗体を産生させるために使用することができ、使用された。これらの抗体は、他の種、例えばウサギまたはヤギ由来のポリクローナル抗ＭＳＰ１ｐ１９抗血清と組合せて、一般的に致命的とはならないP．vivaxによるマラリアと、致命的となりうるP．falci parumによるマラリアとを識別することができるマラリアの半定量診断試験の基礎を形成しうる。この試験の原則は、血中のｐ１９タンパク質を含む全てのＭＳＰ−１分子を捕捉し、定量することである。この点において、組換えｐ４２、特に部分的に欠失した組換えｐ４２の利点は、次の通りである：（ｉ）それらは同一種毎に、異種のマラリア原虫由来の抗体、特にP．falciparu mとP．vivaxに対するものが交差反応を生じないよう異なる種の間は十分に分散して保存されており、（ｉｉ）バキュロウイルス由来の組換えＭＳＰ１ｐ１９分子は、未変性構造のＭＳＰ１ｐ１９の多くを再生するようであるので、これらのタンパク質に対して産生される抗体は診断用途によく適している。以下に同定されている微生物は、次の登録番号で、１９９６年２月１日にブタペスト条約の規則６．１に従って寄託された：同定参照符号登録番号ＰｖＭＳＰ１ｐ１９Ａ１−１６５９ＰｖＭＳＰ１ｐ１９Ｓ１−１６６０ＰｆＭＳＰ１ｐ１９Ａ１−１６６１ＰｆＭＳＰ１ｐ１９Ｓ１−１６６２ＰｃＭＳＰ１ｐ１９Ｓ１−１６６３また本発明は、好ましくは混合物中に当初から含有されるｐ１９型ペプチドを精製するための、（例えばアフィニティークロマトグラフィー用の）固体状の支持体に固定されたこれらの抗体の用途に関する。精製とは、この混合物を抗体と接触させ、抗原−抗体複合体を解離させ、精製されたｐ１９型ペプチドを回収することを意味する。次の請求の範囲であまり保存されていない部分または領域IIIの部分でｐ４２が欠失していると述べている場合、それらは、好ましくは少なくとも１０のアミノ酸を含み、P.vivax、P.cynomolgiおよびP.falciparumの保存率が７０％未満（これらと整列したとき１０のアミノ酸中同一なものが７より少ない）の領域である。ｐ４２を認識するものとして提供される本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、好ましくは、領域IV自体を除いて領域IV以外の領域をより特異的に認識するものである。好ましくは、それらはｐ４２の領域Ｉを認識する。また、本発明はPlasmodium vivax以外のヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態のＭＳＰ−１タンパク質のｐ４２を選択的に認識し、Plasmodium vivaxを認識しない特異的な抗体を分泌するハイブリドーマに関する。特にこれらのハイブリドーマはPlasmodium vivaxを認識せず、Plasmodiumfalc iparumのｐ４２を特異的に認識するモノクローナル抗体を分泌する。さらに、本発明はP.vivaxのｐ４２およびP.cynomolgiのｐ４２を特異的に認識する特異的抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマに関する。Ｆ１０− ３ハイブリドーマが、Plasmodium vivaxのｐ４２糖タンパク質を認識するＩｇＧ２ｂ／ｋを産生するＸ６３Ａｇ８６５３ミエローマから構築された。さらに本発明は、タンパク質または断片の混合物、特に次のタイプ：・P.falciparumのｐ４２とP.vivaxのｐ４２；・P.falciparumｐ４２とP.falciparumのｐ１９；・P.vivaxのｐ４２とP.vivaxのｐ１９；・P.falciparumのｐ４２とP.falciparumのｐ１９、およびP.vivaxのｐ１９とP.v ivaxのｐ４２；の混合物をさらに含有するワクチン用組成物に関する。上記の組成物の全てにおいて、必要ならば、ｐ４２は、その高頻度可変領域が除去されている。例として、ｐ４２に通常含まれるｐ１９断片のものに対応する領域は、それ自体部分的に欠失され、この領域がこのｐ１９に通常含まれる２つのＥＧＦの少なくとも一つを含む。これは、領域II、あるいは領域IIIのＮ末端領域または領域IIIの全てでさえ欠失してもよい。本発明はヒトのワクチンの製造に限定されるものではない。本発明は哺乳動物に感染性である寄生虫由来の抗原または対応タンパク質を用いる家畜用ワクチン組成物の製造および同様の条件下での製品にも適用することができる。さらに、同様のタイプの感染であるバベシア病がウシ、イヌ、およびウマにも現れることが知られている。バベシア種の抗原の一つは、ＭＳＰ−１のタンパク質の一部と高い高次構造的相同性（特に、２つのＥＦＧ様体とシステインに富んだドメインにおいて）と機能的相同性を有する［（３６）、（３７）および（３８）］。このような寄生虫に対して可溶性の抗原を使用する家畜用ワクチンの例は開示されている（３９）。これらの混合物に使用されるｐ42が、単離で検討される場合に、上述したように修飾されうることは言うまでもない。文献（１）Holder，J.A.ら（１９８２），「モノクローナル抗体と免疫血清により認識されるPlasmodium falciparumのシゾント抗原の生合成とプロセシング」、J.E xp.Med.、第１５６巻：１５２８−１５３８頁。（２）Howard，R.ら（１９８４），「成熟細胞内トロフォゾイドおよびシゾントの表面における主なPlasmodium falciparumの糖タンパク質の局在性」、Mol.Bio chem.Parasitol.、第１１巻：３４９−３６２頁。（３）Pirson，P.ら（１９８５），「Plasmodium falciparumメロゾイトの表面抗原のモノクローナル抗体での特性化」、J.Immunol.、第１３４巻：１９４６− １９５１頁。（４）Aley，S.B.ら（１９８７），「Plasmodium vivax：血液段階シゾントに対するモノクローナル抗体により認識される赤血球シゾント」、Exp．Parasitol. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (72)発明者ロス，チャールズフランス国Ｆ―92500 リュイユ・マルメゾン，リュ・ジュヌビエーブ・クチュリエ，18，Ｃ／Ｏアニエリモン (72)発明者ナト，ファリダバノフランス国Ｆ―92160 アントニー，リュ・ミラボー，65 (72)発明者バーンウェル，ジョン，ダブリュアメリカ合衆国ニューヨーク 10012, ニューヨーク，ワシントンスクウェアビレッジ３，アパートメント 10Ｄ (72)発明者メンディス，カミニスリランカ国コロンボ８，ピー・オー・ボックス 271，キンゼイロード

Claims

【特許請求の範囲】１．必須構成ポリペプチド配列が：・領域II及び、必要ならば、領域IIIの一部又はより多くの部分、特に少ない保存部分が欠失させられた、ヒトに感染性のマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表面タンパク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の４２キロダルトン（ｐ４２）断片の配列か；・対応する寄生虫によって生体内で正常に誘発される寄生虫血症を阻害しうる該断片の部位の配列か；・又は上記ｐ４２断片もしくは断片の上記部位によってつくりだされるものに等価な細胞性又は体液性の免疫学的応答を誘発しうるぺプチドの配列である組換えタンパク質であって、還元媒体中で不安定で、対応するマラリア原虫に対して形成されたヒト抗血清によって認識されるエピトープの大部分を構成するエピトープの高次構造を含みうる組換えタンパク質。２．ｐ４２に正常に含まれるｐ１９断片の領域に対応する領域がそれ自体部分的に欠失せしめられ、該領域が、このｐ１９に正常に含まれる２つのＥＧＦ領域の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求恒１に記載の組換えタンパク質。３．ｐ１９断片の上記部分の分子量が１０から２５ｋＤａの範囲、特に１０から１５ｋＤａの範囲にあることを特徴とする請求項２に記載の組換えタンパク質。４．ｐ４２の領域Ｉ及び領域IVのポリペプチド配列の双方の必須部分を含み、領域IIが欠失させられていることを特徴とする請求項１に記載の組換えタンパク質。５．ポリペプチド配列が、領域IIが欠失させられたｐ４２のポリペプチド配列であることを特徴とする請求項４に記載の組換えタンパク質。６．領域IIIのＮ末端領域又は領域IIIの全てが欠失させられた請求項５に記載の組換えタンパク質。７．配列がｐ４２の配列に正常に含まれるｐ１９断片を、上記組換えタンパク質が発現される宿主細胞、特に真核生物細胞、好ましくはバキュロウィルスによる感染性の昆虫の細胞に固定させるタイプのグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）を含むことを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載の組換えタンパク質。８．組換えタンパク質が発現される宿主、特に真核生物細胞、好ましくはバキュロウィルスによる感染性の昆虫の細胞の細胞膜への上記組換えタンパク質の固定の誘発を介在する極度に疎水性のＣ末端部分が除去されていることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の組換えタンパク質。９．水溶性であることを特徴とする請求項８記載の組換えタンパク質。１０． Plasmodium.falciparumのMSP-1タンパク質の一部が欠失した上記ｐ４２配列もしくは対応する断片の上記部分を含むことを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の組換えタンパク質。１１． Plasmodium.cynomolgiのMSP-1タンパク質の一部が欠失した上記ｐ４２配列もしくは対応する断片の上記部分を含むことを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の組換えタンパク質。１２． Plasmodium.vivaxのMSP-1タンパク質の一部が欠失した上記ｐ４２配列もしくは対応する断片の上記部分を含むことを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の組換えタンパク質。１３．ワクチンの製造に使用する担体分子に抱合されていることを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の組換えタンパク質。１４．請求項１から１３の何れか１項に記載の組換えタンパク質を有効成分として含む、ヒト感染性のマラリア原虫型寄生虫に対するワクチン組成物。１５． Plasmodium.vivax以外のヒト感染性のマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態のＭＳＰ−１タンパク質のｐ４２を特異的に認識し、Plasmodium.vivaxを認識しない抗体。１６． Plasmodium.vivaxを認識しないことを特徴とする請求項１５記載の特異的抗体。１７． P.falciparumのｐ４２を特異的に認識することを特徴とする請求項１５記載の特異的抗体。１８． P.vivaxのｐ４２を特異的に認識することを特徴とする請求項１５記載の特異的抗体。１９． P.vivaxによる寄生虫感染と他のマラリア原虫による寄生虫感染とを区別する鑑別診断方法において、マラリア原虫に感染した生物学的試料を請求項１８記載の抗体と請求項１６又は請求項１７記載の抗体に接触させ、場合に応じて免疫学的反応の生起又は非生起を検出することを特徴とする診断方法。２０．ベクターに含まれてベクターによって形質転換されうる細胞によって認識されうるプロモーターの制御下で、バキュロウィルス系において用いることができるシグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む組換え体バキュロウィルス型修飾ベクターにおいて、また上記プロモーターの制御下で、少なくとも一部分がペプチド配列：・必要ならば領域II、及び、また必要ならば、領域IIIの一部又はより多くの部分、特によく保存されない部分が欠失させられた、ヒト感染性のマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表面タンパク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の４２キロダルトン（ｐ４２）Ｃ末端断片の配列か；・バキュロウィルス系の第２の配列からの発現物が対応する寄生虫によって生体内で正常に誘発される寄生虫血症を阻害しうる場合には、該ペプチド断片の一部の配列か；・上記ペプチド断片ｐ４２もしくは上記ペプチド断片部位によってつくりだされるものに等価な細胞性又は体液性の免疫学的応答を誘発しうるペプチドの配列、をコードする第１の配列より下流の第２の配列を含み、上記ヌクレオチド配列が、構築されているヌクレオチドの全体の４０％から６０％、好ましくは少なくとも５０％の範囲のＧ及びＣ量を有することを特徴とするベクター。２１．上記第２のポリペプチド配列が請求項２から９の何れか１項に記載されたものに一致することを特徴とする請求項２０記載の修飾ベクター。２２．第２のヌクレオチド配列が合成配列である請求項２０記載の修飾ベクター。２３．第１のヌクレオチド配列がPlasmodium.vivaxからのシグナルペプチドをコードし、マラリア原虫ＭＳＰ−１タンパク質と正常に会合することを特徴とする請求項２０から２２の何れか１項に記載の修飾ベクター。２４．第２のヌクレオチド配列が、特にバキュロウィルスによる感染性の昆虫の細胞に発現される宿主の細胞膜への上記組換えタンパク質の結合の誘導に関係する疎水性Ｃ末端配列の３’末端が欠失せしめられたことを特徴とする請求項２０から２３の何れか１項に記載の修飾ベクター。２５．修飾バキュロウィルスからなることを特徴とする請求項２０から２４の何れか１項に記載の修飾ベクター。２６．請求項２０から２４の何れか１項に記載の修飾ベクターによって形質移入可能で、形質転換された生物であって、特にＳｆ９型昆虫細胞。２７．少なくとも一部分が、・領域II及び、必要ならば、領域IIIの一部又はより多くの部分、特によく保存されない部分が欠失させられた、ヒトに感染性のマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表面タンパク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の４２キロダルトン（ｐ４２）断片の配列か；・対応する寄生虫によって生体内で正常に誘発される寄生虫血症を阻害しうる該断片の部位の配列か；・又は上記ｐ４２断片もしくは断片の上記部位によってつくりだされるものに等価な細胞性又は体液性の免疫学的応答を誘発しうるペプチドの、ペプチド配列をコードする第１ヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、構築されているヌクレオチドの全体の４０％から６０％、好ましくは少なくとも５０％の範囲のＧ及びＣ量を有する合成ＤＮＡ。２８．第１のヌクレオチド配列が、特にバキュロウィルスによる感染性の昆虫の細胞で発現される宿主の細胞膜への、ｐ４２のものに配列が含まれるｐ１９タンパク質の固定の誘導において正常に関係付けされた疎水性Ｃ末端配列の３’末端が欠失せしめられたことを特徴とする請求項２７記載の合成ＤＮＡ配列。２９．第１のヌクレオチド配列は、主配列に対して相同性あるいは非相同性を持つマラリア原虫ＭＳＰ−１タンパク質と正常に会合したシグナルペプチドをコードするシグナルヌクレオチド配列を先に有することを特徴とする請求項２７又は請求項２８記載の合成ＤＮＡ配列。３０．シグナルペプチドがP.vivax由来であることを特徴とする請求項２９記載の合成ＤＮＡ配列。３１．上記第１のヌクレオチド配列が、ポリペプチド細胞膜固定領域をコードする３’末端配列を含み、上記固定領域が、上記合成ＤＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞の膜表面に発現された組換えタンパク質を固定し、上記３ ’配列が主ヌクレオチド配列のものと相同であるか、特にP.vivaxからのものと非相同であることを特徴とする請求項２７から３０の何れか１項に記載の合成ＤＮＡ。３２．３’末端配列がP.vivax由来であることを特徴とする請求項３１記載の合成ＤＮＡ。３３．上記３’末端配列が欠失せしめられていることを特徴とする請求項２７から３１の何れか１項に記載の合成ＤＮＡ。３４．請求項１５から１８の何れか１項に記載の抗体の特性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。３５．ペプチド混合物から所定の特異性を持つｐ４２ペプチドを分離する方法において、好ましくは不溶性担体に既に固定された請求項１５から１８の何れか１項に記載の対応抗体に上記ペプチド混合物を接触させ、ついで形成された抗原 −抗体複合物を解離させ、精製されたｐ４２ペプチドを回収することを特徴とする方法。３６．マラリア原虫感染に対して免疫応答を誘発しうる免疫原組成物を調製するための、請求項１から１２の何れか１項に記載のタンパク質の使用。３７．請求項１から１３の何れか１項に記載のタンパク質と、該タンパク質が由来するものと相同性を持つ寄生虫から由来する対応のｐ１９あるいは他の組換え体ｐ４２又はｐ１９型タンパク質の何れかとの混合物を活性成分として含むワクチン組成物。３８．活性成分の混合物が、次の混合物：・P.falciparumｐ４２とP.vivaxｐ４２；・P.falciparumｐ４２とP.falciparumｐ１９；・P.vivaxｐ４２とP.vivaxｐ１９；・P.falciparumｐ４２とP.falciparumｐ１９、かつP.vivaxｐ４２と．P.vivaxｐ１９；から選択され、必要ならばｐ４２はその最も高頻度の可変領域が欠失せしめられていることを特徴とする請求項３７記載のワクチン組成物。３９．登録番号Ｉ−１８４６で１９９７年２月１４日にＣＮＣＭに寄託されたことを特徴とする請求項３４記載のハイブリドーマ。