JPS63503512A - 新規ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ワクチン 本発明は、ワクチンとして投与した場合、マラリアに対する免疫χ誘導できるタ ンパク質に関する。

マラリアは、全世界７通じて、保健上ま′ｆま丁重要な問題となってきている。

数体の人々がこの病気に罹患していて、寄生原虫類ｐ１ａｓｍｏａ１ｕｍ　ｆａ ｌｃｉｐａｒｕｍによって起こる最も急性の病型では、アフリカだけでも年間、 百方Å以上の小児が死亡している。

寄生原虫類、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの生活環は複雑で、 完結するには、蚊と哺乳類宿主、ヒトＹ必要とする。ヒトへの感染は、感染した 蚊の唾液中の種虫の液洩によって始まる。槙虫は肝臓に移動し、肝細胞に感染し 、外界血球細胞内段階ン経て、メロゾイト期に分化する。すなわち、血液にと９ ついて無世血液期の循環複製χ開始する。生活環は、血液中で有性期配偶子母細 胞に分化して完結する。これが蚊に摂取芒れると消化管内において一連の段階乞 経て発育して種虫、乞生じ、これが唾液腺に移動する。

マラリアの免疫の機構も複雑であるが、抗体および細胞性成分の両者が関与して いるものと考えられている。種虫勘に、この供物の異面は、免疫優性反復エピト ープ乞含有する単一タンパク質、環種虫タンパク質（ｃｉｒｃｕｍａｐｏｒｏｚ ｏｉｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　、Ｃ８Ｐ　）で覆われている。この型に対する防御 をもたら丁抗体の役割は、反復に対する抗体が伝染性を消滅芒セ、肝細胞への侵 襲χ遮断するという事実によって確認嘔れている種の株で一定であることが明ら かにちれ、反復構造は合成的にもまた組換え技術によっても裏遺された。無性期 にはもつと複雑で、寄生虫は免疫系と相互に作用する多くのタンパク質乞産生す る。高分子物質でめる１８［のタンパク質（メロゾイト表面における主要抗原の 前駆体）は、動物モデルで無性期に免疫乞誘導することが示されている。この糧 類の抗原は、検討した限りの全種のマラリアに存在し、ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ ｍでは分子量約１９５．０００である（ポリアクリルアミドグ９ル電気泳動で測 定）。このタンパク質は以下ｐ、　１９５プによってクローン化δれ、構造が決 定δれているブラジルのｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ単離体で、この遺伝子は、 縦に反復するテトラペプチドＡｓｎ　−Ａｌａ　−Ａｓｎ　−ｐｒｏ　（す２− 　）　Ａ　）が３７回くり返し、４個の小リピートＡｅｎ−Ｖａ１−Ａｓｐ−Ｐ ｒｏ　（リピートＢ）が散在する中央領域を含￥１する。多分、この反復配列が 強い免疫原で、抗種虫免疫乞誘導するものと思われる。アメリカ合衆国では、合 成抗種虫ワクチンの第１相臨床試験が進行中である。このワクチンはＡ）遺伝子 の中央反復領地からの３２個の免疫優性テトラペプチドリピー）Ｙ含む組換えタ ンパク質、またはＢ）　３個のテトラペプチドリピートからなる合成ペプチドの いずれがである。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのデータから、種虫の抽出物へのモノクローナル抗体の結合 χ阻害するのに必要な合成または細菌発現テトラペプチドの最小の数は６である こと９５８．１９８５）。最後に挙げたグループは、１６゜３２および４８縦列 コピーとフレーム外Ｔｅｔｒ遺伝子の６２個のアミノ酸のＮ末癩融合タンパク質 としてＣ８Ｐ　Ｙ発現した。細菌性構築体の基本的単位は１６個の９１６−）’ ４コードするＣ８Ｐ遺伝子のフラグメントであった。３２または４８ｍのリピー トを含む精製タンパク質はアジュバントなしでマウスに高い抗体力価ン誘発した が、１６個のリピート乞もつタンパク質は抗原性の発現にメヨウバンまたはフロ イントの完全アジュバン）　（ＦＣＡ　）　Ｙ必要とした。組換えタンパク質に 対する抗体は生存種虫とｃｓｐで反応し、ｉｎ　ＶｉｔｒＯでヒト肝癌細胞の侵 襲乞はぼ完全に遮断した。これらの所見は、抗体力価が種虫感染に対する免疫と よく相関アルコと（Ｎａｒｄｉｎほか：Ｊ、Ｅｘｐ０Ｍｅｄ、　１５６　：２０ ゜１９８２）から、組換え抗種虫ワクチンの使用は有効である可能性を示唆し、 今日までに試験された丁ぺてのｐ、ｆａｌｃｊｐａｒｕｍ単離体は免疫優性Ａｓ ｎ　−Ａｌａ　−Ａａｎ　−Ｐｒ。

リピート７含んでいる（　Ｗｅｂｅｒ　＆　Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ　：　Ｍｏｌ。

糖タンパク質であるＰ−１９５（ａＯＷａｒａ　、Ｒ６Ｊ、ほか：　Ｍｏｂ、　 １３１ｏｃｈｅｍ、ｐａｒａｓｉｔｏｌ、±１　：　３４９．１９８４）は、こ の寄生虫のシゾント内部で合成てれ、内界血球段階の来期にこの抗原はタンパク 分解処理を受けてフラグメントに分離する（　Ｈｏ１ｄｅｒ　＆　Ｆｒｅｅｍａ ｎ　：　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｏａ、１５６　：１５２８．１９８２）。メロゾイト（内界血球段階の末期に 血漿中に放出逼れる）の異面上で、タンパク質は完全に処理嘔れ、分子量約８３ ．０００．４２．０００および１９，０００の６個の分離フラグメントが存在し 、ポリクローナル抗Ｐ、１９５抗体によって認識てれる。これらの３種のフラグ メントがメロゾイトの主要表面抗原でおり、ヒト免疫系によって強力に認識てれ る（　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　）（Ｏｌａｅｒ　：　Ｊ。

Ｐ、　１９５のクローニングおよび免疫学的データは、ヨーロッパ特許出願第８ ５３０１１７３．２号に記載されている。

種虫のワクチンだけでの問題のひとつは、種虫および血液期は抗原的に独特であ って、種虫１００チの中和に失敗すると肝臓の感染を生じ、最終的には全面的な マラリア感染７生じる。同様に、血液期のみに対するワクチンでは、肝臓から起 こる完全なマラリア感染Ｚ避けることはできない。

本発明は、Ｃ８Ｐおよび血液期抗原の両フラグメントからなる組換え、抱合タン パク質がｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの生活塊の種虫および血液期の両者に対する免疫 を誘発できることの発見に基づくものである。

丁なわち、本発明は、第一の態様として、薔生ＰｌａｅｍｏａｉｕｍのＣ３Ｐお よび血液期それぞれの抗原の少なくとも１種のエピトープからなる組換え、抱合 タンパク質を提供するものである。

本明細曹において用いられる゛エピトープ”の語は、免疫原分子の免疫原決定基 ヲ意味する。免疫原決定基とは、適当な型で与えられた場合、感染しＪＰすい動 物に保護免疫応答ン誘発できる分子立体配置からなる。

このようなタンパク質を含有するワクチンにはいくつかの利点である。第一に、 種虫の段階に対する免疫応答の産生に万一失敗しても、その結果生じる初期血液 感染は、この段階に対する抗体による寄生体の制御および抑制が増大して、著し く低下する。この第二の応答がなければ、侵入寄生体丁べてによって徹底的な侵 攻ン受けた筈である。肝細胞の侵襲に成功した各種虫は、肝スキゾントが分裂し たとき数万のメロゾイトを生じるので、種虫生存能の低下は中程度であっても初 期血液感染に劇的な作用乞もたらす。

第二に、接種圧が寄生体に抗原変異乞導く場合があり、１価のワクチンは有用で なくなることがある。このようなＣとが２回起こって２価のワクチンが無効にな る確率は無限に小芒くなる。

本発明によるタンパク質ン含有するワクチンの他の利点は、精製□２個の別個の タンパク質からなる２価ワクチンでは２回の別個の精製２要し、望ましくない不 純物が残存する機会が倍になる；製造−１種のタンパク１Ｋｔｘ合成するために は１種の生物乞培養丁ればよいが、２種では倍の設備が必要になる；受容菌への 利点−細菌の場合みられることが多い付加的タンパク質配列は望ましくないが組 換えタンパク質の通常避は難い部分であって、最小限に保つべきでらる−に関連 したものである。１種のタンパク質のみが必要な場合は、付加的配列の存在は低 下する。

本発明は、さらに別の態様として、ｐ１ａｅｕｉｏａ１ｕｍ種がｐ、　ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍである上述の組換え、抱合タンパク質乞提供する。

で、旅行者が防御乞要するのはこの棟に対してである。

本発明はまた、血液期抗原成分はＰ、　１９５でおる上述の組換え、抱合タンパ ク質ン提供する。

上述のように、試験により、Ｐ、１９５はワクチンとして投与した場合マラリア に対する免疫ン誘発できることが明らかにちれている。本発明はさらに別の態様 として、血液期抗原成分はＰ、　１９５の天然フラグメント、たとえば４２　ｋ Ｄフラグメント、とくに４２ｋｌ）フラグメントのＣ末端である上述の組換え、 抱合タンパク質を提供する。

ヨーロッパ特許出願第８５０４４２９号に記載芒れているように、Ｐ、　１９５ はｉｎ　ｖｉＶｏにおいて、サイズが約８３ｋＤ、４２ｋＤおよび１９　ｋＤの 各７ラグメ。

ントに切断される。この４２　ｋＤフラグメントはとくに保護免疫応答に関連が おるようで、それはそのＣ末端から誘導でれる配列において顕著である。

本発明は芒らに、Ｃ８Ｐエピトープを含む最短の配列が、Ａ（ｎ＋１）、Ａ　（ ｎ）　ＢＸＢＡＢＸＡＢＡ、　ＢＡ　（ｎ）　（式９式％ ｎは≧２である）の群から選ばれる上述の組換え、抱合タンパク質を提供する。

上述のタンパク質はワクチンの剤型として提供されるのが有利である。したがっ て、本発明は、別の態様において、ワクチンの剤型とした上述のタンパク質に関 する。

本発明の本質はまた、上述のタンパク質をコードするのに必要なりＮＡ配列にあ ると理解てれる。

したがって、本発明は、上述のタンパク質乞コードするＤＮＡ配列ン提供する。

本発明のＤＮＡ配列は、所望の抗原ンコードする天然の配列に相当するものであ っても、またそのような配列の突然変異型に相当するものであってもよい。可能 な突然変異には、１個または複数１固の塩基の置換、欠失、挿入および逆位が包 含きれる。しかしいずれにしても、Ｃ８Ｐおよび血液期抗原それぞれの少なくと も１個ずつのエピトープを、陽性または陰性いずれかの意味において、常にコー ドする配列を含有するものである。

ＤＮＡ操作技術は必ずしも所望のペプチドに相当てるＤＮＡ配列を生じさせるの が便利ではないので、本発明のＤＮＡ配列は所望のペプチドフラグメン）より長 いまたは短いペプチド乞コードするものであってもよい。

丁なわち、Ｐ、１９５のフラグメントをコードするＤＮＡはたとえば、そのフラ グメントの最初の６０個のアミノ酸χコードしなくてもよいし、また先行するフ ラグメントの最後の６０個のアミノ酸乞（適当ならば）嘔うにコードするもので あってもよい。

本発明は芒らに別の態様において、本発明のＤＮＡ配列配列社有非病原ウィルス 乞提供する。これは、マラリアに対する免疫ン、感染の可能性があるを椎動物に 付与するために使用できる。

このような免疫は、宿主のウィルスによる感染後、ウィルスが複製し、本発明の タンパク賃金包含する、それがコードするタンパク質乞産生することにより生じ る。細胞からウィルスが放出すれば、免疫タンパク質も放出され、免疫が効果的 に生じる。予めタンパク質を合成するなと高価につく過程は必要なく、単にウィ ルスを繁殖場セればよい。

本発明はまた、任意の他のワクチンと一緒にまたは個々に投与でき、他の感染に 対する免疫ン付与できる、上に定義したような非病原ウィルス乞提供する。

本発明の他の態様は、宿主によって翻訳可能な遺伝子のアミノ末端コード部分に 縦列に結合した本発明のＤＮＡ配列、および所望によりその関連制御配列含金■ する発現ベクターを提供する。

本発明のδらに他の態様においては、宿主ペプチドおよび上に定義した組換え、 抱合タンパク質からなる融合タンパク賃金提供する。

本発明は別の態様において、適当な宿主内で翻訳可能でおり、所望により適当な 制御配列を備えた遺伝子からなり、それに本発明のＤＮＡが挿入嘔れ、宿主ペプ チド乞コードする遺伝子の部分と挿入ＤＮＡが適当な宿主中での発現により正し く翻訳嘔れて上述のような融合タンパク質を産生するように改めた発現ベクター を提供する。

すなわち、本発明はさらに上述のようなりＮＡ乞金含有るベクターを提供する。

さらに、本発明は、上述のようなりＮＡ配列を含有し、それが宿主によって翻訳 可能な遺伝子のコード部分および所望によりその関連制御配列に縦列に結合した 発現ベクター乞提供する。

本発明のδらに他の態様によれば、本発明は、本発明のＤＮＡ配列からなるクロ ーニングベクターで宿主細胞乞形質転換し、この宿主細胞を培養して上述のタン パク質ン発現δセる方法乞提供する。

本発明のδらに他の態様によれば、本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含有するベ クターを提供する。

本発明のさらに別の態様においては、本発明は、本発明のＤＮＡ配列ン含有し、 δらにそのＤＮＡ配列の発現を調節する１種もしくは２種以上の制御配列乞含有 するベクター乞提供する。

本発明はδらに他の実施態様として、上述のタンパク質または所望によりそれが 別のペプチド配列に共有結合したタンパク賃金合成するにあた９、ａ）　Ｐｌａ ｅｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからＣＤＮＡまたはｒツムＤＮＡライブ ラリー７作成し、 ｂ）　ｃｓｐおよび血液期抗原のプローブを選択してそのプローブ？放射活性と し、 Ｃ）このプローブ乞用いてライブラリーの１または２以上のメンバーを選択し、 ｄ）ライブラリーから選ばれたＤＮＡ　Ｙ用いて適当な宿主乞形質転換し、それ ｔ使用して上記タンパク質の発現を行う、 各工程からなる方法を提供する。

さらに本発明の態様には、上に定義したようなワクチンの有効量を、感染の可能 性があるを椎動物宿主に投与すること’Ｙ％徴とする宿主へマラリアに対する免 疫を誘発する方法乞提供する。

本発明のＤＮＡ配列の宿主としてウィルスを使用することができる。たとえば、 感染細胞にヒポサンチンを含有しないメジウム上で生育する能カン付与できない ワクシニアウィルスの株（Ｔｋ−）１用いて組織培養を感染嘔セる。ついで、組 織培養をＴｋ十遺伝決定基に結合した上記ＤＮＡ配列で形質転換する。以後この ウィルスの子孫の一部はこの形質転換配列馨デノム内の挿入体の形でもつことに なる。これらのウィルスは、組織培養細胞にヒポサンチンン欠くメジウム上での 生Ｗ能乞付与する能力によって選択できる。また、ｔｋ−ＤＮＡでトランスフェ クションを受けた細胞中で生育するｔｋ＋ワクシニアウィルスを組換えてｔｋ− 表現型（およびそのＤＮＡ配列）乞取得芒ゼると、これらの組換体は５−ブロモ デオキシウリジンに抵抗性となる。このような細胞ン生育てセ、ついでたとえば ヒト免疫血清を用いてマラリア抗原の産生についてさらに選択する。

新しいワクシニア株は免疫原マラリアタンパク質の産生乞生じるので、このよう なワクシニア株ンマラリアに感染する可能性がある哺乳類動物（ヒ）Ｙ含めて） の免疫感作に使用できる。

Ｃのようなワクチンはまた、他の感染、たとえば痘迫、ジフテリア、Ｂ型肝炎、 狂犬病、単純ヘルペスウィルス、百日咳、ＨＩＶ等に対する免疫ン、適当な免疫 原の導入によって容易に付与できること乞理解丁べきである。

Ｅ、　Ｃ○１１遺伝子遺伝列中性ＤＮＡの断片ン正しい読み取９枠で挿入すると 、アミノ酸配列の一部はＥ、　Ｃ０１ｉ遺伝子から、また一部は挿入ＤＮＡから 誘導嘔れた融合タンパク質を発現嘔七ることができる。適当な制御配列と便利な 制限部位を五する適当な発現ベクターが構築芒れていて、高レベルでの融合タン パク質の発現が可能でおる。

選ばれた発現システムの制限地図および発現１七る配列の検討と翻訳フレームの 知識により、特定のＤＮＡフラグメントン発現ベクター中にリグ９−ジョンし、 ざらに操作ン行うことなく発現１七ることが可能になる。

たとえば、ｐＷＲＬ　５　Ｑ　７はｐＡＴ　１５３およびｔｒｐＥ遺伝子から、 ■ｌｊ遺伝遺伝子ジヌクレオチド１２２６ｇ１１部位に挿入嘔れた合成ＥＣＯＲ ！　−Ｂｇｌ　ｎリンカ−で構築きれたプラスミドである（　Ｎ１ｃｈｏ１８ほ か：Ｊ、Ｍｏ１．　ＢＩＯｌ、、１４６　：４５．　１９８１　）。

適当な制限酵素部位乞用いることにより、上述の一ン化できるが、通常正しい翻 訳フレームではない。

挿入配列を発現芒セるためには、■１工遺伝子と挿入体の間の制限部位に適当な 長さの合成リンカ−乞挿入して、融合タンパク質の正しい読み取り枠での発現２ 起こ嘔七る。別法として、挿入ＤＮＡ　Ｙ含むプラスミド乞バクテリアおよび挿 入ＤＮＡの間の唯一の制限部位で開裂し、ＤＮＡを酵素Ｂａｌ　３　ｌで短時間 処理して線状化ＤＮＡの両端から数塩基ずつｔ除去する。ＤＮＡ　＆　ＩＪメラ ーゼ１の大（フレノウ）フラグメントで修復したのち、プラスミドＹＴ４リガー ゼで再び環化し、細菌の形質転換に用いる。形質転換体３伽中の１ａは、ｔｒｐ Ｅ遺伝子生成物との融合タンパク質として発現する正しい読み取９枠でＤＮＡ配 列を含有するはずである。Ｂａｌ　３１による消化の程度が発現融合タンパク質 の最終的なサイズおよびｔｒｐ　Ｂとその中に含有嘔れろ挿入配列の相対的長嘔 乞決定することは本技術分野の熟練者には明らかなとおりである。芒らに、Ｂａ １３１消化および修復後のリゾ−ジョン時に合成リンカ−乞挿入することにより 、形質転換後の特定の株の解析が容易になる。

特異的訂」限酵素消化とＢａｌ　３１酵素処理ン賢明に利用することにより、マ ラリアタンパク質抗原の任意の特異的領域を融合タンパク質として発現させるこ とができる。

別法として、優先的に一本鎖ＤＮＡ乞分解するヌクレアーゼ＄１ン使用し、Ｂｇ ｌ　ｎ制限部位の粘着端を消化してプラント端ン残丁こともできる。プラスミド を再び環化すると、挿入ＤＮＡは新しい、多分正しい読み取υ枠に置かれる。

ＤＮＡフラグメン）Ｙ発現芒セるための別法では、読み取ジ枠（ＯＲＦ　）ベク ター乞使用し、これに（通常）ＤＮＡの短い断片が多くの場合Ｅ、　ｃｏｌｉタ ンパク質のＮ床端アミノ酸配列乞コードする配列内に挿入できる。

挿入ＤＮＡは正しい翻訳フレームで停止コドンを含んではならず、転写の方向に 関して正しい方向にあり、そして各末端で正しいフレーム内になければならない 。

無作為切断法によって生成したタンパク質フード配列からのＤＮＡ断片について は、正しいフレームで読み通でれる理論的確率は１８分の１である。β−ガラク トシダーゼに基づ（ＯＲＦベクターが報告嘔れている（　ＫＯｅｎｅｎほか：Ｅ ＭＢＯ，Ｊ、、１　：５０９．　１９８２）。

このタンパク質のＮ末端における部位に正しいフレームでＤＮＡ断片を挿入する と、遺伝暗号が読み通されてβ−ガラクトシダーゼタンパク質の発現能が付与嘔 れる。このタンパク質は発色原基’Ｊｔ５−ブロモー４−クロロ−３−インドリ ル−β−Ｄ−ガラクトシド（χｇａｌ　）の加水分解によって検出芒れる。たと えば、コロニー乞生育σゼるアガールにχｇａｐ　’ｌ；ｇ（包含芒ゼでおけば 、官能性β−ガラクトシダーゼ乞発現するプラスミドによる適当な宿主株の形質 転換で青色のコロニーが生じる。このようなベクターのひとつ、ｐｘＹ　４６０ はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子Ｙ　ｔａｃプロモーターの制御下に含有する。Ｄ ＮＡ　Ｙ　ＥｃｏＲ１部位に隣接する３ｍａ　１部位に挿入すると、遺伝子７読 み取り枠での発現に変換できる。ＪＭ　１０５のようなＥ、　ｃｏ１ｉ宿主の形 質転換では、その細菌はアンピシリン抵抗性に変換され、イソプロピル−β−Ｄ −チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＯ）の添加により融合タンパク質の発現が高 レベルで誘導される。

融合タンパク質中の宿主側の配列は、適当なペプチド結合の酵素的または化学的 切断によってその融合タンパク質から切断してもよい。発現したアミノ酸配列ン 調べて、酵素的または化学的切断法ン採用することは、本技術分野の熟練者には 自明のとおりでろる。融合タンパク質発現システム中、マラリアＤＮＡ配列と細 菌遺伝子配列の間に合成オリゴヌクレオチドリンカーを挿入することによジ、発 現融合タンパク質のマラリア配列とその残部の間に酵素または化学的切断に適当 な部位が提供芒れる。この方法で、マラリアクンバク質フラグメント乞宿王ペプ チドから精製するＣとができる。

上述のタンパク質をコードする配列の直接発現は、挿入ＤＮＡ配列乞、それが細 菌の制御領域によって通常転写、翻訳される暗号配列乞置換するように、正しい 読み取り枠でＡＵＧ開始コドンの直後に位置さセることで達成できる。この場合 の制御領域は、開始コドンに対して至適な位置におけるプロモーターおよびリポ ソーム結合部位を包含する。発現さセるＤＮＡは配列は適当な制限部位乞用い、 必要に応じて適当な合成オリゴヌクレオチドリンカー乞使用して、正しく配＊− ｇセる。

挿入ＤＮＡ配列の端に、翻訳を停止さセるため、停止コドンン正しい読み取り枠 で挿入する。転写を停止するため、クーミネーター配列乞添加することもできる 。

発現芒ゼるＤＮＡはｃｓｐおよび血液期抗原の全暗号配列でも、またそれからア ミノ末端シグナル配列乞除去した配列でもよく、好ましくはタンパク質の免疫原 フラグメントに相当する暗号配列の部分である。適当なフラグメントは適当なり ＮＡクローン（ヌクレオチド配列ン論べたのち）を制限酵素消化し、必要ならば 名らにＢａｌ　３　ｉでいずれか一方または両者の末端乞処理してそのＤＮＡ配 列の部分乞制御ちれた方法で消化することにより製造できる。制御てれた消化は 、適当な緩衝液、温度、反応時間および酵素量の選択によって達成ちれる。この 段階で適当な合成リンカ−乞、好ましくは挿入体へのプラント端リゾージョンに よりふ加して、ＡＵ（）開始コドン２与えるか、または発現ベクター中へのリデ ーションン容易にする。

任意のクローン化フラグメントの制御発現は、その配列のいずれかの末端での配 列の使用により、または既知の他の配列の使用により可能になる。このような配 列にはプロモーターおよびエンハンサ−が包含δれる。このようなプロモーター の例としては、坦、ｔｒｐ　、バクテリオファージλｐＬおよびハイブリッドｔ ｒｐ　−１！ＬＣ（ｔａｃ　）　Ｙ挙げることができる。適当なエンハーサーに は５ｖ４０エンハンサ−おヨヒウシ乳頭腫ウィルスからのエンハンサ−がある。

上に述べたベクターは、ＤＮＡのクローニングに適当で、宿主細胞の形質転換に 使用でき、そして適当なタンパク賃金発現できる任意のベクターでよい。このよ うなベクターには、プラスミド、バクテリオファーゾオヨヒコスミドが包含てれ る。ＣＤＮＡのクローニングに使用できるベクターにはｐＵＣ８、ｐＵＣ９、Ｐ ＡＴｉ５３、ｐＢＲ３２５およびｐＢＲ３２８Ｙ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ用に、ｐＢＤ９およびｐＫＴ　４３８　ンＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ ｌｉｓ用に、ｐＭＡ　５６　ｙｘ醇母用に、ｐＡａＤ２６　ＳＶ　（Ａ）　−３ 、ｐｓｖ　２−　ｅＬｈｆｒ　１ＳＶＥＨＡ３および５ＶＬＨＡ　８　Ｙ哺乳類 細胞用に挙げることができる。他の発現系には他のベクターを、たとえばワクシ ニアウィルスおよびバキュロウィルスが昆虫細胞系に使用逼れる。

適当なタンパク質の発現に使用ちれるベクターは上述したような制御配列χ包含 する。このようなベクターとしては、Ｅ、　Ｃ０１ｉ用にｐＸＹ　４６０および ＰＷＲＬ　。

また哺乳類細胞用にｐｓｖ　２−　ｄｈｆｒがある。

上述の方法に使用δれる適当が宿主細胞の例には、バクテリア（たとえばＥ、　 ｃｏｌｌＨＢ　１０１およびＤＨｌ、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　８ｐ、Ｅ３Ｉ）　 １７０およびｌＨ６１４０）のような原核細胞、簿冊（たとえばχＶ６１０−８ ０酵母細胞）、昆虫または哺乳類細胞（たとえばシミアンＣＶ−１細胞）のよう な真核細胞がある。

本発明のワクチンは、上記タンパク質と医薬的に許容される担体からなるのが便 利である。この場合、医薬的に許８でれる担体は、患者に抗原を導入するビーク ルとして使用するのに適した液体メジウムでおる。

このような担体の例としては食塩溶液７挙げることができる。本発明のタンパク 質は溶液、担体中に固体が懸濁された形にするＯともできるし、また医薬的に許 各芒れる界面活性剤２加えて可溶化するＣとも可能でおる。

ワクチンには、免疫応答ン刺激するためのアジュバント２加えて、ワクチンの効 果を増大させることもできる。本発明で使用するのに有利なアジュバントとして は、水酸化アルミニウムケ挙げるＣとができる。

ワクチンはタンパク質を最終濃度０．２〜５　ｍ９／　ｒｕｔ　％好ましくは０ ．５〜２ｍ９７ｍｔの範囲、とくに好ましくは１〜／　ｒｎｌ含有するように調 剤嘔れるのが便利である。

調剤後は、ワクチンＺ滅菌容器に入れ、ついでシールし、低温たとえば４°Ｃに 保存される。凍結乾燥してもよい。

を椎動物宿主にマラリアに対する免疫ン誘発するためには、適当に調剤嘔れたワ クチン１または２用Ｊｉ［乞投与する。１用量はワクチン０．１〜２＃Ｉｔ１好 ましくは０．２〜ｌ　ｍｌ、とくに好ましくはＱ、５ｍｔとすることか薦められ ろ。

ワクチンはワクチン投与に用いられる任意の慣用方法によジ、たとえば非経口的 （たとえば皮下または筋肉内）注射によって投与できる。処置はワクチン１用量 、またはある期間にわたり複数用量とすることができる。

以下の実施例は本発明を単に例示するものであって、いかなる意味においても本 発明ン限定するものでは力い。

以下の実施例の理解を容易にするため、以下の図面を下表に示すような各実施例 の参考に自封した。

図　面　例 １　２および７（Ｃ） ４　７　（Ｃ１および８ ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣ８Ｐ遺伝子をクローニングし、次のように配列 決定した。

合成２１−マーオリゴヌクレオチド、５’　ＴＧＣＡＴＴＴ（）ＧＯＴＴＴＧＣ ＡＴＴＴＧＧ　３’　、リ　ピ　−　ト　ＡＢｎ　−、Ａｌａ　−Ａａｎ　−ｐ ｒ。

の非暗号鎖に相当するヌクレオチドＺ１ムｆａｌｃｉｐａｒｕｍからｃｓｐ遺伝 遺伝子離単離ためのグローブとして使用した。ｒツムＤＮＡ　Ｙホルムアミドの 存在下ヤエナリヌクレアーゼで消化し、遺伝子サイズフラグメント乞生成芒セ（ Ｄａｍｅほか、前出）、そのプローブを用いたサヂン法実験で１．７ｋｂの王た るハイブリダイズフラグメントが示ちれた。このサイズ範囲に消化ｆｉれたＤＮ Ａ乞ベクター１）ＵＣ９中にリゲーションした。約５．０００個の組換え体が得 られ、これらのうち８個が、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドグローブでスクリー ニングした場合、強い陽性のシグナルＺ与えた。

これらの陽性の組換え体の大部分は１，７ｋｂの挿入体を含有した。そのひとつ ｐｃｓｐ　６について芒らに挾肘した。このクローンの部分制限酵素地区作成お よび配列決定により、Ｃ８Ｐ遺伝子ン含むＣとが確認逼れた。

その領域は計４６（３７）のＡリピートおよび６（４）のＢＩＪ１６−）（カッ コ内の数字は発表されたブラジル株での数である）ン含有した。本発明者らの株 では、リピートはＡＢＡＢＡ１５ＢＡ２６の編成であった。ブラジルのり°ロー ンではＡＢＡＢＡＢＡ】５ＢＡ】９であった（　Ｌｏｃｋｙｅｒ＆　Ｓｃｈｗａ ｒｚ　：　Ｍｏ１．１３１ｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　、２２　：１０ １．１９８７）。

例２　：　ａｓｐ遺伝子の部分のβ−ガラクトシダーゼとのト領域と短い隣接配 列ン含ひ５８３　ｂｐフラグメントが得られた。このフラグメン）　Ｙ　ＢＡＬ 　−３１で処理して末端を無作為化し、フレノウで処理し、読み取り枠ベクター ｐＸＹ　４６０の３ｍ＆　１部位にリゲーションした。

この構築体はβ−ガラクトシダーゼとのＮ末端融合としてリピート７発現した。

これらの組換え体のひとつ、ｐｃｓｐ　６００　／　３ンＩＰＴ（）で誘導する と、見掛けの分子量約１４０．０００、ｓＤｓ＆リアクリルアミドデル電気泳動 後の細胞溶解物のクーマツシーブルー染色で検知できる融合タンパク質が生成ち れた。このタンパク質もウェスターンプロット上で、Ｃ３ＰＫ％異的なモノクロ ーナル抗体、および例１０に記載した合成ペプチド−担体抱合体に対して産生じ た抗体と反応した。挿入体とプラスミドベクター接合部の配列は、プラスミド感 作配列決定法によって決定嘔れた（　Ｃｈｅｎ　＆　３ｅｅｂｕｒｇ：ＤＮＡ、 ４：１６５．１９８５）。ＰＣＳｐ　６００　／　５では、挿入体はヌクレオチ ド４２８〜１０１１である。

例３　：　Ｐ、　１９５遺伝子のクローニング、配列決定および発現 この作業は特許出願ＥＰ８５０４４２９Ａ１および述されている。Ｐ、１９５か ら誘導場れたさらに数種のフラグメントがメロゾイトに検出嘔れ、１９ｋｄ種は ４２　ｋｄ種のＣ末端から誘導場れたサブフラグメントであることが明らかにさ れた。芒らに３８．３０および２８　ｋｄのフラグメントが貌察芒れ、はぼ直線 遺伝子配列内に局在した。

例４　：　工ｎ　ｖｉｔｒｏ阻害ア７セイにおけるＰ、　１９５に対する抗体の 影Ｖ：侵入阻止抗体を誘導できるりＰ、　１９５の部分乞発現ベクター内に置き 、β−ガラクトシダーゼまたはアントラニレートシンターゼ融合タンパク質ン生 成芒セた（　Ｈｏ１ｄｅｒほか：Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、１９８７．　＠出 ）。融合タンパク質はウサギに抗体乞産生さセろために使用した。血清から免疫 グロブリン分画’ＹＰ製し、ｐｌａｓｍｏａｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍのｉｎ 　ｖｉ℃ｒｏ培養液に最終濃度約’ｌ　ｍ９７　ｍｌになるように加えた。寄生 体は、８％ヒト血清およびヘマトクリット２％、シゾント０．５％の開始時寄生 体血症の赤血球を補光したＲＰＭＩ　１６４０中で培養した。

ＩｇＧ分画のメロゾイト侵入阻止能は、２４時間後のＱｉｅｍｅ＆染色塗抹標本 中寄生体感染赤血球数乞計数し、ウサギ抗体または昇免疫処置動物からの抗体を 添加しなかった対照培養液の場合と比較してめた。

Ｐ、　１９５配列の最後の（Ｃ末端）の４２０１島のアミノ酸のみ含金’Ｌｒ融 合タンパク質のみが、５０チまで侵入を防止する抗体を誘導した。疎水性末端配 列前の最後の１００＠のアミノ酸を含有する１個の融合タンパク質が、全末端４ ２０アミノ酸ン含有するタンパク質とほぼ同等の効果７有する抗体を誘発した。

例５：組換えタンパク質とメロゾイトによるサルａ）接種に用いた材料 メロゾイトはｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのｉｎ　ＶｉｔｒＯ培養から：１６４ ７．１９８３）。２種のＥ、　Ｃ０１ｉクローン、５０７／４６０　ｐＰｆｃ　 １０２８ＢａｍＨ１−Ｐｓｔ１７４（ｐＭＥ　１１とも呼ばれる）および４６０ 　ｐＰｆｃ　１０２８１）ｄｅ　３−１０　（ｐＭＥｌ　３とも呼ばれる）の融 合タンパク質生成物乞部分精製した。５０７　／　４６０　ｐｐｆｃｌ　０２８ 　ＢａｍＨｌ　−ｐｓｔ　１／４テｔｚ、融合タンパク質はｔｒｐ　ｇ遺伝子生 成物とのハイブリッドで、Ｐ、１９５遺伝子配列中のヌクレオチド４０４６〜５ ２６０から発現するアミノ酸乞含有する（　Ｈｏ１ｄｅｒほか：　ｌＪ＆ｔｕｒ ｅ。

１９８５）。４６０　１０２８Ｄａｅ３−１０では、融合タンパク質はβ−ガラ クトシダーゼとのハイブリットで、ヌクレオチド４９２６〜５２３０から発現す るアミノ酸を含有する。ｔｒｐ　Ｅ融合体は細胞溶解物から、多数の抽出緩衝液 に対するその不溶性に基づいて精製した。ガラクトシダーゼハイブリッドはアフ ィニティークロマトグラフィーによって精製した（　Ｓｔθｓｒｓ　。

ｃｕａｔｒｅｃａｓｅｓ　＆　ｐｏｌｌａｒａ　：　Ｊ、　Ｂｌｏｘ、　ｃｈｅ ｍ、　、２　Ａ　６　：１９６．１９７１）。

ｂ）免疫処置プロトフール ３群の動物を使用した。

群１：陰性コントロール。０．８５　％食塩水ンフロインドのアジュバン）０． ５ｍＺと混合した。Ｑ、２ｍｔ／動物を注射した（３匹）。

群２：陽性コントロール。全寄生体で免疫処置。それぞれＱ、２ｒｎｔ中４Ｘ１ ０’メロシイ）Ｙ含有する２個のバイアルに食塩水を加えて０．５ｍｔとし、フ ロイントのアジュバントＱ、５ｍｔと混合した。０．２　ｍｔ　（１０’メロゾ イト）／動物を注射した（３匹）。

群３：試験群。組換えＤＮＡ法によって製造した試験抗原による免疫処置。食塩 水中各融合タンパク質約１・２　ｍｔ　’を含有するＱ、６ｍｌの浴液ンフロイ ンドのアジュバン）０．６ｍｌと混合した。０．２ｍｔ／動物を注射した（４匹 ）。

この６群の動物を以下に概略７示したヌケジュールに従って免疫処置した。

日０：フロインドの完全アジュバント中抗原での一次免疫処置（筋肉内）。各動 物から５０μｌの血液サンプルン採取し、免疫前抗体価乞測定した。

日１４：各動物から血液サンプル５０μｌを採取し、抗体力価を測定した。

日２８：フロインドの不完全アジュバント中抗原での二次免疫処置（筋肉内）。

日４２；フロイントの不完全アジュバント中抗原での三次免疫処ｔＣ筋肉内）。

各動物から血液サンプル５０μＩＩＺ採取し、抗体力価ン測定した。

日４８：ドナーのサルにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　Ｙ感染 さセた。

日５３：各サル（ドナーン除く）から試験用の血液サンプルン除去 ル赤血球（１０Ｂ　’）の静脈内注射によるチャレンジ感染 日６９：以後、薄い血液塗抹乞必要に応じ毎日または隔日に、サルが回復するま で採取。回復しない動物は、寄生体血症がＩＤ５Ｙ越えた場合、クロロキンの筋 肉注射を行った。

血清サンプルは指示どおりに採取し、その抗体比を分析した。各血清について以 下のスクリーニングヶ実施した。

１）寄生赤血球のアセトン固定塗抹に対する間接免疫螢光 ｉｉ）　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）１１１）精製Ｐ、　１９５タンパク 質（および特異的フラグメント）、メロゾイト抽出物および全血液期原虫の抽出 物に対するウェスターンブロッティング＋Ｖ）　寄生細胞の界面活性剤抽出物か ら３５３−メチオニン標識タンパク質ン免疫沈殿芒セる能力Ｃ）チャレンジの結 果 群１では日７に全動物で寄生が検出され、動物１および２では日１６に、動物３ では８１８にチャレンジ後、クロロキンを投与して実験ン終了した。このとき各 動物の寄生体血症は１０チ以上に上昇していた。

群２では、／１６５の動物１匹で感染の制御に成功し、寄生体血症は１％以上に 上昇セず、日２９からは血液塗抹中に寄生体は検知嘔れなかった。／１６乙の動 物は群１の対照動物と違わない感染経過７示し、日１３にクロロキンで処置した 。第６の動物（４４）では重篤な感染が制御嘔れているように思われ、日１９お よび２０には寄生体血症は低下していたが、日２２に死亡した。

群３では、２匹の動物、／１６９および、％１０で感染の制御に失敗し、それぞ れ、群１の対照の動物腐１およびん３と類似の感染経過７示した。残りの２匹の 動物／１６７と８では、感染が制御ちれた。動物７ではチャレンジ後日１８に− 一りの寄生体血症４チを示したが、日２６以後は血液塗抹に寄生体は認められな かった。

動物８では日１４にピークの寄生体血症２．３チン示したが、日２２には消失し た。

ｄ）免疫処置動物の免疫応答の解析 １）免疫螢光 Ｐ、’　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球のアセトン固定塗抹標本に対する抗体 力価乞、免疫処置前の動物ならびに一次、二次および三次注射から約７日後の動 物からの血清について測定した。群１では、どのサンプルからも、最低希釈１１ ５０で、特異的抗体の存在は検知嘔れなかった。群２では、−次および二次免疫 処置後に特異的抗体が検出ちれ、この特異的力価は三次免疫処置後には増大する ようにみえた。動物６：１／８００、動物４：１／１，６００、動＠５　：　１ ／３，２００゜群６では、免疫処置スケジュール後、動ｖｌＪ１０匹中３匹にの み寄生体特異的抗体（力価１／１００）が認められた。

ｌ）ラジオイムノアッセイ 三次免疫処置後の動物からの血清サンプルについて、マイクロタイタープレート アッセイ中の精！ｈｐ、１９５に対する反応をＲＩＡによ！ｌ１ｗ＋析した。精 製Ｐ、　１９５タンパク質および各組換えタンパク質で免疫処置したウサギから の血清乞対照として用いた。群２および３の丁ぺての動物の血清に、ある程度の 抗体が検出芒れた（希釈１／２５）。

全ｔｒｐ　Ｅ融合タンパクｊＸまたはβ−ガラクトシダーゼ担体に対する反応を 調べた場合、群６の動物は、Ｅ、Ｃｏ１１誘導ポリペプチド部分にきわめてよく 反応した。

ｎ＋）　ウェスターンブロッティング 抗血清は、以下の抗原を用いてウェスターンブロッティングによって触析した。

ａ）ジチオスレイトールにより前もって還元したまたはしないｆｆｆｉ４Ｐ、１ ９５タンパク質および特異的フラグメント ｂ）全感染赤血球 Ｃ）ジテオスレイトールにより前もって還元したまたはしない全メロゾイト 群２および乙の全動物が精製Ｐ、　１９５および１５０ｋ（１フラグメン）Ｙ認 識する抗体ン産生した。群２の動物では１１０および８３　ｋａフラグメントに 対する抗体も産生じた。シゾントの抽出物では、群２の動物からの抗体が多数の ポリペプチド、とくに７０〜８０．０００　ｋｄ種のポリペプチドと反応した。

これらの楓はメロゾイト抽出物中にも存在した。ｐ、１９５および１５０　ｋａ 種は、群６血清中の抗体によって認識され、嘔らに約４５および４２　ｋｔｉ種 が動物９および１０からの血清によって検知δれた。これらの分子量の低い種は ｐ、１９５のＣ末端から誘導される。メロゾイトの抽出物中では、群６の血清は どの抗原ともほとんど反応゛しなかった。

ｉｖ）　免疫沈殿 抗血清乞初期細胞内寄生体（環）または非同期寄生体の抽出物からの３３３−メ チオニン標識ポリペプチドの免疫沈殿に使用した場合、多数の、ｉ（リペプチド が群２の動物によって認識逼れた。群６では、１０匹中３匹の動物のみが、０の アッセイによれば、Ｐ、１９５に対して特異的な抗体乞産生するようにみえた。

組換えタンパク質の免疫処置で達成嘔れる保護は、免疫原として全寄生体音用い て達成芒れる保護と同様に良好であった。全メロゾイトで免疫処置した動物は、 一連の７リペプチドに対する抗体ン産生じたが、組換えタンパク質で免疫処置し た動物は、Ｐ、１９５に特異的に反応するようにみえた。試験群でのＰ、１９５ 抗原に対する反応はウェスターンブロッティング法によって最も明瞭に検出され た。この方法は多分、変性抗原に対する抗体の検出に感受性がより高いものと思 われる。免疫螢光または免疫沈殿により定量した場合、動物１０のみが適当によ く反応したが、この動物はこの群中他の動物よジ良好に保護されていたわけでは 々のエピトープ解析 表面ＩＢＭ（および同時に可溶性免疫グロブリン分子）乞発現するＢ細胞は、通 常空間的に曝露逼れ、しばしば５〜７個のアミノ酸から構成８れ、コンホーメー ションの空間的アレンジが難しいタンパク質エビトープン認識する。タンパク質 の親水性領域を決定するアルこのような抗原決定基の予測に使用されてきた。Ｔ 細胞によって認識されるエピトープは多くの場合線状で、両親媒性ヘリックスン 形成できることが示唆されてきた（　ＤｅＬｉ８１　＆　ＢｅｒＯｆｓｋｙ　： 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、　ＳＣ１゜ＵＳＡ、８２ニア０４８，１９ ８５）。そして、抗原提供細胞の表面および適当なＴ細胞の受容体上でクラス］ 大組織適合性タンパク質と相互作用することができる。ハイブリッドタンパク質 のＰ、１９５成分のアミノ酸配列は、二次構造予測アルゴリズム（たとえば（： ｈＯｕ　＆　Ｆａｓｍａｎ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｉ　３　：　２２ ２゜１９７４）によって調べ、可能性のあるヘリックス構造乞同定した。残基１ ３５０−１３６３．１３８５−１４０２．１４１７−１４４５．１４５１−１４ ７６．１４９２−１５２８．１５３２−１５４０．１５４８−１５６１．１５８ ３−１５９１および１６２８−１６４０についてはα−へソックス構造が予想ち れた。

これらの領域乞ちらにＨＯＰｐ＆　ＷｏｏｄＥ＋の装本性予測を用いて調べたと ころ、領域１３５０−１３６３．１５３２−１５４０．１５４８−１５６１およ び１５８３−１５９１が中等度または高度に親水性であったが、一方、他の領域 （きわめて疎水性の１６２８−１６４０の例外を除いて、両媒性ヘリツクと予測 された。丁なわち、配列は全体に親水性でも全体に疎水性でもなく、疎水性残基 と親水性残基がへソックスの逆側に分離していると予測嘔れた（ヘリックスの１ 回転は６．６残基であり、１残基ごとに１００°ねじれる）。

したがって、らセん状と考えられるセグメン）１３５０−１３６３．１５３２− １５４０．１５４８−１５６１および１５８３−１５９１は抗体によって認識嘔 れるＢ細胞エピトープの全体もしくは部分であり、らせん状セグメント１３８５ −１４０２．１４１７−１４４５．１４５１−１４７６および１４９２−１５２ ８は、大組織適合性クラス■タンパク質とともに現れる場合、適当な受容体と一 緒にＴ細胞で認識可能なＴ細胞エビトープビ構築するものと考えられる。

ａ）　ｔ７Ｐｅ　／　Ｃ８Ｐ　ｔｒｐ　Ｅ　Ｐ、１９５ハイブリツドプラスミド ｐｆｏ１ｔｒｐ　７５、ＰｆＯｌ　ｔｒｐ７７およびｐｆｏｌｔｒｐ　７５０　 （Ａ、　Ｊ、　ＭａｋＯｆｆ　：投稿中）の、ＤＮＡ約２μｇを制限酵素１３ａ ｍ　Ｈｉおよび）（ｉｎａ　］ｌにより製造業者の示唆した条件７用いて消化し 、ついでエチジウムプロミド含有Ｔｒｉ８−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中（１，８ チアガロースゲルを通して電気泳動に付した。ＤＮＡフラグメント乞ＵＶ照射に よって可視化し、それぞれｐｆｏｌｔｒｐ　７５、ｐｆｏｌｔｒｐ　７７および ｐｆｏｌｔｒｐ　７５０からの４．３　ｋｌ）　、　４．１ｋｌ）および４．２ ８　ｋｂ　Ｂａｍ、Ｈ１／Ｈ１ｎｄ　ｌｌフラグメントχ含有する領域乞浴出し 、精製した。

Ｐ、１９５タンパク質のＣ末端乞コードする配列Ｚ含有するＤＮＡフラグメント ｖｐＰｆｃ１０２８がらのＥｃＯＲｌ　−Ｈｌｎｄ　［１フラグメント（ヌクレ オチド３５５５−５９２０、）（ｏｌｄｅｒはか：Ｎａｔｕｒｅ、３１７：２７ ０．１９８５）ｃ−含ｔＴるブ５　スミ）”　ｉ）ｈ　ラＸｈｏ　ＩｔおよびＨ ｌｎｄ　Ｉｎ消化によって切り出した。ＤＮＡ　４μＩを５０ｐｌの）（ｈｏ　 １緩衝液中８単位）ＸｈｏｌＨｃ！ｐ、６７°Ｃで３．２５時間消化した。つい で、０．５μｌの５Ｍ　ＮａＣ１および２０単位のＨｌｎａ　Ｉｎ　Ｙ加え、消 化１２時間継続した。消化嘔れたＤＮＡフラグメン）　Ｙ　Ｏ，８％アガロース デル上電気泳動によって分割した。Ｃ末端２９３のアミノ酸（残基１６４８から ）ンコードする配列ン含む１４６２１）Ｐフラグメント（ヌクレオチド４４５９ −５９２０）Ｔｚｒ：溶出し、精製した。

ｘｈＯｎ−）（１ｎｄ　Ｉｎフラグメントの一部ンベクターのＢａｍ　Ｈ１−Ｈ ｌｎｄ　■フラグメントと混合し、最終容量１０μｌのリゾ−ジョン緩衝液中Ｔ 　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼで処理した。このリゾージョン混合ｖＩＪ乞用いてコ ンピテントなりＨ１細胞乞形質転換した。ベクターＤＮＡ自己リゲーション対照 に比べて形質転換体の数に４〜５０倍の刺激が観察された。形質転換体乞解析し て、それが挿入ＤＮＡンもつ正しいプラスミドを含有すること乞確認した。それ ぞれのひとつのクローンからプラスミドＤＮＡ約１μｇのサンプル乞、０．５μ １（１２単位）のウシ腸ホスファターゼの存在下、唯一のＢａｍ　Ｈ１部位（Ｂ ａｍ　Ｈ１粘着端と）（ｈｏ　ｌ粘着端のリゾ−ジョンにより再生）で、Ｂａｍ Ｈｌにより消化した。３７℃で２時間消化したのち、線状プラスミドＤＮＡ　Ｙ 　Ｏ，８％アガロースゲルを通して電気泳動し、ついで溶出し、精製した。

ｐｃｓｐ　６００　／　３　Ｙアンピシリン１ｏｏμｇ／ｒｎｔ乞含有するＬＢ メジウムｌＱｍｔ中で一夜生育させた。プラスミドＤＮＡを調製し、ついで１０ ０μｌのＢａｍ　Ｈ１消化緩衝液中、ＥＣＯＲ１およびＢａｍ　Ｈ１（各酵素４ ８単位）により、３７℃で２時間消化した。消化δれたＤＮＡ　ｙｔ　Ｏ−８％ アガロースデルン通して電気泳動し、５８３　ｂｐフラグメント乞溶出し精製し た。精製フラグメンｌ−Ｙさらに、最終容量２ｏμｌ中ＸｈＯｎ　（２，５単位 ）により３７°Ｃで２時間消化した。消化生成物乞２チアガロ−スプル上電気泳 動に付し、３４８ｂｐおよび１９２　ｂｐの２つのフラグメン）Ｙ精製した。

３４８　ｂｐおよび１９２　ｂｐの両フラグメントのサンプルＹ、ＢａｍＨ１線 状化、ホスファターゼ処理ベクターと、最終容量１０μｌのリゾ−ジョン緩衝液 中に混合し、０．３　ｐｉ　ｆ）　Ｔ　４リガーゼと４°Ｇで６５時間、１５℃ で２時間処理した。リゲーションされたＤＮＡ　）１用いて、コンピテントなり Ｈ１細胞χ形員転換した。

個々のクローンヶー夜培養して生育８セ、それぞれのプラスミドＤＮＡ　ン制限 醇素消化で解析した。−夜培養液の一部乞また、１０ｏμｆｌ／ｍｔのアンピシ リンおよび１０μ９／ｒｎｌのインドールアクリル醒含有ＬＢメジウムで１：５ に希釈し、ｔｒｐプロモーターからの発現を誘導した。５時間後、これらの培養 物乞遠心分離して収穫ン行い、細胞ペレットラドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ 　）含有緩衝液中に溶解した。

細胞溶解液中に存在するタンパク質’ｇ　ＳＤＳの存在下１０％ポリアクリルア ミドデル中電気泳動によって分離し、ついでタンパク質をクーマツシーブルーで 染色するかまたはニトロセルロースに移した。移したタンパク質をＣ８Ｐまたは Ｐ、　１９５に特異的な抗体で調べた。両抗血清と反応する融合タンパク質を発 現するプラスミド含金む多数の組換え体が得られた。ｔｒｐ　Ｅ遺伝子生成物の 最初の３５．１１６または１６１のアミノ酸（それぞれｐｆＱｌｔｒｐ　７７、 ｐｆｏ１ｔｒｐ７５０またはｐｆＱユｔｒｐ　７５に由来）のいずれか乞これら の融合タンパク質は含有し、それに続いてＣ８Ｐ反り領域の部分、ついでＰ、１ ９５のＣ末端２９６アミノ＠（アミノ酸残基１６４８から始まる）が存在した。

これらの組換えタンパク質の予測構造ン第２衣に示す。１９２ｂｐ　ｘｈｏ　ｌ ］フラグメントの１．２または４コピーのいずれかン含有する組換え体が得られ たことが明らかである。ポリアクリルアミドデル電気泳動から評ｉ’１ｉＩｌａ れた融合タンパク質の分子量は第６表の計算分子量に相Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託嘔れ、ＮＣＴＣ１１９５２号とし て登録嘔れている。

ｂ）省略ｔｒｐ　Ｅ／　Ｃ３Ｐ／　Ｐ、　１９５ハイブリツドブ５スミ）’７５ Ｑ／Ｃ３Ｐ（ａ）／Ｐ、１９５は１個の列ンコードするＤＮＡ中、ＥＣＯＲ１部 位から４４０　ｂｐ。

Ｃ３ＰＩＪビ一ト配列との接合点から１５０　ｂｐの位置に存在する。これより 少ない配列χ含有する融合タンパク賃金製造するため、プラスミド乞制限酵素に よりこの部位で開裂し、Ｂａ１３１で消化し、ついで再すゲーションした。タン パク質の正しい読み取９枠での発現は細胞溶解物のウェスターンブロッティング で決定した。

プ５．ｘ、ミ）”７５０／Ｃ３Ｐ（ａ）／Ｐ−１９５の１０ｂｇｙｔｗ累Ｔｔｈ 　［１ｉで完全に消化した。この線状プラスミドンエキソヌクレアーゼＢａｌ　 ３１で、６０．６０および１２０秒間処理し、ＤＮＡ１ｅリメラーゼクレノウフ ラグメントで修復し、ついでＴ　４１Ｊガーゼにより４℃で一夜処理して再び環 化した。このＤＮＡ　Ｙ用いてＤＨｉ細胞ン形質転換し、アガールプレート上で アンピシリン抵抗性クローンを選択した。６０の各棟・ン取り、プラスミドはＥ ｃｏ　Ｒ１およびＢａｍ　Ｈ１での制限酵素地図作成によって解析した。問題の プラスミドは、Ｃ８Ｐリピート乞コードする３　４８　ｂｐのＢａｎ　Ｈ１フラ グメントとアミノ末端ｔｒｐ　Ｅ配列乞コードする小名なＥＣＯＲ１−Ｂａｎ　 Ｈ１フラグメント乞含有した。これらのプラスミドン含有する株乞、さらに細胞 溶解物のウェスターンブロッティングによって解析した。７５０／　Ｃ３Ｐ　（ ａ）　Ｐ、　１９５　Ｔｔｈ　ｍＩ　Ｂａｌ　３１の６ａ、　４ｂ。

１１ｂおよび１２ｂ株ではＥｅＯＲｉ　−ＢＩＬｍ　Ｈｉ　７ラグメントがそれ ぞれ２６５．６５０．６６０および６２０ｂｐと評価芒れた。これらは母体の７ ５０７Ｃ８Ｐ　Ｃ＆）／Ｐ、１９５プラスミドにおける５９１ｂｐに相当する。

６ａ、４ｂおよび１１ｂ株ではＮｒｕ　１部位１４０　ｂｐ５′からＴｔｈ　［ １’ｉ部位までが除去てれた。

Ｃ）最小の付加的配列乞有するＣ３Ｐ／Ｐ、　１９５ハイブリツド ７’　ラスミ）”　ｐｃｓＰ　６００　／　５　Ｙ　Ｂｌ！Ｌｍ　Ｈ１部位で開 裂し、５０７１）ＰｆＣ１０２８Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ　ｌｌの１８３ｂＰ　 Ｘｈｏ…７ラグメントでリグ−ジョンした。このフラグメントはＰ、　１９５の 末端２９２アミノ酸の暗号配列、ついで停止コドンおよびさらに８７６　ｂｐの 非翻訳配列を含んでいる。この構築体（ｃｓｐ６００／３／Ｐ、１９５）の発現 では、ｃｓｐ　（４６リピート）およびＰ、　１９５タンパク質の両者のエピト ープχ含むｔａｃプロモーターで制御石れる単一のタンパク質種乞生じる。

プラスミド７５０／ｃｓｐ　（ａ）／ｐ、　１９５　（２０ｂｇ）ン４０単位の Ｓａｌ　１によ！＋３７°Ｃで３時間消化した。

エタノール沈殿後、ＤＮＡＹ緩衝液に溶解し、ついでＢａｍＨ１酵素６６単位に より３７℃で７分間消化した。

生成物’ｋ　０．８　％アガロースデル上で分画し、２４３１ｂｐの部分消化フ ラグメントン溶出し、Ｅｌｕｔｉｐカラムに結合嘔七て精製した。プラスミドｐ ｘｙ　４６１　（１６ａｇ　）　ｗ　Ｓａ’ｌ　１の４０単位により、６７℃で ３時間、ついで１３ｂｍ　Ｈ１の３６単位により３７℃で６時間消化した。生成 物ンアガロースン通して電気泳動し、３２５３ｂｐフラグメン）ＶＷ出して精製 した。２種のＤＮＡフラグメントを混合し、Ｔ４リガーゼでリデーションン行い 、ＴＧ−１細胞のアンピシリン抵抗性への形質転換に使用した。形質転換体ンア ンピシリンおよびＸ　−ｇａｐ　Ｙ含有するアガール上で平板培養し、プラスミ ド中のガラクトシダーゼ遺伝子が失われた株から誘導δれたコロニーン採取し、 解析した。採取した１２株中１０株が正しく構築でれたプラスミドを含有し、ア ミノ酸配列ＭＮＳＰＳＭＧ　／　ＤＰ（ＮＡＮＰ　）　２６　ＮＫＮＮＱＧＮＧ ＱＧ／　ＤＰＹＫ・・・・・・・・・（Ｎ末端配列／　Ｃ８Ｐ配列／Ｐ、１９５ のＣ末端配列）乞コードする読み取り枠でｔａｃプロモーターが続いていた。こ れらの株のひとつ乞選んで４６１／　ｃｓｐ　（ａ）　／　ｐ、１９５と命名し た。

第２表 発現生成物の予測構造 株　ｔｒｐ　ｇ配列／Ｃ８Ｐ配列／Ｐ、１９５Ｃ末端配列７７／Ｃ３Ｆ（’）’ Ｐ、１９５　−ＤＰＡＴ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）２６ＮＫＮＮＱＧＮＧＱＧ／ＤＰＹ Ｋｙ・７５Ｑ／Ｃ３Ｐ（ａ）／Ｐ−１９５−ＤＥＤＡ／ＤＰ（’ＮＡＮＰ）２６ ＮＫ’ＮＮＱＧＮＧＱＣ）んＰＹＫ−７５／Ｃ３Ｐ（ａ）／Ｐ、１９５　−ＲＬ ＬＱ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）ｚａＮＫＮＮＱＧＮ’ＱＧ／ＤＰＹＫ”７７／Ｃ３Ｐ（ ｂ）／Ｐ、１９５　・・・ＲＰＡＴ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）３．ＮＶ／ＤＰＹＫ・・ １１６　１３４Ｂ ７５０／Ｃ３Ｐ（ｂ）／Ｐ、１９５−　ＤＥＤＡ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）１５ＮＶ／ ＤＰＹＫ　・・１３１　１３４Ｂ ７５／Ｃ３Ｐ（ｂ）／Ｐ、１９５　−ＲＬＬＱ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）１５ＮＶ／Ｄ ＰＹＫ　−・７５０／Ｃ３Ｐ（１’２　）／Ｐ　−１９５・・・ＤＥＤＡ／ＴＩ Ｐ（ＮＡＮＰ）１５ｔＪＶＤＰ（ＮＡＮＰ））５ＮＶ／ＤＦｆＫ・・７５Ｑ／Ｃ ３Ｐ（＋）４）／Ｐ、１９５・・ＤＥＤ−Ａ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）１暎Ｐ（Ｎ廣） １５睨ＰＣ８Ｐ６００１５／Ｐ、１９５　・・・ＭＮＳ！（ＰＮＡＮ購ＰＮ割蓄 ＤＰ（ＮＡＮＰ）□茜Ｐ４６１／Ｃ５Ｐ（ａ）／Ｐ、１９５　・・−ＭＮＳＰＳ ＭＧ／ＤＰ（ＮＡＮＰ）２６ＮＫＮＮＱＧＮＧＱＧ／配列はアミノ酸の標準−文 字記号で示す。異なる要素の間の接合点は（１）で表示し、数字はｔｒｐ　Ｂお よびＰ、１９５配列中のアミノ酸残基ン示している。

第６表：融合タンパク質の分子量 ７７　／　Ｃ３Ｐ（ａ）／　Ｐ、１９５　４９．２７６７５Ｑ／Ｃ３Ｐ（ａ）／ 　Ｐ−１９５５７，７５２６２，００［１７５／ｃｓｐ（ａ）／　Ｐ、１９５　 ５９，５０１　６２．５００７７　／ｃｓｐ（ｂ）／　Ｐ−１９５４４，１２２ ４７，０００７５０／ｃｓｐ（ｂ）／　ｐ、１９５　５２，５９８　５４．００ ０７５　／ｃｓｐ（ｂ）／　ｐ、１９５　５４．３４７　５４．０００７５０／ ａｓｐ（ｂ２）／　Ｐ、１９５　５８，９６３　６６．０００７５０／Ｃ３Ｐ（ １）４）／Ｐ、１９５　７１．６９３　９３，０００ｃｓｐ６００／３／　Ｐ、 １９５　５５．７３５４６１／ａｓｐ（ａ）／　Ｐ、１９５　４６．０９６　４ ９．５００ａ）プラスミドｐＰｆｃ　ｉ　０２８　ＰＤ　／　ＳＶ　４０　（Ｄ ’ｊＭ築ｐ、１９５ヌクレオチド配列中のヌクレオチド５２７１〜５３３８から なるｐｓｔ　１−　Ｄｒａ　１フラグメント（Ｈｏ１ｄｅｒほか：　Ｎａｔｕｒ ｅ、１９８５　）’Ｙ、予めｐｓｔ　１とＨｌｎａ　１１で消化したプラスミド ｐＵＣ９中にクローン化した。プラント端リゾージョンによ！＋、Ｄｒａ１認識 部位の部分でらるＴＡＡ停止コドンに代わる停止：ｌ　）”　７　（ＴＧＡ　） 　Ｙ再生し、ひとつの株ン選んでｐｐｆｃ１０２８ＰＤ−１と命名した。

ｐＰｆｃ　１０２８　ＰＤ　−１からのＤＮＡ　’ｉ　Ｂａｎ　Ｈｉによジその 唯一の部位で消化し、ついで５Ｖ４ＤウイルスＤＮＡ　由来の、ターミネーショ ン配列含、Ｎ　１３ａｍ　Ｈ１−Ｂｇｌ　ｌフラグメントとリゾ−ジョンし７１ ｃ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉほか：ＭＯ１，（：ｅｌ’ｌ、　Ｂ１０１．、　１　： ８５４．　１９８１　）。

リゲーション生成？！ｌｌ’ｖ用いてＤＨＩ　Ｋ胞乞形質転換した。６憫のアン ピシリン抵抗性株中のプラスミドＤＮＡ？ｐｓｔｉおよび１３ａｍ　Ｈ１を用い る制限地図作成によって解析した。６個のクローン中６個が正しい方向で５ｖ４ ０ク一ミネーシヨ／配列を含有し、他はその配列を逆方向にもっていた。正しい 構築が行われたものひとつを選びｐＰｆｃ　１０２８ＰＤ／ＳＶ４０と命名した 。

ｂ）　ワクシニアウィルスによるｃｓｐ７ｐ、１９５ハイブリツドの発現 Ｃ３Ｐ／Ｐ、　１９５ハイブリツドをコードするＤＮＡをワクシニアウィルスベ クター中にｐｌｌにプロモーターの制御下に挿入した。この構築に際しては、天 然の６′非翻訳配列の代わりにＳＶ　４０タ一ミネーシヨン配列ヲ用いた。トラ ンスファーベクターｐＶｐ　ｉ　ｉ　ｋは、ｐＵＣ９を基礎にしたプラスミド中 のワクシニアウィルスチミジンキナーゼ遺伝子の（Ｈｌａ　１−　ＥＣＯ部位に 挿入されたワクシニアｐ１１にプロモーターからのＣ１ａ　ｉ−ＦＣＯＲ１フラ グメントを含有する（Ｎｅｗｔｏｎはか：ｖａｃｃｉｎｅｓ　８６．ＮＯＷ　ａ ｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉＺａｔｉｏｎ。

Ｂｒｏｗｎ、Ｆ、　、Ｃｈａｎｎｏｃｋ、Ｒ，Ｍ、　＆　Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ 。

編、３０３−３０９頁；　Ｎｅｗｔｏｎはか：　ＶａｃｃｉｎｅＢ１３７゜Ｍｏ ａｅｒｎ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｎｅｗ　ｖａｃｃｌｎｅｅ　、印刷中 ）。読み取り枠を含み、唯一のＥＣＯＲ１部位に正しい方向で挿入逼れたＤＮＡ はｐｌｌにプロモーターの制御下に転写され、組み換えワクシニア感染細胞中で タンパク質配列に翻訳される。

６フラグメントリデーシヨ／を実施した。プラスミドｐＶｐ　１１　ｋ　（４ｐ ｇ　）をＥＣＯＲ１（１０単位）および１２．５単位のウシ腸ホスファターゼに より３７℃で５時間消化した。縁状の脱リン酸プラスミドをアガロースデルを通 して電気泳動し、電気溶出し、ついで精製した。プラスミド４６１／Ｃ５ｐ（ａ ）／ｐ、１９５（２，６μｓ）はＥＣＯＲ１およびｐａｔ　１で消化し、Ｃ８Ｐ リピートの暗号領域とＰ、１９５のｐｅｔ　１部位までの暗号領域を含むフラグ メントを溶出さセた。Ｐ、１９５の残部をコードする配列およびＳＶ　４０ター ミネーショ７配列のＤＮＡはプラスミドｐｐｆｃ　１Ｑ　２８ＰＤ　／　５Ｖ４ ０ｅＰＩｌ！ｔ１とＥＣＯＲ１で消化して得た。これらの３つのフラグメントを Ｔ４リガーゼでリゾ−ジョンさゼ、生成＠を用いてＤＨ１糺胞の形質転換を行っ た。４２個のコロニーについて、ＥＣＯＲｉ　＋　Ｐｅｔ　１、および（：ｌａ 　１＋１３ａｍ　Ｈ１によるプラスミドＤＮＡの制限地図作成を行い検討した。

これらの株の中４個が６個の丁べてのフラグメントラ正しい方向性で含有してい た。こｎう（１）ヒトツ、ＦＶＩ）　１１　ｋ／Ｃ８Ｐ　（ａ）／ｐ、　１９５ を選んでδらに解析した。読み取り枠は４６１　／　Ｃ５ｐ（ａ）／Ｐ、１９５ の場合と同じである。ワクシニア組換え体ハＭａｃｋｅｔｔ　ラ（、ｒ、　Ｖｉ ｒｏｌＯｇｙ、４９　：　８５７ｔ１９８４）によって記載８れた方法を用いて 得た。精製プラスミドＤＮＡを用いてワクシニアウィルス感染ｃ　ｖ　−１細胞 のトランスフエクションヲ行った。５−ブロモデオキシウリジンに抵抗性のウィ ルスプラークを選択して解析したところ、これらの１２個中６個で、細胞の溶解 物のウェスターンプロット上で特異的抗体（ｃｓｐペプチド−ＢＳＡ抱合体、Ｐ 、　１９５ならびにＰＭＥ　２および７５　ｏ／Ｃ８Ｐ　（ａ）／ｐ、　１９５ からの発現生成物に対して産生する）と反応するタンパク質が発現した。

プラスミドＩ）ＡＣ３６Ｑ　（３ｍ１ｔｈはか：　Ｍｏ１．　Ｃｅｌ’ｌ。

Ｂｌｏｌ、、３　：　２１５６．　１９８３　）は、ポリヘトリンの最初の１１ 個のアミノ酸をコードするＤＮＡ　、ついで合成りａｎ　Ｈ１リンカ−１次にイ ニシエーターＡＴＧから＋１７７の天然Ｂａｍ　Ｈ１部位のポリヘトリン配列３ ′ヲ含有する。それをこの唯一のＢａｎ　Ｈ１部位で完全に消化し、Ｈｌｎａ　 １１部位が予めＢｇｌ川／用Ｘｈｏ　１部位に変換されているｐＰｆｃ　１０２ ８の誘導体からの１４６１ｂｌ）ｘｈＯ１１フラグメントとリゲーションを行っ た。こうして、アミノ酸配列ＭＰＤＹＳＹＲＰＴＩＧＰ　／　ＤＰＹＫ・・・　 （ポリヘトリンＮ末端／Ｐ、１９５Ｃ末端からの２９２アミノ酸）の暗号領域を 含有するプラスミドｐＡｃ　６６０１９５Ｃが作成された。

ｐＡｃ　９６０はメリヘドリンの最初の１１個のアミノ酸をコードするＤＮＡと ついでポリヘトリン読み取り枠の末端に近くリゾ−ジョンした合成りａｍ　Ｈ１ リンカ−を含有する。このプラスミドをＢａｍＨｌで消化し、ついで２種のＢａ ｍＨｌ−ｐｅｔ　１フラグメント、ひとつはプラスミドｐｐｆｃ　１０２８　ｐ ｐ　−１（例８）から誘導δれたｐｓｔ　１−　Ｂａｍ　Ｈ１フラグメント、他 はＣ３Ｐリピ一ト暗号配列とＰ、１９５遺伝子の）（ｈｏ　１部位からｐｅｔ１ 部位１’ｅを含Ｗする７　５０／Ｃ８Ｐ　（ａ）／ｐ、　１９５からノＰ８ｔ１ 一部分Ｂａｎ　Ｈ１１１５８ｂｐフラグメントとリデーショ／を行つ’ｆＣｏ　 これにより、ポリへドリンプロモーターに続いてＭＰＤＹＳＹＲＰＴＩＧＰ　／ 　ＤＰ（ＮＡＮＰ）　２．ＮＫＮＮＱＧＮＧＱＧＤＰＹＫ・・・（ポリヘトリン ／　Ｃ８Ｐリビー）／Ｐ、１９５０末端）の暗号配列を五するプラスミドＰＡＣ Ｃ３Ｐ　（ａ）　Ｐ、　１９５　３’が生成した。

ｐＡｃ３６０１９５ｃおよびＰＡＣＣ８Ｐ　（ａ）　Ｐ、　１９５Δ６′をＥＣ ＯＲ１およびｐ８ｔｉで消化し、ＰＡＣＣ３Ｐ（ａ）１９５Ｃの構築に使用した 。この構築において、？リヘドリンプロモーターに続く読み取り枠はｐＡＣＣ８ Ｐ　（ａ）　Ｐ、　１９５△６′の場合と同じで、Ｐ、　１９５遺伝子からの６ ′非非翻訳列か存在する。

これらのプラスミドを用い、Ｓｍ１ｔｈら（前出）の記載した方法によ９組換え バクロウィルスを生成名セた。

閉塞陰性のプラークを観察によってスクリーニングし、ウィルスをサザン法で解 析した。発現したタンパク質は、ＳＤＳ　−ＰＡＣ）Ｅ後り−マツシーブルー染 色および特異的血清でのウェスターンブロッティングによって検（Ｓ−アセトア ミドメチル）システィア　−（Ａｓｎ　−Ａｌａ　−ＡＢＱ　−ｐｒｏ　）４− 　ＡＢＱ　’−Ａｌａの配列をもつペプチドを固相法によって合成して（Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄほか：Ａｎｎ、Ｈｅｖ、阻ｏｃｈｅｍ、、３９　：８４１．　１ ９７０）、水溶性カルボジイミドを用いてスクシニル化ウシ血清アルブミンに結 合さセた。スクシニル化ウシ血清アルブミン２００　ｎｍｏｌｅ　（７１，５ｍ ９）を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ）（４，７５）　２ｔｎｉ中、Ｒプチド１ ３　ｎｍｏｌｅ（１９，６■）と混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルア ミノプロビル）カルボジイミド２０μｍｏｌｅ（６，８〜）を加え、溶液を２２ ℃に１６時間放置した。

１Ｍ酢酸ナトリウム３　ｍｌを加えて反応を停止し、１チ酢酸に対して透析し、 凍結乾燥した。

例１１　：　Ｅ、　ｃｏ１１中で産生じた融合タンパク質の精製７５０／Ｃ３Ｐ （ａ）／Ｐ、　１９５　（ＮＣＴＣＩ　１９５２）。

７５０／Ｃ８Ｐ　（ｂ）／Ｐ、　１９５および７．５０　／　Ｃ３Ｐ（ｂ２）／ Ｐ、１９５株によって産生された融合タンパク質を以下のようにして部分精製し た。

各融合タンパク質の比較的純粋なプレバレーショ／を細胞溶解液から製造した。

１つの株からの単一のコロ＝−ｔ、５０μ９７ｍｔのアンピシリン金含有する　 。

Ｍ９メジウム１００ｉＡ中６７℃で一夜生育てセた。翌日、−夜培養液ｔ−５０ μ９／ａｔのアンピシリンおよび１０μ９７ｒｎｔのインドールアクリル酸を含 有するＭ９培養メジウム４００Ｉｎｔで希釈し、６７℃で５時間インキュベーシ ョンした。６０００ｇで１０分間遠心分離して細菌を収穫した。細菌のベレン） 　ｔ　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１　ｍＭＲＭＳＦ　、０−２　％　（ｖ／ｖ）　ＮＰ　４０および１ｑ／ａｒｔ リゾチーム含［２５ｍＭＴｒｉ８　（ｐＨ８，０）　１０１７中に懸濁して、氷 上に２時間放置した。ついで、ｉ　Ｍ　Ｍｇ５０゜２０　ｐｌ　および１　ｒｎ ｇ　／ｌｎｌ　ＤＮｐ、ｅｅ　２００　ｐｉを加え、サンプルを氷水上でさらに ２時間インキュベーションした。不溶の物’Ｊｔｔ２０，０００　＆で１０分間 遠心分離して収穫し、上澄液（Ｓｌ）は残して置く。ベレット化した物質を５　 ｍＭ　ＥＧＴＡ　、　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、１　ｍＭ　ＰＭＳＦおよび１％Ｎ Ｐ　４０　を含有する５　［］　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　Ｉ　 Ｏ＋ｎｔに懸濁して洗浄した。これを２０．ＯＤＤｇで１０分間遠心分離し、上 澄液（Ｓ２）は残して置く。ペレットを５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ＸＯ，５Ｍ　ＫＳ ＣＮ含有５　［１ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ８，１）　１０　ｍＡに再懸 濁し、２０．ＯＤＤｇで１０分間遠心分離して、第６の上澄液（Ｓ３）とペレッ ト分画（Ｐ）を得た。ペレット分画を５　ｍＡの水に再懸濁し、０．８９％Ｎａ Ｃ１に対して透析した。各上澄液およびペレット分画のサンプルを取り、５ＤＳ −ＰＡＧＥおよびクーマンシーブルー染色で解析した。この操作により、王とし て融合タンパク質を含有する最終のペレット分画が生じ、融合タンパク質の有効 な精製が行われた。

７５０／ｃｓｐ　（ａ）　／ｐ、　１９５融合タンパク質をさらに精製するには クロマトグラフィーを実施した。最終のべｖ７ト分画’ｉ５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ ＣＩ　ｐＨ８，５，８Ｍ尿素、１．ｍＭＥＤＴＡ、　５　［１ｍＭＮａｃｌ、１ ００　ｍＭジテオスレイトール（ＤＴＴ　）中に懸濁し、遠心分離により不溶の 物質を除去した。タンパク質はこの緩衝液（ＤＴＴは１００　ｍＭでなく　１　 ｍＭ金含有中、３ｕｐｅｒｏｅｅ　６（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のカラム上ゲル 濾過によってさらに精製した。別法として、溶液を１Ｍ硫酸アンモニウムに調整 し、この緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　のカラムに適 用した。これらの条件下でタンパク質はカラムに結合し、硫酸アンモニウムの濃 度を低下嘔七れば溶出でセることかできた。

例１２：ハイブリッドタンパク質の免疫原性部分精λしたタンパク質を用い、ウ サギにフロイントの完全アジュバント中り、５Ｔｎ９のタンパク質を筋肉内接種 して免疫処置を行い、日２１および６５にフロイントの不完全アジュバント中０ ．５りのタンパク質をブースター投与した。−次免疫処置から５６日目に血清サ ンプルを集めた。嘔らに日９８および１２５にブースター投与を行い、日１３２ に血清サンプルを集めた。

ａ）Ｃ８Ｐ’ＪビートおよびＰ、　１９５配列に対する抗体応答のラジオイムノ アッセイによる評価融合タンパク質で免疫処置した動物における抗体応答を調べ るために２種の基質を使用した。第１の基質はｐ、　ｆａ’１ｅｉｐａｒｕ’ｍ の抽出液からｆｆ製したｐ、　１９５（Ｈｏ１ｄｅｒ　＆　Ｆｒｅｅｍａｎ　： 　１９８４　、前出）とした。第２の基質は担体タンパク質に抱合しｆｃＣ３Ｐ り一一トヲ含■する合成ペプチドであった。タンパク質を用い、ヨーロッパ特許 出願第８５０４４２９号に記載したラジオイムノアッセイのためのマイクロタイ タープレートのウェルをラベルした。

第４表に示す結果は、融合タンパク質が免疫原であり、ｐ、１９５およびＣ３Ｐ アミノ酸配列の両者に対する抗体を誘導することを示している。

ｂ）ｐ、１９５タンパク質に対する抗体応答の免疫沈殿、ウェスターンブロッテ ィングおよび免疫螢光による評価 ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍシゾントを生物合成的に３５８−メチオニ／で標識 し、ついで細胞を含まない抽出液を調製した（　Ｈｏ１ｄｅｒ　＆　Ｆｒｅｅｍ ａｎ　：　１９８２１　前出）。７５０／　Ｃ８Ｐ　（ａ）　／Ｐ、　１９５か らの部分精久融合タンパク質に対して産生じた抗体は、免疫沈殿、ＳＤＳ　−Ｐ ＡＧＥおよびフルオログラフィーによってポケれるようにＣのシゾントの抽出物 中の完全なｐ、１９５ｋＢ識した。

真面うベルメロゾイトの抽出液から、同じ血清がＰ。

１９５タンパク質の４２およびｉ　９　ｋｄフラグメントを免疫沈殿１セた。

別法として、Ｐ、１９５″ｔモノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフ ィー（Ｈｏ１ｄｅｒ　＆　Ｆｒｅｅｍａｎ　：１９８４、　前出）によって精製 し、ポリアクリルアミドデルを通して電気泳動し、ついでニトロセルロースに移 した。７５０／Ｃ８Ｐ　（ａ）／ｐ、　１９５．７５０／ｃｓｐ　（ｂ）　／ｐ 、　１９５および７５０　／　ＣＳＰ　（ｂ２）　／　Ｐ。

１９５に対して産生じた抗血清によるウェスターンブロッティングから、こ詐ら の血清中の抗体と精製Ｐ。

１９５タンパク質との陽性反応が明らかにてれた。この３種の抗血清は丁べて、 風乾アセトン固定塗抹上、血液期寄生体と免疫螢光によって反応した。

第４９には、１１２５−プロティアＡ結合（ｃｐｍ　）および結合最大カウント の百分率（カッコ内）を示す。

上段は２回、下段は４回のブースター注射後の結果である。

注）例７．ａ）の最後にＥ、ｃｏｌｉ株７５０　／　ｃｓｐ（ａ）／Ｐ、１９５ の寄託について触れたが、これはブダペスト条約によって行われたもので、詳細 は次のとおりである。

囚　国際寄託機関の名称および住所 Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｔｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　（ｕｌｔｕｒｅｓ Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｈｏｌ ｉｎｄａｌｅ　Ａｖｅｎｕｅ Ｌｏｎｄｏｎ　ＮＷ９　５ＨＴ Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ （Ｂｌ　寄託臼：１９８６年４月９日 （Ｃ）　承認番号：　ＮＣＴＣ１１９５２手続補正書。８） 昭和６３年３　月）５日／

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生原虫のＣＳＰおよび血液期抗原のそれぞれの少な くとも１種のエピトープからなる組換え、抱合タンパク質 ２．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの種は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである請求の範囲 第１項に記載の組換え、抱合タンパク質３．血液期抗原成分はＰ．１９５である 請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の組換え、抱合タンパク質 ４．ＣＳＰエピトープを含有する最短の配列は、Ａ（ｎ＋１）、Ａ（ｎ）Ｂ、Ｂ ＡＢ、ＡＢＡ、ＢＡ（ｎ）（式中、ＡはＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｂは Ａｓｎ−ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、ｎは２以上の整数である）からなる群より選 ばれる請求の範囲第１項から第３項までのいずれかに記載の組換え、抱合タンパ ク質 ５．請求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載の組換え、抱合タンパク 質をコードするＤＮＡ配列６．請求の範囲第５項のＤＮＡ配列を含有するベクタ ー７．請求の範囲第５項のＤＮＡ配列をもつ非病原性ウィルス ８．請求の範囲第５項のＤＮＡ配列を含有し、それが宿主によって翻訳可能な遺 伝子の暗号部分、および所望によりそれに関連したコントロール配列と縦列に結 合している発現ベクター ９．宿主ペプチドおよび請求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載の組 換え、抱合タンパク質からなる融合タンパク質 １０．請求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載の組換え、抱合タンパ ク質からなるワクチン１１．さらにアジュバントを加えた請求の範囲第１０項に 記載のワクチン １２．アジュバントは水酸化アルミニウムである請求の範囲第１１項に記載のワ クチン １３．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生原虫のＣＳＰおよび血液期抗原のそれぞれの少 なくとも１種のエピトープからなる組換え、抱合タンパク質を製造するにあたり 、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列をベクター中に挿入し、そのベクター で宿主を形質転換し、そのタンパク質を宿主によって発現させる方法 １４．ＤＮＡ配列は、ａ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生原虫からＣＤＮＡまたはゲ ノムＤＮＡライブラリーを作成し、ｂ）ＣＳＰおよび血液期抗原ＤＮＡのプロー ブを選択し、そのプローブを放射活性とし、ｃ）そのプローブを用いてライブラ リーのメンバー１または２以上を選択し、ｄ）そのＤＮＡをそのメンバーから単 離することによって得る請求の範囲第１３項に記載の組換え、抱合タンパク質の 製造方法 １５．血液期抗原はＰ．１９５である請求の範囲第１３項または第１４項に記載 の方法 １６．ＣＳＰエピトープを含有する最短の配列は、Ａ（ｎ＋１）、Ａ（ｎ）Ｂ、 ＢＡＢ、ＡＢＡ、ＢＡ（ｎ）（式中、ＡはＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、Ｂ はＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、ｎは２以上の整数である）からなる群より 選ばれる請求の範囲第１３項から第１５項のいずれかに記載の方法 １７．発現は細菌、哺乳類動物または昆虫の細胞系中で行われる特許請求の範囲 第１項から第１６項までのいずれかに記載の方法 １８．Ｐｌａｓｍｏｄｕｍ寄生原虫のＣＳＰおよび血液期抗原のそれぞれの少な くとも１種のエピトープからなる組換え、抱合タンパク質を医薬的に許容される 担体と混合するワクチンの製造方法