JPS63500637A

JPS63500637A - 組換えウイルス

Info

Publication number: JPS63500637A
Application number: JP61505157A
Authority: JP
Inventors: ラングフォード，クリストファー・ジョン; エドワーズ，スターリング・ジョン
Original assignee: ザ・ワルタ−・アンド・エリザ・ホ−ル・インスティテュ−ト・オヴ・メディカル・リサ−チ
Priority date: 1985-08-29
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1988-03-10
Also published as: EP0244427A4; KR880700073A; DK219187D0; NZ217400A; WO1987001386A1; EP0244427A1; AU6370186A; ZA866582B; FI871885A0; AU594087B2; IL79880A0; ES2002128A6; DK219187A; FI871885A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウィルス本発明は組換えウィルスに関するものであり、特に組換えによって、発現される免疫原性外来性ポリペプチドの免疫原性を最適にするように修飾された組換えワクシニアウィルスに関するものである一本明細書に於いて使用する「組換えウィルス」という用語は、ウィルスのゲノムに外来遺伝子又は遺伝物質が組み込まれ、遺伝子的に修飾された感染性ウィルスを意味する。従って、この修飾されたウィルスは、組換えウィルスによる細胞の感染の際、′外来性２ポリペプチドの形態で外来遺伝子を発現する。「組換えワクシニアウィルス」という用語は前記に対応した意味である。

感染性ワクシニアウィルスに外来遺伝子を発現させる方法［マケッ）　（Ｍａｃｋｅｔｔ）他、１９８２．バニカリとパオレッティ−（Ｐ　ａｎｉｃａｌｉａｎｄ　Ｐ　ａｏｌｅｔｔｉ）、１９８２］が開発されて以来、生きた組換えワクシニアウィルスは、より有害な他のウィルスによる感染症に対して動物を免疫する上に於いて非常に有用であることが確認された。このことは、宿主の防御的免疫応答の標的抗原をコードしている遺伝子を単離し、それらをワクシニアウィルス・プロモーター要素のコントロール下に、ワクシニアウィルスのゲノムに組み込むことにより実施された。多くの場合、ワクシニアウィルスによって発現される外来性ウィルス抗原は、殆ど自然な状態であり、そのプロセッシング、修飾、輸送、及び最終的な感染細胞表面上の位置は、自然感染の場合と非常に類似しているようである。従って、単純ヘルペスの糖タンパク質Ｄ［パオレッティー他、１９８４．クレーマー（Ｃｒｅｍｅｒ）他、１９８５］、Ｂ型肝炎表面抗原［スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）他、１９８３：モス（Ｍｏｓｓ）他、１９８４］、水痘性口内炎のウィルス糖タンパク質Ｇ１及びインフルエンザウィルス血球凝集素［スミス他、１９８３：パニカリ他、１９８３］の遺伝子を組換えワクシニアウィルスに挿入すれば、この生きた組換えウィルスを、感染症に対し動物を免疫するために使用することができるということは驚くに値しない。

本発明のひとつの目的は、雑種（ハイブリッド）ポリペプチド（これは、雑種ポリペプチドをウィルス感染細胞の表面上若しくは該表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともに、ウィルス又はウィルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくとらひとつ含有する）をコードしている配列（コード配列）を含有することが特徴の組換えウィルスを提供することである。

具体的には、本発明は、上記雑種ポリペプチドをワクシニアウィルス感染細胞の表面上若しくは該表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともにワクシニアウィルス又はワクシニアウィルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ含有する該雑種ポリペプチドのコード配列を含むことが特徴の組換えワクシニアウィルスを提供することである。

本発明の他の目的は、上記雑種ポリペプチドをワクシニアウィルス感染細胞の表面上若しくは該表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともにワクシニアウィルス又はワクシニアウィルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ含有する該雑種ポリペプチドのコード配列を含むＤＮＡ分子を提供することである。

更に、本発明の目的は、上記雑種ポリペプチドをワクシニアウィルス感染細胞の表面上若しくは該表面に位置させるための表面又は膜関連ポリベブヂド・セグメントとともにワクシニアウィルス又はワクシニアウィルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ含有する該雑種ポリペプチドを提供することである。

本発明を、組換えワクシニアウィルスに於ける分泌性反復プラスモディウム抗原（Ｓ−抗原）に基づく雑種ポリペプチドの発現を例によって説明する。

プラスモディウム・ファルシパルム［Ｐ　Ｉａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯性マラリア原虫）］の多数の無性生殖血液期抗原群（ａｓｅｘｕａｌ　ｂｌｏｏｄｓｔａｇｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）をコードしている遺伝子群を単離し、宿主を保護するための抗原を同定するｆこめにその塩基配列の決定が行なわれた［ケンブ（Ｋｅ＋＋＋ｐ）他、１９８３’ｌ。これらの抗原遺伝子の多くは組換えワクシニアウィルスに於いて発現し、た。多くの場合、効果的な免疫は、外来性抗原がウィルス感染細胞の表面上で正しく発現されることにかかっている。しかし、原生動物である寄生虫などの比較的複雑な生物の表面タンパク質は、それに相当する遺伝子が哺乳動物細胞に導入され１こ場合、細胞表面にたどり着くことができない。例えば、宿主赤血球の膜内に位置するＰ、ファルシパルム・タンパク質は、その最終的な目的地に到達する前に寄生虫液胞の膜を通るかなり複雑な経路を横切らなければならないが、この経路は判明されていない。

プラスモディウム・ファルシパルムのＳ−抗原タンパク質は、分裂中の寄生虫の制限膜と、赤血球への寄生虫の侵入に伴う陥入過程期に最初に形成され、続いて寄生虫の増殖期に同化される赤血球の内膜とを隔てた空間に分泌される。イムノゴールド（ｉｍｍａｎｏｇｏｌｄ）電子顕微鏡検査法によって、寄生虫液胞として知られるこの空間は成熟シゾント（分裂体）の破裂の直前にはＳ−抗原によって充嵩されていることが判明した。これらＳ−抗原分子のうちの２つの遺伝子配列［コーマン（Ｃｏｗｍａｎ）他、１９８４］により、疎水性シグナルペプチドをコードしているが遺伝子の残りの部分の他の重要な疎水性領域はコードしていない短い領域が遺伝子の５′末端に存在することが示されたが、このことは分泌タンパク質としてのこの特性に合致するものである。これらのシグナルは、このタンパク質がイン・ビトロ（試験管）培養のワクシニアウィルス感染哺乳動物細胞で発現される時に正確に認識される。

本発明を完成に導いた操作の最初の目的は、動物を免疫するために、プラスモディウム血液期の抗原を生きた組換えワクシニアウィルスを使って動物に移入できるかどうかを調べ、その免疫応答を、組換えＤＮＡ技術又は化学的合成によって生成されるペプチドを用いて得られる免疫応答と比較することてあった。生きたウィルスを使って移入させる方法が理論的に有利な点は、抗−寄生虫ワクチンの効力として最も重要であると思われる免疫系の細胞性アーム（ｃｅｌＩｕｌａｒ　ａｒｍ）をよりよく刺激する可能性があることである。

組換えワクシニアウィルスにより、感染家兎及びマウスにおいて発現される分泌Ｓ−抗原に対する抗体の応答性は小さい。両方の場合とも、抗体力価は感染後直ぐに立ち上がり、急速に弱まってしまう。これらの応答性は、組換えウィルス、又は１１個のアミノ酸の反復ポリペプチドの化学合成コ、ンカテマτ水溶液のいずれかを使用し、２回目の免疫の攻撃（抗原追加）を行っても増強（ブースト）されない。ＦＣＡ用量でＳ−抗原β−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドでブーストしても、必ずしも抗−８−抗原反応はこの融合ポリペプチドの一次注射で天然マウスを免疫して観察された抗原反応よりも強くない。しかし、トランスメンプラン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）部域（ドメイン）を付加することで、ワクシニアＳ−抗原組換え体の免疫原性の増進が計られることが明らかとなり、このことよりウィルス感染細胞の表面に現れることの重要性が確認された。

Ｓ−抗原を用いたこの操作の結果より、外来性の、非表面性免疫原性ポリペプチドを雑種分子として、ワクシニア感染細胞の表面と関連させる一般的方法が示唆された。本方法では、免疫原性を有するポリベブヂドを感染細胞表面上で発現させるのに必要な配列を提供するためにマウス免疫グロブリン遺伝子を使用した。

しかし、ワクシニア感染細胞の表面上で効率よく発現され得る他の表面抗原分子を使用しても同様に、該配列を良好に得ることができる。これらの典型的な候補分子には、例えばワクシニアウィルスの表面タンパク質、又はＨＢＳＡｇのような誘導抗原が挙げられるであろう。

更に本発明の特徴及び特性を、以下の実施例並びに添付図面に記載するが、これらは本発明を説明するだ（づのものであって、本発明の限定を意図するものではない。

実施例１Ｆｌ［ｉｎ、Ｐ、ファルシパルムのＦＣＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）単離体の欠失Ｓ−抗原遺伝子を含有するトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）プラスミドの組み立ての模式図である。

（ａ）は、シグナルペプチド（陰影部）とこの遺伝子の真下に示す１１アミノ酸反復ペプチド配列の約１００個のコピーをコードしている配列を有するＦｅ２７・Ｓ−抗原遺伝子のゲノムコピーの構造を示している。

（ｂ）は、コーマンら（１９８４）により開示されている、Ｓ−抗原遺伝子の非反復配列を全て含有しているが、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）にクローンする時に起こる自然欠失のため、反復配列を僅か１３コピーだけ含んでいるゲノム・サブクローンＦＣ２７，４，５（４０ｏｏｂｐ）を示している。このＤＮＡを、遺伝子のコード領域の５°側４０塩基対と３′側３５塩基対にあるＡｂａＩｎ制限エンドヌクレアーゼ部位で切断した。ＥｃｏＲＩリンカ−を付加した後、このフラグメントをｐＧＳ６２の唯一のＥｃｏＲＩ制限部位（実験操作を参照）にクローンし、プラスミドｐＶ８を得た。（Ｃ）に示すように、この構築物に於いては、Ｓ−抗原遺伝子はワクシニアウィルス７．５に遺伝子プロモーターの直ぐ下流に位置し、ワクシニアウィルスＴＫ遺伝子配列を両端に有している。第４図及び実験操作に詳細に示している分離クローニングにて、免疫グロブリンのトランスメンプラン配列（平行線部）及び細胞内ドメイン（点線部）を含有する雑種Ｓ−抗原遺伝子をｐＶ８から組み立て、（ｄ）部に示すプラスミドｐＶＡ２０を作成した。

第２図は、ｐＵＣ９β−ガラクトシダーゼ・プロモーターのコントロール下、大腸菌により産生されるＳ−抗原（レーン１）との比較の下に、組換えワクシニアウィルス■８で感染させたＢ５Ｃｌ細胞により産生されるＳ−抗原（レーン２及び３）のウェスターン・プロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った結果を示している。レーン２と３は、感染後４８時間のウィルス感染細胞及び培養培地に関連したＳ−抗原の相対量を示している。分析の前に、培養培地を１２．０００９にて３分間遠心分離にかけた。Ｓ−抗原の１１アミノ酸反復部分のみを認識する家兎抗−血清を用いてフィルターをプローＳ−抗原の合成及び分泌の時間的経過を示すものである。細胞を１ｐｆｕ／細胞にて、１時間感染させた。接種物を取り出し、新鮮な培地を加えた。感染後様々な時間に培養培地の試料を取り出し、それを１２．０００９で３分間、遠心分離にかけた。分析するために遠心分離に上り上清を取り出した。残った細胞と培地を皿から取り出し、全量を新しい試験管に移した。音波処理を行なった後、試料を取り、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析するためにＳＤＳ試料緩衝液に溶解した。各試料の等しい分画を分析にかけ１こ。Ｓ−抗原の１１アミノ酸反復部分を特異的に認識する家兎抗−血清を用いてフィルターを第４［ｆｆｌ＋よ、マウス膜ＩｇＧ）ランスメンプラン配列をＦ’Ｃ２７Ｓ−抗原遺伝子の３°末端に位置するＳ　ｐｌｌ　１部位にサブクローンする時に行う工程の模式図である。トランスメンプラン、細胞内ドメイン及びヒンジ（蝶番）領域部分をコードしている１　８６　ｂｐ　Ｈａｅｍフラグメントをティラー（ＴｙｌｅｒＸｌ　９８２）らに開示されたγ１ｃＤＮＡクローンから分離した。このフラグメントの末端に５ｐｈｌリンカ−ＤＮＡを付加し、５ｌ）ｈｌ消化した後、得られたフラグメントをＳ−抗原遺伝子クローンｐＦＣ２？　Ａｈａ２の５ｐｈｘ部位にクローンして新しくクローンｐＡ２０を作成した。次いで、Ｓ−抗原遺伝子を含有したこれらのプラスミドからＥｃｏＲＩフラグメントを得、ベクターｐＧＳ６２（第１図を参照）のＥｃｏＲＩクローニング部位にクローンしてプラスミドｐＶ８とｐＶＡ２０とをそれぞれ作成した。

Ｓ−抗原遺伝子と免疫グロブリン遺伝子との結合部に於ける配列は、下段に示しているが、これは結合部に於ける新しいアミノ酸配列を示すものである。星印で示したアラニンとプロリンのアミノ酸が親タンパク質のいずれにも存在しないものであるのは、これらがＳ　ｐｈ　１リンカ−ＤＮＡ配列により生成されたものであるからである。

免疫グロブリン遺伝子の細胞外ドメインの６アミノ酸が、新しい雑種タンパク質には存在する。

第５図は、ＶＡ２０組換えウィルスで感染された細胞によって産生されるＳ−抗原はもはや分泌されないことを示すものである。１ｐｆｕ／細胞の割合でＶ８又はＶＡ２０組換えウィルスのいずれかで感染させた後４８時間して、第３図の説明のように感染細胞と培養培地の試料を捕集した。Ｓ−抗原の全量としては同量であったが、ＶＡ２０感染細胞の場合、Ｓ−抗原は培地中に殆ど分泌されなかつた。家兎抗−ＦＣ２７Ｓ−抗原反復抗一血清を用いてウェスターンをプローブした。

第６１１：Ｖ８又はＶＡ２０組換えウィルスのいずれかを用いて４８時間感染させｆこＢ５Ｃ−１細胞を０，０５％トリトンｘ１１４中に４℃にて１時間可溶化した。低速度遠心分離によって不溶性の物質と細胞核を取り除いた。温度を３７ °Ｃまで上げ、不溶性トリトンＸ１１４ミセルの白濁性懸濁液を３７℃の遠心分離によって分離し、更に各分画をトリトンｘ１１４分配する工程によって再び精製した。

界面活性剤と水層にあるＳ−抗原を、家兎２１０抗血清（Ｒ２！０）を用いたウェスターン・プロット分析によって検出した。

第７図は、組換えウィルスＶＡ２０（Ａ及びＣ）又はＶ８（Ｂ及びＤ）を用いて１８時間前に感染させたＢ５Ｃｌ細胞の間接免疫蛍光検査を示すものである。細胞に透過性をイ」与して細胞内のＳ−抗原の検出を可能にするために染色の前に細胞を固定化するか（Ａ及びＢ）、又は感染細胞の表面に位置するＳ−抗原を検出するために染色後に細胞を固定化するか（Ｃ及びＤ）のいずれかを行なった。

固定化は、水冷９５％エタノール＝５％水酢酸を用いて行なった。

１：５００に希釈した家兎２１０抗血清を用い、Ｓ−抗原の位置を探った。次いで、蛍光安定化ＤＡＢＣＯを含有したグリセリンに固定化する前に、２番目の抗体としてＦＩＴＣ−複合ヤギ抗−家兎接合体を使用した。ＵＶ照射し、油浸漬して細胞を撮影した。ＭａｇＸで１回層腔内免疫した後、３週目に検定したマウス血清の抗体力価を示したものである。９６ウエル・マイクロタイター皿を予め測定しておいた最適濃度３μｇ／ｍＱのＦＣ２７Ｓ−抗原反復／β−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチド調製物でコートした。前−免疫血清を連続的に希釈し、最高吸光度のＩ／２に達する希釈率を測定した。

これらの値を、使用したマウスのＢＡＬＢ／Ｃ，Ｈ−２にと１２９／Ｊ系統の両方についてプロットした。

第９図は、生きた組換えウィルスＶＡ２０の１０”ＰＦＵを１回皮内注射した後、ｌから５週目に採取した家兎抗血清を通常のＥＬＩＳＡ分析して得られた吸光度をプロットしている。第８図での説明に記載した２つの抗Ｓ−抗原抗体について、血清の標準的希釈率１　：３２０（点線）で血清を分析するか、又は血清の標準的希釈率　ｌ：２５８０（実線）でＢＰＬ不活性ワクシニアウィルスを用いてコートしたプレートを使用し、抗−ワクシニア抗体について血清を分析した。

（Ｂ）は、組換えウィルスＶ８（点線）又はＶＡ’２０（実線）のｌＯ’ＰＦＵを用いて皮内免疫した後の２週間口に抗Ｓ−抗原抗体に関して一匹の家兎抗血清を分析したＥＬＩＳＡによって得られた吸光度を示すものである。

Ｆｅ１２　Ｓ−抗原の欠失誘導体を含をしている８　８０　ｂｐ　ＡｈａＩＩ［フラグメントを、コーマンら（１９８４）により開示されているゲノムＥｃｏＲＩクローンＦＣ２７，４，８から分離した。このフラグメントをｐＵｃ９にクローンする前にＥｃｏＲＩリンカ−を付加させた。

この８８０ｂｐサブクロ一ン体（ｐＦ　Ｃ２７Ａｈａ２）は、２３アミノ酸の疎水性シグナル配列及び保存された６８アミノ酸のアミノ末端を含んでいるＳ−抗原の完全な３“末端部、欠失されていないタンパク質には１００コピーあると思われる１１アミノ酸反復ペプチドの１３コピー、及びこの分子の保存されたカルボキン終末末端の完全な３５アミノ酸配列をコードしていた。更には５°及び３ °の両端にそれぞれ４０および３５塩基対の非コード化ＤＮＡがあった。次いで、この８８０ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントを、マケット（ＭａｃｋｅｔＬＸ　１９８４）らが開示しているベクターｐＧＳ２０のＥｃｏＲＩ制限酵素部位のひとつを欠失させて組み立てたワクシニア・トランスフェクション用ベクターｐＧＳ６２の唯一のＥｃｏＲＴクローニング部位にクローンした。

Ｓ−抗原遺伝子がワクシニア７．５にタンパク質の初めの遺伝子プロモーターの３′側に正しい配列性で挿入され、そのプラスミドベクターのワクシニアウィルスＴＫ遺伝子配列の５°及び３′末端を両側に各々有する組換え体を選別した。

この新たな構築物ｐＶ８を使用し、Ｓ−抗原遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルスＶ８の起源である野性型ワクシニアウィルスで感染させたｃＶ１細胞をトランスフェクトした。

マウスＩｇＧ免疫グロブリンのヒンジ領域の６アミノ酸、トランスメンブラン・ドメインの２６アミノ酸、及び細胞内ドメインの２８アミノ酸を含有する１　８６　ｂｐ　ＨａｅＩ［［フラグメントを、ティラー（１９８２）らに開示されているγ１ｃＤＮＡクローンから分離した。次いで、配列５°−ＣＣＧＣＡＴＧＣＧＣ，３″の５ｐｈＩリンカ−ＤＮＡをこのＨａｅＩＩ［フラグメントにライゲートし、５ｐｈＩを用いて消化してサブクローンＩ）ＰＣ２７Ａｈａ２のＳ−抗原遺伝子の３°末端から６５ｂｐに位置する唯一のＳ　ｐｈ　１部位にクローンした。

次いで、Ｓ−抗原遺伝子に関して正しい配列性で挿入された５ｐｈＩフラグメントを含有する得られたクローンｐＡ２０を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、得られた〜１０８０ｂｐフラグメントを前述したｐＧＳ６２のＥｃｏＲＩ部位に正しい配向てクローンし、プラスミドｐＶＡ２０を得た。このプラスミドＤＮＡを用い、ワクシニア感染ＣＶｔ細胞にトランスフェクトして組換えワクシニアウィルスＶＡ２０を産生じた。

組換えワクシニアウィルスの生産及び選別方法方法は、２５μｇ／ｌｎＱ　５− ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）の存在下、単層のＴＫ−１４３細胞を含有する９６−ウェルマイクロタイター皿に於ける希釈終末点法を２回行なうことによって唯一のウィルス・プラークを選別することを除いては、マケット（１９８４）らに開示されている。Ｓ−抗原遺伝子を含有する組換えウィルスを、ＤＮＡの存在についてドツト・プロット分析（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）によってスクリーニングするか、又はＳ−抗原の生産については、１１アミノ酸ＦＣ２７Ｓ−抗原反復ポリペプチドの２３コピーを含有するクローンＡｇ１６［＝＋ベベルＣｏｐｐｅｌ）他、１９８３］由来のβ−カラクトシダーゼ融合ポリペプチドで家兎を免疫することにより得た高力価ポリクローナル抗血清Ｒ２１０によってＳ−抗原を検出してスクリーニングした。

組換えワクシニア感染細胞に於けるＳ−抗原の発現融合単層体のＢ２Ｏ−１細胞を、精製した組換えウィルス１　ｐｆｕ／細胞を用いて常法通りに感染させ、３７℃で１８−４８時間インキュベートし、感染された細胞及び／又１よ上清を捕集してＳＤＳ試料緩衝液に溶解し、煮沸した。次いで、Ｓ−抗原分子の反復エピトープを認識する家兎抗Ｓ−抗原抗血清Ｒ２１０を用いた免疫プロット法、及びプローブ法によって試料を分析した。

トリトンＸＩ　１４分配法　組換えワクシニア感染細胞をＰＢＳ中０．５％トリトンＸＩ　１４に４℃で１時間溶解した。２００　Ｏｒｐｍで遠心分離し、トリトンＸ１１４中の核を取り除いた後、可溶性物質を０．０６％シヨ糖／ＰＢＳ中６％トリトンのクッションに重層し、次いで温度を３７℃に上げた。不溶性物質の白濁性懸濁液を３７℃の遠心分離によって除去した。トリトンＸＩ　１４ベレツトと名付けたこの分画は、トリトンＸ１１４界面活性剤に対する疎水性トランスメンプラン配列の強い親和性によってこの全膜タンパク質を含有しているはずである（これは温度を上昇させると不溶性となる［ポーダー（Ｂｏｒｄｉｅｒ）、＋９８１］。可溶性タンパク質を含存するはずの上清も捕集した。夾雑物を少なくするために各分画を更に精製工程にかけた。次いで、各分画の試料をＳＤＳ試料緩衝液に加え、免疫プロット法によって分析した。

免疫蛍光検査法　Ｂ１０−１細胞を無菌のカバーグラス上で６時間増殖させた後、それらをＶ８若しくはＶＡ２０組換えウィルスのいずれか、又は対照としてＴＫ＝非組換えウィルスを用い、０．５ｐｒｕ／細胞で感染させた。１８時間の後、カバーグラスを冷ＰＢＳ中で洗浄し、次いで素早く家兎抗Ｓ−抗原抗血清、次いでＦＩＴＣ複合ヒツジ抗−家兎抗体を用いて染色した。次いで、グリセリン中に置き蛍光顕微鏡で観察する前に、細胞を冷９５％エタノール＝５％水酢酸にて固定化させた。

細胞に透過性を付与するために、染色の前に感染細胞の類似群を冷９５％エタノール：５％氷酢酸に固定化させた。

動物の免疫精製した組換え体又はＴＫ−野性型ウィルスのＩＯ’ＰＦＵを家兎の後部背中に皮内注射を一回して家兎を免疫した後、６週間後に２回目の免疫を行った。最初の免疫から２．３日して、皮下に病変がみられ、それは直径約１から１　、５　ｃｍの大きさに達していた。時としてこれらの病変部は潰瘍を形成していた。２週間後では、病変部はこれ以上出現しなかった。ｌ過量おきに家兎から採血し、得られた血清を抗Ｓ−抗原又は抗ワクシニア抗体に関してＥＬ　Ｔ　ＳＡ分析した。年令及び体重の類似した各系統の通交マウスを、ウィルスｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ ＰＦＵの１回腹腔内注射によって免疫した後、３週間後に２回目の免疫を行った。初回免疫の３週間後、並びに再免疫の１２日後及び３週間後に、常法により各々血清を捕集した。抗Ｓ−抗原と抗ワタシニア抗体の１２価を、ＥＬＩＳＡ分析に於ける血清の連続的希釈によって検定した。

ＦＣ２７ゲノム・クローンＦＣ２７，４，Ｓの８８０　ｂｐＡｈａｌｌｌフラグメント（コーマン他、１９８５Ｘ第１ｂ図）を、ワクシニアウィルス・トランスフェクション・プラスミドｐＧＳ６２（マケットらに開示されているｐＧｓ２０の誘導体）のＥｃｏＲＩ部位にクローンした。

この構築物に於いて、Ｓ−抗原遺伝子の開始コドンは、ワクシニア７゜５に遺伝子プロモーター（第１ｃ図）に隣接するＥｃｏＲＩクローニング部位から４ｏｂｐ下流に位置している。このメヂオニン・コドンでの翻訳の開始、及び８２２ヌクレオチド下流の終止コドンでの終止により、シグナル・ペプチドの開裂の後の長さ２７４アミノ酸又は大きさ約２８にダルトンのタンパク質が生じる。このタンパク質は、１１アミノ酸反復ポリペプチドの１３コピーを含有している。

この反復エピトープをコードしている、Ａｇ１６と呼称されるｃＤＮＡクローンは、既に開示されている（コベル他、１９８３）。このＣＤＮＡの配列から、安定なβ−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドのＰ、フアルシパルム・セグメントは、反復１１アミノ酸ポリペプチドで構成されていることは間違いない。この融合ポリペプチドに対する家兎抗体は、２２０にダルトンの天然Ｓ−抗原分子を認識する（コベル他、１９８３）。Ｖ８感染細胞から分離されたタンパク質のプラーク免疫検定及び免疫プロットの両方の検定では、これらの抗体は、組換えワクシニアウィルスＶ８によって産生されるタンパク質と特異的に反応した（第２ｂ図、レーン２）。しかし、みかけの分子のサイズは、配列から予想される２７にダルトンより乙大きいサイズである。更に、量的には少ないがより小さいバンドおよびより大きいバンドも多数存在していた。同じ見かけの分子量のタンパク質がｐｕｃ９のβ−ガラクトシダーゼ・プロモーター要素（第２図、レーンｌ）のコントロール下で、大腸菌で創製されるので、この異常な分子量はグリコジル化に基づくものでない。更に、組換えウィルスに於けるＤＮＡ挿入体は、実際、正確な長さであった（データは示していない）。本発明者らは、不規則なＳＤＳ結合特性により、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ検定による見かけの分子量に異常を生じたと考えている。このように、Ｓ−抗原は、ワクシニア・プロモーター要素のコントロール下で組換えワクシニア感染細胞に於いて合成されると思われる。

Ｓ−抗原をワクシニア感染細胞から分泌させる。

単層体のＢ５Ｃｌ細胞を、精製した組換えウィルス■８を用いて感染させた。１時間後、ウィルス接種物を新鮮な培地と取り換えた後、様々な時間に細胞と培養培地を捕集し、遠心分離によって分離して免疫プロット分析を行った。感染後３ −４時間して培地中にＳ−抗原が検出され始め（第３図）、更に４８時間にわたって増加していき、合成されたＳ−抗原の全量の６５％総量に達した（第２ｂ及び０図）。抗ワクシニア抗体を使用した対照実験により、これは上清物質中に存在するウィルスによるものでないことが判明した（データは開示しなかった）。

明らかにＳ−抗原は、それが増員生殖後期（シゾゴニー）に於いて寄生虫液胞に寄生虫から分泌されるのと同様にワタシニア感染真核生物細胞から分泌される。

このデータにより、種が異なっているにもかかわらずシグナルポリペプチドなどの認識シグナルが認識されることが判る。

■８組換えウィルスを用いた動物の免疫実験操作に記載したように３匹の家兎を免疫した。これらの抗体力価は、３匹のうち２匹は免疫ｉチのレベルより高くなく、３番目の家兎は１：５０より低かった。抗ワクシニア抗体は、３動物とも全て非常に高いレベルに達した。各群３動物の１３系統マウスも種痘した。前記の前免疫値の抗体力価は少ししか増加していないことが、血清の１＝２０希釈で観察された。

本発明者らは、Ｓ−抗原の発現は高レベルであるが、多分、この分泌された分子がウィルス感染細胞の表面に正しく存在しないので、免疫系によって効果的に認識されないと結論付けた。

５Ｊ抗原へのトランスメンブラン配列の付加ヒンジ領域部、トランスメンブラン及び細胞内ドメインの全体をコードしている配列を含有するマウスγ１ｃＤＮＡクローンのフラグメントを、５ｐｈＩ平滑末端アダプターを使用し、Ｓ−抗原遺伝子の３′末端に位置するＳ　ｐｈ　１部位にフレーム内（相内）でクローンし、雑種遺伝子ｐＶＡ、２０を作成した（第４図参照）。次いで、この遺伝子をｖ８クローンと同一の、ｐＧＳ６２のクローニング部位に導入し、実験操作に記載したようにワクシニア感染ＣＶＩ細胞にトランスフェクトした。この雑種タンパク質の発現レベルは、■８組換え体と同様であったが、該タンパク質はワクシニア感染細胞から分泌されなかった（第５図）。

この判定基準によって、トランスメンブラン・セグメントを含有する雑種Ｓ−抗原が通常の完全な膜タンパク質として挙動するかどうかを試験するために、トリトンＸＩ　１４分配実験（ボーダー、１９８１）を行った。実際、■８タンパク質は、もっばら親水性可溶性タンパク質として挙動するのに対し、ＶＡ２０タンパク質の大部分は界面活性剤相に分配された（第６図）。このことは、疎水性トランスメンブラン配列が可溶性Ｓ−抗原タンパク質を膜関連タンパク質に変換したことを示している。ＶＡ２０又は■８組換えウィルスのいずれかで感染したＢ１０−１細胞を、感染１８時間後に間接免疫蛍光検査にかけた。冷９５％エタノールー５％氷酢酸中での細胞の固定化は、膜に透過性を付与し、抗体による原形質標識を可能にするために染色の前に行うか、又は表面結合抗原だけを検出するために染色後に行うかのいずれで実施した。第７図に示した結果によって、Ｖ８感染細胞には表面の標識はなく、Ｖ　Ａ、　２０感染細胞の表面には明瞭な標識のあることが判る。より高濃度の抗体では、ｖ８感染細胞に低レベルではあるが有意なレベルの表面標識を観察するこ７８組換えウィルスを用いた初回免疫の後、ワクシニア抗体に対して異なった応答を示すマウスの２系統を選択し、ＶＡ２０ウィルスの免疫抗原性について検定した。Ｖ８及びＶＡ２０ウィルスのｌＯ’ ＰＦＵの腹腔的注射に対するこれらのマウスの応答を、第８図に示している。３匹の家兎についても免疫したのでその結果を第９図に示す。第９ａ図は、感染後２週間のＶＡ２０免疫した家兎に於ける抗Ｓ−抗原抗体力価のピークを示すものであるが、抗ワクシニア抗体力価は次の３週間にわたっても上昇し続けた。■８組換え体に対する家兎応答性は非常に低く、測定困難であるが同様の結果が得られた。第９Ｂ図では、■８及びＶＡ２０組換え体を与えた６匹全ての家兎に於いて最大の応答を示す血清を連続的に希釈することによってＥＬＩＳＡ分析でその血清を比較している。３匹の家兎から得た血清の個々の力価には大きな相異が認められたが、タンパク質の免疫原性に於ける明らかな増加が認められる。

χ隻■ス実施例１は、それ自身表面抗原分子ではないが生物学的に重要な分子を、組換えワクシニアウィルス感染細胞の表面に向は直すことができるより一般的な方法の具体例である。本実施例も、導入された外来性抗原に対する良好な免疫応答の誘発にとって、抗原のこの表面上の位置がどんなに重要であるかを示すものである。

実施例１で選ばれた抗原であるマラリアＳ−抗原は、第一に分子の免疫優性の反復部分が著しく変異するので、現在までのところ、有効なワクチンの候補として挙げられてはいなかった。これらの反復構造は、その数、長さ及びアミノ酸組成の点に於いて著しく変化する。この変化は、その分泌タンパク質としての挙動にはたいして影響を与えないが、その免疫原性に多大の影響を与える。

本実施例は、このＳ−抗原反復エピトープを、ワクヂン分子として重要である無関係な配列で置換できることを示すしのである。多くの場合、適当なトランスメンブラン固定化配列（アンカー配列）を更に含有しているこれらの雑種分子は、既述した雑種Ｓ−抗原分子と同様、効果的に組換えウィルス感染細胞の表面に輸送されるはずである。

以下に記述するのは、Ｓ−抗原分子の反復部分を欠失させ、それを別の反復性エピトープと置換するのに必要な操作である。−例として、ザーカムスボロゾイト被覆タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　ｃ。

ａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＮＡＮＰ）配列［これは、熱帯熱マラリアのスポロゾイト（種虫）感染期に於いて免疫を誘起する重要なエピトープであると確認されている］を選別した。しかし、この新規なエピトープは更に、他のマラリアの生活環の分子、又は他の臨床的に重要な病原体の抗原から誘導することもてきる。このように、本実施例は、抗原決定基を、組換えワクシニアウィルス感染細胞の表面にこのエピトープを運ぶように設計された「担体」分子に仕上げ得る方法のひとつの例である。本発明者らはまた、別の組換えウィルスであるネズミ・レトロウィルスも、培養液中、ウィルス感染マウス細胞の表面上に雑種ＶＡ２０遺伝子の生産物を発現させることができることを確認した。このことにより、本方法が各種の組換えウィルスのベクター系に於いて、任意の多数の「担体」エピトープのうちの発現される各種の抗原性エピトープに一般的に適用できることが判明した。

第１Ｏ図は、ｐＶＡ、２０から３３ｂｐＳ−抗原反復配列を欠失させ、それらをＰ、ファルシパルム・サーカムスボロゾイト被覆タンパク質の４アミノ酸反復エピトープの１６．３２及び４８コピーをコードしている配列で置換するのに必要な操作の模式図である。

第１１図は、優性４アミノ酸反復単位ＮＡＮＰの配列を示すＰ。

ファルシパルム・サーカムスポロゾイト被覆タンパク質遺伝子（最上段）の模式図を表すものである。下には、新しい挿入体を合成するのに使用される合成オリゴヌクレオチドの配列、及びＢａｍＨＩ切断プラスミドｐＬ　Ｋ　８　（Ｓ−抗原配列）と新しい挿入体配列との間の５′及び３゛結合領域の配列を表す（最下段）ものである。挿入体の５“と３°末端の中実ボックスに示した６ｂｐアダプタ一配列、挿入体をはさんでいる５ａｕ３Ａ部位、及びＢａｍＨ１部位かどのようにして挿入体の５°末端のみて再生されるかに注意するべきである。５′及び３゛という用語は、挿入ＤＮＡのコード鎖の両末端を表わすものである。

第１２図は、Ｐ、ファルシパルム・サーカムスボロゾイト・タンパク質の１２ｂｐ反復配列の１６．３２及び４８フビーをそれぞれ含有するプラスミドｐ６．４４、ｐ６６．６及びｐ、６６６．３４由来のＤＮＡの二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列決定反応を示すものである。解り易くするために、ｒＡＪ反応のみを３構築物に関して示しである。左側は、配列５’−ＡＡＣＶＣＣＡＡＣＣＣ−３’＋７）組み立テニ使用される合成オリゴヌクレオチドのコード鎖の配列である。見て解るように、へ二重鎖の２対は、反復の各コピーで見られる。塩基配列決定プライマーは、ＢａｍＨＴ部位の５°側２０ｂｐに位置しているコード鎖配列にホモローガスな１７ヌクレオチドであった。

第１３図は、Ｋ　Ｌ　Ｈと接合した４アミノ酸配列ＮＡＮＰの３コビ−をコードしているアミノ酸長さ１２個の合成ペプチドを用い、家兎を免疫して生産した抗血清（Ｒ５１，６抗Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｐ　３Ｋ　Ｌ　Ｈ）を使用してプローブした組換えウィルス感染Ｂ５Ｃ−１細胞由来のタンパク質を免疫プロットした検査の結果を示す。この抗血清は、既述した−６．４４雑種遺伝子を含有する組換えウィルス（ｖ６．４４）で感染された細胞によって産生されるかＢａｍＨ１部位に挿入された無関係の配列を含有する同様の構築物（Ｖ−コントロール）で感染された細胞での類似操作では産生されないポリペプチドを認識する。右側に分子！（Ｋダルトン）を示す。

Ｓ−抗原反復配列の欠失既述したｐＶＡ２０構築物からＳ−抗原反復配列を欠失させる前に、その組み立てに使用されるｐＧＳ６２に多数の変化を付与した。

最初にプラスミドのｐＢＲ３２２部分のＣｌａｌ部位を、Ｃｌａｌ部分消化、クレノー（Ｋ　１ｅｎｏｗ）「充填」、及び再ライゲーションにより除去した。合成オリゴヌクレオチド・アダプター（ＡＡＴＴＡＴＣＧＡＴ）を用いて、ベクターのワクシニアＴＫ遺伝子部分の今は唯一のＣｌａｌ部位に、強い雑種細菌性プロモーターＬａｃＵＶ５／Ｔｒｐ由来の２５１ｂｐＴａｑＩ−ＥｃｏＲ１フラグメントを挿入し、ＥｅｏＲＩ部位をＣｌａＩ部位に変換した［アマン（Ａｍａｎｎ）他・　１９８３］・これにより新規なベクターｐＧ　Ｓ　６２　ｔａｃ（第１０図の上段参照）が生成した。このベクターを用いてベクターの多数クローニング部位（ＭＣ６）に挿入された遺伝子の発現を、細菌のみならずウィルス感染細胞に於いても検査することができる。次いで、ＢａｍＨＩ部位をＢａｎＨＩ消化によってＭＣ３から欠失させ、クレノー「充填」し、再ライゲートすることで新規なプラスミドｐＧ　Ｓ　６２−ｔａｃ［ＢａｍＨＩＡ　］を得た。ｐＶＡ２０由来ノ１０８８ｂｌ）ＥｃｏＲ１部位をＭＣＳのＥｃｏＲ■にクローンしてプラスミドｐＣＬ４を得た。

同様のクローニング操作で分離したｐＶＡ２０のＥＣ０ＲＩフラグメントを５ａｕ３Ａで消化した。この酵素はＳ−抗原反復部の各々を一回切断する。反復部分に対する非反復フラグメント５°及び３′側を分離し、ベクターｉ）Ｇ　９６２ −　ｔａｃ［Ｂ　ａｍＨＩ　ΔコのＥｃｏＲ１部位にライゲートして第１θ図に示すような新規な構築物ｐＬＫ８を得た。

プラスミドＩ）ＬＫ８は、３３ｂｐ反復配列のひとつの完全なコピーよりも少なく、この残りの部分反復配列内に位置する唯一のＢａｍＨ１部位を有するＳ−抗原遺伝子を含有している。抗原決定基をコードしている好適に操作された配列をクローンでき、Ｓ−抗原反復エビトープを適切に置換し得るのはこの部位である。

本実施例に記載した状況で獲得する配列は、ＢａｍＨＩｒ粘着末端」を備えておく必要があり、また全雑種遺伝子の解読フレームが維持されるように操作される必要があろう。このためには、挿入ＤＮＡの全長が３塩基対の等倍数であり、解読フレームが挿入体（のコードｔａ）の５°末端のＧＧＡＴＣＣＢａｍＨＩ部位のＧＡＴコドンの相内にある必要がある。

また、発現され得るエピトープは、たとえこのエピトープが天然の抗原分子に於いて１度しか発現されないとしても、その免疫原性が可能な限り最大になるように多数回反復しなければならないことが知られている。

例えば、Ｐ、ファルシパルム・サーカムスボロゾイト被覆タンパク質の優性Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｐアミノ酸反復エピトープをコードしている１２ｂｐ配列を選別した。

しかし、同様に、線状エピトープ、又は他の抗原分子のエピトープに一致した［ミモトーブ（ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）　Ｊに同一の操作を好適に適用できることは理解されるであろう。

本実施例では、組換えワタシニアウイルス感染哨乳動物細胞に於いて最良に発現できる様にコドンを「哺乳類化（ｍａｍｍｌｉａｎｉｚｅ）Ｊすることが可能な、ＮＡＮＰペプチドをコードしている短いｔ２ｂｐ配列を化学的に合成する道を選んだ。これは、好ましいコドンの使い方に於いて噴孔動物細胞とは異なった強いバイアスを示すＰ、ファルシパルムなどの種からの外来性タンパク質を最良に発現させ１場合に重要である。しかし、挿入体は、既述した長さ及び相の要件を充足する限り、天然に存在する配列から誘導することもできる。

新規な反復エピトープの合成、及びＳ−抗原遺伝子の本体へのその挿入以下の操作は第１１図の模式図に説明されている。

２つの相補的オリゴヌクレオチド配列、５’−ＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣ−３’ 及び５’−ＧＧＴＴＧＧＣ：ＧＴＴＧＧ−３°をオリゴヌクレオチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｂｅｓｉｓｅｒ）で作成し、ＨＰ　Ｌ　Ｃによって精製した。次いで、これらを枠壁的方法でアニーリングしてライゲートする前にキナーゼ処理した。オリゴヌクレオチドを、末端が１方向だけに相補性を持つように設計することで、二重鎖モノマーの「ヘッドーテイル（頭−尾）」のライゲーションだけを可能にした。次いで、ライゲートされたフラグメントを、低ゲル化温度のアガロースゲル上、大きさに基づく分画を行い、大きさ力月８０から６００ｂｐの範囲のＤＮＡ分子を分離し、アガロースから精製した。次いで、これらの大きさの分画分子を、５°−ＧＡＴＣＣＣ−３′及び５’−ＧＡＴＣＧＧ−３°の配列を有する２つのキナーゼ処理済合成オリゴヌクレオチドの存在下、ＢａｍＨＩ切断／仔牛腸内フォスファターゼ処理ｐＬＫ８プラスミドＤＮＡとライゲートさせた。反復オリゴヌクレオチドフラグメントの３°突出ＣＣ及びＣＧ末端の、Ｉ）ＬＫ８の５° 突出ＧＡＴＣ粘着末端とのライゲーションを可能にするために、これらのアダプターを設計し、挿入体配列がＳ−抗原の配列の”フレーム中”にあるようにした。

１２ｂｐ配列を含有する組換え細菌性クローンを、γ−［３！ｐ］　ｐ。

ＴＰキナーゼ処理オリゴヌクレオチド（配列５°−ＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣ− ３’）を使用したコロニー・ハイブリダイゼーションによって選別した。

プラスミドＤ　Ｎ　Ａをポジティブクローンから分離し、制限酵素を用いて消化して最も長い挿入体を含有するクローンを検出した。次いで、アルカリ変性させたプラスミドＤＮＡｆｆ製物について、標準的な二重鎖ＤＮＡ塩基配列決定法を使用してこれらの多くのクローンの塩基配列を調へ、正しい配向で挿入体を有するクローンを選別して予想した配列を確認した。次いで、このプラスミドＤＮＡ（ｐ６゜４４、第１０図）を野性型ワクシニアウィルス感染細胞に直接トランスフェクトして既述したＴＫ−ＩＪＩ換えウィルスを生産した。

サブクローンを更に行うことによる反復エピトープの長さの伸張雑種遺伝子ｐ６．４．４に於ける新規な１９２ｂｐ挿入体は、組換えプラスミドからの分離精製を可能にする５ａａ３Ａ部位を両端に有する。

しかし、このハイブリッドでは、挿入体のコード鎖の５°末端にあるひとつのＢａｍＨＩ部位だけが再生されている（第１１図）。従って、ＢａｍＨＩを用いて組換えプラスミドを線状化でき、フォスファターゼ処理しど分離した１　９２ｂｌｌｌＳａｕ３　Ａフラグメントとライゲートすることができる。プラスミドＤＮＡを、このクローニングで得られた形質転換細菌から調製し、制限酵素を用いて消化し、二重反復（又は三重反復）の挿入体を有するクローンを選別した。次いで、これらの塩基配列を決定して正しい配向であるかを検定し、予想した配列を確認した。これら新規な雑種体は再び挿入体の５゛末端に唯一のＢａｍＨ１部位を有しており、この工程を何度も繰り返すことであらゆる所望の長さに挿入体の大きさを伸張させることができる。本実施例では、Ｃ９Ｐ遺伝子の１２ｂｐ反復の１６（ｐ６．４４）、３２（ｐ６６．６）及び４８（ｐ６６６．３４）を含有する挿入体を調製した（第１０及び１２図参照）。

雑種抗原の特性化、及び組換えウィルス感染細胞に於けるその完敗組換えワクシニアウィルスに導入して、これらの雑種遺伝子をウィルス感染細胞に於いて試験し、エピトープに特異的な抗体に認識され得る安定な雑種タンパク質が産生されるかどうかを観察した。

この例は第１３図に説明されており、これは、ＮＡＮＰペプチドの３コピーからなる１２アミノ酸の長さの合成ペプチドに対して惹起させた家兎抗血清を用いてプローブされた、Ｖ６．４４ウィルス感染哺乳動物Ｂ５Ｃ−１細胞によって産生されるタンパク質のウェスターン・プロット法の結果を示している。

参肴文献ボーダー（Ｂｏｒｄｉｅｒ、ＣＸ１９８１　）、「トリトンＸ１１４中の完全膜タンパク質の相分離」、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）、２５６．１６０４−１６０７゜フペル（Ｃｏｐｐｅｌ、Ｒ，Ｌ）、コーマン（Ｃｏｗｍａｎ、Ａ、　Ｆ、　）、リンゲルバッハ（Ｌｉｎｇｅｌｂａｃｈ、に、　Ｒ，）、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ、Ｇ、　Ｖ、　）、セイント（Ｓａｉｎｔ、Ｒ，Ｂ、　）、ケンプ（Ｋｅｍｐ、Ｄ、　Ｊ、　）、及びア〉・ダース（Ａｎｄｅｒｓ、Ｒ，Ｆ、　ＸＩ　９８３）、「ＩＩアミノ酸の反復配列を含有するプラスモチラム・ファルシパルムの分離−特異的なＳ− 抗原」、ネイチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）、１度立、７５１−７５６゜クレー？−（Ｃｒｅｍｅｒ、に、　Ｊ、　）、マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ、　）、ウォーレンベルク（Ｗｏｈｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｃ）、ノッキン（Ｎｏｔｋｉｎｓ、Ａ、Ｌ、　）及びモス（Ｍｏｓｓ、Ｂ、　ＸＩ　９８５）、［マウスに於いて潜伏性ヘルペスを予防する単純ヘルペスウィルス１型糖タンパク質りを発現するワグアン（Ｇｕａｎ、Ｊ−Ｌ）及びローズ（Ｒｏｓｅ、Ｊ　、　Ｋ、　ＸＩ　９８４）、「ゴルジ複合体に運搬１．、細胞表面に運搬しないことに基づく分泌性タンパク質のトランスメンブランタンパク質への転換」、セル（Ｃｅｌｌ）３７．７７９−７８７゜ケンブ（Ｋｅｍｐ、Ｄ、　Ｊ、　）、コベル（Ｃｏｐｐｅｌ、Ｒ，Ｌ、　）、コーマン（Ｃｏｗｍａｎ、Ａ、　Ｆ、　）、セイント（Ｓａｉｎｔ、Ｒ，Ｂ、　）、ブラウン、及びアンダース（Ａｎｄｅｒｓ、Ｒ，Ｆ、　ＸＩ　９８３）、［大腸菌に於けるプラスモチラム・ファルシパルム血液期抗原の発現：ヒト免疫からの抗体の検出」、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデミーマケット、スミス及びモス（１９８２）、［ワクシニアウィルス：選択できる真核細胞クローニング及び発現ベクター玉プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・ザイエンシイズＵＳＡ旦、７４１５−７４１９゜マケット、スミス及びモス（１９８４）、「外来性遺伝子を発現する感染ワクシニアウィルス組換え体を生産及び選別する一般的方法」モス、スミス、ブラン（Ｇｅｒｉｎ、Ｊ、　Ｌ、）及びバーセル（Ｐ　ｕｒｃｅｌｌ。

Ｒ，ｉ−ｒ、　ＸＩ　９８４）、「チンパンジーをＢ型肝炎から保護する生きバニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ、　）及びバオレツチ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、　Ｘ１９８２）、「クローニングベクターとしてのポックスウィルスの組み立て：単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子の、感染ワクシニアウィルスＤＮＡへの導入」、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシイズＵＳＡ７９．４９２パニカリ、ディビス（Ｄａｖｉｓ、Ｓ、　Ｗ、　）、ワインベルク及びバオレッチ（１９８３）、「遺伝子操作したポックスウィルスを使用することによる肝ワクチンの組み立て；インフルエンザウィルス血球凝集素を発現する組換えワクシニアウィルスの生物学的活性」、プロシアディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシイズＵＳＡ８０．５３６４−５３６８゜バオレッチ、リピンスカス（Ｌｉｐｉｎｓｋａｓ、Ｂ、　Ｒ，）、サムソノツホ（Ｓａｍｓｏｎｏｆｆ、Ｃ，）、メルカー（Ｍｅｒｃｅｒ、　Ｓ　、　）及びパニカリ（１９８４）、「遺伝子操作したポックスウィルスを使用することによる肝ワクヂンの組み立て：Ｂ型肝炎表面抗原及び単純ヘルペスウィルス糖タンパク質りを発現するワクシニアウィルス組換え体の生物学的活性」、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・ザイエンシイズＵＳＡ８１Ｓ　＋９３−１９７゜スミス、マケット及びモス（１９８３ａ）、［Ｂ型肝炎ウィルス表面スミス、パー７　イー　（Ｍｕｒｐｈｙ、Ｂ　、　Ｒ、）及びモス（１９８３ｂ）、「インフルエンザ血球凝集素遺伝子を発現し、ハムスターに於いてインフルエンザウィルス感染症に対する耐性を誘導する感染ワクシニアウィルス組換え体の組み立て及び特徴付け」、プロシーディング・ティラー（Ｔｙｌｅｒ、Ｂ、　Ｍ、　）、コーマン（Ｃｏｔｖｍａｎ、Ａ、　Ｆ、　）、ゲロンダキス（Ｇｅｒｏｎｄａｋｉｓ、Ｓ、　Ｄ、　）、アダムス（Ａｄａｍｓ、　Ｊ　、　Ｍ、　）及びパーナート（Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｏ，Ｘｉ　９８２）、［高度な保存トランスメンプラン配列及び細胞内ドメインの２８残基をコードしている表面免疫グロブリンγ鎖のｍＲＮＡＪ、プロシーディング・オフ・ナショバレンツーラ（Ｖ　ａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ　、　）、コイト（Ｃｏｉｔ、Ｄ、　）、メゾイナーセルビー（Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｅｌｂｙ、Ｍ、　Ａ、　）、クオ（Ｋｕｏ、Ｃ，Ｈ，）、フォンネスト（Ｖａｎ　Ｎｅ５ｔ、Ｇ、　）、ブルク（Ｂｕｒｋｅ、Ｒ，Ｌ、　）、プル（Ｂｕｌｌ、Ｐ、　）、アープイア（Ｕｒｄｅａ、Ｍ、　Ｓ、　）及びグラベス（Ｇｒａｖｅｓ、Ｐ、　Ｖ、　ＸＩ　９８５）、「酵母での抗原操作、雑種Ｂ型肝炎表面抗原−単純ヘルペスＩｇＤ粒子の合成及びアセンブリー」、バイオテクノロジー（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　３．３２３−３２６゜アマン（Ａｍａｎｎ、Ｅ、　）、ブロシウス（Ｂ　ｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ　、　）及びブタシーン（Ｐｔａｓｈｎｅ、Ｍ、　ＸＩ　９８３）、「大腸菌に於いてクローンされた遺伝子の発現を調節するのに有用な雑種Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ａｃプロモーターを有するベクター」、ジーン（Ｇｅｎｅ）２５．１６７−１．７８゜Ａｈａｌｌｌ　ＡｌＩＣ１１１１Ｆ／Ｇ、２Ｆｔｃ、　、３：拍Ｐ朶四幼ｐ凄ゆＶ８　ＶＡ２０扮　配。

トドへ゛のトラ・γりｌ＋１１＋ｌＩＩ勇１’Ａｌ１１（ｌｌｌ＋＋−ｐ、ＴハＩＩＱ（、ＩＭＱｃｅＥＰ　１２０７８　ＣＡ　１１７２５８４　Ｆｉｌ　２４４２２７１　ＪＰ５５１０４８８６ＡＵ　２３４２４／８４　０Ｋ　３７１０／８４　ＥＰ　１１０３８５　讐０８４０２０７７

Claims

【特許請求の範囲】

１．雑種ポリペプチドをウイルス感染細胞の表面上若しくは表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともに、ウイルス又はウイルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ含む該雑種ポリペプチドをコードしている配列を含有することを特徴とする組換えウイルス。
２．雑種ポリペプチドをワクシニアウイルス感染細胞の表面上若しくは表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともに、ワクシニアウイルス又はワクシニアウイルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ含む該雑種ポリペプチドをコードしている配列を含有することを特徴とする組換えワクシニアウイルス。
３．雑種ポリペプチドのコード配列がＰ．ファルシパルムの免疫原性ポリペプチドを少なくともひとつコードしている配列を含有する第１項又は第２項のいずれかに記載の組換えウイルス。
４．Ｐ．ファルシパルムの少なくともひとつの免疫原性ポリペプチドをコードしている配列がＰ．ファルシパルムの免疫原性ポリペプチドの反復部分の少なくともひとつのコピーをコードしている配列である第３項に記載の組換えウイルス。
５．Ｐ．ファルシパルムの少なくともひとつの免疫原性ポリペプチドをコードしている配列が該反復部分のひとつ以上のコピーをコードしている配列である第４項の組換えウイルス。
６．Ｐ．ファルシパルムの免疫原性ポリペプチドがＰ．ファルシパルムの無性生殖血液期抗原である第３項に記載の組換えウイルス。
７．Ｐ．ファルシパルムのの免疫原性ポリペプチドがＰ．ファルシパルムのスポロゾイト被膜タンパク質である第３項に記載の組換えウイルス。
８．雑種ポリペプチドのコード配列がトランスメンプランのコード配列を含有する第１項又は第２項に記載の組換えウイルス。
９．雑種ポリペプチドのコード配列が、マウス免疫グロブリン、ワクシニアウイルス表面タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原のうちから選ばれる表面又は膜関連ポリペプチドのコード配列を含有する第１項又は第２項に記載の組換えウイルス。
１０．雑種ポリペプチドをワクシニアウイルス感染細胞の表面上若しくは表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともに、ワクシニアウイルス又はワクシニアウイルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ含む該雑種ポリペプチドをコードしている配列を含有するＤＮＡ分子。
１１．雑種ポリペプチドをワクシニアウイルス感染細胞の表面上若しくは表面に位置させるための表面又は膜関連ポリペプチド・セグメントとともに、ワクシニアウイルス又はワクシニアウイルス感染細胞にとって外来性の免疫原性ポリペプチド・セグメントを少なくともひとつ舎有する雑種ポリペプチド。