JPH07170982A - ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents
ワクチンおよびその製造方法Info
- Publication number
- JPH07170982A JPH07170982A JP6212523A JP21252394A JPH07170982A JP H07170982 A JPH07170982 A JP H07170982A JP 6212523 A JP6212523 A JP 6212523A JP 21252394 A JP21252394 A JP 21252394A JP H07170982 A JPH07170982 A JP H07170982A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- vaccine
- pathogen
- sequence encoding
- nucleotide sequence
- Prior art date
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- Ceased
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 インフルエンザウイルスのＨＡタンパクの一
部または全長をコードする塩基配列と病原体由来物の一
部または全体をコードする塩基配列とが組み込まれたベ
クターであるワクシニアウイルスを含むワクチンおよび
その製造方法。病原体由来物をコードする塩基配列とし
て、例えば、ＨＩＶのエンベロープタンパクgp120 また
はgp160 をコードし少なくとも24塩基を含む塩基配列な
どを用いることができる。 【効果】 液性抗体の産生に加えて細胞性免疫による効
果も期待できるので種々の疾病の治療と予防に有用であ
る。
部または全長をコードする塩基配列と病原体由来物の一
部または全体をコードする塩基配列とが組み込まれたベ
クターであるワクシニアウイルスを含むワクチンおよび
その製造方法。病原体由来物をコードする塩基配列とし
て、例えば、ＨＩＶのエンベロープタンパクgp120 また
はgp160 をコードし少なくとも24塩基を含む塩基配列な
どを用いることができる。 【効果】 液性抗体の産生に加えて細胞性免疫による効
果も期待できるので種々の疾病の治療と予防に有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ワクチンおよびその製
造方法に関する。
造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在使用されているウイルスワクチン
は、弱毒生ワクチンまたは不活化ワクチンである。しか
し、頻繁な変異を引き起こすＨＩＶ (human immunodefi
ciency virus) に対して用いた場合には、これらの従来
型のワクチンは効果に明らかに問題があった。この問題
を解決するために、サブユニットワクチン、ペプチドワ
クチン、そしてウイルス遺伝子の一部をベクターに組込
んだ組み換え型のワクチンが検討されている。
は、弱毒生ワクチンまたは不活化ワクチンである。しか
し、頻繁な変異を引き起こすＨＩＶ (human immunodefi
ciency virus) に対して用いた場合には、これらの従来
型のワクチンは効果に明らかに問題があった。この問題
を解決するために、サブユニットワクチン、ペプチドワ
クチン、そしてウイルス遺伝子の一部をベクターに組込
んだ組み換え型のワクチンが検討されている。
【０００３】インフルエンザウイルスの血球凝集素（he
magglutinin, HA)をコードする塩基配列に、他の病原体
に由来する塩基配列を組合せて、ワクチンとして用いる
ことが可能なキメラタンパクを生産させることも知られ
ている（EP-546787-A)。また組み換えウイルスをワクチ
ンとして用いることについては、ＨＩＶのエンベロープ
(env) タンパクであるgp 160を発現する組み換えワクシ
ニアウイルスの使用（J. Clin. Immunol., 12, 429-43
6, 1992) および狂犬病ウイルスの表在タンパクを発現
する組み換えラクーンポックスウイルスの使用（Natur
e, 354, 520-522, 1991) が知られている。そのほか、
蛋白質・核酸・酵素 (37(3), 440-454, 1992) にワクチ
ンの開発についての解説がある。
magglutinin, HA)をコードする塩基配列に、他の病原体
に由来する塩基配列を組合せて、ワクチンとして用いる
ことが可能なキメラタンパクを生産させることも知られ
ている（EP-546787-A)。また組み換えウイルスをワクチ
ンとして用いることについては、ＨＩＶのエンベロープ
(env) タンパクであるgp 160を発現する組み換えワクシ
ニアウイルスの使用（J. Clin. Immunol., 12, 429-43
6, 1992) および狂犬病ウイルスの表在タンパクを発現
する組み換えラクーンポックスウイルスの使用（Natur
e, 354, 520-522, 1991) が知られている。そのほか、
蛋白質・核酸・酵素 (37(3), 440-454, 1992) にワクチ
ンの開発についての解説がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、液性
免疫に加え、特に細胞性免疫を顕著に誘導する優れたワ
クチンを提供することにある。
免疫に加え、特に細胞性免疫を顕著に誘導する優れたワ
クチンを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく研究を重ねた結果、インフルエンザウイル
スＨＡタンパクをコードする遺伝子にＨＩＶ由来のペプ
チド等である病原体由来物をコードするＤＮＡを挿入
し、さらにこの塩基配列を強力なプロモーターを有する
ベクター、特にワクシニアウイルスに組み込むことによ
り上記の課題を解決できることを見出した。本発明は上
記の知見を基に完成されたものである。
を解決すべく研究を重ねた結果、インフルエンザウイル
スＨＡタンパクをコードする遺伝子にＨＩＶ由来のペプ
チド等である病原体由来物をコードするＤＮＡを挿入
し、さらにこの塩基配列を強力なプロモーターを有する
ベクター、特にワクシニアウイルスに組み込むことによ
り上記の課題を解決できることを見出した。本発明は上
記の知見を基に完成されたものである。
【０００６】すなわち本発明は、インフルエンザウイル
スのＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩基配
列と病原体由来物の一部または全体をコードする塩基配
列とが組み込まれたベクターであるワクシニアウイルス
を含むワクチンを提供するものである。
スのＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩基配
列と病原体由来物の一部または全体をコードする塩基配
列とが組み込まれたベクターであるワクシニアウイルス
を含むワクチンを提供するものである。
【０００７】さらに、本発明の好ましい態様によれば、
上記のワクチンにおいて、病原体由来物をコードする塩
基配列がインフルエンザウイルスのＨＡタンパクのルー
プ領域をコードするＤＮＡに挿入されたワクチン；病原
体由来物がＨＩＶ由来の抗原物質であるワクチン；およ
び病原体由来物をコードする塩基配列がＨＩＶのエンベ
ロープタンパクgp120 またはgp160 をコードし少なくと
も24塩基を含む塩基配列であるワクチンが提供される。
上記のワクチンにおいて、病原体由来物をコードする塩
基配列がインフルエンザウイルスのＨＡタンパクのルー
プ領域をコードするＤＮＡに挿入されたワクチン；病原
体由来物がＨＩＶ由来の抗原物質であるワクチン；およ
び病原体由来物をコードする塩基配列がＨＩＶのエンベ
ロープタンパクgp120 またはgp160 をコードし少なくと
も24塩基を含む塩基配列であるワクチンが提供される。
【０００８】また、本発明の別の態様によれば、上記の
ワクチンの製造方法、上記のワクチンで免疫し細胞性免
疫を誘導する方法；及び、(a) 上記のワクチンで免疫す
る工程と、(b) インフルエンザウイルスのＨＡタンパク
の一部または全部に対応する部分と免疫を所望する抗原
物質に対応する部分とを含みバキュロウイルスとカイコ
の系で発現させたキメラタンパクでさらに追加免疫を行
う工程とを含む免疫方法が提供される。
ワクチンの製造方法、上記のワクチンで免疫し細胞性免
疫を誘導する方法；及び、(a) 上記のワクチンで免疫す
る工程と、(b) インフルエンザウイルスのＨＡタンパク
の一部または全部に対応する部分と免疫を所望する抗原
物質に対応する部分とを含みバキュロウイルスとカイコ
の系で発現させたキメラタンパクでさらに追加免疫を行
う工程とを含む免疫方法が提供される。
【０００９】本発明のワクチンには、インフルエンザウ
イルスのＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩
基配列が含まれる。本発明のワクチンに従えば、病原体
由来物の一部または全体をコードする塩基配列を、イン
フルエンザウイルスのＨＡタンパクのループ領域をコー
ドするＤＮＡに挿入することが好ましい。血清学的にみ
て、インフルエンザウイルスのＨＡタンパクをコードす
る遺伝子（インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子）は14種
の亜型に分類される。これらの亜型内においても抗原変
異が認められるが、この傾向は、特にヒトで流行するウ
イルスにおいて顕著である。株間でのアミノ酸変異が頻
繁に起こる領域は、機能的制約の少ない領域であり、こ
の領域の一例としてＨＡのループ領域を挙げることがで
きる。そのループ構造をコードする遺伝子領域に外来遺
伝子を挿入し、外来遺伝子由来の抗原の免疫原性を高め
ることができる。
イルスのＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩
基配列が含まれる。本発明のワクチンに従えば、病原体
由来物の一部または全体をコードする塩基配列を、イン
フルエンザウイルスのＨＡタンパクのループ領域をコー
ドするＤＮＡに挿入することが好ましい。血清学的にみ
て、インフルエンザウイルスのＨＡタンパクをコードす
る遺伝子（インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子）は14種
の亜型に分類される。これらの亜型内においても抗原変
異が認められるが、この傾向は、特にヒトで流行するウ
イルスにおいて顕著である。株間でのアミノ酸変異が頻
繁に起こる領域は、機能的制約の少ない領域であり、こ
の領域の一例としてＨＡのループ領域を挙げることがで
きる。そのループ構造をコードする遺伝子領域に外来遺
伝子を挿入し、外来遺伝子由来の抗原の免疫原性を高め
ることができる。
【００１０】病原体由来物をコードするＤＮＡとして
は、例えば、免疫を必要とする種々のウイルスや腫瘍由
来のＤＮＡ等を挙げることができる。より具体的には、
このようなＤＮＡの例として、インフルエンザウイル
ス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型
肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス由来のＤＮＡ、メラノ
ーマ等の腫瘍に由来するＤＮＡ、およびマラリア病原体
に由来するＤＮＡ（例えばプラスモジウムのメロゾイト
表面蛋白-1のエピトープ, Plasmodium merozoitesurfac
e protein-1 (MSP-1) epitopes: Journal of Immunolog
y, pp.3483-3490,1994) を挙げることができる。特に好
適なＤＮＡは細胞性免疫により効果的に治療および予防
できる疾病のウイルス（すなわち、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウ
イルス、Ｃ型肝炎ウイルス等）をコードするＤＮＡであ
る。
は、例えば、免疫を必要とする種々のウイルスや腫瘍由
来のＤＮＡ等を挙げることができる。より具体的には、
このようなＤＮＡの例として、インフルエンザウイル
ス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型
肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス由来のＤＮＡ、メラノ
ーマ等の腫瘍に由来するＤＮＡ、およびマラリア病原体
に由来するＤＮＡ（例えばプラスモジウムのメロゾイト
表面蛋白-1のエピトープ, Plasmodium merozoitesurfac
e protein-1 (MSP-1) epitopes: Journal of Immunolog
y, pp.3483-3490,1994) を挙げることができる。特に好
適なＤＮＡは細胞性免疫により効果的に治療および予防
できる疾病のウイルス（すなわち、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウ
イルス、Ｃ型肝炎ウイルス等）をコードするＤＮＡであ
る。
【００１１】病原体由来物をコードするＤＮＡは、免疫
を誘導するのに充分な長さを有していればよい。例え
ば、細胞性免疫を誘導するにはアミノ酸８個以上、体液
性免疫を誘導するにはアミノ酸13個以上をコードする塩
基を選択するのが適当である。それぞれの病原体につい
て予防または治療等の目的に応じて免疫の誘導に最も適
した部位及び長さを選択すべきである。
を誘導するのに充分な長さを有していればよい。例え
ば、細胞性免疫を誘導するにはアミノ酸８個以上、体液
性免疫を誘導するにはアミノ酸13個以上をコードする塩
基を選択するのが適当である。それぞれの病原体につい
て予防または治療等の目的に応じて免疫の誘導に最も適
した部位及び長さを選択すべきである。
【００１２】病原体由来物としてＨＩＶ由来の抗原物質
を用いる場合について本発明をさらに具体的に説明す
る。ＨＩＶ由来の抗原物質として、例えば、ＨＩＶエン
ベロープタンパク（envelope glycoprotein)のgp160 や
gp120 等を用いることができ、このタンパクの一部また
は全長をコードするＤＮＡをインフルエンザウイルスの
ＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩基配列と
組み合わせればよい。例えば、ＨＩＶのＶ３ループを前
記のＨＡタンパクのループ領域に挿入することにより、
ＨＩＶのエピトープを含むペプチド分子構造を崩さず
に、ＨＡ分子の表面にＨＩＶのエピトープを有するタン
パク分子構造を構築することができる。このＨＩＶルー
プのペプチドは、ＨＩＶの中和抗体や細胞傷害性Ｔ細胞
が主に認識する領域からなり、体液性免疫と細胞性免疫
の両方を誘導することが期待できるので好適である。
を用いる場合について本発明をさらに具体的に説明す
る。ＨＩＶ由来の抗原物質として、例えば、ＨＩＶエン
ベロープタンパク（envelope glycoprotein)のgp160 や
gp120 等を用いることができ、このタンパクの一部また
は全長をコードするＤＮＡをインフルエンザウイルスの
ＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩基配列と
組み合わせればよい。例えば、ＨＩＶのＶ３ループを前
記のＨＡタンパクのループ領域に挿入することにより、
ＨＩＶのエピトープを含むペプチド分子構造を崩さず
に、ＨＡ分子の表面にＨＩＶのエピトープを有するタン
パク分子構造を構築することができる。このＨＩＶルー
プのペプチドは、ＨＩＶの中和抗体や細胞傷害性Ｔ細胞
が主に認識する領域からなり、体液性免疫と細胞性免疫
の両方を誘導することが期待できるので好適である。
【００１３】ウイルスベクターとしては、全身感染によ
り効果を挙げるワクシニアウイルスが最も適しており、
特に細胞性免疫の形成に有利である。また、アデノウイ
ルス等を利用することもできる。ワクシニアウイルスの
チミジンキナーゼ(TK)や血球凝集素(HA)をコードする領
域等のワクシニアウイルスに必須でない領域をコードす
る遺伝子座に上記の外来遺伝子を組込むのが適当であ
る。２種以上の外来遺伝子をウイルスベクターに組込む
ことにより多価ワクチンを製造することも可能である。
り効果を挙げるワクシニアウイルスが最も適しており、
特に細胞性免疫の形成に有利である。また、アデノウイ
ルス等を利用することもできる。ワクシニアウイルスの
チミジンキナーゼ(TK)や血球凝集素(HA)をコードする領
域等のワクシニアウイルスに必須でない領域をコードす
る遺伝子座に上記の外来遺伝子を組込むのが適当であ
る。２種以上の外来遺伝子をウイルスベクターに組込む
ことにより多価ワクチンを製造することも可能である。
【００１４】ワクシニアウイルスベクター、必要なプロ
モータ−、及びその組み換え方法等については種々知ら
れている（蛋白質・核酸・酵素, 35(14), 2432-2442, 1
990、同, 37(3), 440-454, 1992等を参照）ので、それ
ら公知の材料及び方法を使用すればよい。例えば、ＡＴ
ＣＣ等から入手できるワクシニアウイルスＷＲ株、リス
ター株およびその温度感受性株、ウイルス粒子成熟欠損
変異株等を利用することができる。好ましいワクチニア
ウイルスベクターとして、ＡＴＩ (cow pox A型封入
体）のプロモーターおよび１個から数個の p7.5 プロモ
ーターを有するワクシニアウイルストランスファーベク
ターpSFB類(Funahashi et al., J. Virology, 65, 5584
-5588, 1991 参照）は、強力なプロモーターとしての作
用が期待でき、よい効果が得られる。
モータ−、及びその組み換え方法等については種々知ら
れている（蛋白質・核酸・酵素, 35(14), 2432-2442, 1
990、同, 37(3), 440-454, 1992等を参照）ので、それ
ら公知の材料及び方法を使用すればよい。例えば、ＡＴ
ＣＣ等から入手できるワクシニアウイルスＷＲ株、リス
ター株およびその温度感受性株、ウイルス粒子成熟欠損
変異株等を利用することができる。好ましいワクチニア
ウイルスベクターとして、ＡＴＩ (cow pox A型封入
体）のプロモーターおよび１個から数個の p7.5 プロモ
ーターを有するワクシニアウイルストランスファーベク
ターpSFB類(Funahashi et al., J. Virology, 65, 5584
-5588, 1991 参照）は、強力なプロモーターとしての作
用が期待でき、よい効果が得られる。
【００１５】組み換えウイルスを作製するには、ウイル
ス感受性細胞でウイルスＤＮＡとウイルスベクターとの
相同組み換えを実施すればよい。そしてこの感受性細胞
へＤＮＡを導入する手段として、リン酸カルシウム法や
エレクトロポレーション法を利用すればよく、効率よく
組み換え体を選出するためにウイルス粒子成熟に欠損の
ある変異株を用いることは有用である。組み換えワクシ
ニアウイルスの一次選択は、ワクシニアウイルスの赤血
球凝集能を利用したプラークアッセイで行うことがで
き、さらに限界希釈法と酵素抗体法等の通常のクローニ
ング手法により単一のウイルスを得ることができる。
ス感受性細胞でウイルスＤＮＡとウイルスベクターとの
相同組み換えを実施すればよい。そしてこの感受性細胞
へＤＮＡを導入する手段として、リン酸カルシウム法や
エレクトロポレーション法を利用すればよく、効率よく
組み換え体を選出するためにウイルス粒子成熟に欠損の
ある変異株を用いることは有用である。組み換えワクシ
ニアウイルスの一次選択は、ワクシニアウイルスの赤血
球凝集能を利用したプラークアッセイで行うことがで
き、さらに限界希釈法と酵素抗体法等の通常のクローニ
ング手法により単一のウイルスを得ることができる。
【００１６】本発明のワクチンを用いれば、種々の疾病
に対する液性抗体の産生を誘導することができ、それら
の疾病の治療及び予防効果が期待できる。さらに、細胞
傷害性Ｔ細胞の活性化によるウイルス感染細胞の障害や
排除を起こす細胞性免疫による治療と予防も期待できる
ことが大きな特徴である。ワクチンの接種は、例えば天
然痘ワクチンの経験に基づいて行えばよい。ＨＩＶに対
する予防的ワクチンは重要であるが、一般的に、激しい
抗原変異に対応したワクチンを開発することは困難であ
る。本発明によれば、ＰＣＲ法等を利用して患者に感染
しているＨＩＶの特異的な抗原部位をコードするＤＮＡ
領域を増幅し、このＤＮＡから翻訳されたペプチドに対
応したワクチンを作製することができる。このようなワ
クチン、およびそれらを用いた治療方法は、本発明の重
要な実施態様である（実施例４参照）。
に対する液性抗体の産生を誘導することができ、それら
の疾病の治療及び予防効果が期待できる。さらに、細胞
傷害性Ｔ細胞の活性化によるウイルス感染細胞の障害や
排除を起こす細胞性免疫による治療と予防も期待できる
ことが大きな特徴である。ワクチンの接種は、例えば天
然痘ワクチンの経験に基づいて行えばよい。ＨＩＶに対
する予防的ワクチンは重要であるが、一般的に、激しい
抗原変異に対応したワクチンを開発することは困難であ
る。本発明によれば、ＰＣＲ法等を利用して患者に感染
しているＨＩＶの特異的な抗原部位をコードするＤＮＡ
領域を増幅し、このＤＮＡから翻訳されたペプチドに対
応したワクチンを作製することができる。このようなワ
クチン、およびそれらを用いた治療方法は、本発明の重
要な実施態様である（実施例４参照）。
【００１７】なお、組み換えウイルスワクチンを用いる
場合、同じワクチンを追加免疫に用いることは、一般的
に好ましくない。この際には、組み換えカイコ核多角体
病ウイルスを使用し、宿主として蚕を用いて大量のキメ
ラＨＡタンパクを産生させ、このキメラＨＡタンパクを
追加抗原として使用するのが有用である（特開平3-1084
80号公報参照）。
場合、同じワクチンを追加免疫に用いることは、一般的
に好ましくない。この際には、組み換えカイコ核多角体
病ウイルスを使用し、宿主として蚕を用いて大量のキメ
ラＨＡタンパクを産生させ、このキメラＨＡタンパクを
追加抗原として使用するのが有用である（特開平3-1084
80号公報参照）。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。
【００１９】実施例１1a ) キメラ遺伝子（フラグメントＢ）の製造：ＨＩＶ−
１のＭＮ株のエンベロープ蛋白であるgp-120のＶ３領域
317〜323 番目の個々のアミノ酸（ＨＩＧＰＧＲＡ）を
コードする塩基配列の前後に、インフルエンザウイルス
A/sw/Ehime/1/80 (H1N2)のＨＡのアミノ酸をコードする
塩基配列をつけ加えて12個のアミノ酸（ＰＮＨＩＧＰＧ
ＲＡＴＡＡ）をコードするＤＮＡフラグメントを合成し
た。5'末端にHaeIIIサイトが、3'末端にSphIサイトが位
置する様に二つのオリゴヌクレオチド 38mer（5'- ＣＣ
ＣＡＡＴＣＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡ
ＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧ-3')と 34mer（5'- ＣＴＧＣＣ
ＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴ
ＴＧＧＧ- 3'）を合成し（Applied Biosystems Model 3
81A DNA synthesizer)、これら２つのオリゴヌクレオチ
ドをアニールさせた。これで得たＤＮＡフラグメントを
T4ＤＮＡキナーゼでリン酸化してフラグメントＢとして
使用した。
１のＭＮ株のエンベロープ蛋白であるgp-120のＶ３領域
317〜323 番目の個々のアミノ酸（ＨＩＧＰＧＲＡ）を
コードする塩基配列の前後に、インフルエンザウイルス
A/sw/Ehime/1/80 (H1N2)のＨＡのアミノ酸をコードする
塩基配列をつけ加えて12個のアミノ酸（ＰＮＨＩＧＰＧ
ＲＡＴＡＡ）をコードするＤＮＡフラグメントを合成し
た。5'末端にHaeIIIサイトが、3'末端にSphIサイトが位
置する様に二つのオリゴヌクレオチド 38mer（5'- ＣＣ
ＣＡＡＴＣＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡ
ＡＣＧＧＣＡＧＣＡＴＧ-3')と 34mer（5'- ＣＴＧＣＣ
ＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴＧＴＧＡＴ
ＴＧＧＧ- 3'）を合成し（Applied Biosystems Model 3
81A DNA synthesizer)、これら２つのオリゴヌクレオチ
ドをアニールさせた。これで得たＤＮＡフラグメントを
T4ＤＮＡキナーゼでリン酸化してフラグメントＢとして
使用した。
【００２０】1b) キメラ遺伝子含有プラスミドの構築：
インフルエウザウイルスA/sw/Ehime/1/80 (H1N2)のＨＡ
遺伝子を組込んだプラスミドpEH-HA1 (FERM BP-2585)を
BamHI およびHaeIIIで切断し、ＨＡの１〜452番目の塩
基配列を持つフラグメントＡを分離した。同様に同じプ
ラスミドをSphIおよびAccIで切断し、ＨＡの 492〜1776
番目の塩基配列を持つフラグメントＣを分離した。T4Ｄ
ＮＡライゲースを用いてフラグメントＡとフラグメント
Ｂをライゲーションし、フラグメントＡ＋Ｂを得た。さ
らにこのフラグメントをフラグメントＣとT4ＤＮＡライ
ゲースでライゲーションさせ、次いでAcc I で処理して
余分な末端塩基を除去してキメラＨＡ遺伝子ＨＡ−ＭＮ
を作出した。
インフルエウザウイルスA/sw/Ehime/1/80 (H1N2)のＨＡ
遺伝子を組込んだプラスミドpEH-HA1 (FERM BP-2585)を
BamHI およびHaeIIIで切断し、ＨＡの１〜452番目の塩
基配列を持つフラグメントＡを分離した。同様に同じプ
ラスミドをSphIおよびAccIで切断し、ＨＡの 492〜1776
番目の塩基配列を持つフラグメントＣを分離した。T4Ｄ
ＮＡライゲースを用いてフラグメントＡとフラグメント
Ｂをライゲーションし、フラグメントＡ＋Ｂを得た。さ
らにこのフラグメントをフラグメントＣとT4ＤＮＡライ
ゲースでライゲーションさせ、次いでAcc I で処理して
余分な末端塩基を除去してキメラＨＡ遺伝子ＨＡ−ＭＮ
を作出した。
【００２１】このＨＡ−ＭＮの両接着末端(BamHIサイ
ト）をＴ４−ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて平滑末端に変
換した。このＨＡ−ＭＮ遺伝子と、あらかじめSmaIで切
断し、bacterial alkaline phosphataseによって脱リン
酸化したワクシニアウイルス・トランスファーベクター
pSFB 5（このトランスファーベクターは、京都大学ウイ
ルス研究所の志田博士より分与されたものである： Fun
ahashiet al., J.Virology, 65, 5584-5588, 1991 を参
照。このベクターは、ＡＴＩ（cow pox A 型封入体）の
プロモーターとタンデムに並んだ５個の7.5-kDa 合成プ
ロモータ−、並びに、その下流に外来遺伝子挿入用制限
酵素サイトを含んでいる。）をライゲーションさせ、Ｈ
Ａ−ＭＮ遺伝子を組込んだプラスミドpCE-1 を作出し
た。図１に上記の工程をスキームで示す。ＨＡ遺伝子(2
66〜287)に相当するプライマー（ 5'-ＴＴＴＧＧＧＡＡ
ＡＣＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡ-3' ）を用いて、ジデオ
キシ法でpCE-1 の塩基配列を確認した。
ト）をＴ４−ＤＮＡポリメラ−ゼを用いて平滑末端に変
換した。このＨＡ−ＭＮ遺伝子と、あらかじめSmaIで切
断し、bacterial alkaline phosphataseによって脱リン
酸化したワクシニアウイルス・トランスファーベクター
pSFB 5（このトランスファーベクターは、京都大学ウイ
ルス研究所の志田博士より分与されたものである： Fun
ahashiet al., J.Virology, 65, 5584-5588, 1991 を参
照。このベクターは、ＡＴＩ（cow pox A 型封入体）の
プロモーターとタンデムに並んだ５個の7.5-kDa 合成プ
ロモータ−、並びに、その下流に外来遺伝子挿入用制限
酵素サイトを含んでいる。）をライゲーションさせ、Ｈ
Ａ−ＭＮ遺伝子を組込んだプラスミドpCE-1 を作出し
た。図１に上記の工程をスキームで示す。ＨＡ遺伝子(2
66〜287)に相当するプライマー（ 5'-ＴＴＴＧＧＧＡＡ
ＡＣＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡ-3' ）を用いて、ジデオ
キシ法でpCE-1 の塩基配列を確認した。
【００２２】1c) 組み換えワクシニアウイルスＥＡ−１
ＲＶＶの作製：キメラＨＡ遺伝子を組込んだプラスミド
pCE-1 2μg とワクシニアウイルスＷＲ株のＤＮＡ7.5
μg とをリン酸カルシウム法を用いて共沈させ、得られ
たＤＮＡをＣＶ−１細胞（大日本製薬株式会社製）にト
ランスフェクトしワクシニアウイルスＩＢＴD 変異株
（Virology, 155, 97 〜105, 1986)共存下で相同組み換
えを行った。組み換え体のスクリーニングは、ワクシニ
アウイルスの赤血球凝集能を利用したプラークアッセイ
で行い、インフルエンザウイルスの赤血球凝集能は、特
異抗体（抗A/sw/HK/1/74ウサギ血清）でマスクし、赤血
球凝集能を有さないプラークを分離した。さらに、限界
希釈法と酵素抗体法によって単一なウイルスをクローニ
ングし、組み換えワクシニアウイルスＥＡ１−ＲＶＶを
得た。
ＲＶＶの作製：キメラＨＡ遺伝子を組込んだプラスミド
pCE-1 2μg とワクシニアウイルスＷＲ株のＤＮＡ7.5
μg とをリン酸カルシウム法を用いて共沈させ、得られ
たＤＮＡをＣＶ−１細胞（大日本製薬株式会社製）にト
ランスフェクトしワクシニアウイルスＩＢＴD 変異株
（Virology, 155, 97 〜105, 1986)共存下で相同組み換
えを行った。組み換え体のスクリーニングは、ワクシニ
アウイルスの赤血球凝集能を利用したプラークアッセイ
で行い、インフルエンザウイルスの赤血球凝集能は、特
異抗体（抗A/sw/HK/1/74ウサギ血清）でマスクし、赤血
球凝集能を有さないプラークを分離した。さらに、限界
希釈法と酵素抗体法によって単一なウイルスをクローニ
ングし、組み換えワクシニアウイルスＥＡ１−ＲＶＶを
得た。
【００２３】1d) キメラＨＡ分子の発現とその生物学的
性状：ワクシニアウイルスによって発現されたキメラＨ
Ａ分子を用いて、赤血球吸着試験、ＥＡ１−ＲＶＶ感染
細胞での酵素抗体試験、間接蛍光抗体試験、免疫沈降試
験、ＥＡ１−ＲＶＶのマウスでの免疫応答試験 (ＨＩ試
験）を行った。赤血球吸着試験 ： RK-13 （大日本製薬製）細胞にＥＡ
１−ＲＶＶを m.o.i. 1で感染させ、37℃で24時間培養
後、細胞に1 % ニワトリ赤血球を吸着させた。細胞は陰
性を示した。
性状：ワクシニアウイルスによって発現されたキメラＨ
Ａ分子を用いて、赤血球吸着試験、ＥＡ１−ＲＶＶ感染
細胞での酵素抗体試験、間接蛍光抗体試験、免疫沈降試
験、ＥＡ１−ＲＶＶのマウスでの免疫応答試験 (ＨＩ試
験）を行った。赤血球吸着試験 ： RK-13 （大日本製薬製）細胞にＥＡ
１−ＲＶＶを m.o.i. 1で感染させ、37℃で24時間培養
後、細胞に1 % ニワトリ赤血球を吸着させた。細胞は陰
性を示した。
【００２４】酵素抗体試験： RK-13 細胞 (3 ×105/di
sh) に 100 plaque/dishになるようにＥＡ１−ＲＶＶを
感染させ、37℃、48時間培養した。精製インフルエンザ
ウイルス A/sw/HK/1/74 をフロイントの不完全アジュバ
ントとエマルジョンにして皮下および筋肉内投与したウ
サギから得た抗血清 (1:100 に希釈) を一次抗体、HRP
標識抗ウサギ IgG (H ＋L)抗体 (Cappel Laboratories,
1:100に希釈) を二次抗体、及び 4- クロロ -1-ナフト
ールを基質として用いてプラークを発色させた。その結
果、全てのプラークが紫青に染まり陽性を示した。
sh) に 100 plaque/dishになるようにＥＡ１−ＲＶＶを
感染させ、37℃、48時間培養した。精製インフルエンザ
ウイルス A/sw/HK/1/74 をフロイントの不完全アジュバ
ントとエマルジョンにして皮下および筋肉内投与したウ
サギから得た抗血清 (1:100 に希釈) を一次抗体、HRP
標識抗ウサギ IgG (H ＋L)抗体 (Cappel Laboratories,
1:100に希釈) を二次抗体、及び 4- クロロ -1-ナフト
ールを基質として用いてプラークを発色させた。その結
果、全てのプラークが紫青に染まり陽性を示した。
【００２５】間接蛍光抗体試験： CV-1細胞（大日本製
薬製）を18×18 mm のカバーグラス上に培養し、これに
ＥＡ１−ＲＶＶを m.o.i. 10で感染させ、37℃、24時間
培養した。一次抗体として 100倍希釈の抗 A/sw/HK/1/7
4 ウサギ血清を用い、二次抗体として 200倍希釈のFITC
標識抗ウサギ IgG(H+L) (Cappel Laboratories) を用い
た。蛍光顕微鏡観察により、感染細胞の表面にはドット
状の強い蛍光所見が認められるので、キメラＨＡ分子が
細胞表面に発現することが示された。この事実は、キメ
ラＨＡ分子が正常に細胞膜へトランスポートされて、そ
の後、そのＣ末端に近傍する疎水部分が膜に埋没して固
定されることを示唆している。また、天然のインフルエ
ンザウイルスのＨＡ分子と同様の生物活性を持つタンパ
クが発現していることを示唆している。
薬製）を18×18 mm のカバーグラス上に培養し、これに
ＥＡ１−ＲＶＶを m.o.i. 10で感染させ、37℃、24時間
培養した。一次抗体として 100倍希釈の抗 A/sw/HK/1/7
4 ウサギ血清を用い、二次抗体として 200倍希釈のFITC
標識抗ウサギ IgG(H+L) (Cappel Laboratories) を用い
た。蛍光顕微鏡観察により、感染細胞の表面にはドット
状の強い蛍光所見が認められるので、キメラＨＡ分子が
細胞表面に発現することが示された。この事実は、キメ
ラＨＡ分子が正常に細胞膜へトランスポートされて、そ
の後、そのＣ末端に近傍する疎水部分が膜に埋没して固
定されることを示唆している。また、天然のインフルエ
ンザウイルスのＨＡ分子と同様の生物活性を持つタンパ
クが発現していることを示唆している。
【００２６】免疫沈降試験： CV-1細胞にＥＡ１−ＲＶ
Ｖを m.o.i. 10で感染させた。４時間後、35S-メチオニ
ンを用いてウイルス構成タンパクを一晩培養してラベル
し、その後、感染細胞を界面活性剤で処理してそのライ
セートを抗 A/sw/HK/1/74 血清を用いて吸収した。吸収
されたキメラＨＡ−抗体結合分子をProtein Ａで免疫沈
降させた。SDS −ポリアクリルアミド電気泳動により沈
降物を分離し、オートラジオグラフィを行った。その結
果、分子量76 Kに相当する位置にバンドが検出された。
この 76 K の分子量は A/sw/HK/1/74 のＨＡ分子の分子
量とほぼ一致しており、発現されたＨＡキメラ分子が天
然のインフルエンザウイルスＨＡ分子と同等の大きさを
有していることが確かめられた。
Ｖを m.o.i. 10で感染させた。４時間後、35S-メチオニ
ンを用いてウイルス構成タンパクを一晩培養してラベル
し、その後、感染細胞を界面活性剤で処理してそのライ
セートを抗 A/sw/HK/1/74 血清を用いて吸収した。吸収
されたキメラＨＡ−抗体結合分子をProtein Ａで免疫沈
降させた。SDS −ポリアクリルアミド電気泳動により沈
降物を分離し、オートラジオグラフィを行った。その結
果、分子量76 Kに相当する位置にバンドが検出された。
この 76 K の分子量は A/sw/HK/1/74 のＨＡ分子の分子
量とほぼ一致しており、発現されたＨＡキメラ分子が天
然のインフルエンザウイルスＨＡ分子と同等の大きさを
有していることが確かめられた。
【００２７】マウスでの免疫応答試験： ４週令のメス
ddYマウス（n= 10)に 1×105 PFU/mouse のＥＡ１−Ｒ
ＶＶまたは対照としてワクシチニアウイルスを尾静脈よ
り投与して感染免疫した。マウス免疫血清のＨＩ抗体価
は１週後に32、２週後に64、そして３週から４週後に 1
28であり、効率良い抗体の上昇が認められた。一方、野
性株のワクシニアウイルスを感染させた対照免疫マウス
のＨＩ価は32以下であった。
ddYマウス（n= 10)に 1×105 PFU/mouse のＥＡ１−Ｒ
ＶＶまたは対照としてワクシチニアウイルスを尾静脈よ
り投与して感染免疫した。マウス免疫血清のＨＩ抗体価
は１週後に32、２週後に64、そして３週から４週後に 1
28であり、効率良い抗体の上昇が認められた。一方、野
性株のワクシニアウイルスを感染させた対照免疫マウス
のＨＩ価は32以下であった。
【００２８】以上の結果から、インフルエンザウイルス
ＨＡ遺伝子に外来遺伝子 (HIV-MN株Ｖ３領域の７つのア
ミノ酸をコードする遺伝子）を組み込むことが可能であ
り、赤血球凝集能以外はキメラＨＡタンパクがインフル
エンザウイルスのＨＡの生物学的性状と同様の性状を保
持していることが明らかとなった。赤血球凝集能が陰性
であったことは、挿入遺伝子から翻訳されるアミノ酸の
数及び配列により蛋白の三次構造に微妙な変化が惹起さ
れたものと推察される。
ＨＡ遺伝子に外来遺伝子 (HIV-MN株Ｖ３領域の７つのア
ミノ酸をコードする遺伝子）を組み込むことが可能であ
り、赤血球凝集能以外はキメラＨＡタンパクがインフル
エンザウイルスのＨＡの生物学的性状と同様の性状を保
持していることが明らかとなった。赤血球凝集能が陰性
であったことは、挿入遺伝子から翻訳されるアミノ酸の
数及び配列により蛋白の三次構造に微妙な変化が惹起さ
れたものと推察される。
【００２９】実施例２2a ) キメラ遺伝子（フラグメントＤ）の製造：ＨＩＶ I
IIB 株のエンベロープ蛋白 gp-120 のＶ３領域の315 〜
329 番目の15個のアミノ酸（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ
ＩＧＫ）をコードする塩基配列の両端にHaeIIIおよびSp
hIの制限酵素サイトを加え、17個（ＰＲＩＱＲＧＰＧＲ
ＡＦＶＴＩＧＫＡ）のアミノ酸をコードする53塩基のオ
リゴヌクレオチド（5'- ＣＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧ
ＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＧＡＣＧ
ＡＴＡＧＧＴＡＡＧＧＣＡＴＧ- 3'）および49塩基から
なる相補鎖（5'- ＣＣＴＴＡＣＣＴＡＴＣＧＴＣＡＣＡ
ＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＡ
ＴＴＣＴＧＧＧ- 3'）を合成し、さらに得られたヌクレ
オチドをアニールした。得られたＤＮＡフラグメントを
T4ＤＮＡキナーゼでリン酸化してフラグメントＤを得
た。
IIB 株のエンベロープ蛋白 gp-120 のＶ３領域の315 〜
329 番目の15個のアミノ酸（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ
ＩＧＫ）をコードする塩基配列の両端にHaeIIIおよびSp
hIの制限酵素サイトを加え、17個（ＰＲＩＱＲＧＰＧＲ
ＡＦＶＴＩＧＫＡ）のアミノ酸をコードする53塩基のオ
リゴヌクレオチド（5'- ＣＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧ
ＡＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＴＧＴＧＡＣＧ
ＡＴＡＧＧＴＡＡＧＧＣＡＴＧ- 3'）および49塩基から
なる相補鎖（5'- ＣＣＴＴＡＣＣＴＡＴＣＧＴＣＡＣＡ
ＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＡ
ＴＴＣＴＧＧＧ- 3'）を合成し、さらに得られたヌクレ
オチドをアニールした。得られたＤＮＡフラグメントを
T4ＤＮＡキナーゼでリン酸化してフラグメントＤを得
た。
【００３０】2b) 実施例１の1b) と同様にして、フラグ
メントＤとインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子とを含
むキメラＨＡ遺伝子ＨＡ- III Ｂを組込んだプラスミド
を作出した。2c ) 1c) と同様にして、組み換えワクシニアウイルスＥ
Ａ２−ＲＶＶを作出した。2d ) ＥＡ２−ＲＶＶによってキメラＨＡ分子を発現さ
せ、このタンパクを赤血球吸着試験、ＥＡ２−ＲＶＶ感
染細胞での酵素抗体試験、及び蛍光抗体試験に付した。
実施例１と同様な結果を得た。
メントＤとインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子とを含
むキメラＨＡ遺伝子ＨＡ- III Ｂを組込んだプラスミド
を作出した。2c ) 1c) と同様にして、組み換えワクシニアウイルスＥ
Ａ２−ＲＶＶを作出した。2d ) ＥＡ２−ＲＶＶによってキメラＨＡ分子を発現さ
せ、このタンパクを赤血球吸着試験、ＥＡ２−ＲＶＶ感
染細胞での酵素抗体試験、及び蛍光抗体試験に付した。
実施例１と同様な結果を得た。
【００３１】本試験では、さらにＥＡ２−ＲＶＶに挿入
されたＨＩＶ遺伝子の発現を合成ペプチド免疫血清を用
いた酵素抗体試験及び間接蛍光抗体試験で確認した。 合成ペプチド免疫血清の調製：挿入遺伝子フラグメント
ＤがコードするＨＩＶ由来の15個のアミノ酸と同一の配
列を有するペプチドを合成し、ヘモシアニン（ＫＬＨ）
と該ペプチドとを共有結合させてコンジュゲートを作製
した。該コンジュゲートを 2.5 kg の雌ウサギに投与し
た。１回目の投与には完全フロイントアジュバントを用
い、 1.2 mg 相当量のＫＬＨコンジュゲートペプチドを
皮内投与した。それぞれ１週後および２週後の２回目及
び３回目の各投与には、不完全フロイントアジュバント
を用いて１回目と同量のペプチドを皮内投与した。血清
試料を１回目の投与から１週間おきに採取し、ＥＬＩＳ
Ａ法により抗体価の上昇を確認した。
されたＨＩＶ遺伝子の発現を合成ペプチド免疫血清を用
いた酵素抗体試験及び間接蛍光抗体試験で確認した。 合成ペプチド免疫血清の調製：挿入遺伝子フラグメント
ＤがコードするＨＩＶ由来の15個のアミノ酸と同一の配
列を有するペプチドを合成し、ヘモシアニン（ＫＬＨ）
と該ペプチドとを共有結合させてコンジュゲートを作製
した。該コンジュゲートを 2.5 kg の雌ウサギに投与し
た。１回目の投与には完全フロイントアジュバントを用
い、 1.2 mg 相当量のＫＬＨコンジュゲートペプチドを
皮内投与した。それぞれ１週後および２週後の２回目及
び３回目の各投与には、不完全フロイントアジュバント
を用いて１回目と同量のペプチドを皮内投与した。血清
試料を１回目の投与から１週間おきに採取し、ＥＬＩＳ
Ａ法により抗体価の上昇を確認した。
【００３２】挿入ＨＩＶ遺伝子による発現タンパクの検
出：ＲＫ−１３細胞にＥＡ２−ＲＶＶを感染させた。ペ
プチド免疫により得られた血清（初回免疫３週後の血
清）を一次抗体、ＨＲＰ標識抗ウサギIgG(H+L)抗体を二
次抗体、4-クロロ-1- ナフトールを基質として用いて、
形成されたプラークを反応に付した。その結果、全ての
プラークが紫青に染まり陽性を示した。また、正常ウサ
ギ血清である陰性コントロール、上記と同じ一次抗体、
及びＦＩＴＣ標識抗ウサギIgG 抗体である二次抗体を用
いて、間接蛍光抗体法による反応を行ったところ、感染
細胞の表面にペプチド免疫血清に対する特異的な蛍光が
認められた。
出：ＲＫ−１３細胞にＥＡ２−ＲＶＶを感染させた。ペ
プチド免疫により得られた血清（初回免疫３週後の血
清）を一次抗体、ＨＲＰ標識抗ウサギIgG(H+L)抗体を二
次抗体、4-クロロ-1- ナフトールを基質として用いて、
形成されたプラークを反応に付した。その結果、全ての
プラークが紫青に染まり陽性を示した。また、正常ウサ
ギ血清である陰性コントロール、上記と同じ一次抗体、
及びＦＩＴＣ標識抗ウサギIgG 抗体である二次抗体を用
いて、間接蛍光抗体法による反応を行ったところ、感染
細胞の表面にペプチド免疫血清に対する特異的な蛍光が
認められた。
【００３３】以上の結果から、インフルエンザウイルス
ＨＡ遺伝子に挿入されたＨＩＶ遺伝子は、抗原性を有す
るペプチドをＥＡ２−ＲＶＶ感染細胞で発現しているこ
とが確認された。
ＨＡ遺伝子に挿入されたＨＩＶ遺伝子は、抗原性を有す
るペプチドをＥＡ２−ＲＶＶ感染細胞で発現しているこ
とが確認された。
【００３４】実施例３ 細胞傷害性（細胞性免疫）試験：組み換えワクシニアウ
イルスＥＡ２−ＲＶＶのＣＴＬ誘導能を高橋らの方法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3105-3109, 1988)
に準じて行った。3a ) ＥＡ２−ＲＶＶの感作：BALB/c(H-2d ) マウスを 1
07/PFU/mouseのＥＡ２−ＲＶＶを尾静脈から投与して免
疫した。５週間後に脾臓からリンパ球を集め(5×106 ce
lls/ml) 、このリンパ球を、イン・ビトロで gp 160 遺
伝子を導入したBALB/c 3T3細胞 (2.5 ×105cells/ml)
と共に６日間培養することで二次刺激を与え活性化した
エフェクター細胞を得た。
イルスＥＡ２−ＲＶＶのＣＴＬ誘導能を高橋らの方法
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3105-3109, 1988)
に準じて行った。3a ) ＥＡ２−ＲＶＶの感作：BALB/c(H-2d ) マウスを 1
07/PFU/mouseのＥＡ２−ＲＶＶを尾静脈から投与して免
疫した。５週間後に脾臓からリンパ球を集め(5×106 ce
lls/ml) 、このリンパ球を、イン・ビトロで gp 160 遺
伝子を導入したBALB/c 3T3細胞 (2.5 ×105cells/ml)
と共に６日間培養することで二次刺激を与え活性化した
エフェクター細胞を得た。
【００３５】3b) ＣＴＬアッセイ：ターゲット細胞とし
て、gp 160の遺伝子を導入したBALB/c 3T3細胞 (15-1
2)、ＨＩＶ IIIB 株のＶ３領域（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦ
ＶＴＩＧＫ）の合成ペプチドでラベルした BALB/c 3T3
細胞 (18 IIIB)(Townsend ら、Cell, 44, 959-968, 198
6)、及び、コントロールとしてラベルしていないBALB/c
3T3細胞を用いた。これらのターゲット細胞((Ｔ）：5
×103 cells/well）に上記のエフェクター細胞（Ｅ）を
加え（Ｅ／Ｔ比 20:1, 40:1, 80:1) 、その細胞障害性
を51Cr- リリース法（Zweerinkら、Eur. J. Immunol.,
7, 630-635, 1977) によって測定した。その値は次式に
よって算出した。
て、gp 160の遺伝子を導入したBALB/c 3T3細胞 (15-1
2)、ＨＩＶ IIIB 株のＶ３領域（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦ
ＶＴＩＧＫ）の合成ペプチドでラベルした BALB/c 3T3
細胞 (18 IIIB)(Townsend ら、Cell, 44, 959-968, 198
6)、及び、コントロールとしてラベルしていないBALB/c
3T3細胞を用いた。これらのターゲット細胞((Ｔ）：5
×103 cells/well）に上記のエフェクター細胞（Ｅ）を
加え（Ｅ／Ｔ比 20:1, 40:1, 80:1) 、その細胞障害性
を51Cr- リリース法（Zweerinkら、Eur. J. Immunol.,
7, 630-635, 1977) によって測定した。その値は次式に
よって算出した。
【００３６】
【００３７】表１に示したように、ＥＡ２−ＲＶＶによ
り感作されたリンパ球（細胞障害性Ｔ細胞）は、ＨＩＶ
のenv タンパクを提示した15-12 細胞あるいはペピチド
をラベルした 18 IIIB細胞に対して高い細胞障害活性を
示した。一方、該リンパ球は対照として用いたBALB/c 3
T3に対しては活性を示さなかった。この実験によって有
効性を示す本発明のワクチンは、感染細胞の排除により
疾病の発症阻止および治療に効果を有する。
り感作されたリンパ球（細胞障害性Ｔ細胞）は、ＨＩＶ
のenv タンパクを提示した15-12 細胞あるいはペピチド
をラベルした 18 IIIB細胞に対して高い細胞障害活性を
示した。一方、該リンパ球は対照として用いたBALB/c 3
T3に対しては活性を示さなかった。この実験によって有
効性を示す本発明のワクチンは、感染細胞の排除により
疾病の発症阻止および治療に効果を有する。
【００３８】
【表１】 ＥＡ２−ＲＶＶのＣＴＬ活性 ───────────────────────────── ％ specific lysis 免 疫 原 Ｅ／Ｔ比 ─────────────── 15-12 18IIIB 対照 ───────────────────────────── ＥＡ２−ＲＶＶ 80:1 60.4 49.4 0.3 〃 40:1 56.7 45.0 3.0 〃 20:1 43.2 33.8 0.7 ─────────────────────────────
【００３９】実施例４ 外来遺伝子組み換え用ベクターの構築：ＰＣＲ法等によ
って増幅されたエピトープ領域をコードするＤＮＡを組
み込むことにより、ＨＡキメラタンパクを発現させるこ
とができるべクターの製造を行った。プラスミドpUC119
（宝酒造）をKpn I およびSph I で消化し、得られたフ
ラグメントの両末端をT4ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
とした。これとは別に、プラスミドpEH-HA1(FERM-BP-25
85) をBamHI で消化してインフルエンザウイルスA/sw/
Ehime/1/80 (H1N2) のＨＡ遺伝子を取り出し、その両末
端をT4ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。
って増幅されたエピトープ領域をコードするＤＮＡを組
み込むことにより、ＨＡキメラタンパクを発現させるこ
とができるべクターの製造を行った。プラスミドpUC119
（宝酒造）をKpn I およびSph I で消化し、得られたフ
ラグメントの両末端をT4ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
とした。これとは別に、プラスミドpEH-HA1(FERM-BP-25
85) をBamHI で消化してインフルエンザウイルスA/sw/
Ehime/1/80 (H1N2) のＨＡ遺伝子を取り出し、その両末
端をT4ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。
【００４０】得られた二種のＤＮＡ断片をライゲーショ
ンしてプラスミドpSK(-)となし、これにＭ13Ｋ07phage
を感染させて一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮ
ＡにSma I サイトを有する合成オリゴヌクレオチドＧＡ
ＴＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＧをアニール
させ、次いでＤＮＡポリメラーゼで処理して二本鎖環状
プラスミドpAC-1 を作出した。このプラスミドpAC-1 を
Sma I およびSph I で消化しT4ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端とすれば、プラスミドpAC-1 に種々の外来遺伝子
を挿入してキメラ遺伝子を含有したプラスミドとするこ
とができる。このプラスミドをPuv IIで処理すればキメ
ラ遺伝子を得ることができるので、ワクシニアウイルス
トランスファーベクターまたはバキュロウイルストラン
スファーベクターにキメラ遺伝子を導入するのに有用で
ある。
ンしてプラスミドpSK(-)となし、これにＭ13Ｋ07phage
を感染させて一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮ
ＡにSma I サイトを有する合成オリゴヌクレオチドＧＡ
ＴＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＧをアニール
させ、次いでＤＮＡポリメラーゼで処理して二本鎖環状
プラスミドpAC-1 を作出した。このプラスミドpAC-1 を
Sma I およびSph I で消化しT4ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端とすれば、プラスミドpAC-1 に種々の外来遺伝子
を挿入してキメラ遺伝子を含有したプラスミドとするこ
とができる。このプラスミドをPuv IIで処理すればキメ
ラ遺伝子を得ることができるので、ワクシニアウイルス
トランスファーベクターまたはバキュロウイルストラン
スファーベクターにキメラ遺伝子を導入するのに有用で
ある。
【００４１】
【発明の効果】本発明のワクチンを用いれば、種々の疾
病の治療と予防に、液性抗体の産生による効果が期待で
きる。また、細胞性免疫による効果も期待できるので本
発明のワクチンは有用である。
病の治療と予防に、液性抗体の産生による効果が期待で
きる。また、細胞性免疫による効果も期待できるので本
発明のワクチンは有用である。
【図１】 本発明のワクチンの製造スキームの１例を示
す図である。
す図である。
Claims (10)
- 【請求項１】 インフルエンザウイルスのＨＡタンパク
の一部または全長をコードする塩基配列と病原体由来物
の一部または全体をコードする塩基配列とが組み込まれ
たベクターであるワクシニアウイルスを含むワクチン。 - 【請求項２】 病原体由来物をコードする塩基配列がイ
ンフルエンザウイルスのＨＡタンパクのループ領域をコ
ードするＤＮＡに挿入された請求項１に記載のワクチ
ン。 - 【請求項３】 病原体由来物がＨＩＶ由来の抗原物質で
ある請求項１または２に記載のワクチン。 - 【請求項４】 病原体由来物をコードする塩基配列がＨ
ＩＶのエンベロープタンパクgp120 またはgp160 をコー
ドし少なくとも24塩基を含む塩基配列である請求項３に
記載のワクチン。 - 【請求項５】 ワクシニアウイルスにインフルエンザウ
イルスのＨＡタンパクの一部または全長をコードする塩
基配列と病原体由来物の一部または全体をコードする塩
基配列とを組み込む工程を含むワクチンの製造方法。 - 【請求項６】 病原体由来物をコードする塩基配列をイ
ンフルエンザウイルスのＨＡタンパクのループ領域をコ
ードするＤＮＡに挿入する工程を含む請求項５に記載の
方法。 - 【請求項７】 病原体由来物がＨＩＶ由来の抗原物質で
ある請求項５または６に記載の方法。 - 【請求項８】 病原体由来物をコードする塩基配列がＨ
ＩＶのエンベロープタンパクgp120 またはgp160 をコー
ドし少なくとも24塩基を含む塩基配列である請求項７に
記載の方法。 - 【請求項９】 請求項１ないし４のいずれか１項に記載
のワクチンで免疫する工程を含む細胞性免疫の形成方
法。 - 【請求項１０】 以下の工程： (a) 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のワクチン
で免疫する工程；及び(b) インフルエンザウイルスのＨ
Ａタンパクの一部または全部に対応する部分と免疫を所
望する抗原物質に対応する部分とを含みバキュロウイル
スとカイコの系で発現させたキメラタンパクでさらに追
加免疫を行う工程；を含む免疫方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6212523A JPH07170982A (ja) | 1993-09-09 | 1994-09-06 | ワクチンおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24866093 | 1993-09-09 | ||
| JP5-248660 | 1993-09-09 | ||
| JP6212523A JPH07170982A (ja) | 1993-09-09 | 1994-09-06 | ワクチンおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07170982A true JPH07170982A (ja) | 1995-07-11 |
Family
ID=26519287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6212523A Ceased JPH07170982A (ja) | 1993-09-09 | 1994-09-06 | ワクチンおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07170982A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002505300A (ja) * | 1998-03-03 | 2002-02-19 | メリアル | 組換え生ワクチンおよび補助剤 |
| JP2008512130A (ja) * | 2004-09-13 | 2008-04-24 | ワイス | 出血性ネコカリシウイルス、カリシウイルスワクチンおよびカリシウイルス感染または疾患を予防するための方法 |
| WO2012137071A2 (en) | 2011-04-06 | 2012-10-11 | Biovaxim Limited | Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans |
-
1994
- 1994-09-06 JP JP6212523A patent/JPH07170982A/ja not_active Ceased
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002505300A (ja) * | 1998-03-03 | 2002-02-19 | メリアル | 組換え生ワクチンおよび補助剤 |
| JP2008512130A (ja) * | 2004-09-13 | 2008-04-24 | ワイス | 出血性ネコカリシウイルス、カリシウイルスワクチンおよびカリシウイルス感染または疾患を予防するための方法 |
| WO2012137071A2 (en) | 2011-04-06 | 2012-10-11 | Biovaxim Limited | Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans |
| EP3000476A1 (en) | 2011-04-06 | 2016-03-30 | Biovaxim Limited | Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans |
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