JP2006511211A - ネコ白血病ウィルスによるネコ感染症のようなオンコウィルス感染症に対するワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
“env”:ネコ白血病ウィルスの内側パッケージのコートタンパクをコードする遺伝子配列
“gag”:ネコ白血病ウィルスの内側パッケージの構造タンパクをコードする遺伝子配列
FeLV:ネコ白血病ウィルス
WT:野生型
WT“env”:NCBIデータベースアクセス番号M12500から抽出した、野生型の“env”DNA配列
WT“gag”:感染ネコの血液から得られた(実施例1参照)野生型“gag”DNA配列で、データベース配列ではないが、データベース配列と相同のもの
NLS:核局在シグナル配列
ODN:オリゴデオキシヌクレオチド
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
LeadFeLVenv(FeLVenv): シグナル配列を有するFeLV“env”配列
LeadFeLVenvgp85(FeLVenvgp85): シグナル配列を有するFeLV“env”配列
配列番号1 “env”遺伝子野生型のDNA配列
配列番号2 “gag”遺伝子野生型のDNA配列
配列番号3 “env”遺伝子野生型のタンパク配列
配列番号4 “gag”遺伝子野生型のタンパク配列
配列番号5 突然変異“gag”遺伝子のDNA配列
配列番号6 突然変異“gag”遺伝子のタンパク配列
配列番号7 突然変異“env”遺伝子(gp85)のDNA配列。gp70配列が、免疫原性p15タンパクをコードする配列分だけここでは延長されている。
配列番号9 突然変異“env”遺伝子(gp85)のタンパク配列
配列番号10 突然変異“env”遺伝子(gp70)のタンパク配列
配列番号11 “env”遺伝子(gp70)野生型のDNA配列、配列番号1から得られたもの(NCBIデータベース、アクセス番号M12500)
配列番号12から配列番号40まで 下記の実施例によって用いられたプライマーの配列。
Midge−NLS−FeLVenvgp70(−)またはMidge−NLS−FeLVgp70(−) p15非含有、コドンおよびシグナル最適化“env”配列(gp70)をコードする、NLS結合Midgeベクター
Midge−NLS−WT “env”遺伝子のWTをコードするNLS結合Midgeベクター
mAK vs.gp70 gp70に対するモノクロナール抗体
陽性コントロール ロイコゲンワクチン
バッファー PBS、陰性コントロール
選択された抗原の野生型配列、特に“gag”遺伝子のものは、感染ネコの血液から得られた。“env”WTのDNA配列は配列番号1に示され(NCBIデータベース、アクセス番号M12500)、“gag”WTのDNA配列は配列番号2に示される。対応アミノ酸配列は、配列番号3(“env”)と配列番号4(“gag”)に示される。
2箇所のEco31I制限部位を取り除くために、下記の変異体プライマーによる3 PCRを行った:
gag−mut1−rneu(配列番号12)
AATTAAGAGCTCCACGTCTCCCCCCGCTAACAGCAACTGGCG
gag−mut2−l(配列番号13)
AATTAAGAGCTCCAGGTCTCCGGGGCTCCGCGGGGCTGCAAGACG
gag−mut3−r(配列番号14)
AATTAAGAGCTCCACGTCTCCTTCCCTTTTGTTGTATATCTTTTCTGC
gag−mut4−l(配列番号15)
AATTAAGAGCTCCAGGTCTCCGGAAACCCCAGAGGAAAGGGAAGAAAG
得られた3種の配列の連結後、下記のプライマーを用いてPCRを行った。
Felvgag−r(配列番号17):TTCTCAGAGCTCTTAGAGGAGAGTGGAGTTGGCGGGT
“env”WT用プライマー
envl(配列番号18):CGGATAAGGTACCATGGCCAATCCTAGTCCACC
envr(配列番号19):AGTTCTCAGAGCTCTTAGGCTGTTTCAAGGAGGGCTT
ネコ用コドン使用テーブルを、コドン使用データベース(http://wwww.kazusa.or.jp/codon/)から入手した。二つのWT配列の全てのアミノ酸について、もっとも高頻度に利用されるコドンを用いた。この規則にたいして下記の制限を用いた。
18から28塩基長のオリゴヌクレオチドを購入した(TibMolbiol)。合計51本のオリゴヌクレオチドをアニーリングとライゲーションによって接合した。重複部は4塩基であった。どの重複部もただ一度きりであり、パリンドロームではないことが確認された。各単一オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖にたいしてハイブリダイズした鎖であり、これは、単一鎖(1本鎖およびアンチセンス1本鎖)をキナーゼバッファー中で約80℃に加熱し、それからゆっくりと室温に冷却して得た。その後、ATPとポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)およびオリゴヌクレオチドを1時間リン酸化した。次に、第1工程で、配列において互いに隣り合うオリゴヌクレオチドを接触させ、連結した(オリゴヌクレオチド1+2、オリゴヌクレオチド3+4)。1時間のライゲーション後、オリゴヌクレオチド1+2のライゲーション反応分液と、3+4のライゲーション反応分液を接触させた。この最後のライゲーション反応分液を取り、両側プライマーによるPCRを実行した。期待された長さのPCR産物が得られた場合には、そのPCR産物を、TAクローニングによってTOPOベクターpCR2.1に挿入し、配列を確認した。これを同様にして、完全遺伝子の他の全ての断片について実行した。4本の断片が得られた。個々の断片を、コントロール挿入プラスミドからEcoRIによって切り出し、Eco31Iによる消化後連結した。適正な長さを持つ完全ライゲーション産物を、BamHIおよびSacIによって消化し、ゲル抽出後の、同様に調製されたベクターpMCV1.4に挿入した。その後、配列を配列決定によって確認した。得られたプラスミドは、pMC1.4−FeLVenvと命名した。
断片1
左側プライマー(配列番号20):ATATTGGATCCCATGGCCAACCCCTCCC
右側プライマー(配列番号21):ATTATGGTCTCCTGCTGCTTCTTCCTGTCTGTGG
断片2
左側プライマー(配列番号22):TAATAGGTCTCCAGCAGCAGACCTACCCCT
右側プライマー(配列番号23):TAATAGGTCTCTGTGAACAGGGCAATGGGGTCA
断片3
左側プライマー(配列番号24):TATTTGGTCTCTTCACAGTGTCCAGGCAGGTGTC
右側プライマー(配列番号25):TATTAGGTCTCAGCTTGTGCTGGGGGGTGG
断片4
左側プライマー(配列番号26):AATAAGGTCTCCAAGCTGACCATCTCTGAGGTGT
右側プライマー(配列番号27):ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC
全体配列
左側プライマー(配列番号20):ATATTGGATCCCATGGCCAACCCCTCCC
右側プライマー(配列番号27):ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC
“env”タンパクの加工を実現するために、シグナル配列(リーダー配列)を、コドン最適化された“env”配列の前に挿入した。このシグナル配列は、22から30bpの長さを持つ8本のODNをアニーリングとライゲーションによって接合して得た。最後のライゲーション工程後、リーダー配列の増幅のためにPCRを実行した。
左側プライマー(配列番号28):ATTGCCGGTACCATGGAGTCCCCCACCACC
右側プライマー(配列番号29):ATCAGAGGTCTCCCATGCCAATGTCAATGGTGAAC
配列の5’末端に、Eco31I認識配列を作製した。
左側プライマー(配列番号30):GATCTGGGTCTCCATGGCCAACCCCTC
右側プライマー(配列番号27):ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC
左側プライマー(配列番号28):ATTGCCGGTACCATGGAGTCCCCCACCACC
右側プライマー(配列番号27):ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC
gp70およびp15から成る、完全な“env”ポリタンパクをクローンした。このために、プラスミドpMCV1.4−FeLVenvp15由来のp15WTをPCRにて増幅し、前述のように、pMCV1.4−LeadFeLVenvの後ろに挿入した。このp15の増幅の際に、Eco31I認識配列を5’末端に作製した。
使用プライマー配列:
左側プライマー(配列番号31):AATTATGGTCTCGCAGTTCAGACAACTACAAATGGC
右側プライマー(配列番号32):AATTATGAGCTCTCAGGGCCTGTCAGGGTC
2.PCR:
LeadFeLVenvの配列を増幅した。その際、認識部位を3’末端に作製した。
左側プライマー(配列番号33):AATTATGGTACCATGGAGTCCCCCACCC
右側プライマー(配列番号34):TATAATGGTCTCAACTGGGCTGTTTCCAGCAGGGC
右側プライマー(配列番号32):AATTATGAGCTCTCAGGGCCTGTCAGGGTC
LeadFeLVenvのDNA配列について、http://www.fruitfly.org/seq tools/.htmlに従って、予想されるスプライス信号配列(部位)に関して分析した。塩基100と140の間に、97%の確率を持つ部位が認識された。塩基119の交換後(AからGへ、GlnからArgへのアミノ酸交換)、もはや予想される部位は認識されなかった(下位閾値=40%確率)。変異配列の作製とクローニングは下記のように実行した。
先ず、LeadsynFeLVenvの塩基1−123から成る断片(1)をPCRによって増幅した。用いた前進プライマーは、PCR産物の5’末端に制限酵素KpnIの認識部位を形成する。
左側プライマー(配列番号28):5’−ATTGCCGGTACCATGGAGTCCCCCACCACC
右側プライマー(配列番号35):5’−ATATTAGGTCTCAGATCCGGGGGGGGGAGGG
FeLVgagのクローニングは、3に記述した過程と同様にして実行した。配列を、3種の単一断片に対してオリゴヌクレオチドをアニールし、連結することによって形成した。この配列は、合計2x31本のオリゴヌクレオチド(前進および逆行鎖)を組み合わせて得られたものである。この断片をPCRにおいて鋳型として用い、下記のプライマー配列によって増幅した。
左側プライマー(配列番号36):ATATTGGTCTCAGGAGAGGGACAAGAAGAG
右側プライマー(配列番号37):AATATGGTCTCTCAGCCTGCTGGCGATGGGGC
断片2:
左側プライマー(配列番号38):ATTATGGTCTCTGCACCTGAGGCTGTACAGGC
右側プライマー(配列番号39):AATATGGTCTCGGTGCTCCCTGCCGGCGGGGGTGCA
断片3:
左側プライマー(配列番号38):ATTATGGTCTCTGCACCTGAGGCTGTACAGGC
右側プライマー(配列番号40):AATATGGTCTCTCTCCTCCTGCCTCTGC
全断片用プライマー:
左側プライマー(配列番号36):ATATTGGTCTCAGGAGAGGGACAAGAAGAG
右側プライマー(配列番号40):AATATGGTCTCTCTCCTCCTGCCTCTGC
f3201細胞系統のネコ細胞を、プラスミドpMCV1.4−FeLVenvp85(−スプライス)、pMC1.4−FeLVenvgp70(−スプライス)、FeLVgag、および、“env”と“gag”に対するWT含有のプラスミドpMOKによって、250Vと1050μFの電気穿孔を通じてトランスフェクトした。
プラスミドpMCV1.4−FeLVenvgp85(−スプライス)、pMCV1.4−FeLVenvgp70(−スプライス)、および、pMCV1.4−FeLVgagを、制限酵素Eco31Iによって37℃で一晩消化した。この制限消化によって2本の断片が生成された。一方は、カナマイシン耐性遺伝子と、他の、そのプラスミドを細菌中で継代するのに必要な配列から成っていた。他方の断片は、MIDGE−DNAの一部となるべき配列から成っていた。すなわち、強調されたCMVプロモーター、キメライントロン、対応遺伝子配列、および、SV40のポリアデニル化配列である。
NLSペプチドPKKKRKVを2工程でODNに結合した。先ず、オリゴヌクレオチド修飾体5’−PH−d(GGGAGTCCAGT xT TTCTGGACであって、xTはC2−アミノリンカーを有するアミノ修飾チミン塩基)(0.1mM)を、室温(RT)でPBSに溶解したsulfo−KMUS(5mM)で活性化した。120分後、50mMのトリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタンを加えて反応を停止させ、活性化ODNを、エタノール沈殿(300mM NaOAc、pH5.2、5.5mM MgCl2、70%エタノール)、遠心、および70%エタノールによる1回の洗浄の後、得た。このようにして得られたODN(0.1mM)をPBSに溶解し、ペプチド(0.2mM)と室温で1時間反応させた。反応は、ゲル電気泳動(3%)と臭化エチジウム染色でチェックした。得られたNLS結合ODNをHPLCにて精製し、前述のMIDGE−NLS構築体の合成に用いた。
各6匹のBALB/cマウスから成る五つのワクチン接種群を形成した(表1参照)。全群(コントロール群を除く)において、基本的抗原は、免疫修飾されたタンパクp15を含む、または、含まない、“env”タンパクの最適化配列である。コード配列、および、その配列に先行するサイトメガロウィルスプロモーター(CMV)を、実施例8に従って、直線状2本鎖分子として用いた。コントロールとして、バッファー、通例ワクチン(ロイコゲン)、および“env”タンパクのWTを用いた。最初の免疫化後(50μg DNA、1mg/ml、皮内)、2回目の免疫化(ブースト)を15日目に行った。血液を、14、28および42日目に採取した。この血液サンプルを、“env”に対する特異的抗体についてアッセイした。
“env”タンパクに対する抗体の半定量的アッセイをウェスタンブロットによって実行した。実験0週目および12週目にネコから得た血漿サンプルを試験した。0週目では、予想通り“env”に対する抗体は認められなかった。表3に(+)として挙げられている弱いバンドは非特異的なものである。12週目では、1、2および4群の全ての動物が、1匹のネコを例外として、明白な抗体反応を示した。動物患者に見られたこの結果は、マウスにおける予備実験の結果を裏付けるものである(実施例10参照)。
達成された高度の抗体生産が、本当にFeLウィルスによる感染にたいして保護を付与するものであるのかどうかを評価し、従って、本発明によるワクチン接種の効力を確認するために、次に感染による実験を行った。各10匹のネコから成る4群に対して、それぞれの構築体を、注射針無しの注入装置を用い皮内に二度(0日目および21日目)ワクチン接種した(表4)。発現構築体として、NLSペプチド結合Midgeベクターを用いた。最後のワクチン接種後21、22および23日目に、ネコを生のウィルスによる試験感染で感染させた(Rickard株、>10e6フォーカス形成単位/ml)。ワクチンの効力は、ネコが、この試験感染後に保護されたかどうかに従って判定した。ネコは、その血液の中にウィルス粒子を持っておらず(血清陰性ネコ)、かつ、その血球の中にウィルスDNAを持っていない場合を保護されているとした。ウィルス粒子をアッセイするために、ネコの血清についてELISAによって抗原p27の有無を調べた。組み込まれたウィルスDNA、所謂プロウィルスDNAの量は、Taqman PCRによって定量した。下記のようなワクチン接種プログラムを処方した。
レーン3:コドン最適化“gag”をコードする発現ベクター
レーン4:非感染ネコの細胞、陰性コントロール
レーン5:ブランク
レーン6:ウィルス感染ネコの細胞、陽性コントロール
レーン7:Boaタンパクマーカー
WTによる発現は極めて弱いタンパクバンドを示すが(1および2)、一方、本発明の配列によって強力な発現が達成された(3)。感染ネコの細胞を比較基準として用いた(6)。“gag”は、感染細胞においてタンパク分解酵素によって分断されてFeLVの構造タンパクとなる前駆体タンパクを意味する。最強の免疫原は構造タンパクp27であり、これは、全体ウィルスに対する抗血清によってよく認識される。レーン6において、55kDaの全体“gag”を表すバンドと、27kDaの両方が認識される理由がこのことによって説明される。この状況とは対照的に、レーン3は、ウィルス粒子は含まないが、“gag”遺伝子によってトランスフェクトされた細胞を含む。見かけ上は、これによって、“gag”遺伝子産物がタンパク分解酵素によってウィルスタンパクに変性されることはなく、全前駆体タンパクが、細胞タンパク分解酵素によって非特異的変性を受けるだけである。
レーン2:非感染ネコ細胞、陰性コントロール
レーン3:ウィルス感染ネコ細胞、陽性コントロール
レーン4:ブランク
レーン5:ウィルス感染ネコ細胞、沈殿、陽性コントロール
レーン6:非感染ネコ細胞、沈殿、陰性コントロール
レーン7:“env”の特異的証明のための追加の陰性コントロール
レーン8:ブランク
レーン9:コドンおよびシグナル最適化FeLVenvgp85(−)をコードする発現ベクター
レーン10:ブランク
レーン11:コドン最適化FeLVenvgp70(−)をコードする発現ベクター
レーン5のコントロールは、envgp85発現の陽性コントロールとして使用が可能な明瞭なタンパクバンドを与える。レーン9は、本発明の配列FeLVenvgp85(−)が、gp85タンパクの発現を誘発することを示す。レーン11は、本発明のFeLVenvgp70(−)を示す。70kDaバンドが見られないことは、gp85とは対照的に、envgp70は分泌タンパクであることから説明される。従って仮に、細胞分解液中にあったとしても、検出が困難である。
B:バッファー
抗体測定は、第2回免疫化の4週間後に行った。第3群では、6個のマウス血清の内3個が抗体陽性であり(矢印下のレーン:Midge−NLS−FeLVgp85(−))、第4群では、5個の血清が強い陽性であり、1個が弱い陽性であった(矢印下のゲルレーン:Midge−NLS−FeLVgp70(−))。一方、第5群の、WTで免疫化した動物では、僅か2例において極めて弱い陽性信号が示されただけであった(矢印下のゲルレーン:Midge−NLS−WT)。本実験では、WT配列に比べて、最適化配列は、インビボにおいても遥かに改善された抗体形成をもたらすことが示され、インビトロの実験結果が確認された。
Claims (18)
- ネコの細胞においてネコ白血病ウィルス(FeLV)の遺伝子産物を発現させるためのDNA発現構築体であって、前記構築体は、ネコ科において作動が可能なプロモーター配列、および、生得の構造タンパク(“gag”)および/または膜タンパク(“env”)をコードする、FeLVの野生型ヌクレオチド配列に関連する少なくとも一つのヌクレオチド配列を含み、FeLVの前記ヌクレオチド配列は変異体であり、開放または隠蔽されたドナーおよび/またはアクセプター配列を含まず、所定のタンパクをコードし、このタンパクは、FeLVの生得の構造タンパク(“gag”)および/または生得の膜(“env”)タンパクに対して高度の相同性を持つが同一ではなく、あるいは、それらのタンパクの一部に対して高度の相同性を持つが、同一ではないことを特徴とするDNA発現構築体。
- FeLVの生得の構造タンパク(“gag”)および/または生得の膜(“env”)タンパクに対して高度の相同性を持つが、同一ではなく、対応する野生型に対する相同性が少なくとも98%であるタンパクをコードすることを特徴とする、請求項1によるDNA発現構築体。
- コドン最適化の過程で変異され、“gag”関連構造タンパクをコードするヌクレオチド配列・配列番号5を含むことを特徴とする、請求項1によるDNA発現構築体。
- コドンおよびスプライス最適化の過程で変異され、env−gp85関連膜タンパクをコードするヌクレオチド配列・配列番号7を含むことを特徴とする、請求項1によるDNA発現構築体。
- コドンおよびスプライス最適化の過程で変異され、env−gp70関連膜タンパクをコードするヌクレオチド配列・配列番号8を含むことを特徴とする、請求項1によるDNA発現構築体。
- 構造および/または膜タンパクが、対応するヌクレオチド配列によって完全にまたは部分的にコードされることを特徴とする、先行請求項の1項または数項によるDNA発現構築体。
- 発現構築体がプラスミドであることを特徴とする、請求項1から5の少なくとも1項によるDNA発現構築体。
- 免疫化ポリヌクレオチド配列が、直線状2本鎖領域を含む共有的に閉鎖された直線状デオキシリボヌクレオチド分子から成る発現構築体の形を取り、2本鎖を形成する各1本鎖は、デオキシリボヌクレオチドから成る短い1本鎖ループによって結合され、前記2本鎖形成1本鎖は、ワクチン接種の対象となる動物において作動が可能なプロモーターの制御下にあるコード配列と、ターミネーター配列のみから成ることを特徴とする、請求項1から5の少なくとも1項によるDNA発現構築体。
- 発現構築体が、一つ以上のペプチドに対して共有的に結合することを特徴とする、先行請求項の少なくとも1項によるDNA発現構築体。
- ペプチドが、3から30個のアミノ酸から構成され、その内の少なくとも半分は、アルギニンとリジンから成るグループの内のメンバーであることを特徴とする、請求項8によるDNA発現構築体。
- ペプチドが、配列PKKKRKV(プロリン−リジン−リジン−リジン−アルギニン−リジン−バリン)を含むことを特徴とする、請求項9によるDNA発現構築体。
- ネコ科、特にネコにおいて予防的および/または治療的免疫を産生するための製薬組成物、特にワクチンであって、請求項1から11の1項または数項によるDNA発現構築体を含む製薬組成物、特にワクチン。
- アミノ酸配列・配列番号6を有するタンパク質であって、ネコ白血病ウィルス(FeLV)の生得の構造タンパク(“gag”)に対して高度の相同性を有するタンパク質。
- アミノ酸配列・配列番号9を有するタンパク質であって、ネコ白血病ウィルス(FeLV)の生得の膜タンパクgp85(“env”)に対して高度の相同性を有するタンパク質。
- アミノ酸配列・配列番号10を有するタンパク質であって、ネコ白血病ウィルス(FeLV)の生得の膜タンパクgp70(“env”)に対して高度の相同性を有するタンパク質。
- 請求項13から15によるタンパクに対するモノクロナール抗体。
- 請求項13から15によるタンパクに対するポリクロナール抗体。
- ネコにおけるネコ白血病ウィルスによる感染の診断用キットであって、請求項17および18による1種以上の抗体を含むキット。
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